KR100833216B1

KR100833216B1 - 데옥시포도필로톡신, 진세노사이드 Ｒｇ1 및 글리시르리진함유 항암 조성물

Info

Publication number: KR100833216B1
Application number: KR1020000030251A
Authority: KR
Inventors: 안병준; 김용; 김송배
Original assignee: 김송배
Priority date: 2000-06-02
Filing date: 2000-06-02
Publication date: 2008-07-01
Also published as: KR20010109710A

Abstract

본 발명은 할미꽃 뿌리, 인삼 및 감초를 60 ℃ 이하의 온도에서 용매로 추출하고 여과하여 동결건조시켜 얻은 생약 제제(SB31 제제)와 할미꽃 뿌리로부터 분리된 항암 성분인 데옥시포도필로톡신(deoxypodophyllotoxin)의 항암효과를 대폭 증강시킬 수 있을 뿐 아니라, 그 항암효과를 지속화시킬 수 있는, 데옥시포도필로톡신, 진세노사이드(ginsenoside) Rg₁ 및 글리시르리진(glycyrrhizin)을 함유하는 항암 조성물에 관한 것이다.

Description

데옥시포도필로톡신, 진세노사이드 Ｒｇ1 및 글리시르리진 함유 항암 조성물{Anticancer composition containing deoxypodophyllotoxin, ginsenoside Rg1 and glycyrrhizin}

도 1은 미삼 추출물의 크로마토그래피 결과를 나타내는 도면;

도 2는 할미꽃 뿌리로부터의 혈관형성 저해물질의 분리과정을 개략적으로 나타내는 도면; 및

도 3은 HUVE 세포의 혈관형성에 대한 DPT의 저해효과를 나타내는 도면.

본 발명은 신규한 항암 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 할미꽃 뿌리, 인삼 및 감초를 60 ℃ 이하의 온도에서 용매로 추출하고 여과하여 동결건조시켜 얻은 생약 제제(SB31 제제)와 할미꽃 뿌리로부터 분리된 항암 성분인 데옥시포도필로톡신(deoxypodophyllotoxin)의 항암효과를 대폭 증강시키고 지속화시킬 수 있는, 데옥시포도필로톡신, 진세노사이드(ginsenoside) Rg₁ 및 글리시르리진 (glycyrrhizin) 함유 항암 조성물에 관한 것이다.

할미꽃[풀사틸라 코리아나(Pulsatilla koreana)를 포함한 할미꽃 속 식물], 인삼(파낙스 진셍; Panax ginseng) 및 감초(글리시르리자 글라브라; Glycyrrhiza glabra)를 60 ℃ 이하의 온도에서 용매로 추출하고 여과하여 동결건조시켜 얻은 생약 제제(SB31 제제)가 항암제로서 유용하다는 사실은 이미 밝혀진 바 있다(한국특허출원 제98-47025호, 제98-48277호, PCT 출원 제KR99/00659호). 종래의 연구 결과에 따르면, 인삼 자체나 그 중의 특정 성분, 할미꽃 뿌리 자체 또는 그로부터 분리된 특정 물질, 또는 감초나 그 성분의 각각은 SB31 제제와 동등한 정도의 항암성을 나타내지 못한다. 그러므로, SB31 제제중 인삼, 할미꽃 뿌리와 감초는 항암 작용에 있어서 상호 상승적 역할을 할 것으로 기대된다.

한편, 데옥시포도필로톡신(DPT)은 하기 화학식 1의 사이클로리그난(cyclolignan)계 물질로서 암세포에 대해 강한 세포독성을 나타내는 것으로 알려져 있다:

T. Terada 등[Chem. Pharm. Bull. 40, 2720-2727(1992)]은 암세포주 P-388 및 S-180에 대하여, A. San Feliciano 등[Planta Med. 59, 246-249(1993); Arch. Pharm(Weinheim) 327, 175-179(1993)]은 암세포주 P388, A-549 및 HT-29에 대하여, Kinghorn 등[Planta Med. 61, 80-81(1995)]과 J. J. Chen 등[Planta Med. 62, 528-533(1996)]은 여러 종류의 사람 암세포주에 대하여, DPT가 강한 세포독성을 나타냄을 확인하였다. 현재까지 밝혀진 DPT의 세포독성 기전은 세포분열시 필수 단계인 미소관 집적(microtuble assembly)을 저해하는 것이다. J. D. Loike 등[Cancer Research 38, 2688-2693(1978)]은 DPT가 0.5 μM의 IC₅₀값을 나타내어, 포도필로톡신의 것과 동등한 수준의 미소관 집적 저해효과를 나타냄을 발견하였다. 그 후, R. S. Gupta[Cancer Research 43, 505-512(1983)]도 동일한 결과를 확인하였다. 또한, Terada 등은 DPT의 DNA 토포이소머라제(topoisomerase)-Ⅱ에 대한 저해효과를 관찰하였는데, 그 IC₅₀값은 186 μM로서 약한 작용만을 나타내었으므로, 이 효소의 저해를 세포독성의 작용기전으로 간주하기에는 어려움이 있는 것으로 판단된다. 또한, 한국특허출원 제98-48080호 및 미국특허출원 제09/405,165호에서 DPT가 HUVE 세포의 혈관신생을 억제한다는 사실이 확인되었다. 따라서, DPT는 미소관 집적 저해작용에 의한 세포독성과 혈관신생 억제작용에 의한 암조직 파괴와 같은 적어도 두 가지의 기전에 의해 그 항암작용을 나타내는 것으로 판단된다.

한편, 인삼의 주성분중의 하나인 하기 화학식 2의 진세노사이드 Rg1(Rg1)은 여러가지 생리작용을 나타낸다:

주작용 사포닌의 하나인 진세노사이드 Rb1(Rb1)이 주로 억제작용을 하는데 비해, Rg1은 활성화 작용을 나타낸다. 예를들어, Rb1은 중추신경을 억제하는데 비해, Rg1은 중추신경을 흥분시킨다. 현재까지 연구된 Rg1의 생리작용은 중추신경 흥분, DNA/RNA 합성 촉진, 부신피질호르몬 분비 촉진, 호르몬 작용 촉진 등이다(1991년, 고려인삼학회 하계 심포지움 강연집, 고려인삼학회 편). 최근의 연구에 의하면, Rg1은 사람 림프구(lymphocytes)의 유사분열(mitosis)을 촉진시킬 뿐만 아니라, 세포증식을 촉진시키는 것으로 관찰되었다[L.S. Tong과 C.Y. Chao; American J. of Chinese Medicine 8, 254-267(1980)]. B. Kenarova 등[Jpn. J. Pharmacol. 54, 447-454(1990)]은 Rg1이 흉선세포의 유사분열을 촉진시킨다고 보고하고 있다. 또한, W.Y. Ng와 C.Y. Chao[American J. of Chinese Medicine 9, 119-133(1981)]는 Rg1이 양파(Allium cepa)세포의 유사분열을 촉진시키는 반면, Rb1은 그것을 불활성화시킨다는 사실을 확인하였다.

본 발명자들은 SB31 제제중의 할미꽃 뿌리, 인삼 및 감초로부터 항암 작용에 관여하는 물질을 분리하여 이들 물질간의 상호작용 여부를 밝히고, 그 연구결과를 토대로 SB31 제제로부터 보다 과학적인 항암 제제를 개발해내기 위하여 연구를 거듭하였다. 그 결과, DPT와 Rg1의 상반된 작용(DPT의 유사분열 저해작용, Rg1의 유사분열 촉진작용)에도 불구하고, Rg1을 SB31 제제나 DPT에 첨가함으로써 그 항암성을 대폭 증강시킬 수 있다는 놀라운 사실을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 할미꽃 뿌리, 인삼 및 감초로 구성된 SB31 제제나, 할미꽃 뿌리로부터 분리된 항암 성분인 DPT에 Rg1이 혼합조성된, 새로운 형태의 보다 과학적인 항암 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 제 1 측면은 할미꽃 뿌리, 인삼 및 감초를 60 ℃ 이하의 온도에서 용매로 추출하고 여과하여 동결건조시켜 얻은 생약 제제(SB31 제제); 및 진세노사이드 Rg₁을 함유하는 항암 조성물을 제공한다. 본 조성물에서, 진세노사이드 Rg₁은 인삼의 메탄올 추출액으로부터 분리된 것일 수 있다. 또한, 생약 제제:진세노사이드 Rg₁의 중량비는 50:1 이상인 것이 바람직하다.

본 발명의 제 2 측면은 데옥시포도필로톡신, 진세노사이드 Rg₁ 및 글리시르리진을 함유하는 항암 조성물을 제공한다. 본 조성물에서, 데옥시포도필로톡신은 할미꽃 뿌리의 메탄올 추출액으로부터 분리된 것일 수 있다. 또한, 데옥시포도필로톡신을 1 mg/㎖ 이상 함유하고, 진세노사이드 Rg₁을 1 mg/㎖ 이상 함유하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 먼저 인삼으로부터 항암작용 증강분획을 찾아내고자, 미삼분말을 메탄올로 2 회 추출하고 건고한 후 메탄올로 최종 추출하고 건고하였다. 그로부터 공지의 방법을 이용하여 디올(diol)계와 트리올(triol)계 진세노사이드를 분리하여, 분획 1(Rg1 분획), 분획 2(Rg1과 Rb1이 포함되지 않는 분획) 및 분획 3(Rb1 분획)을 얻었다. 그 중 분획 1이 SB31 제제의 항암성을 증가시킴을 확인하고, 나아가 그 작용물질이 Rg1임도 확인하였다. 아울러, SB31 제제:진세노사이드 Rg1의 중량비가 50:1 이상에서, SB31 제제의 항암성이 대폭 증강됨을 관찰하였다. SB31 제제는 할미꽃 뿌리에 인삼과 감초를 첨가하여 60 ℃ 이하의 온도에서 용매로 추출하고 여과하여 동결건조시킨 동결건조물에 보조제를 첨가하거나, 추출액에 보조제를 첨가하고 여과한 후 동결건조시켜 얻은 동결건조물을 약제학적 분야에서 통상적으로 사용되는 제제화 방법으로 제제화시킴으로써 얻을 수 있다(한국특허출원 제98-48277호 참조).

한편으로는, 할미꽃 뿌리로부터 혈관형성 저해물질을 분리해내고 그것이 기지 물질인 DPT임을 확인하였다. 이에 DPT의 적당한 투여량을 결정하기 위하여, Rg1 및 Gly의 양을 고정시키고 용액 10 ㎖당 DPT를 각각 5, 10 및 20 mg으로 함유하는 제제를 제조하여 시험한 결과, DPT 10 mg 첨가시 가장 우수한 항암성을 얻을 수 있었다. 따라서, 이 양을 고정시켜놓고 Rg1의 첨가량을 변화시켜가면서 항암성을 추적한 결과, 용액 10 ㎖당 Rg1 10 mg 첨가시 우수한 항암효과, 특히 지속성 있는 항암효과를 얻을 수 있음을 확인하였다.

이상 언급한 바와 같이, DPT는 미세관 집적을 저해함으로써 유사분열을 저해하고, 그와 반대로 Rg1은 유사분열을 촉진시킨다. 이와 같이 상반되는 작용에도 불구하고, Rg1의 첨가가 SB31의 항암성을 대폭 증강시킴을 확인할 수 있었다. 이 같은 사실로부터, Rg1의 유사분열 촉진작용과 DPT의 유사분열 저해작용간에 직접적인 관계가 있음을 알 수 있다. 이론적으로는 Rg1의 유사분열 촉진작용이 DPT의 유사분열 저해작용의 감도(sensitivity)를 향상시키고, 그 감도의 상승이 항암작용을 상승시키는 것으로 유추된다.

본 발명에 따른 항암 조성물은 체중 1 kg 당 5∼20 mg으로 투여될 수 있으나, 이 양은 환자의 성별, 나이, 증상 등에 따라 증감될 수 있다. 또한, 본 발명의 항암 조성물은 일반적으로 주사용 용액 또는 현탁액, 또는 주사시 주사용 증류수로 재조제하여 사용할 수 있는 즉시 사용형 주사용 건조분말 등과 같은 형태의 주사용 제제로 제형화될 수 있다. 이 때 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등과 같은 약제학적 분야에서 주사제 제조시 통상적으로 사용되는 담체와 배합될 수 있다. 이렇게 제조된 약제학적 제제는 예를들면 정맥주사, 암조직에 대한 직접 주사 등의 방법으로 투여될 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명을 실시예를 통해 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 미삼으로부터 항암작용 증강분획의 제조

가) 미삼분획의 제조

미삼분말 100 g을 80% 메탄올 500 ㎖가 들어있는 삼각 플라스크에 가하고 40 ℃에서 3 시간동안 진탕하였다. 진탕액을 여과한 후 여액인 메탄올 층은 보관하고 잔사에 다시 80% 메탄올 1 ℓ를 가하고 3 시간동안 진탕하여 여과하였다. 2 회 추출한 메탄올 추출액을 합하여 감압하에서 건고하였다(건고물 1, 수율: 8.2 g). 건고물 1에 메탄올 100 ㎖를 가하고 진탕한 후 방치하였다. 불용분을 여과하여 제거하고 여액은 감압하에서 건고하였다(건고물 2, 수율: 5.3 g).

건고물 2로부터 공지의 방법[Sanada, S., Kondo, N., Shoji, J., Tanaka, O. 및 Shibata, S.; Studies on the saponins of ginseng(Ⅰ). Chem. Pharm. Bull., 22, 421(1974) 및 22, 2407(1974)]을 이용하여 디올(diol)계와 트리올(triol)계 진세노사이드를 분리하였다. 먼저, 클로로포름/메탄올/물을 65/35/10의 부피비로 혼합하고 진탕한 후 방치하였다. 그 후 상층을 분리하여 크로마토그래피 용매를 조제하였다. 이 혼합용매에 실리카겔(Merck사, 70∼230 메쉬)을 가하여 혼합한 후 지름 3 cm의 칼럼에 채워 높이(filling height)가 50 cm 정도 되게 하였다. 동일한 용매 500 ㎖을 통과시켜 칼럼을 평형 상태로 만든 후 건고물 2를 동일한 용매 15 ㎖에 용해시켰다. 용해되지 않는 부분은 여과하고 여액을 칼럼에 가하여 크로마토그래피를 행하였다. 최초에 유출되는 착색 물질은 제거하고 30 ㎖씩 분획하였다.

각 분획의 약 20 ㎕씩을 실리카겔 박막 크로마토그래피용 플레이트에 찍은 후 부탄올/에틸아세테이트/물을 4:1:5의 부피비로 혼합하여 방치하였다. 생성된 상층을 취하여 전개 용매로 하여 10 cm 높이까지 전개시킨 후, 건조시키고 요오드 챔버에 가하여 발색시켰다. 순품 진세노사이드 Rg1(트리올계 대표 물질, Rg1)과 진세노사이드 Rb1(디올계 대표 물질, Rb1)을 표준물질로 사용하였다.

그 결과를 도 1에 나타내었다. 박막상에 Rg1의 반점이 나타났다가 없어질 때까지의 분획을 분획 1(Fr. 1∼6), Rb1이 나타났다가 없어질 때까지의 분획을 분획 3(Fr. 12∼20), 그 중간의 혼합 분획을 분획 2(Fr. 7∼11)라고 표시하였다. 각각의 분획을 감압 건조하여 얻은 분말(분획 1: 1.8 g, 분획 2: 0.95 g, 분획 3: 1.2 g)을 사용하여 항암성 증강효과를 관찰하였다.

나) SB31 제제의 제조

한국특허출원 제98-48277호의 실시예 3에 기재된 방법에 따라, SB31 제제를 제조하였다. 즉, 증류수 100 ㎖에 분말화된 할미꽃 뿌리 6 g, 인삼 3 g 및 감초 0.9 g을 가하고 증발하는 량만큼 증류수를 보충하면서 60 ℃ 이하의 온도에서 약 60 분간 교반하여 침출시켰다. 침출액을 rpm 5000의 원심분리기로 분리한 후 여기에 등장화제로 염화나트륨 900 mg과 방부제로 파라옥시안식향산 프로필 120 mg 및 무통화제로 벤질알콜 500 mg을 첨가하고 무균실에서 세균여과기로 여과한 후 5 ㎖ 용량의 바이알 20 개에 나누어 가하고 신속하게 -40 ℃ 이하에서 동결건조시킨 후 밀전하여 분말주사제를 제조하였다.

다) 미삼분획이 SB31 제제의 항암성에 미치는 영향

하기 항암효과 측정방법으로 미삼분획이 SB31 제제의 항암성에 미치는 영향 을 살펴보았다.

1) 실험검체

SB31 바이알(250 mg) 3 개를 준비하고 이들 각각에 분획 1, 분획 2, 분획 3 10 mg씩을 차례로 혼합한 후 4% 트윈 80을 가하여 10 ㎖씩 되게하고 용해시켰다. 마우스 20 g당 이 용액 0.2 ㎖씩을 복강 주사하였다.

2) 실험동물 및 세포주

실험동물로는 대한실험동물사의 체중 20∼25 g BDF1 마우스를 사용하였다. 동물실의 온도는 약 20 ℃였고 명암은 12 시간 주기로 자동 조절하였다. 사료와 음수는 무제한으로 공급하였으며 세포주인 루이스 폐암(Lewis lung carcinoma; LLC) 세포주는 생명공학연구소로부터 분양받아 사용하였다.

3) 마우스로의 암세포주 이식방법

5×10⁶ 세포/㎖의 LLC를 마우스 20 g당 0.2 ㎖씩 피하로 이식하였다. 시료는 암세포 이식 후 1 일부터 14 일까지 매일 복강으로 주사하였다. 암세포 이식 후 17, 19 및 21 일째에 형성된 종양의 크기를 개체별로 측정하였다.

4) 저해율(IR, %)의 측정

저해율을 하기 식에 의해 계산하고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.

암괴의 부피(mm³)=길이(mm)×넓이(mm²)/2

암성장 저해율(%)=(C-T)×100/C

C: 대조군의 암괴 평균부피, T: 시료투약군의 암괴 평균부피

미삼 분획의 루이스 폐암세포를 이식한 BDF1 마우스에 대한 항암효과

처방/측정일	17 일	19 일	21 일
SB31	67.4	60	52.2
^a)제제 1	80.2	77	72.9
^b)제제 2	65.1	62	51
^c)제제 3	60	59	59

단위: 저해율 (%)

^a) SB31 250 mg과 분획 1 10 mg에 4% 트윈 80를 가하여 10 ㎖로 만든 용액

^b) SB31 250 mg과 분획 2 10 mg에 4% 트윈 80를 가하여 10 ㎖로 만든 용액

^c) SB31 250 mg과 분획 3 10 mg에 4% 트윈 80를 가하여 10 ㎖로 만든 용액

표 1에 나타낸 바와 같이, 분획 1을 첨가한 제제 1에서 SB31 제제의 항암성이 크게 증가됨을 확인할 수 있었다.

라) Rg1의 SB31 제제에 대한 항암성 증강효과

분획 1중에 함유되어 있는 주사포닌중의 하나가 진세노사이드 Rg1이므로, Rg1이 작용물질일 가능성이 높은 것으로 추측되었다. 따라서, Rg1을 여러가지 양으로 SB31과 혼합한 후(제제 4 내지 6) 상기와 같이 항암성을 측정하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.

Rg1의 루이스 폐암세포를 이식한 BDF1 마우스에 대한 항암효과

처방/측정일	17 일	19 일	21 일
SB31	51.2	45.6	36
^d)제제 4	55	43.1	50
^e)제제 5	49.3	53	31
^f)제제 6	93	87.2	72.7

단위: 저해율(%)

^d) SB31(250 mg)과 Rg1 1 mg에 4% 트윈 80를 가하여 10 ㎖로 만든 용액

^e) SB31(250 mg)과 Rg1 3 mg에 4% 트윈 80를 가하여 10 ㎖로 만든 용액

^f) SB31(250 mg)과 Rg1 5 mg에 4% 트윈 80를 가하여 10 ㎖로 만든 용액

표 2에 나타낸 바와 같이, SB31 250 mg에 Rg1 5mg을 첨가한 경우(제제 6) 항암성이 현저히 증강되었다. 이로부터, Rg1이 바로 미삼에 함유되어 있는 SB31의 항암성 증강 물질임을 확인되었다. 한편, Rg1을 5 mg 이상 첨가하더라도 항암효과가 더 이상 증강되지는 않았다.

실시예 2: 할미꽃 뿌리로부터 HUVE 세포의 혈관형성 저해물질의 분리

동결건조한 할미꽃 뿌리를 분쇄하고 3 kg을 취하여 추출기에 가하였다. 메탄올 6 ℓ씩으로 12 시간동안 3 회 추출하였다. 추출액을 진공증류기에 가하고 메탄올을 증발시킨 후 잔사를 물 1 ℓ에 현탁시키고 석유에테르 1 ℓ씩으로 3 회 추출하였다. 석유에테르를 감압하에서 증발건고하여 얻은 잔사(38 g)를 실리카겔 (70∼230 메쉬)을 채운 칼럼(5×50 cm)에 가하고 헥산/에틸아세테이트(50:1)로 크로마토그래피를 행하였다. 이 용매 1 ℓ가 소비되면 에틸아세테이트의 양을 점차 증가시키면서(헥산:에틸아세테이트=1:50 까지) 분획을 행하였다. 그 중 다섯 번째 분획(분획 5)이 HUVE 세포의 혈관형성을 가장 강력하게 저해하는 것으로 나타났다.

분획 5를 다시 동일한 크기의 실리카겔 칼럼에 가하고 벤젠/에틸아세테이트(15:1)로 시작하여 에틸아세테이트의 양을 점차 증가시키면서(벤젠:에틸아세테이트=1:1 까지) 분획을 행하였다. 그 중 세 번째 분획(분획 5c)이 가장 강력한 혈관형성 저해작용을 나타내었다. 분획 5c를 분취용 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 메탄올:물(55:45)을 이동상으로 하여 순수 작용물질 22 mg을 얻었다. 이 물질의 물리화학적 데이터는 기지 물질인 데옥시포도필로톡신(DPT)의 것과 동일하였다.

이상과 같은 할미꽃 뿌리로부터의 혈관형성 저해물질의 분리과정을 개략적으로 도시하면 도 2와 같다(++++: 분획 5c의 농도 1 ㎍/㎖에서 100% 저해작용; +++: 석유에테르 분획의 농도 100 ㎍/㎖ 및 분획 5의 농도 10 ㎍/㎖에서 70% 저해작용).

하기 방법으로 혈관형성 억제실험을 행하였다.

매트리겔(Matrigel)은 -20 ℃의 냉동고에서 보관하며 사용시에는 4 ℃에서 하룻밤 방치하여 서서히 녹인 후 크라이오 튜브(cryo tube)에 1 ㎖씩 분주하여 4 ℃에서 보관하였다. HUVE 세포 서브컬쳐시 사용하는 트립신-EDTA는 10 배 희석된 원액을 HBSS로 희석하여 조제하였다. M199(Gibco BRL 31100-350) 배지 1 봉과 중탄산나트륨 2.2 g을 증류수 1 ℓ에 용해시킨 후 pH 7.2로 맞추고(1), bFGF(Gibco BRL 13256-029) 10 ㎍을 멸균 증류수 100 ㎕에 용해시킨 후 1 회 사용에 적당한 양을 분주해 놓았다(2). 헤파린(Gibco BRL 15077-019) 100,000 유닛(175 유닛/mg) 571 mg을 멸균한 M199 배지 5.7 ㎖에 용해시켰다(3).

M199 배지(1) 240 ㎖, FBS 60 ㎖, bFGF(2) 9 ㎕와 헤파린(3) 300 ㎕을 가하여 하루동안 오염 여부를 확인한 후 PS 3 ㎖를 첨가하여 사용하였다. 한편, 시판 시약은 2% 젤라틴이므로 3차 증류수로 0.3%로 희석하고 멸균하여 사용하였다. 이것을 T75 컬쳐 플라스크에 1.5 ㎖로 바닥을 코팅하여 클린 벤치내의 평평한 곳에 2 시간동안 방치한 후 냉장고에서 보관하였다.

위에서 제조한 매트리겔을 24-웰 플레이트에 1 웰당 250 ㎕씩 거품이 생기지 않게 가한 후, 플레이트를 37 ℃에서 30 분동안 인큐베이션하였다. 24-웰 플레이트의 1 웰당 4×10⁵HUVE 세포를 가한 후 즉시 위에서 얻은 분획 또는 DPT를 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해시킨 용액을 가하였다. 이 때 최종농도는 분획의 경우 10 또는 100 ㎍/㎖, DPT의 경우 30, 10, 3 또는 1 ng/㎖이 되도록 조정하였다. 양성 대조군으로는 PMA(40 ng/㎖)를 사용하였다. 약물을 가한 후 1 시간 간격으로 24 시간동안 그 HUVE 세포의 혈관형성 여부를 위상차 현미경하에서 관찰하였다.

도 3에 시료 투여 후 20 시간째에 관찰한 혈관 형성 저해효과를 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 1, 3, 10 및 30 ng/㎖의 투여 농도중 3 ng/㎖ 이상에서는 혈관 형성이 완전히 저해됨을 관찰할 수 있었다. 이것은 최저 농도 3 ng/㎖에서 DPT의 고형 암세포들에 대한 평균 세포독성에 비하여 3∼10 배 강한 것으로서, 혈관 형성 저해작용이 DPT 항암작용의 일 요인임을 암시해주는 것이다.

실시예 3: 글리시르리진이 SB31의 항암성에 미치는 영향

글리시르리진(Gly)을 첨가하여 Rg1과 같이 실험한 결과, 항암성 증강효과를 나타내지 않는 것으로 확인되었다. Gly는 해독효과 및 공존하는 약물의 용해보조 등 유리한 일반 약리효과를 갖고 있는 물질이므로, SB31에 함유되어 있는 양을 제제중에 포함시켰다.

실시예 4: DPT와 Rg1으로부터 제제구성 및 그 항암작용

먼저 DPT의 적당한 투여량을 결정하기 위하여, Rg1 및 Gly의 양을 고정시키고 DPT를 5 및 10 mg으로 함유하는 제제(제제 7 및 8)를 조제하였다(표 3).

DPT 투여용량 변화에 따른 항암효과(단위: 저해율(%))

제제/측정일	17 일	19 일	21 일
^f)제제 7	32.4	30.3	18.3
^g)제제 8	58.9	55.4	41.8

^f)제제 7: DPT 5 mg, Rg1 2 mg 및 Gly 3 mg에 4% Tween 80를 가하여 10 ㎖로 만든 용액

^g)제제 8: DPT 10 mg, Rg1 2 mg 및 Gly 3 mg에 4% Tween 80를 가하여 10 ㎖로 만든 용액

표 3에 나타낸 바와 같이, DPT를 10 mg 첨가한 제제 8에서 강한 항암효과가 나타났다. DPT 10 mg 첨가가 우수한 항암성을 나타내므로 이 양을 고정시키고 Rg1의 첨가량을 변화시켜가면서(제제 9 및 10) 항암성을 추적하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.

Rg1의 투여용량 변화에 따른 BDF1 마우스에 이식한 LLC에 대한 항암효과(단위: 저해율(%))

제제/측정일	22 일	24 일	26 일
SB31	46.4	50.5	41
^h)제제 9	44	40	41
ⁱ⁾제제 10	58	56.4	52.5

^h)제제 9: DPT 10 mg, Rg1 5 mg 및 Gly 3 mg에 4% 트윈 80를 가하여 10 ㎖로 만든 용액

ⁱ⁾제제 10: DPT 10 mg, Rg1 10 mg 및 Gly 3 mg에 4% 트윈 80를 가하여 10 ㎖로 만든 용액

그 결과, Rg1을 10 mg 첨가한 제제 10이 가장 우수한 항암성을 나타내었다. 표 4에서 암괴의 측정일은 22, 24 및 26 일로 표 1, 2 및 3의 실험에 비하여 5 일 늦게 측정하였다. 여기서 특기할 사항은 SB31의 경우 26 일째의 저해율은 40% 수준으로 떨어지는데 비하여 제제 10의 경우에는 52.5%의 우수한 항암성을 유지하였다. 이와 같이 연장된 측정일 22, 24 및 26 일의 저해율이 각각 58%, 56.4% 및 52.5%로 그 감소속도가 완만하였다. 이는 제제 10이 지속성 있는 항암작용을 나타냄을 입증하는 것이다.

본 발명에 따르면, 인삼의 Rg1은 기존의 SB31 제제나 할미꽃 뿌리로부터 분리된 항암성분인 데옥시포도필로톡신의 항암효과를 대폭 증강시킬 수 있을 뿐 아니라, 그 항암효과를 지속화시킬 수 있다.

Claims

할미꽃 뿌리, 인삼 및 감초를 60 ℃ 이하의 온도에서 용매로 추출하고 여과하여 동결건조시켜 얻은 생약 제제; 및 진세노사이드 Rg₁을 50:1의 중량비로 함유하는 항암 조성물.
제1항에 있어서, 진세노사이드 Rg₁이 인삼의 메탄올 추출액으로부터 분리된 것인 조성물.
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1 mg/㎖의 데옥시포도필로톡신, 1 mg/㎖의 진세노사이드 Rg₁, 및 0.3 mg/㎖의 글리시르리진을 함유하는 항암 조성물.
제4항에 있어서, 데옥시포도필로톡신이 할미꽃 뿌리의 메탄올 추출액으로부터 분리된 것인 조성물.
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