CN113817013B - 白木香花抗癌活性部位化学成分的制备方法与其应用 - Google Patents

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Abstract

提供白木香花抗癌活性部位PXS66‑2中的化学成分的提取和鉴定方法和其应用。属于药物技术领域。本发明的方法采用色谱柱层析及半制备高效液相色谱的分离方法，以及质谱和核磁共振波谱的鉴定方法，从PXS66‑2中分离、鉴定出了PFS‑2a(葫芦素E)、PFS‑7(樱花素)、PFS‑8(23,24‑二氢葫芦素E)、PFS‑12(葫芦素B)、PFS‑15(6‑甲氧基‑7‑羟基‑2‑[2‑(4′‑甲氧基苯基)乙基])色酮和新化合物PFS‑11(沉香内酯A)。本发明首次阐明PXS66‑2的主要化学成分，并分离鉴定了新化合物PFS‑11，通过本发明的方法，能简单快速地从白木香花及其抗癌活性部位PXS66‑2中获取上述化学成分，并能用于建立白木香花及其抗癌活性部位PXS66‑2的质量控制标准。

Description

白木香花抗癌活性部位化学成分的制备方法与其应用
技术领域
本发明属于天然产物提取分离技术领域，尤其涉及白木香花抗癌活性部位PXS66-2及其化学成分分离和鉴定方法及其应用。
背景技术
白木香[Aquilariasinensis(Lour.)Spreng.]为瑞香科沉香属植物，其含有树脂的心材，即为中药沉香。目前对白木香心材的研究比较广泛，而对于白木香花的研究较少，除了有一篇文献报道了白木香花的精油中的化学成分外[梅文莉，林峰,戴好富.白木香花和果实挥发油成分的GC-MS分析，热带亚热带植物学报,2009,17(3),305-308]，还没有其它化学成分报道。肺癌是当今世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，且呈逐年上升趋势。肺癌治疗包括手术、放化疗、靶向治疗和支持治疗，化疗是临床治疗肺癌的主要手段之一，但肺癌患者在化疗后出现的不同程度耐药是目前阻碍肿瘤化疗的重要原因，研究克服耐药的有效途径是当前肿瘤治疗迫切需要解决的问题[李全志,刘志强,赵玉霞,孙太振.榄香烯对人肺癌A549细胞系耐顺铂细胞株多药耐药的改善作用及机制研究.浙江中医药大学学报,2021,45(1),16-22；褚文希.徐长卿逆转肿瘤多药耐药作用物质基础研究,青岛大学.2016；姚慧丽.萝藦逆转肿瘤多耐药物质基础研究.青岛大学,2017]。专利“白木香花提取物及其药物与其制备方法和其应用”(申请号：202110731199.5)公开了白木香花PXS66-2部位具有显著抗肿瘤活性，但其化学成分未见报道。阐明PXS66-2的化学物质基础，对建立PXS66-2的质量控制标准，以及基于PXS66-2的新药研制具有重要意义。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述问题，提供了白木香[Aquilariasinensis(Lour.)Spreng.]花抗癌活性部位PXS66-2，以其为活性成分的药物组合物，以及PXS66-2中的化学成分提取和鉴定方法。由于PXS66-2具有显著的抗癌活性，但其化学成分不清楚，没有办法建立质量控制标准。所以，本发明提供了一种PXS66-2分离鉴定方法用于解决这个技术问题。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
白木香花提取物乙酸乙酯萃取部位PXS66-2中提取化合物PFS-2a、PFS-7、PFS-8、PFS-12、PFS-15和PFS-11的方法，该方法包括下述步骤：
一、从白木香花提取乙酸乙酯萃取部位PXS66-2：取白木香干燥的花，粉碎后用90％乙醇，60℃水浴超声提取30min，重复4次，合并过滤，回收溶剂，得浸膏即PXS66；将浸膏用水制成混悬液，用石油醚萃取，回收石油醚，得石油醚萃取部位；石油醚萃取后的水相溶液，继续用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯萃取部位PXS66-2；
二、从乙酸乙酯萃取部位PXS66-2分离提取PFS-2a(葫芦素E)、PFS-7(樱花素)、PFS-8(23,24-dihydrocucurbitacin E)、PFS-12(葫芦素B)、PFS-15{(6-甲氧基-7-羟基-2-[2-(4′-甲氧基苯基)乙基])色酮}和PFS-11(沉香内酯A)：
(1)PXS66-2经硅胶柱层析用1:0，10:1，5:1，3:1，2:1，0:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱划段，得到B1、B2、B3、B4、B5和B6等6个部分；
(2)取B1部分经C18反相硅胶柱层析，5:95→100:0的甲醇-水，得到B1-1、B1-2、B1-3、B1-4、B1-5、B1-6、B1-7、B1-8、B1-9、B1-10、B1-11和B1-12等12个部分；
(3)取B1-6部分，经硅胶柱层析用5:1，4:1，3:1，2:1，1:1，0:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱划段得到B1-6-1、B1-6-2、B1-6-3、B1-6-4、B1-6-5和B1-6-6等6个部分；
(4)取B1-6-1部位甲醇重结晶得到PFS-7；
(5)取B1-6-3部位，过LH-20凝胶柱层析，甲醇洗脱后重结晶得到PFS-8；
(6)取B1-6-4部位甲醇重结晶得到PFS-2a；
(7)取B1-6-4部位甲醇重结晶后剩余样品，过LH-20凝胶柱层析，甲醇洗脱后，得到B1-6-4-1、B1-6-4-2、B1-6-4-3和B1-6-4-4等4个部分；
(8)取B1-6-4-1经半制备HPLC制备后，得到化合物PFS-11、化合物PFS-12；
(9)取B1-6-4-2经半制备HPLC制备后，得到化合物PFS-15；
其中，(3)所述的半制备高效液相色谱是用安捷伦1200液相色谱仪，Ultimate AQ-C18色谱柱，色谱柱大小7.8×250mm，洗脱剂为甲醇-水，比例8:92，流速2mL/min；(8)所述的半制备高效液相色谱是用安捷伦1200液相色谱仪，Ultimate AQ-C18色谱柱，色谱柱大小7.8×250mm，洗脱剂为甲醇-水，比例20:80，流速2mL/min；(9)所述的半制备高效液相色谱是用安捷伦1200液相色谱仪，Ultimate AQ-C18色谱柱，色谱柱大小7.8×250mm，洗脱剂为甲醇-水，比例15:85，流速2mL/min。
白木香花提取部位B-1或B-1-6或B-1-7或B-1-8或B-1-9或B-1-10在制备治疗或预防防肺癌、宫颈癌、人神经母细胞瘤、卵巢癌、白血病、前列腺癌、肝癌、乳腺癌的药物中的应用，其中所述的活性部位B-1或B-1-6或B-1-7或B-1-8或B-1-9或B-1-10是由下述方法制备而得：
(1)白木香花提取物PXS66-2经硅胶柱层析用1:0，10:1，5:1，3:1，2:1，0:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱划段，得到B1、B2、B3、B4、B5和B6等6个部分；
(2)取B1部分经C18反相硅胶柱层析，5:95→100:0的甲醇-水，得到B1-1、B1-2、B1-3、B1-4、B1-5、B1-6、B1-7、B1-8、B1-9、B1-10、B1-11和B1-12等12个部分。
白木香花乙酸乙酯萃取部位PXS66-2中的化合物PFS-2a、PFS-7、PFS-8、PFS-12、PFS-15和PFS-11在制备治疗或预防防肺癌、宫颈癌、人神经母细胞瘤、卵巢癌、白血病、前列腺癌、肝癌、乳腺癌的药物中的应用。
药物组合物，其中含有治疗有效量的白木香花乙酸乙酯萃取部位PXS66-2中的化合物PFS-2a、PFS-7、PFS-8、PFS-12、PFS-15和PFS-11，该6个化合物总含量占药物组合物重量百分比的10-95％，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
药物组合物，其中含有治疗有效量的白木香花提取部位B-1或B-1-6或B-1-7或B-1-8或B-1-9或B-1-10，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
药物组合物，其中含有治疗有效量的白木香花乙酸乙酯萃取部位PXS66-2，以及药学上可接受的载体或赋形剂，该药物组合物按以下的重量百分比进行混合：PXS66-2占20-80％，分散剂2-20％，崩解剂3-5％，乳化剂3-8％，粘结剂0.2-2％，润湿剂0.5-10％，其余为辅料。
白木香花乙酸乙酯萃取部位PXS66-2中的化合物PFS-2a、PFS-7、PFS-8、PFS-12、PFS-15和PFS-11在建立PXS66-2的质量控制标准中的应用，其中该6个化合物总含量占PXS66-2的重量百分比的10-95％。
其中涉及到的6个化合物的结构式如下所示：
Figure BDA0003270815140000041
此外，本发明还提供了如下结构式所示的化合物PFS-11(沉香内酯A)，
Figure BDA0003270815140000042
及其药物组合物，该药物组合物含有治疗有效量的化合物PFS-11，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
化合物PFS-11或含其的药物组合物在制备治疗或预防防肺癌、宫颈癌、人神经母细胞瘤、卵巢癌、白血病、前列腺癌、肝癌、乳腺癌的药物中的应用。
本发明具体地制备方法为：PXS66-2中PFS-2a(葫芦素E)、PFS-7(樱花素)、PFS-8(23,24-dihydrocucurbitacin E)、PFS-12(葫芦素B)、PFS-15{(6-甲氧基-7-羟基-2-[2-(4′-甲氧基苯基)乙基])色酮}和新化合物PFS-11(沉香内酯A)是从白木香花乙酸乙酯部位PXS66-2分离得到，步骤为：
(1)PXS66-2经硅胶柱层析用1:0，10:1，5:1，3:1，2:1，0:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱划段，得到B1、B2、B3、B4、B5和B66等6个部分；
(2)取B1部分经C18反相硅胶柱层析，5:95→100:0的甲醇-水，得到B1-1、B1-2、B1-3、B1-4、B1-5、B1-6、B1-7、B1-8、B1-9、B1-10、B1-11和B1-12等12个部分；
(3)取B1-6部分，经硅胶柱层析用5:1，4:1，3:1，2:1，1:1，0:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱划段得到B1-6-1、B1-6-2、B1-6-3、B1-6-4、B1-6-5和B1-6-6等6个部分；
(4)取B1-6-1部位重结晶得到PFS-7(樱花素，92.2mg)；
(5)取B1-6-3部位，过LH-20凝胶柱层析，甲醇洗脱后重结晶得到PFS-8(23,24-dihydrocucurbitacin E，11.0mg)；
(6)取B1-6-4部位甲醇重结晶得到PFS-2a(葫芦素E，8.9mg)；
(7)取B1-6-4部位甲醇重结晶后剩余样品185.8mg，过LH-20凝胶柱层析，甲醇洗脱后，得到B1-6-4-1、B1-6-4-2、B1-6-4-3和B1-6-4-4等4个部分；
(8)取B1-6-4-1经半制备HPLC制备后，得到化合物PFS-11(沉香内酯A，3.1mg)、化合物PFS-12(葫芦素B，16.6mg)；
(9)取B1-6-4-2经半制备HPLC制备后，得到化合物PFS-15((6-甲氧基-7-羟基-2-[2-(4′-甲氧基苯基)乙基])色酮，2.0mg)；
其中，(3)所述的半制备高效液相色谱是用安捷伦1200液相色谱仪，Ultimate AQ-C18色谱柱，色谱柱大小7.8×250mm，洗脱剂为甲醇-水，比例8:92，流速2mL/min；(8)所述的半制备高效液相色谱是用安捷伦1200液相色谱仪，Ultimate AQ-C18色谱柱，色谱柱大小7.8×250mm，洗脱剂为甲醇-水，比例20:80，流速2mL/min；(9)所述的半制备高效液相色谱是用安捷伦1200液相色谱仪，Ultimate AQ-C18色谱柱，色谱柱大小7.8×250mm，洗脱剂为甲醇-水，比例15:85，流速2mL/min。
该方法从PXS66-2中分离得到6个化合物，通过质谱MS及核磁共振波谱NMR对其进行化学结构的确定。从白木香花乙酸乙酯部位PXS66-2分离得到PFS-2a(葫芦素E)、PFS-7(樱花素)、PFS-8(23,24-dihydrocucurbitacin E)、PFS-12(葫芦素B)、PFS-15{(6-甲氧基-7-羟基-2-[2-(4′-甲氧基苯基)乙基])色酮}和新化合物PFS-11(沉香内酯A)，用于建立PXS66-2的质量控制标准。
本发明将干燥的白木香花，用溶剂提取和萃取，制备得到PXS66-2。PXS66-2对肺癌A549细胞、肺癌NCL-H520细胞、肺癌SPC-A-1细胞和癌症紫衫醇耐药株A549/Taxol细胞均具及其显著的抑制活性(IC50＝0.08μg/mL)。尤其对肺癌紫杉醇耐药株A-549/Taxol的抑制活性高于紫杉醇(IC50＝0.54μg/mL)，且PXS66-2对人正常肺上皮BEAS-2B细胞的毒性(IC50＝4.48μg/mL)弱于紫杉醇(IC50＝1.85μg/mL)。PXS66-2及其所含的化合物不同的组合，提供了新的治疗或预防肿瘤或癌症药物和改善肿瘤或癌症耐药的药物。
本发明提供的药物组合物，包括上述化合物或活性部位和药学上可接受的载体或赋型剂。在本发明中，所述药学上可接受的载体或赋型剂优选为固体、半固体或液体稀释剂，填料以及药物制品辅剂。本发明对所述药学上可接受的载体或赋型剂没有特殊的限定，选用本领域熟知的、对人和动物无毒且惰性的药学上可接受的载体和/或赋型剂即可。
本发明对所述药物组合物的制备方法没有特殊的限定，直接将化合物或活性部位与药学上可接受的载体或赋型剂混合即可，本发明对所述混合的过程没有特殊的限定，选用本领域熟知的过程能够得到药物组合物即可。
本发明此外还提供了上述技术方案所述化合物或活性部位及其药物组合物在制备治疗或预防肝癌的药物中的应用。本发明对所述应用的方法没有特殊的限定，选用本领域熟知的方法即可。
在本发明中，当所述化合物或或活性部位或药物组合物用于制备治疗或预防肝癌药物时，所述组合物在药物中的含量优选为0.1～99％；在所述药物组合物中，所述化合物或活性部位在药物组合物中的含量优选为0.5～90％。本发明的药物组合物优选以单位体重服用量的形式使用。在本发明中，所制备的药物优选可经注射(静注、肌注)和口服两种形式给药。
与现有技术相比，本发明具有下述的优益效果：白木香花提取物，特别是乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位PXS66-2对肺癌紫杉醇耐药株A-549/Taxol的抑制活性高于紫杉醇，且PXS66-2对人正常肺上皮BEAS-2B细胞的毒性弱于紫杉醇。本发明首次阐明了白木香花抗癌活性部位PXS66-2的主要化学成分PFS-2a(葫芦素E)、PFS-7(樱花素)、PFS-8(23,24-二氢葫芦素E)、PFS-12(葫芦素B)、PFS-15(6-甲氧基-7-羟基-2-[2-(4′-甲氧基苯基)乙基])色酮和新化合物PFS-11(沉香内酯A)，并证实了其主要化学成分以及白木香花提取部位B-1或B-1-6或B-1-7或B-1-8或B-1-9或B-1-10对癌症的活性作用，药理试验结果表明，乙酸乙酯萃取部位(PXS-66-2)分段B-1、B-2、B-3、B-4、B-5和B-6对肺癌A549细胞、肺癌NCL-H520细胞、肺癌SPC-A-1细胞和癌症紫衫醇耐药株A549/Taxol细胞均具明显的抑制活性。尤其是B-1对癌症紫衫醇耐药株A549/Taxol细胞(IC50＝0.02μg/mL)的抑制活性高于紫杉醇。活性成分PFS-2a、PFS-11、PFS-12和PFS-15对肺癌A549细胞、肺癌NCL-H520细胞、肺癌SPC-A-1细胞和癌症紫衫醇耐药株A549/Taxol细胞均具及其显著的抑制活性。故此，本发明提供了上述活性部位或活性成分在制备治疗或预防防肺癌、宫颈癌、人神经母细胞瘤、卵巢癌、白血病、前列腺癌、肝癌、乳腺癌的药物中的应用。此外，本发明还首次提供了新化合物PFS-11及其药理作用和其制备方法及在制药中的应用。另外，本发明的活性部位或活性化学成分可以用于制订PXS66-2的质量控制标准。
附图说明
图1PFS-2a、PFS-7、PFS-8、PFS-11、PFS-12和PFS-15的化学结构示意图；
图2化合物PFS-11关键的二维核磁共振相关图；
图3化合物PFS-11计算的和实验的电子圆二色谱(ECD)图。
具体实施方式
下面结合附图，用用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
实施例1
PXS66-2的制备：
白木香[Aquilariasinensis(Lour.)Spreng.]的花干燥后的样品1.15kg，粉碎后用90％乙醇(2L)，60℃水浴超声提取30min，重复4次，合并过滤，回收溶剂，得到浸膏。取浸膏计172.0g，加水(1L)制成混悬液，用石油醚萃取(1L×3)，回收石油醚，得石油醚萃取部位；石油醚萃取后的水相溶液，继续用乙酸乙酯萃取(1L×3)，回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯萃取部位(编号PXS66-2)23.0g。
实施例2：
利用硅胶柱层析对PXS66-2进行分段制备，以及对活性段化学成分的分离：
取重量为23.0g的PXS66-2经硅胶柱层析用用1:0、10:1、5:1、3:1、2:1和0:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱划段，得到B-1(5.3g)、B-2(14.0g)、B-3(2.3g)、B-4(0.05g)、B-5(0.08g)和B-6(0.08g)等6个部分。
取B-1部分5.3g经C18反相硅胶柱层析，5:95→100:0的甲醇-水梯度洗脱，得到B-1-1(0.05g)、B-1-2(0.11g)、B-1-3(0.09g)、B-1-4(0.08g)、B-1-5(0.07g)、B-1-6(1.12g)、B-1-7(0.89g)、B-1-8(0.18g)、B-1-9(0.17g)、B-1-10(0.12g)、B-1-11(0.11g)和B-1-12(0.03g)等12个部分。
取B-1-6部分1.12g，经硅胶柱层析用5:1、4:1、3:1、2:1、1:1和0:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱划段得到B-1-6-1(0.13g)、B-1-6-2(0.04g)、B-1-6-3(0.22g)、B-1-6-4(0.28g)、B-1-6-5(0.22g)和B-1-6-6(0.14g)等6个部分。取B-1-6-1部位131.3mg甲醇重结晶得到PFS-7(樱花素，92.2mg)。取B-1-6-3部位216mg，过LH-20凝胶柱层析，甲醇洗脱后重结晶得到PFS-8(11.0mg)。取B-1-6-4部位281.6mg甲醇重结晶得到PFS-2a(8.9mg)；B-1-6-4结晶后的母液，经过LH-20凝胶柱层析，甲醇洗脱后，得到B-1-6-4-1(33.5mg)、B-1-6-4-2(72.6mg)、B-1-6-4-3(29.5mg)和B-1-6-4-4(16.6mg)等4个部分。取B-1-6-4-1部分33.5mg经半制备HPLC(安捷伦1200，Ultimate AQ-C18色谱柱，φ7.8×250mm；甲醇-水，20:80，流速2mL/min)制备后得到PFS-11(3.1mg，保留时间24.543min)和PFS-12(16.6mg，保留时间28.464min)。取B-1-6-4-2部分72.6mg经半制备HPLC(安捷伦1200，Ultimate AQ-C18色谱柱，φ7.8×250mm；甲醇-水，15:85，流速2mL/min)制备后得到化合物PFS-15(2.0mg，保留时间27.467min)。
实施例3
新化合物沉香内酯A(aquilarolide A，PFS-11)的波谱数据和结构解析：
根据化合物PFS-11的高分辨质谱数据，即HR-ESI-MS m/z 567.2937[M+Na]+(calcd.for C31H44NaO8,567.2934)，推断PFS-11的分子式为C31H44O8，具有10个不饱和度。把该化合物的核磁共振(NMR)数据(表1)跟葫芦烷型三萜进行对比，特别是跟化合物Neocucurbitacin D的NMR数据进行对比[Jiang H-Z,Hu S,Tan R-X,Tan R,Jiao R-H.Neocucurbitacin D,a novel lactone-type norcucurbitacin as xanthine oxidaseinhibitor from Herpetospermum pedunculosum.Natural Product Research,2020,34,1728-1734]，推测PFS-11是一个降葫芦烷三萜的内酯。PFS-11的化学结构式最终通过二维核磁共振相关图谱(图2)分析及电子圆二色谱计算(图3)的方法得到确定，如图1所示。
沉香内酯A(PFS-11)的波谱数据：
沉香内酯A(PFS-11)，白色无定型粉末状；[α]D 24-7.1(c 0.10,MeOH)；ECD(c0.056,MeOH)λmax(Δε)334(-0.22),298(+2.68),219(-1.67),199(+5.67)nm；UV(MeOH)λmax282(2.70),229(3.84)nm；1H NMR和13C NMR数据见表1；ESI-MS m/z 567[M+Na]+；HR-ESI-MS m/z 567.2937[M+Na]+(calcd.for C31H44NaO8,567.2934)。
表1化合物PFS-11的1H NMR和13C NMR数据(δin ppm,J in Hz)
Figure BDA0003270815140000091
实施例4：
化合物PFS-2a、PFS-7、PFS-8、PFS-12和PFS-15的波谱数据。
葫芦素E(cucurbitacin E，PFS-2a)，无定型白色粉末，分子式C32H44O8，CAS登记号18444-66-1。[α]D 27-21.3(c 0.32,CHCl3)；1H NMR(CDCl3,500MHz)δH 7.05(1H,d,J＝15.7Hz,H-24),6.46(1H,d,J＝15.7Hz,H-23),5.95(1H,d,J＝2.7Hz,H-1),5.77(1H,m,H-6),4.37(1H,t,J＝7.8Hz,H-16),3.50(1H,brs,H-10),3.21(1H,d,J＝14.5Hz,H-12α),2.72(1H,d,J＝14.5Hz,H-12β),2.48(1H,d,J＝7.1Hz,H-17),2.01(3H,s,OAc),1.57(3H,s,H3-27),1.54(3H,s,H3-26),1.44(3H,s,H3-19),1.38(3H,s,H3-28),1.36(3H,s,H3-21),1.25(3H,s,H3-29),1.03(3H,s,H3-30),0.99(3H,s,H3-18)；13C NMR(CDCl3,126MHz)δC213.0(C-11),202.6(C-22),198.8(C-3),170.5(-OAc),152.1(C-24),144.7(C-2),136.9(C-5),121.0(C-23),120.5(C-6),115.0(C-1),79.5(C-25),78.3(C-20),71.5(C-16),58.3(C-17),50.8(C-14),49.0(C-9),49.0(C-12),48.3(C-13),47.7(C-4),45.7(C-15),41.7(C-8),34.8(C-10),28.1(C-29),26.6(C-27),26.0(C-26),24.1(C-21),23.7(C-7),22.1(OAc),20.3(C-30),20.2(C-28),20.0(C-18),18.5(C-19)。ESI-MSm/z 579[M+Na]+。其NMR数据跟文献[Maatooq G,El-Sharkawy S,Afifi MS,Rosazza JPN.Microbialtransformation of cucurbitacin E 2-O-β-D-glucopyranoside.Journal of NaturalProducts,1995,58,165-171]中的数据基本一致。
樱花素[sakuranetin，PFS-7]，浅黄色针状结晶，分子式C16H14O5，CAS登记号2957-21-3。[α]D 24-5.4(c 0.16,CHCl3)；1H NMR(CDCl3,500MHz)δH 12.02(1H,s,5-OH),7.31(2H,br d,J＝8.6Hz,H-2′,6′),6.89(2H,d,J＝8.6Hz,H-3′,5′),6.07(1H,d,J＝2.3Hz,H-6),6.04(1H,d,J＝2.3Hz,H-8),5.35(1H,dd,J＝13.0,2.9Hz,H-2),5.25(1H,br s,4′-OH),3.81(3H,s,7-OMe),3.09(1H,dd,J＝17.3,13.0Hz,H-3a),2.79(1H,dd,J＝17.3,2.9,Hz,H-3b)；13C NMR(CDCl3,126MHz)δC196.2(C-4),168.2(C-7),164.3(C-5),163.0(C-8a),156.3(C-4′),130.7(C-1′),128.1(C-2′,C-6′),115.8(C-3′,C-5′),103.3(C-4a),95.3(C-6),94.4(C-8),79.1(C-2),55.9(OMe),43.3(C-3)。ESI-MSm/z 309[M+Na]+。其NMR数据跟文献[Vasconcelos JMJ,Silva AMS,Cavaleiro JAS.Chromones and flavanones fromArtemisia campestris subsp.maritima.Phytochemistry,1998,49,1421-1424]中的数据基本一致。
23,24-二氢葫芦素E(23,24-dihydrocucurbitacin E，PFS-8)，无定型白色粉末，分子式C32H46O8，CAS登记号28973-67-3。[α]D 27-21.2(c 0.23,CHCl3)；1H NMR(CDCl3,500MHz)δH 5.95(1H,d,J＝2.7Hz,H-1),5.77(1H,m,H-6),4.32(1H,m,H-16),3.50(1H,brs,H-10),3.23(1H,d,J＝14.5Hz,H-12α),2.72(1H,d,J＝14.5Hz,H-12β),2.52(1H,d,J＝6.9Hz,H-17),1.96(3H,s,-OAc),1.45(3H,s),1.43(3H,s),1.41(3H,s),1.40(3H,s),1.35(3H,s),1.24(3H,s),1.03(3H,s),0.99(3H,s)；13C NMR(CDCl3,126MHz)δC214.1(C-22),212.9(C-11),198.8(C-3),170.5(-OAc),144.7(C-2),136.9(C-5),120.9(C-6),114.9(C-1),81.4(C-25),79.1(C-20),71.2(C-16),57.9(C-17),50.8(C-14),49.0(C-13),49.0(C-12),48.5(C-9),47.7(C-4),45.8(C-15),41.7(C-8),34.9(C-24),34.8(C-10),30.8(C-22),28.1(C-29),26.3(C-26),26.0(C-27),24.6(C-21),23.7(C-7),22.6(-OAc),20.3(C-28),20.2(C-30),20.0(C-18),18.3(C-19)。ESI-MSm/z 581[M+Na]+。其NMR数据跟文献[Ryu SY,Lee SH,Choi SU,Lee CO,No Z,Ahn JW.Antitumor activity of Trichosantheskirilowii.Archives of Pharmacal Research,1994,17,348-353]中的数据基本一致。
葫芦素B(cucurbitacin B，PFS-12)，无定型白色粉末，分子式C32H46O8，CAS登记号6199-67-3。[α]D 27+80.8(c 0.15,CHCl3)；1H NMR(CDCl3,500MHz)δH 7.05(1H,d,J＝15.6Hz,H-24),6.46(1H,d,J＝15.6Hz,H-23),5.78(1H,m,H-6),4.41(1H,m,H-2),4.35(1H,m,H-16),4.25(1H,s,20-OH),3.60(1H,d,J＝3.8Hz,2-OH),3.23(1H,d,J＝14.5Hz,H-12α),2.73(1H,m,H-10),2.68(1H,d,J＝14.5Hz,H-12β),2.49(1H,d,J＝7.0Hz,H-17),2.40(1H,m,H-7a),2.31(1H,m,H-1a),2.00(3H,s,-OAc),1.97(1H,m,H-7b),1.96(1H,m,H-8),1.87(1H,m,H-15β),1.56(3H,s,H3-26),1.54(3H,s,H3-27),1.43(3H,s,H3-21),1.42(1H,m,H-15α),1.35(3H,s,H3-28),1.33(3H,s,H3-30),1.27(3H,s,H3-29),1.22(1H,m,H-1b),1.07(3H,s,H3-19),0.97(3H,s,H3-18)；13C NMR(CDCl3,126MHz)δC213.2(C-3),212.3(C-11),202.6(C-22),170.4(-OAc),152.1(C-24),140.5(C-5),120.6(C-23),120.4(C-6),79.5(C-25),78.4(C-20),71.8(C-2),71.4(C-16),58.3(C-17),50.8(C-14),50.4(C-4),48.8(C-12),48.6(C-9),48.2(C-13),45.5(C-15),42.5(C-8),36.1(C-1),33.9(C-10),29.5(C-29),26.6(C-26),26.1(C-27),24.1(C-21),24.0(C-7),22.1(-OAc),21.4(C-28),20.2(C-30),20.0(C-18),19.0(C-19)。ESI-MSm/z 581[M+Na]+。该化合物的NMR数据归属得到二维NMR图谱的确认。其NMR数据跟文献[Ryu SY,Lee SH,Choi SU,Lee CO,No Z,Ahn JW.Antitumoractivity of Trichosanthes kirilowii.Archives of Pharmacal Research,1994,17,348-353]中的数据基本一致。
7-羟基-6-甲氧基-2-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]色酮(PFS-15)，淡黄色粉末，分子式C19H18O5，CAS登记号1401718-63-5。1H NMR(CD3OD,500MHz)δH 7.35(1H,s,H-5),7.11(2H,brd,J＝8.6Hz,H-2′,6′),6.81(2H,brd,J＝8.6Hz,H-3′,5′),6.72(1H,s,H-8),5.99(1H,s,H-3),3.92(3H,s,6-OMe),3.74(3H,s,4′-OMe),2.98(2H,m,H-7′),2.91(2H,m,H-8′)；13CNMR(CD3OD,126MHz)δC 179.8(C-4),169.8(C-2),159.7(C-4′),156.1(C-7,detected byHMBC),150.4(C-6/C-8a,detected by HMBC),133.4(C-1′),130.4(C-2′,6′),114.9(C-3′,5′),113.9(C-7,detected by HMBC),109.3(C-3),103.9(C-5),103.9(C-8),55.4(6-OMe),55.6(4′-OMe),37.2(C-8′),33.3(C-7′)。ESI-MSm/z 327[M+H]+,349[M+Na]+,675[2M+Na]+。该化合物的NMR数据归属得到二维NMR图谱的确认。其NMR数据跟文献[Wu B,Kwon SW,HwangGS,Park JH.Eight new 2-(2-phenylethyl)chromone(＝2-(2-phenylethyl)-4H-1-benzopyran-4-one)derivatives from Aquilaria malaccensis agarwood.HelveticaChimica Acta,2012,95,1657-1665]中的数据基本一致。
实施例5：
PXS66-2对肿瘤细胞生长抑制作用。
癌症细胞毒活性测试采用MTS法[Yang J,Su Y,Luo J-F,Gu W,Niu H-M,Li Y,Wang Y-H,Long C-L.New amide alkaloids from Piper longum fruits.NaturalProducts and Bioprospecting,2013,3,277-281]，顺铂和紫杉醇作为阳性对照。细胞毒活性测试结果见表2。结果表明，乙酸乙酯萃取部位(PXS-66-2)对肺癌A549细胞、肺癌NCL-H520细胞、肺癌SPC-A-1细胞和癌症紫衫醇耐药株A549/Taxol细胞均具及其显著的抑制活性(IC50＝0.08μg/mL)。尤其对肺癌紫杉醇耐药株A-549/Taxol的抑制活性高于紫杉醇(IC50＝0.54μg/mL)，且PXS66-2对人正常肺上皮BEAS-2B细胞的毒性(IC50＝4.48μg/mL)弱于紫杉醇(IC50＝1.85μg/mL)。
表2 PXS66-2对癌症细胞的生长抑制活性
Figure BDA0003270815140000121
实施例6：
PXS66-2用硅胶柱层析分段制备后得到的B-1、B-2、B-3、B-4、B-5和B-6对癌症细胞生长的抑制作用。
癌症细胞毒活性测试采用MTS法[Yang J,Su Y,Luo J-F,Gu W,Niu H-M,Li Y,Wang Y-H,Long C-L.New amide alkaloids from Piper longum fruits.NaturalProducts and Bioprospecting,2013,3,277-281]，顺铂和紫杉醇作为阳性对照。细胞毒活性测试结果见表3。结果表明，乙酸乙酯萃取部位(PXS-66-2)分段B-1、B-2、B-3、B-4、B-5和B-6对肺癌A549细胞、肺癌NCL-H520细胞、肺癌SPC-A-1细胞和癌症紫衫醇耐药株A549/Taxol细胞均具明显的抑制活性。尤其是B-1对癌症紫衫醇耐药株A549/Taxol细胞(IC50＝0.02μg/mL)的抑制活性高于紫杉醇，且B-1对人正常肺上皮BEAS-2B细胞的毒性(IC50＝5.54μg/mL)弱于紫杉醇(IC50＝2.04μg/mL)。
表3 B-1、B-2、B-3、B-4、B-5和B-6的对癌症细胞的生长抑制活性
Figure BDA0003270815140000131
实施例6：
活性段B-1用硅胶柱层析分段制备后得到的B-1-1、B-1-2、B-1-3、B-1-4、B-1-5、B-1-6、B-1-7、B-1-8、B-1-9、B-1-10、B-1-11和B-1-12对癌症细胞生长的抑制作用。
癌症细胞毒活性测试采用MTS法[Yang J,Su Y,Luo J-F,Gu W,Niu H-M,Li Y,Wang Y-H,Long C-L.New amide alkaloids from Piper longum fruits.NaturalProducts and Bioprospecting,2013,3,277-281]，顺铂和紫杉醇作为阳性对照。细胞毒活性测试结果见表3。结果表明，Fr.B1分段、B-1-7、B-1-8、B-1-9和B-1-10对肺癌A549细胞、肺癌NCL-H520细胞、肺癌SPC-A-1细胞和癌症紫衫醇耐药株A549/Taxol细胞均具明显的抑制活性。尤其是B-1-6(IC50＝0.02μg/mL)和B-1-7(IC50＝0.02μg/mL)对癌症紫衫醇耐药株A549/Taxol细胞的抑制活性高于紫杉醇(IC50＝0.96μg/mL)，且B-1-6(IC50＝1.34μg/mL)和B-1-7(IC50＝1.42μg/mL)对人正常肺上皮BEAS-2B细胞的毒性弱于紫杉醇(IC50＝1.94μg/mL)。
表4活性段B-1制备后得到的B-1-1至B-1-12对癌症细胞的生长抑制活性
Figure BDA0003270815140000141
实施例7：
化合物PFS-2a、PFS-7、PFS-8、PFS-11、PFS-12和PFS-15对癌症细胞生长的抑制作用。
癌症细胞毒活性测试采用MTS法[Yang J,Su Y,Luo J-F,Gu W,Niu H-M,Li Y,Wang Y-H,Long C-L.New amide alkaloids from Piper longum fruits.NaturalProducts and Bioprospecting,2013,3,277-281]，顺铂和紫杉醇作为阳性对照。细胞毒活性测试结果见表5。
白木香花提取物乙酸乙酯萃取部位(PXS-66-2)及其所分离鉴定出的化合物对肿瘤细胞生长抑制作用的IC50值见表5，其活性显著高于阳性对照顺铂。PFS-2a、PFS-11、PFS-12和PFS-15对肺癌A549细胞、肺癌NCL-H520细胞、肺癌SPC-A-1细胞和癌症紫衫醇耐药株A549/Taxol细胞均具及其显著的抑制活性。尤其是PFS-2a(IC50＝0.001μg/mL)、PFS-11(IC50＝0.11μg/mL)、PFS-12(IC50＝0.04μg/mL)、PFS-15(IC50＝0.26μg/mL)对肺癌紫杉醇耐药株A-549/Taxol的抑制活性高于紫杉醇(IC50＝1.54μg/mL)。
表5.PFS-2a、PFS-6、PFS-7、PFS-8、PFS-11、PFS-12和PFS-15的细胞毒活性
Figure BDA0003270815140000151
实施例8：
制备预防或治疗肿瘤或癌症的药物，按以下的重量百分比进行混合：PXS66-2或B-1或B-1-6或B-1-7或B-1-8或B-1-9或B-1-10或PES-2a或PES-11或PES-12或PES-15占20-80％，分散剂2-20％，崩解剂3-5％，乳化剂3-8％，粘结剂0.2-2％，润湿剂0.5-10％，其余为填料。然后按常规药物制备方法制得有效成分为PXS66-2或B-1或B-1-6或B-1-7或B-1-8或B-1-9或B-1-10或PES-2a或PES-11或PES-12或PES-15的预防或治疗肿瘤或癌症的药物。
制剂实施例：
1.将PXS66-2或B-1或B-1-6或B-1-7或B-1-8或B-1-9或B-1-10或PES-2a或PES-11或PES-12或PES-15中的至少一种或任意组合，用二甲亚砜溶解后，按常规方法加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液，所述注射液的浓度为0.5～5mg/mL。
2.将PXS66-2或B-1或B-1-6或B-1-7或B-1-8或B-1-9或B-1-10或PES-2a或PES-11或PES-12或PES-15中的至少一种或任意组合，用二甲亚砜溶解后，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使其溶解，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封，得粉针剂。
3.将PXS66-2或B-1或B-1-6或B-1-7或B-1-8或B-1-9或B-1-10或PES-2a或PES-11或PES-12或PES-15中的至少一种或任意组合，按其与赋形剂质量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。
4.将PXS66-2或B-1或B-1-6或B-1-7或B-1-8或B-1-9或B-1-10或PES-2a或PES-11或PES-12或PES-15中的至少一种或任意组合，按其与赋形剂质量比为5:1的比例加入赋形剂，制粒压片。
5.将PXS66-2或B-1或B-1-6或B-1-7或B-1-8或B-1-9或B-1-10或PES-2a或PES-11或PES-12或PES-15中的至少一种或任意组合，按常规口服液制备方法制成口服液。
6.将PXS66-2或B-1或B-1-6或B-1-7或B-1-8或B-1-9或B-1-10或PES-2a或PES-11或PES-12或PES-15中的至少一种或任意组合，按其与赋形剂质量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊。
7.将PXS66-2或B-1或B-1-6或B-1-7或B-1-8或B-1-9或B-1-10或PES-2a或PES-11或PES-12或PES-15中的至少一种或任意组合，按其与赋形剂质量比为5:1的比例加入赋形剂，制成颗粒剂。

Claims (5)

1.白木香花提取物乙酸乙酯萃取部位PXS66-2中提取化合物PFS-2a、PFS-7、PFS-8、PFS-12、PFS-15和PFS-11的方法，其特征在于该方法包括下述步骤：
一、从白木香花提取乙酸乙酯萃取部位PXS66-2：取白木香干燥的花，粉碎后用90％乙醇，60℃水浴超声提取30min，重复4次，合并过滤，回收溶剂，得浸膏即PXS66；将浸膏用水制成混悬液，用石油醚萃取，回收石油醚，得石油醚萃取部位；石油醚萃取后的水相溶液，继续用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯萃取部位PXS66-2；
二、从乙酸乙酯萃取部位PXS66-2分离提取PFS-2a(葫芦素E)、PFS-7(樱花素)、PFS-8(23,24-dihydrocucurbitacin E)、PFS-12(葫芦素B)、PFS-15{(6-甲氧基-7-羟基-2-[2-(4′-甲氧基苯基)乙基])色酮}和PFS-11(沉香内酯A)：
(1)PXS66-2经硅胶柱层析用1:0，10:1，5:1，3:1，2:1，0:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱划段，得到B-1、B-2、B-3、B-4、B-5和B-6等6个部分；
(2)取B1部分经C18反相硅胶柱层析，5:95→100:0的甲醇-水，得到B-1-1、B-1-2、B-1-3、B-1-4、B-1-5、B-1-6、B-1-7、B-1-8、B-1-9、B-1-10、B-1-11和B-1-12等12个部分；
(3)取B-1-6部分，经硅胶柱层析用5:1，4:1，3:1，2:1，1:1，0:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱划段得到B-1-6-1、B-1-6-2、B-1-6-3、B-1-6-4、B-1-6-5和B-1-6-6等6个部分；
(4)取B-1-6-1部位甲醇重结晶得到PFS-7；
(5)B-1-6-3部位，过LH-20凝胶柱层析，甲醇洗脱后重结晶得到PFS-8；
(6)取B-1-6-4部位甲醇重结晶得到PFS-2a；
(7)取B-1-6-4部位甲醇重结晶后剩余样品，过LH-20凝胶柱层析，甲醇洗脱后，得到B-1-6-4-1、B-1-6-4-2、B-1-6-4-3和B-1-6-4-4等4个部分；
(8)取B-1-6-4-1经半制备HPLC制备后，得到化合物PFS-11、化合物PFS-12；
(9)取B-1-6-4-2经半制备HPLC制备后，得到化合物PFS-15；
其中，(3)所述的半制备高效液相色谱是用安捷伦1200液相色谱仪，Ultimate AQ-C18色谱柱，色谱柱大小7.8×250mm，洗脱剂为甲醇-水，比例8:92，流速2mL/min；(8)所述的半制备高效液相色谱是用安捷伦1200液相色谱仪，Ultimate AQ-C18色谱柱，色谱柱大小7.8×250mm，洗脱剂为甲醇-水，比例20:80，流速2mL/min；(9)所述的半制备高效液相色谱是用安捷伦1200液相色谱仪，Ultimate AQ-C18色谱柱，色谱柱大小7.8×250mm，洗脱剂为甲醇-水，比例15:85，流速2mL/min。
2.白木香花提取部位B-1或B-1-6或B-1-7或B-1-8或B-1-9或B-1-10在制备治疗或预防防肺癌、宫颈癌、人神经母细胞瘤、卵巢癌、白血病、前列腺癌、肝癌、乳腺癌的药物中的应用，其特征在于所述的活性部位B-1或B-1-6或B-1-7或B-1-8或B-1-9或B-1-10是由下述方法制备而得的：
(1)取白木香干燥的花，粉碎后用90％乙醇，60℃水浴超声提取30min，重复4次，合并过滤，回收溶剂，得浸膏即PXS66；将浸膏用水制成混悬液，用石油醚萃取，回收石油醚，得石油醚萃取部位；石油醚萃取后的水相溶液，继续用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯萃取部位PXS66-2；白木香花提取物PXS66-2经硅胶柱层析用1:0，10:1，5:1，3:1，2:1，0:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱划段，得到B-1、B-2、B-3、B-4、B-5、B-6等6个部分；
(2)取B-1部分经C18反相硅胶柱层析，5:95→100:0的甲醇-水，得到B-1-1、B-1-2、B-1-3、B-1-4、B-1-5、B-1-6、B-1-7、B-1-8、B-1-9、B-1-10、B-1-11和B-1-12部位。
3.如下结构式所示的化合物PFS-11即沉香内酯A，
Figure FDA0004186828510000021
4.药物组合物，其含有治疗有效量的化合物PFS-11，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
5.权利要求3所述的化合物PFS-11或权利要求4所述的药物组合物在制备治疗或预防肺癌、宫颈癌、人神经母细胞瘤、卵巢癌、白血病、前列腺癌、肝癌、乳腺癌的药物中的应用。
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