KR100818689B1 - 간엽계 간세포의 식별방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 간엽계 간세포를 검출, 분리·식별하기 위한 마커 및 상기 마커를 사용한 간엽계 간세포의 검출, 분리·식별방법을 제공하는 것이다. 서열목록에 나타내는 유전자는 간엽계 간세포에서 특이적으로 발현한다. 상기 유전자를 간엽계 간세포 검출용의 마커로서 사용하는 것으로 이루어진다. 또, 본 발명은, 상기 간엽계 간세포 마커 유전자 검출용 프로브 및 상기 간엽계 간세포 유전자 마커의 검출시에, 피검세포의 상기 유전자를 증폭하기 위한 PCR용 프라이머를 포함하며, 또, 본 발명의 간엽계 간세포 마커 유전자가 발현하는 폴리펩티드로 이루어지는 간엽계 간세포 검출용 폴리펩티드 마커, 상기 폴리펩티드 마커를 검출하기 위한 상기 폴리펩티드 마커에 특이적으로 결합하는 항체, 또한 간엽계 간세포 마커 유전자 검출용 프로브, 폴리펩티드 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 사용한 간엽계 간세포의 식별, 분리방법을 포함한다.
간엽계 간세포, 유전자 검출
Description
본 발명은 간엽계(間葉系) 간세포의 검출, 분리·식별에 관한 것이며, 특히 간엽계 간세포를 검출, 분리·식별하는데에 사용하는 간엽계 간세포 검출용 유전자 마커 및 간엽계 간세포 검출용 폴리펩티드마커 및 상기 마커를 사용한 간엽계 간세포의 검출, 식별방법에 관한 것이다.
간엽계 간세포는 포유류의 골수 등에 존재하며, 지방세포, 연골세포, 골세포에 분화하는 다능성(多能性)의 간세포로서 알려져 있다. 간엽계 간세포는 그 분화다능성 때문에, 뼈, 연골, 힘줄, 금육, 지방, 치주조직 등, 많은 조직의 재생의료를 위한 이식(移植)재료로서 주목받고 있다(유전자 의학, Vol.4, No.2(2000) p58-61). 최근에는, 간엽계 간세포연구의 현황과 전망에 대한 총설이 발행되어 간엽계 간세포의 채취나 배양에 관한 연구가 보고되고 있다(실험의학, Vol.19, No.3(2월호)2001, p350-356). 또한, 지방조직에도 간엽계 간세포가 존재한다는 연구결과가 보고되었다. (Tissue Engineering, P.A. Zuk et al., Multilineage cells from human adipose tissue : implications for cell-based therapies. 7:211-228, 2001).
근래에, 간엽계 간세포의 배양, 분화 등에 관하여 몇개의 특허출원이 공개된바 있다. 예를 들면, 일본국 특표 평11-506610호 공보에는, 무혈청 환경하에서 인간의 간엽전구세포의 생존을 유지하는 조성물 및 방법에 대하여, 일본국 특표 평10-512756호 공보에는 간엽계 간세포의 분화를 유도하기 위하여, 프로스타그란딘, 아스코르빈산, 콜라겐세포외기질 등으로 이루어지는 골유도인자, 분화부수인자, 연골유도인자 등의 생물활성인자와 접촉시키는 것에 의하여 이루어지는 방법에 대하여, 일본국 특개2000-217576호 공보에는, 프로락틴 또는 그 동효물(同效物)의 공존하에서 다능성 간엽계 간세포를 배양하고, 간엽계 간세포를 지방세포로 분화시키는 방법에 대하여 각각 발명이 개시되어 있다.
본 발명자는, 앞서 기저막 세포외기질의 존재하에 있어서, 또는 섬유아(纖維芽)세포 증식인자(FGF) 등의 함유배지에서 간엽계 간세포를 배양하는 것에 의하여, 간엽계 간세포를 현저하게 빨리 증식시키고, 또한 그 분화능을 유지할 수 있다는 것을 발견하여, 종래의 배양방법과 비교하여 현저히 많은 간엽계 간세포를 얻는 배양방법을 개시한 바 있다(일본국 특개 2003-52360호 공보). 또, 간엽계 간세포의 채취 시에, 채취모체가 안전하고 또한 채취가 용이한 분리채취를 실시하기 위하여, 구강조직으로부터 간엽계 간세포를 분리채취하는 방법을 개시한 바 있다(일본국 특개 2003-52365호 공보).
최근, 재생의료의 발전과 함께, 간엽계 간세포는 그 분화다능성 때문에, 뼈, 연골, 힘줄, 근육, 지방, 치주조직 등, 많은 조직의 재생의료를 위한 이식재료로서 주목받고 있다. 간엽계 간세포를 조직의 재생의료에 이용하기 위해서는, 우선 이 간세포를 생체조직으로부터 채취하고, 그것을 증식시키고, 다시 그것을 분화증식하여 조직의 조제를 실시하는 일이 필요해진다. 간엽계 간세포는 골수나 골막에 존재하나, 조직재생의료에로의 실용화를 위해서는, 우선 이들 조직으로부터 간엽계 간세포를 안전하고 또한 용이하게 채취하는 방법을 개발하는 것이 필요하다. 그리고, 간엽계 간세포를 조직재생의료에 실용화하기 위해서는, 간엽계 간세포의 충분한 양을 확보하는 기술을 개발하는 것이 필요하다. 그렇게 하기 위해서는, 채취한 간엽계 간세포를 분화능력을 유지한 채로 배양증식시키는 기술을 개발하는 것이 중요하다.
본 발명자는, 상기한 바와 같이 간엽계 간세포의 채취에 있어서, 채취모체에 안전하고 또한 채취가 용이한 분리채취를 실시하기 위한 방법을 개발하였다. 또한 본 발명자는 기저막 세포외기질의 존재하에 있어서, 혹은 섬유아세포 증식인자(FGF) 등의 함유배지에서 간엽계 간세포를 배양하는 것에 의하여, 간엽계 간세포를 그 분화능을 유지한 채 폭발적으로 증식시키는 방법을 개발하였다. 그러나, 배양증식한 간엽계 간세포를 재생의료에 실용화하기 위해서는, 배양한 세포가 간엽계 간세포인 것을 확인할 필요가 있으며, 상기 간엽계 간세포를 검출, 식별하는 방법을 개발하는 것이 필요하다. 종래, 간엽계 간세포에 있어서, 그 세포를 특징짓는 마커유전자의 특정은 행해져 있지 않았다. 따라서, 간엽계 간세포를 특징짖는 마커유전자를 특정하고, 간엽계 간세포를 검출, 분리·식별할 수 있는 방법을 개발하는 것은, 간엽계 간세포를 재생의료에 실용화하는데 있어서 해결되어야 할 중요한 과제 이다.
본 발명은, 간엽계 간세포를 검출, 식별하는 데에 사용하는 간엽계 간세포 검출용 유전자 마커 및 간엽계 간세포 검출용 폴리펩티드마커, 상기 유전자 마커를 검출하기 위한 PCR증폭용 프라이머, 및 상기 마커 및 프라이머를 사용한 간엽계 간세포의 검출과 식별방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명자는, 간엽계 간세포 검출용의 마커가 되는 유전자를 찾아내기 위하여, 간엽계 간세포에 있어서의 여러가지 유전자의 발현에 대한 비교를 실시하고, 마커가 되는 유전자에 대하여 탐색한 결과, 서열목록에 나타내는 13의 유전자에 관하여 간엽계 간세포와 섬유아세포와의 사이의 발현량에 차이가 발견되고, 간엽계 간세포에서 특이적으로 발현하고 있으며, 상기 유전자가 간엽계 간세포 검출용의 마커가 된다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하는데 이르렀다. 본 발명은 상기 간엽계 간세포 마커유전자 검출용 프로브(probe), 및 상기 간엽계 간세포 유전자 마커의 검출에 있어서, 피검세포의 상기 유전자를 증폭하기 위한 PCR용 프라이머를 포함하는 것이다. 또, 본 발명은, 본 발명의 간엽계 간세포 마커유전자가 발현하는 폴리펩티드로 이루어지는 간엽계 간세포 검출용 폴리펩티드마커, 상기 폴리펩티드마커를 검출하기 위한 상기 폴리펩티드마커에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것이다. 또한, 본 발명은, 상기 간엽계 간세포 마커 유전자검출용 프로브, 폴리펩티드마커에 특이적으로 결합하는 항체를 사용한 간엽계 간세포의 식별방법 및 분리방법을 포함하는 것이다.
본원의 발명을 완성하기에 이른 경위에 대하여 설명하면, 각종의 간세포 중 에서도 간엽계 간세포는, 뼈, 연골, 힘줄, 지방, 골격근, 심근, 혈관, 신경 등 많은 조직으로 분화하는 능력을 갖는 것이며, 재생용 세포로서의 기대도 크다. 그러나, 지금까지 간엽계 간세포를 특징짓는 마커유전자는 특정되어 있지 않았었다. 그래서, 본 발명자는, 간엽계 간세포를 특징짓는 마커유전자를 특정하기 위하여, 예의탐색을 실시하였다. 즉, 본 발명자는, 앞서 개발한 골수유래의 간엽계 간세포를 FGF등의 존재하에서 배양하는 것에 의하여, 그 분화능력을 유지한 채 폭발적으로 증식하는 방법을 사용하여 간엽계 간세포를 증식시키고, 이 방법에 의하여 얻은 간엽계 간세포와 인간섬유아세포를 FGF존재하에서 배양하여, 배양세포로부터 mRNA를 추출하고, 그 mRNA를 주형(鑄型)으로 하여 DNA칩(인사이트사 제품)을 프로브로 하여, DNA마이크로어레이법에 의하여 인간유래 간엽계 간세포와 섬유아세포에 발현하는 유전자를 비교하였다.
9400의 유전자 중 63유전자가 간엽계 간세포에 있어서 의미있게 발현이 높고, 141유전자가 의미있게 낮았다. 이 가운데, 발현량의 차가 3배 이상이었던 것은 87유전자(간엽계 간세포에서 높았던 유전자가 29유전자, 낮았던 유전자가 58유전자)였다. 3개체 유래의 간엽계 간세포와 3개체 유래의 섬유아세포로부터 전체 RNA를 추출하고, 이들을 주형으로 사용하여 상기 87유전자에 대하여 반정량적(半定量的) RT-PCR법에 의하여 그 발현량을 조사하였다. 그 결과, 발현량에 차이가 발견되지 않는 유전자가 대부분이었다. 또, 상이하는 개체의 간엽계 간세포, 또는 섬유아세포 사이에서도 발현량에 차이가 있고, 개체의 차이에 의하여 발현이 다르다고 생각되는 것도 많이 있었다.
RT-PCR에 의하여 간엽계 간세포에서 발현이 높은 것이 확인된 유전자는, 3유전자(tissue factor pathway inhibitor 2, major histocompatibility complex class2 DR beta 3, serine (or cysteine) proteinase inhibitor), 낮은 것이 확인된 유전자는 10종류(matrix metalloprotease 1, collagenase type XV alpha, CUG triplet repeat RNA binding protein, dermatopontin, protein tyrosine kinase 7, isocitrate dehydrogenase 2, Sam68-like phosphotyrosine protein, C-type lectin superfamily member 2, adrenomedullin, apolopoprotein D)였다. 이들 13유전자의 발현량을 측정하는 것에 의하여, 판별이 곤란했던 간엽계 간세포의 동정(同定)을 단시간에 또한 낮은 비용으로 실시할 수 있게 되었다. 또한, 본 발명에 있어서, 유전자의 탐색을 실시한 결과, 간엽계 간세포 또는 섬유아세포의 사이에서 발현량에 차이가 있는 많은 유전자를 확인하였다. 이들 유전자는 간엽계 간세포 검출용의 유전자 마커가 되는 것이며, 유전자 검출용 프로브를 구축하여 마이크로어레이 또는 DNA칩 등으로 하여, 간엽계 간세포의 검출에 사용할 수가 있는 것이다.
구체적으로 본 발명은, 서열목록의 서열번호 1, 2, 4, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 19 또는 46에 나타내는 염기서열을 갖는 유전자인 것을 특징으로 하는 간엽계 간세포 검출용 유전자 마커, 유전자 INTEGRIN, ALPHA 6 (ITGA6), MRNA (NM_000210) ; 유전자 SOLUTE CARRIER FAMILY 20 (PHOSPHATE TRANSPORTER), MEMBER 1 (NM_005415) ; 유전자 RIBONUCLEOTIDE REDUCTASE M2 POLYPEPTIDE (RRM2), MRNA (NM_001034) ; 유전자 FOLLISTATIN (FST), TRANSCRIPT VARIANT FST317, MRNA (NM_006350) ; 유전자 SPROUTY (DROSOPHILA) HOMOLOG 2 (SPRY2), MRNA(NM_005842) ; 유전자 RAB3B, MEMBER RAS ONCOGENE FAMILY (RAB3B), MRNA (NM_002867) ; 유전자 SOLUTE CARRIER FAMILY 2 (FACILITATED GLUCOSE TRANSPORTER) (NM_006516) ; 유전자 INTERLEUKIN 13 RECEPTOR, ALPHA 2 (IL13RA2), MRNA (NM_000640) ; 유전자 SERINE/THREONINE KINASE 12 (STK12), MRNA (NM_004217) ; 유전자 MINICHROMOSOME MAINTENANCE DEFICIENT (S. CEREVISIAE) 5 (CE)(NM_006739) ; 유전자 THYROID HORMONE RECEPTOR INTERACTOR 13 (TRIP13), MRNA(NM_004237) ; 유전자 KINESIN-LIKE 6 (MITOTIC CENTROMERE-ASSOCIATED KINESIN) (K)(NM_006845) ; 유전자 CYCLIN-DEPENDENT KINASE INHIBITOR 3 (CDK2-ASSOCIATED DUAL(NM_005192) ; 유전자 CHROMOSOME CONDENSATION PROTEIN G (HCAP-G),MRNA(NM_022346) ; 유전자 CDC28 PROTEIN KINASE 1 (CKS1), MRNA(NM_001826) ; 유전자 PROTEIN REGULATOR OF CYTOKINESIS 1 (PRC1), MRNA(NM_003981) ; 유전자 CELL DIVISION CYCLE 2, G1 TO S AND G2 TO M (CDC2), MRNA(NM_001786) ; 유전자 CDC20 (CELL DIVISION CYCLE 20, S. CEREVISIAE, HOMOLOG) (CD)(NM_001255) ; 유전자 LIKELY ORTHOLOG OF MATERNAL EMBRYONIC LEUCINE ZIPPER KINAS(NM_014791) ; 유전자 MINICHROMOSOME MAINTENANCE DEFICIENT (S. CEREVISIAE) 7 (M)(NM_005916) ; 유전자 CYCLIN A2 (CCNA2), MRNA (NM_001237) ; 유전자 THYMIDINE KINASE 1, SOLUBLE (TK1), MRNA (NM_003258) ; 또는 유전자 cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (melanoma, p16, inhibits CDK4) (CDKN2A), mRNA (NM_000077)인 것을 특징으로 하는 간엽계 간세포 검출용 유전자 마커, 유전자 EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1 (NM_018894) ; 유전자 Human insulin-like growth factor binding protein 5 (IGFBP5) mRNA (AU132011) ; 유전자 Homo sapiens clone 24775 mRNA sequence (AA402981) ; proteoglycan 1, secretory granule (AV734015) ; 유전자 insulin-like growth factor binding protein 5 (AA374325) ; 유전자 solute carrier family 21 (organic anion transporter), member 3 (AF085224) ; 유전 transglutaminase 2 (C polypeptide, protein-glutamine-gamma-glutamyl transferase) (AL552373) ; 유전자 coagulation factor II (thrombin) receptor (M62424) ; 유전자 plasminogen activator, urokinase (NM_002658) ; 유전자 tissue inhibitor of metalloproteinase 3 (Sorsby fundus dystrophy, pseudoinflammatory) (W96324) ; 유전자 matrix Gla protein (BF668572) ; 유전자 B-cell CLL/lymphoma 1 (Z23022) ; 유전자 CD74 antigen (invariant polypeptide of major histocompatibility complex, class II antigen-associated) (BG333618) ; 유전자 adducin 3 (gamma) (AL135243) ; 유전자 solute carrier family 16 (monocarboxylic acid transporters), member 4 (NM_004696) ; 유전자 protein S (alpha) (NM_000313) ; 유전자 phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate 5-phosphatase homolog; phosphatidylinositol polyphosphate 5-phosphatase type IV (AF187891) ; 유전자 progesterone membrane binding protein (BE858855) ; 유전자 brain-derived neurotrophic factor (X60201) ; 또는 유전자 apolipoprotein E (BF967316)인 것을 특징으로 하는 간엽계 간세포 검출용 유전자 마커, 유전자 HOMO SAPIENS WNT INHIBITORY FACTOR-1 (WIF-1), MRNA (NM_007191) ; 유전자 HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ11175 (FLJ11175), MRNA (NM_018349) ; 유전자 HOMO SAPIENS RHO GDP DISSOCIATION INHIBITOR (GDI) BETA (ARHGDIB), MRNA (NM_001175) ; 유전자 HOMO SAPIENS POTASSIUM INTERMEDIATE/SMALL CONDUCTANCE CALCIUM-ACTIVATE (NM_021614) ; 유전자 HOMO SAPIENS NUCLEAR FACTOR (ERYTHROID-DERIVED 2)-LIKE 3 (NFE2L3), MRNA (NM_004289) ; 유전자 HOMO SAPIENS GS3955 PROTEIN (GS3955), MRNA (NM_021643) ; 유전자 HOMO SAPIENS CDNA 3' END SIMILAR TO SIMILAR TO GLYCOPROTEIN MUC18 (AA302605) ; 유전자 HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ21841 (FLJ21841), MRNA (NM_024609) ; 유전자 HOMO SAPIENS ZINC FINGER PROTEIN 185 (LIM DOMAIN) (ZNF185), MRNA (NM_007150) ; 유전자 SC1=PUTATIVE TRANS-ACTING FACTOR INVOLVED IN CELL CYCLE CONTROL [HUMAN, MRNA, 24] (S53374) ; 유전자 HOMO SAPIENS NADH DEHYDROGENASE (UBIQUINONE) 1 ALPHA SUBCOMPLEX, 8 (19K) (NM_014222) ; 유전자 HOMO SAPIENS HOMOLOG OF YEAST MCM10; HYPOTHETICAL PROTEIN PRO2249 (PRO2) (NM_018518) ; 유전자 HOMO SAPIENS COLLAGEN, TYPE VII, ALPHA 1 (EPIDERMOLYSIS BULLOSA, DYSTRO(NM_000094) ; 유전자 HOMO SAPIENS AUTOCRINE MOTILITY FACTOR RECEPTOR (AMFR), MRNA(NM_001144) ; 유전자 HOMO SAPIENS CLONE 24421 MRNA SEQUENCE /CDS=UNKNOWN /GB=AF070641 /GI=3283914 /UG=(AF070641) ; 유전자 HOMO SAPIENS MRNA;유전자 CDNA DKFZP586E1621 (FROM CLONE DKFZP586E1621) /CDS=UNKNOWN /GB(AL080235)인 것을 특징으로 하는 간엽계 간세포 검출용 유전자 마커, 유전자 HOMO SAPIENS RESERVED (KCNK12), MRNA (NM_022055) ; 유전자 HOMO SAPIENS UBIQUITIN-CONJUGATING ENZYME E2C (UBE2C), MRNA(NM_007019) ; 유전자 HOMO SAPIENS CDNA FLJ10517 FIS, CLONE NT2RP2000812 /CDS=(61,918) /GB=AK001379 /G(AK001379) ; 유전자 HOMO SAPIENS CARTILAGE LINKING PROTEIN 1 (CRTL1), MRNA(NM_001884) ; 유전자 HOMO SAPIENS MRNA; CDNA DKFZP434F2322 (FROM CLONE DKFZP434F2322) /CDS=UNKNOWN /GB(AL133105) ; 유전자 HOMO SAPIENS, CLONE MGC:9549 IMAGE:3857382, MRNA, COMPLETE CDS /CDS=(92,1285) /G (BC012453) ; 유전자 HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN DKFZP586J1119 (DKFZP586J1119), MRNA(NM_032270) ; 유전자 HOMO SAPIENS GLIA MATURATION FACTOR, GAMMA (GMFG), MRNA (NM_004877) ; 유전자 HOMO SAPIENS CDNA: FLJ23095 FIS, CLONE LNG07413 /CDS=UNKNOWN /GB=AK026748 /GI=10(AK026748) ; 유전자 HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN DKFZP762E1312 (DKFZP762E1312), MRNA (NM_018410) ; 유전자 HOMO SAPIENS IROQUOIS-CLASS HOMEODOMAIN PROTEIN (IRX-2A), MRNA (NM_005853) ; 또는 유전자 HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ10540 (FLJ10540), MRNA(NM_018131)인 것을 특징으로 하는 간엽계 간세포 검출용 유전자 마커, 유전자 HOMO SAPIENS MRNA; CDNA DKFZP434C1915 (FROM CLONE DKFZP434C1915); PARTIAL CDS /C(AL137698) ; 유전자 HOMO SAPIENS MINICHROMOSOME MAINTENANCE DEFICIENT (S. CEREVISIAE) 7 (M)(NM_005916) ; 유전자 HOMO SAPIENS DYNEIN, CYTOPLASMIC, INTERMEDIATE POLYPEPTIDE 1 (DNCI1), M (NM_004411) ; 유전자 HUMAN MRNA FOR PROTEIN GENE PRODUCT (PGP) 9.5. (X04741) ; 유전자 HOMO SAPIENS RAD51-INTERACTING PROTEIN (PIR51), MRNA (NM_006479) ; 유전자 HOMO SAPIENS BACULOVIRAL IAP REPEAT-CONTAINING 5 (SURVIVIN) (BIRC5), MR (NM_001168) ; 유전자 HOMO SAPIENS UDP-N-ACETYL-ALPHA-D-GALACTOSAMINE:POLYPEPTIDE N-ACETYLGAL (NM_004482) ; 유전자 HOMO SAPIENS CYCLIN B1 (CCNB1), MRNA (NM_031966) ; 유전자 HOMO SAPIENS FLAP STRUCTURE-SPECIFIC ENDONUCLEASE 1 (FEN1), MRNA( NM_004111) ; 유전자 HOMO SAPIENS SERINE/THREONINE KINASE 15 (STK15), MRNA (NM_003600) ; 유전자 HOMO SAPIENS MAD2 (MITOTIC ARREST DEFICIENT, YEAST, HOMOLOG)-LIKE 1 (MA) (NM_002358) ; 유전자 HOMO SAPIENS NUCLEOLAR PROTEIN ANKT (ANKT), MRNA (NM_018454) ; 유전자 HOMO SAPIENS HSPC150 PROTEIN SIMILAR TO UBIQUITIN-CONJUGATING ENZYME (H) (NM_014176) ; 유전자 HOMO SAPIENS CYTOCHROME P450 RETINOID METABOLIZING PROTEIN (P450RAI-2), (NM_019885) 유전자 HOMO SAPIENS NIMA (NEVER IN MITOSIS GENE A)-RELATED KINASE 2 (NEK2), MR（NM_002497）；유전자 HOMO SAPIENS BONE MORPHOGENETIC PROTEIN 4 (BMP4), MRNA（NM_001202）；유전자 HOMO SAPIENS CDNA FLJ10674 FIS, CLONE NT2RP2006436 /CDS=UNKNOWN /GB=AK001536 /GI（AK001536）；또는 유전자 HOMO SAPIENS CENTROMERE PROTEIN A (17KD) (CENPA), MRNA（NM_001809）인 것을 특징으로 하는 간엽계 간세포 검출용 유전자 마커, 유전자 HOMO SAPIENS MRNA; CDNA DKFZP564P116 (FROM CLONE DKFZP564P116) /CDS=UNKNOWN /GB=A（AL049338）；유전자 HOMO SAPIENS TTK PROTEIN KINASE (TTK), MRNA（NM_003318）；유전자 HOMO SAPIENS KARYOPHERIN ALPHA 2 (RAG COHORT 1, IMPORTIN ALPHA 1) (KPNA（NM_002266）；유전자 HOMO SAPIENS POLYMERASE (DNA DIRECTED), THETA (POLQ), MRNA（NM_006596）；유전자 HOMO SAPIENS ETS VARIANT GENE 5 (ETS-RELATED MOLECULE) (ETV5), MRNA（NM_004454）；유전자 HOMO SAPIENS TRANSFORMING, ACIDIC COILED-COIL CONTAINING PROTEIN 3 (TAC)（NM_006342）；유전자 HOMO SAPIENS KINESIN-LIKE 1 (KNSL1), MRNA（NM_004523）；유전자 HOMO SAPIENS CENTROMERE PROTEIN E (312KD) (CENPE), MRNA（NM_001813）；유전자 HOMO SAPIENS CDNA, 3' END /CLONE=IMAGE:1651289 /CLONE_END=3' /GB=AI12（AI123815）；유전자 HOMO SAPIENS DISTAL-LESS HOMEO BOX 5 (DLX5), MRNA（NM_005221）；유전자 HOMO SAPIENS V-MYB AVIAN MYELOBLASTOSIS VIRAL ONCOGENE HOMOLOG-LIKE 2 （NM_002466）；또는 유전자 HOMO SAPIENS SERUM DEPRIVATION RESPONSE (PHOSPHATIDYLSERINE-BINDING PRO（NM_004657）인 것을 특징으로 하는 간엽계 간세포 검출용 유전자 마커, 유전자 HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ10604 (FLJ10604), MRNA（NM_018154）；유전자 HOMO SAPIENS RIBONUCLEASE HI, LARGE SUBUNIT (RNASEHI), MRNA（NM_006397）；유전자 HOMO SAPIENS ANILLIN (DROSOPHILA SCRAPS HOMOLOG), ACTIN BINDING PROTEIN（NM_018685）；유전자 HOMO SAPIENS H4 HISTONE FAMILY, MEMBER G (H4FG), MRNA（NM_003542）；유전자 HOMO SAPIENS G PROTEIN-COUPLED RECEPTOR 37 (ENDOTHELIN RECEPTOR TYPE B-（NM_005302）HOMO SAPIENS UBIQUITIN CARRIER PROTEIN (E2-EPF), MRNA（NM_014501）；유전자 HOMO SAPIENS, SIMILAR TO TUMOR DIFFERENTIALLY EXPRESSED 1, CLONE IMAGE:3639252, （BC007375）；유전자 HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN MGC2577 (MGC2577), MRNA（NM_031299）；유전자 HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ13912 (FLJ13912), MRNA（NM_022770）；유전자 HOMO SAPIENS ANNEXIN A3 (ANXA3), MRNA（NM_005139）；유전자 HOMO SAPIENS STATHMIN 1/ONCOPROTEIN 18 (STMN1), MRNA（NM_005563）HOMO SAPIENS, SIMILAR TO RIBOSOMAL PROTEIN L39, CLONE MGC:20168 IMAGE:4555759, M（BC012328）；유전자 HOMO SAPIENS POLO (DROSOPHIA)-LIKE KINASE (PLK), MRNA（NM_005030）인 것을 특징으로 하는 간엽계 간세포 검출용 유전자 마커, 유전자 HOMO SAPIENS PROTEASOME (PROSOME, MACROPAIN) 26S SUBUNIT, ATPASE, 5 (PS)（NM_002805）；유전자 HOMO SAPIENS EUKARYOTIC TRANSLATION INITIATION FACTOR 4 GAMMA, 2 (EIF4G)（NM_001418）；유전자 HOMO SAPIENS DIHYDROPYRIMIDINASE-LIKE 3 (DPYSL3), MRNA）（NM_001387）；유전자 HOMO SAPIENS ADAPTOR-RELATED PROTEIN COMPLEX 1, SIGMA 2 SUBUNIT (AP1S2)（NM_003916）；유전자 HOMO SAPIENS PLECTIN 1, INTERMEDIATE FILAMENT BINDING PROTEIN, 500KD (P)（NM_000445）；유전자 HOMO SAPIENS HETEROGENEOUS NUCLEAR RIBONUCLEOPROTEIN U (SCAFFOLD ATTAC（NM_031844）；유전자 HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN MGC5306 (MGC5306), MRNA（NM_024116）；유전자 HOMO SAPIENS MHC CLASS I POLYPEPTIDE-RELATED SEQUENCE A (MICA), MRNA（NM_000247）；유전자 HOMO SAPIENS PROTEIN ASSOCIATED WITH PRK1 (AWP1), MRNA（NM_019006）；유전자 HOMO SAPIENS PROGESTERONE RECEPTOR MEMBRANE COMPONENT 2 (PGRMC2), MRNA（NM_006320）；유전자 HOMO SAPIENS POLYGLUTAMINE BINDING PROTEIN 1 (PQBP1), MRNA（NM_005710）；유전자 HOMO SAPIENS S-ADENOSYLMETHIONINE DECARBOXYLASE 1 (AMD1), MRNA（NM_001634）； HOMO SAPIENS INTERFERON-INDUCED, HEPATITIS C-ASSOCIATED MICROTUBULAR AG（NM_006417）；유전자 HOMO SAPIENS PROTEIN KINASE, AMP-ACTIVATED, GAMMA 1 NON-CATALYTIC SUBUN（NM_002733）；HOMO SAPIENS PROCOLLAGEN-PROLINE, 2-OXOGLUTARATE 4-DIOXYGENASE (PROLINE（NM_004199）；유전자 HOMO SAPIENS ENDOTHELIAL DIFFERENTIATION, LYSOPHOSPHATIDIC ACID G-PROTE（NM_012152）；또는 유전자 HOMO SAPIENS KIAA0127 GENE PRODUCT (KIAA0127), MRNA（NM_014755）인 것을 특징으로 하는 간엽계 간세포 검출용 유전자 마커, 상기에 기재된 간엽계 간세포 검출용 마커 유전자와 스트린젠트한 조건(stringent condition) 하에서 하이브리다이즈(hybridige)하는 DNA배열을 갖는 간엽계 간세포 마커 유전자 검출용 프로브, 상기에 기재된 염기서열의 안티센스 사슬의 전부 또는 일부로 이루어지는 상기 간엽계 간세포 마커 유전자 검출용 프로브, 상기에 기재된 DNA의 적어도 1개 이상을 고정화시킨 것을 특징으로 하는 간엽계 간세포 마커 유전자 검출용 마이크로어레이 또는 DNA칩, 서열목록의 서열번호 1, 2, 4, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 19 또는 46에 나타내는 염기서열을 갖는 유전자의 그룹, 및 상기에 기재된 유전자 그룹의 2이상의 유전자를 검출하는 프로브를 고정화시킨 것을 특징으로 하는 간엽계 간세포 마커 유전자 검출용 마이크로어레이 또는 DNA칩, 서열목록의 서열번호 3, 5, 8, 13, 16 또는 18에 나타내는 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 간엽계 간세포 검출용 폴리펩티드 마커, 상기에 기재된 폴리펩티드를 사용하여 유도되며, 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체, 상기 항체가 모노클로널항체인 것을 특징으로 하는 상기에 기재된 항체, 상기 항체가 폴리클로널항체인 것을 특징으로 하는 상기에 기재된 항체로 이루어진다.
또, 본 발명은 피검세포에 있어서의 상기에 기재된 간엽계 간세포 마커 유전자의 발현을 검출하는 것을 특징으로 하는 간엽계 간세포의 식별방법, 간엽계 간세포 마커 유전자 발현의 검출을 노던 블로팅법을 사용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 상기에 기재된 간엽계 간세포의 식별방법, 간엽계 간세포 마커 유전자 발현의 검출을 상기에 기재된 간엽계 간세포 마커 유전자 검출용 프로브를 사용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 상기에 기재된 간엽계 간세포의 식별방법, 간엽계 간세포 마커 유전자 발현의 검출을 상기에 기재된 간엽계 간세포 마커 유전자 검출용 마이크로어레이 또는 DNA칩을 사용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 상기에 기재된 간엽계 간세포의 식별방법, 상기에 기재된 간엽계 간세포 마커 유전자 발현의 검출이, 정량적 또는 반정량적 PCR의 사용을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 간엽계 간세포의 식별방법, 정량적 또는 반정량적 PCR의 사용이 RT-PCR법인 것을 특징으로 하는 상기에 기재된 간엽계 간세포의 식별방법으로 이루어진다.
또한, 본 발명은, 서열목록의 서열번호20에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호21에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호22에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호23에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호24에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호25에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호26에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호27에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호28에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호29에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호30에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호31에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호32에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호33에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호34에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호35에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호36에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호37에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호38에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호39에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호40에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호41에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호42에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호43에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 또는 서열목록의 서열번호44에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호45에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머로 이루어지는 간엽계 간세포 마커 유전자 증폭을 위한 RT-PCR용 프라이머, 서열목록의 서열번호47에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호48에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호49에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호50에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호51에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호52에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호53에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호54에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호55에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호56에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호57에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호58에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호59에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호60에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호61에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호62에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호63에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호64에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호65에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호66에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호67에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호68에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 또는 서열목록의 서열번호69에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호70에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머로 이루어지는 간엽계 간세포 마커 유전자 증폭을 위한 실시간 PCR용 프라이머, 서열목록의 서열번호71에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호72에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호73에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호74에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호75에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열목록의 서열번호76에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호77에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호78에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호79에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호80에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호81에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호82에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호83에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호84에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호85에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호86에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호87에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호88에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호89에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호90에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호91에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호92에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호93에 나타내는 염기서열은 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호94에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호95에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호96에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호97에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호98에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호99에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호 100에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호101에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호102에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호103에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호104에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호105에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호106에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호107에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호108에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호109에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호110에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호111에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호112에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호113에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호114에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 또는 서열목록의 서열번호115에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호116에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머로 이루어지는 간엽계 간세포 마커 유전자 증폭을 위한 RT-PCR용 프라이머로 이루어진다.
또, 본 발명은 피검세포에 있어서의 유전자를, 상기에 기재된 센스프라이머 및 안티센스프라이머의 적어도 1쌍 이상의 프라이머를 사용하여 증폭하며, 증폭한 유전자를 상기에 기재된 간엽계 간세포 마커 유전자 검출용 프로브를 사용하여 검출하는 것을 특징으로 하는 상기에 기재된 간엽계 간세포의 식별방법, 상기에 기재된 항체를 사용하여 피검세포에 있어서의 간엽계 간세포 마커 폴리펩티드의 발현을 검출하는 것을 특징으로 하는 간엽계 간세포의 식별방법, 피검세포에 있어서의 서열목록의 서열번호 1, 11 및 19로 이루어지는 간엽계 간세포 마커 유전자 그룹의 1유전자 이상의 발현과, 서열목록의 서열번호 2, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 14, 15 및 17로 이루어지는 간엽계 간세포 마커 유전자 그룹의 1유전자 이상의 발현을 조합하여 평가하는 것을 특징으로 하는 간엽계 간세포의 식별방법, 상기에 기재된 간엽계 간세포 마커 유전자 검출용 프로브 및/또는 상기에 기재된 항체를 사용하여 피검세포에 있어서의 간엽계 간세포 검출용 마커 유전자 및/또는 간엽계 간세포 검출용 마커 폴리펩티드의 발현을 검출하며, 식별한 간엽계 간세포를 분리하는 것을 특징으로 하는 간엽계 간세포의 식별분리방법, 상기에 기재된 항체를 사용한 형광항체법에 의하여 피검세포 중에 있어서의 간엽계 간세포를 표지화하고, 상기 표지화한 간엽계 간세포를 분리하는 것을 특징으로 하는 상기에 기재된 간엽계 간세포의 식별분리방법, 상기에 기재된 간엽계 간세포 마커 유전자 검출용 프로브, 상기 프로브를 고정한 상기에 기재된 간엽계 간세포 마커 유전자 검출용 마이크로어레이 또는 DNA칩, 및 상기에 기재된 항체의 적어도 하나 이상을 장비하여 이루어지는 간엽계 간세포의 식별용 키트로 이루어진다.
도1은, 본 발명의 실시예에 있어서, 반정량적 RT-PCR법에 의하여, 인간 간엽계 간세포 또는 인간 섬유아세포의 사이에서, 개체에 의한 불규칙성이 큰 유전자를 나타내는 도면.
도2는, 본 발명의 실시예에 있어서, 반정량적 RT-PCR에 의하여 MSC에서 발현이 높았던 유전자를 나타내는 도면.
도3은, 본 발명의 실시예에 있어서, 반정량적 RT-PCR에 의하여 MSC에서 발현이 낮았던 유전자를 나타내는 도면.
도4는, 간엽계 간세포에서 발현이 높음/낮음이 확인된 13유전자에 대하여, 7개체 유래의 간엽계 간세포와 4개체 유래의 섬유아세포로부터 추출한 전(全) RNA를 주형으로 한 반정량적 RT-PCR법에 의하여, 그 발현량의 확인을 실시한 결과를 나타내는 도면.
도5는, 본 발명의 실시예에 있어서, 간엽계 간세포와 섬유아세포에 있어서의 본 발명의 마커 유전자의 발현상황을 시험한 결과를 나타내는 도면.
도6은, 본 발명의 실시예에 있어서, 간엽계 간세포와 골아세포에 있어서의 각 마커 유전자의 디퍼렌셜한 유전자 발현의 상황을 나타내는 도면.
도7은, 본 발명의 실시예에 있어서, 간엽계 간세포와 골아세포에 있어서의 각 마커 유전자의 디퍼렌셜한 유전자 발현의 상황을 나타내는 도면.
도8은, 본 발명의 실시예에 있어서, 간엽계 간세포와 골아세포에 있어서의 각 마커 유전자의 디퍼렌셜한 유전자 발현의 상황을 나타내는 도면.
도9는, 본 발명의 실시예에 있어서, 각 마커 유전자에 대하여 간엽계 간세포와 인간섬유아세포에 있어서의 유전자 발현의 상황을 나타내는 도면.
도10은 본 발명의 실시예에 있어서, 각 마커 유전자에 대하여 간엽계 간세포와 인간섬유아세포에 있어서의 유전자 발현의 상황을 나타내는 도면.
도11은, 본 발명의 실시예에 있어서, 인간세포에 있어서의 간엽계 간세포 DR의 발현을 플로 사이토메트리(flow cytometry)를 사용하여 측정한 결과를 나타내는 도면.
도12는, 본 발명의 실시예에 있어서, 간엽계 간세포의 골아세포에로의 분화유도에 있어서의 각 유전자 발현의 상황을 측정한 결과를 나타내는 도면.
도13은, 본 발명의 실시예에 있어서, 각 마커 유전자에 대하여 골분화유도 4일~28일에서의 유전자 발현의 변화를 나타내는 도면.
도14는, 본 발명의 실시예에 있어서, 각 마커 유전자에 대하여 골분화유도 4일~28일에서의 유전자 발현의 변화를 나타내는 도면.
도15는, 본 발명의 실시예에 있어서, 각 마커 유전자에 대하여 골분화유도 4일~28일에서의 유전자 발현의 변화를 나타내는 도면.
도16은, 본 발명의 실시예에 있어서, 각 마커 유전자에 대하여 골분화유도 4 일~28일에서의 유전자 발현의 변화를 나타내는 도면.
본 발명은, 간엽계 간세포에서 특이적으로 발현하는 간엽계 간세포 검출용 마커 유전자 또는 간엽계 간세포 검출용 마커 폴리펩티드의 발현을 검출하여 간엽계 간세포의 식별을 실시하는 것에 의하여 이루어진다. 본 발명에 있어서, 간엽계 간세포 검출용 유전자 마커가 되는 유전자는, 서열목록의 서열번호 1, 2, 4, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17 또는 19에 나타내는 염기서열을 갖는 유전자이다.
또한, 본 발명에 있어서, 간엽계 간세포 검출용의 폴리펩티드 마커가 되는 폴리펩티드는, 서열목록의 서열번호 3, 5, 8, 13, 16 또는 18에 나타내는 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드이다.
서열목록의 서열번호1에 나타나는 유전자는［serine (or cysteine) proteinase inhibitor］의 유전자이며, 서열목록의 서열번호2에 나타내는 유전자는［adrenomedullin］의 유전자이며, 서열목록의 서열번호4에 나타내는 유전자는［apolopoprotein D］의 유전자이며, 서열목록의 서열번호6에 나타내는 유전자는［collagenase type XV alpha 1］의 유전자이며, 서열목록의 서열번호7에 나타내는 유전자는［CUG triplet repeat RNA binding protein2］의 유전자이며, 서열목록의 서열번호9에 나타내는 유전자는［dermatopontin］의 유전자이며, 서열목록의 서열번호10에 나타내는 유전자는［isocitrate dehydrogenase 2］의 유전자이며, 서열목록의 서열번호11에 나타내는 유전자는［major histocompatibility complex class2, DR beta 3］의 유전자이며, 서열목록의 서열번호12에 나타내는 유전자는［protein tyrosine kinase 7］의 유전자이며, 서열목록의 서열번호14에 나타내는 유전자는［Sam68-like phosphotyrosine protein］의 유전자이며, 서열목록의 서열번호15에 나타내는 유전자는［C-type lectin superfamily member 2］의 유전자이며, 서열목록의 서열번호17에 나타내는 유전자는［matrix metalloprotease 1］의 유전자이며, 또, 서열목록의 서열번호19에 나타내는 유전자는［tissue factor pathway inhibitor 2］의 유전자이며, 서열목록의 서열번호46에 나타내는 유전자는［major histocompatibility complex DR alpha］의 유전자이다.
본 발명의 간엽계 간세포 검출용 마커유전자의 DNA배열정보는, NCBI유전자 데이터 베이스에 있어서, 각각 액세션넘버:ＡＩ１３３６１３(서열번호1), ＮＭ＿００１１２４(서열번호2), ＮＭ＿００１６４７（서열번호４）、Ｌ０１６９７（서열번호６）、Ｕ６９５４６（서열번호７）、ＡＷ０１６４５１（서열번호９）、ＡＬ５４５９５３（서열번호１０）、ＢＦ７３２８２２（서열번호１１）、ＡＬ１５７４８６（서열번호１２）、ＡＡ１１２００１（서열번호１４）、ＸＭ＿００６６２６（서열번호１５）、ＮＭ＿００２４２１（서열번호１７）、ＡＬ５５０３５７（서열번호１９）、및 ＢＦ７９５９２９(서열번호４６)에 의하여 접근할 수가 있다.
또한 본 발명에 있어서 확인된, 섬유아세포에 비교하여, 간엽계 간세포에서 다량으로 발현하고 있는 유전자로서는, 이하의 것을 들 수 있다 :
유전자 INTEGRIN, ALPHA 6 (ITGA6), MRNA（NM_000210）；유전자 SOLUTE CARRIER FAMILY 20 (PHOSPHATE TRANSPORTER)、MEMBER 1（NM_005415）；유전자 RIBONUCLEOTIDE REDUCTASE M2 POLYPEPTIDE (RRM2), MRNA（NM_001034）；유전자 FOLLISTATIN (FST), TRANSCRIPT VARIANT FST317, MRNA（NM_006350）；유전자 SPROUTY (DROSOPHILA) HOMOLOG 2 (SPRY2), MRNA（NM_005842）；유전자 RAB3B, MEMBER RAS ONCOGENE FAMILY (RAB3B), MRNA（NM_002867）；유전자 SOLUTE CARRIER FAMILY 2 (FACILITATED GLUCOSE TRANSPORTER)（NM_006516）；유전자 INTERLEUKIN 13 RECEPTOR, ALPHA 2 (IL13RA2), MRNA（NM_000640）；유전자 SERINE/THREONINE KINASE 12 (STK12), MRNA（NM_004217）；유전자 MINICHROMOSOME MAINTENANCE DEFICIENT (S. CEREVISIAE) 5 (CE)（NM_006739）；유전자 THYROID HORMONE RECEPTOR INTERACTOR 13 (TRIP13), MRNA（NM_004237）；유전자 KINESIN-LIKE 6 (MITOTIC CENTROMERE-ASSOCIATED KINESIN) (K)（NM_006845）；유전자 CYCLIN-DEPENDENT KINASE INHIBITOR 3 (CDK2-ASSOCIATED DUAL（NM_005192）；유전자 CHROMOSOME CONDENSATION PROTEIN G (HCAP-G),MRNA（NM_022346）；유전자 CDC28 PROTEIN KINASE 1 (CKS1), MRNA（NM_001826）；유전자 PROTEIN REGULATOR OF CYTOKINESIS 1 (PRC1), MRNA（NM_003981）；유전자 CELL DIVISION CYCLE 2, G1 TO S AND G2 TO M (CDC2), MRNA（NM_001786）；유전자 CDC20 (CELL DIVISION CYCLE 20, S. CEREVISIAE, HOMOLOG) (CD)（NM_001255）；유전자 LIKELY ORTHOLOG OF MATERNAL EMBRYONIC LEUCINE ZIPPER KINAS（NM_014791）；유전자 MINICHROMOSOME MAINTENANCE DEFICIENT (S. CEREVISIAE) 7 (M)（NM_005916）；유전자 CYCLIN A2 (CCNA2), MRNA（NM_001237）；유전자 THYMIDINE KINASE 1, SOLUBLE (TK1), MRNA（NM_003258）；또는 유전자 cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (melanoma, p16, inhibits CDK4) (CDKN2A), mRNA（NM_000077）。
유전자 EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1（NM_018894）；유전자 Human insulin-like growth factor binding protein 5 (IGFBP5) mRNA（AU132011）；유전자 Homo sapiens clone 24775 mRNA sequence（AA402981）；proteoglycan 1, secretory granule（AV734015）；유전자 insulin-like growth factor binding protein 5（AA374325）；유전자 solute carrier family 21 (organic anion transporter), member 3（AF085224）；유전 transglutaminase 2 (C polypeptide, protein-glutamine-gamma-glutamyl transferase)（AL552373）；유전자 coagulation factor II (thrombin) receptor（M62424）；유전자 plasminogen activator, urokinase（NM_002658）；유전자 tissue inhibitor of metalloproteinase 3 (Sorsby fundus dystrophy, pseudoinflammatory)（W96324）；유전자 matrix Gla protein（BF668572）；유전자 B-cell CLL/lymphoma 1（Z23022）；유전자 CD74 antigen (invariant polypeptide of major histocompatibility complex, class II antigen-associated)（BG333618）；유전자 adducin 3 (gamma)（AL135243）；유전자 solute carrier family 16 (monocarboxylic acid transporters), member 4（NM_004696）；유전자 protein S (alpha)（NM_000313）；유전자 phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate 5-phosphatase homolog; phosphatidylinositol polyphosphate 5-phosphatase type IV（AF187891）；유전자 progesterone membrane binding protein（BE858855）；유전자 brain-derived neurotrophic factor（X60201）；또는 유전자 apolipoprotein E（BF967316）。
유전자 HOMO SAPIENS WNT INHIBITORY FACTOR-1 (WIF-1), MRNA（NM_007191）；유전자 HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ11175 (FLJ11175), MRNA（NM_018349）；유전자 HOMO SAPIENS RHO GDP DISSOCIATION INHIBITOR (GDI) BETA (ARHGDIB), MRNA（NM_001175）；유전자 HOMO SAPIENS POTASSIUM INTERMEDIATE/SMALL CONDUCTANCE CALCIUM-ACTIVATE（NM_021614）；유전자 HOMO SAPIENS NUCLEAR FACTOR (ERYTHROID-DERIVED 2)-LIKE 3 (NFE2L3), MRNA（NM_004289）；유전자 HOMO SAPIENS GS3955 PROTEIN (GS3955), MRNA（NM_021643）；유전자 HOMO SAPIENS CDNA 3' END SIMILAR TO SIMILAR TO GLYCOPROTEIN MUC18（AA302605）；유전자 HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ21841 (FLJ21841), MRNA（NM_024609）；유전자 HOMO SAPIENS ZINC FINGER PROTEIN 185 (LIM DOMAIN) (ZNF185), MRNA（NM_007150）；유전자 SC1=PUTATIVE TRANS-ACTING FACTOR INVOLVED IN CELL CYCLE CONTROL [HUMAN, MRNA, 24]（S53374）；유전자 HOMO SAPIENS NADH DEHYDROGENASE (UBIQUINONE) 1 ALPHA SUBCOMPLEX, 8 (19K)（NM_014222）；유전자 HOMO SAPIENS HOMOLOG OF YEAST MCM10; HYPOTHETICAL PROTEIN PRO2249 (PRO2)（NM_018518）；유전자 HOMO SAPIENS COLLAGEN, TYPE VII, ALPHA 1 (EPIDERMOLYSIS BULLOSA, DYSTRO（NM_000094）；유전자 HOMO SAPIENS AUTOCRINE MOTILITY FACTOR RECEPTOR (AMFR), MRNA（NM_001144）；유전자 HOMO SAPIENS CLONE 24421 MRNA SEQUENCE /CDS=UNKNOWN /GB=AF070641 /GI=3283914 /UG=（AF070641）；유전자 HOMO SAPIENS MRNA ; 유전자 CDNA DKFZP586E1621 (FROM CLONE DKFZP586E1621) /CDS=UNKNOWN /GB（AL080235）。
유전자 HOMO SAPIENS RESERVED (KCNK12), MRNA（NM_022055）；유전자 HOMO SAPIENS UBIQUITIN-CONJUGATING ENZYME E2C (UBE2C), MRNA（NM_007019）；유전자 HOMO SAPIENS CDNA FLJ10517 FIS, CLONE NT2RP2000812 /CDS=(61,918) /GB=AK001379 /G（AK001379）；유전자 HOMO SAPIENS CARTILAGE LINKING PROTEIN 1 (CRTL1), MRNA（NM_001884）；유전자 HOMO SAPIENS MRNA; CDNA DKFZP434F2322 (FROM CLONE DKFZP434F2322) /CDS=UNKNOWN /GB（AL133105）；유전자 HOMO SAPIENS, CLONE MGC:9549 IMAGE:3857382, MRNA, COMPLETE CDS /CDS=(92,1285) /G（BC012453）；유전자 HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN DKFZP586J1119 (DKFZP586J1119), MRNA（NM_032270）；유전자 HOMO SAPIENS GLIA MATURATION FACTOR, GAMMA (GMFG), MRNA（NM_004877）；유전자 HOMO SAPIENS CDNA: FLJ23095 FIS, CLONE LNG07413 /CDS=UNKNOWN /GB=AK026748 /GI=10（AK026748）；유전자 HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN DKFZP762E1312 (DKFZP762E1312), MRNA（NM_018410）；유전자 HOMO SAPIENS IROQUOIS-CLASS HOMEODOMAIN PROTEIN (IRX-2A), MRNA（NM_005853）；또는 유전자 HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ10540 (FLJ10540), MRNA（NM_018131）。
유전자 HOMO SAPIENS MRNA; CDNA DKFZP434C1915 (FROM CLONE DKFZP434C1915); PARTIAL CDS /C（AL137698）；유전자 HOMO SAPIENS MINICHROMOSOME MAINTENANCE DEFICIENT (S. CEREVISIAE) 7 (M)（NM_005916）；유전자 HOMO SAPIENS DYNEIN, CYTOPLASMIC, INTERMEDIATE POLYPEPTIDE 1 (DNCI1), M（NM_004411）；유전자 HUMAN MRNA FOR PROTEIN GENE PRODUCT (PGP) 9.5.（X04741） ；유전자 HOMO SAPIENS RAD51-INTERACTING PROTEIN (PIR51), MRNA（NM_006479）；유전자 HOMO SAPIENS BACULOVIRAL IAP REPEAT-CONTAINING 5 (SURVIVIN) (BIRC5), MR（NM_001168）；유전자 HOMO SAPIENS UDP-N-ACETYL-ALPHA-D-GALACTOSAMINE:POLYPEPTIDE N-ACETYLGAL（NM_004482）；유전자 HOMO SAPIENS CYCLIN B1 (CCNB1), MRNA（NM_031966）；유전자 HOMO SAPIENS FLAP STRUCTURE-SPECIFIC ENDONUCLEASE 1 (FEN1), MRNA（NM_004111）；유전자 HOMO SAPIENS SERINE/THREONINE KINASE 15 (STK15), MRNA（NM_003600）；유전자 HOMO SAPIENS MAD2 (MITOTIC ARREST DEFICIENT, YEAST, HOMOLOG)-LIKE 1 (MA)（NM_002358）；유전자 HOMO SAPIENS NUCLEOLAR PROTEIN ANKT (ANKT), MRNA（NM_018454）；유전자 HOMO SAPIENS HSPC150 PROTEIN SIMILAR TO UBIQUITIN-CONJUGATING ENZYME (H)（NM_014176）；유전자 HOMO SAPIENS CYTOCHROME P450 RETINOID METABOLIZING PROTEIN (P450RAI-2),（NM_019885）；유전자 HOMO SAPIENS NIMA (NEVER IN MITOSIS GENE A)-RELATED KINASE 2 (NEK2), MR（NM_002497）；유전자 HOMO SAPIENS BONE MORPHOGENETIC PROTEIN 4 (BMP4), MRNA（NM_001202）；유전자 HOMO SAPIENS CDNA FLJ10674 FIS, CLONE NT2RP2006436 /CDS=UNKNOWN /GB=AK001536 /GI（AK001536）；또는 유전자 HOMO SAPIENS CENTROMERE PROTEIN A (17KD) (CENPA), MRNA（NM_001809）。
유전자 HOMO SAPIENS MRNA; CDNA DKFZP564P116 (FROM CLONE DKFZP564P116) /CDS=UNKNOWN /GB=A（AL049338）；유전자 HOMO SAPIENS TTK PROTEIN KINASE (TTK), MRNA（ NM_003318）；유전자 HOMO SAPIENS KARYOPHERIN ALPHA 2 (RAG COHORT 1, IMPORTIN ALPHA 1) (KPNA（NM_002266）；유전자 HOMO SAPIENS POLYMERASE (DNA DIRECTED), THETA (POLQ), MRNA（NM_006596）；유전자 HOMO SAPIENS ETS VARIANT GENE 5 (ETS-RELATED MOLECULE) (ETV5), MRNA（NM_004454）；유전자 HOMO SAPIENS TRANSFORMING, ACIDIC COILED-COIL CONTAINING PROTEIN 3 (TAC)（NM_006342）；유전자 HOMO SAPIENS KINESIN-LIKE 1 (KNSL1), MRNA（NM_004523）；유전자 HOMO SAPIENS CENTROMERE PROTEIN E (312KD) (CENPE), MRNA（NM_001813）；유전자 HOMO SAPIENS CDNA, 3' END /CLONE=IMAGE:1651289 /CLONE_END=3' /GB=AI12（AI123815）；유전자 HOMO SAPIENS DISTAL-LESS HOMEO BOX 5 (DLX5), MRNA（ NM_005221）；유전자 HOMO SAPIENS V-MYB AVIAN MYELOBLASTOSIS VIRAL ONCOGENE HOMOLOG-LIKE 2 （ NM_002466）；또는 유전자 HOMO SAPIENS SERUM DEPRIVATION RESPONSE (PHOSPHATIDYLSERINE-BINDING PRO（NM_004657）。
유전자 HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ10604 (FLJ10604), MRNA（NM_018154）；유전자 HOMO SAPIENS RIBONUCLEASE HI, LARGE SUBUNIT (RNASEHI), MRNA（NM_006397）；유전자 HOMO SAPIENS ANILLIN (DROSOPHILA SCRAPS HOMOLOG), ACTIN BINDING PROTEIN（NM_018685）；유전자 HOMO SAPIENS H4 HISTONE FAMILY, MEMBER G (H4FG), MRNA（NM_003542）；유전자 HOMO SAPIENS G PROTEIN-COUPLED RECEPTOR 37 (ENDOTHELIN RECEPTOR TYPE B-（NM_005302）HOMO SAPIENS UBIQUITIN CARRIER PROTEIN (E2-EPF), MRNA（NM_014501）；유전자 HOMO SAPIENS, SIMILAR TO TUMOR DIFFERENTIALLY EXPRESSED 1, CLONE IMAGE:3639252, （BC007375）；유전자 HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN MGC2577 (MGC2577), MRNA（NM_031299）；유전 자 HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ13912 (FLJ13912), MRNA（NM_022770）；유전자 HOMO SAPIENS ANNEXIN A3 (ANXA3), MRNA（NM_005139）；유전자 HOMO SAPIENS STATHMIN 1/ONCOPROTEIN 18 (STMN1), MRNA（NM_005563）HOMO SAPIENS, SIMILAR TO RIBOSOMAL PROTEIN L39, CLONE MGC:20168 IMAGE:4555759, M（BC012328）；유전자 HOMO SAPIENS POLO (DROSOPHIA)-LIKE KINASE (PLK), MRNA（NM_005030）인 것을 특징으로 하는 간엽계 간세포 검출용 유전자 마커.
또, 본 발명에 있어서 확인된, 섬유아세포에 비교하여, 간엽계 간세포에서 발현하고 있지 않거나 또는 극히 소량만 발현하고 있는 유전자로서는 이하의 것을 들 수 있다：
유전자 HOMO SAPIENS PROTEASOME (PROSOME, MACROPAIN) 26S SUBUNIT, ATPASE, 5 (PS)（NM_002805）；유전자 HOMO SAPIENS EUKARYOTIC TRANSLATION INITIATION FACTOR 4 GAMMA, 2 (EIF4G)（NM_001418）；유전자 HOMO SAPIENS DIHYDROPYRIMIDINASE-LIKE 3 (DPYSL3), MRNA）（NM_001387）；유전자 HOMO SAPIENS ADAPTOR-RELATED PROTEIN COMPLEX 1, SIGMA 2 SUBUNIT (AP1S2)（NM_003916）；유전자 HOMO SAPIENS PLECTIN 1, INTERMEDIATE FILAMENT BINDING PROTEIN, 500KD (P)（ NM_000445）；유전자 HOMO SAPIENS HETEROGENEOUS NUCLEAR RIBONUCLEOPROTEIN U (SCAFFOLD ATTAC（NM_031844）；유전자 HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN MGC5306 (MGC5306), MRNA（NM_024116）；유전자 HOMO SAPIENS MHC CLASS I POLYPEPTIDE-RELATED SEQUENCE A (MICA), MRNA（NM_000247）；유전자 HOMO SAPIENS PROTEIN ASSOCIATED WITH PRK1 (AWP1), MRNA（NM_019006）；유전자 HOMO SAPIENS PROGESTERONE RECEPTOR MEMBRANE COMPONENT 2 (PGRMC2), MRNA（NM_006320）；유전자 HOMO SAPIENS POLYGLUTAMINE BINDING PROTEIN 1 (PQBP1), MRNA（NM_005710）；유전자 HOMO SAPIENS S-ADENOSYLMETHIONINE DECARBOXYLASE 1 (AMD1), MRNA（NM_001634）； HOMO SAPIENS INTERFERON-INDUCED, HEPATITIS C-ASSOCIATED MICROTUBULAR AG（NM_006417）；유전자 HOMO SAPIENS PROTEIN KINASE, AMP-ACTIVATED, GAMMA 1 NON-CATALYTIC SUBUN（NM_002733）；HOMO SAPIENS PROCOLLAGEN-PROLINE, 2-OXOGLUTARATE 4-DIOXYGENASE (PROLINE（NM_004199）；유전자 HOMO SAPIENS ENDOTHELIAL DIFFERENTIATION, LYSOPHOSPHATIDIC ACID G-PROTE（NM_012152）；또는 유전자 HOMO SAPIENS KIAA0127 GENE PRODUCT (KIAA0127), MRNA（NM_014755）인 것을 특징으로 하는 간엽계 간세포 검출용 유전자 마커.
본 발명에 있어서, 본 발명의 간엽계 간세포 마커 유전자의 발현을 검출하기 위해서는 공지의 유전자 발현의 검출방법을 사용할 수가 있다. 예를 들면, 본 발명의 간엽계 간세포 마커 유전자의 발현을 검출하기 위하여, 노던 블로팅법을 사용할 수가 있다. 또, 본 발명의 유전자 마커에 의하여, 간엽계 간세포를 검출, 식별하기 위하여, 본 발명의 간엽계 간세포 유전자 마커의 DNA배열과 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA배열을 갖는 프로브를 사용할 수가 있다. 상기 프로브를 사용하여 간엽계 간세포를 검출하기 위해서는, 공지의 방법을 사용하여 적절히 실시할 수가 있다. 예를 들면, 서열목록에 나타낸 유전자 마커의 DNA배열로부터 적당한 길이의 DNA프로브를 제작하고, 적당한 형광표지 등의 표지를 부여해 놓고, 이것을 피검체와 하이브리다이즈하는 것에 의하여, 간엽계 간세포의 검출을 실시한다. 상기 DNA프로브로서는 서열목록에 나타낸 본 발명의 유전자 마커의 염기서열의 안티센스사슬의 전부 또는 일부로 이루어지는 간엽계 간세포 마커 유전자 검출용 프로브를 사용할 수가 있다. 또, 상기 프로브를, 적어도 1개 이상을 고정화시킨 마커 유전자 검출용의 마이크로어레이 또는 DNA칩의 형태로 사용할 수도 있다.
또한, 상기 DNA프로브의 제작시에, 본 발명의 염기서열에 있어서,「간엽계 간세포 검출용 마커 유전자의 DNA배열과 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는」조건으로서는, 예를 들면, 42℃에서의 하이브리다이제이션, 및 1×SSC(0.15M NaCl, 0.015M 쿠엔산 나트륨), 0.1%의 SDS(Sodium dodecyl sulfate)를 포함하는 완충액에 의한 42℃에서의 세정처리를 들 수 있으며, 65℃에서의 하이브리다이제이션 및 0.1×SSC, 0.1%의 SDS를 포함하는 완충액에 의한 65℃에서의 세정처리를 보다 바람직하게 들 수 있다. 또한, 하이브리다이제이션의 스트린젠시에 영향을 미치는 요소로서는 상기 온도조건 이외에 여러가지의 요소가 있으며, 당업자라면 여러가지의 요소를 조합하여 상기 예시한 하이브리다이제이션의 스트린젠시와 동등한 스트린젠시를 실현할 수가 있다.
또, 본 발명에 있어서는, 본 발명의 간엽계 간세포 검출용 폴리펩티드 마커의 검출시에, 상기 단백질의 폴리펩티드에 의하여 유도되며, 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 사용할 수가 있다. 상기 항체로서는 모노클로널항체 및 폴리클로널항체를 들 수 있다. 상기 항체의 제작은, 본 발명의 폴리펩티드 마커를 항원으로 하여 상법에 의하여 제작할 수가 있다. 본 발명의 항체를 사용하여 피검세포에 있어서의 간엽계 간세포 검출용 마커 폴리펩티드의 발현을 검출하기 위해서 는, 공지의 항체를 사용한 면역학적 측정법을 사용하여 실시할 수가 있다. 상기 면역학적 측정법으로서는, 예를 들면, RIA법, ELISA법, 형광항체법 등의 공지의 면역학적 측정법을 들 수가 있다.
본 발명에 있어서는, 본 발명의 간엽계 간세포 검출용 프로브 및/또는 본 발명의 간엽계 간세포 검출용 항체를 사용하여, 피검세포에 있어서의 간엽계 간세포 검출용 마커 유전자 및/또는 간엽계 간세포 검출용 마커 폴리펩티드의 발현을 검출하고, 식별하여 간엽계 간세포를 분리하여 취득할 수가 있다. 피검세포에 있어서의 간엽계 간세포 검출용 마커 유전자의 검출시에는, 피검세포의 유전자를 증폭시키기 위하여 정량적 또는 반정량적 PCR을 사용할 수 있다. 상기 PCR로서는 RT-PCR(역전사(逆轉寫)PCR)을 사용할 수가 있다. 상기 PCR을 실시할 때에는, 본 발명의 간엽계 간세포 검출용 마커 유전자를 증폭시키기 위한 센스프라이머 및 안티센스프라이머로 이루어지는 프라이머를 사용한다.
본 발명의 간엽계 간세포 검출용 마커 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머를 열거하면: 서열목록의 서열번호20에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호21에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호22에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호23에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호24에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호25에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호26에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호27에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호28에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호29에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호30에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호31에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호32에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호33에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호34에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호35에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호36에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호37에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호38에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호39에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호40에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호41에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호42에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호43에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 또는 서열목록의 서열번호44에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호45에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머를 들 수가 있다.
또, 본 발명의 간엽계 간세포 검출용 마커 유전자를 증폭하기 위한 프라이머를 열거하면 : 서열목록의 서열번호47에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호48에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호49에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호50에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호51에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호52에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호53에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호54에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호55에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호56에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호57에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호58에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호59에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호60에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호61에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호62에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호63에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호64에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호65에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호66에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호67에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호68에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 또는 서열목록의 서열번호69에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호70에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머로 이루어지는 간엽계 간세포 마커 유전자 증폭을 위한 실시간 PCR용 프라이머를 들 수가 있다.
또, 본 발명의 간엽계 간세포 검출용 마커 유전자를 증폭하기 위한 프라이머를 열거하면 : 서열목록의 서열번호71에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호72에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호73에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호74에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호75에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호76에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호77에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호78에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호79에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호80에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호81에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호82에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호83에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호84에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호85에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호86에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호87에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호88에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호89에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호90에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호91에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호92에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호93에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호94에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호95에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호96에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호97에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호98에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호99에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호100에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호101에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호102에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호103에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호104에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호105에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호106에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호107에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호108에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호109에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호110에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호111에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호112에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 서열목록의 서열번호113에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호114에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머, 또는 서열목록의 서열번호115에 나타내는 염기서열을 갖는 센스프라이머와 서열목록의 서열번호116에 나타내는 염기서열을 갖는 안티센스프라이머로 이루어지는 간엽계 간세포 마커 유전자 증폭을 위한 RT-PCR용 프라이머를 들 수가 있다.
본 발명에 있어서, 간엽계 간세포의 식별을 실시하기 위해서는, 피검세포에 있어서의 유전자를 상기의 센스프라이머 및 안티센스프라이머의 적어도 1쌍 이상의 프라이머를 사용하여 증폭하고, 증폭한 유전자를 본 발명의 간엽계 간세포 마커 유전자 검출용 프로브를 사용하여 검출한다.
본 발명의 간엽계 간세포 검출용 마커 유전자는, 간엽계 간세포에 있어서 특이적으로 높게 발현하는 유전자와, 특이적으로 낮게 발현하는 유전자가 있으며, 그들 유전자의 발현을 조합하여 검출하는 것에 의하여, 간엽계 간세포의 검출정밀도를 높일수가 있다. 덧붙여 말하면, 간엽계 간세포에 있어서 특이적으로 높게 발현하는 유전자로서는, 서열목록의 서열번호 1, 11 및 19로 이루어지는 간엽계 간세포 마커 유전자를 들 수 있으며, 특이적으로 낮게 발현하는 유전자로서는, 서열목록의 서열번호 2, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 14, 15, 17 및 46으로 이루어지는 간엽계 간세포 마커 유전자를 들 수 있다. 또, 본 발명에서 확인된 간엽계 간세포 마커 유전자를 들 수가 있다. 따라서, 각각의 유전자 그룹의 1유전자 이상의 발현을 조합하는 것에 의하여, 보다 검출정밀도가 높은 간엽계 간세포의 식별을 실시할 수가 있다.
본 발명의 항체를 사용하여 형광항체법을 따라서, 피검세포에 있어서의 간엽계 간세포 마커 폴리펩티드의 발현을 검출하고, 간엽계 간세포를 식별, 분리하기 위해서는, 공지의 방법에 의하여 간엽계 간세포를 표지화하여, 분리할 수가 있다. 상기 표지화 방법으로서는, 예를 들면, 형광항체법을 들 수가 있다. 형광항체법에 의하여 미분화 조혈세포를 표지화하기 위해서는, 본 발명의 간엽계 간세포 검출용 폴리펩티드 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 형광표지하고, 이를 항원을 발현하고 있는 간엽계 간세포에 결합시켜서 간엽계 간세포를 표지화하거나(직접 형광항체 법), 또는 항원을 발현하고 있는 간엽계 간세포에, 미표지의 본 발명의 특이항체를 결합시킨 후에, 표지화한 2차항체(항면역 글로블린항체)를 결합시켜서 간엽계 간세포를 표지화하여(간접 형광항체법), 상기 표지화한 간엽계 간세포를 분리, 채취한다.
본 발명의 간엽계 간세포의 검출, 식별에 사용하는 간엽계 간세포 마커 유전자 검출용 프로브, 상기 프로브를 고정한 간엽계 간세포 마커 유전자 검출용 마이크로 어레이 또는 DNA칩, 및 본 발명의 간엽계 간세포 검출용의 항체는, 그들을 장비한 간엽계 간세포의 식별용 키트로서 제품화해서 놓을 수가 있다.
이하, 실시예에 따라서 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명의 기술적 범위는 이들 예시에 한정되는 것이 아니다.
실시예1 [재료와 방법]
(세포)
인간유래 간엽계 간세포(human mesenchymal stem cell）, 및 인간섬유아세포(human fibroblast）는 Dalbecco's modified Eagle's medium（low glucose）（Sigma사 제품）에 10％ fetal calf serum、1ng／ml의 bFGF를 첨가한 배지를 사용하여 37℃에서 배양하였다.
(DNA마이크로어레이)
10㎝ 접시 1장의 각 세포로부터 TRIZOL reagent（Invitrogen사 제품)를 사용하여 전(全) RNA를 추출한 후, micro poly (A) purist（Ambion사 제품)를 사용하여 mRNA를 정제하고, DNA microarray（Incyte Genomics사：Kurabo Life Array analysis servis；Lot. No. KL01081）를 실시하였다. 또한, DNA 마이크로어레이 해석은 kurabo사에 위탁하였다.
(반정량적 RT-PCR)
각 세포로부터 TRIZOL reagent（Invitrogen사 제품)를 사용하여 전체 RNA를 추출한 후, 각 전체 RNA 1㎎을 주형으로 하여 SuperScript first-strand synthesis system for RT-PCR（Invitrogen사 제품）을 사용하여 42℃, 50분간의 역전사 반응을 실시하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 하여 Advantage 2 PCR enzyme system（Clontech사 제품）을 사용하여 각 유전자를 증폭시켰다. 94℃ 30초간에서 변성(變性), 68℃ 1분간에서 어닐링을 30사이클 실시하였다. 증폭에 사용한 각 유전자의 프라이머배열을 표1에 정리하였다. 증폭한 유전자를 1% 아가로스겔을 사용한 전기영동으로 분리하고, 에티듐 브로마이드 염색에 의하여 검출하였다.
< 실시예2[검출결과] >
(DNA마이크로어레이)
DNA마이크로어레이의 결과, 9400유전자 중, 63유전자가 섬유아세포와 비교하여 간엽계 간세포에 있어서 의미있게 발현이 높고, 141유전자가 낮다는 것이 명백해졌다. 또, 그 이외의 유전자에서는 우위의 차이가 확인되지 않았다. 이 중, 3배 이상의 차이가 확인된 87유전자 중, 간엽계 간세포 쪽이 발현이 높았던 유전자가 29유전자, 낮았던 유전자가 58유전자였다.
(반정량적 RT-PCR)
3개체 유래의 간엽계 간세포와 3개체 유래의 섬유아세포로부터 전체 RNA를 추출하고, 이들을 주형으로 사용하여 상기 87유전자에 대하여 반정량적 RT-PCR법에 의하여 그 발현량을 조사하였다. 그 결과, 발현량에 차이가 나타나지 않는 유전자가 대부분이었다. 또, 상이한 개체의 간엽계 간세포, 또는 섬유아세포 사이에서도 발현량에 차이가 있으며, 개체차에 따라서 발현이 다르다고 생각되는 것도 많았다(도1).
RT-PCR에 의하여 간엽계 간세포에서 발현이 높다는 것이 확인된 유전자는, serine (or cysteine) proteinase inhibitor(서열목록의 서열번호1)、major histocompatibility complex class2 DR beta 3（서열번호11）、및 tissue factor pathway inhibitor 2(서열번호19)의 3유전자였다(도2).
또, 낮다는 것이 확인된 유전자는, adrenomedullin（서열번호2）、apolipoprotein D（서열번호４）、collagenase type XV alpha 1（서열번호６）、CUG triplet repeat RNA binding protein（서열번호7）、dermatopontin protein（서열번호９）、isocitrate dehydrogenase 2（서열번호10）、tyrosine kinase 7（서열번호12）、Sam68-like phosphotyrosine protein（서열번호14）、C-type lectin superfamily member 2（서열번호15)、및 matrix metalloprotease 1(서열번호17)의 10유전자(도3)였다. 또, 이들 13유전자에 대하여 7개체 유래의 간엽계 간세포와 4개체 유래의 섬유아세포로부터 추출한 전체 RNA를 주형으로 한 반정량적 RT-PCR법에 의하여, 그 발현량의 확인을 실시하였다(도4).
실시예3[간엽계 간세포에 있어서의 각 유전자 발현의 측정 I]
실시예1과 동일하게 하여, 본 발명의 유전자 마커의 인간유래 간엽계 간세포 및 인간 섬유아세포에 있어서의 발현을 측정하였다. 사용한 RT-PCR 및 실시간 PCR의 프라이머와 실시간 PCR용의 프로브를 표2에 나타낸다.
간엽계 간세포와 인간섬유아세포에 있어서의 mRNA 레벨의 발현의 상황을 도5에 나타낸다. 또, 간엽계 간세포와 인간섬유아세포에 있어서의 상대적인 mRNA레벨의 발현 상황을 도6, 7, 8에 나타낸다.
< 실시예4 [간엽계 간세포에 있어서의 각 유전자 발현의 측정 II] >
실시예1과 동일하게 하여, 본 발명의 각 유전자 마커의 인간유래 간엽계 간세포 및 인간섬유아세포에 있어서의 발현을 측정하였다. 사용한 RT-PCR의 센스 및 안티센스프라이머는 서열목록의 서열번호71~116에 나타낸다. 간엽계 간세포와 인간섬유아세포에 있어서의 유전자 발현의 상황을 도9 및 도10에 나타낸다. 또, 간엽계 간세포/섬유아세포의 발현의 비율을 표3에 나타낸다.
< 실시예5 [간엽계 간세포에 있어서의 각 유전자 발현의 측정 III] >
실시예1과 동일하게 하여, 본 발명의 각 유전자 마커의 인간유래 간엽계 간세포 및 인간섬유아세포에 있어서의 발현을 측정하였다. 간엽계 간세포/섬유아세포의 발현의 비율을 표4에 나타낸다.
| (간엽계 간세포/섬유아세포) 유 전 자 명 |
| 8.9 EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1 |
| 8.4 Human insulin-like growth factor binding protein 5 (IGFBP5) mRNA |
| 7.7 Homo sapiens clone 24775 mRNA sequence |
| 7 "proteoglycan 1, secretory granule" |
| 6.8 insulin-like growth factor binding protein 5 |
| 6.7 "solute carrier family 21 (organic anion transporter), member 3" |
| 6.5 "transglutaminase 2 (C polypeptide,proteinglutamine-gamma-glutamyl transferase)" |
| 5.8 coagulation factor II (thrombin) receptor |
| 5.6 "plasminogen activator, urokinase" |
| 5.5 "tissue inhibitor of metalloproteinase 3 (Sorsby fundus dystrophy, pseudoinflammatory)" |
| 5.1 matrix Gla protein |
| 4.6 B-cell CLL/lymphoma 1 |
| 4.6 "CD74 antigen (invariant polypeptide of major histocompatibility complex, class II antigen-associated)" |
| 4.2 adducin 3 (gamma) |
| 4.2 "solute carrier family 16 (monocarboxylic acid transporters), member 4" |
| 3.4 protein S (alpha) |
| 3.3 "phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate 5-phosphatase homolog; phosphatidylinositol polyphosphate 5-phosphatase type IV" |
| 3.2 progesterone membrane binding protein |
| 3.2 brain-derived neurotrophic factor |
| 3 apolipoprotein E |
| 38.5 "GI|6005949|REF|NM_007191.1| HOMO SAPIENS WNT INHIBITORY FACTOR-1 (WIF-1), MRNA" |
| 12.7 "GI|8922916|REF|NM_018349.1| HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ11175 (FLJ11175), MRNA" |
| 11.2 "GI|10835001|REF|NM_001175.1| HOMO SAPIENS RHO GDP DISSOCIATION INHIBITOR (GDI) BETA (ARHGDIB), MRNA" |
| 10.3 "GI|11055973|REF|NM_021614.1| HOMO SAPIENS POTASSIUM INTERMEDIATE/SMALL CONDUCTANCE CALCIUM-ACTIVATE" |
| 8.7 "GI|5731346|REF|NM_004289.3| HOMO SAPIENS NUCLEAR FACTOR (ERYTHROID-DERIVED 2)-LIKE 3 (NFE2L3), MRNA" |
| 7.6 "GI|11056053|REF|NM_021643.1| HOMO SAPIENS GS3955 PROTEIN (GS3955), MRNA" |
| 7.5 "EST10324 ADIPOSE TISSUE, WHITE I HOMO SAPIENS CDNA 3' END SIMILAR TO SIMILAR TO GLYCOPROTEIN MUC18," |
| 6.6 "GI|13375818|REF|NM_024609.1| HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ21841 (FLJ21841), MRNA" |
| 6.5 "GI|6005971|REF|NM_007150.1| HOMO SAPIENS ZINC FINGER PROTEIN 185 (LIM DOMAIN) (ZNF185), MRNA" |
| 6.5 "GNL|UG|HS#S2334464 SC1=PUTATIVE TRANS-ACTING FACTOR INVOLVED IN CELL CYCLE CONTROL [HUMAN, MRNA, 24" |
| 6.4 "GI|7657368|REF|NM_014222.1| HOMO SAPIENS NADH DEHYDROGENASE (UBIQUINONE) 1 ALPHA SUBCOMPLEX, 8 (19K" |
| 6.3 "GI|8924142|REF|NM_018518.1| HOMO SAPIENS HOMOLOG OF YEAST MCM10; HYPOTHETICAL PROTEIN PRO2249 (PRO2" |
| 6.2 "GI|4502960|REF|NM_000094.1| HOMO SAPIENS COLLAGEN, TYPE VII, ALPHA 1 (EPIDERMOLYSIS BULLOSA, DYSTRO" |
| 6.2 "GI|4502074|REF|NM_001144.1| HOMO SAPIENS AUTOCRINE MOTILITY FACTOR RECEPTOR (AMFR), MRNA" |
| 6.2 GNL|UG|HS#S1090551 HOMO SAPIENS CLONE 24421 MRNA SEQUENCE /CDS=UNKNOWN /GB=AF070641 /GI=3283914 /UG= |
| 6.2 GNL|UG|HS#S1570341 HOMO SAPIENS MRNA; CDNA DKFZP586E1621 (FROM CLONE DKFZP586E1621) /CDS=UNKNOWN /GB |
| 6.1 "GI|11545760|REF|NM_022055.1| HOMO SAPIENS RESERVED (KCNK12), MRNA" |
| 6.0 "GI|5902145|REF|NM_007019.1| HOMO SAPIENS UBIQUITIN-CONJUGATING ENZYME E2C (UBE2C), MRNA" |
| 5.9 "GNL|UG|HS#S1970614 HOMO SAPIENS CDNA FLJ10517 FIS, CLONE NT2RP2000812 /CDS=(61,918) /GB=AK001379 /G" |
| 5.8 "GI|4503052|REF|NM_001884.1| HOMO SAPIENS CARTILAGE LINKING PROTEIN 1 (CRTL1), MRNA" |
| 5.8 GNL|UG|HS#S1972520 HOMO SAPIENS MRNA; CDNA DKFZP434F2322 (FROM CLONE DKFZP434F2322) /CDS=UNKNOWN /GB |
| 5.7 "GNL|UG|HS#S3837475 HOMO SAPIENS, CLONE MGC:9549 IMAGE:3857382, MRNA, COMPLETE CDS /CDS=(92,1285) /G" |
| 5.4 "GI|14150008|REF|NM_032270.1| HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN DKFZP586J1119 (DKFZP586J1119), MRNA" |
| 5.4 "GI|4758439|REF|NM_004877.1| HOMO SAPIENS GLIA MATURATION FACTOR, GAMMA (GMFG), MRNA" |
| 5.4 "GNL|UG|HS#S2654530 HOMO SAPIENS CDNA: FLJ23095 FIS, CLONE LNG07413 /CDS=UNKNOWN /GB=AK026748 /GI=10" |
| 5.3 "GI|8922180|REF|NM_018410.1| HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN DKFZP762E1312 (DKFZP762E1312), MRNA" |
| 5.3 "GI|5031806|REF|NM_005853.1| HOMO SAPIENS IROQUOIS-CLASS HOMEODOMAIN PROTEIN (IRX-2A), MRNA" |
| 5.2 "GI|8922501|REF|NM_018131.1| HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ10540 (FLJ10540), MRNA" |
| 5.1 "GNL|UG|HS#S1972896 HOMO SAPIENS MRNA; CDNA DKFZP434C1915 (FROM CLONE DKFZP434C1915); PARTIAL CDS /C" |
| 5.1 "GI|14149622|REF|NM_005916.1| HOMO SAPIENS MINICHROMOSOME MAINTENANCE DEFICIENT (S. CEREVISIAE) 7 (M" |
| 5.0 "GI|4758177|REF|NM_004411.1| HOMO SAPIENS DYNEIN, CYTOPLASMIC, INTERMEDIATE POLYPEPTIDE 1 (DNCI1), M" |
| 5.0 HUMAN MRNA FOR PROTEIN GENE PRODUCT (PGP) 9.5. |
| 5.0 "GI|5453903|REF|NM_006479.1| HOMO SAPIENS RAD51-INTERACTING PROTEIN (PIR51), MRNA" |
| 4.9 "GI|4502144|REF|NM_001168.1| HOMO SAPIENS BACULOVIRAL IAP REPEAT-CONTAINING 5 (SURVIVIN) (BIRC5), MR" |
| 4.9 "GI|9945386|REF|NM_004482.2| HOMO SAPIENS UDP-N-ACETYL-ALPHA -D-GALACTOSAMINE:POLYPEPTIDE N-ACETYLGAL" |
| 4.9 "GI|14327895|REF|NM_031966.1| HOMO SAPIENS CYCLIN B1 (CCNB1), MRNA" |
| 4.8 "GI|6325465|REF|NM_004111.3| HOMO SAPIENS FLAP STRUCTURE-SPECIFIC ENDONUCLEASE 1 (FEN1), MRNA" |
| 4.8 "GI|4507274|REF|NM_003600.1| HOMO SAPIENS SERINE/THREONINE KINASE 15 (STK15), MRNA" |
| 4.8 "GI|6466452|REF|NM_002358.2| HOMO SAPIENS MAD2 (MITOTIC ARREST DEFICIENT, YEAST, HOMOLOG)-LIKE 1 (MA" |
| 4.7 "GI|15421859|REF|NM_018454.2| HOMO SAPIENS NUCLEOLAR PROTEIN ANKT (ANKT), MRNA" |
| 4.7 "GI|7661807|REF|NM_014176.1| HOMO SAPIENS HSPC150 PROTEIN SIMILAR TO UBIQUITIN-CONJUGATING ENZYME (H" |
| 4.7 "GI|9845284|REF|NM_019885.1| HOMO SAPIENS CYTOCHROME P450 RETINOID METABOLIZING PROTEIN (P450RAI-2)," |
| 4.7 "GI|4505372|REF|NM_002497.1| HOMO SAPIENS NIMA (NEVER IN MITOSIS GENE A)-RELATED KINASE 2 (NEK2), MR" |
| 4.7 "GI|4502422|REF|NM_001202.1| HOMO SAPIENS BONE MORPHOGENETIC PROTEIN 4 (BMP4), MRNA" |
| 4.7 "GNL|UG|HS#S1970775 HOMO SAPIENS CDNA FLJ10674 FIS, CLONE NT2RP2006436 /CDS=UNKNOWN /GB=AK001536 /GI" |
| 4.7 "GI|4585861|REF|NM_001809.2| HOMO SAPIENS CENTROMERE PROTEIN A (17KD) (CENPA), MRNA" |
| 4.6 GNL|UG|HS#S1368141 HOMO SAPIENS MRNA; CDNA DKFZP564P116 (FROM CLONE DKFZP564P116) /CDS=UNKNOWN /GB=A |
| 4.6 "GI|4507718|REF|NM_003318.1| HOMO SAPIENS TTK PROTEIN KINASE (TTK), MRNA" |
| 4.6 "GI|4504896|REF|NM_002266.1| HOMO SAPIENS KARYOPHERIN ALPHA 2 (RAG COHORT 1, IMPORTIN ALPHA 1) (KPNA" |
| 4.6 "GI|5729983|REF|NM_006596.1| HOMO SAPIENS POLYMERASE (DNA DIRECTED), THETA (POLQ), MRNA" |
| 4.5 "GI|4758315|REF|NM_004454.1| HOMO SAPIENS ETS VARIANT GENE 5 (ETS-RELATED MOLECULE) (ETV5), MRNA" |
| 4.5 "HOMO SAPIENS TRANSFORMING, ACIDIC COILED-COIL CONTAINING PROTEIN 3 (TAC" |
| 4.5 "HOMO SAPIENS KINESIN-LIKE 1 (KNSL1), MRNA" |
| 4.5 "HOMO SAPIENS CENTROMERE PROTEIN E (312KD) (CENPE), MRNA" |
| 4.5 " HOMO SAPIENS CDNA, 3' END /CLONE=IMAGE:1651289 /CLONE_END=3' /GB=AI12" |
| 4.4 "HOMO SAPIENS DISTAL-LESS HOMEO BOX 5 (DLX5), MRNA" |
| 4.4 "HOMO SAPIENS V-MYB AVIAN MYELOBLASTOSIS VIRAL ONCOGENE HOMOLOG-LIKE 2 " |
| 4.4 "HOMO SAPIENS SERUM DEPRIVATION RESPONSE (PHOSPHATIDYLSERINE -BINDING PRO" |
| 4.4 "HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ10604 (FLJ10604), MRNA" |
| 4.4 "HOMO SAPIENS RIBONUCLEASE HI, LARGE SUBUNIT (RNASEHI), MRNA |
| 4.4 "HOMO SAPIENS ANILLIN (DROSOPHILA SCRAPS HOMOLOG), ACTIN BINDING PROTEIN" |
| 4.4 "HOMO SAPIENS H4 HISTONE FAMILY, MEMBER G (H4FG), MRNA" |
| 4.3 "HOMO SAPIENS G PROTEIN-COUPLED RECEPTOR 37 (ENDOTHELIN RECEPTOR TYPE B-" |
| 4.3 "HOMO SAPIENS UBIQUITIN CARRIER PROTEIN (E2-EPF), MRNA" |
| 4.3 "HOMO SAPIENS, SIMILAR TO TUMOR DIFFERENTIALLY EXPRESSED 1, CLONE IMAGE:3639252, " |
| 4.2 "HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN MGC2577 (MGC2577), MRNA" |
| 4.2 "HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN FLJ13912 (FLJ13912), MRNA" |
| 4.2 "HOMO SAPIENS ANNEXIN A3 (ANXA3), MRNA" |
| 4.2 "HOMO SAPIENS STATHMIN 1/ONCOPROTEIN 18 (STMN1), MRNA" |
| 4.2 "GNL|UG|HS#S3837587 HOMO SAPIENS, SIMILAR TO RIBOSOMAL PROTEIN L39, CLONE MGC:20168 IMAGE:4555759, M" |
| 4.2 "HOMO SAPIENS POLO (DROSOPHIA)-LIKE KINASE (PLK), MRNA" |
< 실시예6 [간엽계 간세포에 있어서의 각 유전자 발현의 측정 VI] >
실시예1과 동일하게 하여, 본 발명의 각 유전자 마커의 인간유래 간엽계 간세포 및 인간섬유아세포에 있어서의 발현을 측정하였다. 간엽계 간세포/섬유아세포의 발현의 비율을 표5에 나타낸다. 표 중의 - 은 간엽계 간세포에 있어서, 유전자가 발현하고 있지 않거나, 또는 극히 소량의 발현인 것을 나타낸다.
| (간엽계 간세포/섬유아세포) 유 전 자 명 |
| -53.576 "HOMO SAPIENS PROTEASOME (PROSOME, MACROPAIN) 26S SUBUNIT, ATPASE, 5 (PS" |
| -45.692 "HOMO SAPIENS EUKARYOTIC TRANSLATION INITIATION FACTOR 4 GAMMA, 2 (EIF4G" |
| -27.6354 "HOMO SAPIENS DIHYDROPYRIMIDINASE-LIKE 3 (DPYSL3), MRNA" |
| -20.5446 "HOMO SAPIENS ADAPTOR-RELATED PROTEIN COMPLEX 1, SIGMA 2 SUBUNIT (AP1S2)" |
| -19.5809 "HOMO SAPIENS PLECTIN 1, INTERMEDIATE FILAMENT BINDING PROTEIN, 500KD P" |
| -16.9025 "HOMO SAPIENS HETEROGENEOUS NUCLEAR RIBONUCLEOPROTEIN U (SCAFFOLD ATTAC" |
| -14.97 "HOMO SAPIENS HYPOTHETICAL PROTEIN MGC5306 (MGC5306), MRNA" |
| -14.6106 "HOMO SAPIENS MHC CLASS I POLYPEPTIDE-RELATED SEQUENCE A (MICA), MRNA" |
| -13.8886 "HOMO SAPIENS PROTEIN ASSOCIATED WITH PRK1 (AWP1), MRNA" |
| -13.6578 "HOMO SAPIENS PROGESTERONE RECEPTOR MEMBRANE COMPONENT 2 (PGRMC2), MRNA" |
| -11.4783 "HOMO SAPIENS POLYGLUTAMINE BINDING PROTEIN 1 (PQBP1), MRNA" |
| -10.2392 "HOMO SAPIENS S-ADENOSYLMETHIONINE DECARBOXYLASE 1 (AMD1), MRNA" |
| -9.9506 "HOMO SAPIENS INTERFERON-INDUCED, HEPATITIS C-ASSOCIATED MICROTUBULAR AG" |
| -9.2594 "HOMO SAPIENS PROTEIN KINASE, AMP-ACTIVATED, GAMMA 1 NON-CATALYTIC SUBUN" |
| -7.518 "HOMO SAPIENS PROCOLLAGEN-PROLINE, 2-OXOGLUTARATE 4-DIOXYGENASE (PROLINE" |
| -6.0365 "HOMO SAPIENS ENDOTHELIAL DIFFERENTIATION, LYSOPHOSPHATIDIC ACID G-PROTE" |
| -5.4442 "HOMO SAPIENS KIAA0127 GENE PRODUCT (KIAA0127), MRNA""" |
< 실시예7 [인간세포에 있어서의 간엽계 간세포 DR의 발현의 측정] >
인간세포에 있어서의 간엽계 간세포 DR의 발현을 플로 사이토메트리를 사용하여 측정하였다. 결과를 도11에 나타낸다.
< 실시예8[간엽계 간세포의 분화유도에 있어서의 각 유전자 발현의 변화]>
실시예1과 동일하게 RT-PCR을 사용하여 간엽계 간세포의 분화유도에 있어서의 각 유전자 발현의 변화를 측정하였다. 골아세포의 분화유도에 있어서의 각 유전자의 발현을 도12~16에 나타낸다.
최근, 재생의료의 진전과 함께, 간엽계 간세포가 많은 조직의 재생의료를 위한 이식재료로서 주목받고 있다. 간엽계 간세포를 조직의 재생의료에 이용하기 위해서는, 간엽계 간세포의 충분한 양을 확보하는 기술을 개발하는 것이 필요함과 동시에, 배양한 세포가 간엽계 간세포인 것을 확인할 필요가 있으며, 상기 간엽계 간세포를 검출, 식별하는 방법이 중요해진다. 또, 항체 등을 사용하여 다종류의 세포의 집단으로부터 간엽계 간세포를 분리하는 것에도 도움이 된다. 본 발명에 의하 여, 간엽계 간세포를 특징짓는 마커 유전자를 특정하는 것에 의하여, 용이하고 또한 확실하게 간엽계 간세포를 검출, 식별하는 것이 가능해지며, 간엽계 간세포를 재생의료에 실용화하는 데에 크게 공헌할 것을 기대할 수 있다.
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- 피검세포의 APOLIPOPROTEIN D（APOD:서열번호４）; COLLAGEN, type XV, ALPHA 1（COL15A1:서열번호６）; CUG triplet repeat, RNA-BINDING PROTEIN 2(CUGBP2:서열번호7); MATRIX METALLOPROTEINASE 1 (MMP1:서열번호17) ; BONE MORPHOGENETIC PROTEIN 4 (BMP4: Gen Bank Accession No. NM_001202); HOMO SAPIENS CLONE 24775 mRNA sequence/potassium channel tetramerisation domain containing 12 (KCTD: Gen Bank Accession No. AA402981); MATRIX GLA PROTEIN (MGP: Gen Bank Accession No. BF668572); PROTEOGLYCAN 1, SECRETORY GRANULE (PRG1: Gen Bank Accession No. AV734015)；TRIBBLES HOMOLOG 2 (TRIB2: Gen Bank Accession No. NM_021643); HOMO SAPIENS DYNEIN, CYTOPLASMIC, INTERMEDIATE POLYPEPTIDE 1 (DNCI1: Gen Bank Accession No. NM_004411); BRAIN-DERIVED NEUROTROPHIC FACTOR（BDNF: Gen Bank Accession No. X60201)를 포함하는 간엽계 간세포 마커 유전자의 단백질을 인코딩하는 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 검출하는 간엽계 간세포의 식별분리 방법.
- 제 33항에 있어서,상기 간엽계 간세포 마커 유전자의 발현을 스트린젠트한 조건(stringent condition) 하에서 서열목록의 서열번호 4, 6, 7 또는 17, 또는 Gen Bank Accession No. NM_001202, AA402981, BF668572, AV734015, NM_021643, NM_004411 또는 X60201에 나타낸 염기서열 또는 서열목록의 서열번호 4, 6, 7 또는 17, 또는 Gen Bank Accession No. NM_001202, AA402981, BF668572, AV734015, NM_021643, NM_004411 또는 X60201에 나타낸 염기서열의 안티센스 사슬의 전체 또는 일부를 갖는 간엽계 간세포 마커 유전자와 하이브로다이즈하는 DNA 서열을 갖는 간엽계 간세포 마커 유전자 검출용 프로브를 사용하여 검출하는 것을 특징으로 하는 간엽계 간세포의 식별분리 방법.
- 제 33항에 있어서,상기 간엽계 간세포 마커 유전자의 발현을 서열목록의 서열번호 4, 6, 7 또는 17, 또는 Gen Bank Accession No. NM_001202, AA402981, BF668572, AV734015, NM_021643, NM_004411 또는 X60201에 나타낸 염기서열을 갖는 간엽계 간세포 마커 유전자 검출용 마이크로어레이 또는 DNA칩을 사용하여 검출하는 것을 특징으로 하는 간엽계 간세포의 식별분리 방법.
- 제 33항 기재의 유전자중 어느 하나의 간엽계 간세포 마커 유전자의 발현이 정량적 또는 반정량적 PCR의 사용을 포함하는 간엽계 간세포의 식별분리 방법.
- 제 36항에 있어서,상기 정량적 또는 반정량적 PCR의 사용이 RT-PCR법 또는 실시간 PCR법인 것을 특징으로 하는 간엽계 간세포의 식별분리 방법.
- 제 37항에 있어서,상기 RT-PCR법에 사용되는 간엽계 간세포 마커 유전자의 증폭을 위한 RT-PCR 프라이머가, 서열목록의 서열번호 24에 나타낸 염기서열을 갖는 센스 프라이머와 서열목록의 서열번호 25에 나타낸 염기서열을 갖는 안티센스 프라이머; 서열목록의 서열번호 26에 나타낸 염기서열을 갖는 센스 프라이머와 서열목록의 서열번호 27에 나타낸 염기서열을 갖는 안티센스 프라이머; 서열목록의 서열번호 28에 나타낸 염기서열을 갖는 센스 프라이머와 서열목록의 서열번호 29에 나타낸 염기서열을 갖는 안티센스 프라이머; 또는 서열목록의 서열번호 42에 나타낸 염기서열을 갖는 센스 프라이머와 서열목록의 서열번호 43에 나타낸 염기서열을 갖는 안티센스 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 간엽계 간세포의 식별분리 방법.
- 제 37항에 있어서,상기 실시간 PCR법에 사용되는 간엽계 간세포 마커 유전자의 증폭을 위한 실시간 PCR 프라이머가, 서열목록의 서열번호 49에 나타낸 염기서열을 갖는 센스 프라이머와 서열목록의 서열번호 50에 나타낸 염기서열을 갖는 안티센스 프라이머; 서열목록의 서열번호 57에 나타낸 염기서열을 갖는 센스 프라이머와 서열목록의 서열번호 58에 나타낸 염기서열을 갖는 안티센스 프라이머; 서열목록의 서열번호 69에 나타낸 염기서열을 갖는 센스 프라이머와 서열목록의 서열번호 70에 나타낸 염기서열을 갖는 안티센스 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 간엽계 간세포의 식별분리 방법.
- 제 33항에 있어서,상기 피검세포의 유전자가 제 38항 또는 제 39항에 의한 센스 프라이머와 안티센스 프라이머를 포함하는 적어도 한 쌍의 프라이머를 사용함에 의해 증폭되고, 상기 증폭된 유전자는 간엽계 간세포 마커 유전자 검출용 프로브를 사용함에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 간엽계 간세포의 식별분리 방법.
- 피검세포의 간엽계 간세포 검출용 마커 유전자 및 간엽계 간세포 검출용 마커 폴리펩티드 중에서 선택된 1종 또는 2종의 발현이, 서열목록의 서열번호 4, 6, 7 또는 17, 또는 Gen Bank Accession No. NM_001202, AA402981, BF668572, AV734015, NM_021643, NM_004411 또는 X60201에 나타낸 염기서열을 갖는 간엽계 간세포 마커 유전자와 하이브로다이즈하는 DNA 서열을 갖는 간엽계 간세포 마커 유전자 검출용 프로브를 사용함에 의해 검출되는 간엽계 간세포의 식별분리 방법.
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