JPWO2018030459A1 - 膵がんでのcldn18−arhgap6融合遺伝子又はcldn18−arhgap26融合遺伝子の検出 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]膵がんに罹患していることが疑われる被験者又は膵がんに罹患している被験者から得た試料中の、クローディン18(CLDN18)遺伝子とロージーティーピーアーゼアクティベーティングプロテイン6(ARHGAP6)遺伝子との融合部を含むポリヌクレオチド又はクローディン18(CLDN18)遺伝子とロージーティーピーアーゼアクティベーティングプロテイン26(ARHGAP26)遺伝子との融合部を含むポリヌクレオチドの存在を検出する工程を含む、CLDN18遺伝子とARHGAP6遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者又はCLDN18遺伝子とARHGAP26遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者を選別する方法。
[2]前記ポリヌクレオチドが、下記(1)又は(2)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、[1]に記載の方法:
(1)配列番号2、4、6若しくは8に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(2)配列番号2、4、6若しくは8に示されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。
[3]前記(1)又は(2)のポリペプチドが、腫瘍進展能を有する、[2]に記載の方法。
[4]前記ポリヌクレオチドが、配列番号2、4、6又は8に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、[2]に記載の方法。
[5]前記ポリヌクレオチドが、下記(3)又は(4)のポリヌクレオチドである、[1]に記載の方法:
(3)配列番号17若しくは19に示される塩基配列との同一性が90%以上である塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(4)配列番号17若しくは19に示される塩基配列において、1〜10個の塩基が欠失、置換、挿入、及び/又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド。
[6]前記ポリヌクレオチドが、配列番号17、18、19、20、又は21に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである、[5]に記載の方法。
[7]前記ポリヌクレオチドの存在が検出された場合に、被験者がCLDN18遺伝子とARHGAP6遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者又はCLDN18遺伝子とARHGAP26遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者であると判定し、検出されなかった場合に該融合遺伝子陽性の被験者でないと判定する工程をさらに包含する、[1]〜[6]のいずれかに記載の方法。
[8]前記ポリヌクレオチドの存在を検出するために、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程、及び/又は、被験者から得た試料中の核酸にプローブをハイブリダイズさせる工程を包含する、[1]〜[7]のいずれかに記載の方法。
[9]以下のプライマーセットを用いて、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を包含する、[8]に記載の方法:
CLDN18遺伝子とARHGAP6遺伝子との融合遺伝子又はCLDN18遺伝子とARHGAP26遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、CLDN18をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びARHGAP6をコードする部分又はARHGAP26をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含み、該アンチセンスプライマーは、前記ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、該センスプライマーは、前記ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる、プライマーセット。
[10]センスプライマーが、配列番号1の塩基番号1から750からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号1の塩基番号751から3087からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるか、
センスプライマーが、配列番号3の塩基番号1から750からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号3の塩基番号751から2460からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるか、
センスプライマーが、配列番号5の塩基番号1から750からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号5の塩基番号751から2088からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるか、又は
センスプライマーが、配列番号7の塩基番号1から750からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号7の塩基番号751から1923からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる、[9]に記載の方法。
[11]センスプライマーが、配列番号1の塩基番号1から750間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号1の塩基番号751から3087間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるか、
センスプライマーが、配列番号3の塩基番号1から750間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号3の塩基番号751から2460間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるか、
センスプライマーが、配列番号5の塩基番号1から750間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号5の塩基番号751から2088間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるか、又は
センスプライマーが、配列番号7の塩基番号1から750間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号7の塩基番号751から1923間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなる、[9]又は[10]に記載の方法。
[12]増幅された核酸断片が目的とするサイズで得られたか否かを検出する工程をさらに包含する、[9]〜[11]のいずれかに記載の方法。
[13]増幅された核酸断片が目的とするサイズで得られた場合に、被験者がCLDN18遺伝子とARHGAP6遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者又はCLDN18遺伝子とARHGAP26遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者であると判定し、得られなかった場合に該融合遺伝子陽性の被験者でないと判定する工程をさらに包含する、[12]に記載の方法。
[14]増幅された核酸断片の塩基配列を決定する工程をさらに包含する、[9]〜[11]のいずれかに記載の方法。
[15]増幅された核酸断片がCLDN18をコードする部分の塩基配列とARHGAP6をコードする部分の塩基配列又はARHGAP26をコードする部分の塩基配列とを同一断片に含む場合に、被験者がCLDN18遺伝子とARHGAP6遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者又はCLDN18遺伝子とARHGAP26遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者であると判定し、同一断片に含まない場合に該融合遺伝子陽性の被験者でないと判定する工程をさらに包含する、[14]に記載の方法。
[16]前記ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むプローブを、被験者から得た試料中の核酸にハイブリダイズさせる工程を包含する、[8]に記載の方法。
[17]被験者から得た試料、前記ポリヌクレオチドのCLDN18をコードする部分から設計されるプローブ、及び前記ポリヌクレオチドのARHGAP6をコードする部分又はARHGAP26をコードする部分から設計されるプローブを用いてインサイチュハイブリダイゼーションを行う工程を包含する、[16]に記載の方法。
[18]CLDN18をコードする部分から設計される複数種のプローブ、及びARHGAP6をコードする部分又はARHGAP26をコードする部分から設計される複数種のプローブを用いる、[17]に記載の方法。
[19]被験者から得た試料中の核酸にプローブをハイブリダイズさせる工程で、
配列番号1の塩基番号1から750の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種、及び配列番号1の塩基番号751から3087の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種用いるか、
配列番号3の塩基番号1から750の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種、及び配列番号3の塩基番号751から2460の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種用いるか、
配列番号5の塩基番号1から750の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種、及び配列番号5の塩基番号751から2088の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種用いるか、又は
配列番号7の塩基番号1から750の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種、及び配列番号7の塩基番号751から1923の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種用いる、[17]又は[18]に記載の方法。
[20]ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅させる工程をさらに包含する、[17]〜[19]のいずれかに記載の方法。
[21]CLDN18をコードする部分から設計されるプローブからのシグナルとARHGAP6をコードする部分又はARHGAP26をコードする部分から設計されるプローブからのシグナルとの重なりを検出する工程をさらに包含する、[17]〜[20]のいずれかに記載の方法。
[22]2つのシグナルが同じ場所にあることが検出された場合に、被験者がCLDN18遺伝子とARHGAP6遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者又はCLDN18遺伝子とARHGAP26遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者であると判定し、検出されなかった場合に前記融合遺伝子陽性の被験者でないとする判定する工程をさらに包含する、[21]に記載の方法。
[23]被験者から試料を得る工程を包含する、[1]〜[22]のいずれかに記載の方法。
[24]試料が体液又は体腔洗浄液である、[1]〜[23]のいずれかに記載の方法。
[25]試料が腹水又は腹腔洗浄液である、[1]〜[24]のいずれかに記載の方法。
[26]ARHGAP6阻害剤若しくはARHGAP26阻害剤、及び/又はCLDN18遺伝子とARHGAP6遺伝子との融合遺伝子若しくはCLDN18遺伝子とARHGAP26遺伝子との融合遺伝子により惹起される異常シグナルを遮断する薬剤による治療の適応対象となる膵がんに罹患していることが疑われる被験者又は膵がんに罹患している被験者を同定する方法であって、[1]〜[22]のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
[27]被験者から試料を得る工程を包含する、[26]に記載の方法。
[28]CLDN18遺伝子とARHGAP6遺伝子との融合部を含むポリヌクレオチド又はCLDN18遺伝子とARHGAP26遺伝子との融合部を含むポリヌクレオチドが被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者がARHGAP6阻害剤若しくはARHGAP26阻害剤、及び/又はCLDN18遺伝子とARHGAP6遺伝子との融合遺伝子若しくはCLDN18遺伝子とARHGAP26遺伝子との融合遺伝子により惹起される異常シグナルを遮断する薬剤による治療の適応対象であると判定し、検出されなかった場合に該被験者が該治療の適応対象でないと判定する工程をさらに包含する、[26]又は[27]に記載の方法。
[29][12]に記載の工程、及び、増幅された核酸断片が目的とするサイズで得られた場合に、被験者がARHGAP6阻害剤若しくはARHGAP26阻害剤、及び/又はCLDN18遺伝子とARHGAP6遺伝子との融合遺伝子若しくはCLDN18遺伝子とARHGAP26遺伝子との融合遺伝子により惹起される異常シグナルを遮断する薬剤による治療の適応対象であると判定し、得られなかった場合に該被験者が該治療の適応対象でないと判定する工程をさらに包含する、[26]又は[27]に記載の方法。
[30][14]に記載の工程、及び、増幅された核酸断片がCLDN18をコードする部分の塩基配列とARHGAP6をコードする部分の塩基配列又はARHGAP26をコードする部分の塩基配列とを同一断片に含む場合に、被験者がARHGAP6阻害剤若しくはARHGAP26阻害剤、及び/又はCLDN18遺伝子とARHGAP6遺伝子との融合遺伝子若しくはCLDN18遺伝子とARHGAP26遺伝子との融合遺伝子により惹起される異常シグナルを遮断する薬剤による治療の適応対象であると判定し、含まなかった場合に該被験者が該治療の適応対象でないと判定する工程をさらに包含する、[26]又は[27]に記載の方法。
[31][21]に記載の工程、及び、2つのシグナルが同じ場所にあることが検出された場合に、被験者がARHGAP6阻害剤若しくはARHGAP26阻害剤、及び/又はCLDN18遺伝子とARHGAP6遺伝子との融合遺伝子若しくはCLDN18遺伝子とARHGAP26遺伝子との融合遺伝子により惹起される異常シグナルを遮断する薬剤による治療の適応対象であると判定し、検出されなかった場合に該被験者が該治療の適応対象でないと判定する工程をさらに包含する、[26]又は[27]に記載の方法。
[32]膵がんに罹患していることが疑われる被験者又は膵がんに罹患している被験者から得た試料中のCLDN18遺伝子とARHGAP6遺伝子との融合遺伝子又はCLDN18遺伝子とARHGAP26遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、CLDN18をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びARHGAP6をコードする部分又はARHGAP26をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含み、該アンチセンスプライマーは、[1]〜[6]のいずれかに記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、該センスプライマーは、該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる、プライマーセット。
[33]センスプライマーが、配列番号1の塩基番号1から750からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号1の塩基番号751から3087からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるか、
センスプライマーが、配列番号3の塩基番号1から750からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号3の塩基番号751から2460からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるか、
センスプライマーが、配列番号5の塩基番号1から750からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号5の塩基番号751から2088からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるか、又は
センスプライマーが、配列番号7の塩基番号1から750からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号7の塩基番号751から1923からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる、[32]に記載のプライマーセット。
[34]センスプライマーが、配列番号1の塩基番号1から750間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号1の塩基番号751から3087間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるか、
センスプライマーが、配列番号3の塩基番号1から750間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号3の塩基番号751から2460間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるか、
センスプライマーが、配列番号5の塩基番号1から750間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号5の塩基番号751から2088間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるか、又は
センスプライマーが、配列番号7の塩基番号1から750間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなり、アンチセンスプライマーが、配列番号7の塩基番号751から1923間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなる、[32]又は[33]に記載のプライマーセット。
[35]膵がんに罹患していることが疑われる被験者又は膵がんに罹患している被験者から得た試料中のCLDN18遺伝子とARHGAP6遺伝子との融合遺伝子又はCLDN18遺伝子とARHGAP26遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプローブであって、[1]〜[6]のいずれかに記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、プローブ。
[36][35]に記載のプローブを複数含むプローブセットであって、[1]〜[6]のいずれかに記載のポリヌクレオチドのCLDN18をコードする部分から設計されるプローブ及びARHGAP6をコードする部分又はARHGAP26をコードする部分から設計されるプローブを含む、プローブセット。
[37]CLDN18をコードする部分から設計される複数種のプローブ、及びARHGAP6をコードする部分又はARHGAP26をコードする部分から設計される複数種のプローブを含む、[36]に記載のプローブセット。
[38]配列番号1の塩基番号1から750の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種、及び配列番号1の塩基番号751から3087の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種含むか、
配列番号3の塩基番号1から750の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種、及び配列番号3の塩基番号751から2460の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種含むか、
配列番号5の塩基番号1から750の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種、及び配列番号5の塩基番号751から2088の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種含むか、又は
配列番号7の塩基番号1から750の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種、及び配列番号7の塩基番号751から1923の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種含む、[36]又は[37]のプローブセット。
[39]膵がんに罹患していることが疑われる被験者又は膵がんに罹患している被験者から得た試料中のCLDN18遺伝子とARHGAP6遺伝子との融合遺伝子又はCLDN18遺伝子とARHGAP26遺伝子との融合遺伝子を検出するための検出用キットであって、[32]〜[34]のいずれかに記載のプライマーセットを含む、融合遺伝子の検出用キット。
[40]膵がんに罹患していることが疑われる被験者又は膵がんに罹患している被験者から得た試料中のCLDN18遺伝子とARHGAP6遺伝子との融合遺伝子又はCLDN18遺伝子とARHGAP26遺伝子との融合遺伝子を検出するための検出用キットであって、[35]〜[38]のいずれかに記載のプローブ又はプローブセットを含む、検出用キット。
[41]ハイブリダイゼーションのシグナルを増幅する試薬をさらに含む、[40]に記載の検出用キット。
[42]膵がんに罹患していることが疑われる被験者又は膵がんに罹患している被験者から得た試料中の、下記(1)又は(2)のポリペプチドの存在を検出する工程を含む、CLDN18とARHGAP6との融合蛋白質陽性の被験者又はCLDN18とARHGAP26との融合蛋白質陽性の被験者を選別する方法:
(1)配列番号2、4、6若しくは8に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(2)配列番号2、4、6若しくは8に示されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。
[43]前記ポリペプチドが、腫瘍進展能を有する、[42]に記載の方法。
[44]前記ポリペプチドが、配列番号2、4、6又は8に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、[42]に記載の方法。
[45]前記ポリペプチドの存在を検出する工程が、被験者から得た試料に該ポリペプチドのCLDN18遺伝子由来部分を認識する抗体(一次抗体)及び該ポリペプチドのARHGAP6遺伝子由来部分又はARHGAP26遺伝子由来部分を認識する抗体(一次抗体)を接触させる工程を含む、[42]〜[44]のいずれかに記載の方法。
[46]下記i)〜v)に記載の工程をさらに包含する、[45]に記載の方法:
i)一次抗体にそれぞれ結合する、オリゴヌクレオチドが連結された二次抗体を添加する工程、ii)該二次抗体に連結された該オリゴヌクレオチドと部分的に相補的な二種類のオリゴヌクレオチド及びそれらが近接した際に該二種類のオリゴヌクレオチドをライゲーションさせて環状構造を形成することができるライゲースを含有するライゲーション溶液を添加し、ライゲーション反応させる工程、iii)形成された環状構造に沿って核酸を伸長させる工程、iv)伸長した核酸にハイブリダイズすることのできる標識されたオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程、及び、v)該標識シグナルを検出する工程。
[47]被験者から試料を得る工程を包含する、[42]〜[46]のいずれかに記載の方法。
[48]ARHGAP6阻害剤若しくはARHGAP26阻害剤、及び/又はCLDN18遺伝子とARHGAP6遺伝子との融合遺伝子若しくはCLDN18遺伝子とARHGAP26遺伝子との融合遺伝子により惹起される異常シグナルを遮断する薬剤による治療の適応対象となる膵がんに罹患していることが疑われる被験者又は膵がんに罹患している被験者を同定する方法であって、[42]〜[46]のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
[49]被験者から試料を得る工程を包含する、[48]に記載の方法。
[50][42]〜[44]のいずれかに記載のポリペプチドが被験者から得た試料から検出された場合に該被験者がARHGAP6阻害剤若しくはARHGAP26阻害剤、及び/又はCLDN18遺伝子とARHGAP6遺伝子との融合遺伝子若しくはCLDN18遺伝子とARHGAP26遺伝子との融合遺伝子により惹起される異常シグナルを遮断する薬剤による治療の適応対象であると判定し、検出されなかった場合に該被験者が該治療の適応対象でないと判定する工程をさらに包含する、[48]又は[49]に記載の方法。
[51]膵がんに罹患していることが疑われる被験者又は膵がんに罹患している被験者から得た試料中のCLDN18とARHGAP6との融合蛋白質又はCLDN18とARHGAP26との融合蛋白質を検出するための検出用キットであって、[42]〜[44]のいずれかに記載のポリペプチドのCLDN18遺伝子由来部分を認識する抗体(一次抗体)及び該ポリペプチドのARHGAP6遺伝子由来部分又はARHGAP26遺伝子由来部分を認識する抗体(一次抗体)を含む、融合蛋白質の検出用キット。
[52]一次抗体にそれぞれ結合する、オリゴヌクレオチドが連結された二次抗体、該二次抗体に連結された該オリゴヌクレオチドと部分的に相補的な二種類のオリゴヌクレオチド、それらが近接した際に該二種類のオリゴヌクレオチドをライゲーションさせて環状構造を形成することができるライゲース、環状構造に沿って核酸を伸長させることができるポリメラーゼ、及び標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む、[51]に記載の検出用キット。
[53]下記(1)又は(2)に記載のポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド:
(1)配列番号2、4、6若しくは8に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(2)配列番号2、4、6若しくは8に示されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。
[54]下記(1)〜(3)のいずれかに記載のポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド:
(1)配列番号2、4、6若しくは8に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含み、かつ腫瘍進展能を有するポリペプチド、
(2)配列番号2、4、6若しくは8に示されるアミノ酸配列を含み、かつ腫瘍進展能を有するポリペプチド、又は、配列番号2、4、6若しくは8に示されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ腫瘍進展能を有するポリペプチド、
(3)配列番号2、4、6若しくは8に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
本発明の方法には、1.融合遺伝子陽性の被験者を選別する方法と、2.融合遺伝子にコードされる融合蛋白質陽性の被験者を選別する方法(以下にまとめて「本発明の選別方法」ともいう。)とが含まれる。さらに、本発明の方法には、3.ARHGAP6阻害剤若しくはARHGAP26阻害剤、及び/又はCLDN18遺伝子とARHGAP6遺伝子との融合遺伝子若しくはCLDN18遺伝子とARHGAP26遺伝子との融合遺伝子により惹起される異常シグナルを遮断する薬剤による治療の適応対象となる被験者を同定する方法(以下、「本発明の同定方法」ともいう。)が含まれる。本発明の方法は、被験者から得た試料中の、特定のポリヌクレオチド又はポリペプチドの存在を検出する工程を含む。
配列番号3に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、CLDN18遺伝子(NCBI登録番号:NM_001002026.2)の塩基番号54(CDSの5’末端に対応)から803と、ARHGAP6遺伝子(NCBI登録番号:NM_006125.2)の塩基番号1462から3171までの塩基配列のポリヌクレオチドである。
配列番号5に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、CLDN18遺伝子(NCBI登録番号:NM_001002026.2)の塩基番号54(CDSの5’末端に対応)から803と、ARHGAP26遺伝子(NCBI登録番号:NM_015071.4)の塩基番号1143から2480までの塩基配列のポリヌクレオチドである。
配列番号7に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、CLDN18遺伝子(NCBI登録番号:NM_001002026.2)の塩基番号54(CDSの5’末端に対応)から803と、ARHGAP26遺伝子(NCBI登録番号:NM_001135608.1)の塩基番号1143から2315までの塩基配列のポリヌクレオチドである。
本発明の融合遺伝子陽性の被験者を選別する方法における「ポリヌクレオチドの存在を検出する工程」(本明細書において、本発明の「ポリヌクレオチドの存在を検出する工程」と称する。)において、その検出対象となるポリヌクレオチド(本明細書中において「検出対象ポリヌクレオチド」と称する)としては、CLDN18遺伝子とARHGAP6遺伝子との融合部を含むポリヌクレオチド又はCLDN18遺伝子とARHGAP26遺伝子との融合部を含むポリヌクレオチドが挙げられる。検出対象ポリヌクレオチドにおける「融合部」とは、検出対象ポリヌクレオチドにおけるCLDN18遺伝子由来の部分とARHGAP6遺伝子由来の部分又はCLDN18遺伝子由来の部分とARHGAP26遺伝子由来の部分とが融合した部分を意味する。
(1)配列番号2、4、6若しくは8に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(2)配列番号2、4、6若しくは8に示されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。
前記ポリペプチドは、さらに腫瘍進展能を有していてもよい。
Gap penalty = 10
Extend penalty = 0.5
Matrix = BLOSUM62
(1)配列番号2、4、6若しくは8に示されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ腫瘍進展能を有するポリペプチド、
(2)配列番号2、4、6若しくは8に示されるアミノ酸配列を含み、かつ腫瘍進展能を有するポリペプチド。
(3)配列番号17若しくは19に示される塩基配列との同一性が90%以上である塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(4)配列番号17若しくは19に示される塩基配列において、1〜10個の塩基が欠失、置換、挿入、及び/又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド。
Gap penalty = 10
Extend penalty = 0.5
Matrix = DNAfull
本発明の融合蛋白質陽性の被験者を選別する方法は、「CLDN18とARHGAP6との融合蛋白質又はCLDN18とARHGAP26との融合蛋白質」(本明細書において、「本発明の融合蛋白質」と称する。)陽性の被験者を検出する方法であり、当該融合蛋白質は、CLDN18遺伝子とARHGAP6遺伝子との融合遺伝子にコードされる融合蛋白質又はCLDN18とARHGAP26遺伝子との融合遺伝子にコードされる融合蛋白質である。
また、本発明の「ポリヌクレオチドの存在を検出する工程」及び本発明の「ポリペプチドの存在を検出する工程」は、ARHGAP6阻害剤若しくはARHGAP26阻害剤、及び/又はCLDN18遺伝子とARHGAP6遺伝子との融合遺伝子若しくはCLDN18遺伝子とARHGAP26遺伝子との融合遺伝子により惹起される異常シグナルを遮断する薬剤による治療の適応対象となる被験者(膵がん患者)を同定する方法にも使用することができる。ARHGAP6又はARHGAP26の阻害剤として、例えば、機能阻害剤又は発現阻害剤を挙げることができる。機能を阻害するとは、ARHGAP6又はARHGAP26の蛋白質としての機能を阻害することをいう。発現を阻害するとは、本発明の融合遺伝子をコードする核酸の転写、及び/若しくは蛋白質への翻訳を阻害すること、又は当該蛋白質の分解を亢進することをいう。CLDN18遺伝子とARHGAP6遺伝子との融合遺伝子又はCLDN18遺伝子とARHGAP26遺伝子との融合遺伝子により惹起される異常シグナルとして、これらの融合遺伝子非発現下に比較してこれらの融合遺伝子発現下で亢進又は抑制されるシグナル、例えば細胞増殖を亢進するシグナル又はプログラム細胞死を抑制するシグナルなどが挙げられる。CLDN18遺伝子とARHGAP6遺伝子との融合遺伝子又はCLDN18遺伝子とARHGAP26遺伝子との融合遺伝子により惹起される異常シグナルを遮断する薬剤として、例えば、細胞増殖亢進シグナルを下方制御する薬剤又はプログラム細胞死抑制シグナルを解除する薬剤を挙げることができる。
本発明は、本発明の方法で使用されるプライマーセット、プローブ、プローブセット及び検出用キットを包含する。
配列番号1の塩基番号1から750からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び、配列番号1の塩基番号751から3087からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
配列番号3の塩基番号1から750からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び、配列番号3の塩基番号751から2460からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
配列番号5の塩基番号1から750からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び、配列番号5の塩基番号751から2088からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、又は
配列番号7の塩基番号1から750からなるポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び、配列番号7の塩基番号751から1923からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
配列番号1の塩基番号1から750間の任意の連続する少なくとも16塩基からなるセンスプライマー及び配列番号1の塩基番号751から3087間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
配列番号3の塩基番号1から750間の任意の連続する少なくとも16塩基からなるセンスプライマー及び配列番号3の塩基番号751から2460間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、
配列番号5の塩基番号1から750間の任意の連続する少なくとも16塩基からなるセンスプライマー及び配列番号5の塩基番号751から2088間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット、又は
配列番号7の塩基番号1から750間の任意の連続する少なくとも16塩基からなるセンスプライマー及び配列番号7の塩基番号751から1923間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
配列番号1の塩基番号1から750の任意の連続する少なくとも16塩基(好ましくは16〜30塩基、より好ましくは18〜25塩基)のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種(好ましくは10〜25種、より好ましくは18〜22種、さらに好ましくは20種のプローブペア)、及び配列番号1の塩基番号751から3087の任意の連続する少なくとも16塩基(好ましくは16〜30塩基、より好ましくは18〜25塩基)のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種(好ましくは10〜25種、より好ましくは18〜22種、さらに好ましくは20種のプローブペア)、
配列番号3の塩基番号1から750の任意の連続する少なくとも16塩基(好ましくは16〜30塩基、より好ましくは18〜25塩基)のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種(好ましくは10〜25種、より好ましくは18〜22種、さらに好ましくは20種のプローブペア)、及び配列番号3の塩基番号751から2460の任意の連続する少なくとも16塩基(好ましくは16〜30塩基、より好ましくは18〜25塩基)のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペア複数種(好ましくは10〜25種、より好ましくは18〜22種、さらに好ましくは20種のプローブペア)、
配列番号5の塩基番号1から750の任意の連続する少なくとも16塩基(好ましくは16〜30塩基、より好ましくは18〜25塩基)のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種(好ましくは10〜25種、より好ましくは18〜22種、さらに好ましくは20種のプローブペア)、及び配列番号5の塩基番号751から2088の任意の連続する少なくとも16塩基(好ましくは16〜30塩基、より好ましくは18〜25塩基)のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種(好ましくは10〜25種、より好ましくは18〜22種、さらに好ましくは20種のプローブペア)、又は
配列番号7の塩基番号1から750の任意の連続する少なくとも16塩基(好ましくは16〜30塩基、より好ましくは18〜25塩基)のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペアを複数種(好ましくは10〜25種、より好ましくは18〜22種、さらに好ましくは20種のプローブペア)、及び配列番号7の塩基番号751から1923の任意の連続する少なくとも16塩基(好ましくは16〜30塩基、より好ましくは18〜25塩基)のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む隣接したプローブペア複数種(好ましくは10〜25種、より好ましくは18〜22種、さらに好ましくは20種のプローブペア)。
[実施例1]
CLDN18−ARHGAP6/26融合遺伝子の融合部を含むポリヌクレオチドの検出
国立がん研究センター中央病院及び要町病院の膵癌患者26人から包括同意に基づき回収した腹水沈渣を、試薬の標準プロトコルに従いISOGEN(ニッポンジーン社)に懸濁、保存の上、上記保存溶液からtotal RNAを精製した。その後、1μgのtotal RNAを鋳型として、High―Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を用いて試薬の標準プロトコルに従い逆転写反応を行うことで、cDNAを合成した。次に、上記cDNAを鋳型(total RNA換算で100ng)として、DNAポリメラーゼ(AccuPrimeTM Taq DNA Polymerase;サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を使用して20μLの反応容量でPCR(94℃2分に続いて94℃15秒、55℃15秒、68℃1分を30サイクル又は35サイクル)を行い、当該融合遺伝子の融合部を含む領域の増幅を行った。この際にCLDN18−ARHGAP6の増幅には、配列番号9に示されるCLD−ARH_C6A12_partial fwd01及び配列番号10に示されるCLDN18−ARHGAP6_CDS_R893をプライマーとして用いた。一方でCLDN18−ARHGAP26の増幅には、上記CLD−ARH_C6A12_partial fwd01と配列番号11に示されるCLD−ARH_C6A12_partial rev01をプライマーとして用いた。その後、得られたPCR産物2μLを鋳型として上記と同じ条件でnested PCRを行った。その際にCLDN18−ARHGAP6の増幅には、配列番号12に示されるCLD−ARH_C6A12_partial fwd02及び配列番号13に示されるCLDN18−ARHGAP6_CDS_R815をプライマーとして用いた。一方でCLDN18−ARHGAP26の増幅には、上記CLD−ARH_C6A12_partial fwd02と配列番号14に示されるCLD−ARH_C6A12_partial rev02をプライマーとして用いた。上記プライマーにより、CLDN18−ARHGAP6融合遺伝子が存在する場合には300bp程度の鎖長のPCR産物が、CLDN18−ARHGAP26融合遺伝子が存在する場合には500bp程度の鎖長のPCR産物が、それぞれ生じることが予想される。また、鋳型cDNAの量が一定であることを確認するため、配列番号15に示されるACTB_F2及び配列番号16に示されるACTB_R2のプライマーを用いて、上記と同じDNAポリメラーゼを使用してACTB(β―アクチン)のPCR(94℃2分に続いて94℃15秒、55℃15秒、68℃1分を25サイクル)を行った。その後、PCR産物を2%アガロースゲル(ロンザ社)で電気泳動したところ、CLDN18−ARHGAP6に関して全9検体において上記と同程度の鎖長を有するPCR産物を(9検体のうち1検体(No.193)について図1に示す)、またCLDN18−ARHGAP26に関しても1検体(No.164)において上記と同程度の鎖長のPCR産物を(図2)、確認した。
次に、上記PCR反応で増幅産物が確認された全症例について、そのPCR産物をクローニングベクター(TOPO TA Cloning(登録商標) Kit;サーモフィッシャーサイエンティフィック社)にクローニングした。インサートの塩基配列はユーロフィンジェノミクス株式会社のDNAシーケンス受託サービスを利用して決定した。この結果、CLDN18−ARHGAP6に関しては、増幅産物が確認された9検体全てにおいて、既に胃癌で報告されているCLDN18(NCBI登録番号:NM_001002026.2)の塩基番号803と、ARHGAP6(NCBI登録番号:NM_013427.2又はNCBI登録番号:NM_006125.2)の塩基番号1462とが融合した転写産物が存在していることを確認した。融合部の前後各40塩基、合計80塩基の配列を示す(図3)。またCLDN18−ARHGAP26に関しても、増幅産物が確認された1検体で、既に胃癌で報告されているCLDN18(NCBI登録番号:NM_001002026.2)の塩基番号803と、ARHGAP26(NCBI登録番号:NM_015071.4又はNCBI登録番号:NM_001135608.1)の塩基番号1143とが融合した転写産物が存在していることを確認した。融合部の前後各40塩基、合計80塩基の配列を示す(図3)。以上から、これまで報告のある胃癌だけでなく、膵がんにおいても、CLDN18−ARHGAP6/26融合遺伝子が存在することを明らかにした。
国立がん研究センター研究所バイオマーカー探索部門にて樹立済みの胃癌細胞株NSC−47Cに加えて、胃癌細胞株HSC−39(国立がん研究センター研究所動物実験部門から譲受)、胃癌細胞株KATO−III(JCRB0611、JCRB細胞バンク)、及び国立がん研究センター研究所バイオマーカー探索部門にて樹立済みの胃癌細胞株NSC−9Cの、合計4細胞株から調製したtotal RNAに対して、逆転写酵素を含むキットであるSuperScript(登録商標) III First−Strand Synthesis System (サーモフィッシャーサイエンティフィック社)及びオリゴ(dT)プライマー(オリゴ(dT)20プライマー;サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を用いて、試薬の標準プロトコルに従って逆転写反応を行い、cDNAを合成した。
参考例1に示した、CLDN18−ARHGAP26融合遺伝子を内在的に発現する胃癌細胞株NSC−47Cを、10%ウシ胎児血清(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)含有RPMI−1640培地(和光純薬)で培養後、遺伝子導入試薬DharmaFECTTM1(GEヘルスケア社)の標準プロトコルに従って目的のsiRNAの導入(「siRNA処理」とも称する)を行った。具体的には、上記胃癌細胞株を6ウェルプレート(140675、ヌンク社)に1ウェルあたり2×105細胞播種した後、CLDN18を標的とするsiRNA(s27688、サーモフィッシャーサイエンティフィック社)、ARHGAP26を標的とするsiRNA(s23013及びs23015、サーモフィッシャーサイエンティフィック社)及びコントロールsiRNA(AM4611、サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を、75pmol(終濃度75nM)となるようそれぞれ細胞に添加し、37℃、5%CO2環境下で72時間培養した。ARHGAP26を標的とするsiRNAのうち、s23013はその配列から野生型遺伝子及び当該融合遺伝子を標的とし、s23015はその配列から野生型遺伝子のみを標的とし当該融合遺伝子は標的としないことが期待される。またCLDN18を標的とするsiRNAはその配列から野生型遺伝子及び当該融合遺伝子を標的とすることが期待される。以下、コントロールsiRNAで処理した群をControl siRNA群、CLDN18を標的とするsiRNAで処理した群をCLDN18 siRNA群、ARHGAP26を標的とするsiRNAのうちs23013で処理した群をARHGAP26 siRNA(Wild&Fusion)群、s23015で処理した群をARHGAP26 siRNA(Wild)群、とそれぞれ称する。
Claims (11)
- 膵がんに罹患していることが疑われる被験者又は膵がんに罹患している被験者から得た試料中の、クローディン18(CLDN18)遺伝子とロージーティーピーアーゼアクティベーティングプロテイン6(ARHGAP6)遺伝子との融合部を含むポリヌクレオチド又はクローディン18(CLDN18)遺伝子とロージーティーピーアーゼアクティベーティングプロテイン26(ARHGAP26)遺伝子との融合部を含むポリヌクレオチドの存在を検出する工程を含む、CLDN18遺伝子とARHGAP6遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者又はCLDN18遺伝子とARHGAP26遺伝子との融合遺伝子陽性の被験者を選別する方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、下記(1)又は(2)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、請求項1に記載の方法:
(1)配列番号2、4、6若しくは8に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(2)配列番号2、4、6若しくは8に示されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。 - 前記(1)又は(2)のポリペプチドが、腫瘍進展能を有する、請求項2に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号2、4、6又は8に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、請求項2に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、下記(3)又は(4)のポリヌクレオチドである、請求項1に記載の方法:
(3)配列番号17若しくは19に示される塩基配列との同一性が90%以上である塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(4)配列番号17若しくは19に示される塩基配列において、1〜10個の塩基が欠失、置換、挿入、及び/又は付加された塩基配列を含むポリヌクレオチド。 - 前記ポリヌクレオチドが、配列番号17、18、19、20又は21に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項5に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドの存在を検出するために、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程、及び/又は、被験者から得た試料中の核酸にプローブをハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 以下のプライマーセットを用いて、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を包含する、請求項7に記載の方法:
CLDN18遺伝子とARHGAP6遺伝子との融合遺伝子又はCLDN18遺伝子とARHGAP26遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、CLDN18をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びARHGAP6をコードする部分又はARHGAP26をコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含み、該アンチセンスプライマーは、前記ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなり、該センスプライマーは、前記ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなる、プライマーセット。 - 試料が体液又は体腔洗浄液である、請求項1から8のいずれかに記載の方法。
- 試料が腹水又は腹腔洗浄液である、請求項1から9のいずれかに記載の方法。
- ARHGAP6阻害剤若しくはARHGAP26阻害剤、及び/又はCLDN18遺伝子とARHGAP6遺伝子との融合遺伝子若しくはCLDN18遺伝子とARHGAP26遺伝子との融合遺伝子により惹起される異常シグナルを遮断する薬剤による治療の適応対象となる膵がんに罹患していることが疑われる被験者又は膵がんに罹患している被験者を同定する方法であって、請求項1から10のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
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