KR101756528B1 - Ros에 의한 tert 발현 억제를 통한 간질환 치료제 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

본원은 PI3K-Akt/β-카테닌 기전을 통한 ROS에 의한 TERT의 발현 증가에 기반한 간암 치료제를 스크리닝하는 방법을 개시하며, 본원에 따른 방법에 의해 스크리닝된 물질은 효과적인 간암치료제로 사용될 수 있다.

Description

ROS에 의한 TERT 발현 억제를 통한 간질환 치료제 스크리닝 방법 {Method for screening agents for treating liver disease through inhibition of ROS-mediated TERT expression}

본원은 ROS에 의한 TERT 발현 억제를 통한 간질환 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

간암은 전세계 암관련 사망의 두 번째 주요 원인으로, 이중 간세포암(hepatocellular carcinoma(HCC))은 전체 간암의 85%를 차지한다. HCC의 대략 70-80%는 종양이 진행암 단계(advanced grade)로 진행되었을 때 발견된다. HCC의 주요 원인 인자는 간경변(liver cirrhosis)이다. 그러나 간경변이 간염바이러스(HBV 및 HCV) 감염, 알코올 소비, 및 비알코올성 지방간염과 같은 다른 요인에 의해 유발될 수 있듯이, 간경변에만 기초하여 HCC 환자에 대한 치료 전략을 계획하는 것은 어렵다. 따라서 간세포암의 치료를 위해서는 발암현상에 존재하는 다양한 분자 기전의 규명이 필요하다. Wnt-β-카테닌 경로, p53-Rb 경로, 크로마틴 리모델링 및 포스파티딜이노시톨 3-키나제-Akt 포유류라파마이신 표적 (PI3K-Akt-mTOR) 경로 모두 HCC 진행에 관련성이 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 사실에도 불구하고 초기 HCC(GI HCC)부터 진행성 HCC(GII 및 GIII HCC)까지 진행의 주요 결정인자는 알려져 있지 않다.

진행성 HCC를 포함한, 다양한 인간 암에서 키나아제 활성은 제어가 곤란한 것으로 알려져 있다. 현재 강력한 멀티키나아제 저해제인 소라페닙(sorafenib)만이 진행성 HCC를 치료하는 약물로 승인받았다. 소라페닙은 미토젠-활성화 단백질 키나아제(MAPK) 경로, 다양한 VEGFR (vascular endothelial growth factor receptor) 경로, 및 혈소판-유래 성장 인자 수용체-β(platelet-derived growth factor receptor-β (PDGFR)) 경로를 저해하는 작용을 하지만, PI3K-Akt 경로를 직접적으로 저해하지 않는다. 비록 PI3K-Akt-mTOR 및 Wnt-β-카테닌 경로가 간암에서 활성화된 주요 시그널링 경로인 것으로 보고되어 있지만, 각 경로를 자극하는 업스트림 인자는 아직 보고되지 않았다.

대한민국 공개특허공보 2010-0041937 (2010년 4월 23일 공개)

본원은 간세포암을 일으키는 원인 및 그 기전을 규명한 것으로, ROS에 의한 TERT 발현 억제를 통한 간질환 치료제 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 ROS의 농도가 증가된 간암세포를 제공하는 단계; 상기 세포를 TERT (Telomerase Reverse Transcriptase) 발현을 억제할 것으로 기대되는 시험물질과 접촉하는 단계; 및 상기 시험물질과 접촉된 세포와 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군 세포에서 상기 TERT의 발현 정도를 비교하여, 상기 시험물질과 접촉된 세포에서 상기 TERT의 발현이 상기 대조군의 TERT 발현과 비교하여 감소한 경우 이를 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는 간암 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

본원에 따른 스크리닝 방법에 사용되 간암세포는 예를 들면 HepG2, Huh7, Hep3B, 또는 SNU449를 포함하는 세포주 또는 간암조직에서 유래된 세포를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 방법에서 간암세포에서 증가된 ROS는 TERT의 발현을 증가시키고 궁극적으로 텔로미어 길이를 신장시키며, 이는 PI3K/AKT 신호전달 경로를 통한 것이며, 따라서 이러한 경로를 통해 TERT의 발현 및/또는 텔로미어의 길이 신장을 억제 또는 감소 시킬 수 있는 시험물질이 사용될 수 있다.

ROS는 PI3K/AKT 신호전달 경로를 통해 -카테닌의 핵으로의 이동을 유도하고, 이는 핵에서 TERT의 발현을 증가시키고 텔로미어의 길이를 신장 또는 증가시킨다.

이런 측면에서 본원에 따른 방법은 -카테닌이 핵에 존재하는지 여부를 검출하는 단계를 추가로 포함하며, 대조군과 비교하여 상기 카테닌의 핵으로의 이동이 감소한 경우, 상기 시험물질을 후보물질로 선별하는 단계를 포함한다.

또한 본원에 따른 방법은 상기 세포에서 텔로미어 길이 변화여부를 검출하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 대조군과 비교하여 텔로미어의 길이가 감소된 경우, 상기 시험물질을 후보물질로 선별한다.

본원에 따른 스크리닝 방법은 ROS가 간세포암에서 TERT의 발현을 증가시키며 이러한 증가는 PI3K-Akt/β-카테닌 기전의 규명에 근거한 것으로, 이러한 기전을 억제하는 물질은 효과적인 간암치료제를 제공할 수 있다.

도 1은 본원의 일 실시예에 따른 ROS가 HCC 세포주에서 텔로머라아제역전사효소-매개 텔로미어 신장(elongation)을 촉진한다는 것을 나타낸다. GI, GII, 및 GIII HCC 종양 조직에서의 (A) TERT 발현, (B) 텔로미어 형광, 및 (C) 8-옥소-dG 형광을; y축은 종양 조직에 대한 비종양 간경변 조직의 비율을 나타낸다. GI, GII, 및 GIII은 각각 HCC 그레이드 I, II, 및 III을 나타낸다. 수평바는 평균 TERT 발현(n = 78), 텔로미어 길이(n = 133), 및 ROS 레벨(n = 133)을 나타낸다. TERT 발현은 β-액틴의 것에 노말라이즈하였다. ROS 레벨은 8-옥소-dG 형광 레벨로 측정하였다. (D 및 E) 다양한 과산화 수소(H₂O₂) 농도에서의 세포 생존율(라이트 블루), 텔로미어 형광(적색), 및 TERT 발현(검정색)의 퍼센트, 및 TERT 단백질의 면역블롯 분석을 나타낸다. 평균 텔로미어 길이는 Flow FISH로 결정하였다. Hep3B cells:D, Huh7 cells:E. (F) 300μM H₂O₂- 및 mock-처리 Hep3B 및 Huh7 세포에서의 텔로머라아제 활성을 나타낸다. D, E 및 F에 나타난 수치는 평균 ±SEM(각 그룹당 n=4)로 나타내었다; ** P < 0.01.
도 2는 본원의 일 실시예에 따른, HCC 조직에서의 ROS 레벨은 더 긴 텔로미어와 관련이 있다. (A) low 또는 high 8-옥소-dG 형광을 가진 HCC 조직에서의 평균 텔로미어 형광(수평바). n=133. (B) 선영회귀분석에서, HCC 조직의 텔로미어 형광 및 8-옥소-dG 형광사이에 정적(positive) 상관관계를 보여준다. n=133. (C) HCC FFPE(formalin-fixed, paraffin-embedded) 조직(SMH 코호트, n=133)(좌) 및 냉동 조직(KU 코호트, n=78)(우)에서의 TERT 프로모터 돌연변이 빈도. (D 및 E) WT 또는 돌연변이 TERT 프로모터를 가진 HCC 조직에서의 평균 TERT 발현(n=78) (D) 및 평균 텔로미어 형광(n=133)(E); 수평바는 평균치를 나타낸다. WT는 야생형을 의미한다. (F) 그레이드 III HCC 조직에서의 면역형광 염색을 한 텔로미어(노란색), 8-옥소-dG(적색), 핵(파란색) 및 센트로미어(녹색); 스케일 바, 40㎛.
도 3은 본원의 일 실시예 따른 ROS가 HCC 세포 라인에서 β-카테닌-매개 텔로머라아제 역전사효소 상향조절을 촉진한다는 것을 나타낸다. (A) PI3K 또는 Akt 저해제-처리 Huh7 세포라인에서의 TERT 발현 및 면역블롯 분석. TERT 발현은 β-액틴의 것으로 노말라이즈되었다. (B) 300μM H₂O₂- 및 mock-처리 Hep3B 및 Huh7 세포에서의 TERT, β-카테닌, p-Akt (인산화 Akt), Akt, p-GSK3β (인산화 글리코겐 합성효소 키나아제 3β)의 면역블롯 분석. (C) 핵 및 세포질 추출물에서 얻은 β-카테닌의 면역블롯. 라민 B1 및 α-튜블린은 각각 핵 및 세포질 분획의 로딩 대조군으로 작용한다. (D) 대조군 IgG 및 β-카테닌 항체를 사용한 300μM H₂O₂-처리 Huh7 세포의 핵 추출물 또는 면역침강 생성물(IP)은, 왼쪽에 지시되어 있는 항체를 사용한 면역블롯 분석(IB)의 영향을 받는다. (E) 300μM H₂O₂- 및 mock-처리 Huh7 세포에서의 β-카테닌 또는 SetD1A의 면역형광 염색. 스케일 바, 10㎛. (F) 300μM H₂O₂- 및 mock-처리 Huh7 세포에서의 TERT 프로모터의 β-카테닌 상호작용 부위를 사용한 ChIP. β-cat: β-카테닌, Pol II: RNA 폴리머라제 II. 수치는 평균 ±SEM(그룹당 n=4); ** P < 0.01 및 *** P < 0.001 by t-test.
도 4는 본원의 일 실시예에 따른 ROS 레벨이 GIII HCC 종양 조직에서 β-카테닌 및 TERT의 핵 발현과 연관되어 있다는 것을 나타낸다. (A) GIII HCC 종양 및 비종양 조직에서의 β-카테닌(노란색), 8-옥소-dG(적색), TERT(녹색), 및 핵(청색)의 면역형광 이미지를 나타낸다. 스케일 바, 40㎛. (B) GIII HCC 종양 및 상응하는 비종양 조직의 핵에서의 β-카테닌, 8-옥소-dG, 및 TERT의 공동-국재화를 평가하는 핵 공동국재화 스코어. 핵 공동-국재화 스코어는 β-카테닌, 8-옥소-dG, 및 TERT의 공동 국재화를 나타내는 핵의 퍼센트를 결정함으로써 측정하였다; 총 핵 수는 100 내지 120핵의 범위인 것으로 분석되었다. 그레이딩 시스템은 하기와 같다: 0, 공동-국재화를 나타내는 핵의 퍼센트가 0% ≤ ; 1, 20% < 공동-국재화를 나타내는 핵의 퍼센트 ≤ 40%; 2, 40% < 공동-국재화를 나타내는 핵의 퍼센트 ≤ 60%; 3, 60% < 공동-국재화를 나타내는 핵의 퍼센트 ≤ 80%; 4, 80% < 공동-국재화를 나타내는 핵의 퍼센트 ≤ 100%. 세 개의 관측의 평균 스코어를 각 조직 샘플(그룹당 n=25)의 대표적 스코어로 정하였다. 데이타는 대표 스코어 및 평균으로 나타내었다. P 수치는 양측검정(two-tailed paired t-test)으로 계산하였다.
도 5는 HCC 세포라인에서 PI3K-Akt-β-카테닌-TERT 활성화를 통하여 ROS가 TERT 발현을 촉진한다. (A) GSK3β 저해제, 300μM H₂O₂를 처리하거나 또는 언제나 활성인 GSK3β 인산화 돌연변이(GSK3β S9A)의 이소성 발현(ectopic expression)일 때의 Huh7 세포에서의 TERT 발현을 정량한 것이다. pcDNA3 빈 벡터(empty vector)를 음성 대조군으로 사용하였다. (B) Huh7 세포에서 shNC-(비 타겟팅 shRNA) 및 shRNA-매개 β-카테닌 (CTNNB1) 녹다운 사이의 TERT 발현의 비교. (C, D 및 E) PI3K 저해제(C), Akt 저해제(D) 또는 GSK3β 저해제(E)를 사용한 Huh7 세포의 ChIP. 수치는 평균 ±SEM를 나타낸다(그룹당 n=4); ** P < 0.01 and *** P < 0.001 by t-test.
도 6은 본원의 일 실시예에 따른, HCC 환자에게서의 ROS 레벨이 낮은(poor) 전체 생존율 및 무재발 생존율과 양적 상관관계를 가진다는 것을 나타낸다. (A, B, 및 C) 텔로미어 형광(A), 8-옥소-dG 형광(B), 및 TERT 프로모터 돌연변이 상태(C)에 상대적인 전체 생존율 및 무재발 생존율(전체 생존율에서 n=133 그리고 무재발 생존율에서 n=118). 텔로미어 또는 8-옥소-dG 형광에 근거하거나 또는 TERT 프로모터 돌연변이 상태에 근거하여 시료(SMH 코호트)를 두 개의 그룹으로 분리하였다. 생존율은 카플란-마이어 방법(Kaplan-Meier method)을 사용하여 측정하였고; 생존율의 차이는 로그-랭크 테스트(log-rank test)를 사용하여 비교하였다. 상응하는 위험비(hazard ratio =HR)은 생존 플롯에 나타내었다. (D) 진행 HCC에서 ROS의 잠재 기능을 나타내는 분자모델. 고양된 ROS 레벨은 진행 HCC에서 Akt 시그널링을 활성화함으로써 TERT를 상향조절한다. Akt 활성화는 GSK3β 활성을 억제하고; GSK3β 불활성화는 연속적으로 핵에서 β-카테닌 단백질 축적을 가능하게 한다. TERT 프로모터에서 β-카테닌 점증(recruitment)은 TERT 발현을 증가시켜, 텔로미어 신장(elongation)으로 이끈다. RNA Pol II, RNA polymerase II.
도 7은 과산화수소를 처리하면 텔로미어의 길이와 TERT 발현이 증가한다는 것을 나타낸다. (A) mock 처리, 300μM H₂O₂ 처리, NAC와 함께 300μM H₂O₂ 처리, 및 NAC-단독 처리에 따른 Huh7 세포에서의 메타기 염색체의 정량적 FISH (Q-FISH) 분석. 메타기 염색체는 DAPI 및 PNA-프로브를 사용하여 염색하였다. 텔로미어 DNA는 Cy3-접합 (CCCTAA)3-함유 PNA 프로브를 사용하여 FISH로 탐지하였다(적색). 스케일 바: 10㎛. (B) RNA-seq를 사용하여 300μM H₂O₂- 및 mock-처리 Huh7 세포 라인에서의 TERT 발현을 정량화한 것이다. FPKM은 맵핑된 백만 분획당 천염기 엑손당 분획(fragments per kilobase of exon per million fragments mapped)을 나타낸다. B에 있는 에러 바는 피셔의 정확검정법(Fisher’s exact test)에 근거하여 평균 및 P 수치의 SD를 나타낸다. (C 및 D) 300μM H₂O₂ - 및 mock-처리 SNU-449 및 HepG2 세포라인에서의 텔로미어 길이(텔로미어 형광)(C) 및 TERT 발현(D)의 정량화. TERT 발현은 β-액틴의 것으로 정량화되었다. B를 제외하고, 모든 수치는 평균 ± SEM으로 나타낸다. * P < 0.05 and ** P < 0.01 by paired t-test.
도 8은 본원의 일 실시예에 따라, PMS 또는 파라과트(paraquat)로 처리하면 텔로미어 길이 및 TERT 발현을 증가시킨다는 것을 나타낸다. (A 및 B) 4μM PMS (A) 또는 50μM 파라과트 (PQ) (B)로 처리한 후 Hep3B 및 Huh7 세포 라인에서의 텔로미어 길이(텔로미어 형광)을 그래프로 나타낸 것이다. 텔로미어 길이는 Flow FISH를 사용하여 측정하였다. (C 및 D) 4μM PMS (C) 또는 50μM PQ (D)로 처리한 후 Hep3B 및 Huh7 세포 라인에서의 TERT 발현을 정량화한 것이다. TERT 발현은 β-액틴의 것으로 노말라이즈하였다. 모든 수치는 평균 ± SEM으로 나타낸다(그룹당 n=4). * P < 0.05 및 ** P < 0.01 by paired t-test.
도 9는 본원의 일 실시예에 따라, HCC 종양에 돌연변이를 가진 TERT 프로모터 서열을 나타낸 것이다. HCC 종양 조직에서 TERT 프로모터에서의 C228T 돌연변이 및 비-종양 조직에서 얻은 TERT 프로모터에서의 야생형 서열(좌). HCC 종양 조직에서 TERT 프로모터에서의 C250T 돌연변이 및 비-종양 조직에서 TERT 프로모터에서의 야생형 서열(우).
도 10은 본원의 일 실시예에 따라, GIII HCC 종양 조직 및 비-종양 조직에서 β-카테닌, 8-옥소-dG, 및 TERT의 면역형광 분석을 나타낸 것이다. 합해진 이미지는 β-카테닌 (노란색), 8-옥소-dG (적색), TERT (녹색), 및 핵(청색)의 공동-편재화를 나타낸다. 상응하는 환자에 대한 케이스 ID가 좌측에 기재되어 있다. 스케일 바: 40㎛.
도 11은 본원의 일 실시예에 따라, CTNNB1-녹다운(위) 또는 SNAI1-녹다운 Huh7 세포(밑)의 각 레인에 동등 양의 단백질이 탑재되어 있는 것을 나타내는, 항-β-액틴 항체를 사용한 면역블롯 이미지를 나타낸 것이다.

본원은 간암에서 ROS의 농도가 증가되어 있으며, ROS는 PI3K-Akt-β-카테닌 시그널링 경로를 활성화하여 TERT 발현을 증가시킴으로써 간암 세포에서 텔로미어 신장을 자극하여 암의 진행을 촉진한다는 발견에 근거한 것이다.

따라서 한 양태에서 본원은 ROS가 증가된 간암 세포를 제공하는 단계; 상기 세포를 시험물질과 접촉하는 단계; 및 상기 시험물질과 접촉된 세포와 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군에서 TERT의 발현을 분석하는 단계를 포함하며, 상기 분석결과 상기 시험물질과 접촉된 세포에서 상기 TERT의 발현이 대조군과 비교하여 감소한 경우 이를 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는 간세포암 치료 물질 스크리닝 방법에 관한 것이다.

활성 산소종 ROS (Reactive Oxygen Species)는 산소분자에서 유래된 다수의 반응성(reactive) 분자 및 자유 라디칼을 일컫는 것으로, 산소 호흡과정에서 미토콘드리아의 전자 수송과정에서 또는 산화환원 효소 등에 의해, 그리고 오염물질, 방사선, 약물 등과 같은 외부 자극을 통해, 산소의 연속적 환원에 의해 생성된다. 종류로는 수퍼옥사이드 음이온, 퍼옥사이드, 하이드로젠퍼옥사이드, 하이드록실 라디칼, 하이드록실 이온 등을 포함한다.

본원에서 간세포암 (Hepatocellular carcinoma, HCC) 또는 간암은 알콜 남용, 바이러스성 간염 및 대사성 간질환과 같은 위험인자를 갖는 환자에서 발생하는 간조직 자체에서 발생하는 원발성 악성 종양을 일컫는 것이다.

본원에 따른 방법에 사용되는 간암 세포는 ROS의 농도가 증가된 것이면 제한되지 않으며, 예를 들면 HepG2, Huh7, Hep3B, SUN449 또는 PLC/PRF/5 (인간 liver hapatoma)와 같은 세포주 또는 간암 조직 유래의 일차종양 세포가 사용될 수 있다. ROS의 과발현 또는 발현 증가는 간암 세포 또는 암세포가 아닌 정상 세포 또는 조직에서의 ROS의 농도와 비교하여 증가된 것을 의미하며, 증가된 정도를 용이하게 판단할 수 있다. ROS의 농도 및 종류를 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 본원 실시예에 기재된 방법을 참고할 수 있다.

본원에서 ROS를 과발현하는 세포주는 암의 발생을 억제할 것으로 기대되는 시험물질, 또는 후술하는 TERT 발현을 억제할 것으로 기대되는 시험물질, 또는 후술하는 PI3K-Akt-β-카테닌 시그널링을 통해 TERT 발현을 억제할 것으로 기대되는 시험물질을 의미하며, 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 핵산분자(예컨대, DNA, RNA, PNA 및 앱타머), 단백질, 당 및 지질 등을 포함하나 이로 한정하는 것은 아니다. 상기 시험물질은 2개 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 6개, 10개, 12개, 20개 이하 또는 20개 초과 예컨대 50개 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩타이드일 수 있다.

간암의 발생을 억제, 치료 및/또는 예방하는 약물의 스크리닝 목적을 위해서는 화합물은 저분자량의 치료효과를 갖는 것이 사용될 수 있다. 예를 들면 중량이 400 Da, 600 Da 또는 800 Da과 같은 약 1000 Da 내외의 화합물이 사용될 수 있다. 목적에 따라 이러한 화합물은 화합물 라이브러리의 일부를 구성할 수 있으며, 라이브러리를 구성하는 화합물의 숫자도 수십개부터 수백만개까지 다양하다. 이러한 화합물 라이브러리는 펩타이드, 펩토이드 및 기타 환형 또는 선형의 올리고머성 화합물, 및 주형을 기본으로 하는 저분자 화합물, 예컨대 벤조디아제핀, 하이단토인, 바이아릴, 카보사이클 및 폴리사이클 화합물 (예컨대 나프탈렌, 페노티아진, 아크리딘, 스테로이드 등), 카보하이드레이트 및 아미노산 유도체, 디하이드로피리딘, 벤즈하이드릴 및 헤테로사이클 (예컨대 트리아진, 인돌, 티아졸리딘 등)을 포함하는 것일 수 있으나, 이는 단지 예시적인 것으로 이로 한정되는 것은 아니다. 시험물질의 양은 사용하는 구체적인 실험방법 및 시험물질의 종류에 따라 달라지며, 당업자라면 적절한 양을 선택할 수 있을 것이다.

본원에서는 ROS가 TERT의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. 기존에는 정상세포에서 ROS에 의해 TERT의 발현이 감소하거나 이의 활성이 억제되는 것으로 알려져 있었다. 다양한 인간 종양의 진행에서 TERT(telomerase reverse transcriptase)-매개 활성에 의해 텔로미어 길이가 증가하고, 결과적으로 종양 세포 불멸화로 이끌게 된다. 정상세포에서 텔로미어는 각 세포분열 후에 짧아지고 결국 이들이 악화되면 세포 성장을 멈추고 노쇠 및 사멸로 이끈다.

따라서 본원의 방법에서 상기 시험물질과 접촉된 세포와 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군에서 TERT 발현을 비교하여, 상기 시험물질과 접촉된 세포에서 상기 TERT의 발현이 대조군과 비교하여 감소한 경우 이를 후보물질로 선별하는 단계를 포함한다. TERT의 발현은 mRNA 및/또는 단백질 수준에서의 변화를 포함하는 것이다. mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction), 경쟁 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 이러한 방법은 본원의 실시예 바로 앞 부분에 기재된 문헌리스트에서 적절한 것을 참고할 수 있다.

단백질의 농도를 측정하기 위한 방법도 공지되어 있으며, 예를 들면 실시예바로 앞 부분에 기재된 문헌리스트에서 적절한 것을 참고할 수 있다. 또한 예를 들면 세포에서 추출한 TERT 단백질과 그에 특이적인 항체 간의 "항원-항체 복합체" 형성을 이용한 방법, 웨스턴블랏, ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbant Assay), 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 조직면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS (Fluorescent Activated Cell Sorter), 단백질 칩 등을 들 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다. 상기 검출 방법들을 통하여, 대조군에서의 TERT mRNA 또는 단백질 발현량과 시험물질이 처리된 시험군에서의 발현량을 비교하여 그 양을 감소시킨 물질을 간암을 억제할 수 있는 후보물질로 선별한다. 이러한 물질은 간암 억제제로서 유용할 수 있다.

본원에 따른 방법에서 실험결과 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 존재하에서 대조군과 비교 약 99% 이하 감소, 약 95% 이하 감소, 약 90% 감소, 약 85% 감소, 약 80% 감소, 약 75% 감소, 약 70% 감소, 약 65% 이하 감소, 약 60% 이하 감소, 약 55% 감소, 약 50% 이하 감소, 약 45% 이하 감소를 의미하나, 이를 벗어나는 범위를 제외하는 것은 아니다.

아울러 본원에서는 증가된 ROS는 본원 실시예에 상세히 기재된 바와 같이 PI3K-Akt-β-카테닌 시그널링 경로를 활성화하여 TERT 발현을 증가시킴으로써 인간 HCC 세포에서 텔로미어 신장을 촉진한다는 것을 규명하였다. 이러한 결과는 ROS가 텔로머라아제 활성 증가를 촉진시키는데에 결정적 영향을 미치는 것을 의미한다.

PI3K(Phosphoinositide 3-kinase)-Akt(protein Kinase B)-β-카테닌 시그널링 경로는 기존에 인간 유방암에서 불량한 예후와 관련이 있는 것으로 알려져 있다 (Elena Lopez-Knowles et al., 2010. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 19, 301-309). 또한 PI3K/Akt 시그널링과 β-카테닌의 주요 시그널링 이라고 알려진 Wnt/β-카테닌 시그널링 간의 상호협력이 암의 진행에 관여한다고 알려져 있으나, PI3K-Akt-β-카테닌 시그널링 경로를 활성화하여 TERT 발현을 증가시키는 것은 본원에서 최초로 규명하였으며 β-카테닌은 핵으로 이동하여 TERT의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 이어 TERT 발현은 세포내 텔로미어의 길이를 증가시킨다.

따라서 본원에 따른 방법은 β-카테닌이 핵으로의 이동 또는 존재여부를 검출하는 단계를 추가로 포함하며, 대조군과 비교하여 상기 β 카테닌의 핵으로의 이동이 감소한 경우, 상기 시험물질을 후보물질로 선별하는 단계를 추가로 포함하며, 이러한 단계는 TERT의 발현 조절과 단독으로 또는 함께 사용되어 간암 치료제 후보물질의 스크리닝에 사용될 수 있다.

또한 본원에 따른 방법은 상기 세포에서 텔로미어 길이 증가되었는지 여부를 검출하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 대조군과 비교하여 텔로미어의 길이가 감소된 경우, 상기 시험물질을 후보물질로 선별한다.

암세포에서 텔로미어 길이가 증가되어 있다는 것은 알려진 사실로서, 당업자라면 정상세포와 암세포에서의 텔로미어의 길이를 구분할 수 있을 것이다. 텔로미어의 길이를 측정하는 방법은 관련된 기술분야에 알려진 것을 사용할 수 있으며 일반적으로 세포를 고정시킨 후 텔로미어를 특이적으로 인식할 수 있는 표지된 프로브를 사용하여 교잡반응을 수행한다. 프로브가 형광물질로 표지된 경우 콘포칼 현미경으로 형광 신호를 검출하여 형광 세기를 TFL-Telo 프로그램 (Wellspring, LLC, USA)을 사용하여 분석한다. 예를 들면 본원의 실시예에 기재된 방법을 사용하여 측정할 수 있다.

본 발명은 달리 언급이 없는 한 세포생물학, 세포배양, 분자생물학, 유전자 형질전환 기술, 미생물학, DNA 재조합기술, 및 면역학 분야의 당업자의 기술수준 내인 통상의 기술을 사용하여 실시될 수 있다. 또한 일반적인 기술에 관한 보다 자세한 설명은 다음의 책 및 문헌을 참조할 수 있다. 분자생물학 및 생화학에 관한 일반적인 방법에 관해서는 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); DNA Cloning, Volumes I and II (Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (Gait ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (Hames and Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (Hames and Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (Freshney and Alan, Liss, Inc., 1987); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller and Calos, eds.); Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition (Ausubel et al., eds.); 및 Recombinant DNA Methodology (Wu, ed., Academic Press)등을 참조할 수 있다. 세포배양 및 배지에 관한 일반적 기술에 관하여는 Large Scale Mammalian Cell Culture (Hu et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8 (1997), 148); Serum-free Media (Kitano, Biotechnology 17 (1991), 73); Large Scale Mammalian Cell Culture (Curr. Opin. Biotechnol. 2 (1991), 375); 및 Suspension Culture of Mammalian Cells (Birch et al., Bioprocess Technol. 19 (1990), 251)을 참조할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실 시 예

물질 및 방법

종양 시료

인간 조직을 사용한 모든 실험은 서울대학교 기관 심사위원회의 승인을 받았다(SNUIRB No. E1308/001-035). 면역FISH 및 면역염색을 하기 위하여, 133개의 외과적으로 절제한 포르말린-고정 파라핀-임베딩 HCC 종양 조직 샘플 및 비-종양 간 조직 샘플을 분석하였다. 유전자 발현 분석을 위하여, 78개의 외과적으로 절제한 냉동 HCC 종양 조직 샘플 및 미-종양 간 조직 샘플을 분석하였다. 2005년과 2009년 사이에(133개의 파라핀-임베딩 샘플), 및 2011년과 2013년 사이에(22개의 냉동 조직 샘플) 한국 가톨릭대학의 서울성모병원에서 뿐만 아니라 2010년과 2013년 사이에(56개의 냉동 조직 샘플) 고려대학교 구로병원(KU 구로 유전자 은행 2013-020)에서 예기하고 연속적으로 케이스를 확인하였다. 구로병원에서 얻은 56개의 냉동 조직 샘플 또한 본발명자의 이전 연구에도 사용되었다. 가장 높은 등급을 나타내는 종양 부위에 근거하여, 종양 분화의 조직학적 등급을 에드몬슨-스타이너(Edmondson-Steiner) 등급 시스템에 따라 정의하였다. 도 1B 및 C, 도 2A, B, C, E, F, 도 4 및 도 6A, B 및 C, 표 1, 도 10, 표 2에 기재되어 있는 데이터는 SMH 코호트에서, 그리고 도 1A, 도 2C 및 D, 도 9, 및 표 3의 데이터는 KU 코호트에서 각각 얻었다. 하기 표 1은 Cox 비례위험모델(Proportional Hazard Model)을 사용하여 일변량(Univariate) 및 다변량(Multivariate) 분석을 한 것이다.

[표 1]

위험비는 각 공변량(covariate)의 효과를 기술하기 위하여 사용하였다(위험인자). 모든 위험비는 임상적 또는 분자 이벤트 부재와 관련되어 있다. HCC 조직에서 종합적 및 재발 없는 생존 분석(각각 n=133 및 118). TERT, 텔로머라아제 역전사효소; ROS, 활성산소종; AFP, 알파-페토단백질(fetoprotein)l HBV, B형 간염 바이러스; HCV, C형 간염 바이러스; CI, 신뢰구간. * P < 0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.001.

하기 표 2는 133명의 HCC 환자에서의 텔로미어 길이, ROS 레벨, TERT 프로모터 돌연변이 및 임상병리학적 데이터를 나타낸다(SMH 코호트).

[표 2]

133개의 파라핀 포매 조직 샘플에서 얻은 텔로미어 길이, ROS 레벨, 및 TERT 프로모터 돌연변이 자료이다. TERT, 텔로머라아제 역전사효소; ROS, 활성산소종; AFP, 알파-페토단백질; HBV, B형 간염 바이러스; HCV, C형 간염 바이러스

하기 표3은 78 HCC 환자에서의 TERT 발현, TERT 프로모터 돌연변이, 및 임상병리학적 데이터를 나타낸다.

[표 3]

78개의 냉동 조직 샘플에서 TERT 발현 및 TERT 프로모터 돌연변이에 대한 정보를 얻었다. TERT, 텔로머라아제 역전사 효소; mRNA, 메신저 RNA; ROS, 활성 산소종; AFP, 알파-페토단백질; HBV, B형 간염 바이러스; HCV, C형 간염 바이러스.

DNA 염기서열 분석

HCC 종양 조직 및 상응하는 비-종양 조직에서 DNA를 추출하였다. 매뉴얼에 따라, 파라핀-임베딩 조직에서 얻은 DNA(조직 마이크로어레이 ; TMA)은 Arcturus picopure DNA 추출 킷트(Applied Biosciences, Foster City, CA, USA)를 사용하여 분리하였고, 냉동 조직에서 얻은 DNA는 NucleoSpin^® TriPrep Kit (Macherey-Nagel, Duen, Germany; 740966.250)를 사용하여 분리하였다. C228 및 C250 (chr5: 1,295,228; chr5: 1,295,250, 각각 ; hg19 assembly)를 함유하는 프록시말 프로모터를, 각 프라이머(forward primer: GGCCGATTCGACCTCTCT; reverse primer: AGCACCTCGCGGTAGTGG)를 함유하는 25㎕ 부피내의 10ng의 템플레이트 DNA를 가진 hTaq 폴리머라아제(Solgent, Daejeon, Korea)를 사용하여 증폭시켰다. NucleoSpin DNA clean-up kit (Macherey-Nagel; 740609.250)를 가진 489-bp 증푹 생성물을 정제한 후, TERT 프로모터 부위를 생거 시퀀싱(Sanger sequencing)으로 분석하였다. 모든 생거 시퀸싱 실험은 Macrogen Inc. (Seoul, Korea)에서 수행하였다. 모든 돌연변이는 직접 시퀀싱된 PCR 생성물의 양 가닥으로부터 Chromas Lite software 2.1 (Technelysium, South Brisbane, Australia)에서 가시화하여 확인하였다.

RNA 염기서열 분석

NucleoSpin^® TriPrep Kit를 사용하여 mock- 및 300μM H₂O₂-처리한 Huh7 세포에서 RNA를 추출하였다. 총 RNA 질과 양은 NanoDrop 1000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA) 및 Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)에서 입증하였다. 라이브러리 구축은 Macrogen Inc. (Macrogen, Seoul, Korea)에서 수행하였다. 1마이크로그램의 총 RNA를 사용하여 TruSeq RNA library kit (Illumina, San Diego, CA, USA)로 cDNA 라이브러리를 구축하였다. 포함된 프로토콜은 다음 단계와 같다 : polyA-selected RNA 추출, RNA 분확화, 랜덤 hexamer-primed 역전사, 및 Illumina HiSeq2000에 의한 100-nt paired-end 시퀸싱. qPCR 정량 프로토콜 가이드에 따른 qPCR을 사용하여 라이브러리를 정량화하였고 Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer를 사용하여 정성(qualify)하였다. 발현 레벨을 측정하기 위하여, TopHat v.1.3.3 (Johns Hopkins University, Baltimore, MD, USA)를 사용하여 인간 게놈에 RNA-seq 리드를 맵핑하였다. 참조 게놈 서열(hg19, Genome Reference Consortium GRCh37) 및 주석 데이타는 UCSC website (http://genome.uscs.edu)에서 다운로드하였다. 유전자레벨에서 카운트한 전사를 계산하였고, 무변화라는 널(NULL) 가설에 대하여 유전자 발현에서 로그 폴드 변화가 관찰되는지 테스트하는 Cuffdiff software(version 1.2.1)를 사용하여 FPKM(fragments per kilobase of exon per million fragments mapped)로 상대적 전사 어번던스를 측정하였다. FDR(false discovery rate)는 Benjamini-Hochberg algorithm를 사용하여 P 수치를 조정함으로써 조절하였다.

Flow FISH

본 방법은 텔로미어 길이를 측정하여 변화여부를 확인할 수 있는 실험 방법이다. 몇 가지 변형된 것을 제외하고는 종전(Rufer N, et al. Nat Biotechnol 1998;16:743-7.)과 같이 Flow FISH를 수행하였다. 구체적으로 0.1% w/v BSA(bovine serum albumin)를 함유하는 차가운 PBS(phosphate-buffered saline) 용액으로 세포를 두 번 세척하였다. 연속하여, 상기 세포를 혼성화버퍼(70% 탈이온화 포름아미드(Amresco, Solon, OH, USA), 20 mM Tris-HCl [pH 6.8], 1% BSA, 및 1 nM FAM-라벨된 텔로미어 펩타이드 핵산(PNA) 프로브(TelG-FAM: TTAGGGTTAGGGTTAGGG) (Panagene, Daejeon, Korea) 또는 1 nM FAM-labeled 센트로미어 PNA 프로브(Cent-FAM: AAACTAGACAGAAGCATT) (Panagene)에 재서스펜젼시켰다. 혼성화 버퍼의 부피는 105세포당 100㎕로 조정하였다. 다음에, 상기 세포를 85℃ 수조에서 10분간 배양하였다. 실온에서 3시간동안 어두언 곳에서 텔로미어로 혼성화한 다음, 상기 샘플을 각각 세척 용액으로 세척하였고(세척 용액 I: 70% 탈이온화 포름아미드, 10 mM 트리스-HCl[pH 6.8], 0.1% BSA 및 0.1% 트윈 20; 세척 용액 II: 0.1% BSA 및 0.1% 트윈 20 in PBS) 그리고 37℃에서 1시간동안 용액(0.1% BSA, 10 μg/mL RNase A, 및 0.06 μg/mL of 7-AAD in PBS)에서 배양하였다. 각 개별 배양액에서 총 15,000-20,000 핵을 분석하였다. G1-G0 세포 주기 단계에서 모은 핵의 텔로미어 형광 강도는 CELLQUEST 소프트웨어를 사용하는 BD FACS Calibur flow cytometer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)를 사용하여 측정하였다.

ImmunoFISH

본 방법은 텔로미어 길이를 측정하여 변화여부를 확인할 수 있는 실험 방법이다. 기존 ImmunoFISH 프로토콜(Plentz RR, et al., Hepatology 2007;45:968-76)d을 약간 변형하여 사용하였다. 구체적으로 파라핀-포매 섹션을 자일렌으로 탈파라핀화하여 에탄올 농도 구배(gradient)를 사용하여 다시 수화하였다. 마이크로웨이브에서 10분간 100mM 소디움 시트레이트(pH 6.0)에서 섹션을 가열함으로써 항원 회복(antigen retrieval)를 수행하였다. 프로테이나제 K(15 μg/mL in PBS [pH 7.4])로 37℃에서 20분간 투과처리(permeabilization)을 한 후, 8-옥소-dG-특이성 항체(1:100, Abcam, Cambridge, MA, USA; ab62623)를 1% BSA in PBS-0.1% Triton X-100에 희석시켜 실온에서 밤새 배양하였다. 상기 슬라이드를 세척한 후, 알렉사 647 2차 항원으로 1시간 동안 처리하였다. 샘플을 4% 포름알데히드를 사용하여 고정한 다음 에어 드라이를 하였다. 상기 샘플을 90℃에서 6분간 변성(denature)시키고 나서 암소에서 실온에서 2시간동안 혼성화하였다. 혼성화 용액은 2 x SSC, 5% MgCl₂, 0.25% 블로킹 시약(Roche, Basel, Switzerland), 15.4 nM의 Cy3-라벨된 텔로미어 PNA 프로브 (TelC-Cy3: CCCTAACCCTAACCCTAA) (Panagene, Daejeon, Korea), 및 18.4 nM의 FAM-라벨된 센트로미어 PNA 프로브(Cent-FAM: AAACTAGACAGAAGCATT) (Panagene)의 70% 포름아미드를 포함한다. 상기 슬라이드를 세척한 후, DAPI를 함유하는 PBS로 린스하고나서 DAPI 봉입제(mounting medium)(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)로 마운팅하였다. 동시에 텔로미어 염색 및 8-옥소-dG 염색의 내부 대조군으로서 센트로미어를 염색하였다. 텔로미어 형광 레벨 및 8-옥소-dG 형광 레벨은 각각 텔로미어 형광 강도에 대한 센트로미어 형광 강도의 비율 및 8-옥소-dG 형광 레벨에 대한 센트로미어 형광 강도의 비율를 말한다. 텔로미어 형광 강도, 센트로미어 형광 강도 및 8-옥소-dG 형광 강도를 정량하기 위하여 동일한 노출 시간을 사용하였다. 종양 조직의 텔로미어 형광 레벨 및 8-옥소-dG 형광 레벨은 5 랜덤 필드에서 상응하는 비-종양 조직의 형광 레벨을 나누어 계산하였다. 이미지 분석은 Image-Pro plus 6.0 software (Media Cybernetics, Inc., USA)을 사용하여 수행하였다.

메타기 스프레드에서의 텔로미어 FISH

본 방법은 텔로미어 길이를 측정하여 변화여부를 확인할 수 있는 실험 방법이다. 메타기 스프레드에서의 텔로미어 FISH를 문헌(Sfeir A et al., Cell 2009;138:90-103)에 따라 수행하였다. 텔로미어 FISH에 Cy3-(CCCTAA)3-함유 PNA 프로브 (Panagene, Daejeon, Korea)를 사용하였다. Huh7 세포를 0.1 mg/mL의 콜세미드(colcemid)(Sigma-Aldrich, St Louis, USA)로 처리하였다. 텔로미어 FISH 시그널을 100x/1.35 NA 렌즈를 가진 DeltaVision Spectris Restoration microscope built around an Olympus IX70 stand(Applied Precision, Issaquah, WA, USA)로 관찰하였다. SoftWorx software (Applied Precision)를 사용하여 0.4-㎛-시크 광학 섹션(thick optical section), 프로세스, 및 머지(merge)의 시리즈로 상기 이미지를 캡춰하였다. 텔로미어 형광 시그널은 60메타기부터 통합하여 TFL-Telo 프로그램을 사용하여 정량하였다.

면역형광 어세이

파라핀-포매 섹션은 자일렌으로 탈파라핀화하여 에탄올 구배로 재수화(rehydrate)하였다. 100 mM 소디움 시트레이트(pH 6.0)에서 10분간 섹션을 마이크로웨이브에서 가열함으로써 항원 회수를 수행하였다. β-카테닌-특이 항체(1:1500, Abcam, Cambridge, MA, USA; ab6302)를 4℃에서 밤새 적용시킨 후, 세척하여 2차 항체와 함께 배양하였다. 고정시킨 후, TERT-특이 항체(1:1500, Abcam, Cambridge, MA, USA; ab6302)를 4℃에서 밤새 적용한 후, 세척하여 2차 항체와 함께 배양하였다. 고정하여 50% 포름아미드 처리후, 8-옥소-dG-특이 항체(1:100, Abcam; ab62623)를 1% BSA 및 0.1% Triton X-100를 함유하는 PBS로 희석하여 실온에서 밤새 배양하였다. 슬라이드를 세척하여 DAPI를 함유하는 배지를 사용하여 마운팅하였다. 공초점 현미경(LSM 700; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 이미지를 얻었다. Image-Pro plus 6.0 software (Media Cybernetics, Inc.)를 사용하여 이미지 분석을 수행하였다.

텔로머라아제 반복 증폭 프로토콜 어세이(TRAP Assay)

TRAPEZE^® RT 텔로머라아제 탐지 키트(Millipore, Darmstadt, Germany; S7710)를 사용하여 TRAP 어세이(Telomerase repeat amplification protocol)를 수행하여 텔로머라아제 활성을 정량적으로 결정하였다. 매뉴얼에 따라 총 단백질 추출물(100ng)을 각 반응에서 사용하였다.

정량적 RT-PCR에 의한 유전자 발현 레벨 결정

NucleoSpin^® TriPrep Kit (Macherey-Nagel, Duren, Germany; 740966.250)를 사용하여 총 RNA를 분리하여, TOPscript™ RT Drymix (dT18) (Enzynomics, Daejeon, Korea; RT200)를 사용하여 mock-처리 및 ROS-처리 세포의 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. TOPreal™ qPCR 2 x PreMIX (SYBR Green with high ROX) (Enzynomics, Daejeon, Korea; RT501M) 및 ABI Prism 7300 thermal cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 PCR을 수행하였다. β-액틴으로 유전자 발현을 노말라이즈하였다. 각 유전자에 대한 프라이머 서열은 하기와 같다: TERT (forward primer: GCCTTCAAGAGCCACGTC; reverse primer: CCACGAACTGTCGCATGT) 및 β-액틴 (forward primer: GCAAAGACCTGTACGCCAACA; reverse primer: TGCATCCTGTCGGCAATG). 프라이머 특이성을 체크하기 위하여 해리 단계를 첨가하였다.

면역블랏 분석

2 x SDS 샘플 버퍼(100 mM Tris-HCl [pH 6.8], 4% SDS, 0.2% bromophenol blue, 20% glycerol, 및 200 mM β-mercaptoethanol)에서 5분간 총 2 x 10⁵ 세포를 가열하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏을 수행하였다. TERT를 탐지하기 위하여, β-메캅토에탄올을 제외시킨 2 x SDS 샘플 버퍼에서 15분간 50℃에서 세포를 가열하였다. TERT-특이(1:300, Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA; 600-401-252), β-카테닌-특이(1:2000, Abcam, Cambridge, MA, USA; ab6301), β-카테닌-특이(1:4000, Abcam; ab6302), GSK-3β-특이(1:1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA; #9315), phospho-GSK-3β-특이(1:1000, Cell Signaling Technology; #9336), Akt-특이(1:1000, Cell Signaling Technology; #2920 and #9272), phospho-Akt 특이(1:1000, Cell Signaling Technology; #9271), Lamin B1-특이(1:1000, Abcam; ab16048), α-tubulin-특이(1:2000, Abcam; ab7291), 또는 β-Actin-특이(1:2000, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA; A5441) 항체를 TBS-트윈 20와 함께 5% 스킴 밀크에 희석시켜 4℃에서 밤새 교반시킨 후, 세척하여 HRP-접합 2차 항원(1:1000, Abcam; ab131368 or ab131366)에서 교반하였다. FUSION-SOLO imager (Vilber Lourmat, Marne La Vallee, France)를 사용하여 화학발광(Chemiluminescence) 이미지를 얻었다.

세포 분획(Fractionation)

핵-세포질 분리를 위하여, HCC 세포를 차가운 PBS에서 세척하여 용해버퍼(20 mM HEPES [pH 7.9], 10 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 0.5% NP-40, 100 mM NaF, 1 mM Na₃VO₄, 1 mM PMSF, 및 프로테아제 저해제)에서 재현탁하였다. 상기 세포를 회전 쉐이커에서 4℃에서 30분간 약하게(gently) 쉐이크하고 나서 5000rpm에서 4분동안 원심분리하여 핵 및 세포질 추출물의 상층액을 수집하였다. 핵 펠렛은 버퍼(25 mM Tris-HCl [pH8.0], 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 및 프로테아제 저해제)에서 재현탁하였다.

세포 생존력

세포 생존력을 문헌(Djojosubroto MW et al., Hepatology 2005;42:1127-36.)과 같이 측정하였다. 포르마잔 생산의 광학 밀도는 Power Wave X spectrophotometer (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA)를 사용하여 540nm에서 측정하였다.

크로마틴 면역침강

크로마틴 면역침강(ChIP)을 문헌(Hoffmeyer K et al., Science 2012;336:1549-54; Lim SO et al., Gastroenterology 2008;135:2128-40, 2140 e1-8)에 기재된 바에 몇몇 변형을 하여 수행하였다. PI3K 저해제 (LY294002) (5 μM, Calbiochem, Billerica, MA, USA; 440202), AKT 저해제(SH-6) (10 μM, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA; sc-205974), 또는 GSK3β 저해제 (GSK3β inhibitor XI) (30 μM, Santa Cruz; sc-204770) 존재 또는 부존재하에, ROS 처리없이 또는 처리하여 Huh7 세포를 4일간 배양하였다. 배지는 매일 새로 채웠다. 실온에서 20분간 천천히 흔들면서 상기 세포를 1% 파라포름알데히드를 사용하여 고정하였다. 그러고나서, 상기 세포를 얼음으로 차갑게 한 PBS로 두 번 세척하여; 400μL 마이크로코컬(micrococcal) 누클레아제 버퍼(50 mM Tris-HCl [pH8.0], 5 mM CaCl, 100 μg/mL BSA, 10 mM KCl, 및 프로테아제 저해제 칵테일[Roche, Basel, Switzerland; 4693159001])에서 재현탁하여; 2-mm 지름 지르코늄 비드(Watson)로 교란시켜 ;마이크로코컬 누클레아제 소화(New England Biolabs, Beverly, MA, USA; M0247S)가 되도록 하였다. 크로마틴(150㎍)을 수집하여 희석 버퍼(0.1% NP-40, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl [pH 8.0], 프로테아제 저해제 칵테일 [Roche], 및 포스파타아제 저해제 [Calbiochem])에 희석시킨 후, 2㎍ 절단된 연어 정액 DNA, 10μL 면역전 혈청(preimmune serum)((Santa Cruz Biotechnology; sc-2027), 및 Dynabeads Protein G (Life Technologies; 1004D), 및 Dynabeads 단백질 G (Life Technologies; 1004D)로 4℃에서 2시간동안 예비세척(pre-clear)하였다. 면역침강 후에, 20μL Dynabeads 단백질 G를 첨가하여 2시간동안 배양을 지속하였다. 상기 Dynabead를 각 10분간 TSE 1 (0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, 및 150 mM NaCl), TSE II (0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, 및 500 mM NaCl), 및 버퍼 III (0.25 M LiCl, 1% NP-40, 1% deoxycholate, 1 mM EDTA, and 10 mM Tris-HCl)로 연속적으로 세척하였다. 상기 비드를 그후 TE 버퍼로 세 번 세척하여 1% SDS 및 0.1 M NaHCO₃를 사용하여 추출하였다. 용출액을 65℃에서 밤새 가열하여 포름알데히드 교차-연결을 전환시켰다. DNA 절편을 NucleoSpin DNA clean-up kit를 사용하여 정제하였다. PCR 증푹 생성물은 TERT 프로모터 부위에 특이적인 프라이머를 사용하여 qPCR (ABI 7300; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 정량하였다. 프라이머 서열은 하기와 같다: ChIP에 대한 β-카테닌 상호작용 부위(forward primer: TCCCGGGTCCCCGGCCCA; reverse primer: CCTCGCGGTAGTGGCTGCGC) 및 ChIP에 대한 TERT 인트론(forward primer: TGAGGGCTGAGAAGGAGTGT; reverse primer: CACGATAGACGACGACCTCA). 기존에 보고된 β-카테닌 상호작용 부위의 각 면에, 20-22bps가 첨가되어 있다. 사용된 항체는 하기와 같다: 래빗 폴리클론의 항-β-카테닌(1:200, Abcam, Cambridge, MA, USA; ab6302), 마우스 모노클론의 항-RNA 폴리머라아제 II (1:50, Covance, Princeton, NJ, USA; MMS-126R), 및 래빗 폴리클론의 항-SETD1A (1:100, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA; NBP1-81513).

세포 배양 및 shRNA-매개 유전자 사일런싱

HCC 세포주 (Huh7, Hep3B, HepG2, 및 SNU-449)는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 얻었다. 모든 HCC 세포 라인은 마이코플라즈마 오염을 테스트하였고 문헌(Lim SO et al. Gastroenterology 2008;135:2128-40, 2140 e1-8)에 기재된 바와 같이 10% 우태아혈청 (GenDepot, Barker,TX, USA)을 보충한 DMEM(Welgene, Gyeongsan-si, Korea)에서 37℃에서 가습한 5% CO₂ 배양기에서 생장시켰다. 유전자 인코딩 β-카테닌(CTNNB1)의 shRNA-매개 사일런싱을 하기 위하여, CTNNB1 shRNA를 발현하는 pLKO 벡터 구축물을 시그마-알드리치(MISSION^® shRNA Bacterial Glycerol Stock; St.Louis, MO, USA)에서 구입하여 상기 문헌과 같이 사용하였다.

ROS 처리

배지는 매일 교체하고, 상기 세포는 300μM 과산화수소(H₂O₂) (Sigma-Aldrich; H1009), 4μM 페나진 메토설페이트(PMS) (Sigma-Aldrich; P9625), 또는 50μM 파라콰트(paraquat)(Sigma-Aldrich; 36541)에서 4일간 배양하였다. 몇몇 실험에서는, H₂O₂를 첨가하기 전에 5mM N-아세틸시스테인(Sigma-Aldrich; A7250), 5μM PI3K 저해제 (LY294002) (Calbiochem,Billerica, MA, USA; 440202), 10μM AKT 저해제 (SH-6) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX,USA; sc-205974) 또는 30 μM GSK3β 저해제 (GSK3β inhibitor XI) (Santa Cruz; sc-204770)로 상기 세포를 1시간동안 처리하였다. 멸균 증류수(pH 7.0)를 음성 대조군으로 사용하였다(mock 처리).

통계 분석

텔로미어 길이 측정 및 생존율의 통계적 유의성은 각각 피셔의 정확 검정 및 로그-랭크 테스트를 사용하여 평가하였다. mock 및 ROS 처리 사이의 mRNA 발현 레벨 및 텔로미어 활성 비교에서의 P 수치는 양측 꼬리 검정(two-tailed paired t test)을 사용하여 계산하였다. 도수분포(frequency distribution)의 정규성(normality)은 Shapiro-Willk의 테스트를 사용하여 테스트하였다. 통계분석은 R software (www.r-project.org) 또는 Prism GraphPad Software version 4.0 (GraphPad Software Inc, San Diego, CA, USA)을 사용하여 수행하였다. 모든 실험은 독립적으로 최소 세번 반복하였다. 유의성 수치는 * P < 0.05, ** P < 0.01, 및 *** P < 0.001으로 세팅하였다.

실시예 1. ROS에 의한 HCC 세포주에서 TERT 상향조절 및 텔로미어 신장 유도

텔로미어는 각 세포분열과 함께 짧아지고, 그럼으로써 세포 성장 저지, 노쇠, 및 세포 사멸을 유도하게 된다. DNA 손상을 강력하게 유도하는 활성산소종(ROS)는 종종 텔로미어 길이를 감소시킨다. 종양 세포는 세포불멸화 동안 텔로머라아제 재활성화를 통해 텔로미어-감소를 피하게 된다. 종전의 연구(El-Serag HB, et al., Gastroenterology 2007;132:2557-76. Schulze K et al., Nat Genet 2015;47:505-11)와 일치하게도, 본 발명자는 초기 HCC(GI)부터 진행 HCC(GII 및 GIII)까지 동안 TERT 발현 및 텔로미어 길이가 증가하였다는 것을 관찰하였다(각각 P = 0.003 및 P < 0.001 ; 도 1A 및 B 및 표 2 및 3). 분자 ROS 마커인 산화적 DNA 부가물 8-옥소-2’-데옥시구아노신(8-옥소-dG)의 레벨이 HCC를 포함한 다양한 종양 타입에서 증가한다고 보고되어 있다. 본 발명자는 또한 조직 ROS 레벨(8-옥소-dG 베이스에 축적된)이 초기부터 진행 HCC로 진행하는 동안 증가한다는 것을 발견하였다(P < 0.001; 도 1C). ROS가 증가함에도 불구하고 TERT 발현이 증가하고 텔로미어 길이가 증가하는 것으로 관찰되는 것을 이해하기 위하여, 본 발명자는 ROS 레벨이 HCC 종양에서 텔로미어 길이를 증가시켜, 진행 HCC로 이끌어 사망율을 증가시킨다는 가설을 세우고 이를 테스트하였다.

텔로미어 길이에 대한 ROS의 효과를 확인하기 위하여, 본 발명자는 두 개의 HCC세포주 Hep3B 및 Huh7를 다양한 농도(0-300μM)의 H₂O₂로 처리하였다. 텔로미어 길이, TERT 발현, 및 TERT 단백질 발현은 300μM H₂O₂-처리 HCC 세포주(P < 0.01 for Hep3B 텔로미어, P < 0.01 for Hep3B TERT mRNA 레벨, P < 0.01 for Huh7 텔로미어, 및 P < 0.01 for Huh7 TERT mRNA 레벨; 도 1D 및 E, 및 도 7A)에서 증가하였다. RNA 시퀸싱 분석 또한 300μM H₂O₂-처리 Huh7 세포에서 TERT 발현이 증가한 것으로 나타냈다(P = 0.01; 도 7B). 두 개의 다른 HCC 세포주 SNU-449 및 HepG2에서, 텔로미어 길이 및 TERT 발현 또한 300μM H₂O₂에 의해 증가하였다(P < 0.01 for SNU449 텔로미어, P < 0.01 for SNU449 TERT mRNA 레벨, P < 0.01 for HepG2 텔로미어, 및 P < 0.01 for HepG2 TERT mRNA 레벨; 도 7C 및 D). ROS 스캐빈저인 N-아세틸시스테인을 같이 처리하면 각 세포주에서 H₂O₂-유도 TERT 발현 및 텔로미어 길이가 폐지된다(도 1D 및 E 및 도 7). ROS 유도제 페나진 메토설페이트(phenazine methosulfate (PMS)) 및 파라쿼트(PQ)로 처리하였을 때, 텔로미어 길이 및 TERT 발현이 증가하였다(P < 0.05 for PMS-처리 Hep3B 텔로미어, P < 0.05 for PMS-처리 Huh7 텔로미어, P < 0.01 for PQ-처리 Hep3B 텔로미어, P < 0.01 for PQ-처리 Huh7 텔로미어, P < 0.01 for PMS-처리 Hep3B TERT mRNA 레벨, P < 0.01 for PMS-처리 Huh7 TERT mRNA 레벨, P < 0.01 for PQ-처리 Hep3B TERT mRNA 레벨, 및 P < 0.01 for PQ-처리 Huh7 TERT mRNA 레벨; 도 8). 이러한 결과는, 산화적 스트레스에 의해 HCC 세포에서 TERT 발현 및 텔로머라아제 활성이 상향조절됨으로써 텔로미어를 길어지게 할 수 있다는 것을 말한다(도 1D, E 및 F).

즉, 본 발명에서는 상대적 ROS 레벨을 측정함으로써 ROS 레벨을 정량하였다(HCC 종양 조직의 8-옥소-dG 강도로 노말라이즈함). 또한 300μM H₂O₂ 또는 4μM PMS와 같은 ROS 유도자와 처리하면 항산화 효소를 감소시킬 뿐만 아니라 EMT(epithelial-mesenchymal transition) 표현형을 유발시키며 HCC 세포주에서 텔로미어 길이를 증가시켰다(도 1D 및 E, 도 7 및 8). 텔로머라아제 재활성화-매개 텔로미어 신장 뿐만 아니라 EMT도 진행 HCC의 양상인데, 이는 HCC 세포에 ROS 처리하는 본 발명의 실험 설계가 진행 HCC 표현형의 흉내내는데 적합하다는 것을 말한다.

실시예 2. HCC 조직에서 ROS 농도와 텔로미어 길이와의 상관관계

임상적 HCC 조직에서 ROS 및 텔로미어 길이가 증가하여 나타나있는지를 결정하였다. 높은 ROS 레벨에 상응하는 높은 8-옥소-dG를 가지는 HCC 조직이 텔로미어 길이가 더 긴 것으로 나타났다(P < 0.001; 도 2A). 선형 회귀 분석(linear regression analysis)을 사용하여 상당히 양적으로 상관되어 있는 것이 관찰되었다(P < 0.0001; 도 2B). 종전 연구(Huang FW et al, Science 2013;339:957-9; Horn S et al, Science 2013;339:959-61.)에서는, TERT 프로모터의 두 개의 체세포 돌연변이가 인간 종양에서 TERT 발현을 증가시킨다고 하였다. 이러한 돌연변이는 HCC를 포함한 다양한 세포 타입에 보존되어 있고, HCC 전구자인 간경변 종양 발현전 부위에서 TERT 발현과 포지티브하게 연관되어 있다. 그러나 다른 그레이드의 HCC 사이에는 TERT 프로모터 돌연변이 빈도에서는 아무런 차이가 관찰되지 않았다(GI, GII, 및 GIII HCC) (P = 0.328 for the SMH 코호트 및 P = 0.761 for the KU 코호트; 도 2C, 도 9, 및 표 2 및 3);돌연변이 및 야생형 종양 조직사이에는 TERT 발현 또는 텔로미어 길이 중 어느 하나에서도 다른 차이점이 관찰되지 않았다(각각 P = 0.796 및 P = 0.710; 도 2D 및 E). 실제로, ROS 함량 및 텔로미어 길이 둘다 GIII HCC 조직에서 증가하였다(도 2F). 추가하여, 텔로미어는 ROS 함량이 더 높은 HCC 조직에서 더 길었다(도 2A 및 B). 이러한 결과는, 진행 HCC에서 세포내 ROS 농도가 TERT 발현 및 텔로미어 길이를 증가시키는 기여 인자일 수 있다는 것을 보여준다.

실시예 3. ROS 증가에 의해 시그널링이 활성화되면 β-카테닌-매개 TERT 상향조절이 촉진됨을 확인

본 발명자는 ROS가 TERT 발현을 증가시키는 메커니즘에 대해 시험하였다. 즉 본 발명자는, HCC 세포주를 사용하여 ROS-활동의 다운스트림 매개자인 PI3K 및/또는 Akt가 ROS-유도 TERT 발현에 필요한지에 대하여 처음 실험하였다. PI3K 저해제 또는 Akt 저해제와 같이 세포를 처리하였을 때, ROS는 TERT 발현 및 단백질 생산을 유도하지 못하였다(도 3A). ROS 단독을 처리하였을 때, 인산화 Akt 및 이의 다운스트림 매개자인 글리코겐 신타제 키나아제 3β(GSK3β)가 증가하였다(도 3B). 전사를 자극하기 위해 TERT 프로모터에 리루르트되는 인자인 β-카테닌의 발현 또한 증가하였다(도 3B). β-카테닌은 혈관신생, 세포 침입, 세포 증식 및 세포 생존에 관여하는 다양한 유전자의 발현을 전사적으로 조절하고;β-카테닌은, 상기 기능을 유지하려고 종종 악성 종양에서 핵 로컬화를 나타내었다. 300μM H₂O₂로 처리할 때, β-카테닌 레벨은 Hep3B 및 Huh7 세포의 핵 분획에서 증가하였다(도 3C). TERT 프로모터에서 증가된 핵 β-카테닌이 증가된 염색질 증가성과 연관이 있는지를 결정하기 위하여, 본 발명자는 내인성 β-카테닌 또는 히스톤 메틸트랜스퍼라아제 SetD1A에 대한 항체를 사용하여 공동-면역침강 실험을 수행하였다. 후자는 염색질 리모델링에 의해 전사를 촉진하는 것으로 보고되어 있다. 본 발명자는 300μM H₂O₂로 처리된 Huh7 세포에서 β-카테닌에 결합된 SetD1A를 관찰하였다(도 3D). 면역염색실험은 나아가, β-카테닌 및 SetD1A 둘다 300μM H₂O₂로 처리된 Huh7 세포의 핵에 축적되어 있다고 보여주었다(도 3E). ChIP 어세이 팔로우업에서, β-카테닌, SetD1A, 및 RNA 폴리머라아제 II (Pol II)를 포함하여, key TERT 전사 활성화-관련 인자의 TERT 프로모터에의 결합이 증가하였다(도 3F). 이와 함께, 이러한 결과는 ROS가 β-카테닌의 핵 발현을 증가시킴으로써 TERT 프로모터에 SetD1A 리쿠르트를 촉진한다는 것을 나타낸다. 결과적으로, SetD1A가 TERT 전사의 활성화에 필요한 염색질 리모델링을 촉진하였다.

연속하여, 면역조직화학분석에서 GIII HCC 종양 조직의 핵에 8-옥소-dG가 증가하면서 TERT 및 β-카테닌 단백질 발현이 증가한 것으로 나타났다(도 4A 및 도 10). 본 발명자는 나아가 등급 스코어를 사용하여 TERT, β-카테닌, 및 8-옥소-dG의 핵 공동-로컬화를 측정하였다; 더 높은 핵 공동-로컬화 스코어는 TERT, β-카테닌 및 8-옥소-dG의 공동-로컬화 스코어를 나타내는 핵 퍼센트가 증가하는 것과 상응하였다. 핵 공동-로컬화 스코어는 비-종양 조직과 비교하여 GIII 종양 조직에서 상당히 더 높았다(P < 0.0001; 도 4B). 이러한 데이터는, ROS가 진행 HCC 종양에서 β-카테닌의 핵 로컬화를 유도함으로써 TERT 발현을 증가한다는 것을 가리킨다.

GSK3β의 Akt-매개 인산화는 β-카테닌을 활성화시키고 TERT 전사를 증가시킬 수 있다(도 3). GSK3β 저해제로 처리한 후, HCC 세포에서 TERT 발현이 증가하였으며, 반면 구조적 활성인 GSK3β 돌연변이(GSK3β S9A)는 TERT 발현을 감소시켰다(각각 P < 0.01 및 P < 0.001 ; 도 5A). 게다가, CTNNB1 유전자 인코딩 β-카테닌이 사일런싱되었을 때 H₂O₂ 처리 후에도 TERT 발현은 감소하였고, 반면 또다른 GSK3β 기질인 SNAI1가 사일런스되었을 때 TERT 발현은 변하지 않았다(도 5B 및 도 11). 더욱이, PI3K 또는 Akt 저해제와 같이 처리하면, H₂O₂ 존재에도 불구하고 HCC 세포에서 TERT 프로모터에 결합하는 β-카테닌 및 SetD1A는 감소하였고, 반면 GSK3β 저해제와 같이 처리하면, H₂O₂ 처리와 상관없이 β-카테닌 및 SetD1A 결합이 증가하였다(도 5C, D, 및 E). 이와 함께, 이러한 결과는 PI3K-Akt 시그널링 캐스케이드의 활성화를 통해 ROS가 TERT 프로모터로의 β-카테닌 리쿠르트를 증가시켜, HCC 세포에서 TERT 및 텔로미어 신장이 증가하게 된다는 것을 가리킨다.

즉, Akt는 GSK3β를 인산화시키고, GSK3β 활성을 억제하며; 다음에 β-카테닌의 프로테아좀 분해가 세포질에서 억제되고, 그리고 β-카테닌은 핵에 축적된다. 본 발명의 결과(도 3 및 5)를 근거로 하여 살펴보면, ROS-매개 Akt 활성화는 GSK3β 활성을 억제하며 결과적으로 β-카테닌이 TERT 발현이 상향조절된 핵에 축적되어, 텔로미어가 HCC 세포에서 길어지게 된다(도 6D). 종전에는 Wnt/β-카테닌 시그널링 경로가 또한 TERT 상향조절에 포함되는 것으로 보고되어 있었다. Akt 및 Wnt 시그널링 사이에 현저한 차이가 있는데, Akt 시그널링은 GSK3β에서 세린-9를 직접적으로 인산화 함으로써 GSK3β 활성을 억제하는 반면, Wnt 시그널링은 APC/axin/GSK3β을 기반으로 하는 헝클어진(dishevelled) 파괴 복합체를 조절함으로써 GSK3β 활성을 억제한다. 본 발명자는 본질적으로 활성인 GSK3β 돌연변이 (GSK3β S9A)가 β-카테닌 및 TERT 발현을 감소시킨다는 것을 발견하였다(도 5A). 따라서, ROS-유도 PI3K-Akt-β-카테닌 경로 활성화는 Wnt/β-카테닌 시그널링과는 서로 다르다.

실시예 4. 텔로미어 길이 및 ROS 농도와 HCC 환자의 사망율 및 재발율과의 관련성

증가된 TERT 발현을 통한 텔로미어 안정화는 세포 불멸로의 게이트웨이로서, 암 사망율 위험을 증가시킨다. 본 발명자는 텔로미어 길이 및 ROS 레벨이 각각 HCC 사망율 및 재발과 포지티브하게 연관되어 있다는 것을 발견하였다(Log-rank test, P < 0.0001 for 텔로미어 길이와 연관된 전체 생존율, P < 0.0001 for 텔로미어 길이와 연관된 재발없는 전체 생존율, P = 0.0002 for ROS 레벨과 연관된 전체 생존율, 및 P < 0.0001 for ROS 레벨과 연관된 재발없는 전체 생존율; 도 6A 및 B). 다변수 통계에 근거하여, 텔로미어 길이 및 ROS 레벨은 또한 HCC 사망율 및 재발율과 상당히 연관되어 있다(위험율 = 4.594, 95% CI = 1.841-11.462, P = 0.0011 for 더 긴 텔로미어 길이와 관련된 전체 생존율 ; 위험율 = 3.997, 95% CI = 1.626-9.826, P = 0.0025 for 더 긴 텔로미어 길이와 관련된 재발없는 전체 생존율; 위험율 =2.504, 95% CI = 1.069-5.868, P = 0.0346 for 더 높은 ROS 레벨과 관련된 전체 생존율; 및 위험율 = 2.905, 95% CI = 1.236-6.831, P = 0.0145 for 더 높은 ROS 레벨과 관련된 재발없는 전체 생존율; 표 1). 반대로, TERT 프로모터 돌연변이가 있는 환자와 없는 환자 사이의 생존율 차이점은 무시할 만하다(도 6C 및 표 1). 결국, 본 발명에 의해 ROS가 HCC 종양에서 사망율 및 암 재발을 증가시키게 하는 텔로미어 신장의 주요 결정요소라는 것을 알 수 있다.

돌연변이된 암 유전자를 확인하는 것이 HCC 환자를 치료하는데에 도움이 된다. 전체 엑솜 시퀀싱에 관한 최근 보고를 보면, HCC 케이스의 30% 이상이 CTNNB1에 돌연변이를 가지고 있다(β-카테닌 ; β-카테닌-활성화 돌연변이). CTNNB1 돌연변이가 HCC에서 변형될 고위험을 지니고 있는데도 불구하고, β-카테닌이 HCC에서 TERT 발현을 직접적으로 조절하는 지는 불분명하다. 유사하게, TERT 프로모터에서의 돌연변이(TERT-전사 활성화 돌연변이)는 HCC 케이스의 30-50%에서 탐지되었다. HCC의 전구체인 간경변의 종양발현전 부위에 세포질 돌연변이가 있을 때 TERT 발현은 높다. 그러나, TERT 프로모터 돌연변이는 HCC 종양에서 TERT 발현 레벨, 텔로미어, 또는 환자 생존율에 직접적으로 영향을 미치지 않는다(도 2D, E, 및 6C). 환자 간경변 역사의 다양성, 암 드라이버 유전자의 존재 및 게놈 변경과 연관된 경로가 간암을 가장 복잡한 대표적 질환 중 하나가 되도록 한다. 텔로미어 신장(초기에서 진행 HCC로의 진행 동안)의 강력한 유도자로서의 ROS에 대한 본 발명의 데이터는 간암(hepatocarcinogenesis)에 존재하는 메카니즘을 더 잘 이해하도록 할 것이다.

본 발명에서 최초로 간암 진행에서 Akt 및 β-카테닌이 PI3K-Akt-mTOR 및 Wnt-β-카테닌 경로에 영향을 미쳐, 텔로미어 신장이 촉진된다는 것을 밝혔다. ROS-PI3K-Akt-β-카테닌 시그널링 축을 통해 ROS가 TERT 발현을 유도한다는 본 발명은 중요하며 또한 HCC 치료에서 새로운 치료적 타겟이 될 수 있는 새롭고 변형된 HCC 진행 경로를 입증하였다.

Claims (7)

1. ROS(Reactive Oxygen Species)의 농도가 증가된 간암세포를 제공하는 단계;
   상기 세포를 TERT (Telomerase Reverse Transcriptase) 발현을 억제할 것으로 기대되는 시험물질과 접촉하는 단계; 및
   상기 시험물질과 접촉된 세포와 상기 시험물질과 접촉되지 않은 대조군 세포에서 상기 TERT 발현을 비교하여, 상기 시험물질과 접촉된 세포에서 상기 TERT의 발현이 상기 대조군의 TERT 발현과 비교하여 감소한 경우 이를 후보물질로 선별하는 단계를 포함하며,
   상기 ROS는 상기 TERT의 발현을 증가시키고, 상기 TERT 발현 증가는 PI3K(Phosphoinositide 3-kinase)/Akt(protein Kinase B) 신호전달 경로를 통한 상기 세포 내의 β-카테닌의 핵으로의 이동에 의한 것인, 간암 치료제 스크리닝 방법.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 세포는 HepG2, Huh7, Hep3B, 또는 SNU449를 포함하는 세포주 또는 간암조직에서 유래된 세포인 것인, 간암 치료제 스크리닝 방법.
   
3. 삭제
4. 삭제
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 방법은 상기 β-카테닌이 핵에 존재하는지 여부를 검출하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 대조군과 비교하여 상기 β-카테닌의 핵으로의 이동이 감소한 경우, 상기 시험물질을 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 간암 치료제 스크리닝 방법.
   
6. 삭제
7. 제 1 항에 있어서,
   상기 방법은 상기 세포에서 텔로미어 길이 변화 여부를 검출하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 대조군과 비교하여 텔로미어의 길이가 감소된 경우, 상기 시험물질을 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 간암 치료제 스크리닝 방법.
   

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