KR100798252B1

KR100798252B1 - ｃ-Ｋｉｔ 활성 저해제, 피부미백제 및 이를 함유하는피부미백용 조성물

Info

Publication number: KR100798252B1
Application number: KR1020060005369A
Authority: KR
Inventors: 진무현; 김호정; 김병준; 강상진; 조완구
Original assignee: 주식회사 엘지생활건강
Priority date: 2006-01-18
Filing date: 2006-01-18
Publication date: 2008-01-24
Also published as: CN101370470B; CN101370470A; KR20070076228A

Abstract

본 발명은 c-Kit 활성 저해제, 피부미백제 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부미백용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 c-Kit 활성 저해제는 하기 화학식 1로 표시되는 디오스메틴(Diosmetin)이다. 디오스메틴은 멜라닌 생성 및 멜라닌 세포의 분화와 성숙 등에 관여하는 c-Kit의 활성을 저해한다. 따라서, 디오스메틴은 피부미백제로서 유용하며, 디오스메틴을 유효성분으로 함유하는 화장료 등의 조성물은 기미나 주근깨 개선 등의 피부미백에 매우 효과적으로 사용될 수 있다.

디오스메틴, c-Kit, 피부미백, 기미개선

Description

ｃ-Ｋｉｔ 활성 저해제, 피부미백제 및 이를 함유하는 피부미백용 조성물{c-Kit activation inhibitor, skin whitening compound and composition for skin whitening containing the same}

도 1은 디오스메틴의 H¹-NMR 스펙트럼 그래프이다.

도 2는 디오스메틴의 C¹³ NMR 스펙트럼 그래프이다.

도 3은 디오스메틴의 질량분석 스펙트럼 그래프이다.

본 발명은 멜라닌 생성 및 멜라닌 세포의 분화와 성숙 등에 관여하는 c-Kit 활성 저해제, 기미나 주근깨 개선 등의 피부미백에 유용한 피부미백제 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부미백용 조성물에 관한 것이다.

c-Kit는 receptor tyrosine kinase (RTK)의 class III에 속하는 수용체로서, 멜라닌 세포의 생존, 증식 및 분화에 관여하는 것으로 알려져 있다. UV에 노출된 피부에서는 멜라닌 세포의 수가 증가하는데, 이 과정에서 c-Kit가 중요한 역할을 한다. K14 (keratin promoter)-steel factor의 형질전환 쥐의 경우, 모낭의 멜 라닌 세포를 생성, 분화시키는 'niche'에서 증가된 SCF는 멜라닌 세포를 증식, 분화시켜 niche밖으로 나오게 하는 것이 확인되었고, 태아일 때 c-Kit의 항체인 ACK2를 처리한 쥐는 하얀 털과 하얀 피부를 나타내었다(Nature 416, 854-860, 2002).

원래 c-Kit는 미백제의 표적으로 보다는 항암제 개발의 표적으로 더 많이 연구되어 왔다. Imatinib (Gleevec, STI-571, Novatis, East Hanover, NJ, USA)는 Bcr-Abl kinase를 표적으로 하는 백혈병 등의 항암제로 널리 알려져 있다. 그런데, imatinib를 처방받은 6명의 환자들에게서 피부의 색소 감소현상이 나타났고, 이는 imatinib가 Bcr-Abl 외에도 c-Kit의 활성을 억제하여 나타난 결과이다. 따라서, SCF/c-Kit가 사람의 멜라닌 세포의 성장, 유지에 필수적 역할을 하고 있음을 알 수 있다(Cancer 98, 2483-7, 2003).

한편, c-kit의 리간드인 SCF는 기미(Melasma)의 병변 부위에서 정상 부위보다 과량 발현되며(대한 피부과학회지 2005;43(8) :1046~1052) 또한 자외선에 의한 피부 흑화(UVB-Melanosis), 노인성 반점(Lentigo senilis), 피부섬유종(Dermatofibroma) 및 Caffe aure macule과 같은 병적인 피부의 과다 흑화 증상에서 과량 발현됨이 보고되고 있다(Pigment Cell Research 17:96-110. 2004).

c-Kit는 활성화되면 MAP kinase를 활성화시키고, 다시 helix-loop-helix, leucine zipper 단백질인 Mitf(microphthalmia-associated transcription factor)를 인산화시켜 활성인 상태로 만든다. 활성화된 Mitf는 tyrosinase, Tyrp-2 등의 멜라닌생성 효소의 전사를 활성화시켜 멜라닌 색소를 생성하게 한다. 자외선을 받으면 keratinocyte에서 분비되는 SCF가 c-Kit가 존재하고 있는 전구체 멜라닌 세포 를 성숙한 멜라닌 세포로의 분화를 촉진하며, 더불어 멜라닌 합성에 관여하는 효소들의 전사를 촉진함으로서 멜라닌 색소의 합성을 촉진하게 한다.

이와 같이, c-Kit는 자외선에 의한 멜라닌 합성을 촉진하도록 하는 신호전달에 중요하게 관여하고 있다. 따라서, c-Kit에 대한 활성을 저해할 수 있다면, 항암 효과 외에도, 멜라닌 세포의 분화와 성숙을 저해할 수 있다.

희고 고운 피부를 갖고자 하는 것은 모든 사람의 한결 같은 소망인데, 멜라닌 합성이 피부 내에서 과도하게 일어나면, 피부 톤을 어둡게 하고, 기미, 주근깨 등을 발생시키기도 한다. 따라서, c-kit 저해제는 SCF/c-Kit이 관여하는 피부의 과색소 침작증의 개선이 가능하다. 즉, 피부내의 멜라닌 색소의 합성을 저해시키면 피부 톤을 밝게 하여 피부미백을 실현할 수 있을 뿐만 아니라, 자외선, 호르몬 및 유전적인 원인에 기인하여 발생할 수 있는 기미, 주근깨뿐만 아니라, 노인성 반점, 피부섬유종(Dermatofibroma) 및 Caffe aure macule과 같은 병적인 과다 흑화 증상 등의 피부 과색소 침착증을 개선시킬 수 있다.

이에, 종래에는 하이드로퀴논(hydroquinone)이나 아스콜빈산(ascorbic acid), 고지산(kojic acid), 글루타치온(glutathione)과 같은 티로시나제에 저해 활성을 갖는 물질을 연고나 화장료와 같은 피부 적용 조성물에 배합하여, 기미, 주근깨의 개선 등 피부미백을 실현하고자 하였다. 그러나, 하이드로퀴논은 소정의 미백효과는 인정되지만 피부자극성이 심하여 사용량이 극히 제한된다. 또한, 아스콜빈산은 산화되기 쉬워 이를 배합한 화장료와 같은 조성물은 변색, 변취되는 등의 문제가 발생한다. 한편, 글루타치온, 시스테인 등의 티올계 화합물은 특유의 불쾌 한 냄새가 나며 경피흡수에도 문제가 있고, 이들의 배당체 및 유도체들도 극성이 높아 배합 성분으로 사용하기에는 어렵다.

따라서, 본 발명의 기술적 과제는 멜라닌 합성이나 항암작용 등에 관여하는 c-Kit의 활성을 저해할 수 있는 c-Kit 활성 저해제를 제공하는데 있다. 또한, 본 발명이 이루고자 하는 다른 기술적 과제는 피부에 대한 부작용이 없어 안전하게 사용될 수 있으며, 색소 침착의 저해 효과가 뛰어난 피부미백제 및 이를 함유하는 피부미백용 조성물을 제공하는데 있다.

상기와 같은 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 디오스메틴(Diosmetin)으로 된 c-Kit 활성 저해제를 제공한다.

<화학식 1>

디오스메틴은 감국(Chrysanthemum morifolium의 꽃; 甘菊)으로부터 추출하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 디오스메틴(Diosmetin)으로 된 피부미백제 및 이를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부미백용 조성물 을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 디오스메틴(Diosmetin)으로 된 기미개선을 위한 피부미백제 및 이를 기미개선을 위해 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부미백용 조성물을 제공한다.

상기 디오스메틴의 함량은 조성물 총 중량을 기준으로 0.000001 내지 10중량%인 것이 바람직한데, 디오스메틴은 스킨, 로션, 크림, 파운데이션, 에센스, 젤, 팩, 폼 클렌징, 비누, 연고 등의 다양한 제형에 첨가되어 피부미백 효과를 나타낼 수 있다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 상기 화학식 1의 디오스메틴(5,7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxy-phenyl)-chromen-4-one, C₁₆H₁₂O₆,CAS No. 520-34-3)으로 된 c-Kit 저해제를 제공한다.

디오스메틴(Diosmetin)은 아카시아 파네시아나(Acacia farnesiana), 아칠리아 아시아티카(Achillea asiatica), 아르니카 론지폴리아(Arnica longifolia), 아테미시아 루티폴리아(Artemisia rutifolia), 아테미시아 불가리스(Artemisia vulgaris), 칼레리아나 치오노필라(Caleriana chionophila), 카프셀라 버사-파스토리스(Capsella bursa-pastoris), 시트러스 리몬(Citrus limon), 크니듐 모니에리(Cnidium monnieri), 사이페러스 알로페큐로이데스(Cyperus alopecuroides), 젠티아나 바바타(Gentiana barbata), 히에라슘 코포시텀(Hieracium compositum), 르나 리아 마크루라(Lnaria macroura), 멘타 스피카타(Mentha spicata), 오리가가넘 불가레(Origaganum vulgare), 페달리엄 무렉스(Pedalium murex), 페트로셀리넘 크리스펌(Petroselinum crispum), 로스마리너스 오피시날리스(Rosmarinus officinalis), 살비아 칸디디시마(Salvia candidissima), 살비아 누탄스(Salvia nutans), 살비아 렙탄스(Salvia reptans), 소로세리스 훅케리아나(Soroseris hookeriana), 스테모디아 비스코세(Stemodia viscose), 타나세텀 불가레(Tanacetum vulgare), 토달리아 플로리번다(Toddalia floribunda), 팀브라 카피타타(Thymbra capitata), 티무스 히르투스(Thymus hirtus), 티무스 불가리스(Thymus vulgaris), 버베나 비피나티피다(Verbena bipinnatifida), 발레리아나 카르다민스(Valeriana cardamines), 발레리아나 에리오필라(Valeriana eriophylla), 발레리아나 페드츠켄코이(Valeriana fedtschenkoi), 발레리아나 락시플로라(Valeriana laxiflora), 비시아 트룬카툴라(Vicia truncatula), 산토르호이아 하스틸 더치(Xanthorrhoea hastile durch) 및 산토르호이아 하스틸라(Xanthorrhoea hastila) 식물의 성분으로 보고되어 있는 물질이다. 특히 디오스메틴(Diosmetin)은 항박테리아 효과(Planta Medica, 70(6), 2004, 509-514), 항알러지효과(Bioorg. Med. Chem, 10(10), 2002, 3123-3128), 항염증(J. haram. Pharmacol., 50(9), 1998, 1069-1074) 등으로 알려져 있다.

본 발명자들은 멜라닌 생성 및 멜라닌 세포의 분화와 성숙 등에 관여하는 c-Kit의 활성을 저해하는 물질을 스크리닝(screening)하기 위하여 천연에서 자생하는 동식물 등을 대상으로 연구를 거듭한 결과, 디오스메틴이 매우 강력한 c-Kit의 활성 저해능을 나타냄을 밝혀내고 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 디오스메틴은 c-Kit에 대한 활성을 저해하므로, 항암 효과 외에도 멜라닌 세포의 분화와 성숙 및 멜라닌 합성에 관여하는 효소의 합성도 저해하는 다기능 피부미백제로 사용이 가능하다. 특히, 디오스메틴과 같은 c-Kit 활성 저해제는 멜라닌 합성의 신호전달 초기에 작용함으로써 소량으로도 효과적인 피부미백 효과를 달성할 수 있다.

디오스메틴을 감국으로부터 추출하는 방법을 예시하면 다음과 같으며, 추출 대상이나 추출방법이 이에 한정되는 것은 아니다.

생약재로 시판되는 감국을 구입하여 잘게 분쇄하고, 분쇄물 건조 중량에 대하여 5-20부피의 메탄올로 환류 냉각기가 달린 추출기에서 50-100℃로 1-5시간 가열하여 추출한다. 이 결과물을 여과포로 여과한 후 잔사를 같은 방법으로 1회 이상씩 더 추출한다. 추출액을 합하여 감압 농축한 후 동결건조나 분무 건조하여 건조추출물을 얻는다. 제조된 감국의 메탄올 추출물로부터 유효성분을 확인하기 위해 메탄올 추출물을 10배의 물에 현탁시킨 후 동일 양의 헥산 용매로 분획하여 비극성 물질을 제거하고, 이후 남은 수층에 대해 동일 양의 부탄올 용매로 용매 분획하여 감국 부탄올 분획을 얻었다. 제조된 감국 부탄올 분획은 실리카겔 컬럼 크로마토그라피를 용리액으로서 클로로포름, 메탄올 혼합용매로 수행하여 유효성분을 분리하고, 얻은 유효성분은 분취용 HPLC사용하여 동일 조건으로 수행하여 순수하게 정제한다. 정제된 유효성분은 핵자기공명스펙트럼(NMR) 및 질량분석(Mass)을 통하여 디오스메틴(Diosmetin)으로 확인할 수 있다.

디오스메틴은 조추출물의 형태로 또는 정제한 순수 화합물의 형태로 스킨, 로션, 크림, 파운데이션, 에센스, 젤, 팩, 폼 클렌징, 비누 등의 화장료나 연고와 같은 다양한 조성물에 유효량 첨가되어 피부미백 효과를 나타낼 수 있다. 피부미백 효과와 경제성을 고려할 때, 디오스메틴의 첨가량은 조성물 총 중량을 기준으로 0.000001 내지 10중량%인 것이 바람직한데, 더욱 바람직하게는 0.0001 내지 1.0중량%이다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석 되어서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.

<실시예 1>

생약재로 시판되는 건조된 감국을 구입하여 잘게 분쇄하고, 분쇄물 10kg에 대하여 150L 메탄올로 환류 냉각기가 달린 추출기에서 70℃로 3시간 동안 가열하여 추출하였다. 추출물을 여과포로 여과한 후 잔사를 같은 방법으로 1회 이상 더 추출하였다. 추출액을 합하고 감압농축하여 건조 추출물 1.2kg을 얻었다.

<실시예 2>

실시예 1에서 제조된 감국 메탄올 추출물 1kg을 10L의 물에 현탁시킨 후 헥산 10L씩을 가해 3회 용매 분획하여 헥산 분획을 제거하고, 남은 수층에 대해 10L씩의 부탄올을 가해 3회 용매 분획하여 부탄올 분획을 얻고, 이를 감압농축하여 건조물 125g을 얻었다.

<실시예 3>

실시예 1에서 제조된 감국 메탄올 추출물 1kg을 10L의 물에 현탁시킨 후, 에칠아세테이트 10L씩을 가해 3회 용매 분획하여 에칠아세테이트 분획을 얻고, 이를 감압농축하여 건조물 230g을 얻었다.

<실시예 4>

실시예 2에서 제조된 감국 부탄올 가용분획 100g을 실리카겔 컬럼 크로마토그라피를 용리액으로서 클로로포름, 메탄올 혼합용매로 수행하여 유효분획을 얻고, 이 분획을 분취용 HPLC를 수행하여 유효성분 1.2g을 얻었다. 분리한 유효성분은 핵자기공명스펙트럼(NMR) 및 질량분석(Mass)을 통하여(도1 내지 도3 참조) 하기 화학식 1로 나타낸 디오스메틴을 확인하였다.

<화학식 1>

분자식) C₁₆H₁₂O₆

분자량) 300.27

융점) 260 ~ 264℃

UV(λax, nm)(MeOH) 272, 342

1H-NMR(DMSO-d6) σ: 3H(6.69,s), 6H(6.13,s), 8H(6.39,s), 2'H(7.41,s), 5'H(7.06,d,8.6Hz), 6'H(7.51,d,8.6Hz), 5-OH(12.89,br), 7-OH(10.0,br), 4'-OMe(3.85,s)

<실험예 1> c-Kit 활성 저해 효과

상기 실시예 1(메탄올 추출물) 및 실시예 2(부탄올 가용분획)의 농도가 각각 20ug/ml, 실시예 4(Diosmetin)은 최종농도가 0.3uM이 되도록 하여 c-Kit RTK을 ATP와 384-well plate의 각 웰에 첨가하여 상온에서 1차 반응시킨 후, 기질로서 비오티닐화된 폴리[글루타민:티로신](4:1)(biotinylated-poly[Glu:Tyr] (4:1))을 첨가하여 2차 효소 반응을 진행시켰다.

기질들과 결합하도록 스트렙타비딘(Streptavidin)이 피복된 증여체 비드(donor bead)와 항체(P-Tyr-100)가 결합된 수용체 비드(acceptor bead)가 포함된 캡쳐 완충액(capture buffer)을 첨가하여 3차 반응시켰다. 기질의 인산화 정도는 퓨전 마이크로플레이트(Fusion^TM microplate) 분석장치를 이용하여 알파스크린 신호를 측정함으로써 결정한다. 또한 기존에 c-Kit의 저해제로 알려진 Tyrphostin A51를 이용하여 저해효과를 비교하였다.

알파스크린 신호를 정확하게 측정하기 위하여 각각의 시료에 대하여 3회 실시하였으며 c-Kit에 대한 저해율을 구하기 위해서 양성 대조군에는 시료대신 DMSO를 가하였고, 음성 대조군에는 시료 대신 DMSO를 가하고 효소대신 완충액을 가하였다.

감지된 signal로부터 c-Kit에 대한 활성 저해율(%inhibition)은 하기 수학식 1에 의하여 계산하고 결과를 하기 표 1에 정리하였다.

시료	저해율(%)
메탄올 추출물(실시예 1) 20ug/ml	33.3
부탄올 가용분획(실시예 2) 20ug/ml	45.1
Diosmetin(실시예 4) 0.3uM	83.1
Tyrphostin A51 14.8uM	100.0

표 1의 결과에서 볼 수 있듯이, 디오스메틴을 함유하는 조추출물인 실시예 1과 2의 시료는 c-Kit에 대한 저해율이 높았으며, 정제한 디오스메틴인 실시예 4의 시료는 c-Kit의 활성 저해제로 알려진 Tyrphostin A51과 비교할 때 동등 수준으로 우수한 c-Kit 활성의 억제능이 있음을 알 수 있다.

<실험예 2> 미백효과 평가

디오스메틴을 화장료에 첨가시 미백효과를 평가하기 위하여, 하기 표 2에 기재된 성분과 함량으로 크림을 제조하였다.

성분(중량, %)	제조예 1	비교예1
Diosmetin(실시예 4)	0.5	-
스테아린산	15.0	15.0
세탄올	1.0	1.0
수산화칼륨	0.7	0.7
글리세린	5.0	5.0
프로필렌그리콜	3.0	3.0
방부제	적량	적량
향	적량	적량
정제수	to 100	to100

상기 표 2에 따라 제조한 크림에 대한 색소침착 저해효과를 검증하기 위해 사용한 방법은 다음과 같다. 건강한 남여 20명을 선정하여 양팔의 하박부에 직경 15mm크기의 구멍이 2개씩 2줄로 파인 알루미늄 호일을 붙이고, 팔에서 10cm 떨어진 거리에서 ORIEL solar simulator 1000W를 사용하여 60mJ/cm²의 광량을 조사하였다. 조사전에 70% 에탄올 수용액으로 조사 부위를 잘 세척하였다. 조사하기 3일전부터 조사 후 3주째까지 1일 2회씩 제조예 1 및 비교예 1에 따라 제조된 기제를 한 쌍으로 같은 줄에 도포하였다.

각각에 대하여 제조예와 비교예의 색소침착도를 육안으로 판정하고, 제조예가 비교예에 비해 색소침착을 억제한 정도를 효과있음, 차이없음의 2단계로 평가하였으며, 그 결과는 하기 표 3과 같다.

시험물질	효과있음(명)	차이없음(명)
제조예 1	14	6

위의 표 3의 결과에서 볼 수 있듯이, 제조예 1의 디오스메틴을 함유한 크림은 피시험자 20명 중에서 14명에 대하여 미백 효과를 나타내었으며, 피부내에서 어떤 부작용도 나타나지 않았다.

<실험예 3> 기미 개선 효과

기미를 갖고 있는 건강한 여성 10명을 선정하여 안면부의 기미 부위에 1일 2회씩 제조예 1 에 따라 제조된 기제를 3주간 도포하였다.

실험종료 후 전문가에 의한 색소 침착도를 육안으로 판정하였고 피시험자의 주관적인 판단에 의하여 기미 개선 정도를 판정하여 제조예 1 의 기미 개선에 대한 여부를 효과있음, 효과없음의 2단계로 평가하였으며, 그 결과는 하기 표 4과 같다.

	효과있음(명)	차이없음(명)
전문가 판단	5	5
피시험자의 주관적 판단	7	3

상기 표 4의 결과에서 볼 수 있듯이, 제조예 1에 따라 제조된 디오스메틴(Diosmetin)을 함유한 크림은 피시험자 10명 중에서 7명에 대하여 기미 개선 효과를 나타내었다.

이와 같이, 본 발명에 따른 디오스메틴은 효과적인 c-Kit 활성 저해제이다. 특히, 디오스메틴은 피부에 대한 부작용이 없으며, 멜라닌 생성 및 멜라닌 세포의 분화와 성숙을 저해하므로, 디오스메틴을 유효성분으로 함유하는 화장료 등의 조성물은 기미나 주근깨 개선 등의 피부미백에 매우 효과적으로 사용될 수 있다.

Claims

삭제
하기 화학식 1로 표시되는 디오스메틴(Diosmetin)을 함유하는 피부미백제.

<화학식 1>
제2항에 있어서, 상기 디오스메틴은 기미개선을 위해 적용된 것을 특징으로 하는 피부미백제.
제2항에 있어서, 상기 디오스메틴은 감국(Chrysanthemum morifolium의 꽃; 甘菊)으로부터 추출된 것을 특징으로 하는 피부미백제.
하기 화학식 1로 표시되는 디오스메틴(Diosmetin)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물.

<화학식 1>
제5항에 있어서, 상기 디오스메틴은 기미개선을 위해 유효성분으로 함유되는 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물.
제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 디오스메틴의 함량은 조성물 총 중량을 기준으로 0.000001 내지 10중량%인 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물.
제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 피부미백용 화장료 조성물은 스킨, 로션, 크림, 파운데이션, 에센스, 젤, 팩, 폼 클렌징, 비누 및 연고로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형으로 형성된 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물.