KR100753321B1 - 감광제를 이용한 생물오염물질의 불활화를 위한 방법 및기기 - Google Patents

감광제를 이용한 생물오염물질의 불활화를 위한 방법 및기기 Download PDF

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Abstract

유체내 또는 표면위 미생물의 불활화를 위한 방법 및 기기를 제공한다. 가급적 유체는 혈액 또는 혈액 산물을 함유하고, 생리활성 단백질을 포함한다. 선호되는 방법에서, 내생성 감광제의 비-독성 효과량을 유체에 첨가하고, 상기 유체를 충분한 광방사선에 노출시켜 내생성 감광제를 활성화시키고, 이에 따라 미생물은 불활화된다. 주스, 물등을 비롯하여, 다른 유체는 이들 방법으로 오염제거하는데, 식품의 표면, 동물 사체의 표면, 상처표면, 식품 조제물 표면, 욕조 및 수조의 표면도 이들 방법으로 오염제거할 수 있다. 알록사진, 비타민K, 비타민L은 선호되는 감광제이다. 감광제를 이용한 이런 유체의 오염제거를 위해 유출-통과 및 일괄처리를 위한 장치 및 기기를 제공한다.

Description

감광제를 이용한 생물오염물질의 불활화를 위한 방법 및 기기{METHOD AND APPARATUS FOR INACTIVATION OF BIOLOGICAL CONTAMINANTS USING PHOTOSENSITIZERS}
관련된 출원에 대한 참고
이 출원은 미국 출원 09/119,666(1998. 7. 21)의 일부계속출원이며, 이를 여기에 참고문헌으로 한다.
HIV, 간염, 다른 바이러스 및 박테리아와 같은 감염성 미생물로 인한 혈액의 오염은 전체혈액을 수혈하거나 또는 혈소판, 적혈구, 혈장, Ⅷ인자, 플라스미토겐, 피브로넥틴, 항-트롬빈 Ⅲ, 내분비침전물, 사람 혈장단백질분취물, 알부민, 면역청 글로불린, 프로트롬빈 복합성 혈장 생장호르몬, 다른 혈액에서 분리한 성분과 같은 다양한 성분을 투여받아야 하는 사람들의 건강에 심각한 위협이 된다. 혈액 선별 과정은 오염물질을 놓칠 가능성이 있고, 그리고 세포혈액 성분을 손상시키지 않으면서 효과적으로 모든 감염성 바이러스 및 미생물을 불활화시키는 멸균 과정은 이전에는 사용되지 않았다.
혈액 성분 오염제거의 용매 세정방법은 HIV와 같은 바이러스를 둘러싼 인지질막을 분해하여 이루어지는데, 혈액의 단백질성분에는 아무런 손상을 주지 않는다; 하지만, 혈액세포가 존재하면, 이런 방법은 세포막에 손상을 주기 때문에 사용 할 수 없다.
감광제, 즉 한정된 파장의 빛을 흡수하고, 흡수된 에너지를 에너지 수용체에 전달하는 화합물을 혈액 성분 멸균에 사용하는 방법이 제시되고 있다. 가령, 유럽 특허출원 196,515(1986. 10. 8 공개)에서는 포르피린, 프소랄렌, 아크리딘, 톨루이딘. 플라빈(아크리플라빈 염산염), 레노티아진 유도체와 같은 비-내생성(endogenous) 감광제, 중성 레드와 같은 염료, 메틸렌 블루의 혈액 첨가제로의 용도를 제안하였다. 프로토포피린은 신체에서 자연적으로 발생하는 것인데, 대사분해시켜 감광제를 만들 수 있다; 하지만, 이의 사용은 제한적인데, 그 이유는 이것은 원하는 생리활성의 단백질을 분해하기 때문이다. 클로로프로마진 역시 감광제의 일 예이다; 하지만, 이의 사용은 제한적인데, 이것은 클로로프로마진의 진정작용으로 인해, 오염 제거후 환자에게 투여된 임의의 유체에서 이를 제거해야 하기 때문이다.
Goodrich, R.P., et al.("The Design and Development of Selective, Photoactivated Drugs for Sterilization of Blood Products,"Drugs of the Future 22:159-171, 1997)은 프소랄렌을 비롯한 일부 감광제 및 혈액 산물의 오염제거를 위한 감광제의 선택에 있어 중요한 몇 가지 사안을 검토하였다. DNA 광분할을 위한 텍사피린의 용도는 미국 특허 5,607,924(March 4, 1997, Magda et al), 5,714,328(February 3, 1998, Magda et al)에서 제시하였다. 바이러스 불활화를 위한 사피린의 용도는 미국 특허 5,041,078(August 20, 1991, Matthews)에서 제시하였다. 혈액 및 혈액 성분에서 펜티아진-5-이움 염료 및 광에 의한 세포외 외피바이러스의 불활화는 미국 특허 5,545, 516(August 13, 1996, Wagner)에서 제시하였다. 포르피린, 헤마토포르피린, 메로시아닌 염료를 체액과 같은 신체조직에서 나온 바이러스나 원생동물과 같은 전염성 오염물질을 박멸하기 위한 감광제로 사용하는 것에 대해서는 미국 특허 번호 4,915,683(April 10, 1990, Sieber et al), 관련 미국 특허 5,304,113(April 19, 1994, Sieber et al)에서 공개하였다. 이런 감광제 작용기작에는 외피 바이러스 및 일부 바이러스-감염된 세포의 지질이중층 도메인에 대한 선호적 결합이 관여하는 것으로 알려지고 있다. 막-결합물질 분자의 광들뜸은 지질 과잉산화를 유발하는 일중합산소와 같은 반응성 산소종류의 형성을 유도한다. 이런 감광제를 사용할 때의 문제점은 이들이 적혈구 세포와 같은 오염제거 대상 유체 성분의 세포막을 공격하고, 또한 일중합 산소도 처리대상 체액의 단백질 성분을 공격한다는 점이다. 미국 특허 4, 727,027(February 23, 1988, Wiesehahn, G.P.)에서는 프소랄렌을 포함한 푸로코우마린 및 이의 유도체의 혈액 및 혈액산물의 오염제거를 위한 용도를 공개하면서, 생물활성 단백질의 변성을 억제하기 위하여, 용해된 산소 및 다른 활성종의 효율을 감소시키기 위한 조치를 강구해야 한다고 지적하였다. 할로겐화된 코우마린을 사용한 바이러스 및 박테리아 혈액 오염물질의 광불활화는 미국 특허 5,516,629(May 14, 1996, Park, et al), 미국 특허 5,587,490(December 24, 1996 , Goodrich Jr., R.P., et al)에서 제시하였고, 미국 특허 5,418,130(Platz, et al)에서는 바이러스 및 박테리아 혈액 오염물질의 불활화를 위한 치환된 프소랄렌의 용도를 공개하였다. 나중 쪽의 특허는 또한 다른 혈액성분에 대한 자유 라디컬손상의 조절필요성을 지적하였다. 미국 특허5,654,443(August 5,1997, Wollowitz et al)에서는 혈액의 광오염물질제거에 사용하는 신규한 프소랄렌 조성물을 제시하였다. 미국 특허 5,709,991(January 20, 1998, Lin et al)에서는 혈소판 제조물의 광오염제거를 위한 프소랄렌의 용도 및 이후의 프소랄렌 제거를 제시하였다. 미국 특허 5,120,649(June 9, 1992), 관련 미국 특허 5,232,844(August 3, 1993, Horowitz, et al)에서는 지질막을 공격하는 감광제와 병용한 "소거제(quencher)"의 사용필요성을 지적하고, 미국 특허 5,360,734(November 1, 1994, Chapman et al)에서는 다른 혈액 성분에 대한 손상을 예방하는 문제를 다루었다.
핵산을 공격하는 감광제는 공지된 것이다. 미국 특허 5,342,752(August 30, 1994, Platz et al)에서는 적혈구, 혈소판, 혈장 단백질분취물로 이루어진 혈액물질상의 기생충 오염을 줄이기 위한 아크리딘 염료에 기초한 화합물의 용도를 공개하였다. 이들 물질은 적혈구 세포에 대해 상당히 적긴 하지만, 어느 정도의 독성을 나타낸다. 이 특허에서는 유출-통과에 기초하여 혈액의 오염을 제거하는 기기에 대해서는 전혀 언급하지 않았다. 미국 특허 5,798,238(Goodrich, Jr.,)에서는 바이러스 및 박테리아 오염물질의 불활화를 위한 퀴놀론 및 퀴놀론 화합물의 용도를 공개하였다.
광활성물질과 DNA를 결합시키는 방법은 혈액에서 림프구성 개체군을 줄이기 위한 공정에 이용되고 있다(미국 특허 4,612,007(September 16, 1986), 관련 미국 특허 4,683,889(August 5, 1987, Edelson)).
리보플라빈(7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진)은 핵산을 공격하는 것으로 알려지고 있다. 리보플랄빈의 존재하에서 핵산의 광변형은 Tsugita, A, et al. (1965), "Photosensitized inactivation of ribonucleic acids in the presence of riboflavin," Biochimica et Biophysica Acta 103:360-363; Speck, W.T. et al. (1976), "Further Observations on the Photooxidation of DNA in the Presence of Riboflavin," Biochimica et Biophysica Acta 435:39-44에서 제시하였다. 루미플라빈(7,8,10-트리메틸이소알록사진)의 DNA에 대한 결합은 Kuratomi, K., et al. (1977), "Studies on the Interactions between DNA and Flavins," Biochimica et Biophysica Acta 476:207-217에서 설명하였다. Hoffmann, M.E., et al.(1979), "DNA Stand Breaks in Mammalian Cells Exposed to Light in the Presence of Riboflavin and Tryptophan," Photochemistry and Photobiology 29:299-303에서는 가시 형광 또는 자외선-인접 광에 노출후 포유동물세포의 DNA상에 개방을 유도하기 위한 리보플라빈 및 트립토판의 용도를 공개하였다. 이 자료논문에서 이들 효과는 리보플라빈 또는 트립토판이 배지에서 제거될 경우, 일어나지 않는다고 밝혔다. 프로플라빈 또는 광에 노출 직후 DNA 가닥 개방은 Piette, J. et al.(1979), "Production of Breaks in Single-and Double-Stranded Forms of Bacteriophage φX174DNA by Proflavine and Light Treatment," Photochemistry and Photobiology 30:369-378에서 밝혔고, 프로플라빈-매개의 DNA 광멸균동안 구아닌 잔기의 변형은
Piette, J., et al.(1981), "Alteration of Guanine Residues during Proflavine Mediated Photosensitization of DNA," Photochemistry and Photobiology 33:325-333에서 공개하였다.
J. Cadet, et al.(1983), "Mechanics and Products of Photosensitized Degradation of Nucleic Acids and Related Model Compounds," Israel J. Chem 23:420-429에서는 일중항산소 생산에 의한 로즈 벤갈, 메틸렌 블루, 티오닌, 다른 염료의 작용기작을 일중항산소 생산이 관여하지 않는 기작과 비교하여 논하였는데, 일중항산소의 생산시, 플라빈 또는 피테론 유도체에 의한 핵산공격이 진행된다. 이 공개문에서는 핵산을 분해하는 능력을 가진 것으로 리보플라빈을 예로 들었다. Korycka-Dahl, M., et al.(1980), "Photodegradation of DNA with Fluorescent Light in the Presence of Riboflavin, and Photoprotection by Flavin Triplet-State Quenchers," Biochimica et Biophysica Acta 610:229-234에서는 활성 산소종류 역시 리보플라빈에 의한 DNA 분할에 직접적으로 관여하지 않는다고 밝혔다. Peak, J.G., et al.(1984), "DNA Breakage Caused by 334-㎚ Ultraviolet Light is Enhanced by Naturally Occurring Nucleic Acid Components and Nucleotide Coenzymes," Photochemistry and Photobiology 39:713-716에서는 추가적으로 리보플라빈 및 다른 감광제의 작용기작을 조사하였다. 하지만, 이런 감광제가 약물 유체의 오염제거를 위해 사용될 수 있다는 것에 대해서는 어떠한 언급도 없다.
혈액의 오염제거를 위한 기기는 미국 특허 5,290,221(March 1, 1994 , Wolfe, Jr., et al), 미국 특허 5,536,238(July 16, 1996, Bischof)에서 제시하였다. 미국 특허 5,290,221에서는 상대적으로 협소하고 아치형 간극에서 유체의 방사선조사에 대하여 공개하였다. 미국 특허 5,536,328에서는 침투 배지로 확장되는 광학섬유를 이용한 장치를 공개하였다. 양 특허는 감광제로 세포벽에 친화성을 가진 벤조포피린 유도체를 추천하였다.
여기서 언급한 모든 공개문헌은 일관된 본 내용에 참고문헌으로 한다.
요약
적어도 일부 미생물 및 백혈구세포를 불활화시키기 위한 유체 또는 다른 물질을 처리하는 방법 및 장치를 제공하였다. 이런 유체는 또한 하나 또는 복수의 성분을 함유하는데, 이런 성분은 생물활성의 파괴없이, 단백질(예, 치료요법 단백질과 같은 생물활성 단백질), 혈액, 혈액 구성성분에서 선택된다.
상기 방법은 다음과 같이 이루어진다;
(a) 내생성(endogenous) 감광제 또는 내생성-기초의 유도성 감광제의 비-독성 효과량과 유체를 혼합하고;
(b) 유체를 충분한 광방사선에 노출시켜, 감광제를 활성화시킨다; 이에 따라 미생물의 적어도 일부는 불활화된다.
이들 감광제가 미생물을 불활화시키는 기작중의 하나는 핵산을 간섭하여, 핵산의 복제를 예방하는 것이다.
여기서, "미생물의 불활화"란 미생물을 죽이거나 또는 재생능력을 방해하여, 전반적으로 또는 부분적으로 미생물의 복제를 예방하는 것을 의미한다.
미생물에는 바이러스(세포외 및 세포내), 박테리아, 박테리오파아지, 진균, 혈액-이동 기생충, 원생동물이 포함된다. 전형적인 바이러스에는 후천성 면역결핍(HIV) 바이러스, 간염 A, B, C 바이러스, 신드비스 바이러스, 시토메갈로바이러스, 수포성구내염바이러스, 단순포진 바이러스(예, I, II형), 사람 T-림프영 양성 레트로바이러스, HTL Ⅴ-Ⅲ, 림프절증 바이러스 LAV/IDAV, 파르보바이러스, 수혈-전이(TT) 바이러스, 엡스테인-바르 바이러스, 다른 공지된 바이러스가 포함된다. 박테리오파아지에는 φX174, φ6, λ, R17, T4, T2가 포함된다. 전형적인 박테리아에는 녹농균(P. aeruginosa), 황색포도구균(S. aureus), 표피포도구균( S. epidermidis), 리스테리아 모노시토게네스(L. monocytogenes), 대장균(E. coli ), 클레브시에라 피뉴모니아(K. pneumonia), 영균(S. marcescens)이 포함된다.
백혈구 세포의 불활화는 면역 또는 자가면역반응의 억제가 필요한 경우, 가령 공여 백혈구세포가 존재할 때, 적혈구, 혈소판, 혈장의 수혈과 관련된 과정에 바람직하다.
본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 물질에는 바이러스 불활화가 이루어지도록 충분한 광을 제공하는 광방사선을 적적히 투과시키거나 또는 광방사선을 투과시키는 유체에 현탁 또는 분해될 수 있는 물질이 포함된다. 이런 물질의 예로 전체 혈액, 또는 혈액이나 혈액 구성성분에서 유도한 생리활성 단백질을 보유한 수용성 조성물을 들 수 있다. 뭉친 적혈구세포, 혈소판, 혈장(새로운 또는 새롭게 동결된 혈장)은 이런 혈액 구성성분의 전형적인 예이다. 또한, 치료요법적 단백질 조성물은 의학적 질환의 치료에 유용한 생리활성 단백질을 함유한 유체와 같은 혈액에서 유도한 단백질을 보유하는데, 이런 활성성분에는 인자 Ⅷ, 본 윌레브랜드 인자, 인자 Ⅸ, 인자 Ⅹ, 인자 XI, 하게만 인자, 프로트롬빈, 항-트롬빈III, 피브로넥틴, 혈장단백질분취물, 면역혈청글로불린, 변형면역글로불린, 알부민, 형질인 자호르몬, 소마토메딘, 플라스미노겐 스트렙토키나아제 복합체, 세룰로플라스민, 트랜스페린, 햅토글로빈, 안티트립신, 프레칼리크레인이 있고, 상기 단백질조성물은 본 발명의 오염제거 방법으로 처리할 수 있다. 본 발명의 처리로부터 도움을 받을 수 있는 다른 유체에는, 연결동안 오염되어 복막 감염을 유발하는 복막 투석용 용액이 있다.
"생물활성"이란 생물체 또는 이의 구성요소에 변화를 일으킬 수 있다는 것을 의미한다. 여기서 언급한 것과 같은 "생물활성단백질"의 측면에서, "생물활성"은 불활화된 미생물의 일부분이 되는 단백질을 의미하지 않는다. 유사하게, 감광제의 측면에서 "비-독성"은 사람 및 다른 포유동물에 대한 저독성 또는 무독성을 의미하며, 불활화된 미생물에 대한 무독성을 의미하지 않는다. 생물활성의 "실제적인 파괴"란 포르피린 또는 포르피린 유도체, 대사산물, 전구물질에 의해 야기된 것과 적어도 동일한 파괴를 의미하는데, 이들은 사람 및 포유동물의 생물활성 단백질 및 세포를 손상시키는 것으로 알려져 있다. 유사하게, "실제적으로 비-독성"은 포르피린, 포르피린 유도체, 대사산물, 혈액 멸균에 공지된 전구물질보다 낮은 독성을 의미한다.
여기서 사용한 "혈액 산물"에는 혈액 구성성분 및 치료요법적 단백질 조성물이 포함되는데, 이들 조성물은 상기 정의한 것과 같이 혈액에서 유도한 단백질을 함유한다. 혈액에서 유도한 것을 제외한 다른 생물활성 단백질을 함유한 유체 또한 본 발명의 방법으로 처리한다.
내생성 감광제 및 내생성-기초의 감광제 유도체를 이용한 본 발명의 오염제거 방법은 미생물을 제외한 유체성분의 생리활성을 실제적으로 파괴하지 않는다. 이들 성분의 생리활성이 가능한 많이 유지되고, 비록 특정한 경우이긴 하지만 이들 방법이 최적화되는 경우, 생리활성의 일부 손실(예, 단백질성분의 변성)은 유체의 효과적인 오염제거와 균형을 이루게 된다. 유체성분이 의도한 또는 본 목적에 유용한 충분한 생리활성을 가능한 오래 유지하는 경우, 이들의 생리활성은 "실제적으로 파괴된" 것으로 간주하지 않는다.
본 발명에 유용한 감광제에는 미생물을 불활화시키는데 유용한 것으로 당분야에 공지된 임의의 감광제가 포함된다. "감광제"는 하나 또는 복수의 한정된 파장의 방사선을 흡수하고, 이 흡수된 에너지를 이용하여 화학공정을 행하는 임의의 화합물로 정의한다. 이런 감광제의 예에는 포르피린, 프소랄렌, 중성 레드와 같은 염료, 메틸렌 블루, 아크리딘, 톨루이딘, 플라빈(아크리플라빈 염산염), 감광제 유도체, 코우마린, 퀴놀론, 퀴논, 앤트로퀴논이 있다. 본 발명의 감광제에는 가급적 핵산을 흡수하고, 이후 이들의 광역동적 효과를 미생물 및 바이러스에 집중시키면서도 동반한 세포나 단백질에는 거의 영향을 주지 않는 화합물이 포함된다. 다른 감광제도 본 발명에 유용한데, 그 예로 일중항산소-의존성 기작을 이용한 것을 그 예로 들 수 있다. 내생성 감광제가 가정 적절하다. "내생성"이란 신체에 의한 생합성 또는 필수 식량(예, 비타민)의 섭취에 의한 결과로, 또는 대사산물의 형성 또는 생체내 부산물로 사람 또는 포유동물 체내에서 자연적으로 발견되는 것을 의미한다. 이런 내생성 감광제의 예로 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진(리보플라빈), 7,8,10-트리메틸이소알록사진(루미플라빈), 7,8-디메틸알록사진(루미크롬), 이소알록사진-아데닌 이중뉴클레오티드(플라빈 아데닌 이중뉴클레오티드[FAD]), 알록사진 단일뉴클레오티드(플라빈 아데닌 이중뉴클레오티드[FMN], 리보플라빈-5-인산염), 비타민 Ks, 비타민 L, 이들의 대사산물 및 전구물질, 나프트트오퀴논, 나프탈렌, 나프톨, 평면분자형을 가진 이들의 유도체와 같은 알록사진을 들 수 있다. "알록사진(alloxazine)"에는 이소알록사진이 포함된다. 내생성-기초의 유도성 감광제에는 합성유도성 유사체 및 내생성 감광제의 동소체가 포함되는데, 이들 유사체 및 동소체는 원 감광제로부터 유도된 저급(1-5)알킬 또는 할로겐 치환체를 보유 또는 결핍하고, 원 감광제의 기능 및 실제적인 비-독성을 계속 유지한다. 내생성 감광제를 사용할 경우, 특히, 이런 감광제가 본질적으로 비-독성이거나 또는 방사후, 독성 광산물(photoproduct)을 만들지 않는 경우, 오염제거후 소거나 정제단계가 필요하지 않으며, 처리된 산물은 직접 환자의 체내에 환원하거나 치료요법 효과가 필요한 환자에게 투여할 수 있다. 적절한 내생성 감광제는 다음과 같다.
화학식
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본 발명의 방법에서는, 감광제와 오염제거할 물질을 혼합해야 한다. 혼합은 감광제를 또는 감광제를 함유한 용액을 오염제거할 체액에 부가하여 행한다. 한 구체예에서, 감광제가 부가되는 오염제거물질은 광방사선재료를 빠르게 통과하는데, 일반적으로 물질의 유출이 충분한 난류가 제공하여, 오염제거할 체액 전체로 감광제를 분산시킨다. 또 다른 구체예에서, 체액 및 감광제는 광투과성 용기에 놓아두고 방사선으로 일괄처리하면서, 가급적 용기를 휘저어 감광제를 완전히 분산시키고, 모든 체액을 방사선에 노출시킨다.
체액과 혼합되는 감광제의 양은 적절히 미생물을 불활화시킬 만큼의 양이 되겠지만, 독성(사람 또는 다른 동물에게)양 또는 불용성양 미만이어야 한다. 여기서 지적한 것과 같이, 원하는 감광제의 최적농도는 당업자가 과도한 실험없이 결정할 수 있다. 가급적 감광제는 체액에서 적어도 최대 1μM의 용해성 농도로 사용된 다. 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진의 경우, 농도는 1μM와 160μM사이의 범위가 선호되며, 가급적 10μM가 된다.
감광제를 함유한 체액은 적절한 파장의 광방사선에 노출시켜 감광제를 활성화시키는데, 여기서 전술한 것과 같이 감광제를 활성화시킬 만큼의 충분한 양의 방사선을 사용하지만, 생리성분에 비-특이적 손상을 일으키거나 또는 체액에 존재하는 다른 단백질의 생리활성을 실제적으로 간섭하는 양 미만이어야 한다. 사용한 파장은 선택한 감광제에 따라 달라지는데, 당업자는 다음의 지침을 따라 과도한 실험없이 손쉽게 결정할 수 있다. 적절한 광원은 300㎚ 내지 700㎚광을 제공하는 형광 또는 발광원이고, 좀더 적절하게는 340㎚ 내지 650㎚의 방사선이 된다. 자외선에서 가시광선 범위까지의 파장이 본 발명에 유용하다. 광원(들)은 가시광선범위상의 광, 자외선범위의 광, 또는 적절하게는 가시광선 및 자외선범위의 혼합광, 좀더 적절하게는 가시광선 및 자외선 스펙트럼상이 각각 절반이 되며, 다른 비율도 사용가능하다. 혼합광선의 장점중 하나는 가시광선 스펙트럼이 혈소판에 손상을 주지않으면서, 좀더 해로운 자외선 방사선의 필요량을 줄일 수 있다는 점이다. 활성화된 감광제는 미생물의 복제를 간섭하거나 예방하여, 이를 불활화시킬 수 있다. 감광제의 작용 특이성은 감광제가 미생물 핵산의 근처로 근접함으로써 전달되는데, 이는 감광제가 핵산에 결합하기 때문이다. "핵산"에는 리보핵산(RNA) 및 데옥시리보핵산(DNA)이 포함된다. 다른 감광제는 세포막에 결합하거나 또는 다른 기작을 통해 작용한다. 이 감광제는 항체, 가급적 미생물에 대한 특정 단일클론 항체와 공유결합함으로써 불활화되는 미생물의 표적이 된다.
감광제를 함유한 유체는 방사목적의 광투과성 용기로 흘러간다. "용기"란 밀폐된 또는 개방된 공간을 의미하는데, 이들은 경직된 또는 유연성 물질(예, 백, 박스, 나무그릇)로 구성된다. 이것은 꼭대기가 닫혀있거나 또는 개방될 수도 있고, 양끝에 구멍이 있어(예, 튜브, 고무관) 유체가 이를 통과하여 흐를 수도 있다. 쿠벳을 이용하여 유출-통과장치와 관련된 본 발명의 한 구체예를 예시하였다. TrimaTM SpectraTM 및 Cobe Laboratories의 아프헤레시스 장치에서 이용한 것과 같은 수집 백을 사용하여 유체의 일괄-처리와 관련된 본 발명의 다른 구체예를 예시하였다.
"광투과성"이란 용기의 물질이 감광제를 활성화시키기 위한 적절한 파장의 광방사선을 적당히 투과시키는 것을 의미한다. 유출-통과장치에서, 용기는 광방사선이 용기를 적당히 투과하고 광원으로부터 멀리 떨어진 감광제 분자에 접촉하여, 오염제거할 유체상의 미생물이 불활화되게 하는 충분한 깊이(광방사선원으로부터 방사선방향으로 측정한 치수)와 유체가 광방사선에 충분히 노출될 만큼 충분한 길이를 갖는다. 과도한 실험없이 당업자는 이런 용기를 만들기 위한 재료, 이런 용기의 깊이 및 넓이를 여기의 지침을 따라 쉽게 결정할 수 있고, 용기를 통과하는 유체의 유속과 함께, 광방사선의 강도 및 유체 성분(예, 혈장, 혈소판, 적혈구세포)의 흡수도로 유체의 광방사선에 대한 노출 필요시간을 결정한다. 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진의 경우, 방사선의 적절량은 1J/㎠ 내지 120J/㎠이다.
일괄-처리와 관련된 또 다른 구체예에서, 처리할 유체는 휘저으면서 광방사 선에 노출시킨 광투광성 용기에 놓아두는데, 시간은 미생물을 충분히 불활화시킬 정도로 충분히 설정한다. 광투광성 용기는 가급적 투명 또는 반투명 플라스틱으로 이루어진 혈액 백이고, 교반수단은 가급적 진탕기 테이블이 된다. 감광제는 분말 또는 액제형으로 용기에 부가하고, 용기를 휘저어 감광제가 유체와 섞이게 하고, 미생물이 불활화되도록 모든 유체를 광방사선에 노출시킨다.
처리한 유체로부터 개별적으로 감광제를 광투과성 용기에 첨가하거나 또는 흘러 넣는다, 또는 용기에 유체를 넣기 전 감광제를 유체에 첨가한다. 한 구체예에서, 감광제는 항응고약에 첨가하고, 감광제와 항응고약의 혼합물은 유체에 첨가한다.
강화물질을 유체에 첨가하여, 과정을 더 효율적이고 선택적으로 만든다. 이런 강화물질에는 원하는 유체 성분에 대한 손상을 예방하거나 또는 미생물의 불활화 비율을 향상시키는 항산화약 또는 다른 물질이 포함이 포함되며, 그 예로 아데닌, 히스티딘, 시스테인, 티로신, 트립토판, 아스코르빈산염, N-아세틸-L-시스테인, 니코틴아마이드, 프로필 갈산염, 글루타티온, 멀캡토프로피온일글리신, 디티오트레오톨, 니코틴아마이드, BHT, BHA, 리신, 세린, 메티오닌, 글루코스, 만니톨, 트롤록스, 글리세롤, 이들의 혼합물을 들 수 있다.
본 발명은 또한 생리활성 단백질, 혈액 또는 혈액 구성성분으로 이루어지고, 내생성 감광제를 함유한 유체를 포함한다.
전체 혈액, 혈액 산물을 함유한 유체, 생리활성 단백질의 오염제거에 더하여, 본 방법은 물, 과일, 주스, 우유, 육즙, 수프와 같은 사람 또는 동물의 자양 분수단이 되는 유체를 비롯한 다른 유체의 처리에 유용하다. 이 방법은 또한 복막 또는 주사액의 처리에 유용하다.
본 발명에는 표면을 처리하여 여기에 존재하는 미생물을 불활화시키는 방법이 포함되는데, 이 방법은 표면에 내생성 감광제 또는 내생성-기초의 감광제 유도체의 비-독성 불활화-효과량을 바르고, 상기 표면을 충분히 광방사선에 노출시켜 감광제를 활성화시키는 단계로 이루어진다. 표면은 과일, 야채 또는 동물 시체와 같은 식품 표면, 절단된 또는 가공된 식품의 표면이 된다. 육고기와 같은 특정 물질은 감광제와 상기 물질을 혼합하고, 방사선조사하여 생표면을 광방사선에 노출시키면서 계속 혼합하여 처리한다.
표면은 판매대 또는 창고선반과 같은 식품 저장소 표면, 또는 부엌 싱크대, 목욕통, 온수욕조, 또는 수영풀장과 같은 목욕 또는 세척 용기의 표면이 될 수 있다. 또한, 표면은 살아있는 동물 또는 식물의 표면, 또는 상처표면이 된다.
감광제는 다른 치료 첨가제를 함유한 물이나 용액과 같은 적당한 담체로 첨가하는데, 이는 뿌리거나, 담그거나, 닦거나 또는 당분야에 공지된 다른 임의의 방법으로 행한다. 당업자는 과도한 실험없이 감광제의 양 및 처리에 필요한 감광제의 에너지를 쉽게 결정할 수 있는데, 이들은 오염의 정도와 처리할 물질에 따라 달라진다.
본 발명은 또한 전술한 것과 같이 유체 또는 다른 물질을 처리하여 여기에 존재하는 미생물을 불활화시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 유체 또는 다른 물질에 비-독성 불활화-효과량을 첨가하는 것으로 이루어진다. 꼭 필요한 것은 아니지만 가급적, 유체 또는 다른 물질은 방사선조사하여 미생물의 불활화를 강화한다. 어떤 경우에, 비타민 K5를 이용한 불활화는 이 글의 실시예에서 자세히 설명한 것과 같이 주변조도 또는 어둠속에서 발생한다. 적혈구 세포를 함유한 유체는 광방사선 단계없이 비타민 K5로 처리하는 것이 바람직하다. K5 화합물은 또한 혈액 또는 복막 투석 고무관 장치의 표면을 피막하여 멸균연결 및 멸균도킹을 확실하게 한다.
본 발명의 오염제거 장치에서, 광방사선원은 광채널 또는 섬유성 광도관과 같은 광가이드를 통해 유체용 광투과성 용기에 연결되는데, 여기서 광채널 또는 섬유성 광도관은 광방사선원과 유체용 용기사이의 광의 분산을 예방하고, 좀더 중요하게는 용기내 유체의 실제적인 가열을 예방한다. 광원에 직접 노출되면, 특히 광에 노출된 유체가 소량일 경우, 온도가 10 내지 15℃정도 상승하는데, 이런 경우 혈액성분이 변성될 수 있다. 광가이드를 사용하여 가열을 2℃ 미만으로 유지한다. 이 방법에서 또한 유체상의 목적 단백질이 손상되는 온도 이하로 온도를 유지해야 경우, 온도센서 및 냉각 메커니즘을 이용한다. 가급적 온도는 0℃ 내지 45℃사이로 유지하고, 좀더 적절하게는 4℃ 내지 37℃, 가장 적절하게는 22℃로 유지한다.
본 발명은 또한, 유체를 처리하여 여기에 존재하는 미생물을 불활화시키는 장치를 제공하는데, 이 장치는 다음과 같이 구성된다.
(a) 유체, 내생성 감광제 또는 내생성-기초 감광제 유도체를 담고있는 용기, 여기서 상기 용기는 입력수단을 장착하고, 유체가 충분한 광방사선량에 노출되어 감광제를 활성화시킬 수 있는 광투과성 표면을 가진다.
(b) 용기상의 유체에 충분한 광방사선을 제공하기 위한 하나 이상의 광방사선원, 이때, 상기 유체는 감광제가 활성화되고 이에 따라 미생물이 불활화되도록 하는 유형 및 양을 갖는다.
가시광선 방사선 또는 자외선 방사선 또는 둘 모두가 광방사선의 출처가 된다. 가급적 가시 및 자외방사선이 제공되고, 좀더 적절하게는 광방사선은 자외선 절반과 자외선 절반이 되는데, 다른 비율도 이용가능하다. 자외선과 가시광선 스펙트럼상의 광방사선은 동시에 또는 순차적으로 부가되는데, 가급적 가시영역이 먼저 부가된다. 광방사선원은 단순한 램프이거나, 또는 상이한 파장을 조사하는 다중램프로 구성된다. 광방사선원은 1 내지 120J/㎠를 전달할 수 있어야 한다. 자외선 및 가시광선의 혼합은 감광제가 7,8-디메틸-10-리비틸-이소알록사진과 같이 노출후 가시광선을 흡수하는 능력을 상실한 것일 경우에 특히 바람직하다.
감광제를 오염제거할 유체에 첨가하고 상기 유체를 당분야에 공지된 투과성 용기에 놓아두기 위한 임의의 수단을 사용하는데, 전형적으로 이런 수단에는 유출도관, 출구, 저장기, 밸브등이 포함된다. 가급적, 이 장치에는 오염제거할 유체로의 감광제 유출을 조절하여 농도가 전술한 것과 같이 효과수준으로 유지되도록 하기 위한 펌프 또는 조절밸브와 같은 수단이 포함된다. 한 구체예에서, 감광제는 항응고약 공급 재료와 혼합하고, 혈액 아프헤레시스 장치로 처리한다. 내생성 감광제 및 당(糖)부분을 가진 이의 유도체의 경우, 용액의 pH는 당분야에 공지된 바과 같이, 당(糖)부분의 이탈을 예방하기 위해 가급적 충분히 낮게 유지한다. 가급적 감광제는 선-혼합한 수용성 용액(예, 물 또는 저장 완충용액)에 녹여 오염제거할 유체에 첨가한다.
유출-통과장치를 위한 광투과성 용기는 다중탄산염, 유리, 석영, 폴리스틸렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리올레핀, 또는 다른 투명물질로 이루어진 투명 쿠벳이다. 쿠벳은 벽에 거울이 달린 방사실에서 밀봉한다. 제 2 광방사선원과 같은 광방사선 강화기 또는 반사표면을 쿠벳에 인접위치시켜 쿠벳상의 유체에 접촉하는 광방사선량을 증가시킨다. 이 장치에는 가급적 유체의 유속을 원하는 수준으로 조절하여 전술한 바와 같이 실제적인 오염제거를 위한 펌프가 포함된다. 쿠벳은 유체가 충분한 광방사선에 노출되어 실제적으로 오염제거될 수 있을 만큼의 길이를 가지는데, 이의 통과 유속과 조화시킨다.
또한 쿠벳은 가급적 광원과 충분한 거리를 두고 위치시켜 쿠벳상의 유체가 가열되지 않도록 하고, 광은 광가이드를 통해 광원으로부터 쿠벳으로 이동하도록 한다.
또 다른 구체예에서, 유체는 아프헤레시스 장치(미국 특허 5,653,887)를 이용해 혈액 백과 같은 광투과성 용기에 넣고, 광방사선에 노출시키면서 교반한다. 적절한 백에는 이 글에서 밝힌 것과 같은 수집 백이 포함된다. Cobe Laboratories, inc의 SpectraTM 장치 또는 TrimaTM 아프헤레시스 장치에서 사용한 수집 백이 특히 적당하다. 진탕기 테이블은 당분야에 공지된 것이다(미국 특허 4,880,788). 백은 유체를 첨가하기 위한 적어도 하나의 출입구가 장착되어 있다. 한 구체예에서, 감광제, 가급적 7,8-디메틸-10-리비틸-이소알록사진은 분말형태로 유체-충전백에 첨가한다. 상기 백은 이후 진탕기 테이블에 놓고, 실질적으로 모든 유체가 광방사선에 노출될 때까지 광방사선하에서 휘젓는다. 다른 방법으로, 백은 여기에 담겨진 분말 감광제로 미리 채운다. 오염제거할 유체는 이후 적절한 출입구를 통하여 첨가한다.
전술한 것과 같은 오염제거 장치는 독립형 유니트로 고안하여, 환자로부터 뽑거나 또는 투여할 혈액을 분리 또는 처리하기 위한 기존의 공지된 장치와 쉽게 통합할 수 있다. 가령, 이런 혈액-조절 장치에는 다른 제조업체의 아프헤레시스 장치를 비롯하여, Cobe Laboratories, Inc(Lakewood, CO)에서 구할 수 있는 COBE SpectraTM이나 TRIMA® 아프헤레시스 장치, 또는 Cobe Laboratories의 다른 장치(미국 특허 5,653,887, U.S. 연속 번호. 08/924,519(September 5, 1997)(PCT 공개 번호. WO 99/11305))가 포함된다. 오염제거 장치는 환자에게 혈액 산물을 주입하기 직전, 환자 또는 공여체로부터 혈액을 뽑아낸 지점의 바로 아래, 또는 혈액 구성성분의 분리 전후, 임의 지점에 삽입한다. 감광제는 적절한 구체예에서, 항응고약과 함께 혈액 성분에 첨가하고, 방사선원을 분리하고, 쿠벳은 혈소판, 혈장, 적혈구세포 수집지점으로부터 하류에 놓아둔다. 세 개의 개별 혈액 오염제거 장치를 사용하는 것이 단일 혈액 오염제거 장치를 아프헤레시스 장치의 혈액 분리 용기 하류에 배치하는 것보다 선호되는데, 그 이유는 개별 성분 라인에서 유속이 느릴수록, 방사가 훨씬 용이하기 때문이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 오염제거 장치를 이용하여 이전에 수집하고 저장한 혈액산물을 가공한다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 적혈구 세포가 처리할 유체에 존재하는 경우, 세포에 의한 광흡수를 보상하기 위하여 유체는 가늘게 하고, 더 오랜 기간동안 더 높은 에너지의 방사선에 노출시키고, 다른 혈액 성분을 사용할 경우에 필요한 것 보다 좀더 오랜 기간동안 휘젓거나 또는 더 얕은 용기에서 광방사선에 노출시킨다.
이 글에서 공개한 내생성 감광제 및 내생성-기초의 유도성 감광제는 이 글에서 공개한 오염제거 장치를 비롯하여, 기존의 혈액 성분 오염제거 장치에도 사용할 수 있다. 가령, 본 발명의 내생성 감광제 및 내생성-기초의 유도성 감광제는 미국 특허 5,290,221, 5,536,238, 5,290,221, 5,536,238에서 제시한 오염제거 장치에 사용할 수 있다.
전술한 것과 같은 내생성 감광제 및 내생성-기초의 유도성 감광제로 이루어진 혈소판 첨가용액 역시 이 글에서 제시한다. 당분야에 공지된 혈소판 첨가용액을 이런 목적을 위하여 사용할 수 있는데, 이런 용액은 미국 특허 5,908,742p; 5,482,828; 5,569,579; 5,236,716; 5,089,146; 5,459,030에 공개되어 있다. 이런 혈소판 첨가용액에는 생리식염수, 완충액, 가급적 인산나트륨, 염화마그네슘, 글루코산나트륨이 포함된다. 이런 용액의 pH는 가급적 7.0 내지 7.4가 된다. 이들 용액은 혈소판 농축물이 저장동안 세포성질 및 대사를 유지할 수 있도록 하는 담체로서 유용하다. 감광제는 이런 용액에서 1μM 내지 용액내 감광제의 용해성 농도사이의 임의의 농도로 존재하고, 적절하게는 10μM 내지 100μM , 좀더 적절하게는 10μM의 농도로 존재한다. 적절한 구체예에서, 혈소판 첨가용액은 아세트산나트륨, 염화나트륨, 글루코산나트륨, 1.5mM 염화마그네슘, 1 mM 인산나트륨, 14μM 7,8-디메틸-10-리비틸-이소알록사진으로 이루어지고, 가급적 6mM 아스코르빈산염으로 이루어진다.
도1은 리보플라빈 흡수스펙트럼을 나타낸 것이다.
도2는 광흡수도, 적혈구세포에 대한 예상 및 관찰 적혈구용적률, 혈소판에 대한 예상 적혈구용적률 사이의 상관관계를 나타낸 것이다.
도3은 항응고성 산 시트레이트 덱스토로오스(ACD) 용액에서 리보플라빈의 시간에 따른 광분해를 나타낸 것이다. 원으로 표시한 실선은 373nm에서 잔존하는 초기 리보플라빈의 %를 가리킨다. 네모로 표시한 점선은 447nM에서 잔존하는 초기 리보플라빈의 %를 가리킨다.
도4는 다양한 플라스틱 쿠벳의 전달외형을 파장의 함수로 나타낸 것이다. 실선은 3.2mm 아크릴 쿠벳을 묘사한 것이다. 점선(----)은 3.2 mm UV 아크릴 쿠벳을 묘사한 것이다. 띠줄(
Figure 112000005388637-pct00005
Figure 112000005388637-pct00006
)은 3.2 mm 폴리스틸렌(PS)쿠벳을 묘사한 것이고, 교차선은 3.2mm 다중탄산염(PC)쿠벳을 묘사한 것이다.
도5는 필요 광유량(mW/㎠), 즉 1 joule/㎠를 쿠벳상의 샘플에 전달하는데 필요한 유량을 유속의 함수로 나타낸 것이다.
도6은 본 발명의 광방사장치를 통합한 혈액 분리 기기를 나타낸 것이다.
도7은 본 발명의 오염제거 조립품을 나타낸 것이다.
도8은 비타민 K5를 감광제로 하여, 혈소판 제조물상의 박테리아 불활화를 방사에너지의 함수로 나타낸 것이다.
도9는 90% 혈소판과 10% 혈소판 첨가용액(90:10), 30%혈소판과 70% 첨가용액(30:70)을 사용하여, 박테리아의 불활화를 혈소판 제조물 및 방사에너지의 함수로 나타낸 것이다.
도10은 바이러스, 박테리오파아지, 박테리아의 불활화에 대한, 항산화약을 혈소판 농축물에 첨가할 때의 효과를 보여준다.
도11은 자외선 절반과 가시광선 절반을 사용하여, 단순 포진 II형 바이러스에 대한 불활화 곡선을 20J/㎠의 방사에너지에서 감광제의 농도함수로 보여준다.
도12는 다양한 농도의 감광제 및 방사에너지에서, 표피포도구균(S. epidermidis)의 불활화를 보여준다.
도 13은 다양한 농도의 감광제 및 방사에너지에서, φX174 파아지의 불활화를 보여준다.
도14는 자외선과 가시광선의 50:50 혼합광선을 이용하여, 다양한 방사에너지에서 황색포도구균(S. aureus) 및 φX174 파아지의 불활화를 보여준다.
도15는 자외선과 가시광선을 50:50 혼용한 다양한 방사에너지에서, 표피포도구군(S. epidermidis) 및 HSV-Ⅱ의 불활화를 보여준다.
도16은 휘젓고 다양한 수준으로 방사한 혈액 백에서 HSV2 바이러스의 불활화를 보여준다.
도17은 자외선광 단독 또는 자외선 및 가시광선의 50:50 혼합광선을 이용하여 다양한 유체상의 우두바이러스에 대한 불활화 결과를 비교한 것이다.
도18은 다양한 방사시간에서 우두바이러스의 감작약 유무하의 불활화 결과를 비교한 것이다.
도19는 5, 50μM의 감광제 및 다양한 방사에너지에서, 세포외 HIV-1의 불활화를 비교한 것이다.
도20은 5, 50μM의 감광제 및 다양한 방사에너지에서, 세포내 HIV-1의 불활화를 비교한 것이다.
도21은 P24 항원 수준을 이용하여, 5, 50μM의 감광제 및 다양한 방사에너지에서 세포외 HIV-1의 불활화를 비교한 것이다.
도22는 아스코르빈산염을 함유한 혈소판 첨가용액이 담긴 배지에서, 혈소판 농축물을 이용한 다양한 방사수준하의 HSV-Ⅱ 불활화를 보여준다.
도23은 처리할 유체 및 감광제를 함유한 혈액 백, 광원에서 나온 광방사선에 노출되면서 유체를 교반할 수 있는 진탕기 테이블을 이용한 본 발명의 구체예를 보여준다.
내생성 감광제 및 내생성-기초의 유도성 감광제를 이용한 본 발명의 오염제거 방법은 감광제로 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진을 이용하여 예시하였는데, 이외에도 감광제에 의해 활성화되어 미생물을 불활화시키는 임의의 감광제를 사용할 수도 있다. 감광제는 오염제거할 유체에서 유익한 성분을 파괴시키지 않고, 또한, 가급적 광방사 결과로, 유익한 성분을 상당히 파괴하거나 또는 상당한 독성을 유발하는 산물로 분해되지 않는 것이어야 한다. 감광제가 활성화되는 파장은 공지자료를 이용하거나 또는 직접 측정하여, 이 글에서 밝힌 바와 같이 결정한다. 오염제거할 유체, 또는 오염제거할 유체와 운반용 유체의 화합물에서, 감광제 용해도 역시 이렇게 결정한다. 오염제거할 유체를 투과하는 활성파장에서 광방사능력은 이 글에서 지시한 바와 같이 결정해야 한다. 감광제 및 이의 기질사이의 반응을 위한 적당한 온도를 결정하고, 또한 미생물 불활화를 최대한으로 하면서도 유체상의 유익한 단백질 또는 세포내 성분에 대한 손상을 최소화하는 온도의 범위, 광방사 강도, 지속시간을 결정한다. 실시예 1-7 및 도1-5에서, 본 발명의 유출-통과 오염제거 장치를 개발하는데 필요한 정보의 결정을 설명하였다.
유출-통과 장치에 대한 필요사항이 결정되면, 정확한 유속, 광투광성, 광강도를 제공하는 장치를 고안하여, 이 글에서 지시한 바와 같이, 유체상에 존재하는 미생물을 불활화시킨다. 오염제거할 유체는 감광제와 혼합하고, 이후 충분한 양의 광방사량으로 조사하여 유체내에서 미생물과 반응하는 감광제를 활성화시켜 유체상의 미생물이 불활화되도록 한다. 유체상의 미생물에 도달하는 광방사량은 적당한 광방사선원, 오염제거할 유체로부터 광방사선원까지의 적당한 거리(광가이드를 이용하여 광방사선을 직접 유체용 용기에 전달할 경우 증가한다), 유체용 용기를 위한 적당한 투과성물질, 광방사선이 용기로 완전히 침투하도록 하는 적당한 깊이, 하나 또는 복수의 부가적인 광방사선원(가급적 제 1 광방사선원 또는 방사선원에서 나온 광을 용기로 반사시키는 반사기로부터 용기의 반대쪽에 위치)과 같은 광방사선 강화기, 용기내 유체의 적당한 유속, 미생물의 불활화에 충분한 시간을 제공하는 용기의 길이를 선택하여 조절한다. 온도감지기와 조절기 역시 유체를 최적온도로 유지하기 위해 필요하다. 도6은 혈액 성분을 분리하기 위한 장치의 일부로서 본 발명의 오염제거 장치를 설명한 것이고, 도7은 적절한 오염제거 장치의 세부사항을 제공한 것이다.
일괄 장치의 경우, 오염제거할 유체를 감광제와 함께 백에 놓아두는 것이 유익한데, 여기서 백은 광투과성이거나 또는 적어도 충분한 방사선이 이들 내용물에 도달하여 감광제를 활성화시킬 수 있을 만큼 광을 투과시킨다. 충분한 감광제를 각 백에 첨가하여 불활화를 제공하는데, 가급적 감광제 농도는 적어도 10μM가 되게 하고, 백은 6 내지 36분동안 1 내지 120J/㎠로 방사하고 휘저어 실제적으로 모든 유체가 방사선에 노출되도록 한다. 가급적, 가시광선 및 자외선광은 동시에 혼용한다. 감광제는 분말형태로 첨가한다.
본 방법에서는 가급적 내생성 감광제를 사용하는데, 이의 예로 핵산복제를 방해하는 내생성 감광제를 들 수 있다. 본 발명에 사용할 수 있는 가장 적절한 감광제는 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진이다. 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진과 핵산사이에 일어나는 것으로 여겨지고 있는 화학작용은 일중항산소-의존성 과정(II형 기작)이 아닌, 직접적인 감작약-기질 상호작용(I형 기작)에 의해 진행된다. Cadet et al(J. Chem., 23:420-429, 1983)은 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진 효과가 구아노신 잔기의 비-일중항산소 산화에 기인함을 분명하게 입증하였다. 또한, 아데노신 염기는 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진 및 UV 광효과에 민감한 것으로 보인다. 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진은 UV광 노출직후, 다량의 일중항산소를 만드는 대신, 오히려, 들뜬 상태의 감작약 종류와의 전이반응을 통하여 기질(예, 핵산)과 직접 상호작용하여 효과를 발휘하는 것으로 보인다. 세포 및 단백질에 대한 무차별적 손상은 주로 일중항산소로부터 발생하기 때문에, 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진의 작용을 위한 기작 경로는 II형 화학반응을 상당히 보유한 프소랄렌과 같은 화합물의 경로보다 작용선택성이 더욱 뛰어나게 된다.
도6은 본 발명의 광방사선 장치를 통합한 혈액 기계 장치 및 아프헤레시스 장치를 보여준다. 백혈구를 공여체/환자4로부터 뽑아 아프헤레시스 장치 또는 혈액성분 분리장치8에 제공하는데, 여기서 혈액은 다양한 성분유형으로 분리되고, 이들 혈액성분유형중의 적어도 하나는 장치8로부터 옮겨진다. 이들 혈액성분은 이후 다른 사람이 사용하도록 제공하거나, 또는 치료상의 처리를 하여 공여체/환자4에게 환원한다.
혈액성분분리장치8에서, 혈액은 공여체/환자4로부터 뽑아 체외 고무관 회로10 및 혈액-가공 용기12를 통하여 주사하여, 완전히 밀폐된 멸균 장치를 명확히 하였다. 혈액 성분 분리 장치8은 펌프에 연결한다(보이지 않음). 혈액은 체외 고무관 회로10을 통하여 공여체/환자4로부터 회전하는 혈액가공용기12로 흘러 들어간다. 혈액가공용기12내 혈액은 다양한 혈액성분으로 분리되고, 이들 성분유형(혈소판, 혈장, 적혈구세포)은 혈액가공용기로부터 지속적으로 옮겨진다. 수집 또는 치료처리를 위해 계속해서 유지되지 않는 혈액성분은 혈액가공용기12로부터 옮겨 체외 고무관 회로10을 통하여 공여체/환자4에 환원시킨다.
혈액성분분리장치의 작동은 여기에 포함된 하나 또는 복수의 컴퓨터 프로세서로 조절한다.
체외 고무관 회로10은 캐세트 조립체14 및 이것과 상호연결된 다수의 고무관 조립체 20, 50, 60, 80, 90, 100으로 이루어진다. 혈액 이동/환원 고무관 조립체20은 공여체/환자4와 캐세트 조립체14사이에 단일 바늘 접점을 제공하고, 혈액 입구/혈액 성분 고무관 소조립체60은 캐세트 조립체14와 혈액가공용기12사이에 접점을 제공한다. 항응고약 고무관 조립체50, 혈소판 수집 고무관 조립체80, 혈장 수집 고무관 조립체90, 적혈구세포 수집 고무관 조립체70, 배출 백 고무관 소조립체100 역시 캐세트 조립체 14와 상호연결된다.
혈액 이동/환원 고무관 조립체20에는 이것과 상호연결된 바늘 소조립체30과 항응고약 고무관 26이 포함되는데, 이것은(26) 캐세트 조립체 14를 통하여 항응고약 고무관 조립체50와 연결된다.
캐세트 조립체14에는 전후로 주형된 플라스틱 판이 포함되는데, 이들 판들은 통합유체경로를 갖는 직각 캐세트 구성원을 한정하기 위하여 함께 고온용접된다. 캐세트 조립체 14에는 다양한 통합경로를 상호연결하는 다수의 외향 돌출 고무관 루프가 추가로 포함된다. 통합경로는 또한 다양한 고무관 조립체와 상호연결된다. 특히, 캐세트 조립체14는 혈액 이동/환원 고무관 조립체20의 항응고약 고무관26, 항응고약 고무관 조립체50과 상호연결된다. 항응고약 고무관 조립체50에는 항응고약 및 감광제원53, 멸균필터 56에 연결되는 스파이크 방울 체임버52가 포함되는데, 이것은 항응고약 및 감광제원53, 멸균필터56과 연결된다. 사용하는 동안, 항응고약 고무관 조립체50은 감광제와 혼합된 항응고약을 공여체/환자4로부터 뽑아낸 혈액에 공급하여, 체외 고무관 회로10내에서 임의의 응고를 줄이거나 예방한다. 많은 항응고약이 당분야에 알려져 있는데(Chapter 3, AABB Technical Manual, 11th edition, 1993), 그 예로 ACD-A, CPD, CP2D, CPDA-1, 헤파린을 들 수 있다. 세포저장용액인 AS-1, AS-3, AS-5를 비롯하여, 상기 물질은 이 글에서 밝힌 모두 내생성 감광제 및 내생성-기초의 유도성 감광제와 상보적이다.
캐세트 조립체14에는 또한 혈액 이동/환원 고무관 조립체20의 혈액 이동 고무관과의 상호연결부분이 포함된다. 혈액은 압력센서를 통과하고, 캐세트 조립체14에서 입구필터를 지나 이후 혈액 입구 고무관62로 이동한다. 혈액 입구 고무관62는 또한 혈액가공용기12와 상호연결되어 이곳에 가공을 위한 전체 혈액을 제공한다.
분리된 혈액성분을 캐세트 조립체14로 환원시키기 위하여, 혈액 입구/혈액성분 고무관 조립체60은 추가로 적혈구세포(RBC)/혈장출구고무관, 혈소판출구고무관, 혈장출구고무관이 포함되는데, 이들은 혈액가공용기12에서 상응하는 출구와 상호연결된다. 적혈구세포(RBC)/혈장출구고무관은 캐세트 조립체14를 통하여 분리된 적혈구세포(RBC)/혈장성분을 적혈구세포 수집고무관 조립체70으로 전달하고, 이후 일차 오염제거 장치72에 통과시킨다. 혈소판 출구 고무관은 캐세트 조립체14를 통하여 분리된 혈소판을 혈소판 수집 고무관 조립체80으로 전달하고, 이후 이차 오염제거 장치82에 통과시킨다. 혈장출구고무관은 캐세트 조립체14를 통하여 분리된 혈장을 혈장수집고무관 조립체90으로 전달하고, 이후 삼차 오염제거 장치에 통과시킨다. 감광제를 활성화시키고, 존재하는 미생물을 불활화시키기 위한 오염제거 장치 72, 82, 92에서 방사후, 혈액 성분은 적혈구세포 수집 백 74, 혈소판 수집 백 84, 혈장수집 백94에서 수거한다. 통풍 백104는 장치내 가스의 환기에 사용한다.
도7은 본 발명의 독립형 오염제거 조립체를 나타낸다. 혈액산물180(최근에 수거된 혈액, 혈액성분 또는 저장혈액)은 혈액산물라인186에 연결되는데, 이 라인은 펌프184를 통하여 오염제거 쿠벳164로 연결된다. 감광제 보관기166은 투입펌프170이 장착된 감광제 투입라인168로 연결되고, 오염제거 쿠벳164로부터 상류의 혈액산물라인186에 이른다. 오염제거 쿠벳164는 오염제거를 위해 선택된 깊이(d) 및 길이(l)의 광투과성 쿠벳이다. 온도모니터192와 합쳐진 냉각장치190은 유체의 온도를 조절을 위해 오염제거 쿠벳164와 연결된다. 오염제거 쿠벳164는 광가이드162를 통하여 광방사선원160에 연결된다. 광방사선 강화기163은 쿠벳상의 혈액산물에 도달하는 광방사선의 양을 증가시키기 위하여 오염제거 쿠벳164에 인접하여 위치한다. 오염제거된 혈액산물라인188은 오염제거 쿠벳164로부터 오염제거된 혈액산물수집기182에 이른다.
작동중에, 혈액산물180은 혈액산물라인186으로 이동시키는데, 여기서 이것은 감광제 보관기166에 나온 감광제와 합쳐지고, 이때 감광제는 감광제 투입라인68상에서 감광제 투입펌프170에 의해 조절되는 유속으로 흘러가고, 감광제 투입라인68상에서 혈액산물라인186과 합쳐진다. 혈액산물라인186에서 유속은 펌프184로 조절하여, 오염제거 쿠벳164에서 확실하게 오염을 제거한다. 온도감시기 192는 쿠벳164에서 유체온도를 측정하고, 냉각 장치190을 조절하여 쿠벳상의 온도를 최적작동에 필요한 범위내로 유지시킨다. 오염제거 쿠벳164상의 혈액산물은 광방사선원160으로부터 광가이드162로 안내한 광방사선으로 방사한다. 광방사선원은 두 개 또는 더 많은 실제광으로 이루어진다. 화살표는 광가이드162의 말단에서 나온 광방사선을 가리키는데, 이들 광방사선은 투명한 오염제거 쿠벳164내부의 혈액산물사이로 퍼져나간다. 오염제거 쿠벳164에 인접하여 광방사선 강화기163이 존재하는데, 이것은 광방사선의 추가원 또는 반사표면이 된다. 광방사선 강화기163으로부터 오염제거 쿠벳164를 향하는 화살표는 광방사선 강화기163으로부터 나온 광방사선을 가리키는데, 이들 광방사선은 쿠벳164상의 혈액산물물질에서 빛을 낸다. 오염제거된 혈액 산물은 오염제거된 혈액산물라인188을 통하여 오염제거 쿠벳164를 빠져나가고, 오염제거된 혈액산물 수집기 182에서 수거한다.
7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진(Sigma Chemical Company)을 감광제로 이용한 한 구체예에서, 광섬유로 이루어진 광가이드(EFOS Corporation, Williamsvi lle, N.Y.)를 사용한다. 이 장치는 355-380㎚ 영역에서, 6,200 mW/㎠ 강도로 집중된 광선을 전달할 수 있다. 400-500㎚의 스펙트럼영역에서, 4,700mW/㎠ 출력을 성취하기 위해 이 장치와 함께 상호변환필터를 사용하는 것도 가능하다. 두 경우에서, 320㎚이하 영역상의 광출력은 무시한다. 다양한 치수(3,5,8㎜)의 광가이드를 본 장치에 사용할 수 있다. 광은 21도로 퍼지면서 광가이드 끝을 빠져나간다. 8mm 광가이드를 적절하고 정확하게 위치시켜 오염제거 쿠벳의 표면을 비추도록 하는데, 여기서 상기 쿠벳은 Cobe Spectra®일회용 세트(Industrial Plastics, Inc., Forest Grove, OR.)에 사용하는 표준쿠벳이다.
유속은 변화가능한데, 샘플에 전달할 광에너지양으로 이를 결정한다. 유속 은 연동펌프(Cole-Parmer Instrument Company, Vernon Hills, IL.)로 조절한다. 유속 및 투입 유(流)의 유형은 당분야에 공지된 컴퓨터 프로세서를 통하여 조절한다.
도23은 오염제거할 유체가 입구282를 장착한 혈액 백284에서 위치한 본 발명의 한 구체예를 설명한 것으로, 입구282를 통과한 분말형태의 감광제284는 혼합관288을 통하여 플라스크286으로부터 첨가된다. 진탕기 테이블280을 작동시켜 백284를 휘젓고, 감광제290을 분해하고, 동시에 광방사선원260은 활성화시켜 백284상의 유체 및 감광제를 방사한다. 다른 방법으로, 백은 감광제를 함유하도록 사전에 포장하고, 유체는 이후 백에 첨가한다.
본 발명의 방법에는 "소거물질(quencher)" 또는 산소 소거제와 같은 강화물질을 사용할 필요는 없지만, 이들 강화물질은 비-특이적 세포 또는 단백질-손상 화학반응의 정도를 감소시키거나 또는 병원체 불활화의 비율을 증가시켜 공정을 촉진하기 위하여 사용할 수도 있다. 비-독성 내생성 감광제 및 내생성-기초의 유도성 감광제를 이용한 좀더 적절한 방법에서는 광방사후 유체로부터 감광제를 제거할 필요가 없다. 실험결과에서, 다른 혈액 성분에 거의 손상을 주지 않는 것을 알 수 있다, 예를 들면 혈소판은 처리한지 5일후에도 생리활성을 유지했다.
실시예1. 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진의 흡수외형
7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진(98% 순도) 샘플은 Sigma Chemical Company로부터 입수하였다. 이 샘플의 일부를 스캐닝 UV 분광광도계를 이용하여 분석하였다. 200 내지 900㎚의 영역에 걸쳐서 조사하였다. 분석을 위해, 샘플은 증류수에 녹였다. 이번 분석에서 나타난 샘플의 스펙트럼은 도1에서 알 수 있다.
7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진에 대한 최대 흡수도 및 소멸계수 결과는 기존의 문헌에서 알려진 것과 일치하였다.
Literature λmax(ε) Measure λmax(ε)
267(32,359) 222(30,965)
265(33,159)
373(10,471) 373(10,568)
447(12,303) 445(12,466)
조사를 위한 적당한 파장은 373 및 445nm이다. 이들 최대 흡수도에서 측정한 소멸계수는 용액에서 감작약을 적당히 활성화시킬 만큼 충분하다.
실시예2. 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진의 용해도
이솔리트 S, pH 7.4 배지 상의 용해도
이솔리트 S 배지 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진의 최대용해도는 다음과 같이 결정하였다.
7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진은 이솔리트 S와 혼합하여 침전물이 생기게 한다. 혼합물은 실온에서 한 시간동안 휘젓고, 혼합교반하여 현탁물질을 완전히 분해시킨다. 추가적으로 교반혼합하여도 고형현탁액이 계속 남아있을 때까지 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진를 추가로 첨가한다. 이 현탁액은 이후 원심분리하여 녹지않은 물질을 제거한다. 이 제조물로부터 얻은 상청액을 옮기고, 분광 광도계를 이용하여 분석한다. 용액의 흡수치는 443nm 및 373nm에서 결정한다. 앞서 결정한 소멸계수로부터, 포화용액의 농도를 추정할 수 있다.
농도(373) = 110μM = 42㎍/mL
농도(447) = 109μM = 40.9㎍/mL
ACD-A 항응고약상의 용해도
ACD-A 항응고약을 이용하여, 전술한 것과 동일한 과정을 반복하였다. 이들 측정에서 얻은 수치는 다음과 같다;
농도(373) = 166μM = 63㎍/mL
농도(447) = 160μM = 60.3㎍/mL
이들 조사에서 얻은 수치에서 화합물의 예상용해도의 최대치를 알 수 있다.
실시예3. 수용성배지에서 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진의 광분해
Sigma ACD-A를 용매로한 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진용액은 63㎍/mL의 농도로 제조한다. 이 제조물은 유리피펫으로 흡입하고, UV광원(320㎚아래의 광을 제거하는 필터와 함께, 365㎚λmax)의 경로에 놓아둔다. 현탁액은 일정 시간 간격동안 조사하는데, 이때 일부용액을 분광현미경분석을 위해 이동시킨다. 분해된 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진용액의 흡수도는 각 시간 간격마다 373nm 및 447nm로 감시한다. 결과는 도3 및 표1에서 제시하였다.
표1. 산성용액에서 UV광 노출직후 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진용액의 광분해
방사시간 초기%, 373㎚ 초기%, 447㎚
0 100 100
5 87.3 61.6
10 90.5 76.6
15 100 70
373nm에서 용액에 대한 흡수외형으로부터 전체 조사기간동안 반응물이 그다지 분해되지 않음을 알 수 있다. 이 파장에서 광흡수도는 n-π*전자전이에 해당한다. 전체시간동안 최고강도가 감소되지 않았다는 것은, 이들 조건하에서 조사가 연장되어도 분자의 링구조에는 아무런 손상이 없다는 것을 의미한다. 447㎚에서 분자의 흡수도는 π-π*전자전이에 기인한다. 조사증가와 함께, 이 파장에서 분자의 흡수도 감소는 분자의 공명구조에 미묘한 변화가 있었음을 암시한다. 이런 변화는 주로 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진 골격구조에서 리보즈의 상실 및 이로 인한 7,8-디메틸알록사진의 형성에 기인한다. 이들 변화는 UV광 조사 직후 분자의 행동에 대한 기존 문헌의 자료와 일치한다.
이 분자의 링구조 분해의 결여는 유사한 조건하의 프소랄렌에 기초한 화합물에서 관찰한 결과와 극명한 대조를 이룬다. 조사동안, 용액내 분자에서 상당한 형광을 발견했다. 분자의 이런 행동은 링구조의 공명특징과 일치하고, 들뜬 상태의 분자내 에너지를 비-파괴적 형태로 소멸시킬 수 있는 방법을 제공한다.
실시예4. 유출 장치 개념 평가
기존 스펙트럼 쿠벳의 광전송 특성
기존의 스펙트럼 쿠벳은 다중탄산염으로 이루어진다. 이런 쿠벳의 광전송 특성은 쿠벳을 UV 분광광도계의 광경로에 위치시켜 373 내지 447㎚로 측정한다. 결과는 다음과 같다:
Wavelength of Light % Transmittance
363㎚ 66%
447㎚ 80%
이들 결과는 다중탄산염 플라스틱(도4)에 대해 기존 문헌에서 밝힌 내용과 일치한다. 참고수치는 300㎚영역에서 다중탄산염을 통한 광의 전송이 급격히 증가함을 보여준다. 350㎚이상 영역의 경우, 광전송 특성은 이번 출원에 적당하다.
유속의 함수로 계산한 광 필요유량
사용가능한 유출장치를 만들기 위해, 광경로상에 존재하는 동안 적당한 광유량을 샘플에 제공해야 한다. 제안한 스펙트럼 쿠벳이 이런 목적을 충족시킨다면, 광 필요유량은 다음과 같이 쿠벳을 통과하는 유속의 함수로 추정할 수 있다: 쿠벳의 조사부분에 존재하는 용액의 부피는 ca.0.375mls이다. 쿠벳의 이 부분상의 세포에 대한 전송시간은 다음과 같은 방정식으로 결정할 수 있다:
Figure 112000005388637-pct00007
100mls/min에서, 전송시간(T)은 0.00375분 = 0.0225초가 된다.
샘플이 노출되는 에너지는 다음의 방정식에 따른 유량으로 결정한다.
Energy(EmJoules/㎠)=
Figure 112000005388637-pct00008
감작약을 적절히 활성화시키는데 1 Joule/㎠이 필요하고, 전송시간(T)은 0.22초라고 가정하는 경우, 쿠벳을 통한 샘플전송동안 필요한 유량은 4,545mW/㎠가 된다. 광원으로부터 필요한 유량과 쿠벳을 통과할 때의 유속의 상관관계를 보여주는 그래프를 도5에 제시하였다.
이들 결과에서, 유출장치가 적절하게 작동하려면, Watts/㎠의 영역에서 배출되는 UV원이 필요함을 알 수 있다.
도2는 흡수도가 혈소판 농도에 따라 어떻게 변화는 지를 보여준다.
실시예5. 적혈구세포의 흡수도
UV광이 적혈구세포를 투과하는 정도, 그리고 샘플 두께 및 적혈구용적률의 광투과에 대한 효과를 평가하기 위하여, 광량측정법(흡수된 광이 화학반응을 유발하는 능력 및 정도를 측정하여 광원으로부터 발산되는 광강도의 실제량을 측정하는 방법)을 이용하여, 몇 가지 예비 실험을 행하였다. 이들 연구의 경우, 페리옥살레이트 용액을 이용하여 물에서 관찰한 광강도와 비교하여 광강도를 측정하였다. 샘플제조에 사용한 화합반응 및 방법에 대한 세부사항은 Gordon, A.J. and Ford, R.A. (1972), "The Chemist's Companion: A Handbook of Practical Data, Techniques and References"(John Wily & Sons), pp. 362-368에서 지시한 것과 동일하다.
옥살산화 철(Ⅲ) 샘플은 0.15M 농도로 실험재료(다양한 적혈구용적률에서 물 또는 혈액산물)에서 제조한다. 이들 샘플은 이후 표준 스펙트럼 쿠벳에 싣고, 조사조립체에 위치시킨다. 샘플은 원하는 에너지량 수준(1J/㎠)에 따라 사전 결정한 시간 간격동안 노출시킨다. 샘플은 이후 이동시키고, 1,10-페난트롤린 용액에 녹 인 실험물질의 510㎚ 흡수도를 판독하여 Fe3+ ⇒ Fe2+변환량을 결정한다(Gordon, A.J. and Ford, R.A.,). 흡수도 수치가 더 높을수록 샘플에 더 많은 광이 투과되었다는 것을 의미한다. 1 J/㎠ UV방사선에 노출시킨후 물에서 관찰한 흡수도를 100% 전송수준으로 한다. 적혈구세포샘플에 대한 모든 수치는 이 기준과 비교하여 결정한다.
표2. 샘플을 1 J/㎠ UVA광에 노출시킨 후 흡수도 판독결과.
모든 평균 수치는 6번 실험의 중간값을 의미한다. % 전송수치는 물 샘플과 비교하여 계산한다.
510㎚에서의흡수도 평균 표준이탈 전달% 표준이탈
물 2.40 0.04 100 0.0
RBC, 1.3% 적혈구 용적률 2.40 0.10 99.5 4.8
RBC, 3.7% 적혈구 용적률 1.46 0.38 60.6 15.4
RBC, 5.07% 적혈구 용적률 0.20 0.26 8.3 10.8
RBC, 6.0% 적혈구 용적률 0.13 0.09 5.2 3.9
RBC, 10.2% 적혈구 용적률 0.23 0.19 9.7 7.9
RBC, 16.3% 적혈구 용적률 0.25 0.11 10.4 4.6
RBC, 21.8% 적혈구 용적률 0.09 0.06 3.6 2.6
RBC, 80.2% 적혈구 용적률 0.01 0.11 0.3 4.4
이들 수치를 이용하여, UV 광의 투과깊이를 계산할 수 있다(Beer's Law(A = ∈ b C)).
램버트 법칙(Lambert's Law)에서,
흡수도(Absorbance) = Log(1/전송(Transmittance))
농도(C)가 샘플의 적혈구용적률과 동일하다고 할 경우, b=0.3㎝(스펙트럼 쿠벳의 경로길이)이므로, 적혈구샘플에 대한 흡수도와 적혈구용적률 X 경로길이의 산물을 그래프로 계산하여 샘플에 대한 가짜-소멸계수(∈')를 결정할 수 있다. 샘플에 대한 소멸계수는 이 선의 기울기에 해당한다
표3: 적혈구세포 샘플에 대한 소멸계수의 결정
T B HCT B*HCT 흡수도 log(1/T) ∈
0.995 0.3 1.3 0.39 0.002 .0051
0.606 0.3 3.7 1.11 0.218 .196
0.0525 0.3 6 1.8 1.280 .71
0.097 0.3 10.2 3.06 1.013 .33
0.104 0.3 16.3 4.89 0.983 .20
0.036 0.3 21.8 6.54 1.444 .22
0.0033 0.3 80.2 24.06 2.481 .10
전술한 것과 같이 얻은 수치를 이용하여, 이들 샘플에 대하여 결정한 가짜-소멸계수는 0.08661이다.
소멸계수에 대한 수치를 이용할 경우, 적혈구세포샘플로의 UV광의 투과거리는 샘플 적혈구용적률 함수로 계산할 수 있다. 이들 계산에서, 입사광의 90%가 흡수되는 샘플의 투과 깊이는 다음과 같은 방정식을 이용하여 결정한다:
A = ∈ b C
A = 1(입사광의 90% 흡수도), ∈=0.08661, C=샘플 적혈구용적률, b=경로길이.
광량측정법을 이용하여 결정한 수치를 이전에 적혈구 및 혈소판샘플상의 광흡수도의 UV 분광광도측정에서 얻은 측정치를 이용하여 계산한 수치와 비교하였다.
도2는 적혈구세포에서 흡수도 및 광원으로부터의 거리가 관찰수치의 예상치와 비교하여 얼마나 변할 수 있는지를 보여준다. 이들 결과에서, 80%영역내 적혈 구 용적률의 샘플의 경우, 본 발명의 유용한 구성을 이용하여 샘플의 0.14cm깊이까지 광을 넣을 수 있다. 이것은 유출 경로넓이가 현재 스펙트럼 쿠벳 넓이의 절반이하가 된다는 것을 의미한다.
실시예6. 시험관내 혈소판 한정요소에 대한 바이러스 불활화 처리의 효과
시험관내 혈소판 한정요소에 대한 바이러스 불활화 처리의 효과를 평가하였다. 혈소판 제조물은 UV광과 함께, 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진으로 처리하였다. 다양한 시험관내 한정요소를 혈소판 기능의 감지기로 이용하여 처리환경에 의해 유도된 변화정도를 결정하였다. 처리후 혈소판 성질에 대한 UV광 노출의 에너지 수준, 사용한 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진의 효과량, 샘플가공환경과 같은 인자의 효과를 검사하였다. 이 연구에서 얻은 결과를 이용하여, 혈소판 기능의 약화없이 HIV-1의 불활화를 위한 적당한 처리실행기간을 확정할 수 있다.
샘플은 상이한 세 가지 농도의 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진으로 준비한다. 표준 스펙트럼 LRS 수집기에 수거한 혈소판을 이들 연구에 사용한다.
시작 샘플은 원심분리하여 혈소판 결정소구로 농축시킨다. 결정소구는 70:30 (이솔리트 S, pH 7.4; McGaw, Inc. 배지:혈장)용액에서 재현탁한다. 특정농도의 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진은 혈장:배지 혼합물상에 존재한다. 혈소판 현탁액은 이후 세 가지 특정유속 중 한 유속으로 UV 방사실을 통과한다. 유속은 방사실을 통과하는 세포/배지 혼합물에 대한 노출에너지수준과 직접 관계한다. 방사실을 통과한 후, 샘플은 앞으로의 분석을 위해 구연산 가소성 시료채취백에 저장한다.
방사후, 저혈압성 충격반응(HSR), GMP-140 발현, pH, pCO2, pO2, 혈소판 소용돌이, 세포계수를 비롯하여, 혈소판 기능의 시험관내 수치를 평가하여 세포 성질에 대한 처리프로토콜의 효과를 결정한다.
혈소판 성질은 조사 환경(감작약 농도 및 유속/에너지 수준)의 함수로 관찰한다. 혈소판 성질에는 HSR 반응, GMP-140 활성화등과 같은 한정요소가 포함된다. 조사한 유속은 다음과 같이 노출에너지와 관계한다.
전달시간(T, sec) = 노출 시간 =
Figure 112000005388637-pct00009
Fr=유속(mls/min)
0.375mls = 쿠벳 부피(mls)
∴ T(sec) =
Figure 112000005388637-pct00010
에너지(Joules/㎠) =
Figure 112000005388637-pct00011
E =
Figure 112000005388637-pct00012
처리한 혈소판에 대한 UV 노출에너지 및 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진 농도의 효과를 평가하였다. 세 가지 에너지 수준 및 세 가지 농도수준은 다음과 같이 평가하였다.
에너지 수준: 1,5,9 J/㎠
7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진
농도: 1, 50 100 μM
* 전체 에너지 노출수준은 표4의 전환 도표에 따라서 방사실을 통과하는 현탁액의 유속으로 결정하였다.
** 배지는 70:30(배지:혈장)으로 희석하기 때문에, 혈장과 혼합하기 전에 배지상의 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진의 보존농도를 적절히 조정한다. 이것은 이솔리트 S상에서 1.43, 71.4, 143μM의 초기농도를 필요로 한다.
표4. 방사실을 통과하는 유속의 함수로서의 에너지 노출수준
전달된 에너지(J/㎡) 유속(mls/min) 20mls를 처리하기 위한 시간(minutes)
1 16.90 1.18
2 8.45 2.37
3 5.83 3.55
4 4.22 4.73
5 3.38 5.92
6 2.82 7.10
7 2.41 8.29
8 2.11 9.47
9 1.88 10.65
10 1.69 11.84
유량 = 3640mW/㎠; 체임버 부피 = 0.117mls.
처리한 샘플에 대한 수치를 컨트롤 그룹과 비교하였다. 컨트롤 샘플에는 다음이 포함된다:
혈장상의 처리하지 않은 샘플(조직 컨트롤)
+유출-UV-7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진
과정
정상적인 공여 혈소판 아프헤레시스 산물은 AABB 공인된 혈액저장시설에서 얻는다. 샘플은 표준 스펙트럼 LRS 과정을 이용하여 수거한다. 후술한 모든 처리 및 과정은 표준 실험실 안전과정 및 방법으로 실시한다. 단위개체수와 혈액형은 기록한다. 모든 샘플은 수거 24시간 이내에 사용한다. 모든 샘플 이동 및 공정단계이후 방부처리를 한다.
샘플은 500 mls PVC 이동 팩으로 옮겨 500 x g에서 5분동안 원심분리하여 혈소판을 뭉치게 한다. 이후 혈장은 표준 혈장압착을 이용하여 혈소판 결정소구로부터 옮긴다. 혈장은 추가사용을 위하여 계속 보관한다. 세포 결정소구로부터 옮긴 혈장은 이후 이솔리트 S(pH 7.4; McGaw, Inc)의 보존용액과 혼합한다. 배지의 보존용액은 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진의 사전 결정량을 이솔리트 S에 첨가하여 최종농도가 1.43, 71.4, 143μM이 되게 만든다. 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진를 첨가한후, 보존용액은 0.22μM멸균필터에 통과시켜 여과한다. 보존용액은 이후 70:30(v:v) 비율로 자가조직 혈장과 혼합하여 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진의 최종농도가 각각 1, 50, 100μM가 되게 한다. 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진 보존 용액의 제조동안, 광에 노출되지 않도록 주의한다. 샘플은 다음과 같이 만든다.
1 μM 2 샘플
100μM 2 샘플
50μM 1 샘플
이후 혈소판 결정소구는 혈장:배지 혼합물상에서 원부피의 초기샘플에 현탁시킨다. 샘플은 유출장치에 연결되는데, 이 장치는 세포 및 감광제를 위한 용기, 배지를 위한 용기로 구성되고, 상기 용기들은 밸브가 달린 라인을 통하여, 혼합된 세포/감광제를 위한 단일라인 및 펌프가 장착된 배지에 연결된다. 혼합된 세포/감 광제 및 배지는 거울이 달린 벽을 갖는 용기내에 위치한 쿠벳으로 흘러들어가고, 광원에 의해 조사된다. 이 방사실은 온도프로브가 달려있다. 쿠벳을 통과한후, 유체는 산물 백에서 수거한다.
이 고무관 세트는 이솔리트 S 배지로 기폭한다. 실험 샘플 유출시작 5분전에, 광원을 활성화시킨다. 온도는 이 시간간격동안 감시하여, 조사실에서 32℃미만으로 유지한다.
방사실을 통과하는 샘플의 유속은 표4의 도표로 결정한다. 1, 5, 9 J/㎠의 전체방사에너지 수준을 제공하는 유속은 다음의 실험 모형에 따라 사용한다.
샘플 유출 #1: 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진 농도 = 1μM
A. +7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진+1 J/㎠
B. +7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진+9 J/㎠
샘플 유출 #2: 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진 = 100μM
A. +7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진+1 J/㎠
B. +7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진+9 J/㎠
샘플 유출 #3: 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진 = 50μM
A. +7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진+5 J/㎠
샘플 유출 #4: 컨트롤 샘플, 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진 = 0μM
A. +유출-UV-7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진
모든 샘플은 처리환경(즉 1A)에 따른 유출회수와 샘플 문자지정으로 확인한다. 각 샘플 세트는 전체 2번 반복하여 유출시킨다. 샘플을 처리하는 순서는 임 의의 수 발생기에 따라서 결정한다.
20ml/유출환경의 샘플 부피를 각 샘플에서 수거한다. 이들 샘플은 구연산 가소성 시료채취 백(53 ml 전체 부피)으로 모으고, 분석을 위해 저장한다. 샘플 및 조사실의 온도는 각 유출의 초기, 중기, 말기에 기록한다.
각 조제물로부터 초기 일부분은 처리후 분석을 위해 옮겨둔다. 분석을 위한 한정요소에는 세포계수, pH, pCO2, pO2, 혈소판 소용돌이, HSR, GMP-140분석이 포함된다. 샘플의 남아있는 부분은 +22 배양기내 양끝 혈소판 교반기에 놓고, 처리후 5일동안 저장한다. 5일째, 두 번째 일부분을 옮겨 동일한 시험관내 한정요소에 대해 분석한다.
다음과 같은 장치를 사용한다: Nikon Labophot microscope; Serono-Baker System 9000 Hematology Analyzer; analytical balance; platelet incubator(+22 Celsius) and rotator; laoratory refrigerator(+4 Celsius); Mistral 3000i Centrifuge; Corning Blood Gas Analyzer; Becton-Dickinson FACSCALIBUR Flow Cytometer; UV irradiation chamber; UV radiometer(UVX Radiometer, UVP, Inc.); EFOS Ultracure 100SS Plus(365㎚ 최대 출력 및 340nm 대역 여과기); 온도프로브(열전대).
노출에너지 및 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진의 농도의 제한된 조건에서, 각 세트의 실험변수에 대한 결과를 비교하였다. 처리하지 않은 샘플과 직접 비교하고, 유의성 차이는 연속된 일방 스튜던트 T-실험분석으로부터 확률 p>0.05 로 정의하였다.
이들 실험결과를 요약하면 다음과 같다.
1. 10μM 이상의 감작약 농도 및 1.5E+06/μL이상의 혈소판 농도에서, 2일째 샘플 pH가 감소한다. 2일 이상 저장하면 pH가 서서히 감소하는데, 3일째는 사용할 수 없는 수준(<6.5)에 도달한다. 모든 다른 시험관내 한정요소는 샘플 pH에서 관찰한 패턴을 따른다.
2. 샘플 pH의 감소는 샘플의 UV광 노출여부에 상관없이 발생한다.
3. 5.4E+05μL의 혈소판 농도에서, 연장된 저장기간후 최대 100μM에 이르는 임의의 감작약 농도에서 샘플 pH의 감소는 없다.
4. 최대 10μM 감작약 농도, 1.5E+06/μL이상의 혈소판 농도, 최대 10 J/㎠ UVA 수준에서, 측정한 혈소판 성질은 처리하지 않은 컨트롤 세포와 유사하다. 이들은 처리후 5일 이상의 저장기간동안 컨트롤 수준과 거의 동일했다.
처리후 혈소판 기능에 대한 이들 연구에서, 세포 성질이 처리하지 않은 세포와 유사한 수준으로 유지되는 실행기간이 규명되었다. 이들 결과에서, 세포에 대한 저장 및 처리조건을 바꿈으로써, 이 실행기간을 확대할 수 있다는 것을 알 수 있다. UV광 유무하에, 샘플 pH에 대한 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진의 관찰된 효과는 샘플의 저장 또는 가공조건상의 변화에 의해 완화되는 첨가제의 대사효과를 시사한다.
실시예7. 유속 및 샘플 적혈구 용적률의 함수로 적혈구세포에 대한 전단응력의 측정
고 적혈구용적률인 적혈구 샘플에 대한 UV 광의 투과수준이 낮아서, 적혈구세포를 광 경로상의 좁은 통로로 통과하는 시킬 때의 효과를 이해할 필요가 제기되었다. 광 경로상의 샘플 두께가 줄어들면, 고 샘플 적혈구용적률에 UV 전달량이 증가해야 한다. 이런 접근법을 확인하기 위하여, 변형된 치수의 통로를 이용하여, 여러 번 압력 감소 측정을 실시하였다. 압력 게이지는 좁아진 통로의 상류 및 하류에 연동펌프와 일렬로 배치하였다. 적혈구용적률을 변형한 백혈구는 통제된 유속으로 통로를 흘러간다. 양 지점의 압력 기록차이에서, 통로통과후의 압력감소를 직접 측정할 수 있었다. 통로의 이 수치 및 다른 수치를 이용하여, 적혈구 세포가 좁아진 세포를 통과할 때, 이들에 가해지는 전단응력을 결정하였는데, 다음과 같은 방정식을 이용한다.
Figure 112006047118607-pct00013
감소
Figure 112006047118607-pct00014
혈액의 경우,
μ= 속도 = 0.0125/(1-적혈구용적률)
g = 중력 상수 = 981
Q = 유속 = mls/sec
l, w, d = 통로의 치수(㎝)
표5. 유속 및 샘플 적혈구용적률의 함수로 적혈구세포에 대한 전단응력의 측 정
Figure 112000005388637-pct00015
이전의 실험에서, 1-10분의 시간 간격동안 1,000-2,000 dynes/㎠의 전단응력 또는 대략 10 msec의 시간간격동안 5,000-7,000 dynes/㎠의 수준은 적혈구 세포 용혈을 유도하기에 충분한 것으로 결정되었다. 단지 최대 샘플 적혈구용적률(61%) 및 최대 유속(16.9)의 경우에, 수치가 1,000 dynes/㎠을 초과한다. 이것은 가장 좁은 너비(0.008 인치)의 통로에서만 일어난다.
제시한 구성을 이용한 광투과깊이의 수치에서, 바이러스 불활화 과정을 작동시키는 충분한 UV에너지의 전달이 고-적혈구용적률을 가진 샘플에서도 가능하다.
유출된 적혈구 샘플에 대한 전단응력 분석결과에서, 유출경로치수가 상당히 줄어들고, 고 유속이 적혈구 용혈의 위험없이 계속 유지된다는 것을 알 수 있다.
실시예8.
혈소판 농축물은 혈소판 첨가 용액 이솔리트 S와 혼합하는데, 비율은 20(혈소판 농축물):80(이솔리트 S)이 되게 한다. 혈소판 농축물 및 혈소판 첨가용액의 혼합물은 여기에서 "배지"로 칭한다. 첨가용액없는 혈소판 농축물은 여기에서 "혈장"으로 칭한다. 이들 둘은 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes)로 스파이크흡착된다. 비타민 K5는 이후 300㎍/mL B의 양으로 각각에 첨가한다. 이후 이들 각각을 도7의 쿠벳장치상의 UV, 가시광선, 실내광선에 노출시켰는데, 이들 결과는 표6에 제시하였다.
표6
Log 불활화(cfu/mL)
K5(배지) K5(혈청)
UV,40J/㎠ 4.2 Logs 0.1 Logs
VIS, 40J/㎠ 4.2 Logs 0.1 Logs
실내광 0 Logs 0 Logs
UV 광 = 365㎚
가시 광 = 419㎚
병원체 = 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes)
K5의 농도 = 300 ㎍/mL
실시예9.
전술한 배지 및 혈장은 비타민 K5를 보유하는데, 박테리아로 스파이크흡착시키고, 조사하거나 또는 표7에서 제시한 실내광선(K5-광)에 노출시키고, 3일간 배양한후 성장을 평가하였다. 일부 종의 불활화는 조사가 없는 상태에서 관찰되었다.
표7
배지 혈장
스파이크수준 (cfu/mL) K5 + 광 K5 - 광 K5 + 광 K5 - 광
P.aeruginosa 3.4 Logs - - - -
S. aureus 2.1 Logs - - + +
S. epidermidis 3.2 Logs - + - -
L. monocytogenes 3.5 Logs - - + +
E. coli 3.1 Logs - - + -
UV 광 = 365㎚, 40 J/㎠
+ = 3일간 배양한 후에 감지한 성장
- = 3일간 배양한 후에 감지한 무(無)성장
K5의 농도 = 300㎍/mL
실시예10.
실시예 8에서 밝힌 혈소판 농축물 및 이솔리트 S를 이용하여 만든 배지(이솔리트:혈소판 농축물의 비율 = 70:30, 300㎍/mL 비타민 K5 함유)는 몇 가지 종류의 바이러스로 스파이크협착시키고, 30 및 60 J/㎠의 에너지 수준으로 조사한다. 불활화는 표8 및 도8에서 방사에너지의 함수로 제시하였다.
표8
Energy (J/㎠) S. aureus S. epidermidis L. monocytogenes E. coli
0 4.3 2.6 2.8 3.5
30 3.6 2.7 2 2
60 3.2 2.5 1 1
실시예11.
실시예8에서 밝힌 혈소판 농축물 및 실시예10에서 밝힌 70:30 배지에 10μM의 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진을 첨가한다. 혈소판 농축물 및 배지는 황색포도구균(S. aureus) 또는 표피포도구균(S. epidermidis)로 스파이크흡착시키고, 80 J/㎠ 및 30 J/㎠로 조사하고, 상기와 같이 불활화시킨다. 결과는 도9에 제시되어 있다.
실시예12.
표준 혈액 백에 담겨있는 혈장 농축물(실시예 8)에 25μM 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진을 분말형태로 첨가한다. 백은 표9에서 제시한 박테리아로 스파이크흡착시키고, 휘젓고, 120 J/㎠ 방사선에 노출시킨다. 불활화 결과는 표9에 제시하였다.
표9
병원체 Log 불활화(cfu/mL)
S. aureus 1.7 Logs
S. epidermidis 3.5 Logs
P. aeruginosa 3.6 Logs
E. coli 4.1 Logs
실시예13.
실시예 8에서 밝힌 혈소판 농축물에 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진, 알록사진 단일뉴클레오티드, 또는 7,8-디메틸알록사진을 첨가하고, 이후 황색포도구균(S. aureus) 또는 표피포도구균(S. epidermidis)로 스파이크흡착시키고, 80 J/㎠으로 조사한다. 불활화 결과는 표10에 제시하였다.
표10
Log 불활화(cfu/㎠)
Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis
7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진, 10μM 1.9 Logs 4.1 Logs
알록사진 단일뉴클레오티드, 10μM 1.6 Logs 5.6 Logs
7,8-디메틸 알록사진, 7μM 1.6 Logs 2.9 Logs
실시예14
실시예8의 혈소판 농축물에 10μM 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진을 첨가한다. 부분용액은 "소거물질(quencher)"또는 항산화약으로 무(無)첨가성 10mM 아스코르빈산염 또는 10mM KI를 함유한다. 용액은 HSV-2, φX174, 황색포도구균(S. aureus) 또는 표피포도구균(S. epidermidis)로 스파이크흡착하고, 80 J/㎠로 조사한다. 결과는 도10에 제시하였다.
실시예15.
실시예8의 혈소판 농축물에 다양한 농도의 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진을 첨가한다. 이들 용액은 이중-가닥 DNA 엔벨로프 바이러스인 단순포진 바이러스 II형(HSV-Ⅱ)으로 스파이크흡착한다. 조사는 80 J/㎠로 실시한다. 실험은 세 번 반복한다. 세 번의 실험에서, 완전 불활화를 성취한다. 결과는 도11에 제시하였다.
실시예16.
실시예15의 프로토콜을 따르는데, 예외적으로 40, 80, 120 J/㎠의 방사에너지로, HSV II대신에, 표피포도구균(S. epidermidis)를 이용한다. 불활화 결과는 도12에 제시하였다.
실시예17.
실시예15의 프로토콜을 따르는데, 예외적으로 다양한 농도의 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진 및 방사에너지로, 단일가닥 DNA 박테리오파아지인 φX174를 이용한다. 불활화 결과는 도13에 제시하였다.
실시예18.
실시예8의 혈소판 농축물에 10μM 7,8-디메틸-10-리비틸-이소알록사진을 첨가한다. 이들은 황색포도구균(S. aureus) 또는 φX174로 스파이크흡착하고, 다양한 방사에너지에서 가시광선 및 자외선광의 50:50 혼합광선으로 조사한다.
실시예19.
실시예18의 프로토콜을 따르는데, 예외적으로 미생물로서 표피포도구균(S. epidermidis) 및 HSV-Ⅱ를 사용한다. DYMAX 광원으로 50:50 혼합된 자외선 및 가시광선을 제공한다. 불활화 결과는 도15에 제시하였다.
실시예20.
실시예8의 혈소판 농축물에 10μM 7,8-디메틸-10-리비틸-이소알록사진을 분말형태로 첨가한다. 아스코르빈산염을 첨가하고 또는 첨가없이 실험을 하였다. 150ml의 실험용액은 SpectraTM혈액 백상에 위치시키고, 교반하고, 50:50 가시광선:자외선광의 혼합광선을 이용하여 다양한 방사에너지에 노출시켰다. 40 J/㎠를 흡수한후, 각 백의 내용물은 새로운 백에 옮겨 백의 돌기입구에 남아있는 미생물에 의한 오차를 예방한다. 불활화 결과는 도16에 제시하였다. 하향 화살표는 감지가능한 수준(2.5 log 적정량)의 불활화를 가리킨다
실시예21.
실시예8의 혈소판 농축물 및 이솔리트 S상의 혈소판(혈소판 농축물:이솔리트 S = 30:70)에 20μM 7,8-디메틸-1-리비틸-이소알록사진을 첨가한다. 이들은 이중 가닥 DNA 엔벨로프 바이러스인 우두바이러스로 스파이크흡착시키고, DYMAX 200 UV광원을 이용하여 30분동안 60 J/㎠가시광선 또는 혼합된(50:50)가시광선 및 자외선광에 노출시킨다. 검출한계는 1.5 log이다. 불활화 결과는 도17에 제시하였다. 무(無)감광제, 이솔리트 S 배지상의 감광제 단독, 이솔리트 S 배지상의 혈소판, 7,8-디메틸-1-리비틸-이소알록사진 대신 8-메톡시 프소랄렌을 이용한 이솔리트 S 배지상의 혈소판, 이솔리트 배지(30:70)상의 혈소판 농축물을 이용하여 비교하였다.
실시예22.
이솔리트 S 배지(30:70)상의 혈소판 농축물의 샘플은 10μM 7,8-디메틸-1-리비틸-이소알록사진 유무하에, 우두 바이러스로 스파이크흡착시키고, 다양한 기간동안 가시광선:UV광을 50:50으로 혼합하여 60J/㎠로 조사한다. 불활화 결과는 도18 에 제시하였다.
실시예23.
실시예8에서 밝힌 혈소판 농축물의 샘플에 5μM 또는 50μM 7,8-디메틸-1-리비틸-이소알록사진을 첨가한다. 샘플은 HIV1로 스파이크흡착시킨다. 도7에서 보인 쿠벳 유출실을 이용하여, 샘플은 EFOS 광장치를 이용한 다양한 에너지에서 가시광선:UV광을 50:50혼합하여 조사한다. 불활화 결과는 도19에 제시하였다.
실시예24.
HIV-감염된 ACH-2는 실시예8에서 밝힌 혈소판 농축물의 샘플에 첨가한다. 5 또는 50μM 7,8-디메틸-1-리비틸-이소알록사진을 상기 샘플에 첨가한다. 실시예23의 프로토콜을 따르고, 불활화 결과는 도20에 제시하였다. HIV의 존재는 실험 세포에 대한 HIV의 세포변성효과로 분석하였다.
실시예25.
실시예24의 프로토콜을 따르고, HIV의 존재는 P24 항원생산수준을 정량하여 분석하였다. 불활화 결과는 도21에 제시하였다.
실시예26.
실시예8에서 밝힌 혈소판 농축물의 샘플, 그리고 30% 혈소판 및 70% PASⅢTM배지를 함유한 배지에 6mM 아스코르빈산염 및 14μM 7,8-디메틸-1-리비틸-이소알록사진을 첨가하였다. 샘플은 HSV-II로 스파이크흡착한다. 불활화 결과는 도22 및 표11에 제시하였다.
표 11
시간 (분) 에너지 (UV+VIS) J/㎠ 30:70 PC:배지 logqk이러스 적정량 에너지 (UV+VIS) J/㎠ 90:10 PC:배지 log 바이러스 적정량
0 0 5.6 0 5.6
1.5 5 2.5 40 3.3
3 10 2.5 80 1.5 No Detectable Virus
4.5 15 2.3 120 1.5 No Detectable Virus
6 20 1.8
9 30 1.6
12 40
24 80
36 120
당업자가 인식하는 바와 같이, 앞서 밝힌 명세서는 분 발명의 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위를 벗어남없이 다수의 변화가 있을 수 있다. 가령, 언급한 것인 아닌 다른 감광제, 바람직하게는 핵산에 결합하여 핵산이 복제를 못하도록 하는 감광제, 좀더 바람직하게는 비-독성이고, 독성 파괴산물을 갖지 않는 감광제를 사용한다. 또한, 당업자는 과도한 실험없이 이 글에서 밝힌 지시를 따라, 감광제를 이용한 유체의 오염제거를 위한 유출-통과 장치를 용이하게 제조할 수 있다

Claims (83)

  1. 유체를 처리하여 여기에 존재하는 미생물을 불활화시키는 방법에 있어서, 상기 유체는 하나 또는 복수의 성분을 구성하고, 상기 성분은 단백질, 혈액, 혈액 구성성분에서 선택하고, 상기 방법은
    (a) 내생성 알록사진(Alloxazine) 감광제 또는 내생성 알록사진에서 유도된감광제의 비-독성 불활화-효과량을 상기 유체에 첨가하고;
    (b) (a)단계의 유체를 충분한 광방사선에 노출시켜 감광제를 활성화시키고, 이에 따라 상기 미생물이 불활화되는 것을 특징으로 하는 유체내에 미생물을 불활화시키는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 감광제는 한개 또는 그이상의 파장을 흡수하고, 흡수된 에너지를 이용하여 화학적 반응을 실행하여, 광방사(photoradiation)후에 독성 물질을 생산하지 않는 것을 특징으로 하는 유체내에 미생물을 불활화시키는 방법.
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 알록사진 감광제는 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진, 7,8-디메틸알록사진, 7,8,10-트리메틸이소알록사진, 알록사진 단일뉴클레오티드, 이소알록사진-아데노신 이중뉴클레오티드에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유체내에 미생물을 불활화시키는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 알록사진 감광제는 7,8-디메틸-10-리비틸 이소알록사진인 것을 특징으로 하는 유체내에 미생물을 불활화시키는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 미생물은 박테리아, 박테리오파아지, 세포내외 바이러스인 것을 특징으로 하는 유체내에 미생물을 불활화시키는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 미생물은 박테리아인 것을 특징으로 하는 유체내에 미생물을 불활화시키는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 미생물은 HIV 바이러스, 간염 바이러스, 신드비스 바이러스, 시토메갈로바이러스, 수포성구내염바이러스, 단순포진바이러스, 우두바이러스, 사람 T-림프영양성 레트로바이러스, HTLV-Ⅲ, 림프절증 바이러스 LAV/IDAV, 파르보바이러스, 수혈-전이(TT) 바이러스, 엡스테인-바르 바이러스, 박테리오파아지 φX174, φ6, λ, R17, T4, T2, 녹농균(P. aeruginosa), 황색포도구균(s. aureus), 표피포도구균(S. epidermidis), 리스테리아 모노시토게네스(L. monocytogenes), 대장균(E. coli), 클레브시엘라 피뉴모니아(K. pneumoniae), 영균(S. marcescens)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유체내에 미생물을 불활화시키는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 광방사선은 가시광선 스펙트럼상의 광인 것을 특징으로 하는 유체내에 미생물을 불활화시키는 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 광방사선은 자외선 스펙트럼상의 광인 것을 특징으로 하는 유체내에 미생물을 불활화시키는 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 광방사선은 가시광선 및 자외선 스펙트럼 모두에 위치하는 광으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 유체내에 미생물을 불활화시키는 방법.
  12. 제 1항에 있어서, 광방사선 절반은 자외선 스펙트럼상에 있고, 나머지 절반은 가시광선 스펙트럼상에 있는 것을 특징으로 하는 유체내에 미생물을 불활화시키는 방법.
  13. 제 1항에 있어서, 노출단계에는 감광제를 함유한 유체를 광방사선원을 지나서 흘러가게 하는 단계가 포함되고, 이때 유체는 광방사선이 투과되어 미생물이 불활화되도록 하는 유속과 깊이를 갖는 것을 특징으로 하는 유체내에 미생물을 불활화시키는 방법.
  14. 제 1항에 있어서, 투명한 용기에 담긴 유체 및 감광제를 광방사선에 위치시켜, 상기 유체를 상기 광방사선에 노출시키는 것을 특징으로 하는 유체내에 미생물을 불활화시키는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 광방사동안 용기를 휘젓는 것을 특징으로 하는 유체내에 미생물을 불활화시키는 방법.
  16. 제 1항에 있어서, 투명한 용기상의 유체를 광방사선에 위치시키고, 감광제를 분말형태로 상기 유체에 첨가하고, 용기를 휘젓고, 상기 용기를 상기 광방사선에 노출시키는 것을 특징으로 하는 유체내에 미생물을 불활화시키는 방법.
  17. 제 1항에 있어서, 유체는 혈액구성성분으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 유체내에 미생물을 불활화시키는 방법.
  18. 제 1항에 있어서, 유체는 전체혈액세포로 이루어지는 것을 특징으로 하는 유체내에 미생물을 불활화시키는 방법.
  19. 제 1항에 있어서, 유체는 분리된 혈액 산물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 유체내에 미생물을 불활화시키는 방법.
  20. 제 1항에 있어서, 유체는 전체 혈액에서 분리된 혈소판으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 유체내에 미생물을 불활화시키는 방법.
  21. 제 1항에 있어서, 유체는 전체 혈액에서 분리된 적혈구세포로 이루어지는 것을 특징으로 하는 유체내에 미생물을 불활화시키는 방법.
  22. 제 1항에 있어서, 유체는 전체 혈액에서 분리된 혈청으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 유체내에 미생물을 불활화시키는 방법.
  23. 제 1항에 있어서, 유체는 전체 혈액에서 분리된 혈장으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 유체내에 미생물을 불활화시키는 방법.
  24. 제 1항에 있어서, 유체는 치료요법적 단백질 조성물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 유체내에 미생물을 불활화시키는 방법.
  25. 제 1항에 있어서, 유체는 생리-활성 단백질을 포함하고, 이때 상기 단백질은 인자 VIII, 본 윌레브랜드 인자, 인자 IX, 인자X, 인자XI, 하게만 인자, 프로트롬빈, 항-트롬빈 III, 피브로넥틴, 플라스미노겐, 형질단백질 분취물, 복막 투석용액, 면역혈청글로불린, 변형면역글로불린, 알부민, 형질성장호르몬, 소마토메딘, 플라스미노겐 스트렙토키나아제 복합체, 세룰로플라스민, 트랜스페린, 햅토글로빈, 앤티트립신, 프레칼리크레인에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유체내에 미생물을 불활화시키는 방법.
  26. 제 1항에 있어서, 감광제는 항응혈제에 첨가하고, 상기 항응혈제는 유체에 첨가하는 것을 특징으로 하는 유체내에 미생물을 불활화시키는 방법.
  27. 제 1항에 있어서, 유체를 광방사선에 노출시키기 전에, 상기 유체에 알록사진 감광제 강화물질을 첨가하고, 이때 감광제의 활성을 강화시키는 강화물질은 아데닌, 히스티딘, 시스테인, 티로신, 트립토판, 아스코르빈산염, N-아세틸-L-시스테인, 프로필 갈산염, 글루타티온, 멀캡토프로피온일글리신, 디티오트레오톨, 니코틴아미드, BHT, BHA, 리신, 세린, 메티오닌, 글루코스, 만니톨, 트롤록스, 글리세롤, 이들의 혼합물에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유체내에 미생물을 불활화시키는 방법.
  28. 삭제
  29. 유체를 처리하여 여기에 존재하는 미생물을 불활화시키는 방법에 있어서, 상기 방법은,
    (a) 내생성 알록사진 감광제 또는 내생성 알록사진에서 유도된 감광제의 비-독성 불활화-효과량을 상기 유체에 첨가하고;
    (b) (a)단계의 유체를 충분한 광방사선에 노출시켜 감광제를 활성화시키고, 이에 따라 상기 미생물은 불활화되는 것을 특징으로 하는 유체내에 미생물을 불활화시키는 방법.
  30. 제 29항에 있어서, 유체는 식용 산물인 것을 특징으로 하는 유체내에 미생물을 불활화시키는 방법.
  31. 제 29항에 있어서, 유체는 사람 또는 동물 소비 목적의 음료(drink)인 것을 특징으로 하는 유체내에 미생물을 불활화시키는 방법.
  32. 제 29항에 있어서, 유체는 복막 용액인 것을 특징으로 하는 유체내에 미생물을 불활화시키는 방법.
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
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  77. 삭제
  78. 삭제
  79. 유체를 처리하여 유체에 존재하는 미생물을 불활화시키는 방법에 있어서,
    (a) 알록사진 감광제의 불활화-효과량을 상기 유체에 첨가하고;
    (b) (a)단계의 유체를 자외선 및 가시광선의 혼합광선에 노출시키고, 이에 따라 상기 미생물은 불활화되는 것을 특징으로 하는 유체에 존재하는 미생물을 불활화시키는 방법.
  80. 제 79항에 있어서, 혼합광선은 50:50 자외선:가시광선이 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  81. 삭제
  82. 유체를 처리하여 유체에 존재하는 백혈구세포만을 불활화시키는 방법에 있어서,
    (a) 내생성 알록사진 감광제 또는 내생성 알록사진에서 유도된 감광제의 비-독성 불활화-효과량을 상기 유체에 첨가하고;
    (b) (a)단계의 유체를 충분한 광방사선에 노출시켜 감광제를 활성화시키고, 이에 따라 백혈구세포만을 불활화시키는 방법.
  83. 제 82항에 있어서, 유체는 혈액 또는 혈액성분으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 백혈구세포만을 불활화시키는 방법.
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