CZ20001406A3 - Řešení se týká léčiva k léčení získaného hyperkoagulovatelného stavu nebo získané nedostatečnosti proteinu C. Týká se lidských pacientů se získaným hyperkoagulovatelným stavem nebo získanou nedostatečností proteinu C souvisejícím se sepsí, purpura fulminans, meningokokální sepsí, transplantací kostní dřeně nebo dalšími transplantacemi, těžkými popáleninami, těhotenstvím, těžkými chirurgickými zákroky, těžkým traumatem nebo ARDS, které zahrnuje podávání aktivovaného proteinu C, který představuje vysoce selektivní terapeutické činidlo s nízkým potenciálem způsobení komplikací představujících krvácením. - Google Patents

Abstract

Způsob ošetřování kapalin k inaktivaci mikroorganismů, které se v nich mohou vyskytovat, přičemž kapalina obsahuje jednu nebo několik složek volených ze souboru zahrnujícího protein, krev a složky krve, spočívá v tom, že se (a) přidává do takové kapaliny k inaktivaci účinné, v podstatě netoxické množství endogenního fotosensitizerů nebo derivátu fotosensitizerů na endogenní bázi, (b)kapalina ze stupně (a) se podrobí fotozáření postačujícímu k ativaci fotosensitizerů za inaktivace mikroorganismů. Endogenní fotosensitizerje výhodně volen ze souboru zahrnujícího endogenní alloxaziny, vitamin K a vitamin L

Description

Způsob inaktivace biologických nečistot pomocí fotosensitiserů a 2aří2ení k jeho provádění

Oblast techniky

Vynález je pokračováním americké přihlášky vynálezu číslo 09/119,666, podané 21. července 1998, jejíž text je do předmětného popis plně přenesen až do rozsahu s ním nekompatibilních skutečností.

Dosavadní stav techniky

Znečištění krve infekčními mikroorganismy, jako je HIV, hepatitida a ostatní viry a bakterie představují vážné zdravotní nebezpečí pro příjemce, kteří transfuzí dostávají takovou krev jako celek nebo složky takové krve, jako jsou destičky, červené krvinky, krevní plasma, faktor VIII, plasminogen, fibronektin, antithrombin III. kryoprecipitát, frakce lidského plasmového proteinu, albumin, globulin imunitního sera, prothrombinová komplexní plasma růstových hormonů a jiné složky, izolované z krve, Způsoby prověřování krve mohou přehlédnout nečistoty a sterilizační postupy, které nepoškozují buněčné složky krve, ale účinně inaktivují všechny infekční viry a jiné mikroorganismy nejsou dosud k disposici.

Rozpouštědlové detergentní způsoby dekontaminace krevních složek jsu založeny na rozpouštění fosfolipidových membrán obklopujících viry jako je HIV a nepoškozují proteinové složky krve avšak v přítomnosti krevních buněk nelze takových metod použít vzhledem k poškození buněčných membrán.

Použití fotosensitizerů, což jsou sloučeniny, které absorbují světlo definované vlnové délky a přenášejí absorbovanou energii na akceptor energie, se navrhuje ke sterilizaci krevních složek. Například se v evropském patentovém spise číslo

196515 (zveřejněno 8. října 1986) popisuje použití neendogenních fotosenziti žeru jako jsou porfyriny, psoraleny, akridiny, toluidiny, flaviny (akriflavinhydrochlorid), deriváty fenothiazinu a barviva, jako neutrální červeň a methylenová modř, jako krevních aditivů. Protoporfyrin, který se vyskytuje přirozeně v těle, může být metabolizován k vytvoření fotosensitizeru; jeho užitečnost je však omezená, jelikož odbourává žádoucí biologické aktivity proteinů. Chlorpromazin se rovněž uvádí jako příklad takových fotosensitizerů, avšak jeho užitečnost je omezená tím, že by měl být odstraněn z jakékoli kapaliny podávané pacientovi po dekontaminačnim procesu, jelikož má sedat ivni účinek.

V literatuře je uveden přehled některých fotosensitizerů včetně psoralenů a některé významné problémy při hledání fotosensitizerů pro dekontaminaci krevních produktů (R.P. Goodrich a kol., The Design and Development of Selective Photoactivated Drugs for Steri 1 ization of Blood Products (Konstrukce a vývoj selektivně fotoaktivovaných drog pro sterilizaci krevních produktů) Drugs of the Future 22, str. 159 až 161, 1997). Použití texafyrinů pro fotoštěpení DNA je popsáno v americkém patentovém spise číslo US 5 607924 (uděleno 4. března 1997) a číslo US 5 714328 (uděleno 3,února 1998, Magda a kol,). Použití safirinů k virové desaktivaci je popsáno v americkém patentovém spise číslo US 5 041078 (uděleno 20. srpna 1991, Matthews a kol.). Inaktivace mimobuněčně obalených virů v krvi a v krevních složkách systémem barviva Phenthazin-5-ium plus světlo popsal Wagner (americký patentový spis číslo 5 545516, uděleno 13. srpna 1996). Použití porfyrinů, hematoporfyrinů a merokyani nových barviv jako fotosensitizujicich činidel k likvidaci infekčních nečistot, jako jsou viry a protozoma z tělních tkání, jako jsou tělní tekutiny je popsáno v americkém patentovém spise číslo US 4 915683, (uděleno 10. dubna 1990) a v souvisejícím americkém patentovém spise číslo US 5 304113, (uděleno 19. dubna 1994, Sieber a kol.). Uvádí se, že mechanismus působení takových fotosensitizerů zahrnuje přednostní vázání na domény v lipidových dvoj vrstvách, například na obalených virech a na některých virem infikovaných buňkách. Fotoexcitace membránou vázaných molekul vede k vytváření reaktivních kyslíkových druhů jako je kyslíkový singlet, který způsobuje lipidovou peroxidaci. Problém s použitím takových fotosensitizerů je napadání buněčné membrány žádoucích složek kapalin, jež mají být dekontaminovány, jako jsou červené krvinky, přičemž kyslíkový singlet také napadá žádoucí proteinové složky zpracovávaných kapalin. Americký patentový spis číslo US 4 727026 (uděleno 23. února 1988, G.P.

popisuje použití f1uorokumari nu

Wiesehahn a kol.) psoralenu a derivátů uvádí se však, že včetně k dekontaminaci krve

14. května 1996, Park a kol.) číslo US 5 587490 (uděleno a krevních produktů, musejí být podniknuty kroky ke snížení dostupnosti rozpuštěného kyslíku a dalších reaktivních druhů k bránění denaturaci biologicky aktivního proteinu. Fotoinaktivace virových a bakteriálních nečistot krve pomocí halogenovaných kumarinů je popsána v americkém patentovém spise číslo US 5 516629 (uděleno V americkém patentovém spise 24. prosince 1996, R.P. Goodrich

Jr. a kol.) a 5 418130 (Platz a kol.) se popisuje použití substituovaných psoralenů k inaktivaci virových a bakteriálních nečistot krve. V tomto patentovém spise se také zdůrazňuje nutnost sledovat poškození ostatních složek krve volnými radikály. Americký patentový spis číslo 5 654443 (uděleno 5. srpna 1997, Wollowitz a kol.) popisuje také novou psoralenovou sloučeninu použitou k fotodekontaminaci krve. V americkém patentovém spise číslo US 5 709991 (uděleno 20. ledna 1998, Lin a kol.) se popisuje použití psoralenu k fotodekontaminaci destičkových prostředků a následné odstraňování psoralenu. Americký patentový spis číslo US 5 120649 (uděleno 9. června související patentový spis číslo US 5 232844 (uděleno 1993 Horowitz a kol.) také uvádí potřebu k použití v kombinaci s fotosensitizery, které napadají lipido1992) a 3. srpna hasičů vé membrány a americký patentový spis číslo US 5 360734 (udě• · • to « · · · · · • · · · · · · · • · · · · · · * • to

léno 1.listopadu 1994 Chapman a kol.) také upozorňuje na problém prevence poškozování jiných složek krve.

Fotosensitizery, které napadají nukleové kyseliny jsou v oboru známé. Americký patentový spis číslo US 5 342752 (uděleno 30. srpna 1994, Platz a kol.) se týká použití sloučenin založených na akr idinových barvivěch k redukci parazitického znečištění složek krve včetně červených krvinek, destiček a frakcí proteinů krevní plasmy. Tyto materiály, jakkoliv samy mají nízkou toxicitu, jsou přesto v určité míře toxické například vůči červeným krvinkám. Uvedený patentový spis neuvádí žádné zařízení na dekontaminaci krve na průtočném základě. Americký patentový spis číslo US 5 798238 (Goodrich Jr. a kol.) uvádí chinolin a chinolínové sloučeniny k inaktivaci virových a bakteriálních nečistot.

Vázání DNA s fotoaktivními činidly se provádí ke snížení lymfotických populací v krvi (americký patentový spis číslo US 4 612007, uděleno 16. září 1986: a číslo US 4 683889, uděleno 4. srpna 1987, Edelson),

Uvádí se, že riboflavin (7,8-dimethyl-10-ribitylisoalloxazin) napadá nukleové kyseliny. Je popsána fotoalterace nukleových kyselin v přítomnosti riboflavinu (Tsugita A. a kol., Photosensitized inactivation of ribonucleic acids in the presence of riboflavin (Forosenzitizační inaktivace ribonukleových kyselin v přítomnosti riboflavinu) Biochimica et Biophysica Acta 103, str. 360 až 363, 1965; a Speck, W.T. a kol. Further Observations on Photooxidat i on of DNA in the Presence of Riboflavin (Další poznatky o fotooxidaci DNA v přítomnosti riboflavinu) Biochimica et Biophysica Acta 435, str. 39 až 44, 1976). Vázání lumiflavinu (7,8,10-trimethylisoalloxazinu) na DNA je popsáno v literatuře (K. Kuratomi a kol. (Studíes on the Interactions between DNA and Flavins (Studie interakcí mezi DNA a flaviny) Biochimica et Biophysica Acta 476, str.

• ·

207 až 217, 1977). Hoffmann M.E. a kol. (DNA Strand Breaks in Mammalian Cells Exposed to Light in the Presence of Riboflavin and Tryptophan“ (Přerušování řetězců DNA v savčích buňkách v přítomnosti riboflavinu a tryptofanu) Photochemistry and Photobiology 29, str. 299 až 303, 1979) popisuje použití riboflavinu a tryptofanu k vyvolání zlomů DNA savčích buněk po vystavení účinku viditelného fluorescenčního světla nebo světla blízkého ultrafialové oblasti. V článku se konstatuje, že k těmto jevům nedochází, jestliže se v prostředí vynechá riboflavin nebo tryptofan. Zlomy řetězců DNA po vystavení účinku proflavinu a světla jsou popsány (Piette a kol., Production of Breaks in Single- and Doubíe-Stranded Forms of Bacteriophage iuX174DNA by Prof lavině and Light Treatment (Zlomy jednořetězcových a dvouřetězcových forem bakteriofágu iuX174DNA proflavinem a osvětlením) Photochemistry and Photobiology 30, str. 369 až 378, 1979) a změny guani nových zbytků během proflavinem zprostředkované fotosenzitizace DNA jsou také popsány (Piette J. a kol., Alteration of Guanin Residues during Mediated Photosensitizati on of DNA (Změny guanidinových zbytků během zprostředkované fotosensitizace DNA) Photochemistry and Photobiology 33, str. 325 až 333, 1981).

J. Cadet a kol. ( Mechanisms and Products of Photosensiti zed Degradation of Nucleic Acids and Related Model Compounds (Mechanismy a produkty fotosensitizací odbouraných nukleových kyselin a podobných modelových sloučenin) Israel J. Chem. 23, str. 420 až 429, 1983) popsal mechanismus působení produkováním kyslíkového singletu bengálské červeně, methylenové modře, thioninových a jiných barviv ve srovnání s mechanismy nezahrnujícími produkci kyslíkového singletu, kterými dochází k napadání nukleových kyselin deriváty flavinu a pteronu. Příkladně se uvádí riboflavin mající schopnost odbourávat nukleové kyseliny. M. Korycka-Dahl a kol. (Photodegradation of DNA with Fluorescent Light in the Presence of Riboflavin and Photoprotection by Flavin Triplet-State Quenchers (Odbourávání • · · · • ♦ · · • 4 4 * • *4 · • 4 « 4 ·« 4 ·

DNA fluorescenčním světlem v přítomnosti riboflavinu a fotoochrana flavinovým i hasiči tripletového stavu) Biochemica and Biophysica Acta 610, str. 229 až 234 (1980) uvádí, še aktivní kyslíkové druhy se přímo neúčastňuji střihání DNA riboflavinem. J.G. Peak a kol. (DNA Breakage Caused by 334-nm Ultraviolet Light is Enhanced by Naturally Occuring Nucleic Acid Components and Nucleotide Coensymes (Lámání DNA ultrafialovým zářením o vlnové délce 334 nm je podporování přírodně se vyskytujícími složkami nukleových kyselin a nukleotidovýmí koenzymy), Photochemistry and Photobiology 39, str. 713 až 716, 1984) dále zkoumá mechanismus působení riboflavinu a jiných fotosensitiserů. Neuvádí se však ani zmínka o použití takových fotosensitizerů k dekontaminaci medicínských kapalin.

Přístroje pro dekontaminaci krve popsali Wolf Jr. (americký patentový spis číslo US 5 290221, uděleno 1. března 1994) a Bischof (americký patentový spis číslo US 5 536238, uděleno 16. červenec 1996). V americkém patentovém spise číslo US 5 290221 se popisuje ozařování kapaliny v poměrně úzké obloukové mezeře.

V americkém patentovém spise číslo 5 536238 se popisuje zařízení používající optických vláken zasahujících do filtračního prostředí. V obou případech se doporučují jako fotosensitizery deriváty benzoporfyrinu, které mají afinitu ke stěnám buněk.

Podstata vynálezu

Způsob ošetřování kapalin k inaktivaci mikroorganismů, které se v nich mohou vyskytovat, přičemž kapalina obsahuje jednu nebo několik složek volených ze souboru zahrnujícího protein, krev a složky krve, spočívá podle vynálezu v tom že se (a) přidává do takové kapaliny k inaktivaci účinné, v podstatě netoxické množství endogenního fotosensitizeru nebo derivátu fotosensitizeru na endogenní bázi,

(b) kapalina ze stupně (a) se prodrobí fotoozáření postačujícímu k aktivaci fotosensitiseru za inaktivace raikroorgan i smů.

Jedním mechanismem, kterým mohou tyto fotosensiti aery inaktivovat mikroorganismy je interference s nukleovými kyselinami k zabránění replikace nukleové kyseliny.

Zde použité vyjádření inaktivace mikroorganismu“ znamená úplné nebo částečné zabránění replikaci buď zabitím mikroorganismu nebo jiným působením na jeho schopnost reprodukce.

Jakožto mikroorganismy s uvádějí viry (jak extracelulární, tak intrace1ulární), bakterie, bakteriofágy, houby, paraziti, přenášené krví, a protozoa. Jakožto příklady virů se uvádějí virus získané imunitní nedostatečnosti (HIV), viry hepatitidy A, Ba C, sinbis virus, cytomegalovirus, vesikulární virus ústní dutiny, viry herpes simplex, například typu I a II, lidské T-lymfotropní retroviry, HTLV-III, virus lymfadenopatie LAV/IDAV, parvovirus, trasfusí přenesený virus (TT), EpsteinBarův virus a jiné v oboru známé viry. Jako bakteriofágy se uvádě j i uiX174, ω 6, lamda, R17, T4 a T2, jako bakterie P.aeruginosa, S. aureus, S. epidermis, L. monocytogenes, E. col i , K. pneumonia a S. marcescens.

Inaktivace bílých krvinek může být žádoucí při potlačování imunitní nebo autoimunitní odezvy, například při transfuzi červených krvinek, destiček nebo plasmy, pokud mohou být obsaženy bílé krvinky dárce.

Jakožto materiály, které mohou být ošetřeny způsoby podle vynálezu se příkladně uvádějí veškeré materiály, jež jsou přiměřeně propustné pro fotoradiaci k poskytnutí dostatečného světla k dosažení inaktivace virů, nebo které jsou suspendovány nebo rozpuštěny v kapalinách, které mají takovou propustnost pro fotoradiaci. Jakožto příklady takových materiálů se uvádí plná krev a vodné prostředky obsahující biologicky aktivní proteiny odvozené 2 krve nebo se složek krve. Příklady takových složek krve jsou červené krvinky oddělené od plasmy, destičky a plasma (čerstvá nebo čerstvě zmrazená plasma). Kromě toho terapeutické proteinové prostředky obsahující proteiny odvozené z krve, jako jsou kapaliny obsahující biologicky aktivní protein vhodné k ošetřování léčebných poruch, například faktor VIII, faktor Von Wi 11ebrandův, faktor IX, faktor X, faktor XI, Hagemanův faktor, prothrombin, anti -thrombi η III, fibronektin, plasminogen, frakce plasmového proteinu, globulin imunitního séra, modifikovaný imunitní globulin, albumin, plasma růstového hormonu, somatomedin, plasminogen-streptoki názový komplex, cerulopi asm in, transferin, haptoglobin, antitrypsin a preka11 ikrein se mohou ošetřovt dekontaminaČními způsoby podle vynálezu. Kromě toho přicházejí v úvahu pro způsob podle vynálezu například peritoneální roztoky používané k peritoneální dialyse, které jsou někdy znečiětěny během spojení, což vede k peritoneální infekci.

Označení biologicky aktivní znamená schopnost ovlivnit změnu v živém organismu nebo jeho součásti. Biologicky aktivní vzhledem ke zde uváděnému biologicky aktivnímu proteinu se nevztahuje na proteiny, které jsou součástí inaktivovaného mikroorganismu. Podobně “netoxický ve vztahu k fotosensitize rům znamená nízkou nebo žádnou toxicitu pro lidi nebo jiné savce a neznamená netoxicítu pro inaktivované mikroorganismy. Podstatná destrukce biologické aktivity znamená alespoň takovou destrukci, jaká je způsobena porfyrinem a jeho deriváty, metabolity a prekukzory, o nichž je známo, že mají škodlivý účinek na biologicky aktivní proteiny a lidské a savčí buňky. Podobně v podstatě netoxický znamená méně toxický než porfyrin a jeho deriváty, metabolity a prekursory, které jsou známé pro sterilizaci krve.

Zde používané označení krevní produkt zahrnuje složky

- 9 ♦ ♦ ·· ( * ·

I ΦΦΦΦ

ΦΦΦΦ φ krve a terapeutické proteinové prostředky obsahující proteiny odvozené z krve definované shora. Kapaliny obsahující biologicky aktivní proteiny jiné než odvozené z krve, mohou být také ošetřovány způsobem podle vynálezu.

Dekontaminační způsoby podle vynálezu, používající endogenních fotosensitizerů a derivátů fotosensitizerů na endogenní bázi podstatně nenarušují biologickou aktivitu kapalných složek jiných než mikroorganismů. Zachovává se co možno nejvíce biologické aktivity těchto složek, ačkoli v některých případech, když jsou způsoby optimalizovány, musí být určitá ztráta biologické aktivity, například denaturace proteinových složek, vyvážena účinnou dekontaminací kapaliny. Pokud si kapalné složky uchovají dostatečnou biologickou aktivitu pro záměrné nebo přirozené účely, nejsou jejich biologické aktivity považovány za v podstatě zničené.

Fotosensitizery, užitečné podle vynálezu, zahrnují veškeré fotosensitizery známé v oboru pro inaktivaci mikroorganismů. ”Fotosensitizer je definován jako jakákoliv sloučenina, která absorbuje záření jedné nebo několika definovaných vlnových délek a následně využívá absorbované energie k provádění chemických procesů. Jako příklady takových fotosensitizerů se uvádějí porfyriny, psoraleny, barviva jako neutrální červeň, methylenová modř, akridín, toluidiny, flavin (hydrochlorid akriflavinu) a deriváty fenothiazinu, kumariny, chinolony, chinony a anthrochinony. Fotosensitizery podle vynálezu mohou zahrnovat sloučeniny, které se přednostně adsorbují na nukleových kyselinách a tak zaměřují své fotodynamické působení na mikroorganismy a viry s malým nebo s žádným působením na doprovodnébuňky nebo proteiny. Podle vynálezu jsou užitečné také jiné fotosensitizery například využívající mechanismu závislého na kyslíkovém singletu. Nejvýhodnějšími jsou endogenní fotosensi ti zery. Označení endogenní znamená přirozeně se nacházející v lidském nebo savčím těle, buď jako výsledek synφφ φφ ► φ φ φ

I · φ · • · φ φ > φ φ » · ·♦« mm «·· «φ φ φ

Lesy tělem nebo jako výsledek požití jako podstatné složky potravy (například vitaminy) nebo jako výsledek vytváření metabolitů a/nebo vedlejších produktů in vivo. Příklady takových endogenních £otosensitizerů jsou alloxaziny, jako 7,8-dimethyl-10-ribytylisoalloxazin (riboflavin) , 7, 8,10-trimethy1 isoalloxazin ( 1 um if1avi η), 7,8-dimethylalloxazin (1 umichrom) , dinukleotidisoalloxazin-adenin, (flavinadenindinukleotid [FAD]), alloxazinmononukleotid (známý též jako f1avinmononuk1eotid [FMN] a riboflavin-5-fosfát), vitaminy K, vitamin L, jejích metabolity a prekurzory a naftochinony, naftaleny, naftoly a jejich deriváty mající planární molekulární uspořádání. Výraz alloxazin zahrnuje isoalloxaziny. Jako deriváty fotosensitizerů na endogenní bázuzi se uvádějí synteticky odvozené analogy a homology endogenních fotosensitizerů, které mají popřípadě nižší alkylovovou skupinu (s 1 až 5 atomy uhlíku) nebo atomy halogenu jako substítuenty fotosenzitizerú, z nichž jsou odvozeny a které si uchovávají funkci a podstatnou netoxičnost. Pouzí je-li se endogenních fotosensitizerů, obzvláště nejsou-li takové fotosensitizery inherentně toxické, nebo nevytvářejí toxické fotoprodukty po fotoozáření, není nutný po dekontaminaci žádný stupeň odstraňování nebo čištění a zpracované produkty mohou být vráceny přímo do pacientova těla nebo podány pacientovi potřebujícímu takový léčebný zásah. Výhodnými endogenními fotosensitizery jsou:

ch₂oh

HOCH

I

HOCH

I

HOCH

I

7,8-dimetylalloxazin

7,8-dimetyl-10-ribitylisoalloxazin ·· 99 • « ···

9 9

9 9

9 9

9 9 • · 9 ·

i soa11oxas i n-adenosi nd i nuk1eot1d

CH₂OPO₃ ²

I

HOCH

I

HOCH

I

HOCH

I ch₂

I

a11oxas i nmononuk1eot i d ····

vitamin K2

v i tam i η K5 • to to « · •

to *

to··· ··· • · to * • toto • ···· • · · ♦ ·· ♦· ♦ · ·♦ « ·· to • 9 · « • toto toto* toto

vitamin K-S(II)

OH

OH vitamin L

The method of this invention requires mixing the photosensitizer with the φφ φ* *♦ φφ φφφ φ · φ ♦ φ φφφφ φ φφ φ φ φφ φ · φ φφ φ φ φφ φ φ φφ ♦ φφφφ φφ φφ

ΦΦ · φφφφ φ φ φ φ φ · φφφφ φφφ

Způsob podle vynálezu vyžaduje smísení fotosensitizerů s materiálem, který má být dekontaminován. Směšování se může provádět jednoduchým přidáváním fotosensitizeru nebo roztoku obsahujícího fotosenzitizer do kapaliny určené k dekontaminaci. Podle jednoho provedení se dekontaminovaný materiál s přidaným fotosensitizerem nechává protékat kolem fotoradiačni ho zdroje a tok obvykle zajišťuje dokonalou turbulenci k rozdělení fotosensiti žeru v dekontaminované kapalině. Podle jiného provedení je kapalina s fotosensitizerem umístěna do fotopropustného kontejneru a ozařuje se po dávkách, s výhodou za stálého míchání k plnému rozdělení fotosensitizeru a k vystavení veškeré kapaliny záření.

Množství fotosensiti žeru, směšovaného s kapalinou, má být postačující k přiměřené inaktivací obsažených mikroorganismů, avšak menší než toxické (pro lidi a jiné savce) nebo nerozpustné množství. Jak se má zato, může být optimální koncentrace žádaného fotosensitizerů stanovena pracovníkem v oboru bez nutného experimentování. Fotosensitiaátor se používá s výhodou v koncentraci alespoň přibližně 1 14M do rozpustnosti fotosensi ti žeru v kapalině, s výhodou přibližně 10 uM. Pro 7,8-dimethyl-10-ribitylisoalloxazin je koncentrace 1 uM až přibližně 160 14M, s výhodou přibližně 10 uM.

Kapalina, obsahující fotosensitizer, je vystavena fotor-adiaci vhodné vlnové délky k aktivaci fotosensitizeru v míře fotoradiace postačující k aktivaci fotosensiti žeru jak shora popsáno, avšak menší než takové, která by mohla způsobit nespecifické poškození biologických složek nebo podstatně interferovat s biologickou aktivitou ostatních proteinů, obsažených v kapalině. Použitá vlnová délka závisí, jak je v oboru známo, na zvoleném fotosensitizeru, nebo je snadno stanovitelná bez nutného experimentování podle příslušných návodů. S výhodou je zdrojem světla fluorescenční nebo luminiscenční zdroj poskytující záření o vlnové délce přibližně 300 nm až přibližně 700

4

4*

4 4 99« 9 4 4 9 4 nm, výhodněji přibližně 340 nm až přibližně 650 nm. Podle vynálezu jsou užitečné vlnové délky v ultrafialové a ve viditelné oblasti světla. Zdroj nebo zdroje světla mohou poskytovat světlo ve viditelné oblasti, světlo v ultrafialové oblasti nebo s výhodou směs světla ve viditelné a v ultrafialové oblasti, výhodněji přibližně polovinu ve viditelné oblasti a polovinu v ultrafialové části spektra, ačkoli lze použít i jiných poměrů. Výhodou smíšeného záření je, že viditelné spektrum nepoškozuje destičky a snižuje množství požadovaného, škodlivějšího ultrafialového záření.

Aktivovaný fotosensitizer je schopen inaktivovat obsažené mikroorganismy tím, že předchází jejich replikace. Specifičnost účinku fotosensitizeru je dána těsnou blízkostí fotosensi t izeru k nukleové kyselině mikroorganismu a je výsledkem vazby fotosensiti žeru k nukleové kyselině. Jako nukleové kyseliny se uvádějí kyselina ribonukleová (RNA) a deoxyribonukleová kyselina (DNA). Jiné fotosensitizery mohou působit vazbou na membrány buněk nebo jiným mechanismem. Fotosensítizer může být také zacílen na ínaktivovaný mikroorganismus kovalentní vazbou na protilátku, s výhodou specifickou monoklonální protilátkou na mikroorganismus.

Kapalina obsahující fotosensitizer může protékat fotoprůchodným kontejnerem k ozáření. Pod pojmem kontejner se míní uzavřený nebo otevřený prostor, vytvářený tuhým nebo ohebným materiálem, například to může být sáček nebo krabice nebo koryto. Může být nahoře uzavřen nebo otevřen a může mít otvory po obou stranách, například to může být trubice nebo potrubí, kterým může kapalina protékat. Pro příkladné provedení vynálezu je použito kyvety s průtočným systémem. Pro jiný příklad je použito sběrných sáčků, které používají systémy Trima™ Spectra™ a apherezních systémů Cobe Laboratories, lne. ke zpracování kapaliny po dávkách.

• φ» φφ · * φ • φφφ • · φ φ φ φ φφφ

Pojem “fotopropustný“ znamená, že materiál kontejneru je příslušně propustný pro fotoradiaci vhodné vlnové délky k aktivaci fotosensiti žeru. V průtočném systému má kontejner hloubku (rozměr měřený ve směru záření od fotoradiačního zdroje) postačující k umožnění fotoradiace k přiměřenému proniknutí kontejnerem ke styku molekul fotosensitižeru ve všech vzdálenostech od zdroje záření a zajištění inaktivace mikroorganismů v kapalině určené k dekontaminaci a délku (rozměr ve směru proudění kapaliny) postačující k zajištění dostatčné doby vystavení kapaliny fotoradiaci. Materiály na takové kontejnery, jejich hloubky a délky snadno určí pracovník v oboru bez nutného experimentování podle návodu a spolu s průtočnou rychlostí kapaliny kontejnerem, intenzitou fotoradiace a schopnosti absorbovat složky kapaliny, například plasmy, destiček, červených krvinek, které určí časový úsek, který kapalina potřebuje k vystavení fotoradiaci. Pro 7,8-dimethy1 - 10-ribi ty1 i soalloxazin je výhodná dávka záření 1 J/cm² až 120 J/cm².

Podle jiného provedení zpracování po dávkách se zpracovávaná kapalina umístí do fotopropustného míchaného kontejneru, a vystaví se fotoradiaci po dobu postačující k podstatné inaktivaci mikroorganismů. Fotopropustným kontejnerem je s výhodou krevní sáček zhotovený z průsvitného nebo poloprůsvitného plastu a míchacím zařízením je s výhodou natřásací stůl. Fotosensitizer se do kontejneru může přidávat ve formě prášku nebo kapaliny a kontejner míchaný k promísení fotosensitizeru s kapalinou se vystaví přiměřenému ozáření kapaliny k zaručení inaktivace mikroorganismů.

Fotosensitizer se může přidávat nebo přilévat do fotopropustného kontejneru odděleně od zpracovávané kapaliny, nebo může být do kapaliny přidán před vnesením kapaliny do kontejneru. Podle jednoho provedení se fotosensitizer přidává do protisrážlivého prostředku a směs fotosensitizeru a protisrážlivého prostředku se přidává do kapaliny.

- 17 • X ·· XXX · • χχχχ · • X «X

XX xx

Ke zvětšení účinnosti a selektivity způsobu se do kapaliny mohou přidávat podporující činidla. Takovými podporujícími činidly mohou být antioxidanty nebo jiná činidla k prevenci poškození žádoucích složek kapal iny nebo ke zvýšení rychlosti inaktivace mikroorganismů a jsou to například adenin, histidin, cystein, tyrosin, tryptofan, askorbát, N-aceLyl-L-cystein, propy1gal1át, glutathion, merkaptopropionylglycin, di thiothreotol, nikotinamid, BHT, BHA. lysin, serin, methíonin, glukóza, mannitol, trolox, glycerol a jejich směsi.

Vynález se týká také kapalin obsahujících biologicky aktivní protein, krev nebo krevní složky a obsahujících také endogenní fotosensitizer, deriváty fotosensiti žeru na endogenní bázi nebo jejich fotoprodukt připravený způsobem podle vynálezu. Kapalina může obsahovat také inaktivované mikroorganismy.

Přídavně k dekontaminaci plné krve, kapalin obsahujících krevní produkty a biologicky aktivních proteinů je způsob podle vynálezu vhodný ke zpravování jiných kapalin, včetně kapalin určených pro výživu lidí a savců, jako je voda, ovoce, štávy, mléko, živiny a polévky. Způsob se hodí také ke zpracování per itoneálních a parenterálnich roztoků.

Vynález se týká také způsobu zpracování povrchů k inaktivaci mikroorganismů, které na nich mohou být, spočívajícího v nanášení na takové povrchy inaktivačně účinného netoxického množství endogenního fotosensitizeru nebo derivátu fotosensitizeru na endogenní bázi a vystavení povrchu fotoradiaci postačující k aktivování fotosensitižeru. Povrchem může být povrch potravin například ovoce, zeleniny nebo poraženého dobytka, povrch nebo povrchy řezaných nebo zpracovaných potravin. Cásticové materiály, jako mleté maso mohou být zpracovávány smísením fotosensitizeru s materiálem a pokračovat v míšení při ozařování k vystavení čerstvých povrchů fotoradiaci.

• to to • ••to ·· ·· • ·· « to··· to ·· to • toto · ·· ·· to · • to • · ·· ·« #

« to

Povrchem mohou být alternativně povrchy k přípravě stravy jako je pracovní pult nebo ukládací police nebo to mohou být povrchy koupací nebo mycí nádoby jako je kuchyňský dřez, koupací vana nebo horký džber nebo plavecký bazén. Kromě toho může být povrchem povrch živých zvířat nebo rostlin nebo to může být povrch rány.

Fotosensitizer se může nanášet ve vhodném nosiči jako je voda nebo roztok obsahující jiné zpracovací přísady, nástřikem, máčením nebo natíráním nebo jinými způsoby známými v oboru. Množství fotosensitizerů a energii fotoradiace, potřebné pro zpracování, určí snadno pracovník v oboru bez zbytečného experimentování v závislosti na míře znečištění a na zpracovávaném materiálu.

Vynález se týká také způsobu zpracování kapalin nebo jiných materiálů k inaktivaci případně obsažených mikroorganismů přidáním inaktivačně účinného, netoxického množství vitamínu K5 do kapaliny nebo do jiného materiálu. Kapalina nebo jiný materiál se mohou s výhodou ne však nutně ozářit ke zlepšení inaktivace mikroorganismů. V některých případech dochází při použití vitaminu K5 k inaktivaci okolním světlem nebo ve tmě, jak je uvedeno dále v příkladech. Kapaliny, obsahující červené krvinky, se s výhodou zpracovávají vitaminem K5 chybí-li fotoradiační stupeň. Sloučenina K5 se může také nanášet na povrchy, jako jsou sady trubiček pro krev nebo pro peritoneální dialýzu k zajištění sterilních spojů a sterilního spojování.

V dekontaminačních systémech podle vynálezu může být 2droj fotoradiace spojen s fotopropustným kontejnerem pro kapalinu pomocí vodičů světela, jako jsou světelné kanály nebo vláknová optická trubice, které zabraňují rozptylu světla mezi zdrojem a kontejnerem pro kapalinu a významněji zabraňují podstatnému zahřívání kapaliny v kontejneru. Přímé vystavení o

zdroji světla může zvýšit teplotu až o 10 až 15 C, obzvláště

ΦΦ φφφφ * • φ φ · « φ · • φφφφ · * · *

Φ Φ Φ ΦΦΦ ·Φ · *Φ · · · · *

ΦΦ ΦΦ ΦΦ ·* je-li množství kapaliny, vystavené světlu, malé, což může způsobit denaturaci krevních složek. Použití světelných vodičů o

může snížit ohřev na méně než opřibližně 2 C. Způsob může zahrnovat také případné použití teplotních čidel a chladicího mechanismu k udržování teploty pod hodnotami, při kterých se žádoucí proteiny v kapalině poškozují. S výhodou se udržuje

O B teplota přibližně 0 C až přibližně 45 C, výhodněji přibližně o c o

C až přibližně 37 C a nejvýhodněji přibližně 22 C.

Vynález se také týká systému pro zpracování kapalin k inaktivaci případně obsažených mikroorganizmů, který tvoří:

a) kontejner obsahující kapalinu a endogenní fotosensitizer nebo derivát fotosensiti žeru na endogenní bázi, přičemž je kontejner vybaven vtokem a má fotoprůchodný povrch postačující k vystavení obsažené kapaliny míře fotoradiace postačující k aktivaci fotosensitižeru,

b) alespoň jeden fotoradiační zdroj k zajištění dostatečného ozáření kapaliny v kontejneru typu a množství voleného k aktivaci fotosensiti žeru v podstatě k inaktivaci mikroorgan i zmú.

Zdrojem fotoradiace může být zdroj viditelného záření a/nebo ultrafialového záření. S výhodou se využívá viditelného i ultrafialového záření zvláště se používá přibližně poloviny viditelného a poloviny utrafi a1ového záření, ačkoli lze použít i jiných poměrů. Fotoradiace ve viditelné a ultrafialové části spektra může probíhat souběžně nebo odděleně, přičemž vidi teljako první. Zdrojem fotoradiace několik lamp zářících při různá část se s výhodou používá může být jednoduché lampa nebo ných vlnových délkách. Zdroj fotoradiace má být schopen vydávat přibližně 1 až nejvýše asi 120 J/cm² a viditelného světla je obzvlášť výhodná rem, ztrácejícím schopnost absorbovat viditelné světlo po ur čité době vystavení, je například 7, 8-dimethyl-10-ribityliso al1oxaz i n.

Směs ultrafialového když fotosensiti ze-

• · ·*»* • * · · ·· ·♦

Může se použít jakýchkoli prostředků pro přidávání fotosensitizerů do kapaliny, určené k dekontaminaci, a k převedení kapaliny do fotoprůchodného kontejneru známého v oboru, přičemž mezi takové prostředky patří průtočná potrubí, vstupy, zásobníky, ventily a podobná zařízení. Systém s výhodou zahrnuje prostředky jako jsou čerpadla nebo regulační ventily k řízení průtoku fotosensiti žeru do kapaliny, určené k dekontaminaci, takže jejich koncentrace může být účinně řízena, jak dále popsáno. Podle jednoho provedení se fotosensitizer směšuje s protisráž1 ivým prostředkem, zaváděným do krevního systému. U endogenních fotosensitizerů a derivátů majících cukrový podíl, je hodnota pH udržována dostatečně nízká jak je v oboru známo, k zabránění oddělení cukrového podílu. S výhodou se přidává fotosensitizer do kapaliny, určené k dekontaminaci, jako předem smíchaný vodný roztok, například jako vodný nebo zásobní pufrový roztok.

Fotoprůchodriým kontejnerem pro průtočný systém může být průsvitná kyveta z materiálu, jako je polykarbonát, sklo, křemen, polystyren, po 1yviny1chlorid, polyolefin, nebo z jiného průsvitného materiálu. Kyveta může být uzavřená v radiační komoře mající zrcadlové stěny. Prostředek podporující fotoradiaci, jako je druhý fotoradiační zdroj nebo odrazový povrch, může být umístěn vedle kyvety ke zvětšení míry fotoradiace přicházející do styku s kapalinou uvnitř kyvety. Systém má s výhodou čerpadlo k nastaveni průtočné rychlosti kapalíny na žádoucí úroveň k zajištění podstatné dekontaminace, jak shora uvedeno. Délka kyvety je koordinovaná s průtočnou rychlostí postačující k vystavení obsažené kapaliny dostatečné fotoradiaci k zajištění podstatné dekontaminace.

Výhodně se kyveta umísťuje od zdroje světla v dostatečné vzdálenosti, při které k zahřívání kapaliny v kyvetě nedochází, a světlo se přivádí ze zdroje do kyvety vodičem světla.

4· · • 4 44 • 4 • · • 4 ·♦·· Μ· «4 • 4 ·

• 9 « · • 4 ·· •

• 94 • 4 • 4 99

9 • · • · 9

9

9 • 4 • 9

9

9 • 4

Podle jednoho provedení je kapalina umístěna do fotopropustného kontejneru, jako je krevní sáček například používaný s apheresovým systémem popsaným v americkém patentovém spise číslo US 5 653887 a při vystavení fotoradiaci se míchá. Výhodnými sáčky jsou zde popisované sběrné sáčky. Obzvlášť výhodnými sběrnými sáčky jsou sáčky používané v systému Spectra™ nebo v apheresním systému Trima™ Cobe Laboratories lne. Natřásací stoly jsou v oboru známé a jsou popsané například v americkém patentovém spise číslo US 4 880788. Sáček je opatřen alespoň jedním vstupem pro vnesení kapaliny, Podle jednoho provedení se přidává do kapalinou naplněného sáčku fotosensi· tizer, s výhodou 7, 8-dimethyl-10-ribitylisoalloxazin, ve formě prášku. Sáček se pak umístí na natřásací stůl a obsah se míchá při fotoradiaci, dokud není v podstatě všechna kapalina vystavena fotoradiaci. Alternativně může být sáček už předem balen s obsaženým fotosensiti šerem. Kapalina, určená k dekontaminaci, se pak může přidat vhodným vstupem.

Dekontaminačni systémy, shora uvedené, mohou být konstruovány jako samostatné jednotky nebo mohou být snadno začleněny do stávajících zařízení, známých v oboru k separaci nebo ke zpracování krve odebírané a/nebo podávané pacientovi. Takovými přístroji pro zpracování krve systémy COBE Spectra™ nebo TRIMA^r jsou například apherezní (Cobe Laboratories lne., v americkém patentovéia

Lakevood, CO) nebo spise číslo US 5 zařízeni popsana

653887 a v přihlášce vynálezu číslo US 08/924519 (podaná 5. září 1997, PCT zveřejněná přihláška vynálezu číslo W099/11305) (Cobe Laboratories lne.) a aferezní systémy jiných výrobců. Dekontaminačni systém se může začleňovat přímo ve směru v místě, kde je krev odebírána od pacienta nebo dárce, těsně před dodáním krevního produktu pacientovi nebo v kterémkoliv místě před nebo za separací krevních složek. Fotosentizer se přidává do krevních složek spolu s protisrážlivých činidlem ve vhodném provedení a oddělené ozařovací zdroje a kyvety jsou umístěny ve směru od míst spojování ·« ·· ·· ·* • · · · · · · • · ··· · · · · ·· ·· ··· ·· * ···· ♦··· • ·· ·· ·· ·· ·· • · · ···· · pro destičky, plasmu a červené krvinky. Použití tří oddělených krevních dekontaminačnich systémů je výhodné k umístění jediného krev čisticího systému proti směru se zřetelem na separační nádobu pro krev apherezního systému, jelikož nižší rychlosti proudění v oddělených linkách složek umožňují větší snadnost ozáření. Podle jiných provedení mohou být použity dekoritam i načn í systémy podle vynálezu ke zpracování dříve shromážděných a uložených krevních produktů.

Jsou-li ve zpracovávané kapalině červené krvinky, s čímž se pracovníci v oboru setkávají, může se ke kompenzaci absorpce světla buňkami kapalina zředit, vystavit vyšším energiím záření po delší dobu, míchat delší dobu nebo vystavit radiaci v mělčích kontejnerech nebo přívodech, než je nutné pro použití s jinými složkami krve.

Endogenních fotosensitizerů a der i vat ivních zde popisovaných fotosensitizerů na endogenní bázi je možno použít ve známých dekontaminačnich systémech krevních složek, stejně jako v dekontaminačních systémech podle vynálezu. Například je možno použít endogenních fotosensitizerů a derivátů fotosensitizerů na endogenní bázi podle vynálezu v dekontaminačních systémech podle amerických patentových spisů číslo US 5 290 221, US 5 536238, US 5 290221 a US 5 536238.

Zahrnuty jsou také aditivní roztoky destiček obsahující endogenní fotosensitizery a deriváty fotosensitizerů na endogenní bází, shora popsané. K tomuto účelu je možno použít v oboru známých aditivních roztoků destiček včetně roztoků uvedených v amerických patentových spisech číslo 5 908742, US 5 482828, US 5 569579, US 5 236716, US 5 089146 a US 5 459030. Takové aditivní roztoky destiček mohou obsahovat roztok fyziologické solanky, pufr, s výhodou natriumfosfát a další složky včetně chloridu hořečnatého a glukonátu sodného. Hodnota pH takových roztoků je s výhodou přibližně 7,0 až přibližně 7,4.

Tyto roztoky se hodí jako nosiče koncentrátů destiček umožňujících udržovat kvalitu buněk a metabolismus během skladování, snižovat obsah plasmy a prodlužovat životnost při skladování. Fotosensitizery mohou být v takových roztocích obsaženy v jakékoli požadované koncentraci, od přibližně 1 uM až do rozpustnosti fotosensiti žeru v roztoku a s výhodou přibližně 10 uM až přibližně 100 uM, výhodněji přibližně 10 uM. Ve výhodném provedení obsahují aditivní roztoky destiček také pomocné složky jak shora popsáno. Výhodný aditivní roztok destiček obsahuje octan sodný, chlorid sodný, glukonát sodný, 1,5 mM chloridu horečnatého, 1 mil natr i umf osf átu, 14 uM 7,S-dimethyl10-ribityl -isoalloxazinu a s výhodou také 6 mři askorbátu.

Stručný popis obrázků

Na obr. 1 je absorpční spektrum riboflavinu, (Na ose x je vlnová délka v nanometrech a na ose y je absorbance.)

Na obr. 2 je vynesena závislost absorbance světla a hematokritu (RBC) pozorovaná a předpověděná pro červené krvinky a pro destičky. Čára s kolečky je pro pozorované RBC, se čtverečky pro předpověděné RBC a s trojúhelníčky pro předpověděné PLT. (Na ose x je hematokrit (RBC) nebo koncentrace PLT) a na ose y je vzdálenost v mikromretrech pro absorbanci 90 % světla. )

Na obr. 3 je znázorněno odbourání světlem riboflavinu v antikoagulačním roztoku kyselého citrátu dextrosy (ACD) v závis losti na čase. Plná čára značí procento počátečního ríboflavinu zbývajícího při 373 nm. Čárkovaná čára s čtverečky znamená procento počátečního riboflavinu zbylého při 447 nm. (Na ose x je doba ozáření v minutách a na ose y je procento zbytku počátečního riboflavinu.)

Na obr. 4 jsou znázorněny profily průsvitnosti různých plasto24 vých kyvet v závislosti na vlnové délce. Pevná čár představuje 3,2 mm akrylovou kyvetu. Tečkovaná čára představuje 3,2 mm UV akrylovou kyvetu. Čárkovaná čára představuje 3,2 mm polystyrénovou (PS) kyvetu a čerchovaná čára představuje 3,2 mm polykarbonátovou (PC) kyvetu. (Na ose x je vlnová délka v mikrometrech a na ose y je průsvitnost v procentech).

Na obr. 5 je vyznačen potřebný světelný tok v mW na cm³ v závislosti na rychlosti proudění, tedy tok potřebný k dodání jednoho joulu na cm³ vzorku v kyvetě. (Na ose x je rychlost proudění v mls/min a na ose y je požadovaný tok v mW/cm²).

Na obr. 6 je znázorněno zařízení k separaci krve s fotoradiaci podle vynálezu.

Na obr. 7 je dekontaminačni zařízení podle vynálezu.

Na obr. 8 je inaktivace bakterií v preparátech destiček pomocí vitaminu K5 jako fotosensitizeru v závislostí na energii ozáření. Čára s kosočtverečkem je pro S. aureus, se čtverečkem pro S. epidermidis, s trojúhelníčkem pro L. monocytogenes a s x pro E.coli. (Na ose x je energie ozáření v J/cm² a na ose y je log titru v cfu/ml),

Na obr. 9 je znázorněna inaktivace bakterií jako funkce preparátu destiček a energie ozáření za použití 90 % destiček a 10 % aditivního roztoku destiček (90=10) a 30 % destiček a se 70 % aditivního roztoku destiček (30=70). (Na ose x jsou staphykoky a na ose y je log inaktivace v cfu/ml. První sloupec na ose x se týká 90.10.80 J/cm³ a druhý se týká 30.70.30 J/cm².)

Na obr. 10 je znázorněn účinek inaktivace viru, bakteriofágu a bakterií přidáním antioxidantu do destičkového koncentrátu.(Na ose x jsou mikroorganismy a na ose y je logio inaktivace v cfu/ml. Plný sloupec se týká preparátu bez přísady, prázdný přísady askorbátu a vyčárkovaný přísady 10 mM chloridu draselného . )

Na obr. 11 je inaktivační křivka pro virus Herpes Simplex typu II jako funkce koncentrace fotosensiti žeru při energii ozáření 20 J/cnv³ při použití poloviny ultrafialového a poloviny viditelného světla. (Na ose x je koncentrace 7,8-dimethyl-10-ribi tylisoalloxazinu v uM a na ose y je log inaktivace v cfu/ml.)

Na obr. 12 je znázorněna inaktivace S. epideraidis při různých koncentracích fotosensiti žeru a při různých energiích ozáření. (Na ose x je koncentrace 7,8-dimethy1 - 10-ribi ty1 isoal1oxazinu v uM a na ose y je log inaktivace v cfu/ml.)

Na obr. 13 je znázorněna inaktivace mX174 při různých koncentracích fotosensitizeru a při různých energiích ozáření. Čára s kosočtverečkem je pro 0 mikromolární koncentrací, se čtverečkem pro 50 mikromolární koncentraci a s trojúhelníčkem pro pro 100 mikromolární koncentraci. (Na ose x ]e energie a na ose y je log inaktivace v cfu/ml.)

Na obr. 14 je znázorněna inaktivace S. aureus a iuX174 při různých energiích ozáření za použití směsi 50=50 ultrafialového a viditelného světla. Čára s kosočtverečkem je pro S. aureus, se čtverečkem pro tuX174. (Na ose x je celková dodaná energie (UV^J· VIS) a na ose y je log inaktivace v cfu/ml.)

Na obr. 15 je znázorněna inaktivace S. epidermidis a HSV-II při různých energiích ozáření za použití směsi 50=50 ultrafialového a viditelného světla. Čára s kolečkem je pro S. epidermidis, se čtverečkem pro HSV-II. (Na ose x je celková dodaná energie (UV+VIS) a na ose y je log inaktivace v cfu/ml.)

Na obr. 16 je znázorněna inaktivace viru HSV2 v míchaných krevních sáčcích a ozářených při různých úrovních energie. Čá26 ra s kolečkem je pro -askorbát, se čtverečkem pro +askorbát. (Na ose x je celková dodaná energie v J/cm² a na ose y je log inaktivace v cfu/ml.)

Na obr. 17 jsou shrnuty výsledky inaktivace viru vakcínie v různých kapalinách pomocí ultrafialového světla samotného nebo směsi 50 ^: 50 ultrafialového a viditelného světla. (Na ose x jsou složky krve= první dvojice sloupců platí pro nepřítomnost sensitizeru, druhá dvojice sloupců pro media, třetí dvojice sloupců pro destičky v mediu, čtvrtá dvojice sloupců pro destičky v mediu + 100 um 8-methoxypsoralenu a posloední dvojice sloupců pro plasmu + media a na ose y je log (TCIDso). Čtvereček- platí pro viditelné světlo, čtvereček* pro viditelné a ultrafialové světlo.)

Na obr. 18 jsou porovnány výsledky inaktivace se sensitizerem viru vakcínie a bez něho při různých dobách ozáření. Čára se čtverečkem je pro +10 mikromolární množství, s kosočtverečkem pro případ bez sensitizeru. (Na ose x je čas vystavení v minutách a na ose y je log (TCIDso).)

Na obr. 19 je porovnána inaktivace extrace1ulární HIV-1 při obsahu 5 uíl a 50 uíl f otosens i t izeru a při různých energiích ozáření. Čára s kolečkem je pro 5 mikromolární množství, se čtverečkem pro 50 mikromolární množství (Na ose x je energie vystavení v J/cm² a na ose y je log (TCID^o)·)

Na obr. 20 je porovnána inaktivace intrace1ulárni HIV-1 při obsahu 5 uM a 50 uíl fotosens i t izeru a při různých energiích ozáření. Čára s kolečkem je pro 5 mikromolární množství, se čtverečkem pro 50 mikromolární množství. (Na ose x je energie vystavení v J/cm² a na ose y je log (TCIDso). )

Na obr. 21 je porovnána inaktivace intracelulární HIV-1 při obsahu 5 uM a 50 uM fotosensitizeru a při různých energiích o• · · · • · • · záření za použití různých množství p24 antigenu. Čára s kolečkem je pro 5 mikromolární množství, se čtverečkem pro 50 mikromolární množství. (Na ose x je energie vystavení v J/cm² a na ose y je množství p24 antigenu v pg/ml.)

Na obr.22 je znázorněna inaktívace HSV-II při různých úrovních ozáření za použití koncentrátu destiček (PC) a koncentrátu destiček v mediu obsahujícím aditivní roztok destiček s askorbátem. Čára s kolečkem je pro 30:70 PC:media, se čtverečkem pro 90:10 PC:media. (Na ose x je energie (UV+VIS) vystavení v J/cm² a na ose y je log titru v pfu/ml.)

Na obr. 23 je znázorněno provedení vynálezu za použití krevního sáčku obsahujícího zpracovávanou kapalinu a fotosensitizer natřásací stůl k míchání kapaliny během vystavení fotoradiaci ze světelného zdroje.

Dekontaminačni způsob podle vynálezu za pomocí fotosensitizerů a derivátů fotosensitizerů na endogenní bázi je vysvětlen na příkladu použití 7,8-dimethy1 - 10-ribi ty1 isoa1Ioxazi nu jako fotosensiti žeru; může však být použito jakéhokoli fotosensitizeru, který je akt-i vovate 1 ný fotoradiaci k inaktivací mikroorganismů. Fotosensitizer musí být takového druhu, aby neničil žádoucí složky dekontaminované kapalíny a také výhodně druhu, který se nerozpadne v důsledku fotoradiace na produkty, které významně ničí žádoucí složky nebo jsou významně toxické. Délka vlny, kterou je fotosensitizer aktivován, se určuje jak zde popsáno, za použití zdrojů, známých z literatury nebo přímým měřením. Stanovuje se také rozpustnost fotosensi tizeru v kapalině, určené k dekontaminaci, nebo v kombinaci nosičové kapaliny s dekontaminovanou kapalinou. Schopnost fotoradiace při aktivační délce vlny pronikat do dekontaminované kapaliny musí být rovněž stanovena, jak zde uvedeno. Stanoví se vhodné teploty pro reakci fotosensitizeru se substrátem, stejně jako rozsahy teplot, intenzity a trvání fotoradiace a koncentrace fotosensiti žeru, které optimalizují mikrobiální inaktivaci a minimalizují poškozování proteinů a/nebo buněčných složek v kapalině. Příklady 1 až 7 a obr. 1 až 5 ukazují zjišťování potřebných informací k vyvinutí průtočného dekontaminační ho systému podle vynálezu.

Jakmile jsou určeny takové systémové požadavky pro průtočné systémy, mohou být určeny přístroje, které zaručí správné rychlosti proudění, fotopermeabi1 i ty a intenzity světla, které způsobí inaktivaci mikroorganismů obsažených v kapalině, jak je zde popsáno. Kapalina, určená k dekontaminaci, se smísí s fotosensitizerem a pak se ozáří dostatečnou měrou fotoradiace k aktivaci fotosensiti žeru k reakci s mikroorganismy v kapalině tak, že mikroorganismy obsažené v kapalíne se inaktivují. Míra fotoradiace, zasahující mikroorganismy v kapalině, se řídí volbou vhodného zdroje fotoradiace, vhodné vzdálenosti zdroje fotoradiace od dekontaminované kapaliny, která se může zvětšit použitím světelných vodičů k zavedení fotoradiace přímo do kontejneru pro kapalinu, volbou vhodného fotoprůsvitného materiálu kontejneru pro kapalinu, vhodnou hloubkou k zajištění plného proniknutí fotoradiace do kontejneru, podporujících prostředků fotoradiace jako je jeden nebo několik přídavných fotoradiačních zdrojů, s výhodou na opačné straně kontejneru od prvního zdroje, nebo reflektorů k odrážení světla ze zdrojů záření zpět do kontejneru, vhodných rychlostí proudění kapaliny v kontejneru a vhodnou délkou kontejneru k poskytnutí dostatečně dlouhé doby pro inaktivaci obsažených mikroorganismů. Teplotní monitory a regulátory teploty mohou být též potřebné k udržování kapaliny na optimální teplotě. Obr. 6 ukazuje dekontaminační systém podle vynálezu jako součást zařízení k oddělování krevních složek a obr. 7 ukazuje detaily výhodného dekontaminačního systému.

U systémů pracujících po dávkách je výhodné umístit dekontaminovanou kapalinu spolu s fotosensitzerem do sáčků, kte• to to • to • to to · ···· • to ·· • · to * • ·· · ré jsou fotoprůsvitné nebo alespoň dostatečně průsvitné k tomu, aby dostatečné ozáření zasáhlo jejich obsah k aktivaci fotosensi t i žeru . Do každého sáčku se přidá dostatek fotosensitizerů k zajištění inaktivace, s výhodou k zajištění koncentrace fotosensitizerů alespoň přibližně 10 uM a sáčkem se během ozařování míchá, s výhodou 1 až přibližně 120 J/cm² po dobu přibližně 6 až přibližně 36 minut k zajištění vystavení v podstatě veškeré kapaliny ozáření. S výhodou se používá souběžné o2áření viditelným a ultrafialovým světlem. Fotosensitzer může být přidán v práškové formě.

Způsob využívá s výhodou endogenních fotosensitizerů, včetně endogenních fotosensitzerů, které působí proti replikaci nukleové kyseliny. K použití podle vynálezu je výhodný 7,8dimethy1 - 1 O-ribi ty1 isoa11oxazin. Má se zato, že chemická reakce 7,3-diraethy1 - 10-ribi ty1 isoa11oxazi nu s nukleovými kyselinami neprobíhá procesem závislým na kyslíkovém singletu (například mechanismem typu II), ale spíše přímou interakcí systému sensitizer-substrát (mechanismus typu I). Cadet a kol. (J. Chem 23, str. 420 až 429, 1983) zřetelně ukázal, že účinky 7,8-dimethy1 - 10-ribityl isoalloxazi nu nejsou způsobeny oxidací guanosi nových zbytků kyslíkovým singletem. Kromě toho se jeví adenosinové báze jako citlivé na účinky 7,8-dimethyl-10-ribitylisoalloxazinu plus UV-světlo. To je významné, jelikož adenosinové zbytky jsou poměrně necitlivé vůči procesům závislým na kyslíkovém singletu. Zdá se, že 7,8-dimethyl-10-ribitylisoal loxazin nevytváří velká množství kyslíkového singletu při vystavení účinku UV-světla, ale spíše působí přímou interakcí se substrátem (například nukleovou kyselinou) reakcemi zprostředkovávanými elektrony s vybuzeným stavem sensitizerů. Jelikož je nevybíravé poškození buněk a proteinů působeno přednostně zdroji kyslíkového singletu, umožňuje tato mechanistická dráha působení 7, 8-dimethyl-10-ribitylisoalloxazinu větší selektivitu působení než sloučeniny jako jsou psoraleny, které mají významnou chemickou reaktivitu typu II.

Φ Φ » ·· Φ· ·· φφ • · · · · ♦ · ♦ « φ · • · · · · ·· φ · · · • · · ♦ φ φ φφφ «φ · φ · φ · φ · φφφφ φφφφ φφφ φφ ·Φ φφ φφ

Ha obr. 6 je zařízení pro úpravu krve a apheresní systém zahrnující fotoradiační zařízení podle vynálezu. Plná krev se od dárce/pacienta 4 odebírá a převádí se do apherezního systému nebo do zařízení 3 k separaci krevních součástí, kde se krev dělí na různé typy složek a alespoň jeden typ složek krve je ze zařízení 3 odstraňován. Tyto složky krve mohou být poskytnuty k následnému použití jinému příjemci nebo mohou byt podrobeny terapeutickému zpracování a pak vráceny dárci/pacientovi 4.

V zařízení 3 k rozdělování složek krve se krev odebraná dárci/pacientovi 4 vede mimotělním potrubním okruhem 10 a zpracovací nádobou, jakožto úplně uzavřeným a sterilním systémem. Zařízení 8 k rozdělování složek krve je spojeno ε čerpadlem pro krev (neznázorněno). Krev od dárce/pacienta 4 se převádí mimotělním potrubním okruhem 10 do rotující zpracovací nádoby 12. Krev uvnitř rotující zpracovací nádoby Í2, je rozdělována na různé typy krevních složek a tyto typy složek (destičky, plasma, červené krvinky) se kontinuálně z rotující zpracovací nádoby 12 odvádějí. Složky krve, které se nesbírají ke shromažďování nebo pro terapeutické zpracování (například červené krvinky, bílé krvinky, plasma) se také z rotující zpracovací nádoby 12 odvádějí a vracející se dárci/pacientovi 4 mimotělním potrubním okruhem 10.

S výhodou je činnost zařízení k oddělování složek krve řízena jedním nebo několika procesory zařazeného počítače.

Mimotělní potrubní okruh 10 zahrnuje kazetovou sestavu 14 a řadu potrubních navzájem propojených jednotek, kterými jsou odběrová/vratná potrubní sestava 20, protisrážlivá potrubní sestava 50, první potrubní podsestava 60, potrubní sestava 80 pro destičky, sběrné potrubí 90 pro plasmu a druhá potrubní podsestava 100. Krevní odběrová/vratná potrubní sestava 20 je jednojehlovou vloženou sestavou mezi dárcem/pacientem 4 a ka31 * · » ♦» ·· 44 44 ···· · · · · « · + • 4 4 4 4 4· 4 44 4 « 4444 4444

4444 44« 44 ·4 44 44 zelovou sestavou 14 a první potrubní podstestava 60 vstupu krve/krevní složky tvoří vloženou sestavu mezi kasetovou sestavou 14 a rotující zpracovací nádobou 12. Protisráž1 ivá potrubní sestava 50, potrubní sestava 80 pro destičky, sběrné potrubí 90 pro plasmu, sběrná potrubní sestava 70 shromažďující červené krvinky a druhá potrubní podsestava 100 odvětrávaci ho sáčku 104 jsou také propojeny s kasetovou sestavou 14.

Krevní odběrová/vratná potrubní sestava 20 zahrnuje s ní spojenou jehlovou podsestavu 30 a protisráž1 ivé potrubí 26 připojené na protisráží ivou potrubní sestavu 50 prostřed nictvím kazetové sestavy 14.

Kazetová sestava 14 sestává z čelní a zadní přívařené plastové destičky, které jsou spolu svařeny za tepla a vymezují čtverhrariý kazetový člen mající integrální průchody. Kazetová sestava 14 zahrnuje dále řadu vzhůru směřujících potrubních smyček spojujících různé integrální průchody. Integrální průchody jsou také připojeny k různým potrubním sestavám.

Specificky je kazetová sestava 14 spojena s pot i sráží i vým potrubím 26 krevní odběrová/vratné potrubní sestavy 20 a s protisráž1 ivou potrubní sestavou 50. Proti sráží ivá potrubní sestava 50 zahrnuje komůrku 52 s kapacím bodcem spojovatelnou se zdrojem 53 proti ráž1 ivého činidla a fotosensitizerem a se ster i 1 izačnim filtrem 56. Při použití protisrážlivá potrubní sestava 50 dodává protisráž1 ivé činidlo smísené s fotosensitizerem do krve odebírané dárci/pacientovi 4 ke snížení nebo prevenci jakéhokoli srážení v mimotělním potrubním okruhu 10. V oboru je známo mnoho protisrážlivých činidel (například kapitola 3 AABB Technical Manual, 11. vydání, 1993) včetně ACDA, CPD, CP2D, CPDA-1 a heparin. Tato činidla spolu s roztoky AS-1, AS-3 a AS-5 pro uchovávání buněk jsou všechna kompatibilní s endogenními fotosensitizery a s deriváty zde popisovaných fotosensitizerů na endogenní bázi.

• · • · • * • ♦ ·« • ·

Kazetová sestava 14 je také propojena s krevní odběrovou/ vratnou potrubní sestavou 20. Krev prochází tlakovým čidlem a vstupním filtrem kazetové sestavy 14 a pak do vstupního potrubí 62. Vstupní potrubí 62 je také propojeno s rotující zpracovací nádobou 12 k zavedení plné krve ke zpracování.

K navracení oddělených krevních složek do kazetové sestavy 14 zahrnuje první potrubní podsestava 60 vstup systému krev/krevní složky výstupní potrubí pro systém červené krvinky (RBC)/plasma, výstupní potrubí pro destičkay, výstupní potrubí pro plasmu propojené s odpovídajícími výstupy ve zpracovací nádobě 12. Výstupní potrubí pro systém červené krvinky (RBC)/ plasma převádí oddělený systém červené krvinky (RBC)/plasma kazetovou sestavou 14 do sběrné potrubní sestavy 70 pro červené krvinky prvním dekontaminačnim systémem 72. Výstupní potrubí pro destičky zavádí oddělené destičky kazetovou sestavou 1 4 do potrubní sestavy 80 pro destičky druhým dekontaminačním systémem 82. Výstupní potrubí pro plasmu zavádí oddělenou plasmu kazetovou sestavou 14 do sběrného potrubí 90 pro plasmu třetím dekontaminačním systémem 92. Po ozáření v prvním dekontaminačním systému 72, ve druhém dekontaminačním systému 82 a ve třetím dekontaminačnim systému 92 k aktivaci fotosensiti ze ru a k inaktivaci obsažených mikroorganismů, se krevní složky shromažďují v prvním sáčku 74 na červené krvinky, ve druhém sáčku 84 na destičky a ve třetím sáčku 94 na plasmu, Odvětrávací sáček 104 může sloužit k odvětrávání plynů uvnitř systému.

Obr. 7 ukazuje samostatnou versi dekontaminačni ho zařízení podle vynálezu. Krevní produkt 180 (kterým může být dříve shromážděná krev nebo složky krve nebo skladovaná krev) se spojí s potrubím 186 krevního produktu, které vede čerpadlem 184 do dekontaminační kyvety 164. Zásobník 166 fotosensiti žeru je spojen se vstupním potrubím 168 opatřeným vstupním čerpadlem 170 a vede do potrubí 186 krevního produktu ve směru proudění z dekontaminační kyvety 164. Dekontaminační kyveta 164 je * ·

·· Φ· ·· ·· • 99 9 9 9 9

9 9 99 9 99 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 · • · · · 9 9 9 9 • ·· »· 99 99 ΐotoprůsvitná kyveta s hloubkou (d) a délkou (1) zajišťující dekontaminaci. Chladicí systém 190 spojený s teplotním monitorem 192 jsou spojeny s dekontaminační kyvetou 164 k řízení teploty kapaliny. Dekontaminační kyveta 164 je spojena světelným vodičem 162 s fotoradiačnim zdrojem 160. Pomocné fotoradiační zařízení 163 je umístěno vedle (v dotyku nebo odděleně) dekontaminační kyvety 164 ke zvětšení míry fotoradiace zasahující krevní produkt v kyvetě. Potrubí 188 dekontaminovaného krevníého produktu vede z dekontaminačni kyvety 164 do sběrné mádoby 182 na dekontaminovaný krevní produkt.

2a provozu se zavádí krevní produkt 180 do potrubí 186 krevního produktu, kde se spojí s fotosensitizerem ze zásobní ku 166 fotosensitižeru prouděním rychlostí řízenou vstupním čerpadlem 170 fotosensitizeru v přívodním potrubí 68 fotosensi t izeru, které spojuje potrubí .186 krevního produktu. Rychlost proudění v potrubí krevního prodkuktu 186 je řízena čerpadlem 18.4 k zaručení dekontaminace v dekontaminační kyvetě 164. Teplotní monitor 192 měří teplotu kapaliny v dekintaminační kyvetě .164 a řídí chladicí systém 190, který udržuje teplotu v kyvetě v rozmezí potřebném pro optimální provoz. Krevní produkt v dekontaminační kyvetě 164 se ozáří fotoradiací z fotoradiačního zdroje 160 vedenou světelným vodičem 162. Zdrojem fotoradiace může být dva nebo několik jednotlivých světel. Šipky znázorňují fotoradiaci z konce světelného vodiče 162 pronikající do krevního produktu uvnitř průsvitné dekontaminační kyvety 164. Vedle dekontaminační kyvety 164 je pomocné fotoradiační zařízení 163, což může být další zdroj fotoradiace nebo odrazový povrch. Šipky od pomocného fotoradiačního zařízení 163 směřují k dekontaminační kyvetě 164 a vyznačují fotoradiaci z pomocného fotoradiačního zařízení 163 svítícího na materiál krevního produktu v dekontaminační kyvetě 164 potrubím dekontaminovaného krevního produktu. Dekontaminovaný krevní produkt opouští dekonataminační kyvetu 164 potrubím 188 dekontaminovaného krevního produktu a shromažďuje se ve sběrné • X • X •

X

X χχχχ

X Χ« XX

XX X XX

X XX χχχ

X «χ XX χ χχχ

XXX XX XX

XX XX

X * X X

X XX χ

XX XX χ

X XX χ

XX XX nádobě 182 dekontaminovaného krevního produktu.

V jednom provedení je použito 7,8-dimethyl-10-ribitylisoalloxazinu (společnosti Sigma Chemical Company) jako fotosensitizeru a světelného zdroje (společnosti EFOS Corporation, Wi 11 iamsvi11e, N.Y.) sestávajícího z optických vláken. Systém je schopen dodávat soustředěný paprsek světla o intenzitě 6200 mW/cm² v oboru 355 až 380 nm. Je možno použít v systému též výměnných filtrů k dosažení výkonu 4700 mW/cm² v oblasti spektra 400 až 500 nm. V obou případech je záření v oboru 320 nm a nižším zanedbatelné. Systém poskytuje světelmé vodiče různých rozměrů (3,5 a 8 mm). Světlo vystupuje z konce světelného β

vodiče v rozptylu 21 Vhodný je světelný vodič 8 mra správně umístěný k přiměřenému osvícení čela vhodné dekontami načni kyvety, což je standardní kyveta použitá na Cobe Speetra^R vhodných sadách (společnosti Industrial Plastics,Inc. Foprest Grove, 0R).

Rychlost proudění je řiditelná a je určována množstvím světelné energie dodávané do vzorku. Rychlost proudění se řídí per i sta 1tickýffl čerpadlem (společnosti Cole-Palraer Instrument Company, Vernon Hills, IL). Rychlosti proudění a typ vstupního proudu se mohou řídit pomocí počítačového procesoru známého v oboru.

Na obr. 23 je znázorněno provedení podle vynálezu, kde kapalina určená k dekontaminaci je umístěna do krevního sáčku 284 opatřeného vstupem 282, kterým se vnese fotosensitizer 284 v práškové formě z baňky 286 násypkou 288. Natřásací stůl 280 je aktivován k míchání sáčku 284 k rozpuštění fotosensitižeru 290, zatímco je aktivován fotoradiační zdroj 260 k ozáření kapaliny a fotosensitizeru v sáčku 284. Alternativně může být sáček předběžně připraven s obsahem fotosensiti žeru a kapalina se do sáčku vpraví dodatečně.

··· ·

• · ·

9 9

99

Způsoby podle vynálezu nevyžadují použití podporujících prostředků jako zhášedel nebo kyslíkových lapačů, může se jich však použít k podpoře procesu snížením rozsahu chemického poškození nespecifické buňky nebo proteinu nebo k podpoře inaktivace patogenů. Další výhodné způsoby používající netoxických endogenních fotosensitizerů a derivátů fotosensitizerů na endogenní bázi nevyžadují odstraňování fotosensitizerů z kapaliny po fotoradiaci. Výsledky zkoušek vykazují malé nebo nevykazují žádné poškození jiných složek krve, například destičky zůstávají biologicky aktivní pět- dní po zpracování.

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení. Procenta jsou míněna hmotnostně, pokud není uvedeno jinak.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Absorbační profil 7,8-dimethyl-10-ribitylisoalloaxazinu

Používá se vzorku 7,8-dimethy1 - 10-ribi ty1 isoal1oaxazi nu (čistota 98%) (společnost Sigma Chemical Company). Část tohoto vzorku se podrobí analyse pomocí řádkovacího UV-spektrofotometru. Studovaná oblast je 200 až 900 nm. K analyse se vzorek rozpustí v destilované vodě. Spektrum vzorku z této analysy je na obr.l. Výsledky jsou konsistentní s údaji v literatuře pro maximální absorbanci a extinkční koeficienty pro 7,8-dimethyl10-r i b i tyl i soal1oaxaz i n.

Lambda max z literatury Naměřená lambda max.

267 (32,359)

373(10,471) 447(12,303)

222 (30,965) 265 (33,159) 373(10,568)

445(12,466)

*9 9 • 9 9 9 • 9

9

9

9999 999 »· 99 ♦ 9 9 • 9 999

9 9 9

9 9

99

Příslušné vlnové délky pro ozáření jsou 373 a 445 nm. Pozorované extinční koeficienty při těchto maximech absorbance jsou postačující k zajištění přiměřené aktivace sensitizeru v roztoku.

Příklad 2

Rozpustnost

Rozpustnost

7,3-dimethyl-10-ribitylisoal1oaxaz i nu v isolytu S, prostředí s pH 7,4

Max i máln i v isolytu S rozpustnost se zj išťuje

7,8-dimethyl-10-ribityli soal1oaxaz i nu takto:

7,8-Dimethyl-10-ribitylisoalloaxazin se mísí s isolytem S dokud se vytváří sraženina. Směs se míchá po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti a míchá se k zajištění úplného rozpuštění suspendovaného materiálu. Přidá se další 7, 8-dimethyl- 10ribitylisoalloaxasin dokud zůstává pevná sraženina přes další vířivé míchání. Tato suspense se pak odstředí k oddělení nerozpuštěného materiálu. Supernatant z této přípravy se vyjme a analyzuje se pomocí spektrometru. Hodnoty absorbance roztoku se stanoví jako 447 a 373 nm. Z extinkčích koeficientů, ktré byly určeny předem, je možno stanovit koncentraci nasyceného roztoku.

Koncentrace (373) = 110 uM = 42 Lig/ml

Koncentrace (447) = 109 uM = 40,9 yg/ml

Rozpustnost v antikoagulantu ACD-A

Tentýž postup se opakuje pomocí antikagulantu ACD-A. Získané hodnoty z těchto měření jsou:

Koncentrace (373) = 166 yM = 63 yg/ml Koncentrace (447) = 160 uM = 60,3 ug/ml

Hodnoty získané z tohoto měření udávají horní mez rozpustnosti sloučeniny, kterou lze očekávat.

φφ φ φφφφ φ • φ · • φ φ * φφφ φφφφ φφφ φφ φφφφ • * φ ♦ φ φ φ φφφ φ φ· φ φφ φφφ φφ φ φφφ φφφφ φφ φφ φφ

Pčíklad 3

Fotodekomposice 7,8-dimethy1 - 10-ribi ty1 isoal1oaxazinu ve vodném prostředí

Roztok 7,8-dimethyl-10-ribitylisoalloaxazinu v Sigma ACD-A se připraví v koncentrací 63 ug/ml. Tato příprava se provádí ve skleněné pipetě a roztok se vystaví působení paprsku ze zdroje UV-světí a (lamda max. 365 nm s odfiltrováním světla pod 320 nm). Suspense se ozařuje ve stanovených intervalech, při kterých se odebírají podíly pro spektroskopickou analysu. Absorbance rozpuštěného 7,8-dimethyl-10-ribitylisoalloaxazinu se monitoruje při 373 a 447 nm v každém časovém intervalu. Výsledky jsou na obr. 3 a v tabulce I.

Tabulka I

Fotodekomposice 7,8-dimethyl-10-ribitylisoalloaxazinu po vystavení účinku UV-světla (365 nm) v kyselém roztoku

Doba ozáření % počátečního 373 nm % počátečního 447 nm

O 100 100

87,3 61,6

90,5 76,6

100 70

Absorpční profil roztoku při 373 nm naznačuje, že během celé periody ozáření nedošlo k významnému rozkladu reakčního činidla. Absorbance světla při této vlnové délce odpovídá η-ρίχ přenosu elektronů. Chybějící pokles intenzity při tomto vrcholu v čase znamená, že cyklická struktura molekuly je nedotčena přes prodloužené ozařování za těchto podmínek. Absorbance molekuly při 447 nm je způsobena pí-pí* přenosů stavu e• to • · • · • · • · · · to · · ·* toto to toto • · to·· ·· ·· · • to · to ·· ♦· ·· ·· • to· · • ·· · ·« ·· · • · · · • to ·· lektronů, Pokles absorbance molekuly při této vlnové délce s rostoucí dobou ozařování je indikativní pro mírné změny v rezonanční struktuře molekuly. Změna je nanejvýš pravděpodobně způsobena ztrátou ribosového tvaru cyklické struktury kostry 7,8-dimethyl- 10-isoalloaxazinu a jako výsledek tvoření 7, 8-dimethylalloaxazinu. Tyto změny jsou konsistentní s údaji v literatuře týkající se chování molekuly ozařované UV-světlem

Zjevně chybějící rozklad cyklicklé struktury molekuly je v silném kontrastu s pozorováními se sloučeninami na bázi psoralenu za podobných podmínek. Během ozařování se pozoruje výrazná fluorescence molekuly v roztoku. Toto chování molekuly je konsistentní s rezonančními jevy cyklické struktury a poskytuje prostředky k disipaci energie ve vybuzeném stavu molekuly v nedestruktivním způsobu.

Př i k1 ad 4

Vyhodnocování průtočného systému

Vlastnosti transmise světla kyvety se stávajícím spektrem

Stávající kyveta je z polykarbonátu. Vlastnosti průchodu světla této kyvety se měří při 373 a 447 nm umístěním kyvety do paprsku světla UV-spektrofoboraebru. Získané hodnoty:

Vlnová délka světla % průchodu

373 nm 66 %

447 nm 80 %

Tyto výsledky jsou konsistentní s údaji v literatuře pro po1ykarbonátové plasty (obr. 4). Hodnoty v literatuře udávají strmý pokles průchodu světla polykarbonáty v oboru 300 nm. Pro obor 350 nm jsou vlastnosti průchodu světla pro tyto aplikace přiměřené.

·· ·« ·· ·*

9 9 9 9 9 9 • 9 999 9 99 » • · 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

99 99 99

Požadavky na světelný tok vypočtené jako funkce rychlosti prouděn i

Aby byl průtočný systém proveditelný, musí být vzorek opatřen přiměřeným tokem světla během jeho přítomnosti v dráze paprsku. Jestliže navrhovaná spektrální kyveta vyhovuje tomuto účelu, je pak možno stanovit požadavky na světelný tok v závislosti na rychlosti proudění kyvetou takto:

Objem roztoku obsaženého v ozařovací zóně kyvety je přibližně 0,375 ml. Dobu průchodu buňky v této oblasti kyvety je možno vypočítat z rovnice objem kyvety (ml)

T =-průtočná rychlost (ml/min)

Při 100 ml za minutu by doba průchodu (T) byla 0,00375 min = 0,225 sekund.

Energie, které je vzorek vystaven závisí na toku podle následující rovnice:

Tok (fí, mW/cm²)x Čas (T.sec.)

Energie (E, Joul/cm²) =

1000

Jestliže se předpokládá, že 1 Joul/cm² je nutný k přiměřené aktivaci sensitizeru a transitní doba (T) je 0,22 sekund (tedy průtočná rychlost 100 ml/min kyvetou), pak je požadovaný tok během průtoku vzorku kyvetou 4545 mW/cm². Graf znázorňující závislost požadovaného toku ze zdroje světla a rychlosti proudění kyvetou je na obr. 5.

Tyto výsledky ukazují, že k tomu, aby systém správně pracoval, jsou potřebné zdroje UV světla s výkonem v oboru Watů/cm².

9 999 • 9 9 9 9

99

9 9

9 9 9

99

99

9 9 9

9 9 · • · · · • · · ·

99

Obr. 2 ukazuje jak se má absorbance měnit s koncentrací destiček.

Příklad 5

Absorbance červených krvinek

K vyhodnocení míry, jak muže UV-světlo proniknout vzorkem červených krvinek, a účinku tloušťky vzorklu a hematokritu na míru pronikání světla, bylo provedeno několik předběžných pokusů za použití chemické aktinometrie a způsobu ke stanovení aktuální míry intenzity světla vyzářeného ze zdroje měřením schopnosti a rozsahu, kterým může absorbované světlo ovlivnit chemickou reakci. K těmto studiím bylo použito roztoku ferrioxalátu ke změření intenzity zdroje v poměru k intenzitě pozorované pro vodu. Podrobnosti chemické reakce a způsobů použitých k přípravě vzorků popsali Gordon A.J. a Ford R.A. (The Chemist s Companion: A Handbook of Practical Data, Techniques and References, John Wiley & Son, str. 362 až 368, 1972).

Vzorky oxalátu železitého se připraví ve zkoušeném materiálu (voda nebo krevní produkt s různým hematokri tem červených krvinek) v koncentraci 0,15 M. Tyto vzorky se pak naplní do kyvety standardního spektra a vloží se do ozařovací sestavy. Vzorky se vystaví působení světla po předem stanovenou dobu odpovídající úrovni požadované dávky energie (1 J/cm²).

Vzorky se vyjmou a množství konverze Fe³⁺na Fe²⁺ se stanoví odečtením absorbance zkušebního vzorku v roztoku 1,10-fenanthrolinu při 510 nm (Gordon A.J. a Ford R.A.) Vyšši hodnoty absorbance znamenají větší pronikání světla do vzorku. Pozorovaných hodnot absornance pro vodu po exposici na 1 J/cm² UV záření bylo použito jako úrovně 100% průsvitnosti. Všechny hodnoty pro vzorky červených krvinek se stanoví v poměru k tomuto standardu.

ί • · · «φ φ φ φφ φφ • · · · · · « φφφφ • · II ΦΦΦ 9 4 4 9 • · Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ *

Φ Φ φφφφ φφφφ

ΦΦΦΦ ΦΦΦ φφφφ φφ φφ

Tabulka II

Čtení absorbance po vystavení vzorků 1 J/cm³ světlu UVA. Všechny průměrné hodnoty představují střed ze 6 měření. Hodnoty % průsvitnosti jsou vypočteny v poměru k vodným vzorkům.

Absorbance 510 nm	Průměr	Směrodatná odchylka	% průsvitnosti	Směrodatná odchylka
voda	2, 40	0, 04	100	0, 0
RBC, 1,3% Hematokri t	2, 40	0, 10	99, 5	4, 8
RBC, 3,7% Hematokr i t	1,46	0, 38	60, 6	15, 4
RBC, 5,07% Hematokr i t	0, 20	O, 26	8,3	10, S
RBC, 6,0% Hematokr i t	0, 13	0, 09	5, 2	3, 9
RBC, 10,2% Hematokr i t	0, 23	0, 19	9, 7	7,9
RBC, 16,3% Hematokr i t	0, 25	0, 11	10, 4	4, 6
RBC, 21,8% Hematokr i t	0.09	0, 06	3, 6	2, 6
RBC, 80,2% Hematokr i t	0, 01	0, 1 1	0, 3	4, 4

S použitím těchto hodnot je možno vypočíst penetrační hloubku UV-světla podle Beerova zákona <A=»bC).

Z Lambertova zákona, absorbance = Log(1/transmi tance)

• · ·	4 4	4 4	44	44
• 4	4 4	4	•	4	4	•	4
4	•	4	4	494	4	4	•	«
4	4	4	4	4 4	4	4	4	4
• 44«	4 4 4	44		4 4		4 4	44

Necháme-li koncentraci (C) rovnou hematokritu vzorku a jelikož b = 0,3 cm (délka dráhy spektrální kyvety), je možno určit pseudoextinkční koefient pro vzorek (w ) vynesením hodnot absorbance pro vzorky červených krvinek v závislosti na hematokritových dobách produktu délky dráhy. Extinční koeficient pro vzorky představuje sklon této čáry.

Tabulka III

T	B	HCT	BxHCT	absorbance log(l/T)	»
0, 995	0, 3	1,3	0 , 39	0, 02	. 0051
0, 606	0, 3	3,7	1,11	0, 218	. 196
0,0525	0, 3	6	1 , s	1,280	. 71
0, 097	0,3	10, 2	3,06	1,013	. 33
0, 104	0, 3	16, 3	4, 89	0, 983	. 20
0, 036	0,3	21,8	6, 54	1,444	. 22
0, 033	0, 3	80, 2	24, 06	2, 481	. 10

Za použití shora popsaných hodnot je mošno stanovit pseudoextinční koeficient pro tyto vzorky jako 0.08661.

Hodnota extinčního koeficientu umožňuje výpočet penetrační vzdálenosti UV-světla do vzorků červených krvinek jako funkci hematokritu vzorku. K tomuto stanovení se určí penetrační hloubka vzorku při které je absorbováno 90 % dopadajícího světla z následující rovnice:

A = wbC, kde A = 1 (90% absorbance dopadajícího světla), ra = 0,08661, C = hematokrit vzorku, b = délka dráhy.

Výsledky, získané pomocí aktinometrie, se porovnají s výsledky dříve vypočtenými pomocí odhadů ze spektrometrických φ*

9

999

9 9 9

9 9

99 * ·

99

9 9 9

9 9 9

9 9 9

9 9 9

99 měření absorbance světla ve vzorcích červených krvinek a ve vzorcích destiček.

Na obr. 2 je absorbance a změny vzdálenosti od zdroje záření pro červené krvinky porovnáním předpověděných a pozorovaných hodnot. Tyto výsledky naznačují, ze u vzorků s hematokritem v oboru 80 %, je mošno za použití výhodného uspořádání podle vynálezu zavést světlo do hloubky vzorku 0,14 cm. To představuje šířku dráhy toku menší než polovinu šířky běžné spektrální kyvety.

Příklad 6

Účinky inaktivačni ho zpracování viru na parametry destiček in vitro

Vyhodnotí se účinky inaktivačního zpracování viru na parametry destiček in vitro. Preparáty destiček se zpracují 7,8ditnethyl -10-isoal loaxasinem v kombinaci s UV-světlem. Jako monitorů funkce destiček se použije různých parametrů in vitro ke zjištění rozsahu změn vyvolaných podmínkami zpracování. Zkoumají se faktory jako energetická úroveň vystavení UVsvětlu, použitá dávka 7,8-dimethyl- 10-isoalloaxazinu a podmínky zpracování vzorku z hlediska jejich dopadu na kvalitu destiček po zpracování. Výsledků této studie se použije k určení vhodného zpracovacího okna pro inaktivaci HIV-1 bez narušení funkce destiček.

Vzorky se připraví se třemi různými koncentracemi 7,8-dimethyl- 10-isoalloaxazinu. K těmto studiím se použijí destičky získané z kolekce standardní Spectra LRS.

Napřed se vzorky odstředí k získání pelety destiček. Pelety se resuspenduji v roztoku 70-30 (Isolyte S, pH 7,4; (McGaw, lne. Media-plasma). Ve směsi plasma-media je 7,8-dimet44 *· ·· ·♦ ·· * · · · · · ♦ • · ··· · « · · »· * · ·»· · · 9

9 9 9 9 9 9 9

99 99 99 99 hyl-10-isoalloaxasin obsažen ve specifikovaných koncentracích. Suspense destiček se pak nechá procházet komůrkou s UVzářením jednou ze tří průtočných rychlostí. Průtočné rychlosti se přímo přizpůsobují energetické úrovni exposice pro systém buňka/prostředi, které prochází ozařovací komůrkou. Po průtoku ozařovací komůrkou se vzorky uskladní ve sběrném sáčku změkčeném citrátem k další analyse.

Po ozáření se vyhodnotí měřením in vitro funkce destiček, včetně odezvy na hypotonický šok (HSR), expresi GMP-140, hodnoty pH, pC02, pOz, vír destiček a secí tání buněk ke zjištění účinků zpracovacího postupu na kvalitu buněk.

Kvalita destiček se sleduje v závislosti na podmínkách ozáření (koncentraci sensitizeru a hodnot průtočná rychlost/energie). Kvalita destiček zahrnuje parametry. jako odezvu na HSR a aktivaci GMP-140. Studované průtočné rychlosti mohou být ve vztahu k energii vystavení podle rovnice

0,375 ml

Doba průtoku(T.s) = doba exposice = (F/60)

F = průtočná rychlost (ml/min)

0,375 ml = objem kyvety (ml)

T(s) = Fr

Tok( iu, mW/cm³) *T( sec)

Energie (J/cm²) =

1000 iu*0, 022

F_r

9999 9 ·· ·· ·· ·· * 9 9 9 9 9

999 9 99 9

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

99 99 99

Vyhodnotí se účinek energie exposice UV a koncentrace 7,8dimethyl-10-ribitylisoalloaxazinu na stabilitu a životnost zpracovaných destiček. Vyhodnotí se tři hodnoty energie a tři hodnoty koncentrace·

Hodnoty energie: i, 5, 9 J cm² χ

Koncentrace 7,8-dimethyl-10-ribitylisoalloaxazinu: 1, 50, 100

UÍjx χ χ Hodnoty celkové exposice energii se stanoví průtočnou rychlostí suspense ozařovací komůrkou podle konversní tabulky IV xx Jelikož medium je zředěno 70 = 30 (médi um = plasma), nastaví se příslušně zásobní koncentrace 7,8-dimethy1 - 10-ribi ty1 isoa1 loaxazinu v samotném mediu před smísením s plasmou. To vyžaduje výchozí koncentrace v Isolytu S 1,43; 71,4; a 143 uíl

Tabulka IV

Hodnoty exposice energii v závislosti na rychlosti proudění označovací komůrkou

Dodaná energie (J/cm2)	Průtočná rychlost (ml/min)	Doba zpracování 20 ml (minut)
1	16, 90	1 , 18
2	8,45	2, 37
3	5, 83	3, 55
4	4, 22	4, 73
5	3. 38	5, 92
6	2, 82	7, 10
7	2, 41	8, 29
8	2, 11	9, 47
9	1,88	10, 65
10	1,69	11,84

Tok

3640 mW/cm², objem komůrky = 0,117 ml.

φ* φφ »* ·· • · 9 9 9 9 • ΦΦΦ φ Φ φ Φ

ΦΦ ΦΦΦ φφ φ ► ΦΦΦ φφφφ 99 φφ φφ 99

Hodnoty zpracovaných vzorků se porovnají s kontrolními vzorky včetně= nezpracovaného vzorku v plasmě (historická kontrola) + průtok-UV 7, 8-dimethyl-10-ribitylisoalloaxazinu

Postup

Normální donorový apheresní produkt destiček se získá od akreditované krevní banky AABB. Vzorek se shromáždí standardním způsobem Spectra LRS. Veškeré dále popsané manipulace a postupy se provádějí standardními laboratorními bezpečnými postupy a způsoby. Zaznamená se číslo jednotky a typ krve. Všechny vzorky se použijí v době 24 hodin od shromáždění. Následuje aseptický postup u všech stupňů přepravování a zpracování vzorku.

Vzorek se přemístí do 500 ml přepravního balení z PVC a odstřeďuje se 5 minut při 5000 g ke zhuštění destiček. Plasma se z pelety destiček odebere pomocí standardního plasmového lisu. Plasma se uchová k dalšímu použití. Plasma odebraná z pelety buněk se smísí se zásobním roztokem isolytu S, hodnota pH 7,4 (McGaw, lne.). Tento zásobní roztok media se upraví přidáním předem určeného množství 7,8-dimethyl-10-ribitylisoal loaxazinu do isolytu S k dosažení konečné koncentrace 1,43; 71,4; a 143 uM. Po přidání 7,8-dimethyl-10-ribitylisoalloaxazinu se zásobní roztok zfiltruje přes sterilní filtr 0,22 uM. Zásobní roztok se pak smísí s autologovou plasmou v objemovém poměru 70 = 30 k dosažení koncentrací 7,8-dimethy1 - 10-ribi ty1 i soalloaxazinu 1,50 a 100 uM. Během přípravy zásobního roztoku 7, 8-dimethy1 - 10-ribity1 isoalloaxazinu se pečlivě zabraňuje vystavení účinku světla. Připraví se tyto vzorky:

uM 2 vzorky

100 uM 2 vzorky uM 1 vzorek.

4?

• « * ·

• · ♦ ·· ··· to to • · to · • · ··

Peleta destiček se resuspenduje v systému plasma:medium na původní objem výchozího vzorku. Vzorek se připojí k průtokovému přístroji obsahujícím kontejner pro buňky a fotosensitizer, kontejner pro medium, přičemž jsou tyto kontejnery spojeny potrubím s ventily do jediné linky pro směs buněk se sensitizerem a mediem a přístroj je vybaven čerpadlem. Směs buněk se sensitizerem a mediem protéká do kyvety na držáku se zrcadlovou stěnou ozařovanou zrojem světla. Tato ozařovací komůrka je vybavena teplotním čidlem. Po průchodu kyvetou se kapalina shromažďuje v sáčku produktu.

Sestava potrubí se napřed propláchne mediem Isolyte S.

Pět minut před spuštěním průtoku zkušebního vzorku se zapne zdroj světla. Během té doby se sleduje teplota a udržuje se pod 32 C v ozařovací komůrce.

Průtočná rychlost vzorku ozařovací komůrkou se stanoví podle tabulky IV. Použijí se průtočné rychlosti zajištující celkovou ozařovací energii 1,5 a 9 J/cm² podle následujícího programu:

zkouška číslo 1: Koncentrace 7,8-dimethyl-10-ribitylisoal loaxazinu = 1 nM

A. +7,8-dimethyl-10-ribitylisoalloaxazin+ 1 J/cm²

B. +7,8-dimethyl-10-ribitylisoalloaxazin+ 9 J/cm² zkouška číslo 2- 7, 8-dimethyl-10-ribitylisoalloaxazinu =

100 uM

A. +7,8-dimethyl-10-ribitylisoalloaxazin+ 1 J/cm²

B, + 7,8-dimethy1 - 10-ribi ty1 isoal1oaxazin + 9 J/cm² zkouška číslo 3: 7, 8-dimethy1 - 10-ribi ty1 isoa11oaxazi nu = 50 uM

A. +7,8-dimethyl- 10-isoalloaxazin+ 5 J/cm² • Φ * ΦΦ 44 44 99

9 4 4 9 9 4 4 4 4 4

9 4 4 994 4 9 4 4

Φ 4 4 9 9 4 9 4 4 9 9 • Φ ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ •ΦΦΦ φφφ φφ φφ φφ φφ zkouška číslo 4:Kontrolní vzorek, 7,8-dimethyl-10-ribitylisoal1oaxazin = O uM

A. +průtok-UV-7,8-dimethyl-10-ribityli soal1oaxaz i nu

Všechny vzorky se identifikují podle čísla zkoušky a písmenem vzorku odpovídajícím podmínkám zpracování (například 1A). Každá zkouška se opakuje dvakrát. Sled sprcování vzorku se určí označením podle generátoru náhodných čísel.

Z každého vzorku pro test se shromáždí 20 ml. Tyto vzorky se vnesou do citrátem změkčených vzorkových sáčcích (o celkovém objemu 50 ml) a uchovají se pro analýzu. Teplota vzorku a ozařovací komůrky se zaznamená na začátku, v polovině a na konci každého testu.

Počáteční podíl z každého vzorku se po zpracování odebere pro analysu. Parametry pro analysu jsou počet buněk, hodnota pH, pCOz, pOz , vír destiček, HSR a analýza GMP-140. Zbývající část vzorku se umístí do míchadla destiček od konce ke konci v +22 inkubátoru a uchová se po dobu 5 dní po zpracování. Pátý den se odebere druhý podíl a analyzuje se in vitro stejně jako prvn í pod í1.

Pro testy se používá: mikroskop Nikon Labophot: heraatologický analyzátor Serono/Baker System 9000; analytické váhy; inkubátor destiček (+22 Celsius) a rotátor; laboratorní chladnička +4 Celsius); odstředivka Mistral 3000i; plynový analyzátor Corning Blood Gas Analyzer; průtokový cytometr Becton-Dickinson FACSCALIBUR; Uv ozařovací komůrky; UV radiometr (UVX Radiometer, UVP,lne.); EFOS Ultracure 100SS Plus (maximální výkon 365 nm a 340 nm pásmové filtry) a teplotní čidlo (termoólánek).

Výsledky pro každou zkušební charakteristiku se porovnají s definovanými podmínkami energie exposice a koncentrace 7,8- 49 »» ♦ 99 99 99 99

9 99 9 9 9 9 9 9 9

9 99 999 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 999 99 99 99 99 dimethyl-10-ribitylisoalloaxasinu. Provede se přímé porovnání s nezpracovaným kontrolním vzorkem a významné rozdíly se definují pravděpodobností p >0,05 z párové jednotailové analysy Studentovým T-testem.

Shrnutí výsledků těchto studií:

1. Při koncentraci sensitizeru větší než 10 uh a při koncentracích destiček nad l,5E+06/uL dochází druhý den k poklesu pH vzorku. Hodnota pH klesá trvale po druhém dni skladování a dosahuje nepřijatelné úrovně (<6,5) třetí den skladování. Všechny ostatní parametry sledují model pozorovaný u pH vzorku.

2. Tento pokles hodnoty pH nastává nezávisle na tom, zda vzorek byl nebo nebyl vystaven UV-světlu.

3. Při koncentraci destiček 5,4E+05/ul nedochází k poklesu hodnoty pH vzorku po prodlozeném skladování při jakékoli studované koncentraci sensitizeru až do 100 qřl.

4. Při koncentraci sensitizeru nad 10 uh a koncentracích destiček nad l,5E+0ó/uL a úrovních UVA nad 10 J/cm³ byly měřené vlastnosti destiček porovnatelné s vlastnostmi kontrolních, nezpracovaných buněk. Zůstávaly porovnatelné s kontrolními hodnotami po pěti a více dnech skladování po zpracování.

Tyto studie funkce destiček po zpracování poskytly čiré okno, ve kterém byly vlastnosti uchovány při hodnotách porovnatelných s nezpracovanými buňkami. Výsledky také naznačují, že měněním podmínek zpracování nebo skladování buněk může být toto okno rozevřeno. Pozorovaný účinek 7,8-dimethyl-10-ribitylisoal1oaxazi nu s UV-světlem a bez něho na hodnotu pH naznačuje metabolický účinek tohoto aditivu, který múze být moderován změnami skladovacích nebo zpracovacích podmínek vzorku.

··	9 99	99	»·	99
* »	• ·	•	•	9	•		9	9	9
t	9	β	•	999	•		9	9	9
9									9
9	9		•	• ·	•		9	9	9
999·	99 9			• ·		4 ·		99

Příklad 7

Měření napětí ve smyku na červených krvinkách jako funkce rychlosti proudění a hematokritu vzorku

Nízké hodnoty pronikání UV-světía do vzorků červených krvinek při vysokých hematokri těch zvýšily potřebu porozumět účinku procházení červených krvinek úzkými otvory v dráze světla. Snížení tloušťky vzorku v dráze světla by mělo zvyšovat dodávání UV-dávky při vysokých hematokri těch vzorku. K potvrzení této domněnky bylo provedeno několik měření poklesu tlaku za použití otvorů různých rozměrů. Do linky bylo zabudováno tlakové čidlo s per i sta 11ickým čerpadlem proti směru a po směru od zúžených otvorů. Plná krev s různým hematokri tem se nechala proudit otvory při řízených rychlostech proudění. Rozdíly tlakových údajů v obou místech umožnily přesné měření poklesu tlaku při průchodu otvorem. Použitím této hodnoty a rozměrů otvoru bylo možno stanovit smykové napětí očekávané u červených krvinek při jejich průchodu zúženou branou při použití následující rovnice'·

814IQ

Pokles t1aku delta P = gd³v

4uQ

Smykové napětí hw = gwd²

Pro krev je

U = viskosita = 0,0125/1-Hematokrit) g = gravitační konstanta = 981

Q = průtočná rychlost = ml/s l,w,d = rozměry otvoru v cm

V tabulce V jsou výsledky měření napětí ve smyku na červených krvinkách jako funkce rychlosti proudění a hematokritu vzorku ··

9

Tabulka

Dpmeas (dynes/cm2)	0,0	·—4 cn* 00	rn. v? CN 'T	sq. c? oo r~
CN O o X 00 o θ'	o o“	o CN	r^. 'Τ'	c~ *» oo
Dpmeas (dynes/cm2)	o A r- r-	Cs A CN m CN	NT A. cn in	CN r-J vs CA
0,08 X 0010	o ·—S	o ,A cn	o_ rč	rn~ of
z—> CM co £ 03 S <□ £ CQ έ	ca. v? CA	OO VÝ un cs	0Ó~ so	CA •s cs cn
co o o o X oo o o~	V7 r-		C'' A. CA	Γ- A o CN
	oo cn. ΠΓ II σ	oo rn. m II σ	CS nC T—» II σ	CA_ O~ r~i II σ
	41% HCT	64% HCT	41% HCT	61% HCT

Dpmeas (dynes/cn?)	wn ·*. cn c-	146,9	|| 0‘tt£	881,4
0,1 X 0,012	o.	o ΓΝ CN	A xt	o *» cs
nT“ w p ca E o 4; P CO 5 ω o* c O Ό	cn A o Ό	Cs. o“ OO	A CN CN •g·	SO. xT 00 00
o a·* <=k o X A( A o	o.	o cn''	O A Γ	r-~
Dpmeas i (dynes/cm2)	r^. m CA	OO. O CN	SO cn CA vs	o A cn CA O
oo o o A o X o •s o	C5_ CN~	VS xC	Γ- A cs	cn K. cn cs
	OO CT. cn II O	OO m cn* II σ	cs. » < II σ	CS SO V σ
	41% HCT	64% HCT	41% HCT	Ε- υ \S

•

99

9 9 999

9 ·

• · • · • · ··

9999 999

x-s CM M p C3 5 P M o υ o- e Q >s *o	o. cs xr	Cs CA	SO A r- A CN	5- CN SO
0,15 X 0,012	o A	O A CS	r- v?	r~~ A CN AM
Dpmeas (dynes/cm2)	CN ca“ xt	un ·*. cn xf	SO A ’ΤΓ cn	oo“ cn Γ
0,15X0,010	CN A	a cn	cn A 00	θ oo
Dpmeas (dynes/cm2)	A Γ- CA	o A CN	a. r-J Cs xf	r-A co' un
00 o c< ó X VS O	n cn	Vi. so	cn^ izC	Γ- vl· cn
	OO cn ·>. m II σ	co cn. m II a	Cs. so 7 σ	os so“ ΊΓ a
	Ε- Ο E X	64% HCT	41% HCT	Ε- υ E £ T“·* SO

V dřívějších testech se zjistilo, že smyková napětí 1000-2000 dyn/cm³ v intervalech 1 až 10 minut nebo úrovně 5000 až 7000 dyn/ctn² pro intervaly přibližně 10 ms postačovaly k vyvolání hemolýzy červených krvinek. Pouze v případě nejvyššího hemokritu vzorku (61 %) a nejvyšší průtočné rychlosti přesáhly hodnoty 1000 dyn/cm^s. K tomu došlo pouze případě nejužších otvorů (0,2032 mm).

Hodnoty pro penetrační hloubku světla pomocí navrhované konfigurace naznačují, že dodávka dostatečné UV energie k inaktivaci virů je dosažitelná i pro vzorky s vysokými hematokr i ty.

Výsledky analýzy smykových napětí u vzorků červených krvinek podrobených proudění ukazují, že rozměry průtočné dráhy mohou být významně zmenšeny a vysoké rychlosti proudění se zachovají bez riskování hemolýzy krvinek.

Příklad 8

Koncentrát destiček se smísí s roztokem aditivu destiček Isolyte S při poměru 20 = 80 koncentrát dest i ček ' Isol yt S. Směsí koncentrátů destiček a roztoků aditivů destiček se zde nazývají media. Koncentrát destiček bez roztoku aditivu se označuje jako plasma. Obě prostředí se naočkují Listeria monocytogenes. Do každého prostředí se přidá 300 ng/ml vitaminu K5. Každé prostředí se vystaví světlu UV, viditelnému nebo světlu v místnosti v kyvetovém přístroji podle obr. 7, s výsledky uvedenými v tabulce VI.

Tabulka VI

K5 v mediu

K5 v plasmě

UV, 40 J/cm²

4,2 Log

0, 1 Log • ·

- 53 VIS, 40 J/cm² 4,2 Log

Světlo místnosti 0 Log

0, 1 Log 0 Log

UV světlo = 365 nm Koncentrace K5 = 300 ug/ml

VIS světlo = 419 nm

Pathogen = Listeria monocytogenes

Př i k 1 ad 9

Shora popsaná media a plasma obsahující vitamin K5 se naočkují bakteriemi a ozáří se nebo se vystaví pouze světlu v místnosti (K5-světlo) jak uvedeno v tabulce VII a růst se vyhodnotí po třech dnech inkubace. Inaktivace některých druhů je patrná v chybějícím ozáření.

Tabulka VII

Media Plasma

Úroveň naočko-	K5 + svět1 o	K5- svět1 o	K5 + světí o	K5- svět1 o
ván i	(cfu/ml)
P. aerug i nosa	3,4 log	-	-	-	-
S.aureus	2,1 log	-	-	+	+
S.epidermidis	3,2 1 og	-	+	-	-
L. monocytogenes	3,5 log	-	-	-3-	-í-
E. coli	3,1 log	-	-	+	-

UV-světlo = 365 nm, 40 J/cm² + = růst zjištěný po třech dnech inkubace - = žádný růst zjištěný po třech dnech inkubace Koncentrace K5 = 300 ug/ml

Příklad 10

Media provedená s pomocí koncentrátu destiček popsaná v příkladu 8 a Isolyt S v poměru Isolyt S=koncentrát destiček 70=30 a obsahující 300 ug/ml vitaminu K5 se naočkují různými druhy bakterií a ozáří se energí 30 a 60 J/cm². Inaktivace v závislosti na energii ozáření je v tabulce VIII a na obr. 8.

Tabulka VIII

Energ i e	S.aureus	S.epiderai di s	L.monocytogenes	E.coli
0	4, 3	, ó	2, 8	3,5
30	3, 6	2, 7	2	2
60	3, 2	2, 5	1	1

Příklad 11

Do koncentrátu destiček podle příkladu 8 a media 70=30 podle příkladu 10 se přidá 10 uM 7,8-dimethyl-10-ribitylisoalloaxazinu. Koncentrát destiček a media se naočkují S. aureus nebo S. epidermidis a ozáří se při 80 J/cm² a 30 J/cm² a inaktivace se měří jak shora uvedeno. Výsledky jsou uvedeny v tabulce IX.

Příklad 12

Do plasmového koncentrátu podle příkladu 8, obsaženého v krevním sáčku se přidá 25 uM 7,8-dimethyl-10-ribitylisoalloaxazinu. Sáček se naočkuje bakteriemi uvedenými v tabulce IX, míchá se a vystaví se záření 120 J/cm². Výsledky inaktivace jsou uvedeny v tabulce IX.

·· · ·· ·· ·· ·· ···· ··· to··· • to ·· ··· · · · ·

Tabulka IX

Patogeny	Log inaktivace(cfu/m1)
S.aureus	1,7 log
S.epidermidis	3,5 log
P. aeruginosa	3,6 log
E.coli	4, 1 log

Příklad 13

Do koncentrátu destiček podle příkladu 8 se přidá 7,8-dirnethyl-10-ribitylisoalloaxazin, naočkuje se S. aureus nebo S. epidermidis a ozáří se 80 J/cm². Výsledky inaktivace jsou uvedeny v tabulce X.

Tabulka X j Log inaktivace (cfu/ml) í

| Stafylococus Stafylococus i aureus epodermidis

J_

7,8-dimethyl-10-ribityl - |	1,9	log	4, 1	1 og
1 isoal1oaxazin 10 yM i
alloxazin mononuk1eotid, 10 uM |	1,6	log	5, 6	1 og
1 7, 8-dimethylalloxazin, 7uM |	1,6	log	2, 9	log

Příklad 14

Do koncentrátu destiček podle příkladu 8 se přidá 10 uM

7,8-dimethyl-10-ribitylisoalloaxazinu. Podíly neobsahují aditiv nebo obsahují 10 mM askorbátu nebo 10 mM KJ jako kalič ·· · · · φ φ ·· φ · • · · · ··· φφφφ • · · · ··· · · · · φ φ φφ φφ φφφ φφ φ φ φ φφφφ φφφφ φφφφ φφφ φφ φφ φφ φφ nebo antioxidant. Roztoky se naočkují HVS-2, uiX174, S. epidermidis nebo S. aureus a ozáří se 80 J/cm². Výsledky jsou uvedeny na obr. 10.

Příklad 15

Do koncentrátu destiček podle příkladu 8 se přidá 7,8-dimethyl-10-ribitylisoalloaxazin v různých koncentracích. Roztoky se naočkují virem herpes simplex typu II (HSV-II), dvouřetězcovým virem obalujícím DNA. Ozáří se 80 J/cm². Pokus se opakuje třikrát. Ve všech třech případech se dosáhne úplné inaktivace. Výsledky jsou na obr. 11.

Příklad 16

Postupuje se podle příkladu 15 za použití S. epidermis místo HSV II při energiích záření 40, 80 a 120 J/cm². Výsledky inaktivace jsou na obr. 12.

Příklad 17

Postupuje se podle příkladu 15 za použití iuX174S, jednořetězcového DNA bakteriofágu při různých koncentracích 7,8-dimethyl-10-ribitylisoalloaxazinu a energiích záření. Výsledky inaktivace jsou na obr. 13.

Příklad 18

Do koncentrátů destiček podle příkladu 8 se přidá 10uM

7,8-dimethyl-10-ribitylisoalloaxazinu. Naočkují se S. aureus nebo ωΧ174 a ozáří se různými energiemi záření směsí 50=50 viditelného a UV-světla. Výsledky inaktivace jsou na obr. 14.

··

Příklad 19

Postupuje se podle příkladu 18 za použití S. epiderais a HSV II jako mikroorganismů. Směs 50=50 viditelného a UV-světla se nahradí zdrojem DYMAX. Výsledky jsou na obr. 15.

Příklad 20

Do koncentrátu destiček podle příkladu 8 se přidá 10yM

7,8-dimethy1 - 10-ribi ty1 isoa11oaxazinu ve formě prášku. Provedou se zkoušky s přidaným askorbátem a bez něho. 150 ml zkušebních roztoků se umístí do krevního sáčku Spectra™ a za míchání se vystaví působení různých energií záření při použití směsi 50=50 viditelného a UV-světla. Po ozáření 40 J/cm² se obsah každého sáčku přemístí do nového sáčku k vyloučení chyb způsobených mikroorganismy, které mohly zůstat na nabodnutém vstupu sáčku. Výsledky inaktivace jsou na obr. 16. Šipky směřující dolů značí inaktivaci na úroveň, kterou bylo možno zjistit (2,5 log titr).

Příklad 21

Do koncentrátu destiček podle příkladu 8 a koncentrátu destiček v isolytu S při poměru 30=70 koncentrát destiček=Isolyt S, se přidá 20 uM 7,8~dimethy1 - 10-ribi ty1 isoa11oaxazi nu. Naočkují se virem vaccínie a virem obalujícím dvouřetězcovou DNA a vystaví se působení 60 J/cm·³ viditelného světla nebo smíšeného (50=50) viditelného a UV-světla za použití UV-světelného zdroje DYMAX 2000 po dobu 30 minut. Mez detekce je 1,5 log. Výsledky inaktivace jsou na obr. 17. Provedlo se porovnání bez fotosensitižeru, s fotosensitizerem v Isolytu S samotném, destiček v mediu Isolyt S, destiček v mediu Isolyt S za použití 8-methoxypsoralenu místo 7, 8-dimethyl-10-ribitylisoal loaxazinu a koncentrátu destiček v mediu Isolytu (30=70).

·# ·· » · · » · · · ·

Příklad 22

Vzorky koncentrátu destiček v prostředí Isolytu S 30=70, s 10 nM 7,8-dimethyl-10-ribitylisoalloaxazinu nebo bez něho se naočkují virem vaccínie a ozáří se 60 J/cm² směsí (50=50) viditelného a UV-světla po různě dlouhou dobu a výsledky inaktivace jsou porovnány na obr. 18.

Příklad 23

Do koncentrátu destiček podle příkladu 8 se přidá 5uM nebo 50 uM 7,8-dimethy1 - 10-ribi ty1 isoal1oaxazi nu. Vzorky se naočkují HIV I. Za použití průtočné komůrky znázorněné na obr. 7 se vzorky ozáří různými energiemi směsi (50=50) viditelného a UV-světla za použití osvětlovacího systému EFOS. Výsledky inaktivace jsou porovnány na obr.19.

Příklad 24

Buňky ACH-2 naočkované HIV se přidají do vzorků koncentrátu destiček podle příkladu 8. Do vzorků se přidá 5 nebo 50 uM 7,8-dimethyl-10-ribitylisoalloaxazinu. Postupuje se podle příkladu 23 a výsledky inaktívace jsou na obr. 20. Přítomnost HIV se zjišťovala jeho cytopatickým působením na testované buňky.

Příklad 25

Postupuje se podle příkladu 24 a přítomnost HIV se zjišťuje kvantifikováním úrovně produkce antigenu P24. Výsledky inaktívace jsou na obr.21.

• · ♦ · ·· ·· ·· • · tet· • ··· · · · · • · ··· · · · • · t · · ·· · • · · · · · · ·

Příklad 26

Do koncentrátu destiček podle 8 a media obsahujícího 30 % koncentrátu destiček a 70 % PASIII™ se přidá 6 mM askorbátu a 14 um 7,8-dimethy1 - 10-ribity1isoal1oaxazinu. Vzorky se naočkují HSV-II. Výsledky inaktivace jsou na obr.22 a v tabulce XI.

Tabulka XI

Čas	Energ i e	30 = 70	Energie	90=10 PC=Media
(m i nut)	(UV+VIS)	PC = Media	(UV+VIS)	log virus titr
	J/cm3	log virus titr	J/cm2
0	0	5, 6	0	5, 6
1,5	5	2, 5	40	3, 3
3	10	2, 5	80	i , 5
				nezj i st i te 1ný
				virus
4, 5	15	2, 3	120	1,5
				nezjist i te1ný
				v i rus
6	20	1,8
9	30	1,6
12	40
24	80
36	120

Pracovníkům v oboru je zřejmé, že uvedený popis slouží pouze k objasnění vynálezu, přičemž v rámci rozsahu vynálezu jsou možné mnohé změny bez odchýlení od rozsahu vynálezu. Může se například použít jiných fotosensitizerů. než jaké jsou uvedeny, s výhodou fotosensitizerů, které se vážou na nukleovou kyselinu a tím ji chrání před replikací a výhodněji fotosensitizerů, které jsou netoxické a nemají toxické produkty rozpadu

X

X X

ΧΧΧΧ X

X XX X χχχ XX X X χχχχ

Kromě toho mohou pracovníci v oboru snadno použít rovnocenných prostředků ke konstrukci průtočného systému k dekontaminaci kapalin za použití fotosensitizerů, bez nutného experimentování.

Průmyslová využitelnost

Způsob inaktivace různých mikroorganismy v krevních produktech, v nápojích a v potravinách a také na povrchu potravin, poražených zvířat, zařízení pro přípravu potravin, koupacích nebo mycích nádob, zvířecí kůže i na povrchu ran.

Claims (82)

1. Způsob ošetřování kapalin k inaktivaci mikroorganismů, které se v nich mohou vyskytovat, přičemž kapalina obsahuje jednu nebo několik složek volených ze souboru zahrnujícího protein, krev a složky krve .vyznačující se t i m, že se (a) přidává do takové kapaliny k inaktivaci účinné, v podstatě netoxické množství endogenního fotosensitižeru nebo derivátu fotosensitizeru na endogenní bázi, (b) kapalina ze stupně (a) se prodrobí fotoozáření postačujícímu k aktivaci fotosensitizeru za inaktivace míkroorgan i smů.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se t i m, že fotosensitizerem je foto-aktivovatelná sloučenina, jejíž případné fotolytické produkty jsou málo toxické nebo nejsou vůbec toxické pro lidi nebo zvířata.

3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t i m, že fotosensitizerem je endogenní fotosensitizer volený ze souboru zahrnujícího endogenní alloxaziny, K-vitaminy a vitamin L.

4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že fotosensitizerem je endogenní fotosensitizer volený ze souboru zahrnujícího 7,8-dimety1 - 10-ribi ty1 isoal1oxazin, 7, 8-dimetylalloxazin, 7, 8, 10-trimethy1 isoal1oxazin, alloxazin mononukleotid, isoalloxazin-adenosindinukleotid, vitamin K1, vitamin K1 oxid, vitamin K2, vitamin K5, vitamin K6, vitamin K7, vitamin K-S(II) a vitamin L.

5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že fotosensitizerem je 7,8-dimetyl-10-ribity1 isoalloxazin • ·

6.

44 44 • 4

4 444 4 4 4 • 4 4 4

44 44

44 44

4 4 4 4

4 4 4 4

4 4 4 4

4 4 4 4

44 44

Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že mikroorganismy jsou voleny se souboru zahrnujícího bakterie, bakteriofágy, a intracellulární a extracellulární viry.

7.

Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m, že mikroorganismy jsou bakterie.

8.

Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že mikroorganismy jsou voleny ze souboru zahrnujícího viry HIV, viry hepatitidy, sindbis virus, cytomega1ovirus, vesicular stomatitis virus, herpes simplex viry, virus vaccínie, lidské T-1ymfotropické retroviry, HTLV-III, lymphadenopathy virus, LAV/IDAV, parvovirus, transfusí přenášený (TT)virus, Epstein-Barrův virus, bakter i of ágy tuX174, iu6, lambda, R17, T4, Tg, P. aeruginosa, S. aureus, S. epidermidis, L. monocytogenes, E. coli, K. pneumoniae a S. marcescens.

9. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m, že fotoradiací je světlo ve viditelné části spektra.

10. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m, že fotoradiací je světlo v ultrafialové části spektra.

11. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m, že fotoradiací je světlo ve viditelkné i ultrafialové části spektra.

12. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m, že přibližně polovina fotoradiace je v ultrafialové části spektra a přibližně polovina je ve viditelné části spektra .

13. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t i m, že fotoradiace spočívá v proudění kapaliny obsahující • to ·· 99 99 toto

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 99 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • · toto·· ···· • r·· ··· ·· ·· ·· ·· fotosensitizer kolem zdroje fotoradiace o rychlosti a hloubce volené k zaručení proniknutí fotoradiace kapalinou a inaktivace mikroorganismů.

14. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t i m, že se kapalina a fotosensitizer uchovávají v kontejneru prúsitném pro fotoradiaci a na kapalinu se působí fotoradiací.

15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se t í m, že během fotoradiace se kontejneru! míchá.

16. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m, že se kapalina uchovává v kontejneru průsvitném pro fotoradiaci, do kapaliny se dodáváí fotosensitizer ve formě prášku, kontejnerem se míchá a kontejner se vystavuje fotoradiaci .

1?, Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že kapalinu tvoří složky krve.

18. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t i m, že kapalinou je plná krev.

19. Způsob podle nároku 1, vyznačuj í cí tím, že kapalinou je oddělený krevní produkt.

20. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící tím. že kapalinou jsou destičky oddělené od plné krve.

21 . Způsob podle nároku 1, vyznačující se t i m, že kapalinou jsou červené krvinky oddělené od plné krve

22. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že kapalinou je sérum oddělené od plné krve.

« »*·« » ·· «« 99 99

99 9 9 9 ····

9 99 999 · 9 9 9 « 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

999 99 99 99 99

23. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící tím. že kapalinou je plasma oddělená od plné krve.

24. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se t i m. že kapalinou je terapeutický proteinový prostředek-.

25. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že kapalina obsahuje biologicky aktivní protein volený ze souboru zahrnujícího faktor VIII, Von Wi 11ebrandův faktor, faktor IX, faktor X, faktor XI, Hagemanův faktor, prothrombin, anti-thrombi η III, fikronektin, plasminogen, frakce plasmového proteinu, peritoneální dialysové roztoky, globulin imunitního séra, modifikovaný imunitní globulin, albumin, plasmový růstový hormon, somatomedin, plasm inogenní streptokinázový komplex, ceruloplasmin, transferin, haptoglobin, antitrypsin a preka11 i kre i n .

26. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se t i m, že fotosensitizer se přidává do protisráž1 ivého činidla a proti sráží ivé činidlo se přidává do kapaliny.

27. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t i m, že se do kapaliny přidává podporující prostředek před vystavením fotoradiaci.

28. Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, že podporující prostředek je volen ze souboru zahrnujícího adenin, histidin, cystein, tyrosin, tryptofan, askorbát, N-acetyl-L-cystein, propy1gal1át, glutathion, merkaptopropionylglycin, dithiothreotol, nikotinamid, BHT, BHA, lysin, šeřin, methionin, glukózu, mannitol, trolox, glycerol a jejich směs i.

29. Způsob zpracování kapaliny k inaktivací mikroorganismů, které v ní mohou být obsaženy .vyznačující se t í m, že se

99 9 *9 ·* 99 99 • 9 »9 9 9 9 9 9*9

9 9 · 9 999 « · 9 9

9 · <9 F9 99« 99 9 • 9 9999 99 9 9

9999 999 99 »9 99 99 (a) přidává do takové kapaliny k inaktivaci účinné, v podstatě netoxické množství endogenního fotosensitiseru nebo derivátu fotosensitizerů na endogenní bázi, (b) kapalina ze stupně (a) se prodrobí fotoozáření postačujícímu k aktivaci fotosensiti žeru za inaktivace mikroorganismů.

30. Způsob podle nároku 29, vyznačující se tím, že kapalinou je krevní produkt.

31. Způsob podle nároku 29, vyznačuj ící se t i m, že kapalinou je nápoj určený ke konzumaci lidmi a zvířaty .

32. Způsob podle nároku 29, vyznačující se tím, že kapalinou je peritoneální roztok.

33. Kapalina obsahující biologicky aktivní protein, krev nebo krevní složky a fotosensitizer nebo jeho fotoprodukt, vyznačující se tím, že je připravena způsobem podle nároku 1.

34. Krevní produkt obsahující fotosensitizer nebo jeho fotoprodukt, vyznačující se tím, že je připraven způsobem podle nároku 1.

35. Kapalina obsahující biologicky aktivní protein, krev nebo krevní složky a fotosensitizer nebo jeho fotoprodukt a podporující činidlo, vyznačující se tím, že je připravena způsobem podle nároku 1.

36. Systém zpracování kapaliny k inaktivaci mikroorganismů, které může kapalina obsahovat .vyznačující se t í m, že ho tvoří = (a) kontejner obsahující kapalinu a endogenní fotosensitizer • · nebo derivát fotosensitizeru na endogenní bázi, přičemž je kontejner vybaven vstupními prostředky a má fotopropustný povrch umožňující vystavení kapaliny uvnitř míře fotoradiace postačující k aktivaci fotosensitizeru, (b) alesapoň jeden zdroj fotoradiace k zajištění dostatečného ozáření kapaliny v kontejneru typu a množství voleného k aktivaci fotosensitizeru za inaktivace mikroorganismů.

37. Systém podle nároku 36.vyznačuj ící se t i m, že zdroj fotoradiace poskytuje světlo ve viditelné části spektra.

38. Systém podle nároku 36, vyznačující se t i m , že zdroj fotoradiace poskytuje světlo v ultrafialové části spektra,

39. Systém podle nároku 36, vyznačuj ící se tím, že zdroj fotoradiace poskytuje světlo ve viditelné i v ultrafialové části spektra.

40. Systém podle nároku 36, vyznačující se t i m, že má také podporující prostředky fotoradiace.

41. Systém podle nároku 40, vyznačující se tím, že podporujícím prostředkem fotoradiace je odrazový povrch.

42. Systém podle nároku 36, vyznačuj ící se tím, že obsahuje světelný vodič k vedení fotoradiace ze zdroje fotoradiace do fotoprůsvitného kontejneru.

43. Systém podle nároku 36, vyznačující se t i m, že má teplotní monitor.

44. Systém podle nároku 36, vyznačuj ící tím, že má prostředky k zavádění kapaliny do kontejneru a vypouštění z kontejneru.

45. Systém podle nároku 36,vyznačující se tím, že má také prostředky k míchání kapaliny v kontejneru.

46. Zařízení k rozdělování plné krve na krevní složky, vyznačující se tím, že má systém podle nároku 36.

47. Systém k inaktivací mikroorganismů v kapalině obsahující takové mikroorganismy, vyznačující se tím, že má = (a) prostředky k přidávání účinného množství endogenního fotosensitiseru nebo derivátu fotosensitižeru na endogenní bázi do kapaliny, (b) fotoprůsvitný kontejner na kapalinu ve spojení s prostředky na přidávání fotosensitižeru mající hloubku a délku volenou k vystavení kapaliny ze stupně (a) míře fotoradiace postačující k aktivaci fotosensitizeru při zvolené průtočné rychlost i, (c) prostředky k vytvoření zvolené rychlosti proudění kapaliny kontejnerem, (d) alespoň jeden zdroj fotoradiace k zajištění dostatečné fotoradiace kapalině v kontejneru typu a množství voleného k aktivaci fotosensitizeru.

48. Systém zpracování kapaliny k inaktivací mikroorganismů které může obsahovat, vyznačující se tím, že má ' (a) fotosensitizer v práškové formě, (b) fotoprůstvitný kontejner k pojmutí kapaliny a fotosensitižeru, (c) prostředky k míchání kontejnerem, (d) alespoň jeden fotoradiační zdroj k dodání dostatečné fo68 toradiace kapalině v kontejneru typu a množství voleného k aktivaci fotosensitizeru za inaktivace mikroorganismů.

49. Systém podle nároku 48, vyznačující se tím, že fototransparentním kontejnerem je průsvitný plastový sáček.

50. Systém podle nároku 48, vyznačuj ící se t i m, že prostředkem k míchání kontejnerem je natřásací stůl.

51. Systém podle nároku 48, vyznačující se t i m, že fototransparentni kontejner obsahuje fotosensitizer před přidáním kapaliny.

52. Způsob inaktivace mikroorganismů na povrchu, vyznačující se tím, že se (a) na povrch nanese inaktivačně účinné množství endogenního fotosensitizeru nebo derivátu fotosensitizeru na endogenní báz i , (b) upravený povrch se vystaví fotoradiaci postačující k aktivaci fotosensitizeru.

53. Způsob podle nároku 52, vyznačující se tím, že povrchem je povrch potraviny.

54. Způsob podle nároku 52, vyznačuj ící tím, že povrchem je povrch poraženého zvířete.

55. Způsob podle nároku 52, vyznačuj ící tím, že povrchem je povrch pro přípravu potravin.

56. Způsob podle nároku 52, vyznačuj ící tím, že povrchem je povrch koupací nebo mycí nádoby.

57.

Způsob podle nároku 52, vyznačující se to · to · ·· ·· • · · to to · ···· to »· ♦ • · · · ·· ·· ·· ·· ·· tím, že povrchem je povrch zvířecí kůže,

58. Způsob podle nároku 52, vyznačující se tím, že povrchem je povrch rány.

59. Způsob podle nároku 52, vyznačující se tím, že endogenní fotosensitizer je volen ze souboru zahrnujícího endogenní alloxaziny, vitaminy K a vitamin L.

60. Způsob podle nároku 52, vyznačující se t í m, že endogenní fotosensitizer je volen ze souboru zahrnujícího 7,8-dimetyl-10-ribitylisoalloxazin, 7,8-dimetylalloxazin, 7,8, 10-tri methylisoalloxazin, alloxazin mononukleotid, ísoalloxazin-adenosindinukleotid, vitamin ΚΙ, vitamin KI oxid, vitamin K2, vitamin K5, vitamin K6, vitamin K7, vitamin K-S(II) a vitamin L.

61. Způsob podle nároku 52, vyznačující se t i m, že fotosensitizerem je 7,8-dimetyl-10-ribitylisoalloxazin .

62. Způsob podle nároku 52, vyznačující se tím, že mikroorganismy jsou voleny ze souboru zahrnujícího bakterie, bakteriofágy a viry.

63. Způsob zpracování kapaliny k inaktivaci mikroorganismů, které v ní mohou být obsaženy , vyznačující se t i m, že kapalina obsahuje také složky volené ze souboru zahrnujícího protein, krev a krevní složky, bez ničení biologické aktivity takové složky, přičemž se přidává inaktivačně účinné, netoxické množství vitaminu K5 do kapaliny k v podstatě inaktivaci uvedených mikroorganismů.

64. Způsob podle nároku 63, vyznačující se tím, že se provádí při okolním osvětlení v místnosti.

65.

tím,

Způsob podle že se provádí ve nároku 63, tmě.

vyznačuj

66. Způsob podle nároku 63, vyznačující se tím, že zahrnuje také přidání podporujícího prostředku do kapaliny.

67.

tím, že

Způsob podle nároku 63, podpprujícím prostředkem vyznačuj je antioxidant.

68. Způsob zpracování povrchu k inaktivaci mikroorganismů, které se mohou na povrchu vyskytovat, nebo se kterými může přijít do styku, vyznačující se tím, že se povléká povrch inaktivačně účinným, netoxickým množstvím vitaminu K5 k v podstatě inaktivaci mikroorganismů.

69. Vodný destičkový aditivní roztok obsahující endogenní fotosensitizer, vyznačující se tím, že je volen ze souboru obsahujícího endogenní alloxaziny, vitaminy K a v i tam i n L.

70. Destičkový aditivní roztok podle nároku 69, vyznačující se tím, že obsahuje fyziologický solankový roztok a pufr.

71. Destičkový aditivní roztok podle nároku 69, vyznačující se tím, že obsahuje také chlorid hořečnatý.

72. Destičkový aditivní roztok podle nároku 69, vyznačující se tím, že obsahuje také glukonát sodný.

73. Destičkový aditivní roztok podle nároku 69, vyznačující se tím, že fotosensitizer je obsažen v koncentraci mezi 1 uM a jeho maximální rozpustností.

• · * · ♦ ·· · · ·· • · · · ··· · » · · • · · · · · · · V · 9

74. Destičkový aditivní roztok podle nároku 73, vyznačující se tím, že fotosensitizer je obsažen v koncentraci přibližně 10 uM.

75. Destičkový aditivní roztok podle nároku 69, vyznačující se tím, že hodnota pH je přibližně 7,0 až přibli žně 7,4.

76. Destičkový aditivní roztok podle nároku 69, vyznačující se tím, že fotosensitizerem je 7,8-dimetyl10-ribitylisoalloxazin.

77. Destičkový aditivní roztok podle nároku 69, vyznačující se tím, že obsahuje chlorid sodný, octan sodný, glukonát sodný, chlorid hořečnatý, natriuafosfát, 7,8dimety1 -10-ribity1 isoal1oxazin a má hodnotu pH přibližně 7,0 až přibližně 7,4.

78. Destičkový aditivní roztok podle nároku 69, vyznačující se tím, ěe obsahuje také podporující prostředek volený ze souboru zahrnujícího adenin, histidin, cystein, tyrosin, tryptofan, askorbát, N-acetyl-L-cystě iη, propylgallát, glutathion, merkaptopropionylglycin, dithiothreotol, nikotinamid, BHT, BHA, lysin, serin, methionin, glukózu, mannitol, trolox, glycerol a jejich směsi.

79. Způsob zpracování kapaliny k inaktivaci mikroorganismů, které v ní mohou být obsaženy , vyznačující se tím, že se (a) přidává do kapaliny inaktivačně účinného množství fotosensi t izerů, (b) kapalina ze stupně (a) se vystavuje působení ultrafialového a viditelného světla za inaktivace mikroorganismu.

80.

Způsob podle nároku 79, vyznačující ·· tím, že směsí světla je 50=50 ultrafialového: viditelného světí a.

81. Způsob podle nároku 79, vyznačující se t i m, že fotosensitizerem je netoxický endogenní fotosensitizer nebo derivát fotosensitizeru na endogenní bázi.

82. Způsob ošetřování kapaliny k inaktivací případně obsažených bílých krvinek, vyznačující se tím, že se (a) přidává do takové kapaliny k inaktivací účinné, v podstatě netoxické množství endogenního fotosensitizeru nebo derivátu fotosensitizeru na endogenní bázi, (b) kapalina ze stupně (a) se prodrobí fotoozáření postačujícímu k aktivaci fotosensitizeru za inaktivace bílých krvinek.

83. Způsob podle nároku 82, vyznačuj ící se t i m, že kapalinou je krev nebo složky krve.