SK5832000A3

SK5832000A3 - Method for inactivation of microorganisms using photosensitizers

Info

Publication number: SK5832000A3
Application number: SK583-2000A
Authority: SK
Inventors: Raymond Paul Goodrich Jr; Frank Corbin Iii; Edward C Wood Jr; Dennis Hlavinka
Original assignee: Gambro Inc
Priority date: 1998-07-21
Filing date: 1999-07-21
Publication date: 2001-01-18
Also published as: CA2304696A1; ATE511861T1; HUP0004907A3; IL135100A0; NO20001440D0; NO322633B1; BG104362A; JP2006124405A; EA200000344A1; JP3854068B2; NO20001440L; IL160481A; EP2174669A1; CN101239075A; ATE508755T1; EP1972351A3; EP1972351B1; CA2304696C; AU744978B2; KR100746792B1

Description

Spôsob fr zariadenie na j dezaktivácift» biologických kontaminantov použitím fotosenzibilátorov

Oblasť techniky

Táto prihláška je sčasti pokračovaním US prihlášky č. 09/119 666 podanej 21. júla 1998, ktorá je tu zahrnutá vo svojom celku v miere nekompatibilnej s ďalej uvedeným. Vynález sa týka spôsobu a zariadenia na dezaktiváciu biologických kontaminantov použitím fotosenzibilátorov.

Doterajší stav techniky

Kontaminácia krvných látok infekčnými mikroorganizmami ako je HIV, hepatitída alebo iné vírusy a baktérie predstavuje vážne ohrozenie zdravia tých, ktorí dostávajú transfúzie krvi alebo ktorým sú podávané rôzne krvné zložky, ako sú krvné doštičky, červené krvinky, krvná plazma, faktor VIII, plazminogén, fibronektín, anti-trombín III, kryoprecipitát, proteínová frakcia ľudskej plazmy, albumín, imúnnosérum globulínu, protrombínový komplex rastových hormónov plazmy a iné zložky izolované z krvi. Kontrolné postupy pre krv môžu vynechať kontaminanty a sterilizačné postupy, ktoré nepoškodzujú bunkové krvné zložky, ale efektívna dezaktivácia všetkých infekčných vírusov a Iných mikroorganizmov nebola až doteraz zaznamenaná.

Rozpúšťadlové detergentné spôsoby na odstránenie kontaminantov krvných zložiek pracujú pomocou rozpustenia fosfolipidových membrán obkolesujúcich vírusy, ako je HIV, a nepoškodzujú proteínové zložky krvi, avšak ak sú prítomné krvné bunky, takéto spôsoby nemôžu byť použité z dôvodu poškodenia bunkových membrán.

Pre sterilizáciu krvných zložiek bolo navrhnuté použitie fotosenzibilátorov, zlúčenín, ktoré absorbujú svetlo s definovanou vlnovou dĺžkou a prenášajú absorbovanú energiu na energetické akceptory. Napríklad, európska patentová prihláška č. 196 515 publikovaná 8. októbra 1986 navrhuje použitie neendogénnych fotosenzibilátorov, ako sú porforíny, psoralény, akridíny, toluinidy, flavín (akriflavín hydrochlorid), fenotiazínové deriváty a farbivá, ako je neutrálna červená a metylénová modrá, ako krvné aditíva. Protoporfyrín, ktorý sa vyskytuje prirodzene v tele človeka, môže byť metabolizovaný pre vytvorenie fotosenzibilátora, avšak jeho plné využitie je obmedzené v tom, že znižuje žiadúcu biologickú aktivitu proteinov. Chlórpromazín je tiež príkladom jedného takého fotosenzibilátora, avšak jeho plné využitie je obmedzené skutočnosťou, že musí byť po postupe odstránenia kontaminantov odstránený zo všetkých tekutín podávaných pacientovi, pretože má sedatívny účinok.

Goodrich, R.P., et al. (1997), v „The Design and Development of Selective, Photoactivated Drugs for Sterilization of Blood Products“, Drugs of the Future 22:159-171 uskutočňuje prehľad niektorých fotosenzibilátorov vrátane psoralénov, a niektoré dôležité problémy výberu fotosenzibilátorov na odstránenie kontaminantov krvných produktov. Použitie texapyrínov pre fotoštiepenie DNA je popísané v US patente č. 5 607 924 vydanom 4. marca 1997 a č. 5 714 328 vydanom 3. februára 1998 pre Magda et al. Použitie sapfyrínov pre virálnu dezaktiváciu je popísané v US patente č. 5 041 078 vydanom 20. augusta 1991 pre Matthewsa, et al. Dezaktivácia mimobunkových opláštených vírusov v krvi a krvných zložkách farbivom fentiazin-5-iumu plus svetlom je popísaná v US patente č. 5 545 516 vydanom 13. augusta 1996 pre Wagnera. Použitie porfyrínov, hematoporfyrínov a merocyanínových farbív ako fotosenzibiltátorových činidiel pre vyhubenie infekčných kontaminantov, ako sú vírusy a protozoa z telesných tkanív, ako sú telesné tekutiny, bolo objavené v US patente č. 4 915 683 vydanom 10. apríla 1990 a k nemu blízkom U.S. patente č. 5 304 113 vydanom 19. apríla 1994 pre Siebera et al. Mechanizmus pôsobenia takých fotosenzibilátorov je popísaný ako vyvolávajúce preferenčné viazanie na domény v dvojvrstvách lipidov, napr. na opláštené vírusy a niektoré vírusom infikované bunky. Fotoexcitácia molekúl na membránu viazaných činidiel vedie k vytvoreniu reaktívnych kyslíkových druhov, ako je singletový kyslík, ktorý spôsobuje peroxidáciu lipidov. Problémom pri použití takých fotosenzibilátorov je to, že rozrušujú bunkové membrány rozhodujúcich zložiek tekutín, u ktorých sú odstránené kontamínanty, ako sú červené krvinky, a singletový kyslík tiež rozrušuje žiadúce proteínové zložky tekutín, ktoré boli upravené. US patent č. 4 727 027 vydaný 23. februára 1988 pre Wiesehahna, G.P., et al. objavuje použitie furokumarínov psoralénu a derivátov na odstránenie kontaminantov krvi a krvných produktov, ale uvádza, že musia byť urobené kroky pre redukovanie možnosti rozpusteného kyslíka a iných reaktívnych druhov, aby sa zabránilo denaturácii biologicky aktívnych proteínov. Fotodezaktivácia virálnych a bakteriálnych krvných kontaminantov použitím halogenovaných kumarínov je popísaná v US patente č. 5 516 629 vydanom 14. mája 1996 pre Parka, et al., US patente 5 587 490 vydanom 24. decembra 1996 pre Goodricha Jr., R.P., et al. a US patente č. 5 418 130 vydanom pre Platza et al. a objavujú použitie substituovaných psoraiénov pre dezaktiváciu virálnych a bakteriálnych krvných kontaminantov. Posledne uvedený patent tiež uvádza nevyhnutnosť kontrolovania poškodenia voľnými radikálmi u ďalších krvných zložiek. US patent 4 654 443 vydaný 5. augusta 1997 pre Wollowitza et al. uvádza nové psoralénové kompozície použité na fotoodstraňovanie kontaminantov krvi. US patent č. 5 709 991 vydaný 20. januára1998 pre Lina et al. uvádza použitie psoralénu na fotoodstránenie preparátov s krvnými doštičkami a potom odstránenie psoralénu. US patent 5 120 649 vydaný 9. júna 1992 a k nemu blízky US patent č. 5 232 844 vydaný 3. augusta 1993 pre Horowitza, et al., tiež popisujú potrebu použitia „zhášačov“ v kombinácii s fotosenzibilátormi, ktoré rozrušujú lipidové membrány, a US patent č. 5 360 734 vydaný 1. novebra 1994 pre Chapmana et al. sa tiež zameriava na tento problém zabránenia poškodeniu ďalších krvných zložiek.

Fotosenzibilátory, ktoré rozrušujú nukleové kyseliny sú v doterajšom stave techniky známe. US patent č. 5 342 752 vydaný 30. augusta 1994 pre Platza et al. objavuje použite zlúčenín na báze akridínových farbív pre redukovanie parazitných kontaminantov krvi zahrňujúcich červené krvinky, krvné doštičky a proteínové frakcie krvnej plazmy. Tieto materiály, hoci s celkom nízkou toxicitou, majú nejakú toxicitu, napr. pre červené krvinky. Tento patent nepopisuje zariadenie na odstránenie kontaminantov krvi na základe prietoku. US patent č. 5 798 238 Goodricha Jr., et al., popisuje použitie chinolónu a chinolónových derivátov na dezaktiváciu virálnych a bakteriálnych kontaminantov.

Viazanie DNA s fotoaktívnymi činidlami bolo využité v procesoch redukovania lymfocytových populácií v krvi, ako sa uvádza v US patente č. 4 612 007 vydanom 16. septembra 1986 a k nemu blízkom U S patente č. 4 683 889 vydanom 4. augusta 1987 pre Edelsona.

Riboflavín (7,8-dimetyl-1O-ribityl izoaloxazín) bol zaznamenaný pre rozrušovanie nukleových kyselín. Fotoprestavbu nukleovej kyseliny v prítomnosti riboflavínu rozobral Tsugita, a, et al. (1965) v „Photosensitized Inactivation of Ribonuleic Acids in the Presence of Riboflavin“, Biochimica et Biophysica Acta 103:360-363; a Specka, W.T. et al. (1976), „Further Observations on the Photooxidation of DNA in the Presence of Riboflavin“, Biochimica et Biophysica Acta 435:39-44. Viazanie lumiflavínu (7,8,10-timetylizoaloxazín) na DNA rozobral Kuratomi, K., et al. (1977), v „Studies on the Interactions between DNA and Flavins“, Biochimica et Biophysica Acta 476:207-217. Hoffmann, M.E., et al. (1979), v „DNA Strand Breaks in Mammalian celíš Exposed to Light in the Presence of Riboflavin and Tryptophan“, Photochemistry and Photobiology 29:299-303 popisuje použitie riboflavínu a tryptofánu na indukovanie rozkladu DNA buniek cicavcov po vystavení viditeľnému fluorescentnému svetlu alebo svetlu blízko ultrafialového spektra. Tento článok konštatuje, že tieto efekty sa nevyskytli, ak riboflavin alebo tryptofán bol z tohto prostredia vypustený. Reťazec DNA sa rozkladá po vystavení žiareniu na proflavín a svetlo a sú zaznamenané u Pietteho, J. et al. (1979), v „Production of Breaks in Single- and Double-Stranded Forms of Bacteriophage ΦΧ174 DNA by Proflavine and Light Treatment“, Photochemistry and Photobiology 30:369-378, a premena guanínových rezíduí počas proflavínom sprostredkovanej fotosenzibilácie DNA je rozobraná u Pietta, J., et al. (1981), v „Alteration of Guanine Residues during Proflavín Mediated Photosenzitization of DNA“, Photochemistry and Photobiology 33:325-333.

J. Cadet, et al. (1983), v „Mechanisms and Products of Photosensitized Degradation of Nucleic Acids and Related Model Compounds“, Israel J. Chem. 23:420-429, rozoberá mechanizmus pôsobenia pomocou produkcie singletového kyslíka, bengálskej ružovej, metylénovej modrej, tionínu a ďalších farbív porovnaný s mechanizmami nezahrňujúcimi produkciu singletového kyslíka, ktorým nukleové kyseliny napádajú postupy flavínových alebo pterónových derivátov. Riboflavin je uvedený ako príklad v tomto objave ako majúci schopnosť rozložiť nukleové kyseliny. Korycka-Dahl, M., et al. (1980), v „Photodegradation of DNA with Fluorescent Light in the Presence of Riboflavin, and Photoprotection by Flavin Triplet-State Quenchers“, Biochimica et Biophysica Acta 610:229-234 tiež popisujú, že aktívne druhy kyslíka nie sú priamo zahrnuté v štiepení DNA pomocou riboflavínu. Peak, J.G., et al. (1984), v „DNA Breakage Caused by 334 nm Ultraviolet Light is Enhanced by Naturally Occuring Nucleic Acid Components and Nucleotide Coenzymes, Photochemistry and Photobiology 39: 713-716 ďalej objasňuje mechanizmus pôsobenia riboflavínu a ďalších fotosenzibilátorov. Avšak neboli vykonané žiadne návrhy, že takéto fotosenzibilátory sú použité na odstránenie dekontaminácie telesných tekutín.

Zariadenia na dekontamináciu krvi boli popísané v US patente č. 5 290 221 vydanom 1. marca 1994 pre Wolfa, Jr., et al. a US patente č. 5 536 238 vydanom 16. júla 1996 pre Bischofa. US patent č. 5 290 221 popisuje ožiarenie tekutín v relatívne úzkom oblúkovité prehnutom otvore. US patent č. 5 536 238 popisuje jednotky využívajúce optické vlákna rozširujúce sa do filtračného média. Oba patenty doporučujú ako fotosenzibilátory benzoporfyrínové deriváty, ktoré majú afinitu k bunkovým stenám.

Všetky publikácie, ktoré sa tohto dotýkajú, sú týmto zahrnuté referenciou do takej miery, ktorá nie je s uvádzaným v rozpore.

Podstata vynálezu

Spôsoby a zariadenia sú uskutočnené na upravovanie tekutín alebo ďalšieho materiálu, aby boli dezaktivované aspoň niektoré mikroorganizmy a biele krvinky, ktoré môžu byť prítomné v nich alebo na nich. Takéto tekutiny môžu tiež obsahovať jednu alebo viac zložiek vybraných zo skupiny obsahujúcej protein, napr. biologicky aktívny protein ako terapeutický protein, krv a krvné súčasti bez zničenia biologickej aktivity takých zložiek. Spôsoby zahrňujú:

a) zmiešanie účinného netoxického množstva endogénneho fotosenzibilátora alebo drivovaného fotosenzibilátora na endogénnej báze s tekutinou;

b) vystavenie tekutiny fotoradiácii dostatočnej pre aktiváciu fotosenzibilátora; čím sú aspoň niektoré mikroorganizmy dezaktivované.

Jeden mechanizmus pomocou ktorého tieto fotosenzibilátory môžu dezaktivovať mikroorganizmy je interferencia s nukleovými kyselinami tak, aby sa zabránilo replikách nukleovej kyseliny.

Ako tu bol použitý, pojem „dezaktivácia mikroorganizmu“ znamená celkové alebo čiastočné zabraňovanie mikroorganizmu z replikácie, buď zabitím mikroorganizmu alebo inak, interferujúcemu s jeho schopnosťou reprodukovať.

Mikroorganizmy zahrňujú vírusy (mimobunkové a vnútrobunkové), baktérie, baktériofágy, huby, krvou prenášané parazity a protozoa. Príklady vírusov zahrňujú získaný imunodeficitný (HIV) vírus, vírusy hepatitídy A, B a C, sinbis vírus, cytomegalovírus, vezikulámy stomatitídny vírus, vírusy herpex simplex, napr. typy I a II, ľudské T-lymfotropné retrovírusy, HTLV-III, lymfodenopatický vírus LAV/IDAV, parvovírus, transfúziou prenášaný (TT) vírus, Epstein-Barrov vírus a ďalšie známe v stave techniky. Baktériofágy zahrňujú ΦΧ174, Φ6, λ, R17, T₄, a T₂. Príklady baktérií zahrňujú P. aeruginosa, S. aureus, S. epidermidis, L. monocytogenes, E.coli, K pneumoniae a S. marcescens.

Dezaktivácia bielych krviniek môže byť žiaduca, keď je požadované potlačenie imúnnej alebo autoimúnnej odpovede, napr. v procesoch zahrňujúcich transfúzie červených krviniek, krvných doštičiek alebo plazmy, keď je prítomný donor bielych krviniek.

Materiály, ktoré môžu byť upravované týmito spôsobmi obsahujú všetky materiály, ktoré sú primerane priepustné pre fotoradiáciu, aby sa zabezpečilo dostatočné svetlo pre dosiahnutie virálnej dezaktivácie, alebo ktoré môžu byť suspenzované alebo rozpustené v tekutinách, ktoré majú takú priepustnosť pre fotoradiáciu. Príkladmi takých materiálov sú všetky krvné a vodné kompozície obsahujúce biologicky aktívne proteíny odvodené od krvi alebo krvných súčastí. Príkladmi takých krvných súčastí sú do obalu uložené červené krvinky, krvné doštičky a plazma (čerstvá alebo čerstvo zmrazená plazma). Naviac, dekontaminačnými spôsobmi podlá tohto vynálezu môžu byť upravované terapeutické proteínové kompozície obsahujúce proteíny odvodené od krvi, ako sú tekutiny obsahujúce biologicky aktívny proteín užitočný na liečenie zdravotných porúch, napr. faktor VIII, Von Willebrandov faktor, faktor IX, faktor X, faktor XI, Hagemanov faktor, protrombín, anti-trombín III, fibronektín, plazminogén, proteínové frakcie plazmy, imúnne sérum globulínu, modifikovaný imúnny globulín, albumín, rastový hormón plazmy, somatomedin, plazminogén streptokinázový komplex, ceruloplazmín, transferín, haptoglobln, antitrypsín a prekallikrein. Ďalšie tekutiny, ktoré môžu získať z upravovania podľa tohto vynálezu sú peritoneálne roztoky používané na peritoneálne dialýzy, ktoré sú niekedy kontaminované pri styku, vedúcom k peritoneálnym infekciám.

Pojem „biologicky aktívne“ znamená schopné uskutočnenia zmeny v živom organizme alebo jeho zložkách. „Biologicky aktívne vzhľadom na „biologicky aktívny

Ί protein“ ako je tu uvedené, sa netýka proteínov, ktoré sú časťou mikroorganizmov, ktoré sú dezaktivované. Podobne „netoxické vzhľadom na fotosenzibilátory znamenajú nízku alebo žiadnu toxicitu pre ľudí a iné cicavce, a neznamenajú netoxické pre mikroorganizmy, ktoré sú dezaktivované. „Podstatná deštrukcia“ biologickej aktivity znamená takú deštrukciu, aká je spôsobená porfyrínom a porfyrínovými derivátmi, metabolitmi a prekurzormi, o ktorých je známe, že majú poškodzovací efekt na biologicky aktívne proteíny a bunky ľudí a cicavcov. Podobne, „v podstate netoxické“ znamená menej toxické než porfyrín, porfyrínové deriváty, metabolity a prekurzory, ktoré sú známe v krvnej sterilizácii.

Pojem „krvný produkt“ ako je tu použitý zahrňuje krvné súčasti a terapeutické proteínové kompozície obsahujúce proteíny z krvi, ako bolo definované vyššie. Tekutiny obsahujúce biologicky aktívne proteíny iné než tie, ktoré sú odvodené z krvi, môžu byť upravované spôsobmi podľa tohto vynálezu.

Spôsoby dekontaminácie podľa tohto vynálezu použitím endogénnych fotosenzibilátorov a derivovaných fotosenzibilátorov na endogénnej báze v podstate nepoškodia biologickú aktivitu tekutinových zložiek iných než mikroorganizmov. Keďže biologická aktivita týchto zložiek je podľa možnosti zachovaná, hoci v určitých prípadoch, keď sú spôsoby optimalizované, niektoré strácajú biologickú aktivitu, napríklad denaturalizáciou proteínových zložiek, musia byť vyvážené voči účinnej dekontaminácii tekutiny. Keďže tekutinové zložky zachovávajú dostatočnú biologickú aktivitu užitočnú pre ich zamýšľané alebo prirodzené účely, ich biologické aktivity nie sú považované za „v podstate zničené“.

Fotosenzibilátory užitočné v tomto vynáleze zahrňujú všetky fotosenzibilátory známe v stave techniky, ktoré sú užitočné pre dezaktiváciu mikroorganizmov. „Fotosenzibilátoŕ“ je definovaný ako akákoľvek zlúčenina, ktorá absorbuje žiarenie jednej alebo viacerých vlnových dĺžok a následne využíva absorbovanú energiu na vykonanie chemického procesu. Príklady takých fotosenzibilátorov zahrňujú porfyríny, psoralény, farbivá, ako je neutrálna červená, metylénová modrá, akridín, toluidiny, flavín (akriflavín hydrochlorid) a fenotiazinove deriváty, kumaríny, chinolóny, chinóny a antrachinóny. Fotosenzibilátory podľa tohto vynálezu môžu zahrňovať zlúčeniny, ktoré prednostne absorbujú nukleové kyseliny, a tak zamerajú svoj fotodynamický účinok na mikroorganizmy a vírusy s malým alebo žiadnym účinkom na sprievodné bunky alebo proteíny. Ďalšie fotosenzibilátory sú tiež užitočné v tomto vynáleze, ako sú tie, ktoré používajú mechanizmy závislé na singletovom kyslíku.

Najprednostnejšími sú endogénne senzibilátory. Pojem „endogénne“ znamená prirodzene zistené v ľuskom tele alebo v tele cicavcov, buď ako výsledok syntézy prostredníctvom tela alebo z dôvodu prijímania základnej potravy (napríklad vitamínov) alebo vytvorením metabolitov a / alebo vedľajších produktov in vivo. Príkladmi takých endogénnych senzibilátorov sú aloxazíny, ako je 7,8-dimetyl-10ribityl-izoaloxazín (riboflavín), 7,8,10-trimetyl-izoaloxazín (lumiflavín), 7,8dimetylaloxazín (lumichróm), izoaloxazín-adenín dinukleotid (flavín adenín nukleotid [FAD]), aloxazín mononukleotid (tiež známy ako flavín mononukleotid [FMN] a riboflavín-5-fosfát), vitamín Ks, vitamín L, ich metabolity a prekurzory, a naftochinóny, naftalény, naftoly a ich deriváty majúce rovinné molekulové usporiadanie). Pojem „aloxazín“ zahrňuje izoaloxazíny. Derivované fotosenzibilátory na endogénnej báze zahrňujú odvodené analógy a homológy endogénnych fotosenzibilátorov, ktoré môžu mať alebo nemajú nižšie (1-5) alkylové alebo halogénové substituenty fotosenzibilátorov, z ktorých sú odvodené, a ktoré zabezpečujú ich funkciu a podstatnú netoxicitu. Keď sú použité endogénne senzibilátory, najmä keď také fotosenzibilátory nie sú inherentne toxické alebo neumožňujú vznik toxických poloproduktov po fotoradiácii, nie je vyžadovaný po dekontaminácii žiaden krok odstránenia alebo čistenia, a upravený produkt môže byť priamo vrátený do tela pacienta aiebo podávaný pacientovi, ktorý potrebuje tento terapeutický účinok. Prednostné endogénne senzibilátory sú:

ch₂oh

HOCH

I

HOCH

I

7,8-dimetylaloxazín

7,8-dimetyl-10-ribityl-izoaloxazín

izoaloxazín-adenín dinukleotid

K) ch₂opo,²'

I

HOCH

I

aloxazín mononukleotid

vitamín K1

vitamín K2

vitamín K5

vitamín K-S(ll)

CH₃ vitamín K6

vitamín L

Spôsob podľa tohto vynálezu požaduje zmiešanie fotosenzibilátorov s materiálom, ktorý má byť dekontaminovaný. Zmiešanie môže byť vykonané jednoducho pridaním fotosenzibilátora alebo roztoku obsahujúceho fotosenzibilátor do tekutiny, ktorá má byť dekontaminovaná. V jednom uskutočnení materiál, ktorý má byť dekontaminovaný, do ktorého je pridaný fotosenzibilátor, preteká po fotoradiačnom zdroji a prietok metariálu vo všeobecnosti uskutočňuje dostatočnú turbulenciu pre distribuovanie fotosenzibilátora naprieč tekutinou, ktorá má byť dekontaminovaná. V ďalšom uskutočnení sú tekutina a fotosenzibilátor umiestnené vo fotopriepustnej nádobe a ožiarené dávkovým spôsobom, prednostne pričom je miešanie nádoby pre úplné distrubuovanie fotosenzibilátora a vystavenie všetkej tekutiny ožiareniu.

Množstvo fotosenzibilátora, ktoré má byť zmiešané s tekutinou, bude množstvo dostatočné na primeranú dezaktiváciu mikroorganizmov, ktoré sú v nej, ale menšie než toxické (pre človeka alebo iné cicavce) alebo nerozpustné množstvo. Ako tu bolo uvedené, optimálne koncentrácie pre zvolené fotosenzibilátory môžu byť pohotovo určené osobami vzdelanými v stave techniky bez zbytočne veľkého experimetovania. Prednostne je fotosenzibilátor použitý s koncentráciou aspoň asi 1 μΜ až po rozpustnosť fotosenzibilátora v tekutine, a prednostne asi 10 μΜ. U 7,8dimetyl-10-ribityl-izoaloxazínu je preferované rozpätie koncentrácie medzi asi 1 μΜ a asi 160 μΜ, prednostne asi 10 μΜ.

Tekutina obsahujúca fotosenzibilátor je vystavená fotoradiácii príslušnej vlnovej dĺžky pre aktiváciu fotosenzibilátora použitím množstva fotoradiácie dostatočného pre aktiváciu fotosenzibilátora, ako bolo popísané vyššie, ale menšieho než ktoré by spôsobovalo nešpecifické poškodenie biologických zložiek alebo v podstate interferovalo s biologickou aktivitou ďalších proteínov prítomných v tekutine. Použitá vlnová dĺžka závisí na vybranom fotosenzibilátore, čo je známe v stave techniky alebo pohotovo určiteľná bez zbytočne veľkého experimetovania nasledujúceho po uvedení týchto poznatkov. Prednostne je svetelným zdrojom fluorescentný alebo luminiscentný zdroj zabezpečujúci svetlo so žiarením asi 300 nm až asi 700 nm, a prednostnejšie asi 340 nm až asi 650 nm. Pre tento vynález sú užitočné vlnové dĺžky v ultrafialovej až viditeľnej oblasti. Svetelný zdroj alebo zdroje môžu zabezpečovať svetlo vo viditeľnom a ultrafialovom rozmedzí, prednostnejšie asi polovicu vo viditeľnom a polovicu v ultrafialovom spektre, hoci môžu byť použité aj ďalšie pomery. Jeden prínos zmesi svetla je vtom, že viditeľné spektrum nepoškodzuje krvné doštičky, ale redukuje požadované množstvo veľmi škodlivého ultrafialového žiarenia.

Aktivovaný fotosenzibilátor je schopný dezaktivácie prítomných mikroorganizmov, napríklad interferovaním pre zabránenie ich replikácii. Špecifickosť pôsobenia senzibilátora je preukázaná pomocou blízkosti fotosenzibilátora k nukleovým kyselinám mikroorganizmu a toto môže vychádzať zviazania fotosenzibilátora k nukleovej kyseline. „Nukleová kyselina“ zahrňuje ribonukleovú kyselinu (RNA) a dezoxyribonukleovú kyselinu (DNA). Ďalšie fotosenzibilátory môžu pôsobiť viazaním na bunkové membrány alebo inými mechanizmami. Fotosenzibilátor môže tiež zameraný na mikroorganizmus, ktorý má byť dezaktivovaný, pomocou kovalentnej väzby s protilátkou, prednostne špecificky monoklonálnou protilátkou k mikroorganizmu.

Tekutina obsahujúca fotosenzibilátor môže pretekať do fotopriepustnej nádoby pre ožiarenie. Pojem „nádoba zodpovedá uzavretému alebo otvorenému priestoru, ktorý môže byť vyrobený pevného alebo flexibilného materiálu, napríklad môže byť byť vreckom alebo krabicou alebo vaničkou. Môže byť uzavretá alebo otvorená navrchu a môže mať otvory na oboch svojich koncoch, napríklad môže byť trubicou alebo hadicou, aby umožňovala prietok tekutiny. Ako príklad jedného uskutočnenia tohto vynálezu zahrňujúceho prietokový systém môže byť použitá kyveta. Odberové vrecká, ako sa používajú uTrima™ Spectra™ a aferentných systémov Cobe Laboratories, Inc., boli používané ako príklad ďalšieho uskutočnenia zahrňujúceho upravovanie tekutiny s prerušovanými dávkami.

Pojem „fotopriepustné znamená, že materiál nádoby je primerane priesvitný pre fotoradiáciu charakteristickej vlnovej dĺžky pre aktivovanie fotosenzibilátora. V prietokovom systéme má nádoba hĺbku (rozmer meraný v smere žiarenia od fotoradiačného zdroja) dostatočnú na to, aby umožnila fotoradiácii primeranú penetráciu v nádobe pre kontakt fotosenzibilátorových molekúl vo všetkých vzdialenostiach od svetleného zdroja a zaistaila dezaktiváciu mikroorganizmov v tekutine, ktorá má byť dekontaminovaná, a dĺžku (rozmer v smere toku tekutiny) dostatočnú na to, aby zaistila dostatočný expozičný čas kvapaliny pre fotoradiáciu. Materiály na vyrobenie takých nádob, hĺbka a dĺžka nádob môžu byť ľahko určené osobami vzdelaným v stave techniky bez zbytočne veľkého experimetovania nasledujúceho po uvedení týchto poznatkov a spolu s rýchlosťou prietoku tekutiny cez nádobu, intenzitou fotoradiácie a pohltivosťou zložiek tekutiny, napríklad plazmy, krvných doštričiek, červených krviniek, určia množstvo času, ktorý je pre kvapalinu potrebný na vystavenie fotoradiácii. U 7,8-dimetyl-10-ribityl izoaloxazínu je prednostné množstvo žiarenia medzi asi 1 J/cm² až 120 J/cm².

V ďalšom uskutočnení zarňujúcom upravovanie s prerušovanou dávkou je upravovaná tekutina umiestnená vo fotopriepustnej nádobe, ktorá je miešaná a vystavená fotoradiácii po dobu dostatočnú na v podstate dezaktiváciu mikroorganizmov. Fotopriepustná nádoba je prednostne krvné vrecko, vyrobené z priesvitného alebo polopriestvitného vrecka a miešanie je prednostne vibrovací stôl. Fotosenzibilátor môže byť pridaný do nádoby v práškovej alebo v kvapalnej forme a nádoba je miešaná tak, aby sa premiešal fotosenzibilátor s tekutinou a aby bola všetka tekutina primerane vystavená fotoradiácii pre zaistenie dezaktivácie mikroorganizmov.

Fotosenzibilátor môže byť pridaný alebo môže pritekať do fotopriepustnej nádoby jednotlivo z kvapaliny, ktorá je upravovaná alebo môže byť pridaný do kvapaliny pred umiestením kvapaliny v nádobe. V jednom uskutočnení je fotosenzibilátor pridaný k antikoagulátoru a zmes fotosenzibilátora a antikoagulátora sú pridané do kvapaliny.

Urýchľovače vlastností procesu môžu byť pridané do kvapaliny tiež, aby urobili proces účinnejším a selektívnejším. Takéto urýchľovače zahrňujú antioxidanty alebo iné činidlá na zabránenie poškodenia žiadúcich zložiek tekutiny alebo na zlepšenie rýchlosti dezaktivácie mikroorganizmov a príkladom sú adenín, histidín, cystein, tyrozín, tryptofán, askorbát, N-acetyl-L-cystein, propylgalát, glutation, merkaptopropionylglycín, ditiotreotol, nikotinamid, BHT, BHA, lyzín, serín, metionín, glukóza, manitol, trolox, glycerol a ich zmesi.

Tento vynález tiež zahrňuje tekutiny obsahujúce biologicky aktívny protein, krv alebo krvné zložky a tiež obsahuje endogénny fotosenzibilátor, derivovaný fotosenzibilátor na endogénnej báze, alebo ich poloprodukty vytvorené spôsobom podľa nároku 1. Tekutina môže tiež obsahovať dezaktivované mikroorganizmy.

Naviac, pri dekontaminácii nezmiešanej krvi, tekutín obsahujúcich krvné produkty a biologicky aktívne proteíny, je tento spôsob užitočný pre upravovanie ďalších tekutín vrátane tekutín, ktoré sú určené na výživu ľudí alebo zvierat, ako je voda, ovocie, džúsy, mlieko, bujóny, polievky a podobne. Spôsob je taktiež užitočný pre upravovanie peritoneálnych alebo parenterálnych roztokov.

Tento vynález taktiež zahrňuje spôsoby na upravovanie povrchov pre dezaktiváciu mikroorganizmov, ktoré môžu byť v nich prítomné, zahrňujúcich aplikovanie na také povrchy dezaktivačne efektívneho, netoxického množstva endogénneho fotosenzibilátora alebo derivovaného fotosenzibilátora na endogénnej báze a vystavenie fotoradiácii dostatočnej pre aktivovanie fotosenzibilátora. Povrchom môže byť povrch, ako je ovocie, zelenina alebo trup jatočného zvieraťa, alebo povrch rozkrojených alebo spracovaných potravín. Časticové produkty, ako sú masá, môžu byť upravované zmiešaním fotosenzibilátora s materiálom a pokračovanie premiešaním pri ožiarení, aby boli vystavené čerstvé povrchy fotoradiácii.

Povrchom môže byť alternatívne preparatívny povrch pre potraviny, ako je opak veka alebo povrch police, alebo môže byť povrchom nádoba pre kúpeľ alebo umývanie, ako je kuchynský drez, vaňa alebo sauna, alebo kúpalisko alebo podobne. Naviac, povrchom môže byť povrch živých zvierat alebo rastlím, alebo môže byť povrch rany.

Fotosenzibilátor môže byť aplikovaný na vhodnom nosiči, ako je voda alebo roztok obsahujúci ďalšie aditíva pre úpravu, prostredníctvom sprejovania, ponorenia, otierania o niečo, alebo inými prostriedkami známymi v stave techniky. Množstvo fotosenzibilátora a fotoradiačná energia vyžadované pre upravovanie budú pohotovo určené osobou vzdelanou v stave techniky bez zbytočne veľkého experimentovania v závislosti na úrovni kontaminácie a materiáli, ktorý má byť upravovaný.

Tento vynález tiež uskutočňuje spôsob upravovania tekutiny alebo iného materiálu, ako bol spomenutý vyššie, pre dezaktiváciu mikroorganizmov, ktoré môžu byť v ňom prítomné, ktorý zahrňuje pridanie dezaktivačne efektívneho, netoxického množstva vitamínu K5 k uvedenej tekutine alebo k inému materiálu. Prednostne, ale nie nevyhnutne, sú tekutina alebo iný materiál ožiarené pre zlepšenie dezaktivácie mikroorganizmov. V niektorých prípadoch použitím vitamínu K5 sa dezaktivácia vyskytuje pri izbovom svetle alebo v tme, ako bude ďalej rozobrané v Príkladoch, ktoré budú nasledovať. Tekutiny obsahujúce červené krvinky sú preferované pre upravovanie vitamínom K5 v prítomnosti krtoku fotoradiácie. K5 zlúčenina sa môže tiež trubkovito usadiť na povlečené povrchy, ako je krv alebo peritoneálna dialýza, pre zaistenie sterilných stykov alebo sterilného spojenia.

V dekontaminačných systémoch podľa tohto vynálezu môže byť fotoradiačný zdroj spojený s fotopriepustnou nádobou pre tekutinu pomocou prostriedkov svetelného rozvádzača, ako je svetelný kanál alebo trubica s optickými vláknami, ktorá zabraňuje rozptylovaniu svetla medzi zdroj a nádobu pre tekutinu, a dôležitejšie, zabraňuje v podstate zahrievaniu tekutiny v nádobe. Priame vystavenie svetelnému zdroju môže zvýšiť teplotu o 10°C až 15°C, najmä keď množstvo tekutiny vystavené svetlu je malé, čo môže spôsobiť denaturalizáciu kvných zložiek. Použitie svetelného rozvádzača udržuje akékoľvek zahrievanie na menej než 2°C. Spôsob môže tiež zahrňovať použitie teplotných senzorov a chladiacich mechanizmov, keď je potrebné udržovať teplotu pod teplotami, pri ktorých sú žiadúce proteiny v tekutine poškodené. Prednostne, teplota je udržovaná medzi asi 0°C a asi 45°C, prednostnejšie medzi asi 4°C a asi 37°C a najprednostnejšie asi 22°C.

Tento vynález tiež uskutočňuje systém na upravovanie tekutiny pre dezaktiváciu mikroorganizmov, ktoré môžu byť v nej prítomné, zahrňujúci:

a) nádobu obsahujúcu uvedenú tekutinu a endogénny fotosenzibilátor alebo derivovaný fotosenzibilátor na endogénnej báze, uvedená nádoba je vybavená vstupnými prostriedkami a má fotopriepustný povrch dostatočný pre vystavene tekutiny, ktorú obsahuje, množstvu fotoradiácie dostatočnej pre aktivovanie fotosenzibilátora;

b) aspoň jeden fotoradiačný zdroj pre uskutočnenie dostatočnej fotoradiácie na tekutinu v uvedenej nádobe v type a množstve vybranom pre aktivovanie fotosenzibilátora, čím sú prítomné mikroorganizmy v podstate dezaktivované.

Fotoradiačným zdrojom môže byť zdroj viditeľného žiarenia alebo ultrafialového žiarenia alebo oba. Prednostne je uskutočnené viditeľné aj ultrafialové žiarenie a prednostnejšie je fotoradiáciou asi polovica ultrafialového a polovicu viditeľného žiarenia, hoci u oboch môžu byf použité aj iné pomery. Fotoradiácia v ultrafialovom aj viditeľnom spektre môže byť zavádzaná súčasne alebo následne, s podielom viditeľného spektra zavádzaným ako prvým. Fotoradiačným zdrojom môže byť jednoduchá lampa alebo môže obsahovať viaceré lampy žiariace s rôznymi vlnovými dĺžkami. Fotoradiačný zdroj by mal dodávať asi od 1 do aspoň asi 120 J/cm². Použitie zmiešaného ultrafialového a viditeľného svetla je preferované najmä vtedy, keď fotosenzibilátor je taký, že stráca svoju kapacitu pre absorbovanie viditeľného svetla po dobe expozície, napríklad

7,8-dimetyl-10-ribityl-izoaloxazín.

Môžu byť použité všetky prostriedky pre pridanie fotosenzibilátora k tekutine, ktorá má byť dekontaminovaná, a pre umiestnenie tekutiny vo fotopriepustnej nádobe známe v stave techniky, napríklad prostriedky typicky zahrňujúce prietokové trubice, vstupy, nádrže, ventily a podobne. Prednostne systém zahrňuje prostriedky, ako sú čerpadlá alebo nastaviteľné ventily na kontrolovanie prietoku fotosenzibilátora do kvapaliny, ktorá má byť dekontaminovaná tak, že jeho koncentrácia môže byť kontrolovaná na účinných hodnotách, ako bolo popísané vyššie. V jednom uskutočnení je fotosenzibilátor zmiešaný s antikoagulátorom privádzaným do krvného aferentného systému. U endogénnych fotosenzibilátorov a derivátov majúcich podiel cukru je prednostne udržované dosť nízke pH roztoku, ako je známe v stave techniky, pre zabránenie separácii podielu cukru. Prednostne je fotosenzibilátor pridaný do tekutiny, ktorá má byť dekontaminovaná, vo vopred zmiešanom vodnom roztoku, napríklad vo vode alebo v zásobnom pufrovom roztoku.

Fotopriepustná nádoba pre prietokový systém môže byť priehľadná kyveta vyrobená z polykarbonátu, skla, kremeňa, polystyrénu, polyvinylchloridu, polyolefínu alebo ďalších priehľadných materiálov. Kyveta môže byť uzavretá v radiačnej komore majúcej zrkadlové steny. Urýchľovače fotoradiácie, ako je druhý fotoradiačný zdroj alebo reflektívny povrch, môžu byť umiestnené priľahlé ku kyvete pre zvýšenie množstva fotoradiácie, ktorá je v kontakte s tekutinou v kyvete. Systém prednostne zahrňuje čerpadlo pre nastavenie rýchlosti prietoku tekutiny na požadované hodnoty pre zaistenie podstatnej dekontaminácie, ako bolo popísané vyššie. Kyveta má dĺžku koordinovanú s rýchlosťou prietoku, aby bola tekutina vo vnútri vystavená dostatočnej fotoradiácii pre svoju účinnú podstatnú dekontamináciu.

Prednostne je kyveta od svetelného zdroja v dostatočnej vzdialenosti, aby sa nevyskytovalo zahrievanie tekutiny v kyvete, a svetlo je prenesené zo svetelného zdroja do kyvety prostriedkami svetelného rozvádzača.

V ďalšom uskutočnení je tekutina umiestnená vo fotopriepustnej nádobe, ako je krvné vrecko, napr. používané v aferentnom systéme popísanom v US patente č. 5 653 887, a premiešaná, kým je vystavená fotoradiácii. Vhodné vrecká zahrňujú odberové vrecká, ako bolo už popísané. Odberové vrecká použité v Spectra™ systéme alebo Trima™ aferentnom systéme Cobe laboratories, Inc. sú zvlášť vhodné. Vibrovacie stoly sú známe v stave techniky, napríklad popísané v US patente č. 4 880 788. Vrecká sú vybavené aspoň jedným vstupom, ktorým sa do nich pridáva tekutina. V jednom uskutočnení je fotosenzibilátor, prednostne 7,8dimetyl-10-ribityl-izoaloxazín, pridaný do tekutinou naplneného vrecka v práškovej forme. Vrecko je potom umiestnené na vibrovací stôl a premiešané pri fotoradiácii až kým je v podstate celá tekutina bola vystavená fotoradiácii. Alternatívne môže byť vrecko vopred obalené práškovým fotosenzibilátorom v ňom obsiahnutým. Tekutina, ktorá má byť dekontaminovaná, môže byť potom pridaná cez príslušný vstup.

Dekontaminačné systémy, popísané vyššie, môžu byť navrhnuté ako samostatne stojace jednotky alebo môžu byť ľahko začlenené do existujúcich zariadení známych v stave techniky pre separovanie alebo upravovanie krvi odoberanej alebo podávanej pacientovi. Napríklad, také zariadenia na zaobchádzanie s krvou zahrňujú COBE Spectra™ alebo TRIMA® aferentné systémy, dostupné od Cobe Laboratories, Inc., Lakewood, CO, alebo zariadenia popísané v US patente č. 5 653 887 a US čísle prihlášky 08/924 519 podanej 5. septembra 1997 (PCT Publication No. WO 99/11305) od Cobe Laboratories, Inc., ako aj aferentné systémy od iných výrobcov. Dekontaminačný systém môže byť vložený len po prúde bodu, kde krv je odoberaná od pacienta alebo donora, iba pred vložením krvného produktu pacientovi, alebo v akomkoľvek bode pred alebo po separovaní krvných súčastí. V prednostnom uskutočnení je fotosenzibilátor pridaný ku krvným zložkám spolu s antikoagulátorom, a separované zdroje žiarenia a kyvety sú umiestnené po prúde odberových bodov pre krvné doštičky, plazmu a červené krvinky. Použitie troch oddelených krvných dekontaminačných systémov je preferované pri umiestnení jednotlivého krvného dekontaminačného systému proti prúdu krvnej separačnej nádrže aferentného systému, pretože nižšia rýchlosť prietoku vo vedení jednotlivých zložiek umožňuje väčšie uľahčenie žiarenia. V ďalšom uskutočnení môžu byť dekontaminačné systémy podľa tohto vynálezu použité na spracovanie predtým odobraných a uložených krvných produktov.

Keď sú v tekutine, ktorá má byť upravovaná, prítomné červené krvinky, čo bude ohodnotené osobami vzdelanými v stave techniky, na vyrovnanie absorpcie svetla bunkami môže byť tekutina riedená, vystavená vyšším radiačným energiám po dlhší čas, premiešaná po dlhší čas alebo prítomná pre fotoradiáciu v plytkých nádobách alebo trubiciach než je potrebné pre použitie pri iných krvných zložkách.

Tu popísané endogénne fotosenzibilátory a derivované fotosenzibilátory na endogénnej báze môžu byť použité v už existujúcich dekontaminačných systémoch krvných zložiek, ako aj v dekontaminačnom systéme tu popísanom. Napríklad endogénne fotosenzibilátory a drivované fotosenzibilátory na endogénnej báze podľa tohto vynálezu môžu byť použité v dekontaminačných systémoch popísaných v US patente č. 5 290 221, 5 536 238, 5 290 221 a 5 536 238.

Ako je popísané vyššie, aditívne roztoky s krvnými doštičkami zahrňujúce endogénne fotosenzibilátory a derivované fotosenzibilátory na endogénnej báze, sú v tomto tiež uskutočnené. Aditívne roztoky s krvnými doštičkami známe v stave techniky môžu byť použité na tento účel a zahrňujú tie, ktoré boli popísané v US patente č. 5 908 742, 5 482 828, 5 569 579, 5 236 716, 5 089 146 a 5 459 030. Také aditívne roztoky a krvnými doštičkami môžu obsahovať fyziologický slaný roztok, pufor, prednostne fosfát sodný, a iné zložky vrátane chloridu horečnatého a glukonátu sodného. pH takých roztokov je prednostne medzi asi 7,0 a 7,4. Tieto roztoky sú užitočné ako nosiče koncentrátov krvných doštičiek, aby sa udržiovala kvalita buniek a metabolizmus pri uložení, redukoval obsah plazmy a predĺžila doba pre uloženie. Fotosenzibilátor môže byť prítomný v takých roztokoch v akejkoľvek požadovanej koncentrácii od asi 1 μΜ po rozpustnosť fotosenzibilátora v roztoku, a prednostne medzi asi 10 μΜ a asi 100 μΜ, prednostnejšie asi 10 μΜ. V prednostnom uskutočnení aditívny roztok s krvnými doštričkami zahrňuje octan sodný, chlorid sodný, glukonát sodný, 1,5 mM chlorid horečnatý, 1mM fosfát sodný, 14 μΜ 7,8dimetyl-10-ribityl-izoaloxazín a prednostne tiež 6 mM askorbát.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 znázorňuje absorbančné spektrum riboflavínu.

Obr. 2 znázorňuje vzťah medzi absorbanciou svetla a hematokritom pozorovaný a predpokladaný u červených krviniek a predpokladaný u krvných doštičiek.

Obr. 3 znázorňuje fotorozklad roztoku riboflavínu v antikoaguláte Acid Citrate Dextrose (ACD) v čase. Plná čiara s kruhmi indikuje percentá počiatočného zostatku riboflavínu pri 373 nm. Prerušovaná čiara so štvorcami indikuje percentá počiatočného zostatku riboflavínu pri 447 nm.

Obr. 4 znázorňuje prenosový profil rôznych plastových kyvet ako funkciu vlnovej dĺžky. Plná čiara predstavuje 3,2 mm akrylovú kyvetu. Prerušovaná čiara (-—) predstavuje 3,2 mm UV akrylovú kyvetu. Dlhá prerušovaná čiara (----) predstavuje 3,2 mm polystyrénovovú (PS) kyvetu, a krížiková čiara indikuje 3,2 mm polykarbonátovú (PC) kyvetu.

Obr. 5 znázorňuje potrebný svetelný tok v mW na cm² ako funkciu rýchlosti prúdu, t.j. tok potrebný na dodanie jedného joule/cm² vzorke v kyvete.

Obr. 6 znázorňuje zariadenie na separáciu krvi zahrňujúce fotoradiačný prístroj podľa tohto vynálezu.

Obr. 7 znázorňuje dekontaminačnú zostavu podľa tohto vynálezu.

Obr. 8 znázorňuje dezaktiváciu baktérií v preparátoch krvných doštičiek použitím vitamínu K5 ako fotosenzibilátora ako funkciu radiačnej energie.

Obr. 9 znázorňuje dezaktiváciu baktérií ako funkciu preparátu krvných doštičiek a radiačnú energiu pri použití 90 % krvných doštičiek a 10 % aditívneho roztoku krvných doštičiek (90 : 10) a 30 % krvných doštičiek so 70 % aditívneho roztoku (30:70).

Obr. 10 ukazuje účinok pridania antioxidantov ku koncentrátu krvných doštičiek na dezaktiváciu vírusu, baktériofágu a baktérií.

Obr. 11 ukazuje dezaktivačnú krivku pre vírus Herpes Simplex typu II ako funkciu koncentrácie fotosenzibilátora s radiačnou energiou 20 J/cm² použitím polovice ultrafialového a polovice viditeľného svetla.

Obr. 12 ukazuje dezaktiváciu S. epidermidis menením koncentrácií fotosenzibilátora a radiačných energií.

Obr. 13 ukazuje dezaktiváciu ΦΧ174 menením koncentrácií fotosenzibilátora a radiačných energií.

Obr. 14 ukazuje dezaktiváciu S. aureus a ΦΧ174 menením radiačných energií použitím 50: 50 zmesi ultrafialového a viditeľného svetla.

Obr. 15 ukazuje dezaktiváciu S. epidermidis a HSV-II menením radiačných energií použitím 50: 50 zmesi ultrafialového a viditeľného svetla.

Obr. 16 ukazuje dezaktiváciu vírusu HSV2 v krvnom vrecku premiešanom a ožiarenom rôznymi energetickými hladinami.

Obr. 17 porovnáva dezaktivačné výsledky pre vakcínia vírus v rôznych tekutinách použitím samostaného ultrafialového svetla alebo 50 : 50 viditeľného a ultrafialového svetla.

Obr. 18 porovnáva dezaktivačné výsledky s použitím a bez použitia senzibilátora pre vakcínia vírus s rôznymi radiačnými časmi.

Obr. 19 porovnáva dezaktiváciu mimobunkového HIV-1 pri koncentráciách fofosenzibilátora 5 až 50 μΜ s menením radiačných energií.

Obr. 20 porovnáva dezaktiváciu vnútrobunkového HIV-1 pri koncentráciách fotosenzibilátora 5 až 50 μΜ s menením radiačných energií.

Obr. 21 porovnáva dezaktiváciu vnútrobunkového HIV-1 pri koncentráciách fotosenzibilátora 5 až 50 μΜ s menením radiačných energií pri použití hladín p24 antigénu.

Obr. 22 ukazuje dezaktiváciu HSV-II menením radiačných hladín pri použití koncentrátu krvných doštičiek a koncentrátu krvných doštičiek v prostredí obsahujúcom aditívny roztok krvných doštičiek s askorbátom.

Obr. 23 ukazuje uskutočnenie podľa tohto vynálezu pri použití krvného vrecka pre tekutinu, ktorá má byť upravená, a fotosenzibilátora a vibrovacieho stola pre premiešanie tekutiny pri vystavení fotoradiácii zo svetelného zdroja.

Podrobný popis vynálezu

Spôsob dekontaminácie podľa tohto vynálezu použitím endogénnych fotosenzibilátorov a derivovaných fotosenzibilátorov na endogénnej báze je tu dokladovaný použitím 7,8-dimetyl-IO-ribityl-izoaloxazínu ako fotosenzibilátora, avšak môže byť použitý každý fotosenzibilátor, ktorý je schopný byť aktivovaný fotoradiáciou, aby spôsobil dezaktiváciu mikroorganizmov. Fotosenzibilátor musí byť taký, ktorý neporuší žiadúce zložky tekutiny, ktorá je dekontaminovaná, a tiež prednostne taký, ktorý nebude strhnutý ako výsledok fotoradiácie do produktov, ktoré výrazne porušia žiadúce zložky alebo majú výraznú toxicitu. Vlnová dĺžka, pri ktorej je aktivovaný fotosenzibilátor, je určená tak, ako tu bolo popísané, s použitím literatúry alebo priameho merania. Jeho rozpustnosť v tekutine, ktorá má byť kontaminovaná, alebo v kombinácii tekutiny nosiča a tekutiny, ktorá má byť kontaminovaná, je určená tiež. Schopnosť fotoradiácie pri aktivujúcej vlnovej dĺžke pre penetráciu kvapaliny, ktorá má byť dekontaminovaná, musí byť určená tiež tak, ako sa tu uviedlo. Určené sú príslušné teploty pre reakciu fotosenzibilátora so svojim substrátom, ako aj rozpätia teploty, intenzita fotoradiácie a jej trvanie, a koncentrácia fotosenzibilátora, ktorá bude optimalizovať mikróbovú dezaktiváciu a minimalizovať poškodenie žiadúcich proteínov a / alebo bunkových zložiek v tekutine. Príklady 1 - 7 a obrázky 1-5 ilustrujú určenie informácie požadovanej pre vyvinutie prietokového dekontaminačného systému podľa tohto vynálezu.

Po určení takýchto systémových požiadaviek pre prietokové systémy môžu byť navrhnuté zariadenia, ktoré zabezpečujú správnu rýchlosť toku, fotopriepustnosti a intenzity svetla, ktoré spôsobujú dezaktiváciu mikroorganizmov prítomných v tekutine, ako tu bolo uvedené. Tekutina, ktorá má byť dekontaminovaná, je zmiešaná s fotosenzibilátorom a potom ožiarená dostatočným množstvom fotoradiácie pre aktiváciu fotosenzibilátora, aby reagoval s mikroorganizmami v tekutine tak, že mikroorganizmy v tekutine sú dezaktivované. Množstvo fotoradiácie dosahujúce mikrooragnizmy v tekutine je kontrolované vybraním príslušného fotoradiačného zdroja, príslušnej vzdialenosti fotoradiačného zdroja od tekutiny, ktorá má byť dekontaminovaná, čo môže byť zvýšené použitím svetelných vedení pre prenesenie fotoradiácie priamo do nádoby pre tekutinu, príslušným fotopriepustným materiálom nádoby pre tekutinu, príslušnou hĺbkou, aby umožňovala úplnú penetráciu fotoradiácie v nádobe, urýchľovačmi fotoradiácie, ako je jeden alebo viac fotoradiačných zdrojov, prednostne na opačných stranách nádoby, alebo reflektormi na odrazenie svetla od radiačného zdroja späť do nádoby, príslušnou rýchlosťou prietoku tekutiny v nádobe a príslušnou dĺžkou nádoby, aby umožňovala dostatočný čas na dezaktiváciu prítomných mikroorganizmov. Tiež môžu byť požadované monitory teploty a regulátory pre udržovanie tekutiny pri optimálnej teplote. Obr. 6 znázorňuje dekontaminačný systém podľa vynálezu ako časť zariadenia na separáciu krvných zložiek a obr. 7 ukazuje detaily prednostného dekontaminačného systému.

U dávkovacích systémov je preferované umiestniť tekutinu, ktorá má byť dekontaminovaná, spolu s fotosenzibilátorom vo vreckách, ktoré sú fotopriepustné alebo sú aspoň dostatočne fotopriepustné, aby sa umožnila radiácia pre dosiahnutie obsahov na aktivovanie fotosenzibilátora. Na uskutočnenie dezaktivácie je do každého vrecka pridaný dostatočný fotosenzibilátor, prednostne, aby sa zabepečila koncentrácia fotosenzibilátora aspoň asi 10 μΜ, a vrecko je premiešané pri ožiarení, prednostne s asi 1 až asi 10 /cm² po dobu od asi 6 do asi 36 minút pre zaistenie vystavenia radiácii v podstate celej tekutiny. Prednostne je použitá súčasne kombinácia viditeiľného a ultrafialového svetla. Fotosenzibilátor môže byť pridaný v práškovej forme.

Spôsob prednostne používa endogénne fotosenzibilátory zahrňujúce endogénne fotosenzibilátory, ktoré majú funkciu interferovania s replikáciou nukleových kyselín. Pre použitie v tomto vynáleze je preferovaným fotosenzibilátorom 7,8-dimetyl-IO-ribityl-izoaloxazín. V chémii sa uvažuje, že medzi

7,8-dimetyl-10-ribity-izoaloxazínom a nukleovými kyselinami sa nepostupuje cez postupy závislé na singletovom kyslíku (t.j. mechanizmus Typu II, ale skôr priamo prostredníctvom interakcie senzibilátor-substrát (mechanizmus Typu I). Cadet et al. (1983) J. Chem., 23:420-429, jasne demonštrujú, že účinky 7,8-dimety-1O-ribityl izoaloxazínu sú kvôli oxidácii na singletovom kyslíku adenozínového rezídua. Naviac, adenozínové bázy sa javia ako senzitívne k účinkom 7,8-dimetyl-10-ribitylizoaloxazínu plus UV svetla. Toto je dôležité, keďže adenozínové rezíduá sú relatívne nesenzitívne k procesom závislým na singletovom kyslíku. Zdá sa, že 7,824 dimetyl-10-ribityl-izoaloxazín neprodukuje veľké množstvá singletového kyslíka po vystavení UV svetlu, ale skôr uplatňuje svoje účinky cez priame interakcie so substrátom (napr. nukleové kyseliny) prostredníctvom reakcií prenosu elektrónov so senzibilátorom v excitovanom stave. Keďže nerozlišujúce poškodenie buniek a proteínov vzniká primárne zo zdrojov singletového kyslíka, táto cesta tohto mechanizmu pre pôsobenie 7,8-dimetyl-1 O-ribityl- izoaloxazínu umožňuje väčšiu selektivitu tohto pôsobenia než je to v prípade so zlúčeninami, ako sú psoralény, ktoré majú výraznú chémiu Typu II.

Obr. 6 ukazuje prístroj zariadenia pre krv a aferentný systém, ktoré majú začlenené fotoradiačné prístroje podľa tohto vynálezu. Všetka krv je odobraná donorovi / pacientovi 4 a je uskutočnený aferentný systém alebo prístroj na separáciu krvných zložiek 8, kde krv je separovaná do rôznych typov zložiek a aspoň jeden z týchto typov krvných zložiek je prenesený z prístroja 8. Tieto krvné zložky môžu byť potom následne použité s inými alebo sa môžu podrobovať terapeutickej úprave a byť vrátené donoru / pacientovi 4.

V prístroji zariadenia pre krvné zložky 8 je krv odvedená donorovi / pacientovi 4 a vedená cez mimotelový trubicový obvod 10 a krv spracovávajúcu nádobu 12 určujúce úplne uzavretý a sterilný systém. Prístroj na separáciu krvných zložiek 8 je spojený s čerpadlom (nie je ukázané). Krv tečie od donora / pacienta 4 cez mimotelový trubicový okruh 10 a do rotujúcej nádoby na spracovanie krvi 12. Krv je v nádobe na spracovanie krvi 12 separovaná do rôznych typov krvných zložiek a tieto typy zložiek (krvné doštičky, plazma, červené krvinky) sú kontinuálne odoberané z nádoby na spracovanie krvi 12. Krvné zložky, ktoré nie sú zozbierané alebo nie sú určené na terapeutickú úpravu (napr. červené krvinky, biele krvinky, plazma) sú tiež odvedené z nádoby na spracovanie krvi 12 a vrátené donorovi / pacientovi 4 cez mimotelový trubicový obvod 10,

Operácia prístroja na separáciu krvných zložiek je prednostne kontrolovaná jedným alebo viacerými procesormi počítača, ktorý je zahrnutý v prístroji.

Mimotelový trubicový obvod 10 obsahuje kazetovú zostavu 14 a množstvo trubicových zostáv 20, 50, 60, 80, 90, 100, ktoré sú v ňom spojené. Trubicovú zostavu 20 pre odvedenie / vrátenie krvi zabezpečuje jedno ihlové pripojenie medzi donorom / pacientom 4 a kazetovou zostavou 14 a trubicová podzostava 60 vstupu krvi / krvných zložiek zabezpečuje pripojenie medzi kazetovou zostavou 14 a nádobou na spracovanie krvi. 12. Trubicová zostava pre antikoagulát 50, trubicová zostava pre zber krvných doštičiek 80, trubicová zostava pre zber plazmy 90, trubicová zostav pre zber červených krviniek 70 a trubicová podzostava prieduchového vrecka 100 sú tiež v spojení s kazetovou zostavou 14.

Trubicová zostava 20 pre odvedenie / vrátenie krvi zahrňuje ihlovú podzostavu 30 spojenú s trubicou pre antikoagulát 26 pripojenú ktrubicovej zostave pre antikoagulát 50 cez kazetovú zostavu 14.

Kazetová zostav 14 zahrňuje vpredu a vzadu sformované plastové tabuľky, ktoré sú teplom zvarené dohromady pre definovanie obdĺžnikového kazetového člena majúceho samostatné priechody pre kvapalinu. Kazetová zostava 14 ďalej zahrňuje množstvo z vonkajšej strany vystupujúcich trubicových sľučiek so spojovaním rôznych samostatných priechodov. Zjednotené priechody sú tiež v spojení s rôznymi trubicovými zostavami.

Špecificky, kazetové zariadenie 14 sa spája s trubicou pre antikoagulát 26 trubicovej zostavy 20 pre odvedenie / vrátenie krvi a s trubicovou zostavou pre antikoagulát 50, Trubicová zostava pre antikoagulát 50 zahrňuje klinovú odkvapávaciu komoru 52 pripojiteľnú k antikoagulátu a zdroju fotosenzibilátora 53 a sterilizačnému filtru 56. Pri použití trubicová zostava antikoagulátu 50 dodáa antikoagulát zmiešaný s fotosenzibilátorom do krvi odvedenej donorovi / pacientovi 4, aby sa redukovalo alebo zabránilo akémukoľvek vytváraniu zhlukov v mimotelovom trubicovom obvode 10. V stave techniky je známych veľa antikoagulátov, napr. ako boli popísané v Kapitole 3 v AABB Technical Manual, 11. vydaní, 1993, zahrňujúcej ACD-A, CPD, CP2D, CPDA-1 a heparín. Tieto, ako aj roztoky s uložením buniek, AS-1, AS-3 a AS-5 sú všetky kompatibilné s endogénnymi fotosenzibilátormi a derivovanými senzibilátormi na endogénnej báze, ktoré sú tu popísané.

Kazetová zostava 14 taktiež zahrňuje spojenie s trubicou pre odvedenie krvi trubicovej zostavy 20 pre odvedenie / vrátenie krvi. Krv prechádza cez tlakové senzory a vstupný filter v kazetovej zostave 14 a odtiaľ do trubice pre vstup krvi 62, Trubica pre vstup krvi 62 je tiež spojená s nádobou na spracovanie krvi 12, aby sa zaistilo spracovanie celej tejto krvi.

Pre vrátenie separovaných krvných zložiek do kazetovej zostavy 14 trubicová zostava pre vstup krvi / krvných zložiek 60 ďalej zahrňuje výstupnú trubicu pre červené krvinky (RCB) / plazmu, výstupnú trubicu pre krvné doštičky a výstupnú trubicu pre plazmu spojené so zodpovedajúcimi výstupnými portami na nádobe na spracovanie krvi 12. Výstupná trubica pre červené krvinky (RCB) / plazmu smeruje separovanú zložku červených krviniek (RCB) / plazmy cez kazetovú zostavu 14 ktrubicovej zostave pre zber červených krviniek 70 prostredníctvom prvého dekontamínačného systému 72. Výstupná trubica pre krvné doštičky smeruje separované krvné doštičky cez kazetovú zostavu 14 k trubicovej zostave pre zber krvných doštičiek 80 prostredníctvom druhého dekontamínačného systému 82. Výstupná trubica pre plazmu smeruje separovanú plazmu cez kazetovú zostavu 14 k trubicovej zostave pre zber plazmy 90 prostredníctvom tretieho dekontamínačného systému 92. Po ožiarení v dekontaminačných systémoch 72, 82 a 92 pre aktiváciu fotosenzibilátora a dezaktiváciu prítomných mikroorganizmov sú krvné zložky zhromaždené v zberovom vrecku pre červené krvinky 74, zberovom vrecku pre krvné doštčky 84 a zberovom vrecku pre plazmu 94. Prieduchové vrecko 104 môže byť použité na odvzdušnenie plynov v systéme.

Obr. 7 znázorňuje samostatne stojacu verziu dekontaminačnej zostavy tohto vynálezu. Krvný produkt 180 (ktorým môže byť predtým odobraná krv alebo krvná zložka alebo uložená krv) je spojený s vedením krvného produktu 186, ktorý vedie cez čerpadlo 184 do dekontaminačnej kyvety 164. Nádrž fosenzibilátora 166 je spojená so vstupom vedenia fotosenzibilátora 168 vybaveným vstupným čerpadlom 170 a vedie do vedenia krvného produktu 186 proti prúdu od dekontaminačnej kyvety 164. Dekontaminačná kyveta 164 je fotopriepustná kyveta s hĺbkou (d) a dĺžkou (I) selektovanou pre zaistenie dekontaminácie. Chladiaci systém 190 v kombinácii s teplotným monitorom 192 sú spojené s dekontaminačnou kyvetou 164 na kontrolovanie teploty tekutiny. Dekontaminačná kyveta 164 je pripojená cez svetelný rozvádzač 162 k fotoradiačnému zdroju 160. Urýchľovač fotoradiácie 163 je umiestnený priľahlé k (buď dotýkajúc sa alebo s odstupom od) dekontaminačnej kyvety 164 pre zvýšenie množstva fotoradiácie dosahujúcej krvný produkt v kyvete. Vedenie dekontaminovaného krvného produktu 188 vedie od dekontaminačnej kyvety 164 do zberača dekontaminovaného krvného produktu 182.

Pri operácii je riadený krvný produkt 180 do vedenia krvného produktu 186, kde je spájaný s fotosenzibilátorom z nádrže fotosenzibilátora 166, ktorý preteká rýchlosťou kontrolovanou vstupným čerpadlom fotosenzibilátora 170 vo vstupnom vedení fotosenzibilátora 68, s ktorým sa spája vedenie krvného produktu 186. Rýchlosť prietoku vo vedení krvného produktu 186 je kontrolovaná čerpadlom 184, aby bola vybraná taká rýchlosť, ktorá zaisťuje dekontamináciu v dekontaminačnej kyvete 164. Teplotný monitor 192 meria teplotu tekutiny v kyvete 164 a kontroluje chladiaci systém 190, ktorý udržuje teplotu v kyvete v rozpätí požadovanom pre optimálnu operáciu. Krvný produkt v dekontaminačnej kyvety 164 je ožiarený fotoradiáciou z fotoradiačného zdroja 160 riadenou v svetelnom vedení 162. Fotoradiačný zdroj môže zahrňovať dva alebo viac súčasných svetiel. Šípky indikujú fotoradiáciu od konca svetelného rozvádzača 162 šíriacu sa v krvnom produkte vo vnútri priehľadnej dekontaminačnej kyvety 164. Priľahlé k dekontaminačnej kyvete 164 je urýchľovač fotoradiácie 163, ktorý môže byť dodatočným zdrojom fotoradiácie alebo reflektívneho povrchu. Šípky z urýchľovača fotoradiácie 163 v bodoch zašpicatené smerom k dekontaminačnej kyvete 164 indikujú fotoradiáciu od urýchľovača fotoradiácie 163 žiariaceho na krvný produkt v kyvete 164. Dekontaminovaný krvný produkt vychádza z dekontaminačnej kyvety 164 cez vedenie dekontaminovaného krvného produktu 188 a je zberané v zberači dekontaminovaného krvného produktu 182.

V jednom uskutočnení pri použití 7,8-dimetyl-10-ribityl-izoaloxalínu od Sigma Chemical Company ako fotosenzibilátora je použitý svetelný rozvádzač od EFOS Corporation, Williamsville, N.Y. zložený z optických vlákien. Systém je schopný dodávať zaostrené svetelné paprsky s intenzitou 6 200 mW/cm² v oblasti 355 - 380 nm. Tiež je možné použiť v systéme meniteľné filtre, aby sa dosiahli výstupy 4 700 mW/cm² v oblasti spektra 400 - 500 nm. V oboch prípadoch je výstup svetla v oblasti 320 nm a nižšej nepatrný. V systéme sú možné svetelné rozvádzače rôznych dimenzií (3,5 a 8 mm). Svetlo vychádza z hrotu svetelného rozvádzača s 21 stupňovým rozptylom. 8 mm svetelný rozvádzač je primeraný, správne umiestnený pre adekvátne osvetlenie čela prednostnej dekontaminačnej kyvety, ktorá je štandardnou kyvetou používanou pri Coba Spectra® disponovaných sadách od Industrial Platics, Inc., Forest Grove, OR.

Rýchlosť prietoku je premenná a je určená množstvom svetlenej energie, ktorá má byť dodaná vzorke. Rýchlosť prietoku je kontrolovaná prostriedkami peristaltického čerpadla od Cole-Parmer Inštrument Company, Vernon Hills, IL. Rýchlosť toku a typ vstupného prúdu môže byť kontrolovaná prostredníctvom procesoru počítača, ako je známe v stave techniky.

Obr. 23 znázorňuje uskutočnenie podľa tohto vynálezu, v ktorom tekutina, ktorá má byť dekontaminovaná, je umiestnená v krvnom vrecku 284 vybavenom vstupným portom 282, cez ktorý je pridaný v práškovej forme senzibilátor 284 z baňky 286 cez sypací žľab 288. Vibrovací stôl 280 je aktivovaný pre premiešanie vrecka 284, aby sa rozpustil fotosenzibilátor 290, kým fotoradiačný zdroj 260 je aktivovaný pre ožiarenie tekutiny a fotosenzibilátora vo vrecku 284. Alternatívne, vrecko môže byť uskutočnené tak, že je vopred obalené, aby obsahovalo fotosenzibilátor a tekutina je potom pridaná do vrecka.

Spôsoby podľa tohto vynálezu nevyžadujú použitie urýchľovačov, ako sú „zhášače“ alebo zachytávače kyslíka, avšak tieto môžu byť použité na zlepšenie procesu prostredníctvom redukovania rozsahu nešpecifických buniek alebo protein poškodzujúcej chémie alebo zlepšením rýchlosti patogénnej dezaktivácie. Ďalej prednostné spôsoby použitím netoxických endogénnych fotosenzibilátorov a derivovaných senzibilátorov na endogénnej báze nevyžadujú po fotoradiácii odstránenie fotosenzibilátorov z tekutiny. Výsledky testov ukazujú malé alebo žiadne poškodenie ďalších krvných zložiek, napríklad krvné doštičky ostávavájú biologicky aktívnymi päť dní po úprave.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Absorbančný profil 7,8-dimetyl-10-ribityl-izoaloxazínu

Vzorka 7,8-dimetyl-10-ribityl-izoaloxazínu (98 % čistota) bola získaná od Sigma

Chemical Company. Diel tejto vzorky bol podrobený analýze použitím skenovania UV spektrofotometrom. Skúmané rozpätie pokrývalo oblasť 200 až 900 nm. Na analýzu bola vzorka rozpustená v destilovanej vode. Spektrum vzorky z tejto analýzy je ukázané na obrázku 1.

Výsledky boli zhodné stými, ktoré zaznamenala literatúra pre absorbančné maximum a extinkčné koeficienty 7,8-dimetyl-10-ribityl-izoaloxazínu.

Literatúra Xmax (e)

267 (32,359)

373(10,471)

447 (12,303)

Namerané Xmax (e

222 (30,965)

265 (33,159) 373(10,568) 445(12,466)

Príslušné vlnové dĺžky pre ožiarenie sú 373 a 445 nm. Extinkčné koeficienty pozorované pri týchto absorbančných maximách sú dostatočné pre zaistenie primeranej aktivácie senzibilátora v roztoku.

Príklad 2

Rozpustnosť 7,8-dimetyl-1O-ribityl-izoaloxazínu

Rozpustnosť v Isolyte S, pH prostredia 7,4

Maximálna rozpustnosť 7,8-dimetyl-IO-ribityl-izoaloxazínu v prostredí Isolytu S bola určená nasledovne:

7,8-dimetyl-10-ribityl-izoaloxazín bol zmiešaný s Isolytom S, kým sa nevytvorila zrazenina. Zmes bola premiešaná pri teplote miestnosti po dobu jednej hodiny a bol vírivo miešaný pre zaistenie úplného rozpustenia suspenzovaného materiálu. Ďalší

7,8-dimetyl-IO-ribityl-izoaloxazín bol pridávaný, kým sa vytvorila tuhá suspenzia napriek ďalšiemu vírivému miešaniu. Táto suspenzia bola potom odstredená pre odstránenie nerozpusteného materiálu. Supernatant z tohto preparátu bol odstránený a analyzovaný použitím spektrofotometra. Hodnoty absorbancie roztoku boli určené pri 447 nm a 373 nm. Zextinkčných koeficientov, ktoré boli určené predtým, bolo možné predbežne vypočítať koncentráciu nasýteného roztoku. Koncentrácia (373) = 110 μΜ = 42 pg/ml

Koncentrácia (447) = 109 μΜ = 40,9 μg/ml

Rozpustnosť v ACD-A antikoaguláte

Rovnaký postup, ako bol popísaný vyššie, bol zopakovaný pri použití ACD-A antikoagulátu. Hodnoty získané z týchto meraní boli nasledovné:

Koncentrácia (373) = 166 μΜ = 63 pg/ml

Koncentrácia (447) = 160 μΜ = 60,3 ^g/ml

Hodnoty získané z týchto štúdií indikujú hornú hranicu rozpustnosti zlúčeniny, ktorá môže byť očakávaná.

Príklad 3

Fotorozklad 7,8-dimetyl-IO-ribityl-izoaloxazínu vo vodnom roztoku

Roztok 7,8-dimetyl-10-ribityl-izoaloxazínu v Sigma ACD-A bol pripravený s koncentráciou 63 pg/ml. Tento preparát bol odobraný do sklenej pipety a umiestnený v dráhe ultrafialového svetelného zdroja (365 nm Xmax s filtrami na odstránenie svetla pod 320 nm). Suspenzia bola ožiarená v špecifických intervaloch, v ktorých boli podiely odobrané pre spektroskopickú analýzu. Absorbancia rozpusteného 7,8-dimety-10-ribityl-izoaloxazínu bola monitorovaná pri 373 a 447 nm v každom časovom intervale. Výsledky sú odrazené na Obr. 3 a v tabuľke 1.

Tabuľka 1

Fotorozklad 7,8-dimetyl-10-ribityl-izoaloxazínu po vystavení UV svetlu (365 nm) v kyslom roztoku

Cas ožiarenia	% od počiatku, 373 nm	% od počiatku, 447 nm
0	100	100
5	87,3	61,6
10	90,5	76,6
15	100	70

Absorpčný profil roztoku pri 373 nmm indikuje, že počas celej doby ožiarenia sa nevyskytol výrazný rozklad. Absorbancia svetla pri tejto vlnovej dĺžke zodpovedá η-π* prenosom elektrónov. Neprítomnosť zníženia intenzity tohto vrcholu v čase indikuje, že kruhová štruktúra molekuly je neporušená napriek predĺženému ožiareniu pri týchto podmienkach. Absorbancia molekuly pri 447 nm je dôvodu stavu prechodu elektrónov π-π* . Zníženie absorbancie molekuly pri tejto vlnovej dĺžke so zvýšením časov ožiarenia je oznámením nepatrných zmien v rezonančnej štruktúre molekuly. Táto zmena je najväčšia pravdepodobne kvôli strate ríbózy z kruhovej štruktúry 7,8dimetyl-izoaloxazínovej kostry a vytvoreniu 7,8-dimetylaloxazínu ako výsledku. Tieto zmeny sú v súlade so záznamami v literatúre týkajúcimi sa správania molekuly po ožiarení ultrafialovým svetlom.

Zjavný nedostatočný rozklad kruhovej štruktry molekuly je naprostým kontrastom k pozorovaniam zlúčenín na báze psoralénu pri podobných podmienkach. Počas ožiarenia bola pozorovaná výrazná fluorescencia molekuly v roztoku. Toto správanie molekuly je v súlade s rezonančnými znakmi kruhovej štruktúry a uskutočňuje prostriedky pre stratu energie v excitovanom stave molekuly v nedeštruktívnej podobe.

Príklad 4

Vyhodnotenie konceptu prietokového systému

Vlastnosti transmisie svetla danej Spectra kyvety

Daná Spectra kyvety sa skladá z polykarbonátu. Vlastnosti transmisie svetla tejto kyvety boli merané pri 373 a 447 nm umiestnením kyvety do dráhy ultrafialového spektrofotometra. Získané hodnoty boli nasledovné:

Vlnová dĺžka svetla_% transmisie

373 nm 66 %

447 nm 80 %

Tieto výsledky sú v súlade s tými, ktoré boli zaznamenané v literatúre pre polykarbonátové plasty (viď Obr. 4). Hodnoty z literatúry indikujú strmé stúpanie u transmisie svetla cez polykarbonáty v oblasti 300 nm. V oblastiach nad 350 nm sú vlastnosti transmisie svetla primerané pre toto použitie.

Požiadavky na svetelný tok vypočítané ako funkcia prietokovej rýchlosti

Na to, aby prietokový systém bol realizovateľný, musí byť vzorka zabepečená primeraným tokom svetla počas svojej prítomnosti v dráhe paprsku. Ak navrhovaná Spectra kyveta slúži k tomuto účelu, potom je možné predbežne vypočítať požiadavky na svetelný tok ako funkciu prietokových rýchlostí cez kyvetu nasledovne:

Objem roztoku nachádzajúci sa v pásme ožiarenia kyvety je cca 0,375 ml.

Čas prechodu bunky v oblasti kyvety môže byť určený z nasledujúcej rovnice:

Objem kyvety (ml)

T =-------------------prietoková rýchlosť (ml/min)

Pri 100 ml za minútu by čas prechodu (T) bol 0,00375 min = 0,225 sekúnd.

Energia, ktorej je vzorka vystavená je závislá na toku podľa nasledujúcej rovnice:

Tok (Φ, mW/cm²) * čas (T, s)

Energia (E, J/cm²) = ---------------------------1000

Ak prepokladáme, že 1 J/cm² je primerane potrebný pre aktiváciu senzibilátora a čas prechodu (T) je 0,22 sekúnd (tj. prietoková rýchlosť 100 ml/min cez kyvetu), potom požadovaný tok počas prechodu vzorky cez kyvetu je 4,545 mW/cm². Graf znázorňujúci vzťah požadovaného toku zo zdroja svetla k prietokovým rýchlostiam cez kyvetu je na Obr. 5.

Tieto výsledky indikujú, že na to, aby systém pracoval správne, sú požadované ultrafialové zdroje s výstupmi v oblasti W/cm².

Obr. 2 ukazuje ako sa môže meniť absorbancia s koncentráciou krvných doštičiek.

Príklad 5

Absorbancia červených krviniek

Na vyhodnotenie rozsahu, do akého môže penetrovať vo vzorke červených krviniek ultrafialové svetlo, a účinkov hrúbky vzorky a hematokritu na rozsah svetelnej penetrácie bolo vykonaných niekoľko predbežných experimentov použitím chemickej aktinometrie, spôsobu na určenie skutočného množstva svetelenej intenzity vyžarovanej zo zdroja pomocou merania schopnosti a rozsahu, do ktorého absorbované svetlo môže vykonať chemickú reakciu. Pre tieto štúdie bol použitý roztok ferioxalátu na meranie zdroja intenzity vzhľadom na merania pozorované pre vodu. Detaily chemickej reakcie a spôsoby použitia preparátu vzorky uviedol Gordon, A.J. a Ford, R.A. (1972), v „The Chemisťs Companion: A Handbook of Practícal Data, Techniques and References“ (John Willey & Sons), s.362-368.

Vzorky oxalátu železitého (III) boli pripravené v testovacom materiáli (voda alebo krvný produkt s meniacim sa hematokritom červených krviniek) s koncentráciou 0,15 M. Tieto vzorky boli potom zavedené do štandardnej Spectra kyvety a umiestnené vožarovacej zostave. Vzorky boli vystavené vo vopred určených časových intervaloch zodpovedajúcej požadovanej hladine dávky energie (1 J/cm²).Vzorky boli potom odobrané a množstvo konverzie Fe³⁺ na Fe²* bolo určené odčítaním absorbancie testovaného člena v roztoku 1,10-fenantrolínu pri 510 nm, ako to popísal Gordon, A.J. a Ford, R.A., supra. Vyššie hodnoty absorbancie sú indikatívne pre väčšiu intenzitu svetla vo vzorke. Hodnota absorbancie pozorovaná pre vodu po vystavení 1 J/cm² ultrafialového žiarenia bola použitá ako 100 % transmitancie. Všetky hodnoty vzoriek červených krviniek boli určené vzhľadom na štandard.

Tabuľka 2

Odčítanie absorbancie po vystavení vzoriek 1 J/cm² UVA svetlu.

Všetky priemerné hodnoty predstavujú stred 6 experimentov

Hodnoty % transmitancie sú vypočítané vzhľadom na vzorky vody

Absorbancia pri 510 nm	Priemer	Štandardná odchýlka	%transmitancie	Štandardná odchýlka
voda	2,40	0,04	100	0,0
RBC, 1,3% hematokrit	2,40	0,10	99,5	4,8
RBC, 3,7% hematokrit	1,46	0,38	60,6	15,4
RBC, 5,07% hematokrit	0,20	0,26	8,3	10,8
RBC, 6,0% hematokrit	0,130	0,09	5.2	3,9
RBC, 10,2% hematokrit	0,23	0,19	9,7	7,9
RBC, 16,3% hematokrit	0,25	0,11	10,4	4,6
RBC, 21,8% hematokrit	0,09	0,06	3,6	2,6
RBC, 80,2% hematokrit	0,01	0,11	0,3	4,4

Použitím týchto hodnôt je možné vypočítať hĺbku penetrácie ultrafialového svetla pri použití Beerovho zákona (A = e b C).

Z Lambertovo zákona absorbancia = log (1 / transmitancia)

Ak necháme, aby koncentrácia (C) bola rovná hematokritu vzorky, a keďže b = 0,3 cm (dĺžka dráhy Spectra kyvety), potom je možné určiť pseudoextinkčný koeficient pre vzorky (e') grafickým zobrazením hodnôt absorbancie pre vzorky červených krviniek oproti časom hematokritu na dĺžke dráhy.

Tabuľka 3

T	B	HCT	B*HCT	Absorbancia log 1/T)	e
0,995	0,3	1,3	0,39	0,002	0,0051
0,606	0,3	3,7	1,11	0,218	0,196
0,0525	0,3	6	1,8	1,280	0,71
0,097	0,3	10,2	3,06	1,013	0,33
0,104	0,3	16,3	4,89	0,983	0,20
0,036	0,3	21,8	6,54	1,444	0,22
0,0033	0,3	80,2	24,06	2,481	0,10

Použitím hodnôt získaných ako bolo uvedené vyššie bolo možné určiť pseudoextinkčný koeficient pre tieto vzorky na hodnotu 0,08661.

Hodnota pre extinkčný koeficient umožňuje vypočítanie penetračnej vzdialenosti UV svetla vo vzorkách červených krviniek ako funkciu vzorky hematokritu. Pre tento predbežný výpočet bola penetračná hĺbka vzorky, v ktorej bolo absorbované 90 % dopadajúceho svetla, určená nasledujúcou rovnicou:

A = e b C

A = 1 (90 % absorbancie dopadajúceho svetla), e = 0,08661, C = vzorka hematokritu, b = dĺžka dráhy

Hodnoty určené pomocou aktinometrie boli porovnané s tými, ktoré boli predtým vypočítané použitím predbežných výpočtov z ultrafialových spektrofotometrických meraní absorbancie svetla vo vzorkách červených krviniek a krvných doštičiek.

Obr. 2 ukazuje ako sa mení absorbancia a vzdialenosť od svetelného zdroja pre červené krvinky porovnaním predpokladaných s pozorovanými hodnotami. Tieto výsledky indikujú, že pre vzorky hematokritov v oblasti 80 % je možné použitím prednostného usporiadania tohto vynálezu dostať svetlo vo vzorke do hĺbky 0,14 cm. Toto predstavuje šírku prietokovej dráhy, ktorá je menšia než polovica šírky bežnej Spectra kyvety.

Príklad 6

Účinky dezaktivačnej úpravy vírusov na krvné doštičky in vitro

Parametre

Boli vyhodnotené účinky dezaktivačnej úpravy vírusov na in vitro parametre krvných doštičiek. Preparáty krvných doštičiek boli upravené s 7,8-dimetyl-10-ribitylizoaloxazínom v kombinácii s ultrafialovým svetlom. Rôzne in vitro parametre boli použité ako monitory funkcie krvných doštičiek, aby sa určil rozsah zmien vyvolaných podmienkami upravovania. Faktory, ako je vystavenie hladine energie ultrafialového svetla, dávka použitého 7,8-dimetyl-10-ribityl-izoaloxazínu a podmienky spracovania vzorky boli preverené z hľadiska ich dopadu na kvalitu krvných doštičiek po úprave. Výsledky z tejto štúdie sú použité na stanovenie príslušného okienka úpravy pre dezaktiváciu HIV-1 bez vyrovnávajúcej funkcie krvných doštičiek.

Vzorky boli pripravené s troma rozdielnymi koncentráciami 7,8-dimetyl-10-ribitylizoaloxazínu. Na tieto štúdie boli použité krvné doštičky získané zo štandardnej zbierky Spectra LRS.

Najprv boli vzorky odstredené, aby sa peleta krvných doštičiek koncentrovala. Peleta bola znovu suspenzovaná v 70 : 30 (Isolyte S, pH 7,4; McGaw, Inc. Média:Plasma) roztoku. 7,8-dimetyl-10-ribityl-izoaloxazín v špecifických koncentráciách bol prítomný v zmesi plazma : prostredie. Suspenzia krvných doštičiek prešla potom cez komoru ultrafialového žiarenia pri jednej z troch špecifických prietokových rýchlostiach. Prietokové rýchosti boli priamo korelované s vystavením hladinám energie pre zmes bunky / prostredie, ktoré prechádza cez ožarovaciu komoru. Po prietoku cez ožarovaciu komoru boli vzorky uložené v citrátom zmäkčenom vzorkovacom vrecku na následnú analýzu.

Nasledujúce in vitro merania ožiarenia funkcie krvných doštičiek vrátane hypotonickej šokovej odpovede (HSR), GMP-140 expresie, pH, pCO2, ΡΟ2, vírenia krvných doštičiek a počítanie buniek, bolo vyhodnotené pre určenie účinkov protokolu upravovania na kvalitu buniek.

Kvalita krvných doštičiek bola monitorovaná ako funkcia ožarovacích podmienok (koncentrácia senzibilátora a prietokové rýchlosti / energetické hladiny). Kvalita krvných doštičiek zahrňuje parametre, ako je HSR odpoveď, GMP-14 aktivácia, atď. Prietokové rýchlosti, ktoré sú študované, sa môžu vzťahovať k vystavenej energii nasledovne;

0,375 ml

Čas prechodu (T, s) = Čas vystavenia =----------(F,/60)

F_r = prietoková rýchlosť (ml / s)

0,375 ml = objem kyvety (ml)

T (s) = ----Fr

Tok (Φ, mW/cm²) * T (s)

Energia (J/cm²) =--------------1000

Φ * 0,022 E= -----------Fr

Bol vyhodnotený účinok vystavenia UV energii a koncentrácie 7,8-dimetyl-10ribityl-izoaloxazínu na stabilitu a životaschopnosť upravených krvných doštičiek. Tri energetické hladiny a tri koncentračné hodnoty boli vyhodnotené nasledovne; Energetické hladiny: 1,5,9 J/cm²*

7,8-dimetyl-10-ribityl-izoaloxazín

Koncentrácie; 1, 50,100 μΜ** * Hladiny celkovej energie vystavenia boli určené prietokovou rýchlosťou suspenzie cez ožarovaciu komoru v súlade s konverzným prevedením do Tabuľky 4.

** Keďže prostredie bolo zriedené 70 : 30 (prostredie : plazma) zásobná koncentrácia 7,8-dimetyl-10-ribityl-izoaloxazínu v prostredí samotnom pred zmiešaním s plazmou bola príslušne upravená. Toto vyžadovalo počiatočné koncentrácie v Isolyte S 1,43 μΜ, 71,4 μΜ a 143 μΜ.

Tabuľka 4

Vystavenie energetickým hladinám ako funkcia prietokovej rýchlosti cez ožarovaciu komoru

Dodaná energia (J/cm²)	Prietoková rýchlosť (ml/s)	Cas spracovania 20 ml (min)
1	16,90	1,18
2	8,45	2,37
3	5,83	3,55
4	4,22	4,73
5	3,38	5,92
6	2,82	7,10
7	2,41	8,29
8	2,11	9,47
9	1,88	10,65
10	1,69	11,84

Tok = 3640 mW/cm²; objem komory = 0,117 ml.

Hodnoty upravených vzoriek boli porovnané s kontrolnými skupinami. Kontrolné vzorky sú zahrnuté nasledovne:

neupravená vzorka v plazme (kontrola predtým) + Prietok - UV-7,8-dimetyl-10-ribityl-izoaloxazín

Postup

Bežný donorový aferentný produkt krvných doštičiek bol získaný zAABB schválenej bankovej jednotky pre krv. Vzorka bola zozbieraná použitím štandardných Spectra LRS postupov. Všetky manipulácie alebo postupy popísané ďalej boli vykonané štandardnými laboratórnymi bezpečnými postupmi a spôsobmi. Bol zaznamenaný počet jednotiek a krvných typov. Všetky vzorky boli použité v rámci 24 hodinového zberu. Aseptický postup bol sledovaný u všetkých prenosov vzoriek a procesných stupňov.

Vzorka bola prenesená do 500 ml PVC prenosného balíka a odstredená pri 5000 x g po dobu štyroch minút na zbalenie krvných doštičiek. Plazma bola potom z pelety krvných doštičiek odobraná použitím štandardného stlačenia plazmy.

Plazma bola ponechaná na ďalšie použitie. Plazma odobraná z bunkovej pelety bola potom zmiešaná so zásobným roztokom Isolyte S, pH 7,4; McGaw, Inc. Tento zásobný roztok prostredia bol pripravený pridaním vopred určeného množstva 7,8dimetyl-10-ribityl-izoaloxazínu k Isolyte S, aby sa zabezpečili výsledné koncentrácie 1,43 μΜ, 71,4 μΜ a 143 μΜ. Po pridaní 7,8-dimetyl-10-ribityl-izoaloxazínu bol zásobný roztok filtrovaný cez 0,22 μΜ sterilný filter. Zásobný roztok bol potom zmiešaný s autológovou plazmou v pomere 70 : 30 (obje. : obj.), aby sa zabezpečili výsledné koncentrácie 7,8-dimetyl-10-ribityl-izoaloxazínu 1μΜ, 50 μΜ a 100 μΜ. Pri príprave zásobného roztoku 7,8-dimetyl-10-ribityl-izoaloxazínu bolo starostlivo dbané o vyhnutie sa vystaveniu svetlu. Vzorky boli pripravené podľa nasledovného;

μΜ 2 vzorky

100 μΜ 2 vzorky μΜ 1 vzorka

Peleta krvných doštičiek bola potom znovu suspenzovaná v zmesi plazma: prostredie na pôvodný objem počiatočnej vzorky. Vzorka bola spojená s prietokovým zariadením obsahujúcim nádobu na bunky a fotosenzibilátor, nádobu na prostredie, uvedené nádoby boli pripojené prostredníctvom ventilových vedení k samostatnému vedeniu pre zmiešané bunky / senzibilátor a prostrediu vybavenému čerpadlom. Zmiešané bunky / senzibilátor a prostredie prúdili do kyvety, ktorá bola uchovaná v držiaku so zrkadlovou stenou ožiarenou svetelným zdrojom. Táto ožarovacia komora bola vybavená teplotným snímačom. Po prejdení cez kyvetu bola tekutina zozbieraná vo vrecku pre produkt.

Trubicová sústava bola najprv naplnená prostredím Isolyte S. Päť minút pred začiatkom prúdenia testovacej vzorky bol aktivovaný zdroj. Teplota vožarovacej komore bola monitorovaná počas tohto intervalu a udržovaná nižšie než 32°C.

Prietoková rýchlosť vzorky cez ožarovaciu komoru bola určená podľa záznamu v Tabuľke 4. Prietokové rýchlosti, ktoré zabezpečujú celkové hladiny energie ožarovania 1, 5 a 9 J/cm boli využité podľa nasledujúcej testujúcej matrice:

Pokusná vzorka č. 1 : koncentrácia 7,8-dimetyl-10-ribityl-izoaloxazínu = 1 μΜ

A. + 7,8-dimetyl-10-ribityl-izoaloxazín+ 1 J/cm²

B. + 7,8-dimetyl-10-ribityl-izoaloxazín+ 9 J/cm²Pokusná vzorka č. 2 : 7,8-dimetyl-10-ribityl-izoaloxazín = 100 μΜ

A. + 7,8-dimetyl-10-ribityl-izoaloxazín+1 J/cm²

B. + 7,8-dimetyl-10-ribityl-izoaloxazín+ 9 J/cm²Pokusná vzorka č. 3 : 7,8-dimetyl-10-ribityl-izoaloxazín = 50 μΜ

A. + 7,8-dimetyl-10-ribityl-izoaloxazín+ 5 J/cm²Pokusná vzorka č. 4 : 7,8-dimetyl-10-ribityl-izoaloxazín = 0 μΜ

A. +Prietok-UV-7,8-dimetyl-10-ribityl-izoaloxazín

Všetky vzorky boli identifikované číslom pokusu a označením písmenom vzorky zodpovedajúcim podmienkam upravovania (t.j. 1A). Každá sada vzorky bola robená pre celkove dve replikácie. Poradie, v ktorom boli vzorky upravované, bolo určené označením podľa zdroja náhodných čísel.

Pre každú vzorku bol sústredený objem vzorky na podmienky každého pokusu. Tieto vzorky boli sústredené do citrátom zmäkčeného vzorkovacieho vrecka (53 ml celkový objem) a uložené na analýzu. Teplota vzorky a ožarovacej komory bola zaznamenaná na začiatku, v strede a konci každého pokusu.

Počiatočný podiel z každého preparátu bol odobraný po úprave na analýzu. Parametre pre analýzu zahrňovali počítanie buniek, pH, pCO₂, pO₂, vírenie krvných doštičiek, HSR a GMP-140 analýzu. Zostávajúci podiel vzorky bol umiestnený vmiešadle krvných doštičiek typu prekrývajúcich sa koncov miešadla v +22 inkubátore a uložené po dobu piatich dní po úprave. Na piaty deň bol odobraný druhý podiel a analyzovaný na rovnaké in vitro parametre.

Bolo použité nasledujúce zariadenie: Nikon Labophot mikroskop; Serono-Baker System 9000 Hematology Analyzer; anylytická váha, inkubátor krvných doštičiek +22 Ceisius) a rotátor; laboratórna chladnička (+4 Celsius) ; Mistral 3000i centrifúga; Corningov analyzátor krvných plynov; Becton-Dickinson FASCALIBUR prietokový cytometer; U V ožarovacia komora; UV rádiometer (UVX Radimeter, UVP, Inc.) ; EFOS Ultracure 100SS Plus (365 nm maximálne výstupné a 340 nm pásovo prechádzajúce filtre); a teplotný snímač (termospájač).

Výsledky každej sady testovaných premenných boli porovnané pre definované podmienky energie vystavenia a koncentrácie 7,8-dimetyl-IO-ribityl izoaloxazínu. Bolo urobené priame porovnanie s neupravenou kontrolovanou vzorkou a výrazné rozdiely definované s pravdepodobnosťou p>0,05 zo spárenej Studenťs testovacej analýzy.

Výsledky z týchto štúdií boli sumarizované nasledovne:

1. Pri koncentráciách senzibilátora v nadbytku 10 μΜ a koncentráciách krvných doštičiek nad 1,5Ε+06/μΙ bol pokles pH vzorky druhým dňom. pH stále klesalo po druhom dni uloženia dosahujúc neakceptovateľné hladiny (<6,5) tretím dňom uloženia. Všetky ďalšie in vitro parametre sledovali vzory pozorované s pH vzorky.

2. Toto zníženie pH vzorky sa vyskytlo bez ohľadu na to, či vzorka bola vystavená ultrafialovému svetlu alebo nie.

3. Pri koncentráciách 5,4Ε+05/μΙ nebol pokles pH vzorky po predĺžení uloženia pri akejkoľvek koncentrácii senzibilátora zistený až do 100 μΜ.

4. Pri koncentráciách do 10 μΜ, koncentráciách krvných doštičiek nad 1,5Ε+06/μΙ a UVA hodnotách do 10 J/cm² merané vlastnosti krvných doštičiek boli porovnateľné s kontrolnými, neupravenými bunkami. Tieto ostali porovnateľné s kontrolovanými úrovňami po piatich dňoch alebo dlhšom uložení po úprave.

Tieto štúdie funkcie krvných doštičiek po úprave poskytli jasné okienko, v ktorom vlastnosti buniek boli udržované na porovnateľných úrovniach s neupravenými bunkmi. Výsledky tiež indikujú, že menením uloženia alebo podmienok úpravy buniek toto okienko môže byť rozšírené. Pozorované účinky 7,8-dimetyl-10-ribitylizoaloxazínu s a bez UV svetla na vzorkovom pH naznačujú metabolické účinky tohto aditíva, ktoré môžu byť zmiernené zmenami vzhľadom na uloženie alebo podmienky spracovania vzorky.

Príklad 7

Merania dotykových napätí červených krviniek ako funkcie prietokovej rýchlosti a vzorky hematokritu

Nízke úrovne penetrácie ultrafialového svetla do vzoriek červených krviniek vo vysokých hematokritoch zvýšili nevyhnutnosť pochopiť účinky prechodu červených krviniek cez úzke otvory svetelnej dráhy. Redukcia hrúbky vzorky v svetelnej dráhe by zvýšila dodanie ultrafialovej dávky vo vysokých vzorkých hematokritu. Pre potvrdenie tohto prístupu bolo urobených niekoľko meraní poklesu tlaku použitím otvorov s meniacimi sa rozmermi. Tlakový manometer bol umiestnený v línii s peristaltickým čerpadlom proti prúdu a po prúde od úzkych otvorov. Nezmiešaná

Výsledky z týchto štúdií boli sumarizované nasledovne:

Príklad 7

Nízke úrovne penetrácie ultrafialového svetla do vzoriek červených krviniek vo vysokých hematokritoch zvýšili nevyhnutnosť pochopiť účinky prechodu červených krviniek cez úzke otvory svetelnej dráhy. Redukcia hrúbky vzorky v svetelnej dráhe by zvýšila dodanie ultrafialovej dávky vo vysokých vzorkých hematokritu. Pre potvrdenie tohto prístupu bolo urobených niekoľko meraní poklesu tlaku použitím otvorov s meniacimi sa rozmermi. Tlakový manometer bol umiestnený v línii s peristaltickým čerpadlom proti prúdu a po prúde od úzkych otvorov. Nezmiešaná krv s meniacimi sa hematokritmi prechádzala cez otvory kontrolovanými prietokovými rýchlosťami. Rozdiely v údajoch tlaku v oboch umiestneniach umožňovali priame meranie poklesu tlaku cez otvory. Použitím tejto hodnoty a rozmerov otvoru bolo možné určiť dotykové napätie získané pomocou červených krviniek ako prešli cez úzku bunku použitím nasledujúcej rovnice:

plQ

ΔΡ =----- pokles tlaku gd³ w

4gQ _Xw = ------ dotykové napätie gwd²

Pre krv:

μ = viskozita = 0,0125/(1-hematokrit) g = gravitačná konštanta = 981 Q = prietoková rýchlosť = ml/s l,w,d = rozmery otvoru v cm

Tabuľka 5

Meranie dotykového napätia červených krviniek ako funkcie prietokovej rýchlosti a vzorky hematokritu

		0,08X0,008	Dp namer (dyn/crr?)	0,08X0,010	Dp namer (dyn/cm²)	0,08X0,012	Dp namer (dyn/cm²)
41% HCT	Q=3,38	1,5	95,9	1,0	77,6	0,0	0,0
64%HCT	Q=3,38	4,0	255,8	3,0	232,9	2,0	182,1
41%HCT	Q=16,9	9,7	618,4	7,0	543,4	4,7	425,3
61%HCT	Q=16,9	20,7	1321,9	12,3	,957,2	8,7	789,6

		0,10X0,008	Dp namer (dyn/cm)	0,1X0,010	Dp namer (dyn/cm²)	0,1X0,012	Dp namer (dyn/cm²)
41% HCT	Q=3,38	2,0	93,7	1,0	60,3	1,0	73,5
64%HCT	Q=3,38	4,5	210,8	3,0	180,9	2,0	146,9
41%HCT	Q=16,9	12,7	593,6	7,0	422,1	4,7	343,0
61%HCT	Q=16,9	23,3	1093,0	14,7	884,6	12,0	881,4

b

		0,15X0,008	Dp namer (dyn/cm)	0,15X0,010	Dp namer (dyn/cm²)	0,15X0,012	Dp namer (dyn/cm²)
41%HCT	Q=3,38	3,0	97,4	1,2	49,2	1,0	49,0
64%HCT	Q=3,38	6,5	211,0	3,5	143,5	2,0	97,9
41%HCT	Q=16,9	15,3	497,7	8,3	241,6	5,7	277,6
61%HCT	Q=16,9	35,7	1158,1	18,0	738,1	12,7	620,4

V predchádzajúcich experimetoch bolo určené, že dotykové napätie 1 000 - 2000 dynov/cm² v intervaloch 1-10 minút alebo hodnoty 5 000 - 7000 dynov/cm²v intervaloch približne 10 ms boli dostatočné pre vyvolanie hemolýzy červených krviniek. Iba v prípade najvyššej vzorky hematokritu (61 %) a najvyššej prietokovej rýchlosti (16,9) hodnoty neprekročili 1 000 dynov/cm². Toto sa vyskytlo u otvorov s najužšou šírkou (0,008 palca = 0,02 cm).

Hodnoty hĺbky svetelnej penetrácie použitím navrhovanej konfigurácie indikujú, že dodanie dostatočnej ultrafialovej energie na riadenie procesov dezaktiváce vírusov je dosiahnuteľné dokonca u vzoriek s vysokým hematokritom.

Výsledky analýzy dotykového napätia na základe prietoku uvádzajú, že rozmery prietokovej dráhy môžu byť výrazne redukované a vysoké prietokové rýchlosti udržované bez rizika hemolýzy červených krviniek.

Príklad 8

Koncentrát krvných doštičiek bol zmiešaný s aditívnym roztokom Isolyte S krvných doštičiek s pomerom 20: 80, krvné doštičky : Isolyte S. Zmesi koncentrátov krvných doštičiek a aditívne roztoky krvných doštičiek sú tu nazvané „prostredím“. Koncentrát krvných doštičiek bez aditívneho roztoku je tu nazvaný „plazma. Oba boli napichnuté s Listeria monocytogenes. Do každého bol potom pridaný vitamín

Κ5 v množstve 300 gg/ml B. Každé bolo potom vystavené UV, viditeľnému alebo izbovému svetlu, v zariadení kyvety na Obr. 7 s výsledkami ukázanými v Tabuľke 6.

Tabuľka 6

	log dezaktivácie (cfu/ml)
K5 v prostredí	K5 v plazme
UV, 40 J/cm²	4,2 log	0,1 log
VID, 40 J/cm²	4,2 log	0,1 log
izbové svetlo	Olog	Olog

UV svetlo = 365 nm

VID svetlo = 419 nm patogén = listeria UV svetlo = 365 nm monocytogenes koncentrácia K5 = 300 pg/ml

Príklad 9

Prostredie a plazma, ako bolo popísané vyššie, obsahujúce vitamín K5 boli napichnuté baktériou a ožiarené alebo len vystavené izbovej teplote (K5-svetlo) ako je ukázané v tabuľke 7, a rast bol vyhodnotený po troch dňoch inkubácie. Dezaktivácia niektorých kmeňov bola v neprítomnosti žiarenia.

Tabuľka 7

		Prostredie	Plazma
	Hodnota napichnú tia	K5+ svetlo	K5- svetlo	K5+ svetlo	K5- svetlo
P. aeruginosa	3,4 log	-	-	-	-
S. aerus	2,1 log	-	-	+	+
S. epidermidis	3,2 log	-	+	-	-
L. monocytogenes	3,5 log			+	+
E.coli	3,1 log	-	-	+	-

UV svetlo = 365 nm, 40 J/cm² + = rast zistený po troch dňoch inkubácie

- = rast zistený po troch dňoch inkubácie koncentrácia K5 = 300 pg/mi

Príklad 10

Prostredie vytvorené použitím koncentrátu krvných doštičiek popísané v Príklade 8 a Isolyte S v pomere Isolyte S : koncentrát krvných doštičiek 70 : 30 a obsahujúce 300 pg/mi vitamínu K5 bolo napichnuté niektorými kmeňmi baktérií a ožiarené energiami s 30 a 60 J/cm². Dezaktivácia ako funkcia ožarovacej energie je uvedená v Tabuľke 8 a na Obr.8.

Tabuľka 8

Energia (J/cm²)	S. aureus	S.epidemidis	L.monocytogenes	E. coli
0	4,3	2,6	2,8	3,5
30	3,6	2,7	2	2
60	3,2	2,5	1	1

Príklad 11

Ku koncentrátu krvných doštičiek popísanému v Príklade 8 a k prostrediu 70 : 30 popísanému v Príklade 10 bolo pridané 10 μΜ 7,8-dimetyl-10-ribitylizoaloxazínu. Koncentrát krvných doštičiek a prostredie boli napichnuté S.aureus alebo S. epideňmidis a ožiarené s 80 J/cm² a 30 J/cm² a dezaktivovácia bola nameraná, ako bolo uvedené vyššie. Výsledky sú ukázané na Obr. 9.

Príklad 12

Ku koncentrátu plazmy popísanému v Príklade 8, ktorá bola v štandardnom krvnom vrecku, bolo pridané 25 μΜ 7,8-dimety-10-ribityl-izoaloxazínu v práškovej forme. Vrecko bolo napichnuté baktériou ako je ukázané v Tabuľke 9, premiešané a vystavené ožiareniu s 120 J/cm². Výsledky dezaktivácie sú uvedené v Tabuľke 9.

Tabuľka 9

patogén	log dezaktivácie (cfu/ml)
S.aureus	1,7 log
S.epidermidis	3,5 log
P. aeruginosa	3,6 log
E.coli	4,1 log

Príklad 13

Ku koncentrátu krvných doštičiek popísanému v Príklade 8 bol pridaný 7,8dimety-10-ribityl-izoaloxazín, aloxazín mononukleotid, alebo 7,8-dimetyl-aloxazín, po čom bol napichnutý S. aureus alebo S.epidermidis a ožiarený s 80 J/cm². Výsledky dezaktivácie sú uvedené v Tabuľke 10.

Tabuľka 10

	log dezaktivácie (cfu/ml)
Staphylococcus aureus	Staphylococcus epidermidis
7,8-dimetyl-10ribityl- izoaloxazín, 10 μΜ	1,9 log	4,1 log
aloxazín mononukleotid, 10 μΜ	1,6 log	5,6 log
7,8-dimetyl-aoxazín, 7 μΜ	1,6 log	2,9 log

Príklad 14

Ku koncentrátu krvných doštičiek z Príkladu 8 bol pridaný 10 μΜ 7,8-dimety10-ribityl-izoaloxazín. Podiely neobsahovali žiadne aditívum, 10 mM askorbát alebo 10 mM Kl ako „zhášač“ alebo antioxidant. Roztoky boli napichnuté s HSV-2, ΦΧ174, S epidermidis alebo S.aureus a ožiarené s 80 J/cm². Výsledky sú ukázané na Obr. 10.

Príklad 15

Ku koncentrátu krvných doštičiek z Príkladu 8 boli pridané meniace sa koncentrácie 7,8-dimety-IO-ribityl-izoaloxazínu. Tieto roztoky boli napichnuté herpes simplex vírusom typu II (HSV-II), dvojito reťazcovým DNA obalovým vírusom. Ožiarenie bolo s 80 J/cm². Experiment bol zopakovaný trikrát. Vo všetkých troch pokusoch bola dosiahnutá úplná dezaktivácia. Výsledky sú ukázané na Obr. 11.

Príklad 16

Protokol z Príkladu 15 bol nasledovaný použitím S. epidermidis namiesto HSVII s energiami 40, 80 a 120 J/cm². Výsledky dezaktivácie sú ukázané na Obr. 12.

Príklad 17

Protokol z Príkladu 15 bol nasledovaný použitím ΦΧ174, jednoreťazcového DNA baktériofágu s meniacimi sa koncentráciami 7,8-dimetyl-10-ribitylizoaloxazínu a energiami ožiarenia. Výsledky dezaktivácie sú ukázané na Obr. 13.

Príklad 18

Ku koncentrátom krvných doštičiek z Príkladu 8 bol pridaný 10 μΜ 7,8dimetylIO-ribityl-izoaloxazín. Tieto boli napichnuté S. aureus alebo ΦΧ174 a ožiarené s menením energií so zmesou 50 : 50 viditeľného a ultrafialového svetla. Výsledky dezativácie sú ukázané na Obr. 14.

Príklad 19 protokol z Príkladu 18 bol nasledovaný použitím S. epidermidis a HSV-II ako mikroorganizmov. Bola dodaná zmes 50 : 50 ultrafialového a viditeľného svetla zo svetelného zdroja DYMAX. Výsledky dezaktivácie sú ukázané na Obr. 15.

Príklad 20

Ku koncentrátom krvných doštičiek z Príkladu 8 bol pridaný 10 μΜ 7,8dimetylIO-ribityl-izoaloxazín v práškovej forme. Boli urobené testy s a bez pridania askorbátu. 150 ml testovaného toztoku bolo umiestnené do Spectra™ krvného vrecka a pretrasené a vystavené meniacim sa energiám žiarenia použitím 50 : 50 viditeľného a ultrafialového svetla. Po získaní 40 J/cm² bol obsah každého vrecka prenesený do nového vrecka, aby sa vyhlo chybám kvôli mikroorganizmom, ktoré môžu zostať na vstupe napichnutia vrecka. Výsledky dezaktivácie sú ukázané na Obr. 16. Dolu smerujúce šípky inikujú dezaktiváciu na úroveň, ktorú je možné zistiť (2,5 log titra).

Príklad 21

Ku koncentrátu krvných doštičiek z Príkladu 8 a koncentrátu krvných doštičiek v Isolyte S v pomere 30 : 70, krvné doštičky : Isolyte S, bol pridaný 20 μΜ 7,8dimetylIO-ribityl-izoaloxazín. Tieto boli napichnuté vakcínia vírusom, dvojito reťazcovým DNA obalovým vírusom a vystavené 60 J/cm² viditeľnému svetlu alebo zmiešanému (50 : 50) viditeľnému a ultrafialovému svetlu použitím UV svetelného zdroja DYMAX po dobu 30 minút. Limit detekcie bol 1,5 log. Výsledky dezaktivácie sú ukázané na Obr. 17. Porovnania bolo urobené bez fotosenzibilátora, pre samotný fotosezibilátor v prostredí Isolyte S, krvné doštičky v prostredí Isolyte S, krvné doštičky v prostredí Isolyte S použitím 8-metoxy psoralému namiesto 7,8dimetyl-10-ríbityl-izolaloxazínu, a koncentrát krvných doštičiek v prostredí Isolyte (30:70).

Príklad 22

Vzorky koncentrátu krvných doštičiek v prostredí Isolyte S, 30: 70, s a bez 7,8dimetyl-10-ribityl-izoaloxazínu boli napichnuté vakcínia vírusom a ožiarené s 60 J/cm² s 50 : 50 viditeľným : ultrafialovým svetlom po meniace sa doby a výsledky dezaktivácie boli porovnané ako je ukázané na Obr. 18.

Príklad 23

Ku vzorkám koncentrátu krvných doštičiek popísaným v Príklade 8 bol pridaný 5 μΜ alebo 50 μΜ 7,8-dimetyl-10-ribityl-izoaloxazín. Vzorky boli napichnuté HIV 1. Použitím prietoku buniek kyvetou ukázanou na Obr. 7 boli vzorky ožiarené s 50: 50 videteľným : ultrafialovým svetlom s meniacimi sa energiami použitím svetelného systému EFOS. Výsledky dezaktivácie sú ukázané na Obr. 19.

Príklad 24

HIV infektované ACH-2 bunky boli pridané do vzoriek koncentrátu krvných doštičiek popísaného v Príklade 8. Do vzorky bol pridaný 5 μΜ alebo 50 μΜ 7,8dimetyl-10-ribityl-izoaloxazín. Nasledoval protokol z Príkladu, výsledky dezaktivácie sú ukázané na Obr. 20. Prítomnosť HIV bola analyzovaná svojimi cytopatickými účinkami na bunkách.

Príklad 25

Protokol z Príkladu 24 bol nasledovaný a prítomnosť HIV bola analyzovaná kvantifikovaním úrovne vytvorením P24 antigénu. Výsledky dezaktivácie sú ukázané na Obr. 21.

Príklad 26

Ku vzorkám koncentrátu krvných doštičiek popísaným v Príklade 8 a prostrediu obsahujúcemu 30 % koncentrát krvných doštičiek a prostredie 70 % PASIU™ bol pridaný 6 mM askorbát a 14 μΜ 7,8-dimety-10-ribityl-izoaloxazín. Vzorky boli napichnuté HSV-II. Výsledky dezaktivácie sú ukázané na Obr. 22 a v Tabuľke 11.

Tabuľka 11

Oas (minúty)	Energia (UV + VID) J/cm²	30:70 PC: prostredie log titru vírusu	Energia (UV + VID) J/cm²	90:10 PC: prostredie log titru vírusu
0	0	5,6	0	5,6
1,5	5	2,5	40	3,3
3	10	2,5	80	1,5 nezistiteľný vírus
4,5	15	2,3	120	1,5 nezistiteľný vírus
6	20	1,8
9	30	1,6
12	40

24	80
36	120

Osoby vzdelané v stave techniky chápu, že nasledujúci popis je urobený len na účely ilustrácie a že môže byť urobené množstvo zmien bez toho, aby sa odklonilo od rozsahu vynálezu. Napríklad, môžu byť použité ďalšie fotosenzibilátory než tie, ktoré boli uvedené, prednostne fotosenzibilátory, ktoré sa viažu na nukleovú kyselinu, a tým ju udržujú od replikácie, a prednostnejšie tie, ktoré nie sú toxické a nemajú toxické rozkladné produkty. Naviac, môžu byť zostrojené ekvivalentné štruktúry s tými, ktoré sú tu popísané, pre konštruovanie prietokového systému na dekontamináciu tekutín použitím fotosenzibilátorov bez zbytočného experimentovania osôb vzdelaných v stave techniky, ak sa oboznámia s týmito poznatkami.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob upravovania tekutiny pre dezaktiváciu mikroorganizmov alebo bielych krviniek, ktoré môžu v nej byť prítomné, kde uvedený spôsob zahrňuje;

a) pridanie k uvedenej tekutine dezaktivačne účinného množstva endogénneho fotosenzibilátora alebo derivovaného senzibilátora na endogénnej báze,

b) vystavenie tekutiny podľa kroku a) ultrafialovému alebo viditeľnému svetlu alebo ich zmesi, čím sú uvedené mikroroganizmy dezaktivované.
2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedený fotosenzibilátor je pridaný k uvedenej tekutine v podstate netoxickom množstve.
3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že uvedená tekutina obsahuje jednu alebo viac zložiek vybrané z proteínu, krvi, krvných súčastí, peritoneálnej tekutiny, potravinových produktov a nápojov, uvedené nápoje sú mienené na spotrebu ľudí alebo zvierat.
4. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že uvedená tekutina zahrňuje krv separovanú z nezmiešanej krvi.
5. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že uvedený fotosenzibilátor je endogénny fotosenzibilátor vybraný z 7,8-dimetyl-10ribityl-izoaloxazínu, 7,8-dimetylaoxazínu, 7,8,10-trimetylizoaloxazínu, aloxazín mononukleotidu, izoaloxazín-adenozín dinukleotidu, vitamínu K1, vitamín K1 oxidu, vitamínu K2, vitamínu K5, vitamínu K6, vitamínu K7, vitamínu K-S(ll) a vitamínu L.
6. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že uvedené mikroorganizmy sú vybrané z HIV vírusov, vírusov hepatitídy, sindbis vírusu, cytomegalovírusu, vezikulárneho stomatitídneho vírusu, vírusov herpex simplex, vakcínia vírusu, ľudských T-lymfotropných retrovírusov, HTLV-III, lymfodenopatického vírusu LAV/IDAV, parvovírusu, transfúziou prenášaného (TT) vírusu, Epstein-Barrovho vírusu, baktériofág ΦΧ174, Φ6, λ, R17, T₄, T₂,

P. aeruginosa, S. aureus, S. epidermidis, L. monocytogenes, E.coli, K pneumoniae a S. marcescens.
7. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 3, ktorý ďalej zahrňuje pretekanie tekutiny obsahujúcej uvedený fotosenzibilátor za fotoradiačným zdrojom rýchlosťou a hĺbkou vybranou pre zaistenie penetrácie fotoradiácie cez tekutinu a dezaktiváciu mikroorganizmov, alebo obsahujúcej uvedenú tekutinu a fotosenzibilátor v nádobe priesvitnej pre uvedenú fotoradiáciu a vystavenie uvednej tekutiny uvedenej fotoradiácii.

7. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že uvedený fotosenzibilátor je pridaný k antikoagulátu a uvedený antikoagulát je pridaný k uvedenej tekutine.
8. Spôsob podľa jedného z nárokov 1 až 3, v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že urýchľovač je pridaný k uvedenej tekutine pred vystavením uvedenej tekutiny fotoradiácii.
9. Spôsob dezaktivácie mikroorganizmov na povrchu zahrňujúci:

a) aplikovanie na uvedený povrch dezaktivačne účinného množstva endogénneho fotosenzibilátora alebo derivovaného senzibilátora na endogénnej báze, a

b) vystavenie uvedeného povrchu fotoradiácii dostatočnej pre aktiváciu fotosenzibilátora.
10. Spôsob upravovania tekutiny pre dezaktiváciu mikroorganizmov, ktoré môžu v nej byť prítomné, uvedená tekutina tiež obsahuje zložku vybranú z proteínu, krvi a krvných súčastí, bez poškodenia biologickej aktivity takej zložky, kde uvedený spôsob zahrňuje pridanie dezaktivačne účinného, netoxického mnosžva vitamínu K5 k uvedenej tekutine pre v podstate dezaktiváciu uvedených mikroorganizmov.
11. Spôsob upravovania povrchu pre dezaktiváciu mikroorganizmov, ktoré môžu v nej byť prítomné alebo ktoré môžu byť s ňou v styku, kde uvedený spôsob zahrňuje:

potiahnutie uvedeného povrchu dezaktivačne účinným, netoxickým množstvom vitamínu K5 pre v podstate dezaktiváciu uvedených mikroorganizmov.
12. Systém na upravovanie tekutiny pre dezaktiváciu mikroorganizmov, ktoré v nej môžu byť prítomné, zahrňujúci:

a) nádobu zahrňujúcu uvedenú tekutinu a endogénny fotosenzibilátor alebo derivovaný fotosenzibilátor na endogénnej báze, uvedená nádoba je vybavená vstupnými prostriedkami a majúca fotopriepustný povrch dostatočný pre umožnenie vystavenia tekutiny, ktorá je v nej, množstvu fotoradiácie dostatočnej pre aktiváciu fotosenzibilátora,

b) aspoň jeden fotoradiačný zdroj pre uskutočnenie dostatočnej fotoradiácie tekutiny v uvedenej nádobe v type a množstve vybranom pre aktiváciu fotosenzibilátora, čím sú prítomné mikroorganizmy dezaktivované.
13. Systém podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že uvedený fotoradiačný zdroj uskutočňuje svetlo vo viditeľnom a / alebo ultrafialovom spektre.
14. Zariadenie na separovanie nezmiešanej krvi na krvné zložky zahrňujúce systém podľa nároku 13.
15. Systém na dezaktiváciu mikroorganizmov v tekutine obsahujúci také mikroorganizmy, zahrňujúci:

a) prostriedky pre pridanie do uvedenej tekutiny účinného množstva endogénneho fotosenzibilátora alebo derivovaného senzibilátora na endogénnej báze,

b) fotopriepustnú nádobu pre uvedenú tekutinu v spojení s uvedenými prostriedkami pre pridanie fotosenzibilátora majúcu hĺbku a dĺžku vybranú pre umožnenie vystavenia tekutiny podľa kroku a) množstvu fotoradiácie dostatočnej pre aktiváciu fotosenzibilátora pri vybranej prietokovej rýchlosti,

c) prostriedky pre produkovanie uvedenej vybranej prietokovej rýchlosti cez uvedenú nádobu, a

d) aspoň jeden fotoradiačný zdroj pre uskutočnenie dostatočnej fotoradiácie tekutiny v uvedenej nádobe v type a množstve vybranom pre aktiváciu fotosenzibilátora.
16. Systém na upravovanie tekutiny pre dezaktiváciu mikroorganizmov, ktoré môžu byť v nej prítomné, zahrňujúci:

a) fotosenzibilátor v práškovej forme,

b) fotopriepustnú nádobu, ktorá obsahuje uvedenú tekutinu a fotosenzibilátor,

c) prostriedky pre premiešanie uvedenej nádoby,

d) aspoň jeden fotoradiačný zdroj pre uskutočnenie dosotočnej fotoradiácie tekutiny v uvedenej nádobe v type a množstve vybranom pre aktiváciu fotosenzibilátora, čím sú mikroorganizmy dezaktivované.
18. Vodný aditívny roztok krvných doštičiek zahrňujúci endogénny fotosenzibilátor vybraný z endogénnych aloxazínov, Vitamínov K a vitamínu L.