CN101257930B - 减少生物样品中的病原体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了使用电磁辐射处理生物样品的方法。本发明的方法能够为经历处理的生物样品提供充分表征的，均匀的和可再生的净辐射能和/或辐射功率。此外，本发明的方法能够将电磁辐射递送至生物样品，选择的波长分布可促进病原体减少，同时将对包含治疗剂和/或再输注剂的成分的光诱导损害减少到最低限度。

Description

减少生物样品中的病原体的方法
相关申请的交叉参考
本申请请求2005年7月6日提交的美国临时专利申请US60/696,932在35U.S.C.119(e)之下的优先权，将该申请完整地引入本文作为参考，其程度并不与本文披露的内容相矛盾。
发明背景
生物样品的采集、加工和纯化为一系列医学疗法和程序中重要的过程。用作治疗剂的重要生物样品包括全血和纯化的血液成分，诸如红细胞、血小板、白细胞和血浆。在输血医学领域中，将一种或多种全血成分直接导入患者的血流以便替代耗尽或缺少的成分。输注血浆衍生的物质，诸如血液蛋白质也在许多治疗应用中起关键作用。例如，通常提供血浆衍生的免疫球蛋白以便补充患者受损的免疫系统。由于对用于输血，输注和移植疗法的纯化生物样品需求的增加，大量的研究工作目前都针对于改善用作治疗剂的生物样品的可用性，安全性和纯度。
输血，输注和移植疗法的安全性和功效取决于鉴定供体捐献的生物样品中存在的致病生物污染物的生物活性和/或减少它们，所述的致病生物污染物诸如病毒，细菌，真菌，细菌噬菌体和原生动物。用作治疗剂的样品中存在病原体是危险性的，因为这些污染物能够导致正在进行治疗的患者发生感染，并且可以有害地影响痊愈时间，生活质量和未来的健康。此外，生物样品中存在致病污染物不仅对正在接受治疗性输血、输注和移植处置的患者，而且对常规操作、处理和给予这些物质的医生和其他医护人员而言都具有严重后果。
尽管用作治疗剂的生物样品目前比过去更为安全，但是接触人体血液样品中的病原体的风险仍然是显著的。按照常规，在人体血液的胞内和胞外部分中鉴定大量有害污染物。例如，据估计20万份供体捐献的血液和血液成分样品中大约有1份被乙型肝炎污染，190万份中大约有1份被人免疫缺陷病毒I/II(HIV)污染，而160万份中大约有1份被丙型肝炎污染。细菌污染物甚至比病毒污染物在供体捐献的血液和血液成分样品中更为常见，并且在血小板产品中污染的发生率可高达每2000-3000份样品中大约有1份。供体捐献的血液成分中被供体白细胞污染是另一个常常遇到的问题。
除这些已知的风险外，还证实了人贮血器通常被其它病原体污染，而这些病原体在常规的血液筛查方案中不能被检出，包括输血传染的病毒、戊型肝炎病毒、人疱疹病毒8、HTLV-2、西尼罗病毒、甲型肝炎、TT病毒、SEN-V疟疾、巴贝西虫、锥虫和parvo B19病毒。作为与这些污染物相关的风险的结果，全血和血液成分因对疾病传播的担忧而目前可能尚未作为治疗剂得到充分使用。
在过去的十年中，出现了许多用于降低与生物样品，尤其是供体捐献的血液成分中致病污染物相关的风险的方法。已经证实对供体和获得的血液样品进行筛查以提供用于鉴定和避免病原体污染的生物样品的有效的方法。有效的筛查方法合并了严格的供体访视和病原体特异性检测技术。尽管通过筛查实现了病原体传播的减少，但是这些方法仍然易受与存在致病污染物相关的问题影响。首先，可测的病原体传播的发生率与筛查的血液样品相关，这是由于以能够导致感染的极低水平检测病原体的困难所致。第二，血液样品的筛查导致要处理大量的被认为不可用的供体捐献的血液。因为供体捐献的血液供给有限，所以处理污染的血液显著降低了重要治疗处置所需的血液成分的利用率。第三，目前的筛查方法限于大约九种病原体特异性检测。因此，目前无法检测已知存在于血液样品中的许多病原体，更不必说那些存在于人体血液中的有待鉴定的血液病原体。最后，筛查方法昂贵且劳动量大，从而需要消耗大量的资源以便有效地实施。
降低与生物样品污染相关的风险的不同手段包括通过杀灭病原体或使它们不能复制减少存在于生物样品中的病原体的生物活性。在过去的十年中，已经出现了多种用于降低生物流体中病原体的生物活性的方法，包括直接光化还原，去污剂在灭活具有脂膜的病毒中的应用，化学处理方法和光诱导的化学还原技术。光诱导的化学还原和直接光化还原由于其与大量病原体灭活的相容性和经证实的功效而成为两种尤其有希望的用于处理生物样品的技术。美国专利US6,277,337，US5,607,924，US5,545,516，US4,915,683，US5,516,629和US5,587,490中描述了使血液中的病原体失活的光诱导的化学还原和直接光化还原的系统和方法。
在光诱导的化学还原方法中，将有效量的一种或多种光敏剂加入到生物流体中，随后将其连续混合并且用电磁辐射照射。照射激活光敏剂，由此启动杀灭存在于样品中的病原体的化学反应和/或物理过程或基本上阻止病原体复制。在直接光化还原方法中，用具有直接提供病原体破坏或灭活的波长的电磁辐射照射生物样品。在某些病原体减少应用中与直接光化还原相比优选光诱导的化学还原方法，因为这些技术常常与照射波长，辐射强度和辐射能相容，而不会显著影响接受处理的生物流体的治疗成分的生物活性和生存力。
生物流体中的病原体的有效光诱导的化学还原在样品处理过程中需要获得和维持有效的照射和流体混合条件。首先，激活电磁辐射的波长分布必须在存在的光敏剂的吸收范围内，优选集中在吸收度最大值附近。第二，对进行病原体减少的流体的所有部分提供的照射强度和辐射能必须足以激发样品中的光敏试剂群体，其量大到足以将病原体的生物活性降低至所需的水平。最后，流体混合速率必须足够大以在经受处理的流体的整个体积内均匀地分布光敏剂和辐射能。
尽管光诱导的化学还原和直接光化还原显示出功效，但是这些技术在降低血液和血液成分中病原体的生物活性中的全有益性目前因处理过程中容纳生物样品的常规容器的光学特性产生的问题而受阻。首先，递送至样品的电磁辐射的量取决于在处理过程中容纳样品的容器的透射特性。然而，已知用于常规血袋和容器的许多材料，诸如具有二-2-乙基己基邻苯二甲酸酯(DEHP)增塑剂的聚(氯乙烯)材料在暴露于紫外和可见电磁辐射时经历光化学诱导的化学和/或物理改变。这些改变能够显著影响这些材料的透射特性。这些不需要的光化学过程也很难表征为暴露时间的函数并且会严重地破坏在特定的处理方案过程中对实际递送至样品的辐射量进行定量的工作。病原体减少处理过程中生物样品的容器的透射特性的变化会使所达到的病原体减少程度的精确确定模糊不清，破坏质量控制工作并且可能对产品的验证和管理部门的许可产生负面影响。第二，许多生物样品的常规容器，诸如聚烯烃袋至少部分可被高能紫外电磁辐射透过，从而降低健康细胞，组织和生物分子，诸如蛋白质的存活力和生物活性。因为许多用于处理生物样品的常用光源，诸如电弧放电灯、汞蒸汽荧光灯、冷阴极荧光灯和激发二聚体灯产生大量的高能紫外电磁辐射，所以进行病原体减少的生物样品的成分在处理过程中常常至少在一定程度上经历不需要的光诱导的降解。
从上述描述中可以意识到显然存在对使用电磁辐射处理生物流体的确保用作治疗剂的安全性和有效性的方法和装置的需求。具体而言，需要方法，装置和装置元件，其可确保对经受直接和/或光诱导的病原体化学还原的生物样品提供可再现的和具有良好特征的辐射能。此外，需要可避免包含治疗剂的生物样品的成分暴露于能够对其生物活性和存存活力产生有害影响的电磁辐射或将这种情况减少至最低限度的方法，装置和装置元件。
发明概述
本发明提供了使用电磁辐射处理样品的方法，装置和装置元件。本发明提供了降低生物样品中病原体的生物活性的方法和系统，从而提供了比常规病原体减少处理方法改善的病原体减少有效性，并且该方法和系统优化了来源于处理的生物样品的治疗剂和再输注剂的生物活性和存存活力。
本发明的一个目的在于提供用于处理生物样品的方法和装置，使得它们安全和有效地用作治疗剂或再输注剂。本发明的另一个目的在于提供能够对进行使用电磁辐射处理的生物样品提供可再现的和均匀的净辐射能和/或辐射功率的方法和装置。本发明的另一个目的在于提供使用具有能够精确定量，计算和/或预测的辐射功率和净辐射能的电磁辐射处理生物样品的方法和装置。
本发明在一个方面中提供了减少生物样品中病原体的方法，其中将样品提供在具有光学特性，诸如消光系数、吸收横截面和透射百分率的容器中，这些光学特性在整个处理的自始至终中的容器暴露于电磁辐射过程中基本上恒定。在本说明书的上下文中，“基本上恒定”的消光系数、吸收横截面和透射百分率在指定的处理过程中改变低于约10％，对某些应用而言优选低于约5％。在本发明该方面的一个实施方案中，将生物样品，诸如血液或血液成分提供在包含聚合物材料和至少一种添加剂，诸如增塑剂的容器中，其中构成容器的聚合物材料和添加剂组合能够至少部分透射具有选择的波长分布的电磁辐射，例如提供生物样品中病原体的直接光还原的波长分布和/或能够诱导产生病原体减少的光化反应的波长分布。
在本发明的该方面中，使具有生物样品的容器暴露于电磁辐射，诸如具有电磁波谱可见和/或紫外区的波长的电磁辐射。具有选择的波长分布的电磁辐射至少部分由该容器透射并且与容纳在容器中的生物样品(和/或其中提供的添加剂)发生相互作用，由此减少存在于样品中的病原体。在本发明的该方面中，选择构成容器的聚合物材料和添加剂组合的物理，化学和光学特性，使得由所述容器透射具有选择的波长分布的电磁辐射在用于指定处理操作的整个处理方案过程中(即暴露于电磁辐射期限)基本上恒定。通过选择聚合物材料和添加剂的组合提供本发明该方面的容器的基本上恒定的透射特征，其在暴露于紫外和/或可见电磁辐射时对具有选择的波长分布的光而言不发生其消光系数(或透射百分率)的显著光诱导的改变。
本发明该方面的方法可以进一步包含测定或者表征容器的光学特性，诸如在处理生物样品前的透射百分率和/或消光系数和在处理生物样品过程中持续，定期或间断监测提供给容器的电磁辐射的辐射功率的步骤。在本发明的该方面中，将容器的透射百分率(或消光系数)表征为处理前波长的函数，并且与测定的光源辐射功率、辐射能或它们两者联用，以便测定和/或控制处理过程中提供给生物样品的辐射能和/或辐射功率。提供基本上恒定辐射功率的电磁辐射源的应用提供了精确预测、计算和/或控制所选择的病原体减少程度所需的暴露时间。
使用包含聚合物和一种或多种添加剂的组合的容器的本发明方法的显著优势在于这些方法使得在处理过程中实际递送至样品的净能量能够精确表征和/或测定，所述的组合表现出诸如相当于第一种波长分布的消光系数和透射百分率这类光学特性，它们在暴露于电磁辐射过程中基本上恒定。本发明的这一特征有益于避免生物样品暴露于不足以获得所选择的病原体减少程度的净辐射能，并且用于避免生物样品过度暴露于大于获得所选择的病原体减少程度所需的净辐射能和/或辐射功率，例如避免样品暴露于辐射功率和/或辐射能而导致包含治疗剂的生物样品中的成分发生损害和/或降解。
用于本发明该方面的容器的有用的聚合物材料和添加剂在如下条件下的透射百分率和/或消光系数未表现出显著的改变(即低于约10％或对某些应用而言更优选低于约5％)：暴露于辐射功率、净辐射能和入射波长时第一种波长分布的电磁辐射和用于减少生物样品，诸如血液和血液成分中病原体的暴露时间。有用的材料包含聚合物材料和添加剂的组合，它们表现出良好的光解稳定性且由此耐受因吸收电磁辐射，特别是紫外和可见电磁辐射诱导的化学组成和/或物理状态的改变。这种重要的功能性通过适当选择用于本发明方法的构成容器的聚合物材料和添加剂的组成、物理状态、结合方案和浓度获得并且代表了超过常用生物样品容器的显著改善，诸如那些包含聚(氯乙烯)材料的具有DEHP增塑剂的容器，它们在吸收紫外辐射时发生显著光化学诱导的改变，这些改变降低了这些材料透射用于病原体减少的电磁辐射的能力。
在一个典型的实施方案中，本发明该方面中构成容器的聚合物材料和添加剂在暴露于净辐射能时对第一种分布的电磁辐射表现出低于约10％的透射百分率和/或消光系数改变，所述的净辐射能使用长至30分钟的暴露时间在约0.1J cm-2-约24J cm-2范围内选择。
在本发明该方面的一个实施方案中，聚(氯乙烯)与一种或多种柠檬酸酯增塑剂，诸如柠檬酸正丁酰基三正己酯、柠檬酸三乙酯、柠檬酸乙酰基三乙酯和柠檬酸乙酰基三正丁酯的组合提供了具有光学、机械和毒理学特性的用于使用电磁辐射处理血液和血液成分样品的容器用材料。首先，聚(氯乙烯)与一种或多种柠檬酸酯增塑剂的组合提供了有效透射电磁辐射的容器用材料，所述的电磁辐射具有约285纳米-约500纳米范围的波长，相当于用于直接光化还原和/或光诱导的化学还原方法的电磁辐射。具有这种波长范围的电磁辐射有效地被某些光敏剂吸收，诸如7，8-二甲基-10-核糖基异咯嗪(在生物样品中以结合或未结合状态)。第二，聚(氯乙烯)与一种或多种柠檬酸酯增塑剂组合提供了在暴露于具有用于血液处理的波长的电磁辐射时不会发生显著的透射百分率和消光系数改变的容器用材料。例如，聚(氯乙烯)与柠檬酸正丁酰基三正己酯(具有约38％重量的浓度)的应用提供了在血液或血液成分处理过程中表现出相当于具有约285纳米-约365纳米范围内波长的电磁辐射的低于10％的透射百分率改变的容器。第三，聚(氯乙烯)与一种或多种柠檬酸酯增塑剂的组合提供了氧(O2)和二氧化碳(CO2)气可透过的容器，这有益于储存血液制品和血液成分而不会损害这些材料，诸如包含血小板的血液成分和制品。此外，容器包含聚(氯乙烯)与一种或多种柠檬酸酯增塑剂的组合在氧和二氧化碳的可透性方面在暴露于用于处理血液和血液成分的电磁辐射后不会显著下降。这方面还允许将包含血小板的血液和血液成分储存在病原体减少处理过程中所用的相同容器中，由此避免在光学加工后额外的样品转移到可透性储存容器中的步骤。最终，聚(氯乙烯)与一种或多种柠檬酸酯增塑剂的组合提供了无毒性的材料且由此由这些材料制成的容器在使用电磁辐射处理过程中或在处理后的储存过程中不会对生物样品释放毒性剂。因此，可以将在包含聚(氯乙烯)与一种或多种柠檬酸酯增塑剂的容器中处理和尺寸的生物样品，诸如血液和血液成分作为治疗剂和/或再输注剂安全地给予患者。
本发明在另一个方面中提供了减少生物样品中病原体的方法，其中将进行处理的生物样品提供在用作过滤入射电磁辐射，还在处理过程中容纳生物样品的光学部件的容器内。在本发明的该方面中，该容器包含综合滤光部件。例如，在一个实施方案中，该容器包含一种或多种能够吸收和/或散射入射电磁辐射的材料，由此至少部分地阻止某些波长的光与进行处理的生物样品发生相互作用。
在本发明该方面的一个实施方案中，用于减少生物样品中病原体的方法包含提供容纳生物样品的容器的步骤，其中该容器包含聚合物和至少一种能够吸收和/或散射不需要的电磁辐射，诸如能够损害或降解样品的电磁辐射的滤光添加剂，诸如固定在聚合物网状构造内的添加剂。在本发明的该实施方案中，选择添加剂的组成和浓度以及容器的厚度，以便具有第一种波长分布的电磁辐射由所述容器透射，而具有第二种波长分布的电磁辐射的透射基本上得到阻止。在本申请的上下文中，表达方式“具有第二种波长分布的电磁辐射的透射基本上得到阻止”意指透射百分率低于约10％且在某些应用中低于约5％。在一个用于减少血液和血液成分中的病原体的实施方案中，第一种波长分布相当于能够直接和/或通过启动光化反应引起病原体减少的电磁辐射，所述的光化反应涉及一种或多种光敏剂，且第二种波长分布相当于能够损害或降解生物样品中的有益成分，诸如细胞、蛋白质和细胞器的电磁辐射。该方法进一步包含使所述容器暴露于电磁辐射的步骤，并且作为构成容器的添加剂的光学特性的结果，具有第二种波长分布的电磁辐射的透射基本上得到阻止。相反，具有第一种波长分布的电磁辐射由所述容器透射并且与生物样品中的成分发生相互作用，由此减少生物样品中的病原体。因此，用于本发明该方面的容器自身起滤光器的作用，从而允许用于引起病原体减少的电磁辐射透射，同时将能够损害生物样品中的成分，诸如包含治疗剂和/或再输注剂的成分的电磁辐射的透射减少到最低限度。
在本发明的该方面中，对中容器包含的添加剂的组成和浓度的选择至少部分决定该容器的光学透射特性，诸如光波长透射，吸收和/或散射。在本发明该方面中有用的容器包含添加剂，这些添加剂传送具有能够直接或间接引起病原体减少的波长的电磁辐射，诸如具有约285纳米-约550纳米波长的光，并且基本上防止了具有降低包含治疗剂和/或再输注剂的生物样品中成分的存活力和/或生物活性的波长的电磁辐射透射，诸如具有低于约285纳米波长的光。
在用于包含血小板的血液或血液成分样品中病原体减少的典型实施方案中，用于滤光应用的添加剂是无毒性的，基本上不会降低用于血小板储存的容器在CO2和O2方面的透过性，并且不会对容器的有益机械性能产生负面影响(例如强度、柔韧性和耐久性)。在本发明方法中提供滤光功能性的有用的添加剂包括：氨基酸，诸如酪氨酸、组氨酸、苯丙氨酸和色氨酸；吸收具有约200纳米-约270纳米波长范围的光的肽类和/或蛋白质。可以将氨基酸、肽类和蛋白质添加剂提供为共聚物中的聚合物成分，其中它们与共聚物网状构造中的其它聚合物材料共价连接。或者，可以将氨基酸、肽类和蛋白质添加剂提供为分散和固定在聚合物网状构造内的添加剂材料，但它们不一定与所述的网状构造共价键合。氨基酸、肽类和/或蛋白质添加剂在本发明该方面中的应用特别应用于防止血液和血液成分样品的光诱导的降解，因为这些添加剂的吸收光谱与这些样品中的许多蛋白质光谱重叠，且由此容器中的氨基酸、肽类和/或蛋白质添加剂基本上防止了光透射，否则光可能被存在于样品中的蛋白质吸收。有用的添加剂还包括以共聚物或分散相形式固定在聚合物网状构造中的核酸和/或寡核苷酸，并且包括合成和天然存在的色素和染料。
各种聚合物材料用于本发明的方法，包括，但不限于热塑性塑料、热固性材料增强塑料和复合聚合物材料。此外，各种添加剂用于本发明的方法，包括，但不限于增塑剂、光稳定剂、热稳定剂、抗氧化剂、阻燃剂、脱模剂、成核剂、色素和其它光学吸收剂。本发明的容器可以进一步包含其它材料，诸如纤维、颗粒物质和其它结构强化剂。
本发明容器中添加剂的浓度至少部分确立了用于生物样品的容器的光学透射特性。添加剂，诸如光学吸收剂、色素和柠檬酸酯增塑剂的浓度越高，则容器提供的滤光程度越大。此外，添加剂的浓度可以影响容器的光解稳定性(即在暴露于电磁辐射过程中提供基本上恒定的透射特性)。在本发明用于血液和血液成分样品中病原体的直接光化还原和光诱导的化学还原的实施方案中，在约25％-约50％质量范围内选择柠檬酸酯增塑剂在聚(氯乙烯)中的浓度，对某些应用而言优选约38％重量。
本发明的方法特别用于减少血液成分中的病原，包括，但不限于包含血小板的和/或含血浆的血液成分。处理包含血小板和/或血浆的血液成分的典型方法包括使这些材料暴露于具有约285nm-约365nm范围内选择的波长分布的电磁辐射。任选本发明该方面的方法可以进一步包含向容器内生物样品添加一种或多种样品添加剂的步骤，诸如光敏剂、增强剂、稳定剂、防腐剂、稀释剂或抗凝剂。在包含病原体光诱导的化学还原方法的本发明的一个实施方案中，在暴露于电磁辐射前将7，8-二甲基-10-核糖基异咯嗪提供给含血小板的和/或含血浆的血液成分。
用于本发明方法的容器可以具有用于处理生物样品的任何体积，大小，形状和表面积。本发明的容器包括流体容器，诸如袋、柔性容器、可收缩的容器、管、反应器、室、槽、料槽和本领域中已知处理生物材料的所有这些等同物。用于本发明方法的容器可以完全由聚合物材料和添加剂构成。或者，本发明的方法与具有包含聚合物材料和添加剂的分散的部分透明区的容器相容。本发明的容器可以具有多个部分透明区，由此能够通过使容器的多个表面暴露于电磁辐射进行照射。
可以给用于本发明方法的容器配置鉴别标记，诸如条形码、书面标记或手书标志区。任选用于本发明方法的容器可以可操作地与流体混合装置连接，诸如振荡器、混合器、流体泵、再循环器或搅拌器，用于在处理过程中混合包含流体的生物样品。任选用于本发明方法的容器可以以一种方式配置，使得它们可以集成血液处理仪器，诸如密度离心机、冲洗室、光反应器、洗涤室和购自GambroBCT
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，Lakewood，CO，USA的COBE
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SpectraTM或TRIMA
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单采血液成分系统。本发明的方法适合于处理包含在至少部分透明的固定-体积容器中的流体，特别是生物流体。在本文的上下文中，术语固定体积容器意指密闭空间，它可以由刚性的或柔韧性材料制成。本发明的方法和装置也适合于处理流过包含流动反应器的容器的流体，特别是生物流体。在一个实施方案中，流体以选择的流速流过流动反应器，以便建立流体在流动反应器照射部分中的停留时间，从而提供存在病原体的生物活性的期望程度的下降。在流动反应器中的流体流动条件可以具有层流成分，湍流的成分或层式与湍流成分的混合物。
本发明的方法还用于降低存在于生物样品，诸如血液或其成分中的白细胞的生物活性。通常称作白细胞减少的降低白细胞生物活性通常是理想的，此时抑制免疫应答或自身免疫反应是给予来源于血液的治疗剂所需的。例如，白细胞生物活性降低可以有益于在存在患者或供体白细胞时涉及红细胞，血小板和/或血浆输注的方法。在典型的实施方案中，将经历白细胞减少处理的生物样品提供在具有光学透射特性的容器中，这些特性在选择的处理操作中暴露于电磁辐射期间基本上恒定。本发明还包括方法，其中将生物样品容纳在提供滤光的容器中，这种滤光将样品中成分暴露于有害高能紫外电磁辐射减少到最低限度，同时提供能够降低存在于样品中的白细胞的生物活性的电磁辐射。
本发明的方法和装置广泛适合于任何方法，其中生物样品暴露于电磁辐射。在一个实施方案中，本发明的方法包含降低血液或血液成分中的病原体生物活性的方法，所述的血液或血液成分诸如含红细胞的血液成分，含血小板的血液成分，含血浆的成分，含白细胞的成分和包含一种或多种来源于血液的蛋白质的溶液，该方法提供了优于常规病原体减少方法的改善的血液制品质量。在另一个实施方案中，本发明提供了降低作为治疗剂，诸如静脉药物或腹膜用溶液给予的流体中病原体的生物活性的方法。
本发明在另一个方面中提供了减少生物样品中的病原体的方法，包括下列步骤：(1)提供容纳生物样品的容器；其中该容器包含聚合物材料和至少一种添加剂，且其中该容器透射具有波长分布的电磁辐射；和(2)使该容器暴露于电磁辐射，其中具有所述波长分布的电磁辐射由所述容器透射并且至少部分被生物样品吸收，由此减少生物样品中的病原体；其中所述容器透射具有所述波长分布的电磁辐射在暴露于电磁辐射过程中对基本上恒定。在一个实施方案中，添加剂为一种或多种柠檬酸酯增塑剂，诸如柠檬酸正丁酰基三正己酯；柠檬酸三乙酯；柠檬酸乙酰基三乙酯；和柠檬酸乙酰基三正丁酯。
本发明在另一个方面中提供了减少生物样品中病原体的方法，包括下列步骤：(1)提供容纳生物样品的容器；其中该容器包含聚合物材料和至少一种添加剂，其中选择添加剂的组成和浓度，以便具有第一种波长分布的电磁辐射由该容器透射且具有第二种波长分布的电磁辐射的透射基本上得到阻止，其中具有第一种波长分布的电磁辐射能够引起生物样品中的病原体减少，并且其中具有第二种波长分布的电磁辐射能够损害生物样品；和(2)使该容器暴露于电磁辐射，其中第二种波长分布的电磁辐射的透射基本上得到阻止，并且其中具有第一种波长分布的电磁辐射由所述容器透射且至少部分被生物样品吸收，由此减少生物样品中的病原体。在一个实施方案中，所述的添加剂为一种或多种柠檬酸酯增塑剂，诸如柠檬酸正丁酰基三正己酯；柠檬酸三乙酯；柠檬酸乙酰基三乙酯；和柠檬酸乙酰基三正丁酯。在一个实施方案中，所述的添加剂为：一种或多种氨基酸，诸如酪氨酸、组氨酸、苯丙氨酸和色氨酸；或包含这些氨基酸的肽类和/或蛋白质。
附图简述
图1表示例示减少容纳在包含聚(氯乙烯)和柠檬酸酯增塑剂的容器中的血液或其成分中的病原体的方法的示意图。
图2提供了包含用于容纳血液或血液成分样品的至少部分透明袋的典型容器的示意图。
图3表示7，8-二甲基-10-核糖基异咯嗪在磷酸缓冲盐水中的200微摩尔溶液的吸收光谱(曲线A)，其特征在于在约370纳米，450纳米，260纳米和220纳米有最大吸收。图3还表示作用光谱(log病毒杀灭；曲线B)，它相当于具有7，8-二甲基-10-核糖基异咯嗪并且暴露于选择波长的紫外和可见电磁辐射的含血小板的样品的减少效率。
图4表示用于本发明方法的包含聚(氯乙烯)和柠檬酸酯增塑剂袋的容器的透射光谱(曲线A)和包含常用聚烯烃袋的容器的透射光谱(曲线B)。
图5A表示在连续暴露于紫外辐射时柠檬酸酯增塑的聚(氯乙烯)袋的透射光谱，且图5B提供了在308纳米处作为暴露时间函数的透射百分率的示意图。
图6A表示在连续暴露于紫外辐射时聚(氯乙烯)和DEHP增塑剂袋的透射光谱，且图6B提供了在308纳米处作为暴露时间函数的透射百分率的示意图。
图7A表示在连续暴露于紫外辐射时聚烯烃袋的透射光谱，且图7B提供了在308纳米处作为暴露时间函数的透射百分率的示意图。
图8A-H表示体外细胞质量参数与体内血小板恢复率的相关性。体内血小板恢复率为如下参数的函数：乳酸盐产生值(a)；在22℃下第5天时的pH(b)；葡萄糖消耗(c)；第5天时P-选择蛋白的表达百分比(d)；第5天时的旋涡评分(e)；第5天时的HSR百分比(f)；第5天时的pO2(g)；和第5天时的pCO2(h)。在图8A-8H中提供的示意图中，空心圆圈相当于对照组血小板，实心菱形相当于中剂量UV光处理的血小板，且实心方块相当于高剂量UV光处理的血小板。
图9表示对每一样品测定的O2透射速率(试验组和对照组各3袋样品，每一样品一式两份)。
图10表示具有表示±1标准偏差的误差条的各组(试验和对照)的平均值。
图11表示对每一样品测定的CO2透射速率(试验组和对照组各3袋样品，每一样品一式两份)。
图12表示具有表示±1标准偏差的误差条的各组(试验和对照)CO2透射速率的平均值。
就附图而言，类似的数字表示类似的要素并且在一个以上附图中显示的相同的编号意指相同的要素。此外，下文中应用如下的定义：
“柠檬酸酯增塑剂”意指柠檬酸酯，诸如柠檬酸的醇酯，将其加入到聚合物中，诸如聚(氯乙烯)，以便提供所需的机械、物理、化学和光学特性，包括增强的柔韧性、柔软性、可伸展性、抗冲击性或它们任何组合。用于处理包含治疗剂的生物样品的方法和装置的柠檬酸酯增塑剂为无毒性的。典型的柠檬酸酯增塑剂包括，但不限于：柠檬酸正丁酰基三正己酯；柠檬酸三乙酯；柠檬酸乙酰基三乙酯；柠檬酸三正丁酯；和柠檬酸乙酰基三正丁酯。
术语“电磁辐射”和“光”在本说明书中以同义词使用，并且意指电和磁场中的波。用于本发明方法的电磁辐射包括，但不限于紫外光、可见光或它们任何组合。用于本发明方法的电磁辐射的波长分布的选择可以基于许多因素，包括，但不限于：提供给进行处理的生物样品的一种或多种光敏性材料的吸收光谱；作为波长函数的生物样品成分的透射、吸收和/或散射系数；对生物样品中的成分有害的电磁辐射波长；或它们任何组合。典型方法使用特征在于波长分布的电磁辐射，所述的波长基本上被提供给流体的光敏性材料吸收并且基本上由至少部分流体内的流体自身透射。本发明用于处理含红细胞的血液成分的典型方法和装置使用具有电磁波谱可见区中波长的电磁辐射。例如，在本发明用于处理含红细胞的血液成分并且使用吸收电磁波谱可见区中光的光敏性材料的一个方面中，使用具有在约400nm-约800nm范围内选择的波长分布的电磁辐射。用于处理含血浆和血小板的血液成分的本发明的典型方法和装置使用具有电磁波谱紫外区中波长的电磁辐射。例如，在本发明可以用于处理含血小板和血浆的血液成分和使用包含7，8-二甲基-10-核糖基异咯嗪的光敏性材料的一个方面中，使用具有在约285nm-约365nm范围内选择的波长分布的电磁辐射。正如本领域技术人员可以理解的，当存在某些流体成分，诸如蛋白质时，光敏性材料，诸如7，8-二甲基-10-核糖基异咯嗪的吸收光谱可以改变，并且本发明的方法可以在选择提供给具有光敏性材料的生物样品的电磁辐射的适当波长分布中考虑到这种光敏性材料的吸收光谱的改变。
“净辐射能”意指在流体处理过程或流体处理过程的组合过程中递送至流体的辐射能的总量。净辐射能可以以功率，暴露时间和照射的表面积的方式由如下等式表示；
E net = ∫ A = 0 A = A I ∫ t = 0 t = t f P ( t , A ) dAdt ; - - - ( I )
其中Enet为递送的净辐射能，P(t)为作为时间和面积函数的暴露于立体的电磁辐射功率，tf为照射的时间间隔，t为时间，A为面积且AI为容纳流体的容器的照射面积。在本发明使用基本上恒定功率的方法中，净辐射能可以以辐射功率和暴露时间的方式由如下等式表示：
Enet＝P×tf；
(II)
其中Enet为净辐射能，P为电磁辐射的恒定辐射功率，且tf为照射时间间隔。也可以表示为每单位面积或每单位体积中的净辐射能。
使用电磁辐射“处理”或“加工”生物样品意指一种过程，其中将电磁辐射递送至生物样品以便在生物样品或生物样品成分的组成上获得所需的改变和/或在生物样品中的一种或多种成分的生物活性方面获得改变。在一个方面中，本发明的方法能够使用电磁辐射处理生物样品，包括生物流体，诸如血液和血液成分，按照这类方式降低存在于生物样品中的一种或多种病原体的生物活性。在另一个方面中，本发明的方法能够使用电磁辐射处理生物样品，包括生物流体，诸如血液和血液成分，按照这类方式降低存在于生物样品中的一种或多种白细胞的生物活性。
术语“强度”意指电磁波或多种电磁波的振幅平方。在本文上下文中的术语振幅意指电磁波振动的等级。或者，术语“强度”可以意指电磁辐射光束或多种电磁辐射光束的时间平均能流，例如，光子数/平方厘米/单位时间电磁辐射波束或多种电磁辐射波束。
“生物样品中的成分”和‘生物样品成分”在本说明书中可以作为同义词使用并且意指生物样品的部分或级分。生物样品中的成分可以包括颗粒，分子，离子，细胞和细胞碎片，光敏剂，病原体，分子和复合物聚集物，病原体聚集物，白细胞或它们的任何组合。
“光敏剂”指的是吸收电磁辐射并且使用吸收的能量进行所需化学或物理过程的材料。用于血液处理应用的光敏剂在吸收电磁辐射时能够引起存在于生物样品中的病原体和/或白细胞的生物活性降低。用于本发明某些应用的光敏剂包括优先结合，吸收或嵌入核酸的化合物，由此集中它们对微生物，病毒和白细胞的光动效应。可以用于本发明方法的典型光敏剂包括，但不限于：咯嗪化合物；异咯嗪化合物；7，8-二甲基-10-核糖基异咯嗪；卟啉类；补骨脂素类，染料，诸如中性红、亚甲蓝、吖啶、甲苯胺类、吖啶黄(盐酸吖啶黄)和吩噻嗪衍生物；香豆素类；喹诺酮类；醌类；和蒽醌类。用于实施本发明的光敏剂包括无毒性的内源性光敏剂，无需在给予患者前将它们从包含治疗成分的生物样品中除去。光敏剂可以以电离，部分电离或中心状态存在于进行处理的生物样品中。光敏剂可以作为化合物和分子复合物的聚集物存在于进行处理的生物样品中。
术语“内源性”意指在人或哺乳动物体内天然发现的，可以作为身体合成的结果，也可以因作为主要膳食(例如维生素)摄入产生或体内代谢物和/或副产物形成。术语″非内源性″意指并非在人或哺乳动物体内天然发现的，即并非可以作为身体合成的结果，也可以因作为主要膳食摄入产生或体内代谢物和/或副产物形成。
“增强剂”指的是加入到进行处理的生物样品中以便使所需处理过程更有效和更具选择性的材料。增强剂包括抗氧化剂或其它加入以便防止包含治疗剂的生物样品成分降解的试剂。此外，增强剂包括改善病原体和/或白细胞生物活性降低率的材料。典型的增强剂包括，但不限于腺嘌呤、组氨酸、半胱氨酸、棓酸丙酯、谷胱甘肽、巯基丙酰甘氨酸、二硫苏糖醇、烟酰胺、BHT、BHA、赖氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、葡萄糖、甘露糖醇、trolox、甘油和所述化合物的任何组合。
“生物样品”广义上指的是来源于生物体的任何材料。用于本发明方法的生物样品包括，但不限于液体和一种以上液体的混合物、胶体、泡沫、乳剂、溶液和它们的任何组合。用于本发明的生物样品包括生物流体，诸如全血、血液成分、血液亚成分、含血浆的血液成分、含血小板的血液成分、含红细胞的血液成分、含白细胞的血液成分、含一种或多种来源于血液的蛋白质的溶液或它们的任何组合。典型的生物样品还包括：用于腹膜透析的腹膜溶液；静脉内药物；可注射药物；营养液；食物；由重组方法制备的发酵培养基；由重组技术产生的材料，包括治疗和诊断用材料；由动物和植物产生的材料，包括治疗和诊断用材料；奶和乳制品；和疫苗。术语生物样品指定包括还包含一种或多种样品添加剂的样品，所述的样品添加剂诸如光敏剂、抗凝剂、稳定剂、增强剂和稀释剂。用于本发明方法的生物样品特别包括，但不限于具有一种或多种光敏剂，诸如7，8-二甲基-10-核糖基异咯嗪存在的生物样品。
本文所用的“血液”，“血液制品”和“血液成分”包括全血，血液成分和来源于全血或其成分的材料。本文所用的“血液”，“血液制品”和“血液成分”包括使用一种或多种添加剂，诸如抗凝剂、增强剂、光敏剂、防腐剂或稀释剂处理的血液，血液成分和/或血液制品。“血液”，“血液制品”和“血液成分”还意指这些材料与和添加剂，诸如光敏剂、增强剂、稳定剂、抗凝剂和防腐剂的混合物。细胞血液成分包括，但不限于红细胞(红血细胞)、白细胞(白血细胞)、凝血细胞(血小板)、嗜酸细胞、单核细胞、淋巴细胞、粒细胞、嗜碱细胞、血浆和血液干细胞。非细胞血液成分包括血浆和分离自血液样品的血液蛋白，包括，但不限于因子III、冯维勒布兰德因子、因子IX、因子X、因子XI、Hageman因子、凝血酶原、抗凝血酶III、纤连蛋白、维溶酶原、血浆蛋白级分、免疫血清球蛋白、修饰的免疫球蛋白、清蛋白、血浆生长激素、生长调节素、维溶酶原、链激酶复合物、血浆铜蓝蛋白、转铁蛋白、触珠蛋白、抗胰蛋白酶和前激肽释放酶。
“无毒性”为材料的特征，它们在给予患者，人，动物或植物时不会产生实质上的有害作用。用于某些血液处理过程的无毒性材料的毒性低于通常用于血液灭菌的卟啉和卟啉衍生物和代谢物。
“核酸”包括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)。
“部分透明的”意指在照射时透射至少部分入射电磁辐射的材料，装置或装置元件。
“病原体减少”指的是部分或完全防止病原体再生的过程。病原体减少可以通过直接杀灭病原体，干扰其再生能力或这些过程的组合进行。病原体减少降低了存在于流体中的病原体的生物活性。在一个典型的实施方案中，本发明的方法和装置能够降低存在于生物流体中的病原体的生物活性，使得所述流体作为治疗剂给药时是安全的。
“光源”或“电磁辐射源”指的是能够产生电磁辐射的任何装置或材料或能够产生电磁辐射的多种装置或材料。可用于本发明的典型光源包括，但不限于汞蒸汽荧光灯、冷阴极荧光灯、激发二聚体灯、发光二极管(LED)、发光二极管阵列、电弧放电式灯和钨丝白炽灯。
“致病污染物”和“病原体”指的是病毒，细菌，噬菌体，真菌，原生动物，血液传播的寄生虫。典型病毒包括人免疫缺陷病毒(HIV)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒、新培斯病毒、巨细胞病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、人T-亲淋巴逆转录病毒、HTLV-III、淋巴结病病毒LAV/IDAV、细小病毒、输血(TT)病毒、EB病毒、西尼罗病毒和其它本领域中公知的病毒。典型的细菌噬菌体包括，但不限于ΦX174、Φ6、λ、R17、T4和T2。典型的细菌包括铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidernis)、单核细胞增生利斯特氏菌(L.monocytogenes)、大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumonia)和S.marcescens。典型寄生虫包括疟疾、巴贝西虫和锥虫。
“生物活性”指的是组合物，材料，微生物或病原体在活生物体或其组成部分中产生改变作用的能力。
“细胞质量指示剂”指的是细胞血液成分质量的指示剂。典型的细胞质量指示剂为相当于包含细胞或细胞血液成分的流体物理状态的参数，这些参数提供了用于评价其最后在治疗应用中的应用的质量的测量值。在代谢过程中，细胞消耗葡萄糖并且每消耗一个葡萄糖分子产生两个分子的乳酸盐分子。形成的乳酸盐具有降低血液成分样品的pH的作用。当在将定量的葡萄糖提供给储存过程中的细胞时，过快消耗葡萄糖的储存的细胞血液成分降解。在储存时，较低的葡萄糖消耗率和乳酸盐产率指示了保持高度治疗有效性的细胞血液成分。因此，认为低葡萄糖消耗率和乳酸盐产率为高度细胞质量的指示剂。
“光子的流量”或“光子通量”指的是在指定时间通过确定面积的光子数量。一般而言，以如下单位定义光子通量：(光子数量)cm-2s-1。
“聚合物”指的是包含多个重复化学基团，一般称作单体的分子。聚合物的特征通常在于高分子量。可用于本发明的聚合物可以为有机聚合物或无机聚合物，并且可以为非晶形，半-非晶形，结晶或部分结晶状态。聚合物可以包含具有相同化学组成的单体或可以包含具有不同化学组成的多种单体，诸如共聚物。具有连接的单体链的交联聚合物特别用于本发明的某些应用。可用于本发明方法，装置和装置元件的聚合物包括，但不限于塑料、弹性体、热塑弹性体、热塑性弹性材料、恒温材料、热塑性弹性材料。典型聚合物包括，但不限于聚(氯乙烯)。
在下列描述中，给出了本发明装置，装置元件和方法的大量具体细节，以便提供对本发明确切特性的透彻解释。然而，本领域技术人员显而易见，可以在没有这些具体细节的情况下实施本发明。
本发明提供了使用电磁辐射处理生物样品的方法，装置和装置元件。本发明的方法，装置和装置元件能够对经受处理的生物样品提供具有良好特征的，均匀的和可再现的净辐射能和/或辐射功率。此外，本发明的方法，装置和装置元件能够对生物样品递送电磁辐射，它具有选择的波长分布以便提供强化的病原体减少，同时将对包含治疗剂和/或再输注剂的成分的光诱导的损害减少到最低限度。
图1表示例示减少容纳在包含聚(氯乙烯)和柠檬酸酯增塑剂(即柠檬酸酯增塑的PVC容器)的容器内的血液或血液成分中的病原体的方法和装置的示意图。如图1中所示，电磁辐射(图中箭头100例示)由电磁辐射源110产生并且指向包含聚(氯乙烯)和柠檬酸酯增塑剂的容器120上。容器120容纳进行病原体减少处理的血液或血液成分样品125，它可以任选包含一种或多种添加的抗凝剂、增强剂、光敏剂、防腐剂或稀释剂。容器120还具有至少一个部分透明的表面130，它至少部分透射具有选择的波长分布的电磁辐射(图中箭头135例示)，例如，能够直接减少病原体和/或诱导产生病原体减少的化学反应的电磁辐射。具有选择的波长分布的电磁辐射135通过容器120透射并且至少部分被血液或血液成分样品125吸收，由此降低存在的病原体的生物活性。任选配置振荡器160以便在暴露于电磁辐射的过程中混合血液或血液成分样品125，以确保将电磁辐射均匀提供给进行处理的样品中的所有成分。可以使用流体处理领域中公知的任何方式使振荡器160可操作地与容器120连接。
在处理血液或血液成分样品125前，任选充分表征(例如测定和/或计算)聚(氯乙烯)和柠檬酸酯增塑剂容器120的部分透明的表面130的透射特性(透射百分率和/或消光系数)。在本发明该方面的一个实施方案中，由电磁辐射源110产生的电磁辐射100的辐射功率由位于与电磁辐射源110发生光透射位置的光检测器145连续，定期或间断监测。这种排列使得辐射功率和/或净辐射能确切递送至血液或血液成分样品125，以便使用聚(氯乙烯)和柠檬酸酯增塑剂容器120的部分透明表面130的表面积和透射特性的知识精确计算。
图2提供了典型容器120的示意图，该容器包含用于容纳血液或血液成分样品的至少部分透明柠檬酸酯增塑的聚(氯乙烯)袋。柠檬酸酯增塑的聚(氯乙烯)袋包含由具有等于约38％重量百分比的柠檬酸正丁酰基三正己酯(C28H50O8；分子量等于514原子质量单位)构成的柠檬酸酯增塑的聚(氯乙烯)薄膜(比重：1.19+/-.02)。柠檬酸酯增塑的聚(氯乙烯)袋具有1升体积，等于6.75±0.25英寸的宽度和等于约9.50±0.25英寸的长度。柠檬酸酯增塑的聚(氯乙烯)袋的壁具有等于0.015±0.001英寸的厚度。在某些处理方法中，柠檬酸酯增塑的聚(氯乙烯)袋容纳具有从约200毫升-约400毫升范围选择的体积的血液或血液成分样品，并且在处理过程中照射等于每侧约347cm2的柠檬酸酯增塑的聚(氯乙烯)袋。
柠檬酸酯增塑的聚(氯乙烯)袋的组成和物理尺寸提供了大量用于处理血液的有益属性。柠檬酸酯增塑的聚(氯乙烯)袋为光解稳定的并且在处理方案过程中在透射百分率(或消光系数)方面不会发生明显改变，所述的透射百分率(或消光系数)相当于用于指定过程的有效波长的光。柠檬酸酯增塑的聚(氯乙烯)袋还大量透射(即具有超过约30％的透射百分率)具有285纳米-365纳米范围的光，该范围相当于用于处理含血小板的样品的波长范围。柠檬酸酯增塑的聚(氯乙烯)袋具有2000PSI(纵向；最小)和1900PSI(横向；最小)的拉伸强度并且能够伸长(290％(纵向；最小)，330％(横向；最小)。
在用于减少具有添加的7，8-二甲基-10-核糖基异咯嗪光敏剂的血液或血液成分中的病原体的实施方案中，选择的波长分布包括由生物样品中结合或未结合状态的7，8-二甲基-10-核糖基异咯嗪吸收的电磁辐射波长。存在于血液或血液成分样品中的7，8-二甲基-10-核糖基异咯嗪吸收电磁辐射引起光化反应，导致病原体的生物活性降低。图3表示7，8-二甲基-10-核糖基异咯嗪在磷酸缓冲盐水中的200微摩尔溶液的吸收光谱(吸收度与波长的关系；曲线A)，其特征在于在约370纳米和约450纳米有最大吸收。然而，预计7，8-二甲基-10-核糖基异咯嗪在结合存在于生物样品中的生物分子，诸如蛋白质、RNA分子或DNA分子时，其吸收光谱改变。图3还表示相当于含血小板和细菌的样品的减少效率的作用谱(log病毒杀灭；曲线B)，所述的样品具有7，8-二甲基-10-核糖基异咯嗪并且暴露于紫外和可见电磁辐射的选择的波长。图3还表示DNA吸收光谱(吸收度与波长的关系；曲线C)。从图3提供的作用波长中看出，可能的情况是存在于7，8-二甲基-10-核糖基异咯嗪存在于含血浆的样品中，并且含血浆的样品具有其位移至较高波长(约430纳米和约470纳米)的最大吸收。因此，用于含血小板和/或血浆的血液成分的典型病原体减少方法使用具有约300纳米-约500纳米范围波长分布的电磁辐射。本发明还包括病原体减少方法，其中波长分布相当于能够直接降低存在于样品中的病原体生物活性的电磁辐射(即在无光敏剂存在于生物样品中时)。
图4表示具有柠檬酸正丁酰基三正己酯(38％重量百分比)的柠檬酸酯增塑的聚(氯乙烯)袋的透射光谱(曲线A)和常用聚烯烃袋的透射光谱(曲线B)。如图4中所示，柠檬酸酯增塑的聚(氯乙烯)袋的应用与聚烯烃袋相比减少了短波长区(285-305nm)中光的透射。这种透射光谱的差异有利于包含治疗剂或再输注剂的血液成分的血液处理应用，因为已知短波长区中的光损害细胞成分，诸如血小板和细胞蛋白以及非细胞血液成分，诸如血浆蛋白。实际上，短波长UV光的减少作用是重要的，以便避免度处理的血小板细胞器产生严重损害，诸如维持对血小板存活力和功能的部分生物能ATP供给的线粒体。再次涉及图4，柠檬酸酯增塑的聚(氯乙烯)袋的应用与聚烯烃袋相比还以相对长的波长(365-400nm)增加了光的透射。这种透射光谱的差异有利于使用7，8-二甲基-10-核糖基异咯嗪光敏剂的血液处理应用，因为该化合物在游离或结合状态时在这一电磁波谱区中具有最大吸收。
图5A表示柠檬酸酯增塑的聚(氯乙烯)袋在暴露于紫外辐射几次照射时的透射光谱，且图5B提供了作为暴露时间函数的在308纳米处的透射百分率的示意图。图6A表示聚(氯乙烯)和DEHP增塑剂袋在暴露于紫外辐射几次照射时的透射光谱，且图6B提供了作为暴露时间函数的在308纳米处该袋的透射百分率的示意图。图7A表示聚烯烃袋在暴露于紫外辐射几次照射时的透射光谱，且图7B提供了作为暴露时间函数的在308纳米处该袋的透射百分率的示意图。图5A，5B，6A，6B，7A和7B中的数据通过使具有不同组成的袋暴露于电磁辐射源产生，所述的电磁辐射源提供基本上恒定的辐射输出，正如通过320nm OAI功率计量器(Optical Associates Inc.，San Jose，CA)测定的，强度为约10.5mW/cm2。电磁辐射源为Ushio G25T8E Nichia NP-803磷光体(辐射波长＝265nm-375nm；峰值波长＝306nm-308nm)。暴露时间为0分钟，10分钟，20分钟和30分钟。在所示的暴露时间后，使所研究的袋脱离与电磁辐射源的光学传递。然后将所研究的袋放置在积分球上并且暴露于具有如通过320nm OAI功率计量器测定的约5.4mW/cm2的恒定辐射源。通过OL-754分光辐射谱仪(OptronicLaboratories，Inc.，San Diego，CA)测定光谱输出/透射特性。
如图5A和5B中所示，柠檬酸酯增塑的聚(氯乙烯)袋在照射30分钟的暴露时间过程中在308纳米处表现出低于约10％的透射百分率增加。相反，如图6A和6B中所示，聚(氯乙烯)和DEHP增塑剂容器的透射光谱在308纳米的30分钟的暴露时间表现出高于约55％的透射百分率下降。如图7A和7B中所示，聚烯烃袋在308纳米的30分钟的暴露时间表现出高于约10％的透射百分率下降。图5A，5B，6A，6B，7A和7B中提供的透射光谱比较表示柠檬酸酯增塑的聚(氯乙烯)袋特别是光解稳定的并且使用电磁辐射处理样品的过程中不会发生显著的光诱导的分解或降解。因此，预计聚(氯乙烯)和柠檬酸酯增塑剂容器在本发明方法中的应用对生物样品比具有DEHP增塑剂袋和聚烯烃袋，诸如使用聚(氯乙烯)的常用容器对生物样品提供了更均匀和可再现的辐射能和/或辐射功率。
本文使用的术语和表达方式作为描述的术语使用，但并不限于它们，且并不意指在这类术语和表达方式的应用中排除任何所示和所述特征的等同含义或其部分，但公认各种变型在请求保护的本发明范围内。因此，应理解尽管已经由优选实施方案具体披露了本发明，但是本领域技术人员可以采取典型实施方案和本文披露的概念的任选的特征、变型和变化形式，并且认为这类变型和变化形式属于如待批权利要求定义的本发明范围。本文提供的具体实施方案为本发明有用实施方案的实例，并且显而易见可以使用本说明书中所述的装置，装置元件，方法步骤的大量变化形式实施本发明。方法和用于本方法的装置可以包括大量任选的装置元件和成分，包括任选的滤光器，诸如带通滤波器；高通量截止过滤器和低通量截止过滤器；校准元件，诸如准直透镜和反射镜；聚焦元件，诸如透镜和反射镜；反射器；衍射光栅；流动系统；流体混合系统，诸如搅拌器和振荡器；光导纤维耦合器和传递器；温度控制器；温度传感器；宽谱带光源；窄带光源；流体控制元件，诸如蠕动泵、阀、过滤器、离心系统、冲洗系统；和这些元件的组合。
将本申请中引述的所有参考文献完整地引入本文作为参考，其引入程度并不与本申请披露的内容矛盾。本领域技术人员显而易见并非那些本文具体描述的方法，装置，装置元件，材料，操作步骤和技术可以无需采取过度实验应用于实施作为本文广泛披露的本发明。指定所有公知的本文具体描述的方法，装置，装置元件，材料，操作步骤和技术的等同方案包括在本发明中。
实施例1：使用本发明病原体减少方法的血小板存活力研究
背景：
通过放射性标记的输血后血小板恢复率和存活率测定的，在血小板储存过程中的几个体外血小板质量参数的改变与体内血小板存活力下降相关。本研究目的在于集中于鉴定体外参数与血小板体内恢复率的相关性。我们随后验证了使用应用核黄素和光的病原体减少方法处理的血小板体内恢复率的体外细胞质量测量值的预测性。
研究设计和方法：
在管理部门评审和批准的情况下进行使用放射性标记的血小板的两种血小板恢复率临床研究。在第一种研究中，使用体内血小板恢复率，应用通过Trima单采血液成分术操作采集的18份血小板产品建立体外细胞质量参数相关性，所述的血小板产品用不同剂量的UV光处理并且储存5天。使用基于乳酸盐产率和pH的体内恢复率预测器，研发使用核黄素和光(Mirasol PRT)(6.2J/mL+50μM核黄素)为病原体减少设计的新方法。然后在随后的人体临床试验中通过使用PRT处理的血小板直接测试来验证用于体内恢复的乳酸盐产生和pH的可预测性。
结果：
UV处理增加了乳酸盐产生，葡萄糖消耗和P-选择蛋白表达，并且导致储存过程中的pH，HSR和旋涡下降。这种行为以UV-剂量依赖性方式表现出来。在细胞质量参数中的所有改变均与血小板体内恢复率相关。其中，通过线性回归分析将乳酸盐产率和pH鉴定为最显著地与血小板体内恢复率相关的参数。乳酸盐产率和pH的相关系数分别为0.9090和0.8831，其中p值分别为0.007和0.031。还观察到了乳酸盐产率和pH与血小板存活率的类似相关性和相同的预测趋势。就使用Mirasol PRT处理的血小板而言，根据这些算法预测的第5天的血小板恢复值为44-55％。随后使用24份血小板产品进行的临床研究证实PRT处理的血小板的体内恢复率为51.4+/-18.6％，即充分属于这一预测范围的值。
结论：
这些结果证实可以根据体外细胞质量参数并且在本文使用的条件下预测血小板的体内恢复率，乳酸盐产率和pH为PRT处理的血小板体内存活力的最相关体外指示剂。
血小板输注疗法在预防或治疗血小板减少患者或具有高危出血的患者的出血发作中仍然保持主流。血小板输注的连续取决于输血产品的细胞存活力和止血活性并且取决于输血接受者的生理情况。尽管接受者的生理情况通过该接受者耐受输注的血小板的能力和将它们通过网状内皮系统的循环中清除的倾向反映出来，但是通常根据放射性标记的血小板的体内恢复率和输血后的存活率测定自身供体中细胞的存活率。尽管较好的血小板恢复率一般与较长的血小板存活时间相关，但是体内恢复率更常用于测定血小板输注效率。就过去的几十年而言，储存过程中的血小板存活率因优化储存条件，诸如温度、储存容器的气体交换和搅拌而已经显著改善。然而，在目前血库储存条件下储存的血小板产品主要因发生血小板储存受损而在其体内存活率方面仍然表现出储存时间依赖性下降。因此，体内细胞存活率的测定就成为研发任何用于血小板产生，处理和储存的新技术和目前用于血小板产品的质量控制的关键步骤。
使用放射性标记的测试血小板的体内细胞存活率评价已经证实是一个挑战性的任务，因为人体体内临床试验是昂贵，耗时的并且供体暴露于放射性。由于体内细胞存活率下降始终与体内细胞质量试验中的显著改变相关这一事实，所以使用体外试验预测体内存活率的可能性得以广泛探究。在早期在低温、第一代容器并且通过冷冻下对血小板的研究中，观察到在血小板储存过程中血小板形态从盘形改变成球体形伴随低血小板恢复率。这一观察结果提供了使用血小板旋涡预测血小板存活力的基础。尽管评分的旋涡为最简单的可利用实验室方法之一，但是它是定性试验并且缺乏从实验室到实验室之间的灵敏性和再现性。对形状改变和对低渗休克的反应的测定是定量的并且表现出极为良好的与体内恢复率的相关性，相关系数(r)分别为0.71和0.57。血小板，诸如乳酸盐产率和pH改变的代谢参数也显示出与血小板恢复率和存活率的显著相关性。测定P-选择蛋白表达，即血小板激活标记与体内恢复率的相关性已经产生了不一致的结果。Holme等报道了与血小板恢复率的极弱的相关性11，而测定其他人发现了显著相关性。P-选择蛋白表达作为可靠预测物的临床应用因如下发现而被置疑：既非遗传上缺乏P-选择蛋白的小鼠血小板，也非完全表达P-选择蛋白的人凝血酶激活的血小板具有不同于正常和静息血小板的体内寿命。还证实血小板编程性细胞死亡归因于发生血小板储存受损，但与体内细胞存活率的直接相关性尚未得到确立。
上述所有研究已经分析了不同体外血小板质量参数与体内血小板存活率的相关性并且已经推定某些参数可以为体内恢复率的可能的指示剂。这些研究中没有一种对其发现进行了直接验证。本研究的目的集中于鉴定了体外细胞质量参数于使用不同剂量UV光处理的血小板的血小板恢复率的最佳相关性。在聚烯烃袋中处理血小板且然后在柠檬酸酯化PVC袋中储存5天。使用鉴定的细胞质量参数及其于体内恢复率的相关性，我们预测了使用称作Mirasol PRT的新病原体减少方法处理的血小板的体内恢复率范围。随后在美国的IDE赞助下进行的临床试验中验证了这一预测。从这项工作中我们鉴定并且进一步验证了乳酸盐产率和pH为血小板恢复率的最佳指示剂。这些观察结果为如下情况的进一步指征：细胞质量的体外测量值可以预测体内结果并且为新血小板处理方法的临床前期评价提供有价值的手段。
材料和方法
Trima-采集的单采血液成分血小板浓缩物制备
研究中的所有血小板产品均为来自单一供体的单采血小板浓缩物，由地方血液中心使用TRIMA自动化血液成分采集系统(Gambro BCT，Lakewood，CO)将它们采集在具有柠檬酸正丁酰基三正己酯-38％重量百分比的1升柠檬酸酯增塑的聚(氯乙烯)袋(“柠檬酸酯化PVC ELPTM袋”)中。在临床研究一中，目标血小板产量为3.51×1011。而在第二种临床研究中，目标产量为4.42×1011血小板。
临床研究一：
本研究在Department of Haematology & Cell Biology，Facultyof Health Sciences，University of the Orange Free State(Bloemfontein，South Africa)中进行，其中通过了Ethics Committeeof the University of the Orange Free State和the South AfricanMedicine Control Council(MCC)的评审和批准。在完成许可同意书时，筛选年龄在18-65岁的研究志愿者并且基于地方标准选择和对血小板捐献的AABB要求在本研究中登记。
UV光处理和血小板储存
将具有250mL体积的血小板浓缩物转入3升聚烯烃袋(Sengewald，Rohrdorf，Germany)，随后添加27mL无菌500μM核黄素，使得产品中的终浓度为约50μM。然后使血小板产品暴露于中剂量水平(磷光体265-370nm)(7.2J/ml)或高剂量水平(12.4J/ml)的UV光。总照射时间在约5-10分钟之间改变，同时在25-30℃温度下振荡。在处理后，将血小板产品转入柠檬酸酯化的聚氯乙烯ELPTM袋(Gambro BCT，Lakewood，CO)。将处理的和对照PCs在标准血库条件中的20-24℃下再储存5天。按照与处理的对应物相同的方式制备对照血小板产品，但不添加核黄素并且不进行UV光处理。
体外细胞质量试验
使用无菌技术在血小板储存从第0，3和5天取血小板样品用于实验室试验并且在2小时内完成分析。按照试验地点的标准化操作规程(SOP)对血小板计数，旋涡评分，pH，pO2，pCO2，乳酸盐和葡萄糖进行体外细胞质量试验。如Ruane等所述测定低渗性休克反应(HSR)和P-选择蛋白表达(Ruane PH，Edrich R，Gampp D等Photochemicalinactivation of selected viruses and bacteria in plateletconcentrates using riboflavin and light.Transfusion2004；44：877-85)。
体内血小板恢复率和存活率测定
在5天储存期结束时，使用111铟，按照研究地点的SOP(与人血小板放射性标记的地方和国际标准一致)对血小板的小等分部分进行放射性标记。在通过111氯化铟(Amersham)与托酚酮混合形成111In-托酚酸盐后进行标记操作。如果所标记的血小板样品的pH＞6.5，那么使其降至6.5以便防止在沉淀过程中血小板的不可逆聚集。
在洗涤并且在血浆中重新悬浮后，将放射性标记的等分部分输入自身供体。在本研究中对受试者给予的总放射性低于8MBq。在输注后15分钟，1小时和2-3小时采集用于放射性计数的血液样品，在输注后第1天两次(AM和PM)并且在输注后2-6天一次。在如Holme等所述对2-小时放射性洗脱进行校准(Holme S，Heaton A，Roodt J.Concurrent label method with 111In and 51Cr allows accurateevaluation of platelet viability of stored plateletconcentrates.Br J Haemato11993；84：717-23)后，通过COST计算机程序，使用多次-命中模型计算体内放射性标记的血小板恢复率和存活率值。
临床研究二：
在Dartmouth-Hitchcock Medical Center of New Hampshire和Norfolk Red Cross Center of Virginia进行集中于验证使用MirasolPRT方法处理的血小板的体内恢复率的第二种临床研究。本研究得到了临床研究地点的Institutional Review Board(IRB)和UnitedStates FDA在Investigational Device Exemption(IDE)下的评审和批准。在完成许可同意书时，基于所有FDA和AABB血小板捐献标准筛选具有合格中选条件的每位参与的志愿者且然后选择在本研究中登记。
Mirasol PRT处理和血小板储存
在血小板单采血液成分术采集后2-8小时，将250mL体积的血小板以重量分析方式从采集ELP袋中转至单独的照射和储存ELP容器。通过带有注射器的无菌屏障滤器将28mL体积的核黄素溶液(500μM)加入到测试产品中。将产品放入由Navigant Biotechnologies，Inc.(Lakewood，CO)生产的Mirasol PRT照射装置并且暴露于6.2J/mL的紫外光剂量。对照组产品不加入核黄素并且不使用UV光照射。在MIRASOL PRT方法后，将产品(对照组和试验组)储存在22±2℃与5天水平振荡的正常血库储存条件下。
放射性标记和体内血小板恢复率和存活率测定
在5天储存期结束时，使用Holme等指定的操作步骤，用111In-喔星放射性标记血小板产品的等分部分。如Holme等所述对每一放射性标记的样品进行2-小时放射性洗脱评价(Holme S，Heaton A，RoodtJ.Concurrent label method with 111In and 51Cr allows accurateevaluation of platelet viability of stored plateletconcentrates.Br J Haematol 1993；84：717-23)。
111In-放射性标记的血小板(对照组或试验组)的等分部分(约2-10mL)重新输入最初的受试者。抽取血液样品(进入EDTA管的5mL)用于在输注后1，3，15和26小时，2，3，4，5-6，7和10天进行放射性测定。在对放射性洗脱进行校准后，通过COST计算机程序，使用多次-命中模型计算体内放射性标记的血小板恢复率和存活率值。
UV光透射试验
统计学
就所有体外细胞质量参数而言，计算平均值和标准偏差。如果合适，对重复测量值使用协方差分析(ANCOVA)进行统计学比较。使用SASv8.1中的‘proc mixed’进行这种分析。在模型中最初包括顺序效应，但是如果无显著性，则不用。
结果
临床试验一：UV处理加速细胞糖酵解代谢
在伦理委员会批准和MCC，即南非权威当局通告后，使用标准Trima单采血液成分术操作采集总计18份血小板产品，产量为2.9-3.8×1011个血小板。在采集的当天，在有50μM核黄素存在下，用中UV剂量(7.2J/ml；N＝5)或高UV剂量(12.4J/ml；N＝6)的UV光处理在聚烯烃容器，即Sengewald袋中的产品。附加7份未用UV光处理的产品用作对照组。在单采血液成分术采集后将所有处理的和对照组PC产品转入并且储存在正常血库条件下的ELPTM袋中5天。在第0天(处理前)，第3天和第5天储存时，测定来自所有PC产品的样品的pH，pO2，pCO2，乳酸盐和葡萄糖浓度，P-选择蛋白，HSR和血小板旋涡。表1中概括了这些细胞代谢和质量测量值的结果。在与对照组血小板相比时，处理的血小板表现出在储存过程中乳酸盐产生和葡萄糖消耗增加，伴随样品pH下降，这表明UV光处理增加了细胞糖酵解代谢。UV处理还加速了P-选择蛋白表达增加并且降低了血小板储存过程中的HSR和旋涡评分。显然血小板储存过程中的这些改变的严重性与施用的UV剂量水平成正比。
体外血小板质量与体内细胞恢复率和存活率的相关性
在5天储存结束时，使用铟放射性标记所有处理的和对照组血小板样品，随后将标记的血小板输入相同的供体。测定体内输注的血小板的放射性达7天并且使用多次-命中模型分析计算输注的血小板的体内恢复率。体内恢复率的平均值就用零剂量，中剂量和高剂量UV光处理的血小板而言分别为60％(SD＝16)，30％(SD＝8)和14％(SD＝7)。图8A-H表示体外细胞质量参数与体内血小板恢复率的相关性。体内血小板恢复率为如下参数的函数：乳酸盐产生值(a)；在22℃下第5天时的pH(b)；葡萄糖消耗(c)；第5天时P-选择蛋白的表达百分比(d)；第5天时的旋涡评分(e)；第5天时的HSR百分比(f)；第5天时的pO2(g)；和第5天时的pCO2(h)。在所述的示意图中，空心圆圈为对照组血小板，实心菱形相当于中剂量UV光处理的血小板，且实心方块相当于高剂量UV光处理的血小板。在图8A-H中，将储存过程中或在第5天时的测定的每一代谢和细胞质量参数对每一血小板产品各自的血小板恢复率绘图。观察到这些参数与体内恢复率的相关性。在示意图中绘制的参数中，乳酸盐产率，pH，葡萄糖消耗和P-选择蛋白表现出与测定的体内恢复率具有良好的相关性。这些相关性的程度通过线性回归分析量化并且概括在表2中。相关系数r-值和F-值确定了与体内血小板恢复率最显著相关的乳酸产率和pH，其中p值分别为0.007和0.031。剩余的参数，按照其与体内恢复率的相关性程度顺序依次为葡萄糖消耗率、P-选择蛋白表达、HSR、旋涡、pCO2和pO2。
使用相同的线性回归分析手段观察到各细胞质量参数与血小板存活时间的相关性的极为类似的模式。此外，确定了乳酸盐产率和pH具有与血小板存活率最显著的相关性。然而，这些测定的F-值显示了显著高于那些对恢复率值观察到的变异水平。由于这一原因，所以认为用于血小板存活率的算法作为血小板存活指示剂的可靠性较低。
乳酸盐和pH作为体内恢复的指示剂的验证：临床试验二
获自在南非进行的第一种临床研究的信息用于设计Mirasol PRT处理操作的血小板处理条件。在这些条件下，Mirasol PRT处理使病原体减少的能力最大化，而不会损害血小板储存过程中如通过一系列体外细胞质量试验所评价的血小板的治疗价值。不同于第一种临床研究中所述的血小板处理方案，用Mirasol PRT处理在本研究中新鲜的血小板，通过使它们在柠檬酸酯化的聚氯乙烯ELPTM袋中有50μM核黄素存在下暴露于6.2J/mL UV光来进行。然后在处理后5天将产品储存在相同的袋中，取消了对袋转移步骤的需求。正如图4中所例示的，根据短波长区(285-305nm)中的光透射显著减少和在相对长波长(365-400nm)处的透射增加，ELP袋的应用具有超过用于第一种临床研究的Sengewald袋的优点。具有长波长的区相当于核黄素具有最大吸收的区域。用于针对体外血小板细胞质量和对病毒和细菌失活的本研究中的Mirasol PRT处理条件的作用已经得到广泛评价，正如Li等报道的(Li J，Xia Y，Bertino AM等The mechanism of apoptosisin human platelet during storage.Transfusion 2000；40：1320-9.)和Ruane等。
使用针对获自第一种临床研究的乳酸盐产率和pH(表2)的线性回归方程，预测用Mirasol PRT方法的标准操作条件处理的血小板的恢复率，为44-55％(表3)。用于产生这一预测的乳酸盐产率和pH的值来源于在先的在ELP容器中以6.2J/mL处理产品和随后储存5天后血小板性能的体外研究。在Mirasol PRT方法的第二种试验中验证使用乳酸盐产率和pH参数预测体内恢复率的可靠性。使用在Trima平台上采集的总计24份血小板产品。在用6.2J/mL UV处理和ELP袋中5天储存后，处理的血小板表现出51.4％的平均恢复率与18.6％标准偏差。对处理的产品观察到的体内恢复率值在24.3％-95.8％。这一结果表明乳酸盐产率和pH参数为预测体内血小板恢复率提供了简便而可靠的方式。
讨论
已经进行了许多尝试来根据体外细胞质量参数测量值预测血小板体内存活率。仅少量地报道了在使用这些预测中的连续，可能是因这些参数与体内恢复率测量值的相关性相对较低的限制所致。这一挑战阻止了正常志愿者中相当大的体内恢复率测量值的变异，主要是因接受者的生理情况所致，并且还阻止了对血小板产品进行的体外试验的生物学变异性。24相关性程度还取决于每一变量的范围和分布。获得的细胞质量参数的范围越宽且值的分布越均匀，则可以观察到的相关性越好。为了加宽可以在本研究中观察到的细胞质量值的范围，在第一种临床研究中用三种不同剂量的UV光处理血小板并且储存5天。结果证实所有测定的体外细胞质量参数均以剂量依赖性方式对UV光处理产生反应。UV处理增加了乳酸盐产生，葡萄糖消耗和P-选择蛋白表达，并且在导致储存过程中pH，HSR和旋涡下降或减少。所有这些细胞质量参数的改变均与血小板体内恢复至不同程度相关。其中，通过线性回归分析将乳酸盐产率和pH鉴定为最显著地与血小板体内恢复率相关的参数。乳酸盐产率和pH的相关系数分别为0.909和0.883，其中p值分别为0.007和0.031。还观察到了体外细胞质量与血小板存活相关性的类似模式。这些预测算法的值通过随后的临床研究得以连续地验证，所述的临床研究表明观察到的血小板体内恢复率充分在预测值的范围内。这些结果表明可以根据体外细胞质量参数预测血小板体内恢复率，因为已经在先提示了并且在本文使用的条件下，乳酸盐产率和pH为用于PRT处理的血小板体内存活力的最相关的体外指示剂。
本文报道的我们的观察结果与在先的工作一致。乳酸盐为血小板糖酵解途经中的最终代谢产物并且被转化成乳酸且在储存过程中释放入储存培养基。乳酸盐累积直接反映出血小板糖酵解流量的状态，而UV处理以剂量依赖性方式刺激了乳酸盐产率，表明高能UV光加速了血小板糖酵解流量。乳酸的累积归因于储存过程中血浆pH下降。因为新鲜的血浆具有缓冲容量，所以不能期望pH与体内恢复率的相关性程度和乳酸产率与体内恢复率的相关性程度相同。我们的线性回归分析证实了这一结果。有意义的是，作为乳酸盐产生上游前体的葡萄糖消耗表现出与体内恢复率相关性的相关系数相对低于乳酸盐产率，无统计学显著性(p＞0.05)。对这一观察结果的一种可能的解释在于葡萄糖消耗并不完全与仅产生糖酵解终产物乳酸盐的糖酵解途经相关。实际上，还可以将糖酵解和TCA循环中葡萄糖衍生的中间体中的许多转化成脂肪酸，脂质，氨基酸和蛋白质。可选择的解释在于在储存开始时存在于产品中残留水平的葡萄糖可以改变储存过程中葡萄糖消耗率。因为糖酵解速率直接与葡萄糖浓度相关，所以可能的情况是，这一机制可以处于在反应机制中引入附加变化的运转中。
存在几个选择柠檬酸酯增塑的ELP袋，而不是选择聚烯烃Sengewald袋作为Mirasol PRT血小板处理的照射袋的原因。通过这两种袋对UV透射光谱的研究表明ELP袋材料产生了短波长UV光透射的减少(参见图4)。短波长UV光的减少作用是极为关键的，以便避免对处理的血小板细胞器，诸如线粒体的损害，线粒体维持血小板存活力和功能的部分生物能ATP供给。实际上，独立的研究证实，尽管糖酵解流量得到加速(递交的手稿)，但是线粒体功能和结构的完整性在ELP袋中用6.2J/mL处理血小板并且储存达7天后得以充分保护。有意义的是，因在先的工作产生的结果也证实在ELP袋中处理的产品在储存过程中表现出氧耗量增加，正如根据在储存过程中与对照组相比在处理的产品中5天时的较低pO2值证实的。相反，从在聚烯烃Sengewald袋中进行的研究中获得的结果未表现出这一作用(图8g)。实际上，在聚烯烃Sengewald容器中的固定能量递送并不与在ELP袋中观察到的结果等同(数据未显示)。这些结果提示在聚烯烃Sengewald袋中处理的产品中的氧化机制因线粒体损害这一结果而被破坏。显然，对在聚烯烃容器(Sengewald袋)中处理的产品观察到的暴露于水平就UV光剂量暴露于而言代表了最坏的情况。此外，ELP袋中照射还具有附加的有益性，即避免了随后转移至ELP袋中储存，从而简化了PRT处理血小板的方法。
这些作用还提示了UV光的双峰作用。在短波长区中的光透射越低和在较长的波长区中的透射越高，则在ELP袋中的高能波长实际上协同增加糖酵解和线粒体活性的可能性越低，导致在储存观察中pH和产品稳定性方面的作用平衡。由于在高能波长(短波长)下使用了较高的光剂量，所以可以出现糖酵母解的增加和氧化机制的下降，导致储存过程中pH值较低且细胞质量较差。正如本研究证实的，相当于递送至ELP袋中的产品的6.2J/mL UV剂量的Mirasol PRT处理产生的体内恢复率在51+/-18％，该值属于目前用于标准临床实践的产品的正常范围。
另外重要的是注意到，根据对一种血小板处理和储存系统进行体外血小板质量的线性回归分析的体内存活力预测不一定可以推断其它血小板加工或处理系统。因为基于血小板储存损害发生的机制尚未得到完全理解并且血小板对各种处理因素的反应可能不同，所以获自一种系统的预测不可以应用到其它系统。例如，在该报告中显示为体内恢复率最佳指示剂的乳酸盐产率和pH并不可以用于测定冷冻或冷藏血小板的恢复率和存活率。尽管如此，但是有意义的是注意到，来自血小板乳酸盐产率和pH的信息也用作在室温和正常条件下储存5天的产品的未处理的血小板恢复率的良好指示剂(参见表3)。
这些观察结果进一步证实了体外血小板质量参数测量值在评估产品体内性能中的应用。体外测量值因在许多环境中缺乏明显的相关性而存在疑问。然而，此处提供的工作表明这些测量值可以提供体内血小板性能的有加至的指示剂并且可以作用指导新技术和新处理方法的研发工作的工具。一旦这些相关性得以建立，它们就还能够用作更直接地，但却是复杂的和困难的体内评价的替代者。就每种新的处理方式而言，有必要通过获得这些参数与如本文所述的体内性能的直接相关性来建立体内性能的更有效和可预测的测量值。在本文提供的工作中，发现UV处理的样品在所用条件下的体内恢复率的最有效指示剂为样品pH和乳酸盐产率。这些测量值的应用根据其直到进一步的研发工作得以表现，所述的研发工作已经确定了用于新病原体减少技术Mirasol PRT的处理条件。
表1.UV光处理并且储存5天的血小板的体外细胞质量参数
Figure 2006800326758A00800011
表2：体外细胞质量和体内血小板恢复率的相关性
Figure 2006800326758A00800012
*NS意指在p值≥0.05时无显著性
表3.根据乳酸盐产率和pH参数预测的恢复率和对对照组和使用Mirasol PRT处理的试验血小板测定的恢复率
Figure 2006800326758A00800021
*AuBuchon等人公布了数据(AuBuchon JP，Herschel L，Roger Jet al Efficacy of apheresis platelet treated with riboflavinand ultraviolet light for pathogen reduction.Transfusion2004；44：16A)
实施例2：在暴露于紫外光后柠檬酸酯增塑的聚(氯乙烯)容器通 透性
1.介绍
在暴露于电磁辐射前和之后表征柠檬酸酯增塑的聚(氯乙烯)容器在O2和CO2方面的通透性，以便验证它们在本发明方法中的有用性。本发明的一个目的在于提供在O2和CO2方面表现出通透性的容器，这种通透性在暴露于具有用于处理血液和血液成分的波长，辐射能和辐射功率的电磁辐射时不会显著下降。此外，本发明的一个目的在于提供用于储存血液和血液成分和使用电磁辐射处理血液和血液成分的多功能容器，以避免不必要的和资源集中的附加样品转移步骤。
就血小板存活力而言，必须将血小板储存在允许为血小板有氧代谢中的成分的O2和CO2透射的材料中。在本发明的一个实施方案中，提供暴露于紫外电磁辐射减少包含血小板的样品中的病原体。因此，有益的是在这些方法中使用样品容器，它允许O2和CO2透射，但不会在暴露于紫外电磁辐射后在气体通透性特征方面表现出显著下降。在本研究中，对柠檬酸酯增塑的聚(氯乙烯)ELP血小板储存袋(38％重量百分比的柠檬酸正丁酰基三正己酯)测定O2和CO2透射速率，所述的储存袋系统性地暴露于了用于处理含血小板的样品的选择的净辐射能。因为袋材料为气体通透性测试而必须为干燥的并且不含血液制品，所以将含有核黄素的盐水用于模拟照射过程中的实际应用条件。
2.实验
在本研究中，给1升柠檬酸酯增塑的聚(氯乙烯)ELP血小板储存袋灌注250mL盐水(以便模拟血小板产品体积)和28mL核黄素。将袋放入照明器并且暴露于UV电磁辐射。在递送目标能量等于0(对照组样品)或5J/cm2(测试样品)后取出袋。随后除去流体，将袋切开并且将内侧吸干。在两个能量点对测试制品进行三次重复试验。将测试制品中的6个用于O2透射测试并且将剩余的6个测试制品用于CO2透射测试。按照对90％RH和CO2修改的ASTM D3985，使用建立的方案进行透射测试。表4和5分别提供了用于本研究的测试制品的矩阵和照射条件概述。
表4：测试制品矩阵
Figure 2006800326758A00800031
表5：照射条件概述
Figure 2006800326758A00800041
采取下列操作步骤以便评价暴露于紫外电磁辐射的柠檬酸酯增塑的聚(氯乙烯)ELP血小板储存袋的CO2和O2透射率。
1.获得12个EtO灭菌的1L ELP照射袋。
2.在数据采集单上记录部分号和批号。
3.具有O2或CO2和目标能量的标记袋(即O2 5J/cm2)。
4.给袋灌注250ml无菌盐水和28ml 500μM核黄素溶液。在数据采集单上记录盐水和核黄素批号。
5.就对照组而言(0J/cm2)，给袋灌注盐水和核黄素溶液，然后排空并且进行步骤15。
6.在照明器作图函数验证(P/N 777074-563)中，在每次OAI UVPowermeter光描图中将各测试制品照射至5.0J/cm2。该过程进行约8
Figure 2006800326758_4
分钟。
7.通过讯问屏幕设定照明器。验证将照明器配置成在使用320nm光的EXPOSURE模式下运行，温度设定点(SET TEMP)为30℃，且将ENDPOINT设定在5.0J/cm2。验证将振荡速率设定在120cpm。在数据采集单上记录将照明器配置成暴露于模式。
8.确保灯作图函数验证(P/N 777074-563)在处理任何产品前完成。
9.在照明器工作台上固定充满流体的袋。
10.使用IR温度计测定最初的测试制品温度(℃)并且记录。
11.在每次照射过程开始时，在操作前30描面内验证，所有三种“均为良好”的指示灯启动。在验证时，数据采集单上有是/否的循环。如果灯光不开启，那么终止该过程，直到问题得以修补。
12.照射没有测试制品以便递送5.0J/cm2的总能量剂量。
13.在每次照射操作结束时用IR温度计记录温度。
14.照射后，从照明器中取出袋。
15.排空照射袋中的流体。
16.切开带的底部并且用Kimwipe吸干带的内侧。
17.将每组带放入用适当测试条件标记的适当灭菌的包。
18.测试制品的O2和CO2透射。
3.数据和数据分析
表6列出了O2透射率，包括计算的平均值和标准偏差的结果和概括统计表。另外，对每组测试和对照样品进行平均值的t-检验(α＝0.05)。图9表示对每一样品测定的O2透射率(每组三带样品，每一样品一式两份)。图10表示每组(试验组和对照组)的平均值，其中误差条表示±1标准偏差。如图10中所示，测定的试验和对照实验的O2透射率的平均值在相应的标准偏差范围内。此外，在每次t-检验评价中，测定的O2透射率的平均值在试验与对照组样品之间无显著性差异。
表6：测定的O2透射率
O2透射率
平均值的t-检验  无显著性差异    无显著性差异
α＝.05
表7中列出了CO2透射率，包括计算的平均值和标准偏差的结果和概括统计表。另外，对每组测试和对照样品进行平均值的t-检验(α＝0.05)。图11表示对每一样品测定的CO2透射率(每组三带样品，每一样品一式两份)。图12表示每组(试验组和对照组)的CO2透射率的平均值，其中误差条表示±1标准偏差。如表7，图11和图12中所示，在暴露于紫外辐射时观察到CO2透射率的具有统计学显著性的改变。尽管这种增加在统计学上具有显著性，但是CO2透射率在暴露于紫外辐射时适度增加(约8％)，但与下降相反。此外，观察到的增加等级不足以影响血小板的质量或存活力，且由此无法预计具有临床意义。
表7：测定的CO2透射率
CO2透射率
Figure 2006800326758A00800061
平均值的t-检验  无显著性差异    无显著性差异
α＝.05
有关作为参考和变化形式引入的声明
将本申请上下文中的所有参考文献完整地引入本文作为参考，就如同将它们各自作为参考一样，对每篇文献的引入程度至少部分不与本申请中的披露内容相矛盾(例如，将部分不一致的参考文献引入作为参考，但除外该参考文献中的部分不一致的部分)，其中所述的参考文献例如为专利对比文件，包括颁布或授权的专利或其等效文件；专利申请公开文献；未公布的专利申请；和非专利文献对比文件或其它来源的材料。
将迄今为止的任何附录或附件作为说明书和/或附图的组成部分引入作为参考。
如果本文使用术语“包含”，那么将它们解释为指定存在涉及的所述特征，整体，步骤或要素，但不排除存在或添加一种或多种其它特征，整体，步骤，要素或其部分。还指定包括本发明的各实施方案，其中术语“包含”任选被语法上类似的术语替代，例如“由...组成/组成”或“主要由...组成/基本上由...组成”，以便由此描述并不一定共同扩展的其它实施方案。
已经参照不同的具体和优选实施方案和技术描述了本发明。然而，应理解可以进行许多变化和变型，同时仍然保留在本发明的实质和范围内。本领域技术人员显而易见，非本文具体描述的组合物，方法，装置，装置元件，材料，操作步骤和技术可以适合于在不采用过度实验的情况下实施本文广泛披露的本发明。指定本文所述的组合物，方法，装置，装置元件，材料，操作步骤和技术的所有公知功能性等效方案均包括在本发明中。无论披露何种范围，均指定包括所有的子范围和单个数值，就如同将它们单独列出一样。本发明并不限于披露的实施方案，包括附图中任何所示的或以说明书中为典型，它们作为实施例或解释给出，但不起限定作用。本发明的范围仅应由权利要求限定。

Claims (4)

1.减少包含血液成分的流体中的病原体的方法，所述方法包括下列步骤：
提供用于辐射所述包含血液成分的流体的容器；其中所述容器包含聚(氯乙烯)和至少一种柠檬酸酯增塑剂，其中所述容器透射具有在285纳米至365纳米的范围内选择的波长分布的电磁辐射并且其中该容器对具有所述选择的波长分布的电磁辐射的透射在所述暴露于电磁辐射过程中恒定至10％之内；
测定在所述波长分布内作为波长函数的所述容器的透射百分比；
使用电磁辐射源产生电磁辐射；
监测由所述电磁辐射源产生的所述电磁辐射的功率；
使用所述测定的所述容器的透射百分比计算递送至所述包含血液成分的流体的辐射功率；
确定提供期望程度的病原体减少所需的所述包含血液成分的流体的暴露时间；和
使所述容器暴露于电磁辐射所述暴露时间，其中具有所述选择的波长分布的电磁辐射由所述容器透射且至少部分被所述包含血液成分的流体吸收，由此减少包含血液成分的流体中的所述病原体。
2.权利要求1的方法，其中所述柠檬酸酯增塑剂选自：
柠檬酸三乙酯；
柠檬酸乙酰基三乙酯；
柠檬酸正丁酰基三正己酯；和
柠檬酸乙酰基三正丁酯。
3.权利要求1的方法，其中所述柠檬酸酯增塑剂的浓度在25％-50％重量范围内选择。
4.权利要求1所述的方法，其中所述柠檬酸酯增塑剂的浓度为38％重量。
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