EA002655B1

EA002655B1 - Способ и устройство для инактивации биологических загрязнителей с использованием фотосенсибилизаторов

Info

Publication number: EA002655B1
Application number: EA200000344A
Authority: EA
Inventors: Рэймонд Пол мл. Гудрич; Фрэнк Корбин III; Эдвард К. мл. Вуд; Деннис Хлавинка
Original assignee: Гэмбро, Инк.
Priority date: 1998-07-21
Filing date: 1999-07-21
Publication date: 2002-08-29
Also published as: CN101239075A; CN101239075B; HUP0004907A3; IL135100A0; NZ521054A; KR20060086455A; TR200001216T1; KR100753321B1; AU5219899A; EP1972351B1; EP1972351A3; OA11633A; AP2000001770A0; EA200000344A1; CN100369633C; JP2006273868A; EP1972351A2; NZ503474A; EP2174669B1; PL340630A1

Abstract

Представлены способы и устройства для инактивации микроорганизмов в жидкостях и на поверхностях. Предпочтительно жидкости содержат кровь или продукты крови и включают биологически активные белки. Предпочтительные способы включают стадии добавления эффективного не токсичного количества эндогенного фотосенсибилизатора к жидкости и воздействия на жидкость световым излучением, достаточным для активации эндогенного фотосенсибилизатора, посредством чего указанные микроорганизмы инактивируются. Другие жидкости, включая соки, воду и т.п., а также поверхности пищевых продуктов, туши животных, раны, поверхности для приготовления пищи и поверхности сосудов для купания и мытья также можно деконтаминировать этими способами. Предпочтительными фотосенсибилизаторами являются аллоксазины и витамины К и L. Представлены также системы и устройства проточной и серийной обработки для дезактивации таких жидкостей с использованием фотосенсибилизаторов.

Description

Контаминация продуктов крови инфекционными микроорганизмами, такими как ВИЧ, вирусы гепатитов и другие вирусы и бактерии, представляет серьезную опасность для здоровья тех, кому необходимы переливания цельной крови или введение различных компонентов крови, таких как тромбоциты, эритроциты, плазма крови, фактор VIII, плазминоген, фибронектин, антитромбин III, криопреципитат, белковая фракция крови человека, альбумин, иммунный сывороточный глобулин, протромбиновый комплекс, плазменные гормоны роста и другие компоненты, выделенные из крови. Процедуры скрининга крови могут пропустить загрязнители, а процедуры стерилизации, которые не повреждают клеточные компоненты крови, но эффективно инактивируют все инфекционные вирусы и другие микроорганизмы, до настоящего времени не разработаны.

Способы деконтаминации компонентов крови, использующие растворитель-детергент, действуют путем растворения фосфолипидных мембран, окружающих вирусы, такие как ВИЧ, и не повреждают белковые компоненты крови, однако, если имеются клетки крови, такие способы нельзя применять, поскольку при этом повреждаются клеточные мембраны.

Для стерилизации компонентов крови было предложено применение фотосенсибилизаторов, веществ, которые поглощают свет определенной длины волны и переносят поглощенную энергию на акцептор энергии. Например, Европейская патентная заявка 196515, опубликованная 8 октября 1986 г., предлагает применение неэндогенных фотосенсибилизаторов, таких как порфирины, псоралены, акридин, толуидины, флавин (акрифлавина гидрохлорид), производные фенотиазина и краски, такие как нейтральный красный и метиленовый синий, в качестве добавок к крови. Протопорфирин, который имеется в организме в естественных условиях, может метаболизироваться с образованием фотосенсибилизаторов, однако, его пригодность ограничена тем, что он снижает желательную биологическую активность белков. Хлорпромазин также приводится в качестве примера такого фотосенсибилизатора, однако, его пригодность ограничивается тем, что его необходимо удалять из любой жидкости, вводимой пациенту, после процедуры деконтаминации, поскольку он обладает седативным действием.

Сообпсй К.Р., е! а1., (1997), ТНе Ое81дп апб Эеуе1ортеп1 оГ 8е1ес1|уе. Рйо!оак1гуа!еб

Итидк Гог 81ег1ИхаИоп оГ В1ооб Ргобис!к, Итидк оГ Не Еи1ите, 22:159-171, представили обзор некоторых фотосенсибилизаторов, включая псоралены, и некоторых важных вопросов, касающихся выбора фотосенсибилизатора для деконтаминации продуктов крови. Применение тексафиринов для фоторасщепления ДНК описывается в патентах США №№ 5607924, выданном 4 марта 1997 г., и 5714328, выданном 3 февраля 1998 г. Мадба е! а1. Применение сапфиринов для дезактивации вирусов описано в патенте США № 5041078, выданном 20 августа 1991 г. Ма!111е\\ъ е! а1. Инактивация внеклеточных, покрытых оболочкой вирусов в крови и компонентах крови с помощью фентиазин-5-иевой краски плюс свет описана в патенте США № 5545516, выданном 13 августа 1996 г. ^адпет. Применение порфиринов, гематопорфиринов и мероцианиновых красок в качестве фотосенсибилизирующих агентов для уничтожения инфекционных загрязнителей, таких как вирусы и простейшие, в тканях организма, таких как жидкости организма, описано в патенте США № 4915683, выданном 10 апреля 1990 г., и в родственном патенте США № 5304113, выданном 19 апреля 1994 г. 81еЬет е! а1. Механизм действия таких фотосенсибилизаторов, как описано, включает предпочтительно связывание с доменами липидных двойных слоев, например в вирусе, покрытом оболочкой, и в некоторых инфицированных вирусом клетках. Фотовозбуждение связанных с мембраной молекул агента приводит к образованию реактивных форм кислорода, таких как атомарный кислород, который вызывает перокисление липидов. Проблемой, связанной с применением таких фотосенсибилизаторов, является то, что они атакуют клеточные мембраны желательных компонентов жидкостей, подвергаемых деконтаминации, таких как эритроциты, а атомарный кислород атакует также желательные белковые компоненты жидкостей, подвергаемых обработке. Патент США № 4727027, выданный 23 февраля 1988 г. \У|е8е11а1щ С.Р., е! а1., раскрывает применение фурокумаринов, включая псорален и его производные, для деконтаминации крови и продуктов крови, но указывает также на те шаги, которые должны быть предприняты для снижения доступности растворенного кислорода и других реактивных форм, с целью ингибирования денатурации биологически активных белков. Фотоинактивация вирусных и бактериальных загрязнителей крови с помощью галогенированных кумаринов описана в патенте США № 5516629, выданном 14 мая 1996 г. Рагк е! а1., и в патенте США № 5587490, выданном 24 декабря 1996 г. СообпсН 1т., К.Р., е! а1., а патент США № 5418130, выданный Р1а1х е! а1., раскрывает применение замещенных псораленов для инактивации вирусных и бактериальных загрязнителей крови. Последний патент также указывает на необходимость предотвращения повреждений других компонентов крови, вызванных свобод3 ными радикалами. Патент США № 5654443, выданный 5 августа 1997 г. \νο11ο\νίΙζ е! а1., описывает новые композиции псоралена, которые применяются для фотодеконтаминации крови. Патент США № 5709991, выданный 20 января 1998 г. Ь1и е! а1., описывает применение псоралена для фотодеконтаминации препаратов тромбоцитов и последующее удаление псоралена. Патент США № 5120649, выданный 9 июня 1992 г., и родственный патент США № 5232844, выданный 3 августа 1993 г. ΗοΐΌ\νίΙζ е! а1., также раскрывают необходимость применения гасителей в комбинации с фотосенсибилизаторами, которые атакуют липидные мембраны, а патент США № 5360734, выданный 1 ноября 1994 г. Сйартаи е! а1., также обращается к этой проблеме предотвращения повреждения других компонентов крови.

Известны также фотосенсибилизаторы, которые атакуют нуклеиновые кислоты. Патент США № 5342752, выданный 30 августа 1994 г. ΡΡιΙζ е! а1., раскрывает применение соединений на основе акридиновых красок для снижения паразитарной контаминации в препаратах крови, включающих эритроциты, тромбоциты и белковые фракции плазмы крови. Эти материалы, несмотря на действительно низкую токсичность, все же обладают некоторой токсичностью, например, по отношению к эритроцитам. В этом патенте не описывается устройство для деконтаминации крови по принципу сквозного потока. Патент США № 5798238, выданный Οοοάποίι 1т., е! а1., раскрывает применение хинолона и хинолоновых соединений для инактивации вирусных и бактериальных загрязнителей.

Связывание ДНК с фотоактивными агентами использовалось в способах сокращения популяций лимфоцитов в крови, как описано в патенте США № 4612007, выданном 16 сентября 1986 г., и родственном патенте США № 4683889, выданном 4 августа 1987 г. Εάο18οη.

Рибофлавин (7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазин), как сообщалось, атакует нуклеиновые кислоты. Фотоальтерация нуклеиновой кислоты в присутствии рибофлавина обсуждается в Ткидйа, А., е! а1. (1965), ΡΙιοΙοδοηδίΙίζοά тасОνηΐίοη οΓ Γί6οηι.ιο1οίο ас1бк ίη !йе ртекепее οΓ τί6οΠηνίη. Вюсйншса е! Вюрйукюа Ас1а, 103:360363; и 8реск, А.Т., е! а1. (1976), Рибйег ОЬкегνηΐίοηδ οη !йе ΡΙιοΙοοχίάηΙίοη οΓ ΌΝΑ ίη !йе Ргекепсе οΓ Β^οΓ^νίη, Вюсйншса е! Вюрйукюа Ас!а, 435:39-44. Связывание люмифлавина (7,8,10-триметилизоаллоксазина) с ДНК обсуждается в Китайтс К., е! а1. (1977), 8!иб1ек οη !йе Ιη^πκΙίοηκ Ье1\\'еео ΌΝΑ амб Р1аутк, ΒίοсЫтюа е! Вюрйукюа Ас!а, 476:207-217. ΗοίΙ^η, Μ.Ε., е! а1. (1979), ΌΝΑ 81гаиб Вгеакк ίη Маттайам Се11к Εxрο8еб !ο Ь1дй! ίη !йе Ргекемсе οΓ ΚίΟοΓΡινίη амб Т^Юркам, Ρйο!οсйет^8!гу амб ΡΕο!οΜο1ο^, 29:299-303, описывает применение рибофлавина и триптофана для ин дуцирования разрывов в ДНК в клетках млекопитающих после воздействия видимым флуоресцентным светом или практически ультрафиолетовым светом. В статье заявляют, что эти эффекты не наблюдаются, если рибофлавин или триптофан исключаются из среды. Цепь ДНК разрывается при воздействии профлавина и света, как сообщается в Р1е!!е, 1., е! а1. (1979), Ρτο6ис!юп οΓ Вгеакк ίη 8тДе- амб ^οиЬ1е-8!^аηбеб Ροπηκ οΓ Вас!етюрйаде ФХ174 ΌΝΑ Ьу РгаПауше амб Ь1дй! ТщаЦиет, Ρйο!οсйет^8ί^у амб ΡΕο!οΜο1ο^, 30:369-378, а повреждение гуаниновых остатков во время профлавинопосредованной фотосенсибилизации ДНК обсуждается в Р1е!!е, 1., е! а1. (1981), Л1!е^аί^οη οΓ Сиашпе Рембиек биппд РгоПамте Меб1а!еб Ρйο!ο8еη8^!^ζаί^οη οΓ ΌΝΑ, Ρйο!οсйет^8ί^у амб ΡΕο!οΜο1ο^, 33:325-333.

ЕСабе!, е! а1. (1983), Месйашктк амб Ргобис!к οΓ Ρйο!ο8еη8^!^ζеб Ое^^а!^ οΓ Шскю Лабк амб Ке1а!еб Μοбе1 Сοтрοиηб8, 1кгае1 ЕСйет., 23:420-429, обсуждает механизм действия посредством образования атомарного кислорода красок розовый бенгальский, метиленовый синий, тионин и других красок, по сравнению с механизмами, не включающими образование атомарного кислорода, посредством которых атакуется нуклеиновая кислота флавиновыми или птероновыми производными. В этом описании рибофлавин приводится в качестве примера соединения, обладающего способностью разрушать нуклеиновые кислоты. КюгускаОай1, М., е! а1. (1980), Ρйο!οбед^абаί^οη οΓ ΌΝΑ \\йй Ρ1иο^е8сеη! Ь1§й! ίη !йе Ргекемсе οΓ ΚίΟοίΕινίη, амб Р^тцтоЮ^^!! Ьу ΡΕινίη Тпр1е!-81а!е Рие^ке^, Вюсйншса е! Вюрйукюа Α^, 610: 229-234 также описывает тот факт, что формы активного кислорода не участвуют непосредственным образом в разрезании ДНК рибофлавином. Реак, 1.С., е! а1. (1984), ΌΝΑ Вгеакаде Саикеб Ьу 344-пщ ийтаую1е! Ь1дй! ίκ Εηйаηсеб Ьу Ша(ига11у Оссигшд Мю1ею Αο6 Сοтрοηеη!8 амб ^с^йбе Сοеηζуте8, Ρйο!οсйет^8ί^у амб Ρ^!οΜο1ο^, 39:713-716 далее изучает механизм действия рибофлавина и других фотосенсибилизаторов. Однако указанные сенсибилизаторы не предлагаются для деконтаминации жидкостей, применяющихся в медицине.

Устройства для деконтаминации крови описаны в патенте США № 5290221, выданном 1 марта 1994 г. ΑοΓο, 1т., е! а1., и в патенте США № 5536238, выданном 16 июля 1996 г. ΒίκΛοΓ. Патент США № 5290221 раскрывает облучение жидкости в относительно узкой, аркообразной зоне. Патент США № 5536238 раскрывает устройства, в которых используются оптические волокна, проходящие в фильтрационную среду. Оба патента рекомендуют в качестве фотосенсибилизаторов производные бензопорфирина, которые обладают сродством в отношении клеточных стенок.

Все публикации, упомянутые в настоящем документе, включены в него в качестве ссылок в совместимых с ним пределах.

Краткое описание существа изобретения

Представлены способы и устройства для обработки жидкости или другого материала с целью инактивации, по меньшей мере, некоторых микроорганизмов и лейкоцитов, которые могут в них или на них присутствовать. Указанные жидкости могут содержать также один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из белка, например биологически активного белка, такого как терапевтический белок, крови и заменителей крови, без устранения биологической активности указанных компонентов. Эти способы включают:

(a) смешивание эффективного не токсичного количества эндогенного фотосенсибилизатора или производного фотосенсибилизатора на эндогенной основе с жидкостью;

(b) воздействие на жидкость облучением светом, достаточным для активации фотосенсибилизатора; посредством чего инактивируются, по меньшей мере, некоторые микроорганизмы.

Одним механизмом, посредством которого эти фотосенсибилизаторы могут инактивировать микроорганизмы, является вмешательство в нуклеиновые кислоты, препятствующее репликации нуклеиновой кислоты.

Используемый в настоящем документе термин инактивация микроорганизма означает тотальное или частичное предотвращение репликации микроорганизма посредством его уничтожения или какого-либо другого вмешательства в его способность к репродукции.

Микроорганизмы включают вирусы (как внеклеточные, так и внутриклеточные), бактерии, бактериофаги, грибы, передающиеся через кровь паразиты и простейшие. Примеры вирусов включают вирус приобретенного иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусы гепатитов А, В и С, синдбис вирус, цитомегаловирус, вирус везикулярного стоматита, вирусы герпеса простого, например, типа I и II, Т-лимфотропные ретровирусы человека, НТЬУ-Ш, вирус лимфаденопатии ЬАУ/ШАУ, парвовирус, передающийся через трансфузию вирус (ТТ), вирус Эпштейн-Барра и другие известные вирусы. Бактериофаги включают ФХ174, Ф6, λ, К.17, Т4 и Т2. Примеры бактерий включают Р.аетидтока, 8.аигеи8, 8.ер|6епш615. ЕтопоеуЮдепех. Е.еой, К.риеитоша и 8.тагсе5ееп5.

Инактивация лейкоцитов может быть желательной, когда требуется подавление иммунного или аутоиммунного ответа, например, в процессах, включающих трансфузию эритроцитов, тромбоцитов или плазмы, когда могут присутствовать лейкоциты донора.

Материалы, которые можно обрабатывать с помощью способов по настоящему изобретению, включают любые материалы, которые являются адекватно проницаемыми для световых лучей, что обеспечивает достаточно света для достижения инактивации вирусов, или которые могут быть суспендированы или растворены в жидкостях, которые являются адекватно проницаемыми для световых лучей. Примерами указанных материалов являются цельная кровь и водные композиции, содержащие биологически активные белки, полученные из крови, или заменители крови. Эритроцитная масса, тромбоциты и плазма (свежая или свежезамороженная плазма) являются примерами указанных заменителей крови. Помимо этого, терапевтические белковые композиции, содержащие белки, полученные из крови, такие как жидкости, содержащие биологически активный белок, пригодный для лечения заболеваний, например фактор VIII, фактор фон Виллебранда, фактор IX, фактор X, фактор XI, фактор Хагемана, протромбин, антитромбин III, фибронектин, плазминоген, белковая фракция плазмы, сывороточный иммуноглобулин, модифицированный иммуноглобулин, альбумин, плазменный гормон роста, соматомедин, плазминоген-стрептокиназовый комплекс, церулоплазмин, трансферрин, гаптоглобин, антитрипсин и прекал-ликреин, можно подвергать обработке с помощью способов деконтаминации по настоящему изобретению. Другие жидкости, которые можно обрабатывать по настоящему изобретению, представляют собой перитонеальные растворы, используемые для перитонеального диализа, которые иногда загрязняются во время соединения, что приводит к перитонеальным инфекциям.

Термин биологически активный означает способный вызывать изменение в живом организме или его компоненте. Термин биологически активный по отношению к биологически активному белку, как он используется здесь, не относится к белкам, которые являются составной частью инактивируемых микроорганизмов. Подобно этому, не токсичный по отношению к фотосенсибилизаторам означает низкую токсичность или отсутствие токсичности для человека и других млекопитающих, и не означает нетоксичность для инактивируемых микроорганизмов. Значительное нарушение биологической активности означает, по меньшей мере, настолько же большое нарушение, как то, которое вызывают порфирин и производные, метаболиты и предшественники порфирина, которые, как известно, оказывают повреждающее действие на биологически активные белки и клетки человека и млекопитающих. Подобно этому, практически не токсичный означает менее токсичный, чем порфирин и производные, метаболиты и предшественники порфирина, известные для применения при стерилизации крови.

Термин продукт крови, используемый в настоящем документе, включает заменители крови и терапевтические белковые композиции, содержащие белки, полученные из крови, как определено выше. Жидкости, содержащие биологически активные белки помимо тех, которые получают из крови, также можно обрабатывать с помощью способов по настоящему изобретению.

Способы деконтаминации по настоящему изобретению с использованием эндогенных фотосенсибилизаторов и производных фотосенсибилизаторов на эндогенной основе не нарушают значительным образом биологическую активность компонентов жидкости, кроме микроорганизмов. Биологическая активность этих компонентов сохраняется, насколько это возможно, хотя в некоторых случаях, когда эти способы будут оптимизированы, некоторая потеря биологической активности, например денатурация белковых компонентов, должна быть сбалансирована с эффективной деконтаминацией жидкости. До тех пор пока компоненты жидкости сохраняют достаточную биологическую активность, чтобы выполнять предназначенные им или их естественные функции, их биологическую активность не считают значительно нарушенной.

Фотосенсибилизаторы, пригодные для настоящего изобретения, включают любые известные фотосенсибилизаторы, которые пригодны для инактивации микроорганизмов. Фотосенсибилизатор определяется как любое соединение, которое поглощает лучи одной или более определенной длины волны и в дальнейшем утилизирует поглощенную энергию для осуществления химического процесса. Примеры таких фотосенсибилизаторов включают порфирины, псоралены, краски, такие как нейтральный красный, метиленовый синий, акридин, толуидины, флавин (акрифлавина гидрохлорид) и фенотиазиновые производные, кумарины, хинолоны, хиноны и антрахиноны. Фотосенсибилизаторы по настоящему изобретению могут включать соединения, которые предпочтительно поглощаются нуклеиновыми кислотами, фокусируя, таким образом, свой фотодинамический эффект на микроорганизмах и вирусах, не влияя или мало влияя на имеющиеся клетки или белки. Другие фотосенсибилизаторы также пригодны для настоящего изобретения, такие как те, которые используют механизмы, зависящие от атомарного кислорода. Наиболее предпочтительными являются эндогенные фотосенсибилизаторы. Термин эндогенный означает встречающийся в естественных условиях в организме человека или другого млекопитающего, или в результате синтеза в организме, или в результате поступления незаменимых питательных веществ (например, витаминов), или в результате образования метаболитов и/или биопродуктов ίη νίνο. Примерами таких эндогенных фотосенсибилизаторов являются аллоксазины, такие как 7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазин (рибофлавин), 7,8,10-триметилизоаллоксазин (люмифлавин), 7,8-диметилалло ксазин (люмихром), изоаллоксазинаденин динуклеотид (флавинадениндинуклеотид [ФАД]), аллоксазин мононуклеотид (также известный как флавинмононуклеотид [ФМН] и рибофлавин-5-фосфат), витамин Кз, витамин Ь, их метаболиты и предшественники и нафтохиноны, нафталины, нафтолы и их производные, имеющие плоские молекулярные конформации. Термин аллоксазин включает изоаллоксазины. Производные фотосенсибилизаторов на эндогенной основе включают синтетические аналоги и гомологи эндогенных фотосенсибилизаторов, которые могут иметь или не иметь низших (1-5) алкильных или галогеновых заместителей фотосенсибилизаторов, из которых они получены, и которые сохраняют их функцию и практическую нетоксичность. Когда используются эндогенные фотосенсибилизаторы, особенно, когда такие фотосенсибилизаторы не являются токсичными по своей природе или не образуют токсичных фотопродуктов после облучения светом, после проведения деконтаминации не требуется стадии удаления или очистки и обрабатываемый продукт может непосредственно возвращаться в организм пациента или вводиться пациенту, который нуждается в его терапевтическом действии. Предпочтительными эндогенными фотосенсибилизаторами являются

Способы по настоящему изобретению требуют смешивания фотосенсибилизатора с материалом, который должен быть деконтаминирован. Смешивание можно осуществлять простым добавлением фотосенсибилизатора или раствора, содержащего фотосенсибилизатор, к жидкости, которая должна быть деконтаминирована. В одном варианте осуществления настоящего изобретения материал, подлежащий деконтаминированию, к которому добавляют фотосенсибилизатор, протекает мимо источника светового излучения и поток материала обычно создает турбулентность, достаточную для распределения фотосенсибилизатора в жидкости, которая должна быть деконтаминирована. В другом варианте осуществления настоящего изобретения жидкость и фотосенсибилизатор помещают в проницаемый для света контейнер и облучают сериями, предпочтительно при встряхивании контейнера, до полного распределения фотосенсибилизатора и обеспечения воздействия облучения на всю жидкость.

Количество фотосенсибилизатора, которое должно смешиваться с жидкостью, должно представлять собой такое количество, которое будет достаточным для адекватной инактивации в ней микроорганизмов, но будет меньше токсического (для людей или других млекопитающих) или нерастворимого количества. Как предлагается в настоящем документе, оптимальные концентрации для желательных фотосенсибилизаторов могут быть легко определены специалистом без излишнего экспериментирования. Предпочтительно фотосенсибилизатор используют в концентрации, по меньшей мере, около 1 мкМ и до предела растворимости фотосенсибилизатора в жидкости и предпочтительно около 10 мкМ. Для 7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазина предпочтительная концентрация составляет приблизительно от 1 до 160 мкМ, предпочтительно около 10 мкМ.

Жидкость, содержащую фотосенсибилизатор, подвергают облучению светом подходящей длины волны для активации фотосенсибилизатора, используя количество светового облучения, достаточное для активации фотосенсибилизатора, как описано выше, но менее того количества, которое вызывает неспецифическое повреждение биологических компонентов или которое значительно нарушает биологическую активность других белков, присутствующих в жидкости. Используемая длина волны будет зависеть от выбранного фотосенсибилизатора, что известно специалисту, или может легко оп11 ределяться без излишнего экспериментирования с помощью настоящего описания. Предпочтительно источник света является флюоресцентным или люминесцентным источником, генерирующим свет с длиной волны приблизительно от 300 до 700 нм и более предпочтительно приблизительно от 340 до 650 нм. Длины волн в пределах спектра от ультрафиолетовых лучей до видимого света являются пригодными для осуществления настоящего изобретения. Источник или источники света могут генерировать свет в видимом диапазоне, в ультрафиолетовом диапазоне или предпочтительно смесь видимого и ультрафиолетового диапазонов спектра, более предпочтительно около половины видимого и половины ультрафиолетового диапазонов спектра, хотя можно использовать и другие их соотношения. Преимуществом смеси диапазонов света является то, что видимый спектр не повреждает тромбоциты, но сокращает необходимое количество более вредного ультрафиолетового облучения.

Активированный фотосенсибилизатор способен инактивировать присутствующие микроорганизмы, препятствуя их репликации. Специфичность действия фотосенсибилизатора обусловлена тесной близостью фотосенсибилизатора и нуклеиновой кислоты в микроорганизме, и это может происходить вследствие связывания фотосенсибилизатора с нуклеиновой кислотой. Нуклеиновая кислота включает рибонуклеиновую кислоту (РНК) и дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК). Другие фотосенсибилизаторы могут действовать путем связывания с клеточными мембранами или посредством других механизмов. Фотосенсибилизатор может также нацеливаться на микроорганизм, подлежащий инактивации, посредством ковалентного связывания с антителом, предпочтительно специфичным по отношению к данному микроорганизму моноклональным антителом.

Жидкость, содержащую фотосенсибилизатор, можно наливать в светопроницаемый контейнер для облучения. Термин контейнер относится к закрытому или открытому пространству, которое может быть изготовлено из ригидного или эластичного материала, например, может представлять собой мешок или коробку или лоток. Он может быть закрытым или открытым в верхней части и может иметь отверстия на обоих концах, например, может представлять собой трубку или систему труб, что позволяет жидкости протекать через него. В качестве примера одного варианта осуществления настоящего изобретения использовалась кювета, включающая систему сквозного протекания жидкости. Пакеты для сбора, такие, которые используются с Тйша™ 8рес1га™ и системами афереза СоЬе ЬаЬога1опе8, 1пс., использовали в качестве примера другого варианта осуществления настоящего изобретения, включающего обработку жидкости на основе серий.

Термин светопроницаемый означает, что материал, из которого изготовлен контейнер, является адекватно прозрачным для облучения светом подходящей длины волны для активации фотосенсибилизатора. В системе сквозного протекания жидкости контейнер имеет глубину (измерение, определяемое в направлении лучей от источника светового излучения), достаточную для того, чтобы световые лучи адекватно проникали в контейнер и контактировали с молекулами фотосенсибилизатора на всех расстояниях от источника света и гарантировали инактивацию микроорганизмов в жидкости, подвергаемой деконтаминации, и длину (измерение, определяемое в направлении тока жидкости), достаточную для того, чтобы обеспечить достаточное время воздействия светового облучения на жидкость. Материалы для изготовления указанных контейнеров, глубину и длину этих контейнеров специалист может легко определить без излишнего экспериментирования с помощью настоящего описания и в совокупности со скоростью тока жидкости через контейнер, интенсивностью светового облучения и поглощающей способностью компонентов жидкости, например плазмы, тромбоцитов, эритроцитов, также может определить промежуток времени, в течение которого жидкости необходимо подвергаться световому облучению. Для 7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазина предпочтительное количество облучения составляет приблизительно от 1 до 120 Дж/см².

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, включающем обработку на серийной основе, жидкость, подвергаемую обработке, помещают в светопроницаемый контейнер, который встряхивают и подвергают воздействию облучения светом в течение периода времени, достаточного для практической инактивации микроорганизмов. Указанный светопроницаемый контейнер предпочтительно представляет собой мешок для крови, изготовленный из прозрачного или полупрозрачного пластика, а средством встряхивания предпочтительно является встряхивающий стол. Фотосенсибилизатор можно добавлять в контейнер в порошкообразной или жидкой форме, и контейнер встряхивают для перемешивания фотосенсибилизатора с жидкостью и адекватного воздействия светового облучения на всю жидкость, чтобы гарантировать инактивацию микроорганизмов.

Фотосенсибилизатор можно добавлять или наливать в светопроницаемый контейнер отдельно от жидкости, подвергаемой обработке, или добавлять в жидкость до помещения ее в контейнер. В одном варианте осуществления настоящего изобретения фотосенсибилизатор добавляют к антикоагулянту, а смесь фотосенсибилизатора и антикоагулянта добавляют к жидкости.

К жидкости можно добавлять также усилители, чтобы сделать процесс более эффектив13 ным и избирательным. Такие усилители включают антиоксиданты или другие агенты для предотвращения повреждения нужных компонентов жидкости или для улучшения скорости инактивации микроорганизмов; их примерами являются аденин, гистидин, цистеин, тирозин, триптофан, аскорбат, Ν-ацетил-Ь-цистеин, пропилгаллат, глутатион, меркаптопропионилглицин, дитиотреотол, никотинамид, ВНТ, ВНА, лизин, серин, метионин, глюкоза, маннит, тролокс, глицерин и их смеси.

Настоящее изобретение включает также жидкости, содержащие биологически активный белок, кровь или заменители крови, а также содержащие эндогенный фотосенсибилизатор, производное фотосенсибилизатора на эндогенной основе или их фотопродукты, изготовленные в соответствии со способом по п. 1 формулы изобретения. Жидкость может содержать также инактивированные микроорганизмы.

Помимо деконтаминации цельной крови, жидкостей, содержащих продукты крови, и биологически активных белков этот способ является пригодным для обработки других жидкостей, включая жидкости, предназначенные для питания людей или животных, такие как воды, фруктовые соки, молоко, бульоны, супы и т.п. Этот способ пригоден также для обработки перитонеальных или парентеральных растворов.

Настоящее изобретение также включает способы обработки поверхностей для инактивации микроорганизмов, которые могут на них присутствовать, состоящие в нанесении на указанные поверхности эффективного для инактивации, не токсичного количества эндогенного фотосенсибилизатора или производного фотосенсибилизатора на эндогенной основе и воздействии на указанную поверхность облучения светом, достаточным для активации фотосенсибилизатора. Указанной поверхностью может быть поверхность пищевых продуктов, таких как фрукты, овощи или туши животных, поверхность или поверхности нарезанных или находящихся в процессе изготовления пищевых продуктов. Материалы, состоящие из частиц, такие как мясной фарш, могут обрабатываться путем смешивания фотосенсибилизатора с указанным материалом и перемешивания во время процесса облучения, чтобы воздействовать светом на новые поверхности.

Альтернативно, указанной поверхностью может являться поверхность для приготовления пищи, такая как прилавок или полка шкафа для продуктов, или поверхность сосуда для купания или мытья, такого как кухонная раковина, ванна или лохань или плавательный бассейн и т.п. Помимо этого, поверхность может являться поверхностью живого животного или растения, или раневой поверхностью.

Фотосенсибилизатор может использоваться в подходящем носителе, таком как вода или раствор, содержащий другие добавки для обработки, путем распыления, погружения, протирания или с помощью других известных способов. Количество фотосенсибилизатора и энергия светового облучения, которые требуются для обработки, может без излишнего экспериментирования легко определить специалист, в зависимости от уровня загрязнения и подвергаемого обработке материала.

Настоящее изобретение относится также к способу обработки жидкости или другого материала, как перечислено выше, для инактивации микроорганизмов, которые могут в них присутствовать, который включает добавление эффективного для инактивации, не токсичного количества витамина К5 к указанной жидкости или другому материалу. Предпочтительно, но не необходимо, жидкость или другой материал облучают для усиления инактивации микроорганизмов. В некоторых случаях при использовании витамина К5 инактивация наблюдается в условиях обычного комнатного освещения или в темноте, как далее обсуждается в примерах. Жидкости, содержащие эритроциты, являются предпочтительными для обработки витамином К5 в отсутствии этапа светового облучения. Соединение К5 может также покрывать поверхности, такие как системы трубок для диализа крови или перитонеального диализа, для гарантии стерильности соединений и стерильной стыковки.

В системах деконтаминации по настоящему изобретению источник светового излучения может быть соединен со светопроницаемым контейнером для жидкости посредством световода, такого как световой канал или фиброоптическая трубка, которые предотвращают рассеяние света между источником и контейнером для жидкости и, более важно, предотвращают значительное нагревание жидкости внутри контейнера. Прямое воздействие источника света может повышать температуру на 10-15°С, особенно, если количество жидкости, подвергаемой обработке светом, невелико, что может вызвать денатурацию компонентов крови. Применение световода обеспечивает нагревание не более чем приблизительно на 2°С. Этот способ может также включать применение температурных датчиков и охлаждающих механизмов, когда необходимо поддерживать температуру ниже температур, при которых нужные белки в жидкости повреждаются. Предпочтительно температуру поддерживают на уровне приблизительно от 0 до 45°С, более предпочтительно приблизительно от 4 до 37°С и наиболее предпочтительно около 22°С.

Настоящее изобретение относится также к системе для обработки жидкости для инактивации микроорганизмов, которые могут в ней присутствовать, включающей:

(а) контейнер, содержащий указанную жидкость и эндогенный фотосенсибилизатор или производное фотосенсибилизатора на эндо15 генной основе; указанный контейнер оборудован входным устройством и имеет светопроницаемую поверхность, достаточную для осуществления воздействия на находящуюся в нем жидкость световым излучением в количестве, достаточном для активации фотосенсибилизатора;

(Ь) по меньшей мере, один источник светового излучения для обеспечения достаточного светового облучения жидкости в указанном контейнере, такого типа и количества, которые выбраны для активации фотосенсибилизатора, в результате чего имеющиеся микроорганизмы практически инактивируются.

Источник светового излучения может представлять собой источник видимого света или ультрафиолетового излучения или и то, и другое. Предпочтительно обеспечивается как видимый, так и ультрафиолетовый свет, и более предпочтительно световое облучение является приблизительно наполовину ультрафиолетовым и наполовину видимым, хотя могут использоваться и другие соотношения. Световое облучение как ультрафиолетовым, так и видимым спектрами могут применяться одновременно или последовательно; видимая часть предпочтительно применяется первой. Источником светового излучения может быть простая лампа, или он может состоять из множества ламп, испускающих лучи различных длин волны. Источник светового излучения должен быть способен обеспечивать приблизительно от 1 до, по меньшей мере, 120 Дж/см². Использование смешанного ультрафиолетового и видимого света является особенно предпочтительным, если фотосенсибилизатором является соединение, которое утрачивает свою способность поглощать видимый свет после периода экспозиции, такое как 7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазин.

Могут применяться любые известные средства для добавления фотосенсибилизатора к жидкости, которая должна быть деконтаминирована, и для помещения жидкости в светопроницаемый контейнер; такие средства обычно включают трубопроводы, порты, резервуары, клапаны и т.п. Предпочтительно указанная система включает средства, такие как насосы или регулируемые клапаны, для контроля над поступлением фотосенсибилизатора в жидкость, которая должна быть деконтаминирована, таким образом, чтобы его концентрацию можно было поддерживать на эффективных уровнях, как описано выше. В одном варианте осуществления настоящего изобретения фотосенсибилизатор смешивают с антикоагулянтом, добавляемым в систему афереза крови. Для эндогенных фотосенсибилизаторов и производных, имеющих сахарные доли, рН раствора предпочтительно поддерживают на достаточно низком уровне для предотвращения отсоединения сахарной доли, как это известно специалистам. Предпочтительно фотосенсибилизатор добавляют к жидкости, которая должна быть деконтаминирована, в предварительно приготовленном водном растворе, например в воде или в растворе для хранения, содержащем буфер.

Светопроницаемый контейнер для системы сквозного потока может представлять собой прозрачную кювету, изготовленную из поликарбоната, стекла, кварца, полистирола, поливинилхлорида, полиолефина или другого прозрачного материала. Указанная кювета может быть заключена в камеру для облучения, имеющую зеркальные стенки. Усилитель светового облучения, такой как второй источник светового излучения или отражающая поверхность, может помещаться поблизости от кюветы для увеличения количества светового излучения, контактирующего с жидкостью в кювете. Указанная система предпочтительно включает насос для регулирования скорости потока жидкости до нужных уровней, чтобы гарантировать значительную деконтаминацию, как описано выше. Указанная кювета имеет длину, скоординированную со скоростью протекания через нее жидкости, достаточную для того, чтобы протекающая жидкость получала достаточно светового облучения для обеспечения ее значительной деконтаминации.

Также предпочтительно кювета помещается в стороне от источника света на расстоянии, достаточном для того, чтобы жидкость в кювете не нагревалась, а свет передается из источника света к кювете посредством световода.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения жидкость помещается в светопроницаемый контейнер, такой как мешок для крови, например, используемый в системе афереза, описанной в патенте США № 5653887, и встряхивается во время светового облучения. Подходящие мешки включают мешки для сбора, как описано в настоящем документе. Особенно удобны мешки для сбора, которые используются в системе 8рес1та™ или системе афереза Тпта™, Собе йаЬогаЮпез. 1пс. Встряхивающие столы известны в данной области, например те, которые описаны в патенте США № 4880788. Мешок снабжен, по меньшей мере, одним входом для добавления в него жидкости. В одном варианте осуществления настоящего изобретения фотосенсибилизатор, предпочтительно 7,8диметил-1 0-рибитил-изоаллоксазин, добавляют в порошкообразной форме в мешок, наполненный жидкостью. Мешок затем помещают на встряхивающий стол и встряхивают во время светового облучения до тех пор, пока практически вся жидкость не подвергнется световому облучению. Альтернативно, в мешок можно предварительно засыпать порошкообразный фотосенсибилизатор. Жидкость, которую нужно деконтаминировать, затем добавляют через соответствующий порт.

Системы для деконтаминации, описанные выше, могут изготавливаться в виде отдельных устройств или могут легко встраиваться в существующие устройства, известные для сепарирования или обработки крови, изымаемой у пациента или вводимой пациенту. Например, такие устройства для обработки крови включают системы афереза СОВЕ 8рес1га™ или Тпша™, которые можно приобрести у компании СоЬе ЬаЬогаФпек, 1пс., Ьаке^ооб, Со, или устройства, описанные в патенте США № 5653887, или в патентной заявке США серийный № 08/924519, поданной 5 сентября 1997 г. (публикация РСТ № \νϋ 99/11305) СоЬе ЬаЬогаФпек, 1пс., а также системы афереза от других производителей. Систему деконтаминации можно устанавливать ниже (относительно движения потока) того места, где кровь изымается у пациента или донора, перед местом введения продукта крови пациенту или в любой точке перед устройством для сепарации крови или после него. Фотосенсибилизатор добавляют к компонентам крови вместе с антикоагулянтом в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, а отдельные источники излучения и кюветы помещают ниже (относительно движения потока) мест сбора для тромбоцитов, плазмы и эритроцитов. Применение трех отдельных систем деконтаминации крови предпочтительнее установки единственной системы деконтаминации крови выше (относительно движения потока) сепарационного сосуда в системе афереза, поскольку более низкие скорости потока в отдельных составляющих линиях обеспечивают более легкое облучение. В других вариантах осуществления настоящего изобретения системы деконтаминации по настоящему изобретению могут применяться для обработки ранее собранных и находящихся на хранении продуктов крови.

Если в обрабатываемой жидкости имеются эритроциты, для компенсирования поглощения света клетками можно сделать более тонким слой жидкости, использовать облучение с более высокой энергией в течение более длительных периодов времени, встряхивать в течение более длительных периодов времени или представлять для облучения в более мелких контейнерах или трубопроводах, чем это необходимо при обработке других компонентов крови.

Эндогенные фотосенсибилизаторы и производные фотосенсибилизаторов на эндогенной основе, описанные в настоящем документе, могут использоваться в уже существующих известных системах деконтаминации компонентов крови, а также в системе деконтаминации, описанной в настоящем документе. Например, эндогенные фотосенсибилизаторы и производные фотосенсибилизаторов на эндогенной основе по настоящему изобретению можно применять в системах деконтаминации, описанных в патентах США №№ 5290221, 5536238, 5290221 и 5536238.

Вспомогательные растворы для тромбоцитов, включающие эндогенные фотосенсибилизаторы и производные фотосенсибилизаторов на эндогенной основе, как описано выше, также представлены в настоящем документе. Вспомогательные растворы для тромбоцитов, известные специалистам, могут использоваться для этих целей и включают те, которые описаны в патентах США №№ 5908742, 5482828, 5569579, 5236716, 5089146 и 5459030. Такие вспомогательные растворы для тромбоцитов могут содержать физиологический солевой раствор, буфер, предпочтительно фосфат натрия, и другие компоненты, включая хлорид магния и глюконат натрия. рН таких растворов предпочтительно находится в пределах от 7,0 до 7,4. Эти растворы пригодны в качестве носителей для концентратов тромбоцитов и позволяют поддерживать качество и метаболизм клеток во время хранения, понижать содержание плазмы и продлевать сроки хранения. Фотосенсибилизатор может присутствовать в таких растворах в любой нужной концентрации приблизительно от 1 мкМ до предела растворимости фотосенсибилизатора в растворе и предпочтительно приблизительно от 10 до 100 мкМ, более предпочтительно около 10 мкМ. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения вспомогательный раствор для тромбоцитов включает также усилители, как описано выше. Предпочтительный вспомогательный раствор для тромбоцитов включает ацетат натрия, хлорид натрия, глюконат натрия, 1,5 мМ хлорида магния, 1 мМ фосфата натрия, 14 мкМ 7,8-диметил10-рибитил-изоаллоксазина и предпочтительно также 6 мМ аскорбата.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 изображает спектр поглощения рибофлавина;

фиг. 2 - корреляцию поглощения света и гематокрита, имеющуюся и предсказанную для эритроцитов и предсказанную для тромбоцитов;

фиг. 3 - фотораспад с течением времени рибофлавина в антикоагулянтном кислотном цитратдекстрозном растворе (ЛСЭ). Непрерывная линия с кружками указывает процент от первоначального рибофлавина, который остается при 373 нм. Прерывистая линия с квадратиками указывает процент от первоначального рибофлавина, который остается при 447 нм;

фиг. 4 - профиль трансмиссии различных пластиковых кювет в зависимости от длины волны. Непрерывная линия представляет 3,2 мм акриловую кювету. Прерывистая линия (-—) представляет 3,2 мм УФ акриловую кювету. Пунктирная линия (- - -) представляет 3,2 мм кювету из полистирола (ПС), а линия с крестиками показывает 3,2 мм кювету из поликарбоната (ПК);

фиг. 5 - световой поток, который требуется, в мВт на см² в зависимости от скорости потока, т.е. поток, который требуется для доставки одного джоуля на см² к образцу в кювете;

фиг. 6 - аппарат для сепарации крови, включающий устройство для облучения светом по настоящему изобретению;

фиг. 7 - блок деконтаминации по настоящему изобретению;

фиг. 8 - инактивацию бактерий в препаратах тромбоцитов с использованием витамина К5 в качестве фотосенсибилизатора в зависимости от энергии излучения;

фиг. 9 - инактивацию бактерий в зависимости от препарата тромбоцитов и энергии излучения с использованием 90% тромбоцитов и 10% вспомогательного раствора для тромбоцитов (90:10), а также 30% тромбоцитов с 70% вспомогательного раствора для тромбоцитов (30:70);

фиг. 10 - влияние добавления антиоксидантов к концентрату тромбоцитов на инактивацию вирусов, бактериофагов и бактерий;

фиг. 11 - кривую инактивации для вируса герпеса простого типа II в зависимости от концентрации фотосенсибилизатора при энергии излучения 20 Дж/см², с использованием равных частей ультрафиолетового света и света видимой части спектра;

фиг. 12 - инактивацию Ξ.ορίάοηηίάίδ при различных концентрациях фотосенсибилизатора и различной энергии излучения;

фиг. 13 - инактивацию ФХ174 при различных концентрациях фотосенсибилизатора и различной энергии излучения;

фиг. 14 - инактивацию 8.аигеи8 и ФХ174 при различной энергии излучения с использованием ультрафиолетового света и света видимой части спектра в соотношении 50:50;

фиг. 15 - инактивацию 8.ерИегш1б18 и Н8У-11 при различной энергии излучения, с использованием ультрафиолетового света и света видимой части спектра в соотношении 50:50;

фиг. 16 - инактивацию вируса Н8У2 во встряхиваемых мешках для крови, облучаемых при различных уровнях энергии излучения;

фиг. 17 сравнивает результаты инактивации для вакцинного вируса в различных жидкостях с использованием только ультрафиолетового света или света видимой части спектра и ультрафиолетового света в соотношении 50:50;

фиг. 18 сравнивает результаты инактивации для вакцинного вируса с фотосенсибилизатором и без фотосенсибилизатора при различной продолжительности облучения;

фиг. 19 сравнивает инактивацию внеклеточного ВИЧ-1 при концентрациях фотосенсибилизатора 5 и 50 мкМ и различной энергии излучения;

фиг. 20 сравнивает инактивацию внутриклеточного ВИЧ-1 при концентрациях фотосенсибилизатора 5 и 50 мкМ и различной энергии излучения;

фиг. 21 сравнивает инактивацию внутриклеточного ВИЧ-1 при концентрациях фотосенсибилизатора 5 и 50 мкМ и различной энергии излучения с использованием уровней антигена р24;

фиг. 22 показывает инактивацию Н8У-11 при различных уровнях облучения с использованием концентрата тромбоцитов и концентрата тромбоцитов в среде, содержащей вспомогательный раствор для тромбоцитов с аскорбатом;

фиг. 23 показывает вариант осуществления настоящего изобретения с использованием мешка для крови, содержащего жидкость, подлежащую обработке, и фотосенсибилизатор, а также встряхивающий стол для перемешивания жидкости во время воздействия светового излучения из источника света.

Подробное описание

Способ деконтаминации по настоящему изобретению с использованием эндогенных фотосенсибилизаторов и производных фотосенсибилизаторов на эндогенной основе иллюстрируется в настоящем документе 7,8-диметил-10рибитил изоаллоксазином в качестве фотосенсибилизатора, однако, можно использовать любой фотосенсибилизатор, который способен активироваться световым излучением и вызывать инактивацию микроорганизмов. Фотосенсибилизатор должен быть таким, который не разрушает нужные компоненты жидкости, подвергаемой деконтаминации, и также предпочтительно не распадается в результате облучения светом с образованием продуктов, которые значительно повреждают нужные компоненты или обладают значительной токсичностью. Длина волны, при которой фотосенсибилизатор активируется, определяется, как описано выше, с использованием литературных источников или прямого измерения. Его растворимость в жидкости, подвергаемой деконтаминации, или в комбинации жидкости-носителя и жидкости, подвергаемой деконтаминации, определяется таким же образом. Способность светового излучения активирующей длины волны проникать в жидкость, подвергаемую деконтаминации, также должна определяться как указано в настоящем описании. Подходящие температуры для реакции фотосенсибилизатора с его субстратом также определяются, как и пределы температур, интенсивность и продолжительность светового облучения и концентрация фотосенсибилизатора, которые оптимизируют инактивацию микробов и сводят к минимуму повреждение нужных белков и/или клеточных компонентов в жидкости. Примеры 1-7 и фиг. 1-5 иллюстрируют определение информации, которая требуется для разработки системы деконтаминации по принципу сквозного потока по настоящему изобретению.

После того как требования к системе со сквозным потоком определены, могут быть сконструированы устройства, которые обеспечат подходящие скорости потока, светопроницаемость и интенсивность света, которые вызывают инактивацию микроорганизмов, имею21 щихся в жидкости, как указано в настоящем документе. Жидкость, подвергаемую деконтаминации, смешивают с фотосенсибилизатором, а затем облучают достаточным количеством света для активации фотосенсибилизатора, который взаимодействует с микроорганизмами в жидкости так, что микроорганизмы в жидкости инактивируются. Количество светового излучения, достигающего микроорганизмов в жидкости, регулируется подбором подходящего источника светового излучения, подходящего расстояния от источника светового излучения до жидкости, подвергаемой деконтаминации, которое может увеличиваться, благодаря использованию световодов для переноса светового излучения непосредственно к контейнеру для жидкости, подходящего светопроницаемого материала для контейнера для жидкости, подходящей глубины, позволяющей световому излучению полностью проникать в контейнер, усилителей светового облучения, таких как один или более дополнительный источник светового излучения, предпочтительно на противоположной по отношению к первому источнику стороне контейнера, или рефлекторы для отражения света из источника излучения обратно к контейнеру, подходящих скоростей потока жидкости в контейнере и подходящей длины контейнера, обеспечивающей достаточное время для инактивации имеющихся микроорганизмов.

Могут также потребоваться контрольные устройства и регуляторы температур, чтобы поддерживать температуру жидкости на оптимальном уровне. Фиг. 6 изображает систему деконтаминации по настоящему изобретению как часть устройства для сепарации компонентов крови, а фиг. 7 представляет детали предпочтительной системы деконтаминации.

Для серийных систем предпочтительно помещать жидкость, подвергаемую деконтаминации, вместе с фотосенсибилизатором в мешки, которые являются светопроницаемыми или, по меньшей мере, достаточно светопроницаемыми, чтобы достаточное количество излучения достигало его содержимого и активировало фотосенсибилизатор. В каждый мешок добавляют количество фотосенсибилизатора, достаточное для обеспечения инактивации; предпочтительно концентрация фотосенсибилизатора составляет приблизительно 10 мкМ, и мешок встряхивают во время облучения предпочтительно приблизительно от 1 до 120 Дж/см² в течение периода времени приблизительно от 6 до 36 мин, чтобы гарантировать воздействие излучения практически на всю жидкость. Предпочтительно комбинация света видимой части спектра и ультрафиолетового света используется одновременно. Фотосенсибилизатор можно добавлять в порошкообразной форме.

В указанном способе предпочтительно применяют эндогенные фотосенсибилизаторы, включая эндогенные фотосенсибилизаторы, которые действуют путем препятствования репликации нуклеиновых кислот. 7,8-диметил-10рибитил изоаллоксазин является предпочтительным фотосенсибилизатором для применения в настоящем изобретении. Химическое взаимодействие между 7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазином и нуклеиновыми кислотами, как полагают, происходит без участия процессов, в которых участвует атомарный кислород (т.е. механизм II типа), а скорее путем прямых взаимодействий сенсибилизатор-субстрат (механизм I типа). СаДе! е! а1. (1983) ЬСНсш.. 23:420-429 ясно показали, что эффекты 7,8диметил-10-рибитил изоаллоксазина обусловлены окислением остатков гуанозина, в котором не участвует атомарный кислород. Помимо этого, аденозиновые основания, как представляется, чувствительны к действию 7,8-диметил-10рибитил изоаллоксазина в совокупности с УФ светом. Это важно, поскольку аденозиновые остатки являются относительно нечувствительными к процессам, в которых участвует атомарный кислород. 7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазин, как представляется, не вырабатывает больших количеств атомарного кислорода при действии УФ света, но оказывает свое действие через непосредственные взаимодействия с субстратом (например, нуклеиновыми кислотами) посредством реакций переноса электронов с сенсибилизиторами, находящимися в возбужденном состоянии. Поскольку неизбирательное повреждение клеток и белков происходит, главным образом, вследствие действия атомарного кислорода, этот механистический путь для действия 7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазина обеспечивает более высокую избирательность его действия по сравнению с соединениями, такими как псоралены, химические взаимодействия которых в значительной степени обусловлены механизмом II типа.

Фиг. 6 показывает устройство для обработки крови и систему афереза, включающую источники светового излучения по настоящему изобретению. Цельная кровь изымается от донора/пациента 4 и подается в систему афереза или устройство для сепарации компонентов крови 8, где кровь сепарируют на различные типы компонентов, и, по меньшей мере, один из этих типов компонентов крови удаляется из устройства 8. Эти компоненты крови затем могут использоваться для другого пациента или могут подвергаться терапевтической обработке и возвращаться донору/пациенту 4.

В устройстве для сепарации компонентов крови 8 кровь изымается от донора/пациента 4 и направляется через экстракорпоральную трубопроводную сеть циркуляции 10 и емкость для обработки крови 12, составляющие полностью закрытую и стерильную систему. Устройство для сепарации компонентов крови 8 соединено с насосом (не показано). Кровь протекает от донора/пациента 4 через экстракорпоральную тру23 бопроводную сеть циркуляции 10 во вращающуюся емкость для обработки крови 12. Кровь внутри емкости для обработки крови 12 сепарируется на различные типы компонентов крови и эти компоненты (тромбоциты, плазма, эритроциты) непрерывно удаляются из емкости для обработки крови 12. Компоненты крови, которые не собирают или не оставляют для терапевтической обработки (например эритроциты, лейкоциты, плазма), также удаляют из емкости для обработки крови 12 и возвращают донору/пациенту 4 через экстракорпоральную трубопроводную сеть циркуляции 10.

Работа устройства для сепарации компонентов крови предпочтительно контролируется одним или более компьютерными процессорами, включенными в указанное устройство.

Экстракорпоральная трубопроводная сеть циркуляции 10 включает кассетный блок 14 и ряд трубопроводных единиц 20, 50, 60, 80, 90, 100, соединяющихся с ним. Трубопроводная единица 20 для удаления/возврата крови обеспечивает единственное соединение через иглу между донором/пациентом 4 и кассетным блоком 14, а трубопроводная субъединица 60 для впуска крови/компонентов крови обеспечивает соединение между кассетным блоком 14 и емкостью для обработки крови 12. Трубопроводная единица для антикоагулянта 50, трубопроводная единица для сбора тромбоцитов 80, трубопроводная единица для сбора плазмы 90, трубопроводная единица для сбора эритроцитов 70 и трубопроводная единица для клапана мешка 100 также соединяются с кассетным блоком 14.

Трубопроводная единица 20 для удаления/возврата крови включает субъединицу в виде иглы 30, соединяющуюся с ней, и трубопровод для антикоагулянта 26, соединяющийся с трубопроводной единицей для антикоагулянта 50 через кассетный блок 14.

Кассетный блок 14 включает переднюю и заднюю формованные пластиковые пластины, которые приварены друг к другу, формируя прямоугольный кассетный элемент, имеющий неразъемные проходы для жидкости. Кассетный блок 14 включает также ряд выступающих наружу трубопроводных петель, соединяющихся с различными неразъемными проходами для жидкости. Эти неразъемные проходы также соединяются с различными трубопроводными единицами.

Конкретно, кассетный блок 14 соединяется с трубопроводом для антикоагулянта 26 трубопроводной единицы для удаления/ возврата крови 20 и с трубопроводной единицей для антикоагулянта 50. Трубопроводная единица для антикоагулянта 50 включает камеру для выброса капель 52, которую можно соединять с источником антикоагулянта и фотосенсибилизатора 53 и стерилизующим фильтром 56. Во время использования трубопроводная единица для антикоагулянта 50 поставляет антикоагулянт, смешанный с фотосенсибилизатором, в кровь, изымаемую у донора/пациента 4, для уменьшения или предупреждения свертывания крови в экстракорпоральной трубопроводной сети циркуляции 10. Специалистам известно множество антикоагулянтов, например таких, которые описаны в главе 3 ААВВ Тее11шеа1 Мапиа1, 11-е издание, 1993, включая АС’Э-А. С’РЭ. СР2Э. С'РЭЛ-1 и гепарин. Указанные антикоагулянты, так же как и растворы для хранения клеток, А81, А8-3 и А8-5, совместимы с эндогенными фотосенсибилизаторами и производными фотосенсибилизаторов на эндогенной основе, описанными в настоящем документе.

Кассетный блок 14 включает также соединение с трубопроводом для удаления крови трубопроводной единицы для удаления/возврата крови 20. Кровь проходит через датчики давления и входной фильтр в кассетном блоке 14 и оттуда во входной трубопровод для крови 62. Входной трубопровод для крови 62 также соединяется с емкостью для обработки крови 12, чтобы поставлять туда цельную кровь для обработки.

Для возврата разделенных компонентов крови в кассетный блок 14 трубопроводное соединение 60 для впуска крови/компонентов крови дополнительно включает выпускной трубопровод для эритроцитов (ККК-красных клеток крови)/плазмы, выпускной трубопровод для тромбоцитов и выпускной трубопровод для плазмы, соединенный с соответствующими выпускными отверстиями в емкости для обработки крови 12. Выпускной трубопровод для эритроцитов (ККК)/плазмы проводит отделенный компонент эритроциты (ККК)/-плазма через кассетный блок 14 к трубопроводной единице для сбора эритроцитов 70 через первую систему деконтаминации 72. Выпускной трубопровод для тромбоцитов проводит отделенные тромбоциты через кассетный блок 14 к трубопроводной единице для сбора тромбоцитов 80 через вторую систему деконтаминации 82. Выпускной трубопровод для плазмы проводит отделенную плазму через кассетный блок 14 к трубопроводной единице для сбора плазмы 90 через третью систему деконтаминации 92. После облучения в системах деконтаминации 72, 82 и 92 для активации фотосенсибилизатора и инактивации имеющихся микроорганизмов компоненты крови собирают в мешок для сбора эритроцитов 74, в мешки для сбора тромбоцитов 84 и в мешок для сбора плазмы 94. Вентиляционный мешок 104 может использоваться для отвода газов внутри системы.

Фиг. 7 изображает отдельно расположенную версию блока деконтаминации по настоящему изобретению. Продукт крови 180 (который может представлять собой недавно собранную кровь или компонент крови или хранящуюся кровь) соединяют с линией продукта крови

186, которая ведет через насос 184 в кювету де25 контаминации 164. Резервуар для фотосенсибилизатора 166 соединяется с линией впуска фотосенсибилизатора 168, оборудованной впускным насосом 170, и ведет в линию продукта крови 186 выше (относительно потока жидкости) от кюветы деконтаминации 164. Кювета деконтаминации 164 представляет собой светопроницаемую кювету с глубиной (б) и длиной (1), подобранными таким образом, чтобы гарантировать деконтаминацию. Система охлаждения 190, объединенная с температурным монитором 192, соединяется с кюветой деконтаминации 164 для регулирования температуры жидкости. Кювета деконтаминации 164 соединяется посредством световода 162 с источником светового излучения 160. Усилитель светового излучения 163 помещается поблизости (в контакте или разделенный некоторым пространством) от кюветы деконтаминации 164, чтобы увеличивать количество светового излучения, достигающего продукта крови в кювете. Линия деконтаминированного продукта крови 188 ведет от кюветы деконтаминации 164 к сборнику деконтаминированного продукта крови 182.

Во время работы продукт крови 180 проводится в линию продукта крови 186, где к нему присоединяется фотосенсибилизатор из резервуара фотосенсибилизатора 166, текущий со скоростью, регулируемой впускным насосом 170, в линии впуска фотосенсибилизатора 168, которая присоединяется к линии продукта крови 186. Скорость потока в линии продукта крови 186 регулируется насосом 184 до скорости, выбранной таким образом, чтобы гарантировать деконтаминацию в кювете деконтаминации 164. Устройство контроля температуры 192 измеряет температуру жидкости в кювете 164 и регулирует систему охлаждения 190, которая поддерживает температуру в кювете в пределах, которые требуются для оптимальной работы. Продукт крови в кювете деконтаминации 164 облучается световым излучением из источника светового излучения 160, подаваемым через световод 162. Источник светового излучения может включать два или более действующих света. Стрелки обозначают световое излучение с конца световода 162, распространяющееся в продукте крови, находящемся внутри прозрачной кюветы деконтаминации 164. Поблизости от кюветы деконтаминации 164 расположен усилитель светового излучения 163, который может представлять собой дополнительный источник светового излучения или отражающую поверхность. Стрелки от усилителя светового излучения 163, направленные к кювете деконтаминации 164, обозначают световое излучение от усилителя светового излучения 163, облучающее материал продукта крови в кювете 164. Деконтаминированный продукт крови покидает кювету деконтаминации 164 через линию деконтаминированного продукта крови 188 и собирается в сборнике деконтаминированного продукта крови 182.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения используется 7,8-диметил-10рибитил изоаллоксазин от 81дша С11С1шеа1 Сотрапу в качестве фотосенсибилизатора, световод от ЕЕО8 Согрогабоп. АййаткуШе, Ν.Υ., составленный из оптических волокон. Эта система способна доставлять сфокусированный луч света с интенсивностью 6200 мВт/см² в участке спектра 355-380 нм. Возможно также использование в системе взаимозаменяемых фильтров для достижения выхода 4700 мВт/см² в участке спектра 400-500 нм. В обоих случаях выход света в участке спектра 320 нм и ниже является ничтожно малым. С этой системой можно использовать световоды различных размеров (3, 5 и 8 мм). Свет покидает конец световода с углом распространения 21°. Подходящим является 8 мм световод, правильно расположенный, для адекватного освещения поверхности предпочтительной кюветы деконтаминации, которая представляет собой стандартную кювету, используемую в утилизируемых установках Собе 8рес1га® от компании 1пби81па1 Р1а8бс8, 1пс., Еогек! Сгоуе, ОК.

Скорость потока является переменной и определяется количеством световой энергии, предназначенной для доставки к образцу. Скорость потока регулируется посредством перистальтического насоса от Со1е-Рагтег 1п81гитеп1 Сотрапу, Уегпоп НИИ, 1Ь. Скорости потока и тип входного потока могут регулироваться посредством компьютерного процессора, что известно специалистам.

Фиг. 23 изображает вариант осуществления настоящего изобретения, в котором жидкость, подвергаемая деконтаминации, помещается в мешок для крови 284, снабженный впускным отверстием 282, через которое фотосенсибилизатор в порошкообразной форме 290 добавляется из колбы 286 через желоб 288. Встряхивающий стол 280 запускают для встряхивания мешка 284, чтобы растворить фотосенсибилизатор 290, в то время как источник светового излучения 260 включают, чтобы облучить жидкость и фотосенсибилизатор в мешке 284. Альтернативно, в мешок может заранее помещаться фотосенсибилизатор, а жидкость может добавляться в мешок после этого.

Способы по настоящему изобретению не требуют использования усилителей, таких как гасители или поглотители кислорода, однако, их можно использовать для усиления процесса путем уменьшения распространения неспецифических химических реакций, повреждающих клетки или белки, или повышения скорости инактивации патогенных микроорганизмов. Помимо этого, предпочтительные способы, использующие не токсичные фотосенсибилизаторы и производные фотосенсибилизаторов на эндогенной основе, не требуют удаления фото сенсибилизаторов из жидкости после облучения ее светом. Результаты исследований показывают небольшое повреждение или отсутствие повреждения других компонентов крови, например, тромбоциты остаются биологически активными через пять дней после обработки.

Примеры

Пример 1. Профиль поглощения 7,8диметил-10-рибитил изоаллоксазина.

Образец 7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазина (98% чистоты) приобретали у компании 81§та Сйеш1еа1 Сотрапу. Часть этого образца подвергали анализу с помощью сканирующего УФ спектрофотометра. Изучаемые пределы покрывали участок спектра от 200 до 900 нм. Для анализа образец растворяли в дистиллированной воде. Спектр образца по результатам этого анализа представлен на фиг. 1.

Результаты согласовывались с данными, найденными в литературе, по максимальному поглощению и коэффициентам экстинкции для

7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазина.

Стах (ε) по данным литературы	Стах (ε) по данным измерений
267 (32359)	222 (30965)
	265 (33159)
373 (10471)	373 (10568)
447 (12303)	445 (12466)

Подходящие длины волн для облучения составляли 373 и 445 нм. Коэффициенты экстинкции, наблюдаемые при этих величинах максимального поглощения, были достаточны для гарантии адекватной активации сенсибилизатора в растворе.

Пример 2. Растворимость 7,8-диметил-10рибитил изоаллоксазина.

Растворимость в среде Ио1у1е 8, рН 7,4

Максимальную растворимость 7,8диметил-1 0-рибитил изоаллоксазина в среде 15о1у1е 8 определяли следующим образом:

7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазина смешивали с 1§о1у1е 8 до тех пор, пока не выпадал осадок. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа и придавали ей вращательное движение для обеспечения полного растворения суспендированного материала. Дополнительно добавляли 7,8-диметил-1 0-рибитил изоаллоксазин до тех пор, пока даже при дополнительном перемешивании вращательными движениями не оставалась твердая суспензия. Эту суспензию затем центрифугировали для удаления нерастворенного материала. Надосадочную жидкость удаляли и анализировали с помощью спектрофотометра. Величины поглощения раствора определяли на 447 нм и 373 нм. По коэффициентам экстинкции, которые были определены ранее, было возможным определение концентрации насыщенного раствора: Концентрация (373) = 110 мкМ = 42 мкг/мл Концентрация (447) = 109 мкМ = 40,9 мкг/мл

Растворимость в антикоагулянте ЛСЭ-Л

Повторяли ту же процедуру, которая описана выше, с использованием антикоагулянта ЛСЭ-Л. Величины, полученные в результате этих измерений, были следующими: Концентрация (373) = 166 мкМ = 63 мкг/мл Концентрация (447) = 160 мкМ = 60,3 мкг/мл

Величины, полученные в результате этих исследований, показывают верхний предел растворимости изучавшегося соединения, который можно ожидать.

Пример 3. Разложение 7,8-диметил-10рибитил изоаллоксазина светом в водной среде.

Приготавливали раствор 7,8-диметил-10рибитил изоаллоксазина в ЛСЭ-Л 81§та с концентрацией 63 мкг/мл. Этот препарат набирали в стеклянную пипетку и помещали на пути источника УФ света (365 нм Стах с фильтрами для удаления света ниже 320 нм). Эту суспензию облучали через конкретные интервалы времени, по истечении которых отбирали аликвоты для спектроскопического анализа. Поглощение растворенного 7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазина фиксировали на 373 и 447 нм через каждый интервал времени. Результаты отображены на фиг. 3 и в табл. 1.

Таблица 1 Разложение 7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазина УФ светом (365 нм) в кислом растворе

Время облуче- ния	% от исходного, 373 нм	% от исходного, 447 нм
0	100	100
5	87,3	61,6
10	90,5	76,6
15	100	70

Профиль поглощения для раствора на 373 нм показывает, что по истечении всего периода облучения значительного разложения реагента не наблюдалось. Поглощение света на этой длине волны соответствует электронным переходам п-π*. Отсутствие понижения интенсивности этого пика с течением времени показывает, что кольцевая структура молекулы интактна, несмотря на длительное облучение при этих условиях. Поглощение молекулы на 447 нм происходит вследствие переходов состояния электронов п-π*. Снижение поглощения молекулы на этой длине волны при увеличении периодов времени облучения является показателем едва уловимых изменений в резонансной структуре молекулы. Это изменение, наиболее вероятно, происходит вследствие утраты рибозы кольцевой структурой скелета 7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазином и, в результате, образованием

7,8-диметилаллоксазина. Эти изменения согласуются с литературными данными о поведении этой молекулы при облучении УФ светом. Очевидное отсутствие разложения кольцевой структуры молекулы находится в полном противоречии с наблюдениями, касающимися соединений на основе псоралена, при тех же условиях. Во время облучения наблюдалась значительная флюоресценция этой молекулы в растворе. Это поведение молекулы согласуется с резонансными свойствами кольцевой структуры и обеспечивает средства для рассеяния энергии молекулой в возбужденном состоянии, без ее разрушения.

Пример 4. Принципиальная оценка проточной системы.

Свойства светопропускания существующей кюветы 8рес1га

Существующая кювета 8рее!га изготовлена из поликарбоната. Свойства светопропускания этой кюветы измеряли на 373 и 447 нм путем помещения этой кюветы на пути прохождения света УФ спектрофотометра. Полученные величины были следующие:

Длина волны света	% прохождения
373 нм	66%
447 нм	80%

Эти результаты согласуются с литературными данными по поликарбонатным пластикам (см. фиг. 4). Величины, найденные в литературных источниках, показывают резкий скачок для прохождения света через поликарбонаты на участке спектра 300 нм. Для участка спектра выше 350 нм свойства прохождения света являются адекватными для этого применения.

Требования к световому потоку, рассчитанные в зависимости от скоростей тока жидкости.

Для того чтобы проточная система стала осуществимой, образец должен обеспечиваться адекватным световым потоком при его нахождении на пути лучей. Если предложенная кювета 8рее!га служит этой цели, то существует следующая возможность установления требований к световому потоку в зависимости от скоростей тока жидкости через кювету.

Объем раствора, имеющегося в зоне облучения кюветы, составляет около 0,375 мл. Время прохождения этого участка кюветы для клетки можно определить с помощью следующего уравнения:

_ Объем кюветы (мл) Скорость тока (мл! мин)

При скорости 100 мл/мин время прохождения (Т) составит 0,00375 мин = 0,225 с.

Энергия, действию которой подвергается образец, зависит от потока согласно следующему уравнению:

. 2ч Поток (ф,мВт/см² )*Время(Т ,сек)

Энергия [Е, Джоули/см ) =-------—-----------------------юоо

Если предположить, что для адекватной активации сенсибилизатора требуется 1 Дж/см², а время прохождения (Т) составляет 0,22 с (т.е.

скорость тока жидкости через кювету составляет 100 мл/мин), то требующийся поток во время прохождения образца через кювету составит 4,545 мВт/см². График, изображающий взаимоотношения требующегося потока из источника света и скоростей тока жидкости через кювету, представлен на фиг. 5.

Эти результаты показывают, что для того, чтобы проточная система работала должным образом, требуются источники УФ света с выходами порядка Вт/см².

Фиг. 2 показывает, каким образом поглощение может изменяться в зависимости от концентрации тромбоцитов.

Пример 5. Поглощение эритроцитами.

Чтобы оценить степень, в которой УФ свет может проникать в образец эритроцитов, а также влияние толщины образца и гематокрита на степень проникновения света, было осуществлено несколько предварительных экспериментов с использованием химической актинометрии, способа определения истинного количества интенсивности света, испускаемого источником, путем измерения способности и степени, в которой поглощенный свет может влиять на химическую реакцию. Для этих исследований использовали раствор ферриоксалата с целью измерения интенсивности источника относительно той, что наблюдается в случае воды. Подробности этой химической реакции и способы, применяющиеся для приготовления образца, описаны Оогбоп, Л.Е и Еогб, К.А. (1972) в ТЕе СЕешщГз Сошрашоп: А НапбЬоок оГ Ргасбса1 1)а1а, ТесЕтциез апб КеГегепсез (1Еоп \\'Пеу & 8опз), стр.362-368.

Образцы оксалата железа(111) приготавливались на испытуемом материале (воде или продукте крови с различными величинами гематокрита эритроцитов) с концентрацией 0,15М. Эти образцы затем загружали в стандартную кювету 8рес1га и помещали в блок облучения. Образцы облучали в течение заранее заданных интервалов времени, согласно желаемому уровню дозы энергии (1 Дж/см²). Образцы затем удаляли и определяли количество превращения 3+ р 2+ ге в ге путем считывания поглощения испытуемого вещества в растворе 1,10-фенантролина на 510 нм, как описано Оогбоп, А.Е и Еогб, К.А. выше. Более высокие величины поглощения свидетельствуют о большем проникновении света в образец. Величину поглощения для воды после облучения УФ светом при 1 Дж/см² принимали за 100% уровень коэффициента прохождения. Все величины для образцов эритроцитов определяли относительно этого стандарта.

Таблица 2

Показатели поглощения после облучения образцов УФ светом при 1 Дж/см². Все средние величины представляют среднюю величину по 6 экспериментам. % Величины коэффициентов светопропускания рассчитаны относительно водных образцов

Поглощение на 510 нм	Среднее	Стандартное отклонение	% коэффициента светопропускания	Стандартное отклонение
Вода	2,40	0,04	100	0,0
ККК, гематокрит 1,3%	2,40	0,10	99,5	4,8
ККК, гематокрит 3,7%	1,46	0,38	60,6	15,4
ККК, гематокрит 5,07%	0,20	0,26	8,3	10,8
ККК, гематокрит 6,0%	0,13	0,09	5,2	3,9
ККК, гематокрит 10,2%	0,23	0,19	9,7	7,9
ККК, гематокрит 16,3%	0,25	0,11	10,4	4,6
ККК, гематокрит 21,8%	0,09	0,06	3,6	2,6
ККК, гематокрит 80,2%	0,01	0,11	0,3	4,4

Используя эти величины, возможно рассчитать глубину проникновения УФ света в соответствии с законом Бира (Л=еЬС).

Согласно закону Ламбера

Поглощение = Ьод (1/коэффициент светопропускания)

Предположим, что концентрация (С) равна гематокриту образца, и поскольку Ь = 0,3 см (длина пути в кювете 8рес1га). то возможно определить коэффициент псевдоэкстинкции образцов (е') путем построения графика величин поглощения для образцов эритроцитов в зависимости от длины пути, умноженной на гематокрит. Коэффициент экстинкции для образцов представлен углом наклона этой линии.

Таблица 3

Определение коэффициента экстинкции для образцов эритроцитов

Т	В	НСТ	В*НСТ	Ьод поглощения (1/Т)	е
0,995	0,3	1,3	0,39	0,002	0,0051
0,606	0,3	3,7	1,11	0,218	0,196
0,0525	0,3	6	1,8	1,280	0,71
0,097	0,3	10,2	3,06	1,013	0,33
0,104	0,3	16,3	4,89	0,983	0,20
0,036	0,3	21,8	6,54	1,444	0,22
0,0033	0,3	80,2	24,06	2,481	0,10

Используя величины, полученные, как описано выше, можно было определить коэффициент псевдоэкстинкции этих образцов как 0,08661.

Величина коэффициента экстинкции позволяет произвести расчет расстояния проникновения УФ света в образцы эритроцитов в зависимости от гематокрита образца. Для этой оценки глубину проникновения в образец, в котором будет поглощаться 90% падающего света, определили согласно следующему уравнению:

А = еЬС

А = 1 (90% поглощение падающего света), е = 0,08661, С = гематокрит образца, Ь = длина пути.

Величины, полученные путем актинометрии, сравнивали с рассчитанными ранее с использованием оценок, полученных по УФ спектрофотометрическим измерениям поглощения света в образцах эритроцитов и тромбоцитов.

Фиг. 2 показывает, каким образом поглощение и расстояние от источника света изменяются в случае эритроцитов, сравнивая предсказанные и наблюдаемые величины. Эти результаты показывают, что для образцов с гематокритом в районе 80%, возможно, используя предпочтительную форму настоящего изобретения, направлять свет в образец на глубину 0,14 см. Это представляет собой ширину пути потока, которая составляет менее половины ширины имеющейся в настоящее время кюветы 8рес1га.

Пример 6. Влияние обработки для инактивации вирусов на параметры тромбоцитов ίη νίίΓΟ.

Оценивалось влияние обработки на предмет инактивации вирусов на параметры тромбоцитов ίη νίίτο. Препараты тромбоцитов обрабатывали 1,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазином в комбинации с УФ светом. Различные параметры ίη νίίτο использовали в качестве мониторов функции тромбоцитов, чтобы определить степень изменений, индуцированных условиями обработки. Факторы, такие как уровень энергии УФ света, использованная доза 7,8-диметил-10рибитил изоаллоксазина и условия обработки образца, исследовали на предмет ухудшения ими качества тромбоцитов после обработки. Результаты этого исследования использовали для установления подходящего окна в обработ33 ке, позволяющего инактивировать ВИЧ-1 без нарушения функции тромбоцитов.

Образцы приготавливали с тремя различными концентрациями 7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазина. Для этих исследований использовали тромбоциты, полученные из стандартного сбора 8рес!га РН8.

Исходные образцы центрифугировали для концентрации осадка из тромбоцитов. Этот осадок ресуспендировали в растворе 70:30 (1зо1у!е 8, рН 7,4; МсОа^, 1пс., МеШа: плазма). 7,8Диметил-1 0-рибитил изоаллоксазин в указанной концентрации присутствовал в смеси плазма: среда. Суспензия тромбоцитов затем проходила через камеру УФ облучения с одной из трех указанных скоростей тока жидкости. Скорости тока жидкости непосредственно коррелировали с уровнем энергии, действовавшей на смесь клеток/среды, которая проходила через камеру облучения. После прохождения камеры облучения образцы хранили в мешках для образцов, запечатанных пластиком, которые содержали цитрат, для последующего анализа.

После облучения оценивали ίη νΐΐΓο измерения функции тромбоцитов, включая гипотонический шоковый ответ (Н8К), экспрессию ОМР-140, рН, рСО₂, рО₂, тромбоцитарный завиток и количество клеток, с целью определения влияния процесса обработки на качество клеток.

Качество тромбоцитов наблюдали как функцию от условий облучения (концентрации сенсибилизатора и скоростей тока/уровней энергии). Качество тромбоцитов включает такие параметры, как ИЖ-ответ, активация ОМР-140, и т.п. Изучавшиеся скорости тока жидкости могут относиться к энергии воздействия следующим образом:

Время'прохождения (Т,сек) = Время воздействия =

Р_г = скорость тока жидкости (мл/мин)

0,375 мл = объем кюветы (мл), следова тельно,

Энергия (Е, Джоули/см²) =

Поток (ф, мВт! см²)* Т[сек) ϊοδδ —, «5*0,022

Δ =-----Р_г

Оценивалось влияние энергии УФ облучения и концентрации 7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазина на стабильность и жизнеспособность обработанных тромбоцитов. Оценива ** Поскольку среда разводилась в соотношении 70:30 (среда:плазма), маточные концентрации 7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазина в среде до смешивания с плазмой подбирались соответственно. Это потребовало исходных концентраций в 1зо1у!е 8 - 1,43, 71,4 и 143 мкМ.

Таблица 4

Уровни энергии воздействия в зависимости от скорости тока через камеру облучения

Доставленная энергия, Дж/см²	Скорость тока жидкости, мл/мин	Время обработки для 20 мл, мин
1	16,90	1,18
2	8,45	2,37
3	5,83	3,55
4	4,22	4,73
5	3,38	5,92
6	2,82	7,10
7	2,41	8,29
8	2,11	9,47
9	1,88	10,65
10	1,69	11,84

Поток = 3640 мВт/см²; объем камеры = 0,117 мл.

Величины для обработанных образцов сравнивали с контрольными группами. Контрольные образцы включали следующие:

необработанный образец в плазме (исторический контроль) + ток-УФ-7,8-диметил-10рибитил изоаллоксазин.

Процедура

Нормальный донорский тромбоцитарный продукт афереза получали из ААВВ аккредитованого банка крови. Образец собирали с помощью стандартных процедур 8рес!га ЬК8. Все манипуляции или процедуры, описанные ниже, выполняли с соблюдением всех принятых мер и способов лабораторной безопасности. Номер единицы и тип крови записывались. Все образцы использовали в течение 24 ч после сбора. На всех этапах переноса и обработки образцов соблюдались правила асептики.

Образец переносили в 500 мл емкость из ПВХ и центрифугировали при 5000 х д в течение 5 мин для уплотнения тромбоцитов. Затем удаляли плазму из тромбоцитарного осадка с помощью обычного отжима плазмы. Плазму сохраняли для дальнейшего использования. Плазму, удаленную из клеточного осадка, затем смешивали с маточным раствором 1зо1у!е 8, рН 7,4; МсОа^, 1пс. Этот маточный раствор среды изготавливали путем добавления заранее определенного количества 7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазина к 1зо1у!е 8 с получением конечных концентраций 1,43, 71,4 и 143 мкМ. После добавления 7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазина маточный раствор фильтровали через 0,22 мкм стерильный фильтр. Маточный раствор затем смешивали с аутологичной плазмой в соотношении 70:30 (объем/объем) с получением конечных концентраций 7,8-диметил-10рибитил изоаллоксазина 1, 50 и 100 мкМ соответственно. Во время приготовления маточных ли следующие три уровня энергии и три уровня концентрации:

Уровни энергии: 1, 5, 9 Дж/см²*

Концентрации

7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазина: 1,

50, 100 мкМ** * Уровни общей энергии воздействия определяли по скорости тока суспензии через камеру облучения в соответствии с картой изменений табл. 4.

растворов 7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазина предпринимались меры по избежанию воздействия светом. Были приготовлены следующие образцы:

мкМ 2 образца

100 мкМ 2 образца мкМ 1 образец

Тромбоцитарный осадок затем ресуспендировали в смеси плазма/среда до первоначального объема исходного образца. Образец соединяли с проточным устройством, включающим контейнер для клеток и фотосенсибилизатора, контейнер для среды; причем указанные контейнеры соединялись через линии, снабженные клапанами, с единой линией для смешанных клеток/сенсибилизатора и среды, снабженной насосом. Смешанные клетки/сенсибилизатор и среда выливались в кювету, фиксированную на штативе с зеркальными стенками, которая облучалась источником света. Эта камера облучения была оборудована температурным датчиком. После прохождения через кювету жидкость собирали в мешок для продукта.

Трубопроводную систему первоначально опробовали средой 15о1у1е 8. За пять минут до старта движения испытуемого образца включали источник света. За температурой в течение этого интервала времени наблюдали и поддерживали ее в камере облучения на уровне ниже 32°С.

Скорость тока образца через камеру облучения определяли по карте табл. 4. Скорости тока, которые обеспечивали уровни общей энергии облучения 1, 5 и 9 Дж/см², использовали в соответствии со следующей тест-матрицей.

Прохождение образца № 1: концентрация

7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазина=1 мкМ

A. + 7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазин + 1 Дж/см².

B. + 7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазин + 9 Дж/см².

Прохождение образца № 2: концентрация

7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазина = 100 мкМ

Прохождение образца № 3: концентрация

7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазина = 50 мкМ

А. + 7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазин + 5 Дж/см².

Прохождение образца № 4: контрольный образец, концентрация 7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазина = 0 мкМ

А. + ток-УФ-7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазин.

Все образцы идентифицировали по номеру прохождения через устройство и по буквенному обозначению образца, указывающему условия обработки (т.е. 1А). Каждый вид образца проходил через устройство дважды. Порядок обработки образцов определялся с использованием генератора случайных чисел.

Образец объемом 20 мл на один вид условий прохождения через устройство собирали для каждого образца. Эти образцы собирали в мешки для образцов, запечатанные пластиком, которые содержали цитрат (общий объем 53 мл), и хранили для последующего анализа. Температура образцов и камеры облучения отмечалась в начале, на середине и в конце каждого прохождения образца через устройство.

Первоначальную аликвоту для каждого препарата отбирали для анализа после обработки. Параметры анализа включали содержание клеток, рН, рСО₂, РО₂, тромбоцитарный завиток, Н8К и анализ на СМР-140. Оставшуюся часть образца помещали в переворачивающую мешалку для тромбоцитов в инкубатор при 22°С и хранили в течение пяти дней после обработки. На 5-й день отбирали вторую аликвоту и анализировали ее по тем же ίη νίΐΐΌ параметрам.

Использовалось следующее оборудование. Микроскоп №коп БаЬор1ю1; гематологический анализатор 8егопо-Вакег 8уйет 9000; аналитические весы; инкубатор (+22°С) и ротатор для тромбоцитов; лабораторный холодильник (+4°С); центрифуга М15(га1 30001; анализатор газов крови Согтпд; Флоуцитометр Вес1опЭккшкоп РЛС8СЛЬ1ВиВ; камера УФ облучения; УФ радиометр (ИУХ Рабюте1ег. ИУР, 1пс.); ЕРО8 ИНгасиге 10088 Р1и§ (максимальный выходной сигнал 365 нм и 340 нм полосовые фильтры) и температурный датчик (термопара).

Результаты каждой серии изучавшихся переменных сравнивали с определенными условиями энергии экспозиции и концентрации 7,8диметил-1 0-рибитил изоаллоксазина. Было произведено прямое сравнение с контрольным образцом, не проходившим обработку, и определены достоверные различия, определявшиеся вероятностью р>0,05 по парному одностороннему Т-критерию Стьюдента.

Результаты этих исследований суммируются следующим образом.

1. При концентрациях сенсибилизатора выше 10 мкМ и концентрациях тромбоцитов выше 1,5Е+06/мкл, наблюдалось резкое падение рН в образце на 2-й день. рН постепенно снижалось после 2 дней хранения, достигая неприемлемых уровней (<6,5) на 3-й день хранения. Все остальные параметры ш νίΙΐΌ соответствовали характеру, который наблюдался с рН образца.

2. Это снижение рН образца наблюдалось независимо от того, производилось ли воздействие УФ светом на образец или нет.

3. При концентрациях тромбоцитов 5,4Е+05/мкл не наблюдалось резкого падения рН образца после продолжительного хранения при любой изучавшейся концентрации сенсибилизатора, вплоть до 100 мкМ.

4. При концентрациях сенсибилизатора до 10 мкМ, концентрациях тромбоцитов выше 1,5Е+06/мкл и уровнях УФА до 10 Дж/см² измеренные свойства тромбоцитов были сравнимы с контрольными клетками, не подвергавшимися обработке. Они оставались сравнимыми с контрольными уровнями через 5 дней и более дней хранения после обработки.

Эти исследования функции тромбоцитов после обработки выявили отчетливое окно, в пределах которого свойства клеток сохраняются на уровнях, сравнимых с клетками, не подвергавшимися обработке. Эти результаты показывают также, что путем изменения условий хранения или обработки клеток это окно может быть увеличено. Наблюдавшееся воздействие

7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазина с УФ светом или без него на рН образца наводит на мысль о метаболическом эффекте этого вспомогательного вещества, который может быть смягчен путем изменения условий хранения или обработки образцов.

Пример 7. Измерения касательных напряжений на эритроцитах в зависимости от скорости тока и гематокрита образца.

Низкие уровни проникновения УФ света в образцы эритроцитов с высоким гематокритом сделали необходимым понимание эффектов прохождения эритроцитов через узкие отвер стия на пути света. Уменьшение толщины образцов на пути света должно увеличить доставку дозы УФ в образцы с высоким гематокритом. С целью подтверждения этого подхода было предпринято несколько измерений падения давления с использованием отверстий различных размеров. На линии с перистальтическим насосом выше и ниже (относительно движения жидкости) суженных отверстий были расположены манометры. Цельная кровь с различными значениями гематокрита проходила через отверстия с регулируемой скоростью. Различия показателей давления в обоих местах позволяли производить прямое измерение падения давления вдоль отверстия. С помощью этой величины и размеров отверстия возможно определение касательного напряжения, испытываемого эритроцитами при их прохождении через суженные отверстия, по следующему уравнению:

8ζζ1<2

ΔΡ = —;— Падение давления

4μΟ τ„ =—Касательное напряжение ξ\νά

Для крови:

μ = вязкость = 0,0125/(1-гематокрит); д = гравитационная постоянная = 981;

= скорость тока жидкости = мл/с;

1, б = размеры отверстия, см.

Таблица 5

Измерение касательного напряжения на эритроцитах в зависимости от скорости тока жидкости и гематокрита образца

Гематокрит	Ω	0,08Х 0,008	Падение давления, дины/см²	0,08Х 0,010	Падение давления, дины/см²	0,08Х 0,012	Падение давления, дины/см²
41% НСТ	3,38	1,5	95,9	1,0	77,6	0,0	0,0
64% НСТ	3,38	4,0	255,8	3,0	232,9	2,0	182,1
41% НСТ	16,9	9,7	618,4	7,0	543,4	4,7	425,3
61% НСТ	16,9	20,7	1321,9	12,3	957,2	8,7	789,6

Гематокрит	Ω	0,10Х	Падение давления,	0,1Х	Падение давления,	0,1Х	Падение давления,
0,008	дины/см²	0,010	дины/см²	0,012	дины/см²
41% НСТ	3,38	2,0	93,7	1,0	60,3	0,1	73,5
64% НСТ	3,38	4,5	210,8	3,0	180,9	2,0	146,9
41% НСТ	16,9	12,7	593,6	7,0	422,1	4,7	343,0
61% НСТ	16,9	23,3	1093,0	14,7	884,6	12,0	881,4

Гематокрит	Ω	0,15Х	Падение давления,	0,15Х	Падение давления,	0,15Х	Падение давления,
0,008	дины/см²	0,010	дины/см²	0,012	дины/см²
41% НСТ	3,38	3,0	97,4	1,2	49,2	1,0	49,0
64% НСТ	3,38	6,5	211,0	3,5	143,5	2,0	97,9
41% НСТ	16,9	15,3	497,7	8,3	341,6	5,7	277,6
61% НСТ	16,9	35,7	1158,1	18,0	738,1	12,7	620,4

В предыдущих экспериментах было установлено, что касательные напряжения 10002000 дин/см² для интервалов 1-10 мин или уровни 5000-7000 дин/см² для интервалов приблизительно 10 мс были достаточны для индуцирования гемолиза эритроцитов. Только в случае образца с самым высоким гематокритом (61%) и самой высокой скоростью тока жидкости (16,9) величины действительно превышали

1000 дин/см². Это наблюдалось только для отверстий самой малой ширины (0,008 дюйма ~

0,02 см).

Величины для глубины проникновения света при использовании предложенной конст39 рукции показывают, что доставка энергии УФ, достаточной для запуска процессов инактивации вирусов, может достигаться даже в образцах с высокими значениями гематокрита.

Результаты анализа касательного напряжения в отношении образцов эритроцитов, участвующих в движении жидкости, показывают, что размеры пути потока могут быть значительно сокращены, а скорости тока жидкости могут поддерживаться на высоком уровне без риска развития гемолиза эритроцитов.

Пример 8. Концентрат тромбоцитов смешивали со вспомогательным раствором для тромбоцитов Ио1у!е 8 в соотношении концентрат тромбоцитов: Ио1у!е 8 = 20:80. Смеси концентратов тромбоцитов и вспомогательных растворов для тромбоцитов упоминаются здесь как среды. Концентрат тромбоцитов без вспомогательного раствора упоминается здесь как плазма. Обе были заражены Ык!ет1а топосу!одепек. Затем в каждую добавляли витамин К5 в количестве 300 мкг/мл. Каждую жидкость затем подвергали воздействию УФ, видимого или комнатного света в кюветном устройстве, представленном на фиг. 7, с результатами, представленными в табл. 6.

Таблица 6

	Ьод инактивации (КОЕ/мл)
	К5 в средах	К5 в плазме
УФ, 40 Дж/см²	4,2 Ьод	0,1 Ьод
Видимый свет, 40 Дж/см²	4,2 Ьод	0,1 Ьод
Комнатный свет	0 Ьод	0 Ьод

УФ свет = 365 нм;

Видимый свет = 419 нм;

Патогенный организм = Ык!епа топосу!одепек;

Концентрация К5 = 300 мкг/мл.

Пример 9. Среды и плазму, описанные выше, содержавшие витамин К5, инфицировали бактериями и облучали или только выставляли на комнатный свет (К5-свет), как показано в табл. 7, и оценивали рост бактерий через три дня инкубации. Инактивация некоторых видов наблюдалась в отсутствии облучения.

Таблица 7

	Среды	Плазма
	Уровень инфицирования (КОЕ/мл)	К5+свет	К5-свет	К5+свет	К5-свет
Р.аетидтока	3,4 Ьод	-	-	-	-
8.аитеик	2,1 Ьод	-	-	+	+
8.ер1бетт1б1к	3,2 Ьод	-	+	-	-
Ь.топосу!одепек	3,5 Ьод	-	-	+	+
Е.со11	3,1 Ьод	-	-	+	-

УФ свет = 365 нм, 40 Дж/см² + = Рост наблюдался через три дня инкубации

- = Через три дня инкубации рост не наблюдался Концентрация К5 = 300 мкг/мл

Пример 10. Приготавливали среды, используя концентрат тромбоцитов, как описано выше в примере 8, и Ио1у!е 8 в соотношении Ио1у!е 8:концентрат тромбоцитов = 70:30, с содержанием витамина К5 300 мкг/мл, инфициро вали их несколькими видами бактерий и облучали с уровнями энергии 30 и 60 Дж/см². Инактивация как функция от энергии облучения представлена в табл. 8 и на фиг. 8.

Таблица 8

Энергия, Дж/см²	8.аитеик	8.ер1бетт1б1к	Ь.топосу!одепек	Е.со11
0	4,3	2,6	2,8	3,5
30	3,6	2,7	2	2
60	3,2	2,5	1	1

Пример 11. К концентрату тромбоцитов, как описано в примере 8, и к средам 70:30, как описано в примере 10, добавляли 10 мкМ 7,8диметил-1 0-рибитил изоаллоксазина. Концентрат тромбоцитов и среды инфицировали 8.аитеик или 8.ер1бетт1б1к и облучали при 80 и 30 Дж/см² и определяли инактивацию, как описано выше. Результаты представлены на фиг. 9.

Пример 12. К концентрату плазмы, как описано в примере 8, помещенному в стандартный мешок для крови, добавляли 25 мкМ 7,8диметил-1 0-рибитил изоаллоксазина в порошкообразной форме. Мешок инфицировали бактериями, как показано в табл. 9, встряхивали и подвергали действию облучения 120 Дж/см². Результаты инактивации представлены в табл. 9.

Таблица 9

Патогенный микроорганизм	Ьод инактивации (КОЕ/мл)
З.аигеиз	1,7 Ьод
8.ер1бегт1б18	3,5 Ьод
Р.аегидтоза	3,6 Ьод
Е.со11	4,1 Ьод

Пример 13. К концентрату тромбоцитов, как описано в примере 8, добавляли 7,841 диметил-10-рибитил изоаллоксазин, аллоксазин мононуклеотид или 7,8-диметилаллоксазин, после чего инфицировали 8.аигеиз или 8.ер1бегт1б1з и облучали при 80 Дж/см². Результаты инактивации представлены в табл. 10.

Таблица 10

	I ,оа инактивации (КОЕ/мл)
	81арйу1ососсиз аигеиз	81арЕу1ососсиз ерМегткИз
7,8-диметил- 10-рибитил изоаллоксазин, 10 мкМ	1,9 Ьо§	4,1 Ьо§
Аллоксазин мононуклеотид, 10 мкМ	1,6 Ьод	5,6 Ьод
7,8-диметилаллокса- зин, 7 мкМ	1,6 Ьод	2,9 Ьо§

Пример 14. К концентрату тромбоцитов примера 8 добавляли 10 мкМ 7,8-диметил-10рибитил изоаллоксазина. Аликвоты не содержали вспомогательных веществ, но включали 10 мМ аскорбата или 10 мМ ΚΙ в качестве гасителя или антиоксиданта. Растворы инфицировали Н8У-2, ФХ174, 8.ер1бегт1б1з или. 8.аигеиз и облучали при 80 Дж/см². Результаты представлены на фиг. 10.

Пример 15. К концентрату тромбоцитов примера 8 добавляли 7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазин различных концентраций. Эти растворы инфицировали вирусом герпеса простого типа II (Н8У-П), покрытым оболочкой вирусом с двухцепочечной ДНК. Облучение осуществляли при 80 Дж/см². Этот эксперимент повторяли трижды. Во всех трех испытаниях достигалась полная инактивация. Результаты представлены на фиг. 11.

Пример 16. Осуществлялся протокол примера 15, с использованием 8.ер1бегтИ1з вместо Н8У-П, при энергии облучения 40, 80 и 120 Дж/см². Результаты инактивации представлены на фиг. 12.

Пример 17. Осуществлялся протокол примера 15 с использованием ФХ174, бактериофага с одноцепочечной ДНК при различных концентрациях 7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазина и уровнях энергии облучения. Результаты инактивации представлены на фиг. 13.

Пример 18. К концентратам примера 8 добавляли 10 мкМ 7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазина. Их инфицировали 8.аигеиз или ФХ174 и облучали с различными уровнями энергии облучения смесью 50:50 видимого и ультрафиолетового света. Результаты инактивации представлены на фиг. 14.

Пример 19. Осуществлялся протокол примера 18 с использованием 8.ерИегт1б1з и Н8УII в качестве микроорганизмов. Смесь 50:50 ультрафиолетового и видимого света обеспечивалась источником света ΌΎΜΆΧ. Результаты инактивации представлены на фиг. 15.

Пример 20. К концентрату тромбоцитов примера 8 добавляли 10 мкМ 7,8-диметил-10рибитил изоаллоксазина в порошкообразной форме. Проводили испытания с добавлением и без добавления аскорбата. 150 мл испытуемых растворов помещали в мешок для крови 8рее1га™, встряхивали и подвергали воздействию излучения различных уровней энергии с использованием видимого и ультрафиолетового света в соотношении 50:50. После получения 40 Дж/см² содержимое каждого мешка переносили в новый мешок, чтобы избежать ошибок, связанных с тем, что микроорганизмы могли остаться на отверстии мешка, через которое производилось инфицирование. Результаты инактивации представлены на фиг. 16. Стрелки, направленные вниз, показывают инактивацию до уровня, который было возможно выявить (титр 2,5 1од).

Пример 21. К концентрату тромбоцитов примера 8 и концентрату тромбоцитов в ИоЩе 8 с соотношением 30:70 концентрат тромбоцитов: ИоЩе 8 добавляли 20 мкМ 7,8-диметил-10рибитил изоаллоксазина. Их инфицировали вакцинным вирусом, покрытым оболочкой вирусом с двухцепочечной ДНК и подвергали воздействию видимого света или смешанного (50:50) видимого и ультрафиолетового света с помощью источника УФ света ΌΎΜΆΧ 2000 в течение 30 мин.

Пределы выявления составляли 1,5 1од Результаты инактивации представлены на фиг. 17. Сравнения проводили без использования фотосенсибилизатора с использованием только фотосенсибилизатора в среде Ио1у1е 8, тромбоцитов в среде ИоЩе 8, тромбоцитов в среде ИоЩе 8 с использованием 8-метоксипсоралена вместо

7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазина и концентрата тромбоцитов в среде ИоЩе 8 (30:70).

Пример 22. Образцы концентрата тромбоцитов в среде Ио1у1е 8 30:70, с 10 мкМ 7,8диметил-10-рибитил изоаллоксазина или без него, инфицировали вакцинным вирусом и облучали смесью 50:50 видимого и УФ света при 60 Дж/см² в течение различных периодов времени, а результаты инактивации сравнивали, как показано на фиг. 18.

Пример 23. К образцам концентрата тромбоцитов, как описано в примере 8, добавляли 5 мкМ или 50 мкМ 7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазина. Образцы инфицировали ВИЧ 1. Используя сетку проточной кюветы, показанную на фиг. 7, образцы облучали смесью 50:50 видимого и УФ света при различных уровнях энергии с использованием световой системы ЕЕО8. Результаты инактивации представлены на фиг. 19.

Пример 24. ВИЧ-инфицированные клетки

АСН-2 добавляли к образцам концентрата тромбоцитов, описанного в примере 8. К образцам добавляли 5 или 50 мкМ 7,8-диметил-10рибитил изоаллоксазина. Осуществлялся протокол примера 23, а результаты инактивации представлены на фиг. 20. Наличие ВИЧ анали43 зировали по его фитопатологическому действию на тест-клетки.

Пример 25. Осуществлялся протокол примера 24, а наличие ВИЧ анализировали по количественному определению уровня выработки антигена Р24. Результаты инактивации представлены на фиг. 21.

Пример 26. К образцам концентрата тромбоцитов, как описано в примере

8, и среде, содержащей 30% концентрата тромбоцитов и 70% среды ΡΑ8ΙΙΙ™, добавляли 6 мМ аскорбата и 14 мкМ 7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазина. Образцы инфицировали Н8У-11. Результаты инактивации представлены на фиг. 22 и в табл. 11.

Таблица 11

Время, мин	Энергия (УФ+ВИД) Дж/см²	30:70 КТ:среда 1од титра вируса	Энергия (УФ+ВИД) Дж/см²	90:10 КТ:среда 1од титра вируса
0	0	5,6	0	5,6
1,5	5	2,5	40	3,3
3	10	2,5	80	1,5 вирус не выявлен
4,5	15	2,3	120	1,5 вирус не выявлен
6	20	1,8
9	30	1,6
12	40
24	80
36	120

Специалист без труда поймет, что вышеприведенное описание служит только целям иллюстрации и что может быть осуществлен ряд изменений без отступления от объема настоящего изобретения. Например, могут быть использованы другие фотосенсибилизаторы, предпочтительно такие фотосенсибилизаторы, которые связываются с нуклеиновой кислотой и, таким образом, удерживают ее от репликации и более предпочтительно такие фотосенсибилизаторы, которые не являются токсичными и не имеют токсичных продуктов распада. Помимо этого, специалистами могут быть легко сконструированы структуры, эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, для изготовления проточной системы для деконтаминации жидкостей с помощью фотосенсибилизаторов без излишнего экспериментирования и с использованием идей настоящего изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ обработки жидкости, содержащей один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из белка, крови и заменителей крови, для инактивации микроорганизмов, которые могут в ней присутствовать, включающий:

(a) добавление к указанной жидкости эффективного в отношении инактивации, практически не токсичного количества эндогенного аллоксазинового фотосенсибилизатора или производного аллоксазинового фотосенсибилизатора на эндогенной основе;

(b) воздействие на жидкость стадии (а) световым излучением, достаточным для активации фотосенсибилизатора, посредством чего указанные микроорганизмы инактивируются.
2. Способ по п.1, при котором указанным фотосенсибилизатором является соединение, способное активироваться при воздействии света, продукты светового распада (если они имеются) которого обладают низкой токсичностью или не обладают токсичностью в отношении человека или животных.
3. Способ по п. 1, при котором указанным фотосенсибилизатором является эндогенный аллоксазиновый фотосенсибилизатор, выбранный из группы, состоящей из 7,8-диметил-10рибитил изоаллоксазина, 7,8-диметилаллоксазина, 7,8,10-триметилизоаллоксазина, аллоксазин мононуклеотида, изоаллоксазин-аденин динуклеотида.
4. Способ по п. 1, при котором указанным фотосенсибилизатором является 7,8-диметил1 0-рибитил изоаллоксазин.
5. Способ по п.1, при котором указанные микроорганизмы выбирают из группы, состоящей из бактерий, бактериофагов и внутриклеточных и внеклеточных вирусов.
6. Способ по п.1, при котором указанными микроорганизмами являются бактерии.
7. Способ по п.1, при котором указанные микроорганизмы выбирают из группы, состоящей из вирусов ВИЧ, вирусов гепатита, вируса 8шбЬ18, цитомегаловируса, вируса везикулярного стоматита, вирусов герпеса простого, вакцинного вируса, Т-лимфотропных ретровирусов человека, НТЬУ-Ш, вируса лимфаденопатии ЬАУ/ГОАУ, парвовируса, передающихся через трансфузию вирусов (ТТ), вируса ЭпштейнБарра, бактериофагов ФХ174, Ф6, λ, В17. Т₄ и Т₂, Р.аегидтоза. 8. аигеиз. 8.ер|бегт|фз. Б.топосуЮдепез. Е.сой, К.рпеитошае и
8.татсезсеп8.

8. Способ по п.1, при котором указанное световое излучение представляет собой свет видимой части спектра.
9. Способ по п.1, при котором указанное световое излучение представляет собой свет ультрафиолетовой части спектра.
10. Способ по п.1, при котором указанное световое излучение включает свет как видимой части спектра, так и ультрафиолетовой части спектра.
11. Способ по п. 1, при котором около половины указанного светового излучения представляет свет ультрафиолетовой части спектра и около половины - свет видимой части спектра.
12. Способ по п. 1, при котором указанная стадия воздействия излучением включает также протекание жидкости, содержащей указанный фотосенсибилизатор, мимо источника светового излучения со скоростью и глубиной, выбранными таким образом, чтобы обеспечить проникновение светового излучения через жидкость и инактивацию микроорганизмов.
13. Способ по п. 1, дополнительно включающий содержание указанных жидкостей и фотосенсибилизатора в контейнере, прозрачном для указанного светового излучения и экспонирующем указанную жидкость указанному излучению.
14. Способ по п.13, включающий встряхивание указанного контейнера во время облучения светом.
15. Способ по п. 1, включающий помещение указанной жидкости в контейнер, прозрачный для указанного светового излучения, добавление указанного фотосенсибилизатора к указанной жидкости в порошкообразной форме, встряхивание указанного контейнера и воздействие на указанный контейнер указанным световым излучением.
16. Способ по п. 1, при котором указанная жидкость включает заменители крови.
17. Способ по п. 1, при котором указанная жидкость включает цельную кровь.
18. Способ по п.1, при котором указанная жидкость включает отсепарированный продукт крови.
19. Способ по п.1, при котором указанная жидкость включает тромбоциты, отсепарированные из цельной крови.
20. Способ по п. 1, при котором указанная жидкость включает эритроциты, отсепарированные из цельной крови.
21. Способ по п. 1, при котором указанная жидкость включает сыворотку, отсепарированную из цельной крови.
22. Способ по п. 1, при котором указанная жидкость включает плазму, отсепарированную из цельной крови.
23. Способ по п.1, при котором указанная жидкость включает композицию терапевтического белка.
24. Способ по п. 1, при котором указанная жидкость содержит биологически активный белок, выбранный из группы, состоящей из фактора VIII, фактора фон Виллебранда, фактора

IX, фактора X, фактора XI, фактора Хагемана, протромбина, антитромбина III, фибронектина, плазминогена, белковой фракции плазмы, перитонеальных диализных растворов, сывороточного иммуноглобулина, модифицированного иммуноглобулина, альбумина, плазменного гормона роста, соматомедина, плазминогенстрептокиназного комплекса, церулоплазмина, трансферрина, гаптоглобина, антитрипсина и прекалликреина.
25. Способ по п.1, при котором указанный фотосенсибилизатор добавляют к антикоагулянту и указанный антикоагулянт добавляют к указанной жидкости.
26. Способ по п. 1, при котором усилитель (энхансер) для предотвращения повреждения белка, крови или заместителя крови или для увеличения скорости инактивации микроорганизмов в жидкости добавляют к указанной жидкости до воздействия на указанную жидкость световым излучением.
27. Способ по п. 26, при котором указанный усилитель выбирают из группы, состоящей из аденина, гистидина, цистеина, тирозина, триптофана, аскорбата, Ν-ацетил-Ь-цистеина, пропилгаллата, глутатиона, меркаптопропионилглицина, дитиотреотола, никотинамида, ВНТ, ВНА, лизина, серина, метионина, глюкозы, маннита, тролокса, глицерина и их смесей.
28. Способ обработки жидкости для инактивации микроорганизмов, которые могут в ней присутствовать, включающий:

(a) добавление к указанной жидкости эффективного в отношении инактивации, практически не токсичного количества эндогенного аллоксазинового фотосенсибилизатора или производного аллоксазинового фотосенсибилизатора на эндогенной основе;

(b) воздействие на жидкость стадии (а) световым излучением, достаточным для активации фотосенсибилизатора, посредством чего указанные микроорганизмы инактивируются.
29. Способ по п.28, при котором указанной жидкостью является пищевой продукт.
30. Способ по п.28, при котором указанной жидкостью является напиток для употребления человеком или животными.
31. Способ по п.28, при котором указанной жидкостью является перитонеальный раствор.
32. Жидкость, включающая биологически активный белок, кровь или заменители крови и эндогенный аллоксазиновый фотосенсибилизатор или производное аллоксазинового фотосенсибилизатора на эндогенной основе, обработанная способом по п. 1.
33. Производное продукта крови, содержащее эндогенный аллоксазиновый фотосенсибилизатор или производные аллоксазинового фотосенсибилизатора на эндогенной основе, обработанное способом по п.1.
34. Жидкость, включающая биологически активный белок, кровь или заменители крови, эндогенный аллоксазиновый фотосенсибилизатор или производное аллоксазинового фотосенсибилизатора на эндогенной основе и усилитель (энхансер) для предотвращения повреждения белка, крови или заместителя крови или для увеличения скорости инактивации микроорганизмов в жидкости, обработанная способом по п.1.
35. Система для обработки жидкости с целью инактивации микроорганизмов, которые могут в ней присутствовать, включающая:

(a) контейнер, содержащий указанную жидкость и эндогенный аллоксазиновый фотосенсибилизатор или производное аллоксазинового фотосенсибилизатора на эндогенной основе; причем указанный контейнер оборудован входным устройством и имеет светопроницаемую поверхность, достаточную для осуществления воздействия на находящуюся в нем жидкость световым излучением в количестве, достаточном для активации фотосенсибилизатора;

(b) по меньшей мере, один источник светового излучения для обеспечения достаточного светового облучения жидкости в указанном контейнере, такого типа и количества, которые выбраны для активации фотосенсибилизатора, в результате чего микроорганизмы инактивируются.
36. Система по п.35, в которой указанный источник светового излучения обеспечивает свет видимой части спектра.
37. Система по п.35, в которой указанный источник светового излучения обеспечивает свет ультрафиолетовой части спектра.
38. Система по п.35, в которой, по меньшей мере, один указанный источник светового излучения обеспечивает свет как видимой, так и ультрафиолетовой части спектра.
39. Система по п.35, включающая также усилитель светового излучения.
40. Система по п.39, в которой указанный усилитель светового излучения включает отражающую поверхность.
41. Система по п.35, включающая световод для проведения светового излучения от указанного источника светового излучения к указанному светопроницаемому контейнеру.
42. Система по п.35, включающая также устройство контроля температуры.
43. Система по п.35, включающая также устройство для протекания указанной жидкости в указанный контейнер и из указанного контейнера.
44. Система по п.35, включающая также устройство для встряхивания указанной жидкости в указанном контейнере.
45. Система для инактивации микроорганизмов в жидкости, содержащей такие микроорганизмы, включающая:

(а) устройство для добавления эффективного количества эндогенного аллоксазинового фотосенсибилизатора или производного аллоксазинового фотосенсибилизатора на эндогенной основе к указанной жидкости;

(b) светопроницаемый контейнер для указанной жидкости с жидкостным сообщением с указанным устройством для добавления фотосенсибилизатора, имеющий глубину и длину, подобранные таким образом, чтобы гарантировать воздействие на находящуюся в нем жидкость стадии (а) светового излучения в количестве, достаточном для активации фотосенсибилизатора, при выбранной скорости тока жидкости;

(c) устройство для обеспечения указанной выбранной скорости тока указанной жидкости через указанный контейнер; и (Д) по меньшей мере, один источник светового излучения для обеспечения достаточного светового облучения жидкости в указанном контейнере, типа и в количестве, выбранных для активации фотосенсибилизатора.
46. Система для обработки жидкости с целью инактивации микроорганизмов, которые могут в ней присутствовать, включающая:

(a) аллоксазиновый фотосенсибилизатор в порошкообразной форме;

(b) светопроницаемый контейнер для помещения указанных жидкости и фотосенсибилизатора;

(c) устройства для встряхивания указанного контейнера;

(Д) по меньшей мере, один источник светового излучения для обеспечения достаточного светового облучения жидкости в указанном контейнере, типа и в количестве, выбранных для активации фотосенсибилизатора, в результате чего микроорганизмы инактивируются.
47. Система по п. 46, в которой указанный светопроницаемый контейнер представляет собой прозрачный пластиковый мешок.
48. Система по п.46, в которой указанное средство для встряхивания указанного контейнера включает встряхивающий стол.
49. Система по п.46, в которой указанный светопроницаемый контейнер содержит указанный фотосенсибилизатор еще до добавления указанной жидкости.
50. Способ инактивации микроорганизмов на поверхности, включающий:

(a) нанесение на указанную поверхность эффективного в отношении инактивации количества эндогенного аллоксазинового фотосенсибилизатора или производного аллоксазинового фотосенсибилизатора на эндогенной основе; и (b) воздействие на указанную поверхность световым излучением, достаточным для активации фотосенсибилизатора.
51. Способ по п.50, при котором указанной поверхностью является поверхность пищевого продукта.
52. Способ по п.50, при котором указанной поверхностью является поверхность туши животного.
53. Способ по п.50, при котором указанной поверхностью является поверхность для приготовления пищи.
54. Способ по п.50, при котором указанной поверхностью является поверхность сосуда для купания или мытья.
55. Способ по п.50, при котором указанной поверхностью является поверхность кожи животного.
56. Способ по п.50, при котором указанной поверхностью является раневая поверхность.
57. Способ по п.50, при котором указанный фотосенсибилизатор выбирают из группы, состоящей из 7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазина, 7,8-диметилаллоксазина, 7,8,10триметилизоаллоксазина, аллоксазин мононуклеотида, изоаллоксазин-аденозин динуклеотида.
58. Способ по п.50, при котором указанным фотосенсибилизатором является 7,8диметил-1 0-рибитил изоаллоксазин.
59. Способ по п.50, при котором указанный микроорганизм выбирают из группы, состоящей из бактерий, бактериофагов и вирусов.
60. Водный вспомогательный раствор для тромбоцитов, включающий эндогенный аллоксазиновый фотосенсибилизатор.
61. Вспомогательный раствор для тромбоцитов по п.60, включающий физиологический солевой раствор и буфер.
62. Вспомогательный раствор для тромбоцитов по п. 60, включающий также хлорид магния.
63. Вспомогательный раствор для тромбоцитов по п.60, дополнительно включающий глюконат натрия.
64. Вспомогательный раствор для тромбоцитов по п. 60, в котором указанный фотосенсибилизатор присутствует в концентрации приблизительно от 1 мкМ и до его максимальной растворимости.
65. Вспомогательный раствор для тромбоцитов по п. 64, в котором концентрация указанного фотосенсибилизатора составляет приблизительно 1 0 мкМ.
66. Вспомогательный раствор для тромбоцитов по п.60, имеющий рН приблизительно от 7,0 до 7,4.
67. Вспомогательный раствор для тромбоцитов по п. 60, в котором указанным фотосенсибилизатором является 7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазин.
68. Вспомогательный раствор для тромбоцитов по п.60, включающий хлорид натрия; ацетат натрия; глюконат натрия; хлорид магния; фосфат натрия и 7,8-диметил-10-рибитил изоаллоксазин и имеющий рН приблизительно от 7,0 до 7,4.
69. Вспомогательный раствор для тромбоцитов по п.60, включающий также усилитель (энхансер) для предотвращения повреждения белка, крови или заместителя крови или для увеличения скорости инактивации микроорганизмов в жидкости, выбранный из группы, состоящей из аденина, гистидина, цистеина, тирозина, триптофана, аскорбата, Ν-ацетил-Ьцистеина, пропилгаллата, глутатиона, меркаптопропионилглицина, дитиотреотола, никотинамида, ВНТ, ВНА, лизина, серина, метионина, глюкозы, маннита, тролокса, глицерина и их смесей.
70. Способ обработки жидкости для инактивации микроорганизмов, которые могут в ней присутствовать, включающий:

(a) добавление эффективного в отношении инактивации количества эндогенного аллоксазинового фотосенсибилизатора к указанной жидкости;

(b) воздействие на жидкость на стадии (а) смесью ультрафиолетового света и света видимой части спектра, посредством чего указанные микроорганизмы инактивируются.
71. Способ по п. 70, при котором указанная смесь света представляет собой смесь 50:50 ультрафиолетового света и света видимой части спектра.
72. Способ по п.70, при котором указанным фотосенсибилизатором является нетоксичный эндогенный аллоксазиновый фотосенсибилизатор или производное аллоксазинового фотосенсибилизатора на эндогенной основе.
73. Способ обработки жидкости для инактивации лейкоцитов, которые могут в ней присутствовать, включающий:

(a) добавление эффективного в отношении инактивации, практически не токсичного количества эндогенного аллоксазинового фотосенсибилизатора или производного аллоксазинового фотосенсибилизатора на эндогенной основе к указанной жидкости;

(b) воздействие на жидкость стадии (а) световым излучением, посредством чего указанные лейкоциты инактивируются.
74. Способ по п.73, при котором указанная жидкость включает кровь или компонент крови.