ES2201093T3

ES2201093T3 - Dispositivo y procedimiento para fotoactivacion.

Info

Publication number: ES2201093T3
Application number: ES95902453T
Authority: ES
Inventors: George D. Cimino; Romilly John Simms
Original assignee: Cerus Corp
Current assignee: Cerus Corp
Priority date: 1993-11-10
Filing date: 1994-11-03
Publication date: 2004-03-16
Anticipated expiration: 2014-11-03
Also published as: AU1172195A; EP0727938A1; ATE242960T1; JP3677287B2; JPH09511152A; DE69432832T2; WO1995012973A1; EP0727938B1; CA2176258C; CA2176258A1; DE69432832D1; EP0727938A4

Abstract

SE DESCRIBEN METODOS Y COMPOSICIONES PARA EL TRATAMIENTO DE LOS CONTAMINANTES PRESENTES EN UN MATERIAL PENSADO PARA SU USO IN VIVO, Y EN PARTICULAR EN LA SANGRE Y PRODUCTOS DERIVADOS DE LA SANGRE DE USO HUMANO. LOS CONTAMINANTES PRESENTES EN LAS PREPARACIONES DE CELULAS SANGUINEAS SE INACTIVAN ANTES DE SU ALMACENAMIENTO A LARGO PLAZO Y TRANSFUSION. LA INACTIVACION SE CONSIGUE MEDIANTE LA UTILIZACION DE UN DISPOSITIVO QUE TIENE UN DISEÑO UNICO DE CONTROL DE LA TEMPERATURA.

Description

Dispositivo y procedimiento para fotoactivación.

Campo de la invención

La presente invención trata de modo general un dispositivo y un procedimiento para el tratamiento de los componentes sanguíneos en bolsas sanguíneas.

Antecedentes

Toda la sangre recogida de donantes voluntarios para receptores de transfusión normalmente se separa en sus componentes: glóbulos rojos, plaquetas, y plasma. Cada una de estas fracciones se almacena individualmente y se usa para tratar una multiplicidad de dolencias específicas y estados de enfermedad. Por ejemplo, el componente glóbulos rojos se usa para tratar anemia; el componente concentrado de plaquetas se usa para controlar el sangrado; y el componente plasma se usa frecuentemente como una fuente del factor VIII de la coagulación para el tratamiento de hemofilia.

Idealmente, todas las preparaciones de células sanguíneas deberían provenir de sangre extraída recientemente y entonces trasfundirse inmediatamente al receptor. Sin embargo, la logística de actuación de un centro de donantes de sangre impide esta posibilidad en la gran mayoría de los casos. Las transfusiones se necesitan día y noche y es difícil, si no imposible, organizar el reclutamiento de donantes a horas inusuales. Consecuentemente, los centros de donantes de sangre modernos deben usar productos sanguíneos almacenados.

En los Estados Unidos, los procedimientos de almacenamiento de sangre están sujetos a la regulación del gobierno. Los periodos máximos de almacenamiento para los componentes sanguíneos recogidos en estos sistemas están prescritos específicamente. Por ejemplo, todos los componentes sanguíneos recogidos en un sistema "abierto" (por ejemplo, no estéril) deben, según las normas gubernamentales, ser transfundidos en veinticuatro horas y en la mayoría de los casos dentro de seis a ocho horas. En contraste, cuando todos los componentes sanguíneos se recogen en un sistema "cerrado" (por ejemplo, estéril) los glóbulos rojos se pueden almacenar hasta cuarenta y dos días (dependiendo del tipo de anticoagulante y del medio de almacenamiento usado) y el plasma se puede congelar y almacenar durante periodos aún más largos.

Murphy y Gardner, New Eng. J. Med. 280; 1.094 (1.969), demostraron que las plaquetas almacenadas como plasma rico en plaquetas (PRP) a 22ºC presentaban una mayor vida media in vivo que aquellas almacenadas a 4ºC. Así, se podrían transfundir concentrados de plaquetas más aceptables después de almacenarlos a temperatura ambiente. Hasta hace poco tiempo, las normas permitían el almacenamiento de concentrados de plaquetas a temperatura ambiente hasta siete días (dependiendo del tipo de contenedor de almacenamiento). Sin embargo, se reconoció que la incidencia de crecimiento bacteriano y las consiguientes reacciones a la transfusión se incrementaban en el receptor hasta niveles inaceptables con un concentrado de plaquetas de siete días. Los concentrados de plaquetas no se pueden almacenar ahora durante más de cinco días.

Los bolsas sanguíneas usadas para las preparaciones de los concentrados de plaquetas son estériles, como lo son las bolsas satélite conectadas. Se podría pensar, por tanto, que mantener la preparación sanguínea estéril durante las manipulaciones necesarias para concentrar las plaquetas es un hecho relativamente sencillo. Sin embargo, las bacterias se pueden introducir al menos por dos medios distintos. Primero, si el donante está sufriendo una ligera bacteremia, la sangre estará contaminada, independientemente del procedimiento de recogida o el de almacenamiento. Los donantes con historiales y físicos adecuados disminuirán pero no eliminarán este problema. Véase B. J. Grossman y colaboradores, Transfusión 31; 500 (1.991). Una segunda fuente de contaminación, más persistente, es la venepuntura. Incluso cuando se emplean procedimientos de preparación de piel "estériles", es extremadamente difícil esterilizar las criptas que rodean las glándulas sudoríparas y los folículos capilares. Durante la venepuntura, esta piel contaminada se corta a menudo en un pequeño "núcleo" mediante una aguja fina. Este núcleo puede servir para "sembrar" la bolsa sanguínea con bacterias que pueden crecer y convertirse en un riesgo para el receptor.

De hecho, muchos pacientes que necesitan transfusiones de plaquetas carecen de mecanismos de defensa contra el hospedador para la compensación normal y la destrucción de la bacteria debido bien a la quimioterapia o bien a una enfermedad hematológica básica. El crecimiento de organismos aparentemente inocuos en plaquetas almacenadas puede, tras la transfusión, provocar la reacción y la muerte del receptor. Véase, por ejemplo, B. A. Myhre JAMA 244; 1.333 (1.980), J. M. Heal y colaboradores, Transfusion 27; 2 (1.987).

Los informes que determinan el grado de contaminación en plaquetas difieren en sus procedimientos, tamaño de muestra, y en los sistemas de detección bacteriana. D. H. Buchholz, y colaboradores, Transfusion 13; 268 (1.973) señalaban un nivel total de contaminación de las plaquetas del 2,4% cuando se examinó una muestra mayor (>1000 bolsas) y se tomaron medidas más exhaustivas para el cultivo bacteriano. Mientras que algunas unidades estaban altamente contaminadas después de sólo 24 horas de almacenamiento, la incidencia total variaba de acuerdo con la edad del concentrado y se incrementaba con la práctica extendida de juntar unidades individuales; alrededor del 30% de los fondos estaban contaminados a los 3 días. Véase también D. H. Buchholz, y colaboradores, New Eng. J. Med. 285; 429 (1.971). Mientras otros estudios clínicos sugieren números inferiores, estudios recientes indican las transfusiones sépticas de plaquetas están significativamente sin contabilizar. Véase por ejemplo, J. F. Morrow y colaboradores, JAMA 266; 555 (1.991).

Las plaquetas precultivadas no son una solución al problema de la contaminación bacteriana. El ensayo de cultivo lleva 48 horas para detectar el crecimiento. El mantenimiento de las unidades de plaquetas durante dos días más para esperar los resultados del ensayos crearía, irónicamente, un menor margen de seguridad. Véase Tabla 2 en J. F. Morrow y colaboradores, JAMA 266; 555 (1.991). Mientras que las unidades altamente contaminadas se detectarían a la salida, las unidades ligeramente contaminadas se dejarían crecer durante dos días. Las unidades más antiguas y potencialmente más contaminadas al final serían transfundidas.

Lavar las células sanguíneas (por ejemplo con disoluciones salinas) o filtrar las bacterias tampoco son soluciones prácticas. Estas técnicas consumen tiempo y son ineficaces, ya que pueden reducir el número de células sanguíneas viables disponibles para la transfusión. De mayor importancia, es que típicamente implican una "entrada" en el sistema de almacenamiento. Una vez que se ha hecho una entrada en un sistema previamente cerrado, el sistema se considera "abierto" y la transfusión se debe realizar rápidamente, sin tener en cuenta la manera en que se recogió la sangre y se procesó en primer lugar.

Tampoco los antibióticos son una solución razonable. La contaminación se produce por un amplio espectro de organismos. Serían necesarios los antibióticos para cubrir este espectro. Muchos receptores son alérgicos a los antibióticos. Además, hay una serie creciente de cepas de bacterias resistentes a fármacos que no se inactivarían.

Recientemente ha habido interés en la inactivación de patógenos en sangre usando compuestos fotorreactivos, tales como psoralenos. Los psoralenos son compuestos tricíclicos formados por la condensación lineal de un anillo furano con una cumarina. Los psoralenos se pueden intercalar entre los pares de bases de los ácidos nucleicos de doble cadena, formando aductos covalentes con las bases de pirimidina por absorción de luz ultravioleta (UVA) de larga longitud de onda. G. D. Cimino y colaboradores, Ann. Rev. Biochem. 54; 1.151 (1.985). Hearst y colaboradores, Quart. Rev. Biophys. 17; 1 (1.984). Si hay una segunda pirimidina adyacente a un monoaducto de psoralenpirimidina y en la cadena opuesta, la absorción de un segundo fotón puede conducir a la formación de un diaducto que funciona como un entrecruzamiento intercatenario. S. T. Isaacs y colaboradores, Biochemistry 16, 1.058 (1.977). S. T. Isaacs y colaboradores, Trends in Photobiology (Plenum) pp. 279-294 (1.982). J. Tessman y colaboradores, Biochemistry 24; 1.669 (1.985). Hearst y colaboradores, Patentes de EE.UU. Nos. 4.124.589, 4.169.204 y 4.196.281.

Se ha visto que los psoralenos inactivan virus en algunos productos sanguíneos. Véase H. J. Alter y colaboradores, The Lancet (II, 446) (1.988). L. Lin y colaboradores, Blood 74; 517 (1.989). G. P. Weisehahn y colaboradores, Patentes U.S. Nos. 4.727.027 y 4.748.120 describen el uso de una combinación de 8-metoxipsoraleno (8-MOP) e irradiación. Muestran que 300 \mug/ml de 8-MOP junto con una hora o más de irradiación con luz ultravioleta pueden inactivar efectivamente virus. Sin embargo, estas condiciones de tratamiento provocan daños al producto sanguíneo debido a la transferencia de energía. Su aproximación sólo es factible si se suprime específicamente el daño a las células mediante la limitación de la concentración del oxígeno molecular, un procedimiento difícil y caro.

Los isopsoralenos, al igual que los psoralenos, son compuestos tricíclicos formados por la fusión de un anillo furano con una cumarina. Véase Baccichetti y colaboradores, Patente de EE.UU. No. 4.312.883. F. Bordin y colaboradores, Experientia 35; 1.567 (1.979). F. Dall´Acqua y colaboradores, Medecine Biologie Envir. 9; 303 (1.981). S. Caffieri y colaboradores, Medecine Biologie Envir. 11; 386 (1.983). F. Dall'Acqua y colaboradores, Photochem Photobio. 37; 373 (1.983). G. Guiotto y colaboradores, Eur. J. Med. Chew-Chim. Ther. 16; 489 (1.981). F. Dall'Acqua y colaboradores, J. Med. Chem. 24; 178 (1.984). A diferencia de los psoralenos, los anillos del isopsoraleno no están unidos linealmente. Mientras que son capaces de intercalarse entre los pares de bases de los ácidos nucleicos de doble cadena y formar aductos covalentes con las bases de los ácidos nucleicos por absorción de luz ultravioleta de larga longitud de onda, los isopsoralenos, debido a su geometría angular, normalmente no pueden formar entrecruzamientos con el ADN. Véase de manera general, G. D. Cimino y colaboradores, Ann. Rev. Biochem., 54, 1.151 (1.985).

Hay dispositivos empleados actualmente que emiten radiación ultravioleta para activar psoralenos y otros compuestos fotoactivos. Patente de EE.UU. No. 5.184.020, por Hearst y colaboradores, describe un dispositivo para la fotoactivación de psoralenos. Sin embargo, el dispositivo descrito está diseñado para la irradiación de muestras en tubos como vasos. No describe un dispositivo para usarlo sobre bolsas sanguíneas. Además, aunque la patente describe un sistema de refrigeración para las muestras irradiadas, este sistema no funcionaría para bolsas sanguíneas porque depende de la circulación de fluido alrededor de los vasos de muestra.

Los documentos WO-A-93/17.553 y WO-A-94/03.054 describen un dispositivo que emite radiación ultravioleta para la activación de psoralenos. Este dispositivo comprende: a) medios para proporcionar la longitud de onda adecuada de radiación electromagnética para producir la activación de al menos un compuesto fotorreactivo; b) medios para soportar una pluralidad de productos sanguíneos en una relación fija con los medios que proporcionan la radiación durante la activación; y c) medios para el mantenimiento de la temperatura de los productos sanguíneos dentro de un intervalo de temperatura deseado durante la activación tal como un ventilador o un intercambiador de calor.

Otros dispositivos no son adecuados para la activación de psoralenos, pero se pueden usar para otros propósitos con bolsas sanguíneas. Por ejemplo, las Patentes de EE.UU. Nos. 4.726.949 y 4.866.282 por Miripol, describen un dispositivo de irradiación para su uso en la prevención de la aloinmunización. Este dispositivo no es práctico para usarlo en laboratorios que procesarán grandes cantidades de sangre para su esterilización. El dispositivo solamente soporta un contenedor de sangre, que supondría un cuello de botella en el procesamiento de la sangre. (Véase figura 1, ref. no. 10, de cualquier patente Miripol). Además, proporciona radiación de una longitud de onda de 280 a 320 nanómetros, incluyendo la banda 313, (véase reivindicación 1 de la patente 4.866.282) a la cual los ácidos nucleicos absorben radiación y podrían resultar dañados. El intervalo UVB también puede destruir la función plaquetaria. Las patentes Miripol establecen que las fuentes del intervalo UV-A "no proporcionan una buena reducción del efecto de la aloinmunización de los linfocitos". Columna 2, líneas 61-64, de 4.726.949. Finalmente, las patentes Miripol describen el uso de sólo un medio para la refrigeración del sistema durante la irradiación, un ventilador extractor. El objetivo en aquellas patentes es mantener la temperatura a 31 grados C o menos. Columna 3, líneas 44-46. Sin embargo, actualmente las plaquetas se almacenan a 22-24 grados C. G. Stack y L. Snyder, "Storage of Platelet Concentrate", Blood Separation and Platelet Fractionation, pp. 9-125 (1.991 Wiley-Liss, Inc.).

Por último, hay dispositivos descritos que no serían apropiados ni para la activación de psoralenos ni para otros usos en productos sanguíneos. Patente de EE.UU. No. 4.421.987, por Herold, describe un aparato para irradiar objetos dentales que emplea radiación en el intervalo del espectro de 400 a 500 nanómetros, para tratamientos blanqueantes de partes dentales. El dispositivo se ajusta con un reflector selectivo que refleja solamente la fracción espectral que cae en el intervalo espectral deseado (aproximadamente 400 a 500 nm) de la radiación total emitida por la lámpara mientras que trasmite o deja pasar la fracción de radiación que cae fuera del intervalo espectral deseado. El dispositivo también tiene un sistema de control de temperatura, empleando la combinación de una soplante con un filtro de absorción que, como el reflector, elimina la radiación fuera del intervalo espectral deseado. Este aparato no satisface el presente propósito de un tratamiento de fotodescontaminación, porque está diseñado para su uso con longitudes de onda de luz que son dañinas para algunos componentes sanguíneos, mientras que elimina longitudes de onda necesarias para activar ciertos compuestos fotorreactivos. Además, no está equipado con un sistema de mantenimiento de temperatura que mantendría la temperatura de las muestras de sangre lo suficientemente baja para prevenir daños.

En suma, hay una necesidad de un medio para inactivar las bacterias en los componentes sanguíneos previo al almacenamiento y la transfusión de manera que se preste para su uso en un sistema cerrado, tal como un sistema de bolsas sanguíneas. Esta aproximación debe ser capaz de manejar un gran volumen de sangre y una variedad de organismos mientras controle efectivamente la temperatura y evite el daño al producto sanguíneo o al receptor de la transfusión.

Resumen de la invención

La presente invención trata de un dispositivo y un procedimiento para el tratamiento de componentes sanguíneos en bolsas sanguíneas como se define en las reivindicaciones. Específicamente, la presente invención contempla un dispositivo para la fotoactivación de compuestos nuevos y compuestos conocidos de manera que se unan e inactiven patógenos presentes en la sangre. De acuerdo con la presente invención, se emplea selectivamente un compuesto de unión a ácido nucleico para tratar la contaminación por microorganismos.

En una forma de realización, la presente invención contempla: un dispositivo de fotoactivación para la inactivación de patógenos en productos sanguíneos, que comprende:

: a) una carcasa; b) medios para proporcionar radiación electromagnética que comprenden una pluralidad de bombillas tubulares; c) medios para soportar una pluralidad de bolsas sanguíneas a una distancia fija de dichos medios que proporcionan la radiación; d) medios para el mantenimiento de la temperatura de los productos sanguíneos dentro de un intervalo de temperatura deseado caracterizado en que un borde se envuelve alrededor de los extremos de las bombillas tubulares para obstruir estos extremos de la fuente de radiación electromagnética de las bolsas sanguíneas de irradiación en el dispositivo. El dispositivo puede comprender un ensamblaje de placa inferior transparente a la luz ultravioleta dentro de dicha carcasa, sobre las que dichas bolsas sanguíneas se pueden apoyar; y un ensamblaje de placa superior transparente a la luz ultravioleta, colocada encima de dicho ensamblaje de placa inferior, dichos ensamblajes de placa superior e inferior definiendo un canal, aislado de intercambios significativos con el aire originado fuera de dicha carcasa durante la irradiación, en la cual el aire se puede circular para enfriar dichas bolsas sanguíneas. En otra forma de realización, dicho ensamblaje de placa inferior comprende una placa en la parte superior y en la parte inferior y una cámara de circulación de aire entre dichas placas en la parte superior y en la parte inferior, abierta a dicho canal para permitir el intercambio de aire entre dicha cámara de circulación de aire y dicho canal.

En otra forma de realización, el dispositivo además comprende: primero medios para el mantenimiento de la temperatura, que comprende: medios para bombear el aire desde fuera, a través de dicha carcasa, entre dichos medios que proporcionan la irradiación y dichos ensamblajes de placas, colocados dentro y adyacentes a dicha carcasa, para refrigerar dichos medios que proporcionan la irradiación; y segundo medios para el mantenimiento de la temperatura, colocados dentro de dicha carcasa, para la circulación del aire frío a través de dicha cámara de circulación de aire frío a través de dicha cámara de circulación de aire y dicho canal, que comprenden: un intercambiador de calor, entre dichos ensamblajes de placa, para eliminar el calor proveniente del aire presente en dicha carcasa, y; medios para la circulación de aire, colocados en una relación fija a dicho intercambiador de calor. En una forma de realización, dicho intercambiador de calor comprende un conducto que tiene un puerto de entrada y un puerto de salida de manera que el líquido de control de la temperatura pueda entrar y salir. En una forma de realización, dichos ensamblajes de la placa superior e inferior están separados por aproximadamente entre 1 y 10 cm. Sin embargo, se prefiere que cuando dichas bolsas sanguíneas se apoyen sobre dicho ensamblaje de placa inferior, dicho ensamblaje de placa superior no contacte con dichas bolsas sanguíneas.

Debido a los beneficios del procesamiento rápido, en una forma de realización contemplada dicho ensamblaje de placa inferior tiene dimensiones suficientes para soportar seis de dichas bolsas sanguíneas. Dichos medios de soporte de bolsas sanguíneas puede comprender además medios para colocar una pluralidad de accesorios conectados a dichas bolsas sanguíneas, de manera que dichos accesorios no reducen significativamente la intensidad de radiación sobre dichas bolsas sanguíneas, incluyendo tubos para transferir un producto sanguíneo dentro o fuera de dichas bolsas sanguíneas y bolsas de almacenamiento de productos sanguíneos. El dispositivo puede comprender además medios para la agitación de dichos medios de soporte de las bolsas sanguíneas, que puede comprender una pluralidad de detectores, colocados adyacentes a dichos medios de soporte de las bolsas sanguíneas, para la mezcla de una muestra en una bolsa sanguínea durante la irradiación. La presente invención contempla que dicho ensamblaje de placa inferior tiene una superficie superior estriada para mantener la posición de dichas bolsas sanguíneas durante la agitación.

En una forma de realización preferida, dicha carcasa comprende materiales que obstruyen dichas radiaciones electromagnéticas de manera que los usuarios están protegidos de dichas radiaciones electromagnéticas durante dicha activación. También se contempla un medio para controlar dichos medios que proporcionan radiación, que puede comprender una pluralidad de detectores, colocados alrededor de dichos medios que proporcionan radiación, para medir dicha radiación electromagnética; y un control de retroalimentación, conectado a dichos detectores, que corta dichos medios que proporcionan radiación a una salida deseada de radiación detectada por dichos detectores. Preferiblemente, la intensidad de la radiación proporcionada por dichos medios que proporcionan radiación es de al menos 15 mW/cm^{2}, y dichos medios que proporcionan radiación tienen el límite de longitud de onda máxima por encima de los 400 nanómetros. Adicionalmente, se contempla que los ensamblajes de placa superior e inferior están compuestos de un material que filtra dicha radiación electromagnética para proporcionar el límite de longitud de onda mínima por debajo de los 320 nanómetros.

Los medios que proporcionan radiación además pueden comprender un banco superior y un banco inferior de fuentes de luz, dicho banco superior está localizado por encima de dicho ensamblaje de placa superior, y dicho banco inferior está localizado por debajo de dicho ensamblaje de placa inferior. Los medios reflectantes, adyacentes a dicho banco superior y dicho banco inferior de fuentes de luz, también se contempla que reflejen la radiación electromagnética de dichas fuentes de luz hacia dichos medios de soporte de las bolsas sanguíneas.

La presente invención contempla un dispositivo de fotoactivación que comprende medios para controlar dichos medios que proporcionan radiación. Los medios para controlar dichos medios que proporcionan radiación pueden comprender: una pluralidad de detectores colocados alrededor de dichos medios que proporcionan radiación, para medir dicha radiación electromagnética; y un control de retroalimentación conectado a dichos detectores, que corta dichos medios que proporcionan radiación a una salida deseada de radiación detectada por dichos detectores. En una forma de realización preferida, la intensidad de la radiación proporcionada por dichos medios que proporcionan radiación es de al menos 15 mW/cm^{2} y dichos medios que proporcionan radiación tienen el límite de longitud de onda máxima por encima de los 400 nanómetros.

En una forma de realización, dichos ensamblajes de placa están compuestos de un material que elimina las radiaciones de longitudes de onda que dañan los productos sanguíneos de dicha radiación electromagnética. Específicamente, se contempla que dichos materiales filtren dicha radiación electromagnética para proporcionar el límite de longitud de onda mínima por debajo de los 320 nanómetros. También se contempla que dichos medios que proporcionan radiación comprenden un banco superior y un banco inferior de fuentes de luz, dicho banco superior está localizado por encima de dicho ensamblaje de placa superior, y dicho banco inferior está localizado por debajo de dicho ensamblaje de placa inferior. Los medios reflectantes pueden estar colocados adyacentes a dicho banco superior y dicho banco inferior de fuentes de luz, que reflejan la radiación electromagnética de dichas fuentes de luz hacia dichos medios de soporte de las bolsas sanguíneas.

La presente invención también contempla un procedimiento para la fotoactivación de compuestos fotorreactivos, que comprende:

: a) proporcionar: i) una bolsa sanguínea que contenga uno o más compuestos fotorreactivos y un componente sanguíneo sospechoso de contener un patógeno y ii) un dispositivo de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4; b) colocar dicha bolsa sanguínea en dicho dispositivo; y c) irradiar dicha bolsa sanguínea con dicha fuente de radiación electromagnética para activar al menos uno de dichos compuestos fotorreactivos e inactivar dicho patógeno.

Preferiblemente, la fuente fluorescente de radiación electromagnética entrega una intensidad de radiación electromagnética mayor que 1 mW/cm^{2} a dichas bolsas sanguíneas.

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Descripción de las figuras

La Figura 1 es una vista en perspectiva de una forma de realización del dispositivo de la presente invención en la posición cercana.

La Figura 2 es una vista de la sección transversal del dispositivo mostrado en la Figura 1, en posición abierta, desde el principio de 2-2.

La Figura 3 es una vista de la sección transversal del dispositivo mostrado en la Figura 1 desde el principio de 3-3.

La Figura 4 es una vista de la sección transversal del dispositivo mostrado en la Figura 1 desde el principio de 4-4.

La Figura 5 muestra esquemáticamente la aproximación descontaminante de la presente invención aplicada específicamente a productos sanguíneos.

La Figura 6 es un gráfico mostrando la fotoactivación del 8-metoxipsoraleno al ácido nucleico.

La Figura 7 es un gráfico mostrando la degradación del 8- metoxipsoraleno (8-MOP) comparado con el 4'-aminometil-4,5',8-trimetilpsoraleno (AMT), como se obtiene por HPLC.

Descripción de la invención

La presente invención trata de un dispositivo y un procedimiento para el tratamiento de los componentes sanguíneos en bolsas sanguíneas como se define en las reivindicaciones.

Como se ha observado previamente, toda la sangre se recoge y habitualmente se separa en glóbulos rojos, plaquetas, y plasma. Cada una de estas fracciones se almacena individualmente bajo condiciones específicas previas a su uso en vivo. En muchos casos, el grado de contaminación está relacionado con el tiempo de almacenamientos debido al crecimiento. Un procedimiento que inactivase los microorganismos en el momento de recogida de la sangre se esperaría que previniese el crecimiento durante el almacenamiento.

TABLA 1

Compuestos Fotorreactivos

Actinomicinas

Antraciclinonas

Antramicina

Benzodipironas

Fluorenos y fluorenonas

Furocumarinas

Mitomicina

Azul Rápido Monostral

Norfilina A

Muchos tintes orgánicos no listados específicamente

Fenantridinas

Sales de Fenazationio

Fenazinas

Fenotiazinas

TABLA 1 (continuación)

Compuestos Fotorreactivos

Fenilazidas

Quinolinas

Tiaxantenonas

"Compuestos de fotoactivación" (o "compuestos fotorreactivos") define una familia de compuestos que experimenta cambios químicos en respuesta a radiación electromagnética (Tabla 1). Una especie de compuestos fotorreactivos descrita aquí es comúnmente denominada como las furocumarinas. Las furocumarinas pertenecen a dos categorías principales: 1) psoralenos [7H-furo(3,2-g)-(1)-benzopiran-7-ona, o \delta-lactona del ácido 6-hidroxi-5-benzofuranacrílico], que son lineales;

1

y en los que los dos residuos oxígeno añadidos a la fracción aromática central tienen una orientación 1,3 y además en los que la fracción del anillo furano está unida a la posición 6 de los dos anillos del sistema cumarina, y 2) los isopsoralenos [2H-furo(2,3-h)-(1)-benzopiran-2-ona, o \delta-lactona del ácido 4-hidroxi-5-benzofuranacrílico], que son angulares;

2

en los que los dos residuos oxígeno añadidos a la fracción aromática central tienen una orientación 1,3 y además en los que la fracción del anillo furano está unida a la posición 8 de los dos anillos del sistema cumarina. Los derivados de los psoralenos están derivados de la sustitución de la furocumarina lineal en las posiciones 3, 4, 5, 8, 4', ó 5', mientras que los derivados de los isopsoralenos están derivados de la sustitución de la furocumarina angular en las posiciones 3, 4, 5, 6, 4' ó 5'.

En una forma de realización, la presente invención contempla la inactivación de productos sanguíneos tras la separación pero antes del almacenamiento. En esta forma de realización, se emplea selectivamente un compuesto de unión a ácido nucleico para tratar la contaminación por microorganismos.

En una forma de realización, el compuesto de unión al ácido nucleico se selecciona del grupo que comprende furocumarinas. En una forma de realización preferida, la furocumarina es un psoraleno o un isopsoraleno.

El procedimiento de inactivación de la presente invención proporciona un procedimiento de inactivación de organismos unicelulares y pluricelulares, y en particular, bacterias, hongos, micoplasmas y protozoos. En contraste con aproximaciones previas, el procedimiento de la presente invención no daña los productos sanguíneos. No hay daños significativos a las células y, por tanto, no es necesario limitar la concentración de oxígeno molecular.

La presente invención contempla el uso de concentraciones mucho menores de compuestos de unión a ácidos nucleicos que los empleados previamente. Por ejemplo, la presente invención contempla el uso de 8-MOP a concentraciones de 30 \mug/ml o inferiores. De hecho, una concentración preferida de 8-MOP para la descontaminación bacteriana en concentrados de plaquetas es 3 \mug/ml o inferior, por ejemplo una concentración cien veces menor que la empleada por G. P. Wiesehahn y colaboradores, supra.

La presente invención, además, contempla el uso de menores dosis de irradiación que las previamente descritas. Esto se logra con fuentes de irradiación de menor intensidad, con filtros que limiten longitudes de onda (véase posteriormente), y/o periodos de irradiación más cortos. En una forma de realización preferida, el tiempo de irradiación es variable y es controlado desde 1 segundo a 99 minutos, en incrementos de un segundo.

Mientras que no se intenta que la presente invención esté limitada por la teoría de inactivación, el uso de concentraciones de compuestos y dosis de irradiación inferiores se entiende que, donde la presente invención se aplica a la descontaminación de un organismo unicelular o pluricelular (al contrario que un virus), un menor nivel de unión a los ácidos nucleicos logrará la inactivación. Además, se reconoce que no es esencial que la inactivación sea completa. Es decir, la inactivación parcial será adecuada mientras la porción viable sea incapaz, dentro del periodo de almacenamiento, de crecer a niveles suficientes para causar enfermedad.

Para apreciar que, en cualquier caso dado, un procedimiento de inactivación puede alcanzar o no la inactivación completa, es útil considerar un ejemplo específico. Se dice que un cultivo bacteriano está esterilizado si una alícuota del cultivo, cuando se transfiere a una placa de cultivo fresco y se permite que crezca, es indetectable tras cierto periodo de tiempo. El periodo de tiempo y las condiciones de crecimiento (por ejemplo, la temperatura) definen un "factor de amplificación". Este factor de amplificación junto con las limitaciones del procedimiento de detección (por ejemplo, inspección visual de la placa de cultivo para la aparición de una colonia bacteriana) define la sensibilidad del procedimiento de inactivación. Se debe aplicar un número mínimo de bacterias viables a la placa como una señal para ser detectable. Con el procedimiento de detección óptimo, este número mínimo es 1 célula bacteriana. Con un procedimiento de detección subóptimo, el número mínimo de células bacterianas aplicado de manera que se observe una señal puede ser mucho mayor que 1. El procedimiento de detección determina un "umbral" por debajo del cual el procedimiento parece ser completamente efectivo (y por encima del cual el procedimiento es, de hecho, solamente parcialmente efectivo).

Se puede ilustrar esta interacción entre el factor de amplificación de un ensayo y el umbral que define el procedimiento de detección. Por ejemplo, las células bacterianas se pueden aplicar a una placa: el procedimiento de detección elegido arbitrariamente es inspección visual. Asumir las condiciones de crecimiento y el tiempo son tales que se ha producido una amplificación total de 10^{4}. La señal detectable será proporcional al número de células bacterianas presentes en ese momento tras la amplificación. Para fines de cálculo, se toma un umbral de detección de 10^{6} células, si hay presentes menos de 10^{6} células después de la amplificación, no hay colonias de células detectables visualmente y el procedimiento de inactivación será efectivo. Dado el factor de amplificación de 10^{4} y el umbral de detección de 10^{6}, la sensibilidad límite sería de 100 células bacterianas; si estuviesen presentes menos de 100 células bacterianas viables en la alícuota original del cultivo bacteriano después de que se realice el procedimiento de esterilización, el cultivo todavía aparecería esterilizado.

Es común una situación como esta para ensayos de crecimiento bacteriano. La sensibilidad del ensayo es tal que las células bacterianas viables están presentes pero el ensayo es incapaz de detectarlas. Esto puede explicar, al menos en parte, la variabilidad de los resultados obtenidos por los investigadores en su intento por determinar el grado de contaminación bacteriana en productos sanguíneos. Véase D. H. Buchholz y colaboradores, Transfusion 13; 268 (1.973), en el que se discute tal variabilidad.

Se debería observar que, en muchos países, la contaminación de los productos sanguíneos por organismos celulares es más persistente y, por tanto, más seria que la contaminación viral. Por ejemplo, en Sudamérica, el organismo presente en sangre más importante es T. cruzi, que es el agente etiológico de la enfermedad de Chagas. Aproximadamente 16-18 millones de personas están infectadas en las Américas (incluyendo el 11% de la población de Chile). Se contempla que el procedimiento de descontaminación de la presente invención está bien adaptado para la inactivación de estos protozoos.

La presente invención contempla dispositivos y procedimientos para la fotoactivación y específicamente, para la activación de compuestos fotorreactivos de unión a ácidos nucleicos. La presente invención contempla dispositivos que tengan una fuente barata de radiación electromagnética que esté integrada en la unidad.

La presente invención contempla dispositivos y procedimientos para la fotoactivación y específicamente, para la inactivación de patógenos que contaminan productos sanguíneos mediante la activación de compuestos fotorreactivos. Las características principales de una forma de realización del dispositivo de la presente invención implica: A) una fuente barata de radiación ultravioleta a una distancia fija del medio que soporta los vasos de muestra, B) fotoactivación rápida, C) procesamiento de gran número de muestras, D) control de temperatura de las muestras irradiadas, E) seguridad inherente y F) contenedores de muestras.

A. Fuente de radiación electromagnética

Un dispositivo de fotoactivación preferido de la presente invención tiene una fuente barata de radiación ultravioleta a una distancia fija del medio que soporta los vasos de muestra. La radiación ultravioleta es una forma de energía que ocupa una porción del espectro de radiación electromagnética (el espectro de radiación electromagnética abarca desde los rayos cósmicos hasta las ondas de radio). La radiación ultravioleta puede provenir de muchas fuentes naturales y artificiales. Dependiendo de la fuente de radiación ultravioleta, puede estar acompañada por otros tipos (no ultravioleta) de radiación electromagnética (por ejemplo, luz visible).

Aquí están descritos tipos particulares de radiación ultravioleta en términos de longitud de onda. La longitud de onda se describe aquí en términos de nanómetros ("nm"; 10^{-9} metros). Para los propósitos de la presente, la radiación ultravioleta se extiende aproximadamente desde aproximadamente 180 nm hasta 400 nm. Cuando una fuente de radiación, en virtud de filtros u otros medios, no deja pasar radiación de longitud de onda más corta que una longitud de onda particular (por ejemplo, 320 nm), se dice que tiene un "límite" inferior a esa longitud de onda (por ejemplo, "una longitud de onda corta con límite a 320 nanómetros"). De manera similar, cuando una fuente de radiación deja pasar solamente radiación con longitudes de onda más larga que una longitud de onda particular (por ejemplo, 360 nm), se dice que tiene un "límite" superior a esa longitud de onda (por ejemplo, "una longitud de onda larga con límite a 360 nanómetros").

Para cualquier reacción fotoquímica se desea eliminar o al menos minimizar cualquier reacción lateral deletérea. Alguna de estas reacciones laterales puede ser causada por la excitación de cromóforos endógenos que pueden estar presentes durante el proceso de activación fotoquímica. En un sistema donde sólo están presentes el ácido nucleico y el psoraleno, los cromóforos endógenos son las propias bases del ácido nucleico. Restringiendo el procedimiento de activación de las longitudes de onda mayores que 320 nm se minimiza el daño directo a los ácidos nucleicos ya que hay una pequeñísima absorción por los ácidos nucleicos a longitudes de ondas más largas que 313 nm.

En productos sanguíneos, el ácido nucleico está presente habitualmente junto con cromóforos biológicos adicionales. Si el fluido biológico es sólo proteína, el límite de longitud de onda corta a 320 nm será el adecuado para minimizar las reacciones laterales (los aminoácidos aromáticos no absorben a longitudes de onda más cortas de 320 nm). Si el fluido biológico incluye células y/o constituyentes celulares, habrá otros muchos cromóforos incluyendo grupos hemo y flavinas.

Los grupos hemo son abundantes en productos sanguíneos donde surgen de la lisis de los glóbulos rojos. Las flavinas, como los grupos hemo, se requieren para la respiración metabólica. Ambos de estos cromóforos endógenos causarán daños a las células si se excitan por fotorradiación.

Los grupos hemo tienen tres bandas principales de absorción: dos están en la región del rojo del espectro visible; la otra está centrada aproximadamente a 400 nm. Las flavinas tienen dos picos de absorción principales: uno a 450 nm y otro a 370 nm.

En vista de la presencia de estos cromóforos endógenos en productos sanguíneos, está previsto que en una forma de realización del dispositivo de la presente invención el dispositivo esté diseñado para que tenga en cuenta la irradiación dentro de un pequeño intervalo de longitudes de onda específicas y deseables, y así evitar daños a las células causados por la transferencia de energía. El intervalo preferido de longitudes de onda deseables está entre 320 y 350 nm.

Se puede conseguir alguna selectividad eligiendo fuentes de irradiación comerciales. Por ejemplo, mientras los tubos fluorescentes típicos emiten longitudes de onda que abarcan desde los 300 nm hasta por encima de 400 nm (con un pico amplio centrado alrededor de los 360 nm), las lámparas fluorescentes de tipo BLB están diseñadas para eliminar longitudes de onda más largas de 400 nm. Esto, sin embargo, sólo proporciona un límite de longitud de onda larga.

En una forma de realización preferida, el dispositivo de la presente invención comprende un medio de filtración adicional. En una forma de realización, el medio de filtración comprende un filtro límite de cristal, tal como una pieza de cristal de cobalto. En otra forma de realización, el medio de filtración comprende una disolución filtro líquida que transmite solamente una región específica del espectro electromagnético, tal como una disolución acuosa de Co(NO_{3})_{2}. Ésta disolución salina proporciona una ventana de transmisión de 320-400 nm. En una forma de realización preferida, la disolución acuosa de Co(NO_{3})_{2} se usa junto con NiSO_{4} para eliminar el componente de 365 nm del espectro de emisión del fluorescente o de la fuente de arco empleada. La disolución Co-Ni preserva su transmisión inicial remarcablemente bien incluso después de diez horas de exposición a la luz directa de fuentes de alta energía.

No está previsto que la presente invención esté limitada por el filtro particular empleado. Numerosas sales inorgánicas y cristales satisfacen los requerimientos necesarios. Por ejemplo, el sulfato cúprico es un filtro general más útil para eliminar el infrarrojo, cuando solamente se aísla el ultravioleta. Ofrece estabilidad en fuentes intensas. Otras sales son conocidas por alguien experto en la materia. También se pueden usar lámparas de apertura o reflectoras para conseguir longitudes de onda e intensidades específicas.

Cuando aquí se describe radiación ultravioleta en términos de irradiancia, se expresa en términos de intensidad de flujo (miliwatios por centímetro cuadrado o "mW/cm^{2}"). "Salida" se define aquí para abarcar tanto la emisión de radiación (sí o no; encendido o apagado) así como el nivel de irradiancia. En una forma de realización preferida, la intensidad se monitoriza al menos en 4 localizaciones; con al menos 2 para cada lado del plano de irradiación. En una forma de realización, los monitores son fotodiodos, cada uno colocado para medir la salida de una o más fuentes de radiación.

Una fuente preferida de radiación ultravioleta es una fuente fluorescente. La fluorescencia es un caso especial de luminiscencia. La luminiscencia implica la absorción por parte de una sustancia de radiación electromagnética y la conversión de la energía en radiación de una longitud de onda diferente. Con la fluorescencia, la sustancia que es excitada por la radiación electromagnética vuelve a su estado fundamental por emisión de un cuanto de radiación electromagnética. Mientras que hasta ahora se pensaba que las fuentes de fluorescencia tenían que ser de una intensidad muy baja para ser útiles para fotoactivación, en una forma de realización de la presente invención se emplean fuentes fluorescentes para conseguir resultados hasta el momento realizables solamente con equipamientos caros.

Tal y como se usa aquí, "distancia fija" se define como una distancia constante entre un punto en el plano que define el medio que soporta una pluralidad de bolsas sanguíneas y un punto dentro de la fuente de luz. Así, pequeños cambios en la distancia desde la fuente puede tener un impacto drástico en la intensidad. Puesto que cambios en la intensidad pueden afectar a los resultados de la fotoactivación, la presente invención contempla el uso de una barra extensible de lámparas para una fuente de radiación. Las lámparas de barra extensible minimizan el efecto de los pequeños cambios de distancia sobre la intensidad de la radiación, proveyendo de capacidad de reproducción y repetición.

La geometría se relaciona con la posición de la fuente de luz. Por ejemplo, se puede imaginar que las fuentes de luz se podrían colocar alrededor de la sujeción de muestras de muchas maneras (a los lados, al fondo, en círculos, etc.). La geometría utilizada en una forma de realización preferida de la presente invención permite una exposición de luz uniforme, de más de una muestra, de intensidad apropiada para una rápida fotoactivación. La geometría de un dispositivo preferido de la presente invención implica múltiples fuentes de lámparas lineales en comparación con fuentes de luz puntuales. Además, hay numerosas superficies reflexivas y numerosas superficies absorbentes. Las superficies reflexivas pueden ayudar a igualar la exposición de luz a cada pluralidad de muestras. Debido a esta complicada geometría, se deben evitar los cambios en la posición o en el número de lámparas relativas a la posición de las muestras para ser irradiadas en que tales cambios resultarán en cambios en la intensidad y la variabilidad en la exposición de la intensidad a múltiples muestras.

Otra consideración en la obtención de una exposición de luz uniforme es la provisión para accesorios a los contenedores de las muestras durante la irradiación. La presente invención contempla accesorios tales como tubos, válvulas, bolsas de almacenamiento de productos sanguíneos, y cualquier otro aparato comúnmente unido a bolsas que contengan productos sanguíneos. Esto evita la obstrucción de la luz por parte de los accesorios. En una forma de realización, los medios que soportan las bolsas sanguíneas tienen medios para situar una pluralidad de accesorios conectados a dichas bolsas sanguíneas, de manera que dichos accesorios no reduzcan significativamente la intensidad de la radiación a dichas bolsas sanguíneas.

Es útil que un dispositivo de irradiación entregue la misma intensidad de radiación a la muestra tanto si hay numerosas muestras como si se está irradiando una única muestra. La presente invención contempla el uso de mallas reflectoras parabólicas que se pueden colocar entre las fuentes de luz y la muestra a irradiar. Estas mallas dirigen la luz que pasa a través de ellas, para reducir la dispersión de luz y evitar descensos en la luz que afecta a las muestras cuando se irradia más de una muestra a la vez.

En otra forma de realización, la presente invención contempla el uso de medios de agitación, tales como un sacudidor o un agitador, para mezclar las muestras durante la irradiación. Ésta mezcla puede tener un efecto que promedie la radiación recibida por el material de muestra en diferentes partes de la bolsa. Sin que se prevea limitarse por cualquier mecanismo por el cual la agitación provoque previsibilidad a la irradiación, se contempla que el material de muestra se mueva a través de la bolsa durante la irradiación por la agitación, de tal modo que se exponga cada parte de la muestra a muchas posiciones diferentes para recibir la radiación. Si existen variaciones en la intensidad de la radiación en diferentes zonas de la bolsa, el movimiento actuaría reduciendo la variación en intensidad dentro de la muestra.

La presente invención además contempla que la entrega de luz desde las fuentes de luz será aproximadamente uniforme a lo largo de la longitud de la fuente de luz. Algunas fuentes de luz, particularmente las bombillas tubulares largas, muestran una caída de salida en los extremos de las bombillas. Los extremos también tienden a emitir la mayoría del calor. Para asegurar una iluminación uniforme y una temperatura controlada, el dispositivo de la presente invención tiene un borde que se envuelve alrededor de los extremos de las fuentes de luz para obstruir aproximadamente 2-6 cm de la fuente de luz en cada extremo de la irradiación de muestras en el dispositivo.

B. Fotoactivación rápida

La fuente de luz de la forma de realización preferida de la presente invención permite una fotoactivación rápida. Las características de intensidad del dispositivo de irradiación se han seleccionado para ser convenientes con la anticipación de que se pueden necesitar muchos sistemas de múltiples muestras para ser procesados. Con ésta anticipación, un tiempo de exposición de quince minutos o menos es un objetivo práctico. Debido a que las fuentes de luz ultravioleta pueden variar su flujo en una cantidad determinada de tiempo, en una forma de realización preferida de la presente invención, numerosos detectores de salida de luz están situados a través del dispositivo para medir la salida de las fuentes de luz. En una forma de realización, los detectores están conectados a un control de retroalimentación, que se puede ajustar para desconectar la fuente de luz cuando se ha alcanzado un cierto nivel de salida. Esto asegura capacidad de repetición, que es preferible cuando se inactivan patógenos en productos sanguíneos. Con el control de la exposición de luz que un producto sanguíneo recibe, uno también puede asegurar una exposición suficiente para inactivar patógenos, sin tener que exponer la muestra a excesos de luz, que podría ser dañino.

En el diseño de los dispositivos de la presente invención, las posiciones relativas de los elementos del dispositivo preferido se han optimizado para dejar un tiempo de quince minutos de irradiación, de manera que se proporciona, cuando se mide la longitud de onda entre 320 y 350 nanómetros, un flujo de intensidad mayor que aproximadamente 1 mWcm^{-2}, y preferiblemente de 15 mWcm^{-2} a los vasos de las muestras. En una forma de realización preferida, el dispositivo irradia ambas caras de la bolsa.

C. Procesamiento de un gran número de muestras

Como se observa, otra característica importante de los dispositivos de fotoactivación de la presente invención es que están previstos para el procesamiento de un gran número de muestras. En esta consideración, un elemento de los dispositivos de la presente invención es un medio que soporte una pluralidad de productos sanguíneos, y en particular, bolsas sanguíneas. En la forma de realización preferida de la presente invención los medios de soporte comprenden placas de cristal entre dos bancos de luces con una capacidad de seis bolsas de 50 ml (equivalente a una bolsa Dupont Stericell™) más conectores y tubos, de una vez. Aceptando el uso común de las bolsas sanguíneas disponibles comercialmente, el dispositivo de la presente invención permite el procesamiento adecuado de un gran número de muestras.

En una forma de realización preferida, la placa tiene un medio para colocar accesorios conectados a dichas bolsas sanguíneas, tales como tubos y bolsas de almacenamiento satélite, de manera que dichos accesorios no reducen significativamente la intensidad de radiación a dichas bolsas sanguíneas.

D. Control de temperatura

Como se observa, una de las características importantes de los dispositivos de fotoactivación de la presente invención es el control de temperatura. El control de temperatura es importante porque la temperatura de la muestra durante el tiempo de exposición a la luz puede afectar dramáticamente a los resultados. Por ejemplo, las condiciones que promueven la estructura secundaria de los ácidos nucleicos también aumentan las constantes de afinidad de muchos derivados de psoralenos para ácidos nucleicos. Hyde y Hearst, Biochemistry, 17, 1.251 (1.978). Estas condiciones son una mezcla tanto de la composición del disolvente como de la temperatura. Con ARN ribosomal 5S de cadena sencilla, la irradiación a bajas temperaturas aumenta la adición covalente de HMT a ARNr 5S en 2 veces a 4ºC comparado con 20ºC. Thompson y colaboradores, J. Mol. Biol. 147; 417 (1.981). Se ha informado que incluso mayor temperatura induce el aumento de la unión de psoralenos con polinucleótidos sintéticos. Thompson y colaboradores, Biochemistry 21; 1.363 (1.982).

Con respecto a las bacterias, se debería observar que se produce la reparación de los entrecruzamientos durante la irradiación. Sin embargo, donde se emplea una temperatura inferior durante la irradiación, el proceso de reparación bacteriana se suprime. Así, una irradiación a 15ºC tiene un efecto significativo sobre el nivel de inactivación que se observa.

Adicionalmente, ciertas preparaciones sanguíneas pueden resultar dañadas por pequeños cambios de temperatura. Por ejemplo, las plaquetas están mejor preservadas si se mantienen a 22ºC \pm 2. Así se prefiere que un dispositivo para la fotoactivación de plaquetas mantenga las plaquetas dentro o cerca de este intervalo durante la radiación o la eficacia clínica de las plaquetas se puede reducir.

Sin que se prevea limitarse a cualquier medio particular de control de la temperatura de los productos sanguíneos durante la irradiación en el dispositivo, en una forma de realización el dispositivo emplea dos medios de control de la temperatura. Un primer medio de control de la temperatura es un medio para el bombeo de aire desde fuera de la carcasa del dispositivo, a través del medio que proporciona la irradiación y de vuelta hacia fuera, para enfriarlos y evitar la transferencia de calor a las muestras irradiadas.

Un segundo medio de control de temperatura funciona en un sistema cerrado, enfriando y circulando el aire de dentro del sistema solamente, para evitar el reciclado del calor introducido por el aire escapado desde el primer medio de control de temperatura. El segundo medio es para que circule el aire frío a través de la cámara de circulación de aire y dentro del canal en que se apoyan las bolsas sanguíneas. Este segundo medio de control de temperatura usa un intercambiador de calor y un medio para circular el aire frío. Preferiblemente, el intercambiador de calor es un conducto, que tiene un puerto de entrada y un puerto de salida para la circulación del líquido de control de temperatura. El conducto se puede cubrir con un material ondulado con una alta conductividad térmica, que sirve para incrementar la superficie de intercambio de calor entre el conducto y el aire. En una forma de realización, el medio para circular el aire se propulsa por un motor de corriente continua, que produce menos calor que un motor de corriente alterna. Alternativamente, el medio para circular el aire se puede propulsar desde fuera de la carcasa. Cualquier alternativa controla la cantidad de calor producido dentro de la carcasa.

El aire frío se circula a través del conducto, a través de las bolsas sanguíneas que contienen los productos sanguíneos, y a través de las cámaras y canales que rodean las bolsas sanguíneas. Las cámaras y canales también están aislados del intercambio significativo con el aire originado fuera de la carcasa del dispositivo o del aire que pasa a través de los medios que proveen la radiación electromagnética, de tal forma que se cree "un sistema cerrado" que recircule el aire. En una forma de realización alternativa, la presente invención contempla que el segundo medio de control de temperatura comprenda una unidad de refrigeración instalada dentro de la carcasa del dispositivo para la fotoactivación.

El aire circulante en el segundo medio de control de temperatura no se mezcla con el aire bombeado a través del primer medio de control de temperatura. Esta separación del control de temperatura permite que las muestras se enfríen apropiadamente.

En una forma de realización, el dispositivo de la presente invención comprende un medio de agitación, tal como un sacudidor o un agitador, dando a las muestras un movimiento horizontal unidireccional y sinusoidal de frecuencia y amplitud variables. El uso de un medio de agitación durante la irradiación con el dispositivo se contempla para el mantenimiento de una temperatura uniforme en todas las muestras dentro de las bolsas sanguíneas mezclando una muestra en las bolsas sanguíneas durante la irradiación. Adicionalmente, el uso de un sacudidor para las muestras de plaquetas reduce la activación de las plaquetas durante el almacenamiento. En una forma de realización, se coloca un sacudidor dentro de la carcasa del dispositivo de irradiación, moviendo las muestras por contacto directo de los medios que soportan las bolsas sanguíneas. Se contempla que la placa de la parte superior del ensamblaje de la placa inferior no puede estar fija con respecto al resto del ensamblaje de la placa inferior, permitiendo así a un sacudidor contactar directamente con la placa superior para conseguir la agitación. También se contempla el movimiento del ensamblaje de la placa inferior entero por un sacudidor. Alternativamente se puede colocar un sacudidor fuera de la carcasa, moviendo las muestras por movimiento de toda la carcasa del dispositivo. La presente invención contempla el uso de una superficie rugosa sobre los medios que soportan la bolsas sanguíneas que provee de fricción suficiente para mantener la posición de las bolsas sanguíneas de muestra durante la agitación.

En otra forma de realización, el calor de las lámparas, lastres y otras fuentes se mantiene alejado de las bolsas sanguíneas por una o varias particiones entre las variadas fuentes de calor y las bolsas. Esto además ayuda en el mantenimiento de una temperatura biológicamente aceptable en las muestras.

E. Seguridad inherente

La radiación ultravioleta puede causar quemaduras graves. Dependiendo de la naturaleza de la exposición, también puede ser carcinogénico. La fuente de luz de una forma de realización preferida de la presente invención está blindada respecto del usuario. Esto es en contraste con las fuentes ultravioletas comerciales de mano así como las fuentes grandes, de alta intensidad. En una forma de realización preferida la fuente de irradiación está contenida dentro de una carcasa hecha de material que obstruye la transmisión de energía radiante (por ejemplo, una carcasa opaca). No se deja pasar irradiación al usuario. Esto permite seguridad inherente para el usuario.

F. Contenedores de muestra

El material del contenedor que aloja la muestra que es irradiada en el dispositivo de irradiación puede interferir en el buen funcionamiento del dispositivo de irradiación. El material usado puede provocar la penetración de radiación de la muestra y la cantidad de dispersión de radiación que afecte al contenedor. El contenedor de muestra de una forma de realización de la presente invención es una bolsa sanguínea hecha de un plástico transparente a la luz ultravioleta, preferiblemente Teflón (disponible en American Fluroseal, Silver Spring, MD). Algunos otros componentes plásticos aceptables son etil vinil acetato (bolsas disponibles en Terumo, Japón); poli (cloruro de vinilo) (PVC) (bolsas disponibles en Baxter Travenol o Cutter, Covina, CA), que se puede combinar con plastificantes; o poliolefinas (bolsas disponibles en la División Fenwal de los laboratorios Baxter Travenol, Inc., Dearfield; Illinois). Para el PVC, los plastificantes contemplados son di (2-etilhexil) ftalato (DEHP), tri (2-etilhexil) trimelitato (TEHTM). La presente invención, sin embargo, no se pretende que esté limitada a cualquier composición de la bolsa sanguínea, pero contempla el uso de cualquier bolsa que sea algo transparente a la luz ultravioleta. El material también puede interferir en la concentración de los componentes en las muestras para ser irradiadas. En una forma de realización preferida, la muestra es irradiada sobre el dispositivo de irradiación en una bolsa que no une un porcentaje significativo de compuesto fotorreactivo contenido en la muestra.

Los parámetros del contenedor también controlan en un cierto grado como se afecta la muestra durante la irradiación. Por ejemplo, una bolsa sanguínea para el almacenamiento de plaquetas preserva mejor las plaquetas si sus paredes son lo suficientemente finas para permitir la transferencia suficiente de oxigeno para prevenir el aumento de la tasa de producción de lactato que produce un descenso en la viabilidad de las plaquetas. Carmen, R., "The Selection of Plastic Materials for Blood Bags", Transfusion Med. Rev. 7; 1 (1.993).

La naturaleza de los productos sanguíneos puede tener un impacto sobre la eficacia. Los glóbulos rojos, por ejemplo, absorben a diferentes longitudes de onda de luz de lo que lo hacen las plaquetas. Los glóbulos rojos pueden reducir la eficacia de la irradiación debido a la obstrucción de la luz. Por tanto, las plaquetas contaminadas con glóbulos rojos pueden recibir una menor intensidad de luz que las preparaciones de plaquetas que no contengan glóbulos rojos.

Como se ha apuntado anteriormente, los cambios en la intensidad pueden afectar a los resultados de la fotoactivación, y estos cambios pueden resultar de cambios en la distancia dentro de la muestra a través de la cual debe viajar la radiación. El grosor de la muestra, definido por las paredes de la bolsa sanguínea, y el volumen del producto sanguíneo, también afecta a cuanta luz puede alcanzar la muestra. En una forma de realización preferida de la presente invención, cuando las bolsas sanguíneas que contienen la muestra para la irradiación se apoyan dentro del dispositivo de radiación, se forma una película de producto sanguíneo que tiene una "longitud de trayectoria central" de entre aproximadamente 0,1 y 4 cm. Una "longitud de trayectoria central" se define aquí como la distancia más corta entre dos paredes de una bolsa sanguínea que pasa a través del centro de la bolsa. En una forma de realización, la "longitud de trayectoria central" de la muestra es un valor fijo para todas las bolsas usadas. Esto confiere capacidad de reproducción y repetición. En una forma de realización preferida, se emplea un sacudidor, para proveer de movimiento, o agitación, del material de muestra de manera que cada parte de la muestra llegue a la superficie de la bolsa sanguínea durante la irradiación. Esto puede permitir variaciones en las longitudes de trayectoria centrales de las bolsas, mientras que preserva la capacidad de reproducción y repetición, debido a que la agitación puede circular la muestra a la superficie de la bolsa sanguínea. Por tanto, se asegura que luz suficiente puede alcanzar las muestras sin tener en cuenta la longitud de trayectoria central. En otra forma de realización preferida, no se necesita ejercer otra presión sobre la bolsa por el dispositivo de radiación, o cualquier otra fuente, que la fuerza de la gravedad, para obtener la "longitud de trayectoria central" preferida. En una forma de realización, el ensamblaje de placa superior e inferior están separados entre aproximadamente 1 y 10 cm, para acomodar las bolsas que tienen una longitud de trayectoria central dentro de ese intervalo.

Experimental

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar ciertas formas de realización preferidas y aspectos de la presente invención y no tienen que ser interpretados como limitantes del alcance de estos.

En la descripción experimental que sigue, se aplican las siguientes abreviaturas: eq (equivalentes); M (Molar); \muM (micromolar); N (Normal); mol (moles); mmol (milimoles); \mumol (micromoles); nmol (nanomoles); g (gramos); mg (miligramos); \mug (microgramos); L (litros); ml (mililitros); \mul (microlitros); cm (centímetros); mm (milímetros); \mum (micrómetros); nm (nanómetros); ºC (grados Centígrados); HPLC (Cromatografía Líquida de Alta Presión).

Ejemplo 1

Como se ha observado anteriormente, la presente invención contempla dispositivos y procedimientos para la activación de compuestos fotorreactivos de unión a ácidos nucleicos. En este ejemplo, se describe un dispositivo de fotoactivación para descontaminar productos sanguíneos de acuerdo con el procedimiento de la presente invención. Este dispositivo comprende: a) medios para proporcionar longitudes de onda adecuadas de radiación electromagnética que provoque la activación de al menos un compuesto fotorreactivo; b) medios para soportar una pluralidad de productos sanguíneos a una distancia fija de los medios que proporcionan la radiación durante la activación; y c) medios para mantener la temperatura de los productos sanguíneos dentro de un intervalo de temperatura deseado durante la activación.

La Figura 1 es una vista en perspectiva de una forma de realización del dispositivo que integra las características anteriormente nombradas. La figura muestra una carcasa opaca (100) con una porción de ella eliminada, que contiene una serie de bombillas (101) por encima y por debajo de una pluralidad de medios que contienen productos sanguíneos representativos (102) situados entre ensamblajes de placa (103, 104). Los ensamblajes de placa (103, 104) están descritos con mayor detalle, a continuación.

Las bombillas (101), que son conectables a una fuente de alimentación (no mostrado), sirven como una fuente de radiación electromagnética. Mientras que no se limita al tipo de bombilla particular, la forma de realización está configurada para aceptar un estándar de la industria, la lámpara de dos clavijas dual.

La carcasa (100) se puede abrir mediante un cierre (105) de manera que el producto sanguíneo se puede colocar apropiadamente. Como se muestra en la Figura 1, la carcasa (100), cuando se cierra, contiene completamente la irradiación de las bombillas (101). Durante la irradiación, el usuario puede confirmar que el dispositivo está funcionando mirando a través de un puerto de visión seguro (106) que no permite la transmisión de luz ultravioleta hacia el usuario.

La carcasa (100) también sirve como un montaje para numerosos componentes electrónicos en un panel de control (107), incluyendo, a modo de ejemplo, un interruptor de corriente principal, un contador de tiempo, y un medidor de hora. Por comodidad, el interruptor de corriente se puede conectar al contador de tiempo que en cambio está conectado en paralelo a un medidor de hora y a una fuente de radiación electromagnética. El contador de tiempo permite a un usuario preestablecer el tiempo de irradiación a un nivel deseado exposición. El medidor de hora mantiene una grabación del número total de horas de radiación proporcionadas por la fuente de radiación electromagnética. Esta característica permite que las bombillas (101) sean monitorizadas y cambiadas antes de que su salida disminuya por debajo de un nivel mínimo necesario para la fotoactivación rápida.

La Figura 2 es una vista de la sección transversal del dispositivo mostrado en la figura 1 desde el principio de 2-2. La Figura 2 muestra la organización de las bombillas (101) con la carcasa (100) abierta. Un medio reflectante (108A, 108B) rodea completamente cada serie de bombillas (101). Los medios que contienen los productos sanguíneos (102) están situados entre los ensamblajes de placa transparentes a la luz ultravioleta superior (103) e inferior (104). Cuando el ensamblaje de placa superior (103) se baja sobre el ensamblaje de placa inferior (104), los ensamblajes de placa superior (103) e inferior (104) definen un canal (116 - no mostrado en esta figura) a través del cual el aire se puede circular para enfriar los medios que contienen los productos sanguíneos. Cada ensamblaje de placa está compuesto de placas en la parte superior (103A, 104A) y en la parte inferior (103B, 104B). Los ensamblajes de placa (103, 104) están conectados por una bisagra (109) que está diseñada para acomodar el espacio creado por los medios que contienen los productos sanguíneos (102). El ensamblaje de placa superior (103) se trae para apoyarse justo encima del tope de los medios que contienen los productos sanguíneos (102) sujeto por la placa de la parte inferior (104B) del ensamblaje de placa inferior (104). En una forma de realización alternativa, el ensamblaje de placa superior (103) puede estar en una relación fija con la carcasa (100) y toda la tapa de la carcasa, incluyendo el ensamblaje de la placa superior (103) que se puede traer para apoyarse justo encima del tope de los medios que contienen los productos sanguíneos (102).

Los detectores (110A, 110B, 110C, 110D) se pueden situar convenientemente entre las placas (103A, 103B, 104A, 104B) de los ensamblajes de placa (103, 104). Se pueden conectar a una placa de circuito impresa (111) que en cambio está conectada al panel de control (107).

La Figura 3 es una vista de la sección transversal del dispositivo mostrado en la Figura 1 desde el principio de 3-3. Seis medios que contienen productos sanguíneos (102) (por ejemplo, bolsas de unidades de plaquetas Teflón™) se sitúan en una relación fija por encima de una serie de bombillas (101). La temperatura de los productos sanguíneos se puede controlar mediante un ventilador (112) solo o, más preferiblemente, empleando un intercambiador de calor (113) que tenga una entrada de refrigeración (114) y puertos de salida (115) conectados a una fuente de refrigeración (no mostrado).

La Figura 4 es una vista de la sección transversal del dispositivo mostrado en la Figura 1 desde el principio de 4-4. La Figura 4 muestra más claramente la aproximación del control de temperatura de una forma de realización preferida del dispositivo. Cuando el ensamblaje de la placa superior (103) se baja sobre el ensamblaje de placa inferior (104), los ensamblajes de placa superior (103) e inferior (104) definen un canal (116) bordeado por la placa de la parte inferior (103B) del ensamblaje superior (103) y la placa de la parte superior (104A) del ensamblaje inferior. Las placas del ensamblaje de placa superior (103A, 103B) y las placas del ensamblaje de placa inferior (104A, 104B) definen cada una cámara de circulación de aire (103C, 104C), respectivamente. El ventilador (112) puede circular aire dentro de las cámaras (103C, 104C). Cuando se emplea el intercambiador de calor (113), el aire circulante se enfría y se pasa entre las placas (103A, 103B, 104A, 104B) dentro de las cámaras de circulación de aire (103C, 104C), por el ventilador (112) y se lleva de vuelta al intercambiador de calor (113) a través del canal (116) entre los ensamblajes de placa superior (103) e inferior (104), por tanto enfriando los medios que contienen los productos sanguíneos. El aire circulante se mantiene dentro de un sistema cerrado cuando la carcasa (100) está en la posición cerrada, comprendiendo el canal (116), las cámaras de circulación de aire (103C, 104C) y la superficie del intercambiador de calor (113) y el ventilador (112). El aire dentro del sistema cerrado no se mezcla o se intercambia con el aire de fuera de la carcasa o de dentro de la carcasa que no es parte del sistema cerrado, tales como el área que rodea a las bombillas (101).

Ejemplo 2

La Figura 5 muestra una forma de realización en que las plaquetas son tratadas por el procedimiento de la presente invención. Seguido del fraccionamiento, las plaquetas se transfieren a una bolsa que contenga un compuesto de unión a ácidos nucleicos (mostrado en la Figura 1 como una bolsa sombreada). Esta bolsa, que tiene propiedades de transmisión y otras características adecuadas para la presente invención, se sitúa entonces en un dispositivo de irradación (tal como se describe en el Ejemplo 1, anteriormente) y se irradia. El compuesto libre se puede recoger o "capturar" como se desee por un dispositivo de captura. En tal caso, la bolsa contendría solamente el compuesto que está contenido en las células; la bolsa no tendría compuesto libre (esta bolsa se indica en la Figura 1 como no sombreada).

Ejemplo 3

En este ejemplo, los procedimientos de descontaminación de la presente invención se aplican para inactivar Yersinia enterocolitica, tipo silvestre, serotipo 3, biotipo 4. Este organismo se encuentra en productos sanguíneos. Véase de manera general R. Y. Dodd, En: Transfusion Medicine in the 1.990's (American Assoc. Blood Banks 1.990) (S. J. Nance, ed.). Véase también B. J. Grossman y colaboradores, Transfusion 31; 500 (1.991).

Se hizo un cultivo del organismo durante toda la noche por inoculación de 10 ml de caldo de infusión cerebro-corazón (BHI) a partir de un pinchazo de motilidad. Esto se mantuvo a 35ºC y 0,1 ml de este se usó para inocular 20 ml de caldo BHI para usarlo en el experimento. Tras incubar durante toda la noche a 35ºC, el cultivo estacionario se centrifugó durante 15 minutos a 1.900 g, se descartó el sobrenadante, y el sedimento bacteriano se resuspendió en un pool de 1 ml de suero normal inactivado por calor. Esto se infundió en una unidad de plaquetas humanas muertas recientemente obtenidas del Blood Bank de Alameda-Contra Costa Medical Association. Se extrajeron alícuotas de 5 ml de bacteria que contenían concentrado de plaquetas de la bolsa y recibieron cantidades específicas de 8-MOP e irradiación UVA, excepto para los controles, que se irradiaron sin psoralenos, o no recibieron tratamiento (véase Tabla 2). Se mantuvo la temperatura a 25ºC durante la irradiación colocando el concentrado de plaquetas en cámaras revestidas de agua con cristal tapado unidas a un baño de agua circulante. El dispositivo de irradiación (Derma Control, Dolton; Ill.; Modelo No. 1.224-Special) empleaba dos series (seis lámparas/series separadas a 6,35 cm (2,5 pulgadas), una serie encima de la muestra y un banco debajo de la muestra (la muestra está así a aproximadamente 7,62 cm (3 pulgadas) de las lámparas)). Cada serie está separada de las otras por aproximadamente seis pulgadas, tiene un reflector de metal pulido detrás de ella, y está cubierta por una lámina de plástico acrílico que transmite los rayos UVA. La muestra a ser procesada (por ejemplo, bolsa de plaquetas) se asienta en la lámina inferior.

TABLA 2

	Fármaco	8-MOP/ml	Tiempo Ir.(min)	Log/ml	Título
1	No		0	9,1
2	No		10	9,3	0,2
3	8-MOP	30 \mug	10	< 0	> -9,1
4	8-MOP	10	10	< 0	> -9,1
5	8-MOP	3	10	3,4	-5,7
6	8-MOP	0,2	10	6,8	-2,3
7	8-MOP	0,06	10	9,0	-0,1

Se usaron bombillas tipo Derma Control F587T12-BL-HO. Estas son tubos de "luz negra" (diseñados para emitir longitudes de onda específicas por medio de una capa interna de fósforo) de 60,96 cm (24 pulgadas) de largo. La longitud de onda máxima está por debajo de 360 nm, a diferencia de las simples lámparas de mercurio o las bombillas fluorescentes comunes "BLB". La intensidad total es inferior a 20 mW/cm^{2}.

Las bacterias se cuantificaron plaqueando 0,1 ml de diluciones seriadas 10 veces en caldo BHI en placas petri de 100 mm que contenían agar BHI. Tras 24 horas de incubación a 35ºC, se contaron las colonias y se calculó la concentración la concentración bacteriana por ml. Los resultados (Tabla 2) muestran que tan poco como 3 \mug/ml de 8-MOP es capaz de inactivar casi seis registros de bacteria. Con 10 \mug/ml, diez minutos proporcionan irradiación más que suficiente. De hecho, con 10 \mug/ml, cinco minutos de irradiación parece ser adecuado.

Ejemplo 4

Artuc y colaboradores examinaron la solubilidad de 8-MOP en proteínas séricas humanas y bovinas, y mostraron que a intervalos de concentración de 8- MOP de 100 a 1000 ng/ml se observaron concentraciones similares a éstas en pacientes tratados con terapia ultravioleta A psoraleno (PUVA) para la psoriasis. Del 75% al 80% estaba unido a la albúmina. M. Artuc y colaboradores, Brit. J. Derm. 101; 659 (1.979).

En este ejemplo, la unión de 8-MOP al ADN de timo de ternera se compara usando plasma y un medio libre de proteína en orden para validar la eficacia de las interacciones psoraleno-ácido nucleico bajo los procedimientos de descontaminación de la presente invención. Aunque esta medición usó ácido nucleico eucariótico más que ácido nucleico bacteriano, es un indicador útil del grado de formación de aducto para la bacteria.

Se preparó ^{3}H-8-MOP a una concentración de 115 \mug/ml en etanol a una actividad específica de 4,7x10^{6} CPM/
microgramo (en lo sucesivo "stock 8-MOP"). Después de eso se agotaron 130,5 ó 22 \mul de stock 8-MOP (2 cada) para muestras que contenían ADN ("ADN +") y 52,2 ó 8,7 \mul para muestras que no contenían ADN ("ADN -"). A las muestras ADN +, se añadió 40 \mul de stock ADN (7,7 mg/ml) así como bien 460 \mul de plasma (congelado del día) o bien 450 \mul de tampón Tris-EDTA ("TE"). Por último también se añadió 10 \mul de NaCl 5M. Para las muestras ADN - (por ejemplo los controles), se añadieron 184 \mul de plasma y 16 \mul de agua.

Las muestras se pasaron suavemente por el vortex durante aproximadamente una hora y se contaron las cuentas para confirmar que el 8-MOP se había disuelto.

Cada muestra (100 \mul) se irradió en un HRI-100 (HRI Research Inc., Concord, CA) a 25ºC durante 0, 2, 4, 6, 8, 7 16 minutos. Las muestras se mantuvieron a 4ºC durante toda la noche tras la irradiación. Después de eso se extrajeron las muestras. Primero, se preparó una disolución de fenol a pH 8 equilibrando con Tris 0,1 M pH 8. Cada muestra se extrajo entonces con 100 \mul de fenol. Cada muestra se centrifugó durante 5 minutos para eliminar la fase acuosa a un nuevo tubo. Se realizó una segunda extracción con 100 \mul de fenol:cloroformo 1:1. Se realizó una extracción final con 100 \mul de cloroformo.

Se precipitó la fase acuosa final añadiendo 50 \mul de NaCl ajustado para dar una concentración final de NaCl de 0,2 M y añadiendo entonces 250 \mul de etanol. Las muestras se centrifugaron de nuevo (10 minutos). Se eliminó el sobrenadante y se secaron los sedimentos. Los sedimentos se resuspendieron en 100 \mul de TE y se volvieron a precipitar. Esto se repitió para un total de 3 precipitaciones. Los sedimentos finales se disolvieron en 600 \mul de agua y se contaron 100 \mul. Cada muestra se ensayó para el ADN midiendo la absorbancia (260 nm). Los niveles de 8-MOP se representaron como aductos por 1000 pares de bases ("8-MOP:kBP").

Los resultados (Figura 6) muestran que el plasma cambia significativamente las cinéticas de adición del 8-MOP al ADN. La adición al ácido nucleico es mucho mejor en un medio libre de proteína.

La frecuencia de formación del aducto 8-MOP-ADN en medios libres de proteína predice una alta multiplicidad de modificación del genoma de la bacteria. Además, este tipo de medición bioquímica tiene el potencial para proporcionar un medio para monitorizar la eficacia del procedimiento de inactivación fotoquímica.

Ejemplo 5

La fotoactivación de psoralenos e isopsoralenos puede resultar en una variedad de fotoproductos. "Fotoproductos" se entiende mejor considerando las posibles reacciones de los compuestos fotorreactivos cuando se exponen a longitudes de onda de radiación electromagnética activantes. Mientras que no se limita a cualquier mecanismo preciso, se cree que la reacción de compuestos fotorreactivos en su estado fundamental ("C") con longitudes de onda de radiación electromagnética activantes crea unas especies excitadas de vida corta "C*":

C -> C*

Lo que ocurre a continuación es en gran parte función de que reactivos potenciales están disponibles a las especies excitadas. Puesto que es de vida corta, se cree que sólo es posible una reacción de estas especies con el ácido nucleico ("NA") si el ácido nucleico está presente en el momento en que se generan las especies excitadas. Así, la reacción debe, en términos operativos, estar en presencia de longitudes de onda de radiación electromagnética activantes, por ejemplo es "fotounión"; no es unión oscura. La reacción se puede representar como sigue:

C* + NA -> NA:C

El producto de esta reacción se referirá en lo sucesivo como "Producto de Fotoadición" y se tiene que distinguir del "Fotoproducto".

Con esta reacción descrita, ahora uno puede considerar la situación donde el ácido nucleico no está disponible para unirse en el momento en que se expone el compuesto a longitudes de onda de radiación electromagnética activantes. Puesto que las especies excitadas son de vida corta y no tienen ácido nucleico con el que reaccionar, las especies excitadas simplemente pueden volver al estado fundamental:

C* -> C

Por otra parte, las especies excitadas pueden reaccionar con ellas mismas (por ejemplo, un estado fundamental o especies excitadas) para crear un complejo de estado fundamental ("C:C"). El producto de estas auto-reacciones donde dos compuestos reaccionan se refieren como "fotodímero" o simplemente "dímero". Las auto-reacciones, sin embargo, no se limitan a dos compuestos: se pueden formar una variedad de multidímeros (trímeros, etc.).

Las especies excitadas no se limitan a reaccionar con ellas mismas, pueden reaccionar con su ambiente, tales como elementos del disolvente ("E") (por ejemplo, iones, gases, etc.) para producir otros productos:

C* + E -> E:C

Este es el tipo de reacción que se cree que causa el daño celular (por ejemplo, la reacción con oxígeno para crear especies de oxígeno singlete). Además, puede simplemente reordenarse internamente ("isomerizarse") a un derivado del estado fundamental ("["):

C* -> [

Finalmente, las especies excitadas pueden experimentar otras reacciones distintas que las descritas aquí.

La presente invención y el entendimiento de los "fotoproductos" no dependen de cuál (si hubiera alguna) de estas reacciones ocurre realmente. Los "fotoproductos" -cualquiera que sea su naturaleza- se considera que existen si, siguiendo la reacción de un compuesto y activando longitudes de onda de una radiación electromagnética activante, hay un producto resultante formado que pueda interaccionar con otros componentes del ambiente de la reacción.

Con psoralenos tales como el 4'-hidroximetil-4,5',8-trimetilpsoraleno (HMT), hay una serie de productos resultantes producidos cuando el HMT se expone a longitudes de onda de radiación electromagnética activantes. Los principales productos resultantes del HMT son dos fotodímeros ciclobutilo. En uno de los dímeros, los dos anillos

\hbox{pirona}

están unidos en una configuración cis-sin, mientras que en el otro dímero, la unión ocurre entre el extremo furano de una molécula y el extremo pirona de la otra, de nuevo con configuración cis-sin. Un tercer producto resultante del HMT es un fotoisómero monomérico HMT. En este isómero, los oxígenos del anillo central adoptan una orientación 1,4 en vez de la orientación normal 1,3. Mientras que no se esperaría que los dos fotodímeros tuvieran una actividad intercalante debido a consideraciones geométricas, el fotoisómero permanece plano, y en consecuencia, se contempla que tenga una asociación intercalante positiva con el ácido nucleico de doble cadena y, así, podría ser un mutágeno.

En este ejemplo, el análisis fotoquímico del 8-MOP se compara con el AMT. Las muestras se analizaron por HPLC de fase inversa usando una columna Rainen Dynamax 300A. El gradiente de elución se realizó con acetato de amonio/acetonitrilo 0,1 M (0-70% de acetonitrilo en 42 minutos). El AMT eluye como un único pico aproximadamente a los 24 minutos bajo estas condiciones. La detección fue por absorción bien a 260 o bien a 330 nm. La última longitud de onda se usó para el plasma que contenía las muestras.

Se prepararon disoluciones patrón de cada compuesto a varias concentraciones. Estas disoluciones se diluyeron entonces 1:10 en agua, entonces se inyectaron 300 \mul para el análisis. Todas las muestras se controlaron a 300 nm. Los picos se analizaron midiendo bien la altura del pico o bien midiendo el área del pico, entonces se convierte a un valor gh/ml usando la representación estándar. El área del pico se determinó fotocopiando el trazo, recortando la copia del pico, pesando entonces el trazo resultante. Los dos procedimientos dieron esencialmente el mismo resultado.

Los resultados se muestran en la Figura 7. Claramente, el AMT se degrada más rápidamente que el 8-MOP. Se esperaría, por lo tanto, que se generasen más fotoproductos -que finalmente terminarían en el recipiente de transfusión. En contraste, no se esperaba que el 8-MOP generase una cantidad significativa de fotoproductos. Esto es importante cuando uno considera que el peso de autoridad ha concluido que el 8-MOP no activado no es mutagénico.

Ejemplo 6

Cuando se activan las plaquetas, una glicoproteína de membrana alfa-granulo llamada GMP140 se expresa en la superficie de las plaquetas. Menos del (5%) de plaquetas normales no estimuladas, recientes expresan niveles detectables de GMP 140 por citometría de flujo. Véase de manera general M. J. Metzeiaar, Studies on the Expression of Activation-Markers on Human Platelets (Tesis 1.991).

Para medir el GMP140, se coloca una pequeña alícuota de plasma rico en plaquetas en un tampón HEPES que contiene un anticuerpo de unión a GMP140 o control IgG de ratón. El CD62 es un anticuerpo monoclonal disponiblecomercialmente que se une a GMP 140 (disponible en Sanbio, Uden, Holanda; Caltag Labs, So, San Francisco, CA, y Becton Dickinson, Mountain View, CA). Tras una incubación de quince minutos, se añade IgG de cabra anti-ratón conjugado con FITC al tubo en cantidades saturantes. Finalmente, las células se diluyen en una disolución salina isotónica, se fija con paraformaldehído y se analiza en un FACSCAN™ (Becton Dickinson, Mountain View, CA). El control positivo se hace por adición de forbol miristato acetato (PMA) al sistema de prueba a una concentración final de 10^{-7} M.

En este ejemplo, el CD62 se empleó para medir el impacto, si lo hubiera, de la irradiación sola sobre la activación de las plaquetas. El anticuerpo se almacenó en pequeñas alícuotas (0,01 mg/ml) a -40ºC previo a su uso. Se empleó un control de IgG de ratón (0,05 mg/ml) (Becton Dickinson, Mountain View, CA #9040) concentrado 5x. En el momento de usarlo, este se diluyó 1:5 en tampón HEPES. El anticuerpo secundario era IgG de cabra anti-ratón conjugado con FITC(TAGO, Burlingame, CA #3506). Éste se almacenó en pequeñas alícuotas a -20ºC. El forbol miristato acetato (PMA) (Sigma, St. Louis, MO) se almacenó a -40ºC. En el momento de usarlo, éste se disolvió en DMSO (la concentración de trabajo fue 1,62x10^{-5} M).

Se preparó paraformaldehído al 16% (PFA) (Sigma, St. Louis, MO) por adición de 16 gramos de paraformaldehído en 100 ml de agua desionizada. Esto se calentó a 70ºC, con lo cual se añadió gota a gota NaOH 3 M hasta que la disolución se aclaró. Se enfrió la disolución y se ajustó el pH a 7,4 con HCl 1 N. Esto se filtró y se almacenó. Se usó un tampón isotónico disponible comercialmente; Diluyente Isotónico Hematall (Fisher # CS 606-20).

Para medir la activación de las plaquetas de los concentrados de plaquetas, se obtuvo una unidad de plaquetas humanas del Blood Bank de Alameda-Contra Costa Medical Association. Se extrajeron alícuotas de 5 ml de la bolsa y recibieron cantidades específicas de irradiación UVA, excepto para el control, que no recibió otro tratamiento que colocarlo en una cámara para irradiación. La temperatura se mantuvo a 25ºC durante la irradiación colocando el concentrado de plaquetas en cámaras revestidas de agua con cristal tapado unidas a un baño de agua circulante. El dispositivo de irradiación (Derma Control, Dolton; Ill.; Modelo No. 1.224-Special) era como se describe en el Ejemplo 3, anteriormente.

Después de la irradiación, las plaquetas se almacenaron durante 5 días. En momentos puntuales específicos, se tomaron alícuotas y se procesaron.

El procesamiento incluía la adición de una alícuota (por ejemplo 5 microlitros) de concentrado de plaquetas a cada tubo de microcentrífuga que contenía el anticuerpo y los reactivos apropiados y esto se mezclaba muy suavemente en el vortex. Las muestras se incubaron durante 16 minutos a temperatura ambiente.

Se añadió el IgG-FITC cabra anti-ratón (diluido 1:10 en tampón HEPES) (5 microlitros) a cada tubo y la disolución se mezcló suavemente en el vortex. Se incubaron las muestras durante 15 minutos más a temperatura ambiente.

Se añadió Isoton 11 (1 ml) a cada tubo y se mezcló suavemente con una pipeta desechable de polipropileno. Se añadió PFA al 8% en HEPES (150 microlitros) a cada muestra diluida a una concentración final al 1%. Las plaquetas se analizaron en el FACSCAN™. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

TABLA 3

	Día 3	Día 5
Condiciones	Inactivado	PMA activado	Inactivado	PMA activado
Control	17	85	25	89
UV 5'	17	87	24	86
UV 10'	51	84	77	79

La activación se expresa como un porcentaje. Claramente, la irradiación durante 10 minutos (UV 10') resultó en un significativo impacto negativo sobre las plaquetas almacenadas; las plaquetas estaban altamente activadas. En contraste, la irradiación durante cinco minutos (UV 5') no resultó en la activación significativa sobre el control que no recibió irradiación.

Ejemplo 7

Dados los resultados del Ejemplo 6, está claro que es necesario bien un periodo de irradiación más corto o bien el uso de filtros para evitar el daño a las células por irradiación UV. En este ejemplo, se emplea CD62 para medir el impacto de la irradiación en presencia de psoralenos sobre la activación de las plaquetas. Se emplean separadamente periodos de irradiación más cortos y filtros de longitudes de onda.

Periodos de irradiación más cortos

Se obtuvo de nuevo una unidad de plaquetas humanas del Blood Bank de Alameda-Contra Costa Medical Association. Se extrajeron alícuotas de 5 ml de la bolsa para recibir cinco minutos (5') de irradiación UVA en presencia de 10 \mug/ml de 8-MOP, excepto para el control, que no recibió otro tratamiento que colocarlo en la cámara para la irradiación. Se mantuvo la temperatura a 25ºC durante la irradiación colocando el concentrado de plaquetas en cámaras revestidas de agua con cristal tapado unidas a un baño de agua circulante. El dispositivo de irradiación (Derma Control, Dolton; Ill.; Modelo No. 1.224-Special) era como se describe en el Ejemplo 3, anteriormente.

Después de la irradiación, las plaquetas se almacenaron otra vez durante 5 días como en el Ejemplo 6. En momentos puntuales específicos, se tomaron alícuotas y se ensayaron con el anticuerpo CD62 y se analizó en el FACSCAN™ para mostrar que, bajo estas condiciones, las plaquetas se pueden inactivar sin dañar a las células y almacenarse durante cinco días previos a la transfusión.

Filtros de longitudes de onda

Se usó una disolución acuosa de Co(NO_{3})_{2} junto con NiSO_{4} para eliminar de manera considerable el componente de 365 nm del espectro de emisión de la fuente de luz empleada. La disolución de Co-Ni se puede usar convenientemente en lugar de agua como refrigerante durante la irradiación.

Después de una irradiación de diez minutos con el filtro, las plaquetas se almacenaron y se ensayaron con el anticuerpo CD62 en el FACSCAN™ para mostrar que, bajo estas condiciones, las plaquetas se pueden inactivar sin dañar a las células y almacenarse durante cinco días previos a la transfusión.

Claims

1. Un dispositivo para el tratamiento de componentes sanguíneos en bolsas sanguíneas, que comprende:

a): una carcasa;

b): medios para proporcionar radiación electromagnética que comprenden una pluralidad de bombillas tubulares;

c): medios para soportar una pluralidad de bolsas sanguíneas a una distancia fija de dichos medios que proporcionan radiación;

d): medios para el mantenimiento de la temperatura de los productos sanguíneos dentro de un intervalo de temperatura deseado;

caracterizado porque un borde se envuelve alrededor de los extremos de las bombillas tubulares para obstruir estos extremos de la fuente de radiación electromagnética de las bolsas sanguíneas de irradiación en el dispositivo.

2. Un dispositivo de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que cada borde obstruye de 2 a 6 cm de la fuente de radiación electromagnética en cada extremo de las bolsas sanguíneas de irradiación en el dispositivo.

3. Un dispositivo de acuerdo con la Reivindicación 1 ó 2, en el que dicha radiación electromagnética tiene una longitud de onda entre 320 y 400 nm.

4. Un dispositivo de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, en el que dichos medios que soportan la bolsa sanguínea además comprenden medios para colocar una pluralidad de accesorios conectados a dichas bolsas sanguíneas, de manera que dichos accesorios no reduzcan significativamente la intensidad de radiación a dichas bolsas sanguíneas.

5. Un procedimiento para el tratamiento de componentes sanguíneos en una bolsa sanguínea, que comprende:

a): proporcionar

i): una bolsa sanguínea que contiene uno o más compuestos fotorreactivos y un componente sanguíneo sospechoso de contener un patógeno y

ii): un dispositivo de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4

b): colocar dicha bolsa sanguínea en dicho dispositivo; y

c): irradiar dicha bolsa sanguínea con dicha fuente de radiación electromagnética para activar al menos uno de dichos compuestos fotorreactivos e inactivar dicho patógeno.

6. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 5, en el que dicho compuesto fotorreactivo es un psoraleno.

7. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 5 ó 6, en el que dicho componente sanguíneo comprende plaquetas.

8. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 5 ó 6, en el que dicho componente sanguíneo comprende plasma.

9. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 5 a 8, en el que dicho componente sanguíneo es sospechoso de contener uno o más patógenos seleccionados de un grupo formado por bacterias, hongos, micoplasmas y protozoos.