BG104362A

BG104362A - Метод и устройство за инактивиране на биологични контаминанти с използване на фоточувствителни съединения

Info

Publication number: BG104362A
Application number: BG104362A
Authority: BG
Inventors: Raymond P. Goodrich Jr.; Frank Corbin Iii; Edward C. Wood Jr.; Dennis Hlavinka
Original assignee: Gambro, Inc
Priority date: 1998-07-21
Filing date: 2000-04-21
Publication date: 2001-04-30
Also published as: NO322633B1; EA002655B1; EP1972351A3; OA11633A; CN1287496A; ATE511861T1; NZ503474A; SK5832000A3; KR20010015594A; EP1972351A2; IL160481A0; JP4464939B2; AP2000001770A0; CN101239075B; HUP0004907A3; IL135100A0; EP1972351B1; NZ521054A; CN101239075A; EP2174669A1

Description

МЕТОД И УСТРОЙСТВО ЗА ИНАКТИВИРАНЕ НА БИОЛОГИЧНИ 37ΦΑ311И АгЕНТИ ПРИ ИЗПОЛЗУВАНЕ НА ФОТОЧУВСТВИТЕЛЕНИ СЪЕДИНЕНИЯ

ДАННИ ЗА СВЪРЗАНИ ЗАЯВКИ

Изобретението представлява частично продължение на заявка на САЩ No 09/119,666, подадена на 21.06.1998 г., която се включва в настоящето в цялатата си същност, до съвместима степен.

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Заразяването на кръвни продукти с инфекциозни микроорганизми, като HIV, хепатит и други вируси и бактерии, представлява сериозна заплаха за здравето на тези, които трябва да получат преливане на цялостна кръв или прилагане на различни кръвни компоненти, като тробмоцити, еритроцити (червени кръвни клетки), кръвна плазма, фактор VIII, плазминоген, фибронектин, анти-тромбин III, криопреципитат, белтъчна фракция на човешка плазма, албумин, имунен серумен глобулин, плазмени растежни хормони на протромбиновия комплекс и други съставки изолирани от кръв. Процедурите на селекция на кръвта може да пропуснат заразните агенти, а досега не са били на разположение процедури на стерилизация, които да не нараняват клетъчните съставки на кръвта, но ефективно да инактивират всички инфекциозни вируси и други микроорганизми.

Методите на разтворими детергенти за обезаразяване на кръвни компоненти действат чрез разтваряне на фосфолипидните мембрани заобикалящи вируси като HIV, и не нараняват протеиновите съставки на кръвта; въпреки това, ако присъстват кръвни клетки, такива методи не могат да се използува поради нараняване на клетъчната мембрана.

Използуването на фоточувствителни съединения, съединения които абсорбират светлина с определена дължина на вълната и предават абсорбираната енергия на който и да е акцептор на енергия, е било предложено за стерилизиране на кръвни компоненти. Например, заявка на европейски патент 196,515, публикувана на 08.10.1986, предлага използуването на не-ендогенни фоточувствителни съединения като порфирини, псоралени, акридин, толуидини, флавин (акрифлавин хидрохлорид), производни на фенотиазин, и багрила като неутрално червено, и метилен блу, като добавка на кръв. Протопорфиринът, който естествено се среща в тялото, може да се метаболизира до образуване на фоточувствително

съединение; въпреки това ползата от това съединение е ограничена от това, че то разгражда желани биологични действия на протеините. Хлорпромазинът също се дава за пример като едно такова фоточувствително съединение; въпреки това ползата от това съединение е ограничена от това, че то трябва да се отстранява от която и да е течност, която се прилага на пациент след процедурата на обезаразяване, защото има седативно действие.

Goodrich, R.P. et al., (1997), „The Design and Development of Selective, Photoactivated Drugs for Sterilization of Blood Products“, Drugs of the Future 22:159-171 предоставя преглед на някои фоточувствителни съединения включващи псоралени, и някои от важните резултати от използуването на фоточувствителни съединения за обезаразяване на кръвни продукти. Използуването на тексафирини за фоторазцепване на ДНК е описано в патент на САЩ No. 5,607, 924, издаден на 04. 03 1997 и No 5,714,328, издаден на 03.02.1998 г.на Magada et al. Използуванвето на сафирини за дезактивиране на вируси е описано в патент на САЩ No. 5,041,078 издаден на 20.08.1991 на Mattews, et al. Инактивирането на вируси с екстрацелуларна обвивка в кръв и кръвни компоненти от фентиазин-5-иум багрило плюс светлина е описано в патент на САЩ No. 5,545,516, издаден на 13.08.1996 на Wagner. Използуването на порфирини, хематопорфирини, и мероцианинови багрила като фоточувствителни съединения за изкореняване на инфекциозни заразни агенти, като вируси и протозоа, от телесни тъкани, като телесни течности, е описано в патент на САЩ No. 4,915,683, издаден на 10.04.1990 и свързан патент на патент на САЩ No. 5,304,113, издаден на 19.04.1994 на Sieber et

al. Механизмът на действие на такива фоточувствителни съединения е описан като включващ преференциално свързване към домени в липидния двоен слой, например при вирусите с обвивка и някои клетки инфектирани с вируси, фотовъзбудата на млекули на средства свързани към мембраните води до образуване на видове на реактивоспособен кислород, като синглет кислород, който причинява липидна пероксидация. Проблемът при използуване на такива фоточувствителни съединения е, че те атакуват клетъчната мембрана на желани компоненти на течностите, които трябва да бъдат обезаразени, като червените кръвни клетки, и синглет кислорода атакува, също така, желайте компоненти на протеините на третираните течности. Патент на САЩ No. 4,727,027, издаден на 23.02.1988 на Wiesehahn, G.P. et al., описва използуването на фурокумарини, включително псорален и производни, за обезаразяване на кръв и кръвни продукти, но посочва, че трябва да се предприемат етапи на намаляване на достъпноста на разтворения кислород и на други реактивоспособни видове, с цел да се инхибира денатурирането на биологичноактивни протеини, фотоинактивирането на вирусни и бактериални заразни агенти в кръвта, при използуване на халогенирани кумарини е описано в патент на САЩ No. 5,516,629, издаден на 14.05.1996 на Park, et al., патент на САЩ No. 5,587,490, издаден на 24.12.1996 на Goodrich Jr., R.P. et al., u патент на САЩ No. 5,418,130, на Platz, et al. и описват използуването на заместени псоралени за инактивиране на вирусни и бактериални заразни агенти в кръвта. По-късните патенти също сочат необходимоста от контролиране на радикалните увреждания на други кръвни компоненти. Патент на САЩ No. 5,654,443, издаден на 05.08.1997 на Wollowitz et al., посочва нови псораленови състави използувани за фотообезаразяване на кръв. Патент на САЩ No. 5,709,991, издаден на 20.01.1998 на Lin et al., посочва използуването на псорален за фотообезаразяване на тромбоцити и последващо отстраняване на псоралена. Патент на САЩ No. 5,120,649, издаден на 09.06.1992 и свързан патент на САЩ No. 5,232,844, издаден на 03.08.1993 на Horowitz, et al., Q също описват необходимоста от използуването на „гасители“ в комбинация с фото-чувствителни съединения, които атакуват липидните мембрани, и патент на САЩ No. 5,360,734, издаден на 01.11.1994 на Chapman et al., също поставя този проблем на предпазване от увреждане на други компоненти на кръвта.

Фоточувствителните съединения, които атакуват нуклеиновите киселини са известни от състоянието на техниката. Патент на САЩ No. 5,342,752, издаден на 30.08.1994 на Platz et al., описва използуването на съединения на основата на акридинови багрила за намаляване на паразитна С контаминация на кръв, включително червени кръвни телца, тромбоцити, и фракции на протеина на кръвната плазма. Тези материали, въпреки, че са с ниска токсичност, притежават известна токсичност, например към червените кръвни телца. Този патент не описва устройство за деконтаминация на кръв на основата на поточен метод. Патент на САЩ No. 5,798,238, на Goodrich Jr., R.P. et al., описва използуването на хинолон и хинолонови съединения за инактивиране на вирусно бактериално заразяване.

Свързването на ДНК с фоточувствително съединение е било използувано пни методи за намаляване на лимфоцитни

популации в кръв, както е посочено в патент на САЩ No. 4,612,007, издаден на 16.09.1986 и свързан патент на САЩ No. 4,683,889, издаден на 04.08.1987 на Edelson.

За рибофлавина (7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин) е докладвано, че атакува нуклеиновите киселини, фотопроменянето на нуклеинови киселини в присъствие на рибофлавин се дискутира в Tsugita, A. et al., (1965), „Photosensitized inactivation of ribonucleic acids in the presence of riboflavin“ Biochemica et Biophysica Acta 103:360-363; and Speck, W.T. et al., (1976), „Further Observations on the Photooxidation of DNA in the Presence of Riboflavin“ Biochemica et Biophysica Acta 435:39-44. Свързването на тумифлавина (7,8,10триметилизоалоксазин) към ДНК се описва в Kuratomi, К., et al., (1977), „Studies on the Interactions between DNA and Flavins“, Biochemica et Biophysica Acta 476:207-217. Hoffman, M.E., et al., (1979), „DNA Strand Breaks in Mammalian Cells Exposed to Light in the Presence of Riboflavin and Tryptophan“, Photochemistry and Photobioligy 29:299-303 описва използуването на рибофлавин и триптофан в индуцирано скъсване на ДНК на клетки от бозайник след излагане на източник на видима флуоресцентна светлина или близк до ултравиолетовата светлина. Статията описва, че този ефект не се получава когато рибофлавина или триптофана са изключени от хранителната среда. В Piette, J. et al., (1979) „Production of Breals in Single- and Double-Stranded Forms of Bacteriophage ФХ174 DNA by Proflavin and Light Treatment“, ДНК веригата се скъсва след излагане на профлавин и светлина Photochemistry and Photobioligy 30:369378, и промяна на гуаниновите остатъци по време на медиирано от профлавин фотосензитиране на ДНК се дискутира в Piette, J. et al., „Alteration of Guanine Residues during Proflavin Mediated Photosensitation of DNA“ Photochemistry and Photobioligy 33:325-333.

J. Cadet et al., (1983), „Mecanisms and Photosensitized Degradation of Nucleic Acids and Related Model Compounds“, Israel J. Chem. 23:420-429 описва механизма на действие чрез продуциране на синглет кислород от роза бенгалска (кисело ксантеново багрило), метилен блу, тионин и други багрила, в сравнение с механизми не изискващи продуциране на синглет кислород, чрез който нуклеиновите киселини атакуват чрез флавин, или методи на производни на птерон. В това описание се дават примери за Рибофлавина, като притежаващ способноста да разгражда нуклеинови кисеини. Korycka-Dahl, М., et al., (1980), „Photodegradation of DNA with Fluorescent Light in the Presence of Riboflavin, and Photoprotection by Flavin TripletState Quenchers“, Biochemica and Biophysica Acta 610:229-234 също описва, че активните видове кислород не се включват директно в срязването на ДНК от рибофлавин. Peak, J.G., et al., (1984), „DNA Breakage Caused by 334-nm Ultraviolet Light is Enhanced by Naturaly Occurring Nucleic Acid Components and Nucleotide Coenzymes“, Photochemistry and Photobioligy 39:713716 разучават механизма на действие на рибофлавина и на други фоточувствителни съединения. Въпреки това не се правят предположения такива фоточувствителни съединения да се използуват за деконтаминация на медицински течности.

Устройства за деконтаминация на кръв са описани в патент на САЩ No. 5,290,221, издаден на 01.03.1994 на Wolfe, Jr., et al., и патент на САЩ No. 5,536,238, издаден на 16.07.1996 на Bischof. Патент на САЩ No. 5,290,221, описва облъчването на течност в сравнително тесна, дъговидна дупка. Патент на САЩ No. 5,536,238 описва устройства използуващи оптични влакна опънати във филтратна среда. И двата патента препоръчват като фоточувствителни съединения производни на бензопорфирин, които имат афинитет към клетъчните стени.

Всички публикации отнасящи се към настоящето са включени за литератулна справка в обхват в съгласие с настаящето.

©

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Предоставят се методи и устройства за третиране на течност или друг материал за инактивиране на поне някои от микроорганизмите и белите кръвни клетки, които могат да присъстват в тях или върху тях. Такива течности могат, също така, да съдържат една или повече съставки избрани измежду група състояща се от протеин, например биологичноактивен протеин, като терапевтичен протеин, кръв и кръвни съставки, без да се разруши биологичната активност на тези съставки. Методите включват следното:

® а) смесва се с течност едно ефективно нетоксично количество ендогенно фоточувствително съединение или « производни фоточувствителни съединения на основата на ендогенни такива;

б) течността се излага на фотооблъчване достатъчна да активира фоточувствителното съединение; чрез което се инактивират поне част от микроорганизмите.

Един от механизмите чрез които тези фоточувствителни съединения могат да инактивират микроорганизми е чрез намесване на нуклеинови киселини, така че да предотвратят репликацията на нуклеиновите киселини.

Терминът „инактивиране на микроорганизми“, както се употребява в настоящето означава цялостно или частично предотвратяване на микроорганизмите да се реплицират, било то чрез убиване на микроорганизма, било то чрез намесването на неговата способност за репродуциране.

Микроорганизмите включват вируси (извънклетъчни, както и вътреклетъчни), бактерии, бактериофаги, фунги, паразити предавани чрез кръвта, и протозои. Примери за вируси включват вируса на придобитата имунна недостатъчност (HIV), вируси на хепатит А, В и С, sinbis вирус, цитомегаловирус, вируса на везикуларния стоматит, херпес симплекс вируси, например тип I и II, човешки Т-лимфотропни ретровируси, HTLV-III, вируса на лимфаденопатията LAV/IDAV, парвовирус, преносими чрез преливане вируси (ТТ), EpsteinBarr вирус, и други известни от състоянието на техниката. Бактериофагите включват ФХ174, фб, λ, R17, Т₄, и Т₂. Примери за бактерии включват Р. aeruginosa, S. aureus, S. epidermis, L. monocytogenes, E. coli, K. pneumonia and S. marcescens.

Инактивирането на белите кръвни клетки може да е желателно когато се цели подтискане на имунния или автоимунния отговор, например, при процеси включващи прливане на червени кръвни клетки, тромбоцити или плазма, когато могат да присъстват донорни бели кръвни клетки.

Материалите, които могатда се третират по методите на настоящото изобретение включват които и да са материали, които са адекватно пропускливи към фотооблъчване, за предоставяне на достатъчно светлина за да се достигне вирусно инактивиране, или които могат да се суспендират или разредят в течности, които притежават такава пропускливост към фотооблъчването. Примери за тъкива материали са цялостна кръв и водни състави съдържащи биологично-активни протеини произлизащи от кръв ирли кръвни съставки. Пакетирани червени кръвни клетки, тромбоцити и плазма (прясна или прясно замразена плазма) са примери за такива кръвни съставки. Освен това, терапевтични протеинови състави проилизащи от кръв, като течности съдържащи биологичноактивен протеин полезен при лечението на медицински нарушения, например фактор VIII, Von Willebrand фактор, фактор IX, фактор X, фактор XI, Hageman фактор, протромбин, анти-тромбин III, фибронектин, плазминоген, плазмен протеинов фактор, имунен серумен глобулин, модифициран имунен глобулин, албумин, плазмен растежен хормон, соматомедин, плазминоген стрептокиназен комплекс, церулоплазмин, трансферни, хаптоглобулин, антитрипсин и прекаликреин могат да се третират по методите на деконтаминация на настоящето изобретение. Други течности, които могат да се възползуват от третирането по настоящето изобретение са перитонеални разтвори използувани за перитонеална диализа, които понякога се заразяват по време на свързването, което води до перитонеални инфекции.

Терминът „биологично активно“ означава способно да извършва промяна в живи организми или в техни съставни части. „Биологично активно“, като се има предвид „биологично активен протеин“, както се отнася към настоящето, не се отнася до протеини, които са част от микроорганизмите подлежащи на инактивиране. Подобно, „не-токсично“, като се

има предвид фоточувствителни съединения, означава слабо или нетоксични за хора и други бозайници, и не означава нетоксично по отношение на микрооргнизмите подлежащи на инактивиране. „Съществено разграждане“ на биологичната активност означава най-малкото толкова голямо разграждане, колкото се причинява от порфирин и производните на порфирина, метаболити и тяхни предшественици, за които е известно, че притежават разрушаващо действие върху биологично активни протеини и клетки на хора и бозайници. Подобно „съществено не-токсично“ означава по-малко токсично отколкото порфирин и производните на порфирина, метаболити и тяхни предшественици, за които е известно, че се прилагат за стерилизация на кръв.

Терминът „кръвен продукт“, както се използува в настоящето, включва съставни части на кръвта и терепевтични протеинови състави съдържщи протеини произлизащи от кръв, както е дефиниране по-горе. Течности съдържащи биологичноактивни протеини, различни от тези получени от кръв, също могат да се третират по методите на изобретението.

Методите на обезаразяване на нстоящето иобретение използуващи ендогенни фоточувствителни съединения и ендогенни производни на основата на фоточувствителни съединения, не разрушават съществено биологичната активност на съставните части на течности, различни от микроорганизми. Запазва се колкото е възможно повече биологичната активност на тези съставни части, въпреки че панякога, когато се оптимизират методите, известна загуба на биологична активност, например денатуриране на съставните части на протеина, трябва да бъде балансирана срещу ефективно обезаразяване на течноста. Докато съставните части на течностите задържат достатъчна биологична активност, за да бъдат полезни за тяхното предназначение или естествени цели, те не се разглеждат като „същетвено разградени“.

фоточувствителните съединения полезни за това изобретение включват което и да е фоточувствително съединение, за което е известно от сътоянието на техниката, че е полезно за инактивиране на микроорганизми, „фоточувствително съединение“ се дефинира като което и да е съединение, което абсорбира радиация (облъчване) с една или повече дефинирани дължини на вълната и в последствие използува абсорбираната енергия за осъществяване на химическа реакция. Примери за такива фоточувствителни съединения включват порфирини, псоралени, багрила, като неутрално червено, метилен блу, акридин, толуидини, флавин (акрифлавин хидрохлорид) и прозводни на фенотиазин, кумарини, хинолони, хинони и антрохинони. фоточувствителните съединения съгласно настоящето изобретение могат да включват съединения, които за предпочитане абсорбират нуклеинови киселини, като така съсредоточават тяхния фотодинамичен ефект над микроорганизмите и вирусите, с малък или без ефект над придружаващите клетки или протеини. Други фоточувствителни съединения също са полезни в настоящето изобретение, като тези използуващи механизми зависими от синглет кислород. Най-предпочетени са ендогените фоточувствителни съединения. Терминът „ендогенен“ означава естествено открит в човешкото тяло или тяло на бозайник, или като резултат на синтеза от тялото или поради хрносмилане като естествено хранително вещество (например, витамините) или поради образуване на метаболити и/или продукти in vivo. Примери за такива ендогенни фоточувствителни съединения са алоксазини, като 7,8диметил-10-рибитил изоалоксазин (рибофлавин), 7,8,10триметилизоалоксазин (лумифлавин), 7,8-диметил алоксазин (лумихром), изоалоксазин-аденин динуклеотид (флавин аденин динуклеотид [ FAD], алоксазин мононуклеотид (известен също така като флавин мононуклеотид [FMN] и рибофлавин-5фосфат), витамини К, витамин L, тяхните метаболити и предшественици, и нафтохинони, нафталини, нафтоли и тяхните поизводни, притежаващи повърхностна млекулярна конформация. Терминът „алоксазин“ включва изоалоксазини. Фоточувствителни съединения производни на ендогенни такива включват синтетично получени аналози и хомолози на ендогенни фоточувствителни съединения, които могат да притежават или не низши (1-5) алкилови или халогенови заместители на фоточувствителните съединения, от които те са произлезли, и които предпазват действието и тяхната по същество не-токсичност. Когато се използуват ендогенни фоточувствителни съединения, по-специално когато такива фоточувствителни съединения не са с присъща токсичност или не довеждат до токсични фотопродукти след фотооблъчване, не са необходими етапи на отстраняване или на пречистване след обезаразяването, и третираните продукти могат директно да се върнат в тялото на пациента или да се приложат на пациент нуждаещ се от неговия терапевичен ефект. Предпочитани ендогенни фоточувстви-телни съединения са:

СНгОН

HOCH

I 9¾

7,8-диметил-10-рибитил изоалоксизин

н

7,8-диметилалоксазин

7,8,10-триметилизоалоксин

HOCH

изоалоксазин-аденин динуклеотид

СН₂ОРО₃ ²

HOCH

I

9H2

Алокксазин мононуклеотид

ВИТАМИН К1

СН₃ (СН2СН = ССН2)п

СНз

ВИТАМИН К2

СН₃

СНгСНзСНзСНСН

ВИТАМИН К5 aMM·

ВИТАМИН K-S (II)

ВИТАМИН К6

СН₃

ВИТАМИН К7

CH₃SCH₂

ВИТАМИН L

Методът на настоящето изобретение изисква смесване на фоточувствителни съединения с материал, които предстои да бъде обезаразен. Смесването може да се извърши чрез просто добавяне на фоточувствителните съединения или на разтвор съдържащ фоточувствителните съединения, към течност, която да бъде обезаразена. При един вариант на изпълнение на изобретнито, материалът подлежащ на обезаразяване, към който са прибавени фоточувствителни съединения се пропуска поточно покрай източник на фотооблъчване и потока на материала обикновено доставя достатъчна турбулентност за да се разпределят фоточувствителните съединения в течноста, която се подлага на обезаразяване. При един друг вариант за изплнение на изобртението течноста и фоточувствителното съединение се поставят във фотопропускащ контейнер и се облъчват в дозиращ режим, за предпочитане с разбъркване на контейнера до пълно разпределяне на фоточувствителното съединение и излагане на цялата течност на облъчване.

Количеството фоточувствително съединение, което трябва да се смеси с течнста ще е количество достатъчно адекватно да се инактивират микроорганизмите от нея, но помалко от токсично (за хора или други бозайници) или неразтворими количества. Както се предполага от настоящето, оптимални концентрации за желаните фоточувствителни съединения могат направо да се определят от специалистите в областа без излишно експериментиране. За предпочитане фоточувствителното съединение се използува при концентрация най-малко от приблизително 1 μΜ до разтворимоста на фоточувствителното съединение в течноста, и за предпочитане приблизително 10 иМ. За 7,8диметил-10-рибитил изоалоксазин, предпочетената концентрация е в границите от приблизително 1 μΜ и приблизително 160 μΜ, за предпочитане 10 μΜ.

Течността съдържаща фоточувствителни съединения се излага на фотооблъчване с подходяща дължина на вълната за да се активира фоточувствителното съединение, при използуване на известно количество фотооблъчване достатъчно да активира фоточувствителното съединение, както е описано по-горе, но по-малко от това, което би причинило не-специфични увреждания на биологичните съставки или по същество да е присъщо на биологичната активност на други протеини присъстващи в течноста. Използуваната дължина на вълната ще зависи от избраното фоточувствително съединение, както е известно от състоянието на техниката, или лесно се определя без излишно експериментиране произтичащо от знанието изложено погоре. За предпочитане източника на светлина е флуоресцентен или луминесцентен източник осигуряващ светлина от приблизително 300 nm до приблизително 700 nm, и по20 предпочитано от приблизително 340 nm до приблизително 650 nm облъчване. Дължината на вълната в границите от ултравиолетовата до видимата Светлана е полезна за това изобретение. Източника или източниците на светлина могат да доставят светлина в границите на видимата светлина, светлина в обхвата на ултравиолета, или за предпочитане смес от светлина във видимата и ултравиолетовата области, попредпчитано около половината във видимия спектър и около О половината в ултравиолетовия спектър, въпреки че могат да се използуват и други съотношения. Едно предимство на смесването на светлините е, че видимата светлина не наранява тромбоцитите, но намалява количеството на необходимата поболезнена ултравиолетова радиация.

Активираното фоточувствително съединение е способно да инактивира присъстващите микроорганизми, като се намесва в тяхната репликация. Специфичноста на действие на фоточувствителните съединения се придава от близоста на фоточувствителното съединение до нуклеиновата киселина на —. микроорганизма и това може да се дължи на сврзването на фоточувствителното съединение към нуклеиновата киселина. „Нуклеинова киселина“ включва рибонуклеинова киселина (РНК) и дезоксирибонуклеинова киселина (ДНК). Други фоточувствителни съединения могат да действат чрез свързване към клетъчните мембрани или чрез други механизми, фоточувствителното съединение може, също така, да се насочи към микроорганизма за инактивиране чрез ковалентно свързване към антитяло, за предпочитане специфично към микроорганизма моноклонално антитяло.

Течността съдържаща фоточувствителното съединение може да се пропусне във фотопропускаем контейнер за облъчваве. Терминът „контейнер“ се отнася до затворено или отворено пространство, което може да е направено от твърд или мек материал., например, може да е чанта или кутия или корито. Може да е затворено или отворено отгоре и може да има затварачки от двете страни, например, може да е тръба или тръбопровод, да позволява поточното преминаване на течноста през това. Използува се кювета за онагледяване на един примерен вариант за изпълнение на изобретението, включваща поточна система. Резервоарните торбички, като тези използувани за Trima™ Spectra™ и аферезисните системи на Cobe Laboratories, Inc., се използуват за изяснване на друг вариант за изпълнение на изобретението, включващ дозирано третиране на течноста.

Терминът „фотопропускливост“ означава, че мате-риалът на контейнера е достатъчно прозрачен на облъчване с необходимата дължина на вълната за активиране на фоточувствителното съединение. При поточната система контейнерът е с дълбочина (размерите са измерени в посока на облъчването от източника на фотооблъчване) достатъчна да позволи фотооблъчването адекватно да навлези в контейнера за да влезе в контакт с молекулите на фоточувствителното съединение на каквото и да е разстояние от източника на светлина и да осигури инактивиране на микроорганизмите в течноста, която трябва да се обезарази, и с дължина (размери в посока на потока на течноста) достатъчни зада осигурят на течноста достатъчно време на експозиция на фотооблъчванета. Материалите за изработване на такива

контейнери, дълбочината и дължината на контейнерите лесно могат да се определят от специалистите в областа без излишно експериментиране след наученото по-горе, изаедно със степента на потока преминаващ през контейнера, интензитета на фотооблъчванетаи абсорбентноста на съставните части на течноста, например плазма, тромбоцити, червени кръвни клетки, ще определи времето необходимо на течноста да бъде изложена на фотооблъчване. За 7,8-диметил10-рибитил изоалоксазин, предпочитаното количество облъчване е между приблизително 1 J/cm² до 120 J/cm².

При друг вариант за изпълнение на изобретението изискващ дозирано третиране, течноста подлежаща на третиране се поставя във фотопропусклив контейнер, който се разбърква и се излага на фотооблъчване за време достатъчно да инактивира съществено микроорганизмите, фотопропускливият контейнер е за предпочитане кръвна торбичка изработена от прозрачна или полупрозрачна пластмаса, и начинът на разбъркване е за предпочитане шейкерна маса (клатачка). фоточувствителного съединение може да се добави към контейнера в прахообразна или течна форма и контейнерът да се разбърква за да се размеси фоточувствителното съединение с течноста и достатъчно да се изложи цялата течност на фотооблъчванета за да се осигури инактивиране на микроорганизмите.

Фоточувствително съединение може да се добави към или да се пропусне във фотопроспускливия контейнер отделно от течноста, която трябва да се третира, или може да се добави към течноста преди да се постави течноста в контейнера. При един вариант за изпалнение на изобретението фоточувствителното съединение се прибавя към антикоагулант и сместта от фоточувствителното съединение и антикоагуланта се прибавят към течноста.

Също така към течноста могат да се прибавят енхансери (усилващи вещаства) за да направят процеса по-ефикасен и па-селективен. Такива енхансери включват антиоксиданти или други средства за предпазване от нарушения на желаните сътавки на течноста или за да се подобри степента на инактивиране на микроорганизмите и се посочват примери с аденин, хистидин, цистеин, тирозин, триптофан, аскорбат, Nацетил-1_-цистеин, пропил галат, глутатион, меркаптопропионилглцин, дитиотреитол, никоти-намид, ВНТ, ВНА, лизин, серин, метионин, глюкоза, манитол, тролокс, глицерол и тяхни смеси.

Тази смес включва също така течности съдържащи биологично активен протеин, кръв и кръвни съставки и също съдържащи ендогенни фоточувствително съединение, базиращо се на ендогенно производно на фото-чувствителното съединение, или негов фотопродукт получен по метода на претенция 1. Течноста може сащо да съдържа инактивирани микрорганизми.

Освен обезаразяването на цяла кръв, течностите съдържащи кръвни продукти и биологично активни протеини, този метод е полезен за третиране на други течности включително течности, които се използуват за хранене на хора или животни, като вода, плодове, сокове, млеко, хранителни бульони, супи и други подобни. Методът е полезен също за третиране на перитонеални или парентерални разтвори.

Настоящето изобретение включва също така и методи за третиране на повърхности за инактивиране на микроорганизми, които могат да присъсват върху тях, включащи прилагане върху такива повърхнасти на ефективно за инактивиране и нетоксично количество ендогенно фоточувствително съединение или фоточувствително съединение, базиращо се на ендогенно производно на фоточувствителното съединение и излагане на повърхноста за О фотооблъчване достатъчно да активира фоточувстви-телното съединение. Повърхонстта може да е повърхност на храна, като плод, зеленчук или животински трупове, повърхност или повърхности на нарязана или обработена храна. По-специални материали, като мляно месо, могат да се третират чрез смесване на фоточувствителното съединение с материала като продължава да се размесва, докато се облъчва за да се изложи прясна повърхност на фотооблъчване.

Алтернативно повърхноста може да е повърхност на хранителен препарат, като плот на кантар или покрития за ф складиране, или може да е повърхност на съдове за баня или за миене, като кухненска мивка, вана или сауна, или плувен басейн или други подобни. Освен това, повърхноста може да е повърхноста на живо животно или растение, или може да е повърхност на рана.

Фоточувствителното съединение може да се прилага с подходящ носител, като вода или разтвор съдържащ други добавки за третиране, чрез впръскване, потапяне в разтвор за промиване, изтриване със него, или чрез други начини известни от състоянието на техниката. Количеството фоточувствително съединение и енергия на фотооблъчване необходими за третиране лесно могат да се определят от специалистите в областа, без ненужно експериментиране, според степента на заразяване и материала за третиране.

Настоящето изобретение предоставя, също така, метод за третиране на течност или друг материал, както е посочено по-горе, за инактивиране на микроорганизми, които могат да присъстват там, включващи прибавяне на ефективно за инаквиране, нетоксично количество витамин К5 към ф посочената течност или друг материал. За предпочитане, не е задължително, течноста или материала се облъчва за да се засили инактивирането на микроорганизмите. В някои случаи, при използуване на витамин К5, инактивирането се получава при заобикаляща светлина или на тъмно, както по-долу се дискутира в примерното описание на изобретението. Предпочита се течностите съдържащи червени кръвни клетки да се третират с витамин К5 при отсъствие на етапа на фотооблъчване. К5 съединението може също да покрива повърхности, като кръв или тръбички за перитонеална диализа, ф пригодени да осигурят стерилно свързване и стерилно съхранение.

В системата за обезаразяване на настоящето изобретение изочника на фотооблъчване може да се свържи към фотопропусклив контейнер за течноста чрез светлинен водач, като канал или тръба на оптично влакно, което предпазва от разпръскване на светлината между източника и контейнера за течноста, и по-важното, предпазва от значително загряване на течноста в контейнера. Директното излагане на източника на светлината може да повиши температурата с 10 до 15°С, по-специално когато количеството течност изложено на светлината е малко, което може да причини денатуриране на кръвните компоненти. Използуването на светлинен водач запазва всякакво нагряване по-малко от 2°С. Методът може сащо да включва използуването на температурни сензори и механизми за изстудяване, когато е необходимо да се поддържа температурата под температури, при които желаните протеини в течноста се повреждат. За предпочитане температурата се поддържа между ф приблизително 0°С и приблизително 45°С, по-предпочитано между приблизително 4°С и приблизително 37°С, и найпредпочетено около 22°С.

Изобретението предоставя, също така, система за третиране на течност за инактивиране на микроорганизми, които могат да са включени в нея, съдържаща:

(a) контейнер съдържащ посочената течност и ендогенно фоточувствително съединение или фото-чувствително съединение, базиращо се на ендогенно производно на фоточувствителното съединение, като посочения контейнер е снабден с входни средства, и притежава фотопропусклива повърхност достатъчна да позволи излагане на течноста на едно количество фотооблъчване достатъчно за активиране на фоточувствителното съединение;

(b) най-малко един източник на фотооблъчване за доставяне на достатъчно фотооблъчване на течноста в посочения контейнер от тип и количество избрани да активират фоточувствителното съединение, докато присъстващите микроорганизми са съществено инактивирани.

Източникът на фотооблъчване може да е източник на видимо лъчение или ултравиолетово лъчение или и двете. За предпочитане се предоставят и двете - видимо и ултръвиолетово лъчение, и по-предпочитано фотооблъчването е приблизително наполовина ултравиолетово и наполовина видимо, въпреки че могат да се използуват и други съотношения, фотооблъчването в двата - ултръвиолетовия и видимия спектър, може да се достави конкурентно или последователно, като видимата част се доставя първа. Източника на фотооблъчването може да е обикновена лампа или може да се състои от множество лампи излъчващи с различна дължина на вълната. Източника на фотооблъчване трябва да е способен да доставя от около 1 до най-малко 120 J/cm². Използуването на смесена ултравиолетова и видима светлина е изключително предпочетено когато фоточувствителното съединение е такова, което губи неговата възможност да абсорбира видимата светлина след период на излагане, като 7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин.

Могат да се използуват каквито и да са средства известни от състоянието на техниката за добавяне на фоточувствително съединение към течноста подлежаща на деконтаминация и за поставяне на течноста във фотопропускливия контейнер, като тези методи характерно включват поточни проводи, отверствия, резервоари, клапани и други подобни. За предпочитане системата включва средства като помпи или настройстващи се клапини за контролиране на потока на фоточувствителното съединение в течноста, която ще се обезаразява, така че нейната концентрлация може да се контролира в ефективни нива, както е описано по-горе. При един вариант за изпълнение на изобретението фоточувствителното съединение се смесва с антикоагулантен пълнеж към кръвна аферезисна система. За ендогенни фоточувствителни съединения и производни притежаващи захарни части pH на разтвора за предпочитане се поддържа достатчно ниско, както е известно от състоянието натхниката, за да се предотврати отделянето на захарните части. За предпочитане фоточувствителното съединение се добавя към течноста, която предстои да се обезарази в предварително разбърксан воден разтвор, например, във вода или буферен Ф разтвор за съхранение.

фотопропускливият контейнер за поточната система може да е прозрачна кювета изготвена от поликарбонат, стъкло, кварц, полистирен, поливинилхлорид, полиолефин, или друг прозрачен материал. Кюветата може да е включена в камера за облъчване притежаваща огледални стени. Усилвател на източника на фотооблъчванета, като втори източник на фотооблъчване или отразяваща повърхност може да се постави в близост до кюветата, за да се увеличи количеството фотооблъчване в допир с течноста в кюветата. Системата за предпочитане съдържа помпа за нагласяване на скороста на потока на течноста до желани нива, за да се осигури значително обезаразяване, както е писано по-горе. Кюветата е с дължина координирана от скороста на потока, достатъчна за да се изложи течноста на достатъчно фотооблъчване, за да се осъществи значителното й обезаразяване.

За предпочитане, също така, кюветата се поставя отделно от източника на светлина, на значително разстояние, при което се избягва нагряването на течноста в кюветата, и светлината се предава от източника на светлина до кюветата чрез водач на светлина.

При друг вариант за изпълнение на изобретението течността се поставя във фотопропусклив контейнер, като пликче за кръв, например, използуван със системата за аферезис, описана в патент на САЩ No. 5,653,887 и се разбърква докато се излага на фотооблъчванета. Подходящи пликчета включват пликчета за събиране на кръв, както е описано в настоящето. Пликчетата за събиране на кръв използувани в системата Spectra™ или системата за аферезис Trima™ на Cobe Laboratories, Inc. са особено подходящи. От състоянието на техниката са известни шейкерни маси, например както е описано в патент на САЩ No. 4,880,788. Пликчето е снабдено с отверстие за добавяне на течноста в него. При един вариант за изпълнение на изобретението фоточувствителното съединение, за предпочитане 7,8-диметил10-рибитил изоалоксазин се прибавя към пликчето пълно с течност под прахообразна форма. След това пликчето са поставя върху шейкерната маса и се разклаща докато по същество цялата течност не се изложи на фотооблъчването. Алтернативно, пликчето може предварително да се пакетира с прахообразното фоточувствително съединение, което се съдържа там. След това течноста подлежаща на обезаразяване може да се добави през подходящото отверстие.

Системи за обезаразяване, както са описани по-горе, могат да се проектират като самостоятелни единици или могат лесно да се инкорпорират в съществуващи устройства (апарати), известни от състоянието на техниката за разделяне или третиране на кръв, която е изтеглетна от или е приложена на пациент. Например, такива устройства за боравене с кръв

EP 2 175 709

3^ и инсектицидни вредители, които оказват влияние върху поникването и растежа.

[0385] Както се използват тук термините „пестициден ефект” и „пестицидна активност” означават каквото и да е директно или недиректно действие върху целените вредители, което дава като резултат намаляване на нанесените вреди върху обработените семена, както и върху плодовете, корените, листата и/или пъпките на растенията, които са пораснали от обработени семена в сравнение с необработени семена или съответно с растения, които са пораснали от необработени семена. Терминът „активни против (първи или втори) вредител” също има същото значение. Такива директни или недиректни действия включват убиване на вредители, отблъскване на вредителите не семената, плодовете, корените, пъпките и/или листата на растенията, възпиране на храненето на вредителите върху или снасянето на яйца върху семената, плодовете, корените, пъпките и/или листата на растенията и спиране или предотвратяване на възпроизвеждане на вредителите.

[0386] Вредители в частност включват родени в почвата и обитаващи почвата вредители върху пъпките и листата.

[0387] Конкретни гъби, които трябва да бъдат контролирани, включват:

Albugo spp. (бяла ръжда) на декоративни, зеленчуци (например А. Candida) и слънчогледи (например A. tragopogonis)', Alternaria spp. (Alternaria петна no листата) на зеленчуци, рапица (A. brassicola или brassicae), захарно цвекло (A. tenuis), плодове, ориз, соя, картофи (например A. solani или A. alternata), домати(например A. solani или А. alternata) и пшеница; Aphanomyces spp. на захарно цвекло и зеленчуци; Ascochyta spp. на житни растения и зеленчуци, например A. tritici (anthracnose) на пшеница и A. hordei на ечемик; Bipolaris и Drechslera spp. (телеморфно: Cochliobolus spp.) на царевица (например D. maydis), житни

120

изложи на по-високи енергии на облъчване за по-дълъг период от време, да се разбърква по-продължително време или да се изложи на фотооблъчване в плитки контейнери или проводи, които могат да се използуват с други кръвни съставки.

Ендогенните фоточувствителни съединения и фоточувствителните съединения, базиращи се на ендогенно производно на фоточувствителното съединение, описани в настоящето могат да се използуват в системи за обезаразяване на кръв съществуващи от преди това, както и при система за обезаразяване, описана в настоящето, фоточувствителните съединения и фоточувствителните съединения, базиращи се на ендогенно производно на фоточувствителното съединение, от настоящето изобретение могат да се използуват в системи за обезаразяване описани в патенти на САЩ No.5,290,221, 5,536,238, 5,290,221 и 5,536,238.

Разтвори за добавка на тромбоцити съдържащи ендогенни фоточувствителни съединения и фоточувствителните съединения, базиращи се на ендогенно производно на фоточувствителното съединение, описани по-горе, също се предоставят в настоящето. Разтворите за добавка на тромбоцити известни от състоянието на техниката могат да се използуват за тази цел и включват тези описани в патент на САЩ No.5,908,742; 5,482,828; 5,569,579; 5,236,716; 5,089,146; и 5,459,030. Такива разтвори за добавка на тромбоцити могат да включват физиологичен разтвор, буфер, за предпочитане натриев фосфат, и други компоненти, включващи магнезиев хлорид и натриев глюконат. pH на такива разтвори е за предпочитане около 7,0 и 7,4. Тези разтвори са полезни като носители за концентрати на тромбоцити, за да позволят поддържането на качеството на клетките и на метаболизма по време на съхранението, намаляване съдържанието на плазма и за удължаване живота на съхранене. фоточувствителното съединение може да присъства в такива разтвори в каквито и да са желани концентрации от приблизително 1μΜ до разтворимоста на фото-чувствителното съединение в разтвора, и за предпочитане между 10 μΜ и приблизително 100 μΜ. При един предпочитан вариант за изпълнение разтвора за добавка на тромбоцити съдържа също енхансери (усилватели), както е описано по-горе. Предпочетен разтвор за добавка на тромбоцити съдържа натриев ацетат, натриев хлорид, натриевглюконат, 1,5 тМ магнезиев хлорид, 1тМ натриев фосфат 14 μΜ 7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин и за предпочитане също 6 тМ аскорбат.

КРАТКО ОПИСАНИЕЕ НА ФИГУРИТЕ фигура 1 изобразява спектъра на абсорбция на рибофлавина.

фигура 2 изобразява корелация между абдорбцията на светлина и хематокрита, наблюдавана и предсказана за червените кръвни клетки, и предсказана за тромбоцитите.

фигура 3 изобразява фоторазграждането във времето на рибофлавина в разтвор на антикоагулант Acid Citrate Dextrose (ACD) (Кисел Цитрат на Декстроза). Плътната линия с квъдратчета означава процента първоначален рибофлавин останал при 447 nm.

фигура 4 изобразява профила на предаване на различни пластични кювети като функция от дължината на вълната. Плътната линия представлява 3,2 mm акрилова кювета.

Линията в пунктир (----) представлява 3,2 mm UV акрилова кювета. Прекъснатата линия (—--) представлява 3,2 mm полистиролова кювета (PS), и пресечената линия представлява

3,2 mm поликарбонотна кювета (PC).

фигура 5 изобразява потока светлина необходим в mW на cm² като функция от скороста на потока, т.е. поток необходим да достави един джаул/cm² на пробата в кюветата.

фигура 6 устройство за разделяне на кръв инкорпориращо фотооблъчващото устройство на изобретението.

фигура 7 изобразява постановката за обезаразяване на изобретението.

фигура 8 изобразява инактивирането на бактерии в препарат на тромбоцити, при използуване на витамин К5 като фоточувствително съединение, като функция от енергията на облъчване.

фигура 9 изобразява инактивирането на бактерии като функция от препарат на тромбоцити и енергията на облъчване, при използуване на добавъчен разтвор на 90% тромбоцити и 10% тромбоцити.

фигура 10 показва ефекта на инактивиране на вируси, бактериофаги и бактерии при добавяне на антиоксидант към концентрат от тромбоцити.

фигура 11 показва кривата на инактивиране за вирус Herpes Simplex тип II като функция от концентрацията на фоточувствителното съединение при енергия на облъчване от 20 J/cm², при използуване на половина ултравиолетова и на половина видима светлина.

фигура 12 показва инактивирането на S. epidermidis при различни концентрации на фоточувствителното съединение и енергия на облъчване.

фигура 13 показва инактивирането на ФХ174 при различни концентрации на фоточувствителното съединение и енергия на облъчване.

Фигура 14 показва инактивирането на S. aureus и ФХ174 при различни концентрации на енергия на облъчване при използуване на 40:50 смес на ултравиолетова и видима светлина.

фигура 15 показва инактивирането на S. epidermidis и HSV-II при различни енергии на облъчване, при използуване на 50:50 смес от ултравиолетова и видима светлина.

Фигура 16 показва инактивирането на HSV2 вирус в кръвни пликчета разбърквани и облъчвани при разлино ниво на облъчване.

Фигура 17 сравнява резултатите за vaccinia вирус и различни течности, при използуване на ултравиолетова светлина само или смес 50:50 от ултравиолетова и видима светлина.

Фигура 18 сравнява резултатите на инактивиране със и без фоточувствително съединение на vaccinia вирус при различно време на облъчване.

Фигура 19 сравнява инактивирането на извънклетъчен HIV-1 при 5 и 50 μΜ фоточувствителнжо съединение и променящи се енергии на облъчване.

фигура 20 сравнява инактивирането на вътреклетъчен HIV-1 при 5 и 50 μΜ фоточувствително съединение и променящи се енергии на облъчване.

фигура 21 сравнява инактивирането на вътреклетъчен HIV-1 при 5 и 50 μΜ фоточувствително съединение и променящи се енергии на облъчване, при използуване на нивата на р24 антигена.

фигура 22 показва инактивирането на HSV-II при променящи се нива на енергията на облъчване, при използуванве на концентрат на тромбоцити в среда съдържаща разтвор за прибавяне към тромбоцити с аскорбинова киселина.

фигура 23 показва един вариант за изпълнение на изобретението чрез използуване на пликче за кръв, което да съдържа течноста, която се третира и фоточувствително съединение и шейкерна маса за разбъркване на течноста, докато се излага на фотооблъчване от източник на светлина.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Методът за обезаразяване на настоящето изобретение, при който се използуват ендогенни фоточувствителни съединения и фоточувствително съединение, базиращо се на ендогенно производно на фоточувствителното съединение се изяснява в настоящето с пример за 7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин като фоточувствително съединение, като може да се използува което и да е фоточувствително съединение, способно да бъде активирано чрез фотооблъчване, за да причини обезаразяване от микроорганизми, фоточувствителното съединение трябва да е такова, което не разрушава желаните съставни части на течноста подложена на обезаразяване, а също така за предпочитане, което не се разпада в резултата на фотооблъчването в продукти, които в

Η* значителна степен разрушават желаните съставни части или притежават значителна токсичност. Дължината на вълната при която се активира фоточувствителното съединение се определя както е описано в настоящето, при използуване на литературни източници или директно измерване. Неговата разтворимост в течноста, която трябва да бъде обезаразена или в комбинация с течност-носител и течност, която трябва да бъде заразена също се определя по този начин. Способноста на фотооблъчването при активиращата дължина на вълната да проникне в течноста, която предстои да бъде обезаразена, също трябва да се определи както се предлага в нстоящето. Определят се, също така, подхо-дящите температури за реакцията на фото-чувствителното съединение с неговия субстрат, както и границите на температурата, интензитета на фотооблъчване и продължителноста, и концентрацията на фоточувствително съединение, което ще оптимизира микробиалното инактивиране и ще намали до минимум вредите върху желаните протеини и/или клетъчни съставки в течноста. Примери от 1 до 7 и фигури от 1 до 5 илюстрират определянето на необходимата информация за развитие на поточната система за обезаразяване от настоящето изобретение.

След като изискванията на системата веднъж са определени към поточната система, могат да бъдат конструирани устройства, които да предоставят правилната скорост на потока, фотопропускливоста, и интензитета на светлината причиняващ инактивиране на присъстващите микроорганизми в течноста, както е посочено в настоящето. Течноста подложена на обезаразяване се смесва с фоточувствително съединение след което се облъчва с

достатъчно количество фотооблъчване за да активира фоточувствителното съединение да реагира с микроорганизми в течноста, така че тези микроорганизми от течноста да се инактивират. Количеството фотооблъчване достигащо микроорганизмите в течноста се контролира чрез избор на подходящ източник на фотооблъчване, на подходящо разстояние на източника на фотоаблъчване от течноста подлежаща на обезаразяване, което може да се увеличи чрез използуване на водачи на светлина, които да проведат фотооблъчването директно върху контейнера за течноста, на подходящ фотопропусклив материал за контейнера за течноста, една подходяща дълбочина, която да позволи пълно проникване на фотооблъчванета в контейнера, усилватели на фотооблъчването, като един или повече допълнителни източника на фотооблъчване, за предпочитане на срещуположната страна на контейнера от първия, подхояща скорост на течноста в контейнера и походяща дължина на контейнера позволяваща достатъчно време за инактивиране на присъстващите микроорганизми. Могат да са необходими също така, монитори за температурата и контролери, за да се поддържа течноста при оптимална температура, фигура 6 изобразява система за обезаразяване на изобретението, като част от устройство за разделяне на кръвните съставки, а фигура 7 предоставя детайли от предпочитана система за обезаразяване.

При дозираните системи се предпочита течноста подлежаща на обезаразяване да се постави заедно с фоточувствителното съединение в торбички, които са фотопропускливи или поне достатъчно фотопропускливи за да позволят достатъчно облъчване за да се достигне тяхното съдържание, за да се активира фоточувствителното съединение. Достатъчно количество фоточувствително съединение се прибавя към всяка торбичка за да се предостави инактивиране, за предпочитане за да се предостави концентрация на фоточувствителното съединение поне от 10 до 120 J/cm² за период от около 6 и около 36 минути, за да се осигури излагане на по същество цялата течност на облъчването. За предпочитане се използуват конкурентно комбинация от видима и ултравиолетова светлина, фоточувствителното съединение може да се добави под прахообразна форма.

Методите за предпочитане използуват ендогенни фоточувствителни съединения, включително ендогенни фоточувствителни съединения, които действат чрез намесване на репликацията на нуклеиновите киселини. 7,8-диметил-10рибитил изоалоксазин е предпочитаното фоточувствително съединение за използуване в изобретението. Предполагаемият химическия процес протичащ между изоалоксазина и нуклеиновите киселини не се осъществява чрез синглет кислород зависещи процеси (т.е. Тип II механизъм), а по-скоро директно чрез взаимоотношение между фоточувствително съединение и субстрат (Тип I механизъм). Cadet eta I., (1983) J.Chem., 23:420-429 ясно показва, че ефектите от 7,8-диметил10-рибитил изоалоксазина се дължат на не-синглет кислородно окисляване на гуанозиновите остатъци. В допълнение, аденозиновите бази се оказват чувствителни към ефектите на

7,8-диметил-10-рибитил изо-алоксазина плюс UV светлина. Това е важно тъй като аденозиновите остатъци са относително

нечувствителни към синглет-кислород зависимите процеси.

7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазинът се оказва, че не продуцира големи количестви синглет кислород при излагане на UV светлина, а по-скоро упражнява свойте ефекти чрез директно взоимодействие със субстрата (например, нуклеинови киселини) чрез реакциии на електронен трансфер с някои видове фоточувствителни съединения във възбудено състояние. След като първоначално се нанесат безразборни вреди върху клетките и протеините от източника на синглет кислород, този механичен път за действие на 7,8-диметил-10рибитил изоалоксазина позволява по-висока селективност, отколкото е случая със съединения като псоралени, които притежават значителна Тип II химия.

фигура 6 показва устройство на апарат за кръв и система за аферезис включваща устройствата за фотооблъчване на изобретението. Цялостна кръв се отнема от донор/пациент 4 и се подава на система за аферезис или на устройство за разделяне кръвта на съставните и части 8, където кръвта се разделя на различни типове съставни части и поне един тип от тези съставни части на кръвта се отстранява от устройството 8. Тези съставни части на кръвта след това могат да се доставят за последващо използуване от друг или могат да претърпят терапевтично третиране и да се върнат в донора/пациента 4.

При устройството за разделяне на съставните части на кръвта, кръвта се взима от донор/пациент 4 и се отправя през една извънтелесна тръбна система 10 и съд за процесинг на кръвта 12, дефинираща напълно затворена и стерилна система. Устройството за разделяне на съставните части на кръвта 8 е свързано към помпа (не е показана). Кръвният поток от донора/пациента 4 през извънтелесната тръбна система 10 и в ротационен съд за процесинг на кръвта. Кръвта в съда за процесинг на кръвта 12 се разделя на различни типове съставни части на кръвта и тези типове съставни части на кръвта (тромбоцити, плазма, червени ксръвни клетки) постоянно се отстраняват от съда за процесинг на кръвта 12. Съставните части на кръвта, които не са били задържани за съхранение или за терапевтично третиране (например, червени кръвни клетки, бели кръвни клетки, плазма) също се отстраняват от съда за процесинг на кръвта 12 и се връщат в донор/пациент 4 чрез извънтелесната тръбна система 10.

Операцията на устройството за отделяне на съставните части на кръвта е за предпочитане се контролира чрез един или повече компютърни процесори включени в него.

Извънтелесната тръбна система 10 включва сборна касета 14 и известен брой групи от тръби 20, 50, 60, 80, 90, 100 взаимосвързани с нея. Групите от тръби за отстраняване /връщане на кръвта 20 доставят едноиглена периферия между донор/пациент 4 и сборната касета 14, и входящата/кръвна група от тръби 60 доставя периферия между сборната касета 14 и съда за процесинг на кръвта 12. Антикоагулантна съвкупност от тръби 50, съвкупност от тръби за събиране на тромбоцити 80, съвкупност от тръби за събиране на плазма 90, съвкупност от тръби за събиране на червени кръвни клетки 70 и съвкупност от тръби на пликче 100 също взаимно се свързват със сборна касета 14.

Групата от тръби за отстраняване/връщане на кръвта 20 включва подгрупа от игли 30 свързани към тях и антикуагулантна тръба 26 свързана към антикуагулантна тръбна група 50 през сборна касета 14.

Сборна касета 14 включва предни и задни оформени пластични панички, залепени заедно посредством термо шев, които определят правоъгален елемент на касета, притежаващи непрексъснати канали за течности. Сборната касета 14, освен това включва известен брой излизащи навън тръбни колена свързващи помежду им различни непрекъснати канали. Непрекъснатите канали също са свързани с различните групи тръби.

Характерно, сборна касета 14 се свързва с антикуагулантна тръба 26 от групата тръби за отстраняване/връщане на кръвта 20 и с антикуагулантна тръбна група 50. Антикуагулантната тръбна група 50 вкючва клинообразна капкова камера 52, която може да се свърже към антикуагулант и към източник на фоточувствителни съединения 53 и стерилизиращ филтър 56. При употерба антикуагулантната тръбна група 50 захранва с антикуагулант смесен с фоточувствитело съединение отстранената кръв от донор/пациент 4, за да намали или да предотврати каквото и да е съсирване в извънтелесната тръбна система 10. Известни са много антикуагуланти от предшестващото състояние на техниката, например, както са описани в глава 3 от ААВВ Technical Manual, 11^th edition, 1993, включително ACD-A, CPD, CP2D, CPDA-1 и хепарин. Тези последните, както и разтворите за съхранение на клетки, AS-1, AS-З и AS-5, всички са съвместими с ендогенните фоточувствителни съединения и ендогенно-базираните производни на фоточувствителни съединения описани в настоящето.

Сборната касета 14 вкючва също и връзка с тръба за отстраняване на кръв от групата от тръби за отстраняване/връщане на кръвта 20. Кръвта преминава през датчик за налягане и входен филтър в сборната касета 14 от където кръвта се влива в тръба 62. Тръбата за вливане на кръвта 62 също е свързана със съда за процесинг на кръвта 12 осъществяващ процесинг на цялостната кръв.

За връщане на отделните съставни части на кръвта до • сборната касета 14, групата от тръби бОза входната кръв/кръвните съставни части, освен това включва изходна тръба за червени кръвни клетки (RBC) / плазма, като изходната тръба за тромбоцити и изходната тръба за плазма са свързани със съответните изходни накрайници на съда за процесинг на кръвта 12. Изходните тръби за червени кръвни клетки (RBC) / плазма отвеждат разделените съставни части от червени кръвни клетки (RBC) / плазма през сборната касета 14 до групата тръби за събиране на червени кръвни клетки 70 през една първа система за обеззаразяване 72. Изходната тръба за * тромбоцити отвежда отделените тромбоцити през сборната ~ касета 14 до групата тръби за събиране на тромбоцити 80 през една втора система за обеззаразяване 82. Изходната тръба за плазма отвежда отделената плазма през сборната касета 14 до групата от тръби за събиране на плазма 90 през третата система за обеззаразяване 92. След облъчване в системите за обеззаразяване 72, 82 и 92, за активиране на фоточувствителни съединения и дезактивиране на присъстващите микроорганизми, съставните части на кръвта се събират в резервоар (пликче) за червени кръвни клетки 74, резервоар за тромбоцити 84 и резервоар за плазма 94.

Вентилният резервоар 104 може да се използва за вкараване на газове в системата.

На фигура 7 е показана самостоятелна версия на групата за обеззаразяване от това изобретение. Кръвният продукт 180 (който може да бъде наскоро събрана кръв или кръвни съставни части или съхранявана кръв) е свързана с линията на кръвния продукт 186 която преминава през помпа 184 до кюветата за обеззаразяване 164. Резервоарът за фоточувствителни съединения 166 е свързан с входната линия за фоточувствителни съединения 168 снабдена с входна помпа 170 и отвежда към линията на кръвният продукт 186 над кюветата за обеззаразяване164. Кюветата за обеззаразяване 164 е кювета пропускаща светлина на която дълбочината (d) и дължината (I) се избират така, че да осигурят обеззаразяването. Охлаждаща система 190 комбинирана с екран за темепратурата 192 са свързани с кюветата за обеззаразяване 164 за контролиране на температурата в течността. Кюветата за обеззаразяване 164 е свързана посредством световод 162 към източник на светлина 160. Усилвател на фотооблъчването 163 е разположен в близост до (или е долепен или е на известно растояние от) кюветата за обеззаразяване 164 за увеличаване на количеството фотооблъчване достигащо до кръвният продукт в кюветата. Линията на обеззаразеният кръвен продукт 188 води от кюветата за обеззаразяване 164 до мястото за събиране на обеззаразен кръвен продукт 182.

При работа, кръвният продукт 180 се отвежда в линията за кръвния продукт 186 където се прибавят фоточувстителни съединения от резервоара за фоточувствителни съединения

166 вливащи се при скорост контролирана от входната помпа за фотчувствително съединение 170 във входната линия за фоточувсвително съединение 68 която се присъединява към линията на кръвния продукт 186. Скоростта на потока на линията на кръвния продукт 186 се контролира от помпа 184 до скорост избрана да осигурява обеззаразяването в кюветата за обеззаразяване 164. Екран за температурата 192 измерва температурата на течноста в кюветата 164 и контролира охладителната система 190 която поддържа температурата в кюветата в съответствие с изискванията за оптимална работа.

Кръвният продукт в кюветата за обеззаразяване 164 се облъчва със светлина от източник на фотооблъчване 160 преминаваща през световод 162. Източникът на фотооблъчване може да излъчва две или повече светлини. Стрелките означават фотооблъчванве от края на световод 162 разпространяващо се в кръвния продукт в прозрачната кювета за обеззаразяване 164. В близост до кюветата за обеззаразяване 164 е усилвател на фотооблъчване 163 който може да бъде допълнителен източник на фотооблъчванве или отразяваща повърхност. Стрелките от усилвателя на светлина 163 насочени към кюветата за обеззаразяване 164 означават фотооблъчване от усилвател на светлина 163 осветяващ материала от кръвен продукт в кюветата 164. Обеззаразеният кръвен продукт напуска кюветата за обеззаразяване 164 през линията на обеззаразения кръвен продукт 188 и се събира в колектора за обеззаразен кръвен продукт 182.

При един вариант за изпълнение на изобретението, при който се използува 7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин от Sigma Chemical Company като фоточувствително съединение, се използува водач на светлината от EFOS Corporation, Williamsville, N.Y., съставен от оптично влъкно. Системата е в състояние да достави осветяване с фокусирана светлина с интензитет 6,200 mW/cm² в областа на 355-380 nm. Въможно е, също така, да се използуват със системата заменяеми филтри за да се постигне на изхода 4,700 mW/cm² в спектралната област от 400-500 nm. При всички случаи светлината на изхода в областа на 320 nm и по-ниско е незначителна. Водачи на светлина с различни размери (3,5 и 8 mm) се доставят със системата. Светлината излиза от водача на светлина през накрайник при 21 градуса разпръскване. 8 mm водач на светлина е пригоден, правилно поставен, за да освети подходящо лицето на предпочитана кювета за обезаразяване, която е стандартна кювета използувана върху Cobe Spectra® заменяеми комплекти от Industrial Plastics, Inc., Forest Grove, OR.

Скоростта на потока варира и се определя чрез количеството енергия на светлинатата, която възнамеряваме да доставим на пробата. Скоростта на потока се контралира чрез перисталтична помпа от Cole-Parameter Instruments Company, Vernon Hills, IL. Скоростта на светлината и типа на входящия поток могат да се контролират чрез компютърен процесор, както е известно от предшестващото състояние на техниката.

Фигура 23 изобразява устройство от настоящото изобретение, в което течноста, която трябва да бъде обезаразена се поставя в пликче за кръв 284 снабдено с входящ отвор 282, през който фоточувствителното съединение в прахообразна форма 284 се прибавя от колба 286 чрез

вливаща се струя 288. Шейкерната маса 280 се пуска в действие за разбъркване на пликчето 284 за да се разтвори фоточувствителното съединение 290, докато източника на фотооблъчване 260 се активира за да облъчи течноста и фоточувствителното съединение в пликчето 284. Алтернативно, пликчето може да се достави предварително пакетирано да съдаржа фоточувствително съединение и след това течноста се доставя в пликчето.

Методите на изобретението не изискват използуването на усилватели като „гасители“ или „чистачи на кислорбд“, въпреки че те биха могли да се използуват да засилят процеса на намаляване обхвата на не-специфични клетки или протеинувреждащи химикали или да усилят скороста на инактивиране на патогенни. Други предпочитани методи използуващи нетоксични ендогенни фоточувствителни съединения и фоточувствителни съединения, базиращи се на ендогенно производно на фоточувствителното съединение не изискват отстраняването на фоточувствително съединение, базиращо се на ендогенно производно на фоточувствителните съединения не изискват отстраняване на фоточувствителното съединение от течноста след фотооблъчването. Резултатите показват малки или не показват увреждания на другите съставни части на кръвта, например, тромбоцитите остават биологично активни пет дни след третирането.

ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

ПРИМЕР 1

Профил на абсорбция на 7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин

Проба от 7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин (98% чистота) се получава от Sigma Chemical Company. Част от тази проба се подлага на анализ при използуване на UV спектрофотометър. Изучаваният обхват покрива областа от 200 до 900 nm. За анализа пробата се разтваря в дестилирана вода. Проба от спектъра от този анализ е показана на фигура

1.

Резултатите отговарят на тези, докладвани в литературата за максимална абсорбция и коефициенти на екстинкция за 7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин.

Хтах от литературата (ε)

267 (32,359)

373 (10,471)

447 (12,303) измерена Хтах (ε)

222 (30,965)

265 (33,159)

373 (10,568)

445 (12,466)

Подходящи вълни на светлината за облъчване са 373 и 445 nm. Наблюдаваните коефициенти на екстинкция при тези максимуми на абсорбция са достатъчни за да осигурят адекватно активиране на фоточувствителното съединение в разтвора.

ПРИМЕР 2

Разтворимост на 7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин

Разтворимост в Isolyte S, pH 7,4 среда

Максималната разтворимост на 7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин в Isolyte S среда се определя както следва:

7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин се смесва с Isolyte S докато се образува утайка. Сместа се разклаща на стайна температура в продължение на един час и се вортексира за да се осигури пълно разтваряне на суспендирания материал. Прибавя се допълнително 7,8-диметил-Ю-рибитил изоалоксазин докато остане твърда суспенсия въпреки допълнителното разбъркване на вортекс. След това тази суспенсия се центрофугира за да се отстрани неразтворения материал. Супернатантата от този препарат се отстранява и се анализира чрез използуване на спектрофотометър. Стойностите на абсорбция на разтвора се определят при 47 nm и при 373 nm. От коефициентите на екстинкция, които се определят предварително, е възможно да се пресметне концентрацията на наситения разтвор.

концентрация (373) = 110 μΜ = 42 цд/тк концентрация (447) = 109 μΜ = 40,9 μρ/ηο1_

Разтворимост в ACD-A антикоагулант

Същата процедура като описаната по-горе се повтаря при използуване на CDA-A антикоагулант. Стойностите получени от тези измервания са следните :

концентрация (373) = 166 μΜ = 63 цд/т!_ концентрация (447) = 160 μΜ = 60,3 μς/ιτιΙСтойностите получени от тези изслуедвания показват повисока граница на разтваримост на съединението, отколкото може да се очаква.

ПРИМЕР 3

ФОТОРАЗГРАЖДАНЕ НА 7,8-ДИМЕТИЛ-Ю-РИБИТИЛ ИЗОАЛОКСАЗИН ВЪВ ВОДНА СРЕДА

Разтвор на 7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин в Sigma ACD-A се приготвя в концентрация 63 pg/mL. Този препарат се взима със стъклена пипета и се поставя на пътя на UV източника на светлина (365 nm Zmax с филтри за отстраняване на светлината под 320 nm). Суспенсията се облъчва на специфични интервали, при които се отстраняват аликвотни части за спектрометричен анализ. Абсорбцията на разтворения 7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин се онагледява при 373 и 447 nm при всеки интервал от време. Резултатите са изобразени на фигура 3 и в таблица 1.

Талица 1

Фоторазграждане на 7,8~диметил-10-рибитил изоалоксазин след избагане на UV светлина (365 nm) в кисел разтвор

Време на облъчване	% от първоначалното, 373 nm	% от първоначалното, 447 nm
0	100	100
5	87.3	61.6
10	90.5	76.6
15	100	70

Профилът на абсорбция на разтвора при 373 nm показва, че не протична значително разлагане на реагента по време на целия период на облъчване. Абсорбцията на светлина при тази дълина на вълната съответства на η-π* преход на електрони. Липсата на намаляване при интензитета на този пик през времето означава, че пръстенната структура на молекулата е интактна въпреки продължителното облъчване при тези условия. Абсорбцията на молекулата при 477 nm се дължи на η-π* преходното състояние на електрони. Намаляването на абсорбцията на молекулата при тази дължина на вълната с увеличаването на времето на облъчване е показателно за неуловими промени в структурата на резонанс на молекулата. Тази промяна се дължи най-вероятно на загубата на рибоза от пръстенната структура на гръбнака на 7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазина и образуването на 7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин в резултат на това. Тези промени съвпадат с докладите в лителатрата върху поведението на молекулата при облъчване с UV светлина.

Явната липса на разграждане на пръстенната структура на молекулата е в контраст с наблюденията със съединения основаващи се на псорален при подобни условия. По време на облъчването се наблюдава значителна флуоресценция на молекулата в разтвора. Това поведение на молекулата е в съответствие с резонансните характеристики на пръстенната структура и предоставя средство за разсейване на енергията в молекулата във възбудено състояние по не-деструктивен начин.

ПРИМЕР 4

Концепция за оценка на поточната система

Свойства за предаване на светлината на съществуваща спектрална кювета

Съществуващата спектрална кювета е съставена от поликарбонат. Способностите за предаване на светлината на тази кювета се измерват при 373 и 477 nm чрез поставяне на кюветата на пътя на UV спектрофотометъра. Получените стойности са както следват :

Дължина на вълната на светлината % % пропускливост

373 nm

477 nm

66%

80%

Тези резултати са в съгласие с тези докладвани в литературата за поликарбонатни пластмаси (виж фигура 4). Стойностите от литературата показват стръмно рамо за предаването на светлината през поликарбонати в областа на 300 nm. В областа около 350 nm свойствата на предаване на светлината са адекватни на настоящата заявка.

Изисквания към светлинния поток изчислени като функция от скороста на потока

С цел да може да се осъществи поточната система, пробата трябва да се достави с адекватен поток от светлина по време на присъствието й на пътя на осветяване. Ако предложените Spectra кювети се използуват за тази цел, тогава е възможно да се определят изискванията към

светлинния поток като функция от скороста на потока през кюветата, както следва:

Обемът на присъстващия разтвор в облъчваната зона на кюветата е са. 0,375 mis. Транзитното веме (на преминаване) за клетка в тази област на кюветата може да се определи от следното уравнение:

Обем на кюветата (mis) скорост на потока (mls/min)

При 100 mis на минута времето на преминаване (Т) би било 0,00375 min = 0,225 секунди.

Енергията на която се излага пробата зависи от потока, съгласно следното уравнение:

Енергия (Е, Джаул/cm²) = Поток ((p.mW/cm²)* Време (Т. сек.)

1000

Ако приемем, че 1 джаул/cm² е необходим за адекватно активиране на фоточувствителното съединение, и че времето за преминаване (Т) е 0,22 секунди (т.е. скорост на потока 100 mls/min през кюветата), тогава необходимият поток по време на преминаването на пробата през кювета е 4,545 mE/cm². Графика показваща взаимоотношението от необходимия поток от източника на светлина до скороста на потока през потока е показана на фигура 5.

Тези резултати показват, че за да работи правилно поточната система са необходими източницита на UV с входове в областите на Watts/cm².

фигура 2 показва колко ще варира абсонрбцията с концентрацията на тромбоцити.

ПРИМЕР 5

Абсорбция на червените кръвни клетки

С цел да се определи обхвата, на който може да навлезе UV светлината в пробата от червени кръвни клетки и ефектите от дебелината на пробата и хематокрита върху обхвата на проникване на светлината, някои предварителни експерименти се осъществяват при използуване на химическа актинометрия, метод за опрделяне на актуалното количество еманиращо излъчване от източника чрез измерване на способноста и обхвата, в който абсорбираната светлина може да проведе химическа реакция. За тези изследвания се използува разтвор на фериоксалат, с цел да се измери интензитета на източника в отношение с това което е наблюдавано за вода. Подробности за химическата реакция и методите използувани за препарата на пробата са посочени в Gordon, A.J. and Ford, R.A. (1972), „The Chemist’s Companion: A Handbook of Practical Data, Tachniques and References“ (John Wiley&Sons), pp. 362-368.

Приготвят се проби от железен (III) оксалат в тестовия материал (вода или кръвен продукт с вариращ хематокрит на червените кръвни клетки) при концентрация от 0,15 М. След това се зареждат тези проби в стандартна Spectra кювета и се поставят в облъчващата постановка. Пробите се излагат на предварително определени интервали съответстващи на желаната степен на енергийна доза (1 J/cm²). След това пробите се отстраняват и се определя количеството на конверсията на Fe³⁺ в Fe²⁺ чрез отчитане на абсорбцията на теста в 1,10-фенантролинов разтвор при 510 nm, както е описано в Gordon, A.J. and Ford, R.A., виж по-горе. Високите стойности на абсорбция са показателни за по-голямо проникване на светлина в пробите. Стойностите на абсорбция наблюдавани за вода след излагане на 1 J/cm2 UV облъчване се използуват като 100% степен на пропускливост. Всички стойности за пробите на червени кръвни клетки се определят по отношение на този стандарт.

Таблица 2 Отчитане на абсорбцията след излагане на проби на 1 J/cm²UVA светлина. Всички средни стойности представляват средна стойност от 6 експеримента. % стойности на пропускливост се изчисляват по отношение на водна проба

Абсорбиране в 510 nm	Средно	Стандартно отклонение	% пропускп ивост	Стандартно отклонение
Вода	2.40	0.04	100	0.0
RBC, 1.3% Хематокрит	2.40	0.10	99.5	4.8
RBC, 3.7% Хематокрит	1.46	0.38	60.6	15.4
RBC, 5.07% Хематокрит	0.20	0.26	8.3	10.8
RBC, 6.0%	0.13	0.09	5.2	3.9

Хематокрит
RBC, 10.2% Хематокрит	0.23	0.19	9.7	7.9
RBC, 16.3% Хематокрит	0.25	0.11	10.4	4.6
RBC, 21.8% Хематокрит	0.09	0.06	3.6	2.6
RBC, 80.2% Хематокрит	0.01	0.11	0.3	4.4

Чрез използуване на тези стойности е възможно да се изчисли дълбочината на проникване на UV светлината при използуване на закона на Beer (A =е b С).

От закона на Lambert,

Абсорбция = Log (1/пропускливост)

Ако оставим концентраията (С) да е равна на хематокрита на пробата, и щом като b = 0,3 cm (дължината на пътеката на Spectra кюветата), тогава е възможно да се определи коефициента на псевдо-екстинкция за пробите (е‘) чрез чертнане на стойностите на абсорбцията на червените кръвни клетки спрямо продукта на времето на хематокрита за дължината на пътеката. Коефициентът на екстинкцията за пробите е представен чрез наклона на тази права.

Таблица 3

Определяне коефициента на екстинкцията на проби от червени кръвни клетки

т	В	нст	В*НСТ	Поглъщане юд(1Я)	е
0.995	0.3	1.3	0.39	0.002	.0051
0.606	0.3	3.7	1.11	0.218	.196
0.0525	0.3	6	1.8	1.280	.71
0.097	0.3	10.2	3.06	1.013	.33
0.104	0.3	16.3	4.89	0.983	.20
0.036	0.3	21.8	6.54	1.444	.22
0.0033	0.3	80.2	24.06	2.481	.10

При изполуване на стойностите получени по-горе е възможно да се определи коефициента на псевдо екстинкцията за тези проби, който трябва да е 0,08661.

Стойността на коефициента на екстинкция позволява да се пресметне разстоянието на проникване на UV светлината в червените кръвни клетки на пробата като функция от хематокрита на пробите. За това изчисление се определя дълбочината на проникване на пробата, в която 90% от падащата светлина ще бъде абсорбирана, чрез използуване на следното уравнение:

А =е ЬС

А = 1 (90% Абсорбция на Падащата Светлина), е = 0,08661,

С = Хематокрит на пробата,

Ь= Дължина на пътеката

Стойностите определени чрез използуване на актинометрията се сравняват с тези, които са изчислени предварително чрез използуване на определения получени от UV спектрофотометричните измервания на абсорбцията на светлина в пробите на червените кръвни клетки и на тромбоцитите.

фигура 2 показва как се променят абсорбцията и разстоянието от източника на светлина за червените кръвни клетки, като се сравнят предсказаните с получените стойности. Тези резултати показват, че за пробите с хематокрит в областа на 80% е възможно, при използуване на предпочитаната конфигурация на изобретението, да се пропусне светлина в пробата на дълбочина от 0,14 cm. Това представлява ширината на пътеката на потока, който е помалко от половината ширина на настоящата Spectra кювета.

ПРИМЕР 6:

Ефекти от третирането за вирусно инктивиране върху параметрите на тромбоцитите in vitro.

Изчисляват се ефектите от третирането за вирусно инктивиране върху параметрите на тромбоцитите in vitro. Тромбоцитните препарати се третират с 7,8-диметил-10рибитил изоалоксазин в комбинация с UV светлина. Използуват се различни in vitro параметри за онагледяване на функцията на тромбоцитите с цел да се определи обхвата на промените индуцирани от условията на третиране, фактори като енергийно ниво на излагането на UV светлина, доза на използуван 7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин и условията за завършване на пробата се разглеждат за тяхното

въздействие върху качеството на тромбоцитите след третирането. Резултатите от това изследване се използуват за да се определи отрязък от подходящо третиране за инактивиране на HIV-1 без да се наруши функцията на тромбицитите.

Приготвят се проби с три различни концентрации на 7,8диметил-10-рибитил изоалоксазин. За това изследване се използуват тромбоцити получени от стандартно събиране със Spectra LRS.

Първоначалните проби се центрофугират за концентриране на тромбоцитите в плътна утайка (пелета). Пелетета се ресуспендира в 70:30 (Isolyte S, pH 7,4; McGraw, Inc. Media:Plasma) разтвор. 7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин в посочената концентрация присъства в сместа плазма:средата. След това суспенсията с пелетата се пропуска през UV камера за облъчване при една от три посочени скорости на потока. Скоростите на потока са в директна корелация с нивотно на енергията на излагане за сместа клетки/среда, която преминава през камерата за облъчване. След преминаването през камерата за облъчване пробите се съхраняват в пликчета за проби от пластифициран цитрат за последващ анализ.

Поточното облъчване, in vitro измерване на функцията на тромбоцитите, включващо отговор на хипотоничен шок (HSR), GMP-140 експресиране, pH, рСО₂, тромбоцитно завъртане, и преброяване на клетките, се определя с цел да се определят ефектите на протокола на третиране върху качеството на клетките.

Качеството на тромбоцитите се онагледява като функция от условията на облъчване (концентрация на фоточувствителното съединение и отношение между скорост на потока/ниво на енергията). Качеството на тромбоцитите включва параметри като HSR отговор, GMP-140 активиране и др. Изучаваните скорости на потока могат да са свързани с енергията на излагане както следва:

Време на преминаване (Т, sec)=BpeMe на излагане= 0,375 mis (F_r/60)

F_r = Скорост на потока (mls/min)

0,375 mis = Обем на кюветата (mis) лТ (sec) = Скорост на потока 22

F_r

Енергия (Joules/cm²) = Поток (Ф.тУУ/ст2)* T(sec)

1000

Е = Ф * 0,022

F_r

Изчислява се действието на енергията на излагане на UV и концентрацията на 7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин върху стабилноста и жизнеспособноста на третираните тромбоцити. Нивата на концентрация и нивата на три концентрации се определят както следва :

Нива на енергията : 1,5,9, J/cm²

7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин Концентрации : 1,50,100 μΜ**

* Нивата на общата енергия на излагане се определят чрез скороста на потока на суспенсията през камерата за облъчване, в съответстивие с картата на конверсия от таблица

4.

** Тъй като средата се разрежда 70:30 (Среда:Плазма) концентрацията на сток-разтвора на 7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин в средата самостоятелно преди да се размеси с плазма се нагласява подходящо. Необходими са изходни концентрации на Isolyte S от 1,43, 71,4 и 143 μΜ.

Таблица 4

Степен на излагане на енергия като функция от скороста на потока през камерата за облъчване

Отдадена енергия (J/cm²)	Скорост на потока (mls/min)	Време на действие 20 mis (минути)
1	16.90	1.18
2	8.45	2.37
3	5.83	3.55
4	4.22	4.73
5	3.38	5.92
6	2.82	7.10
7	2.41	8.29
8	2.11	9.47
9	1.88	10.65
10	1.69	11.84

Поток = 3640 mW/cm²; обем на камерата = 0,117 mis. Стойностите на третираните проби се сравняват с контролната група. Контралните проби включват следното:

Нетретирани проби в Плазма (Историческа контрола) + Поток - UV -7,8-диметил-Ю-рибитил изоалоксазин

Процедура

Тромбоцити от нормален донорен продукт на аферезис се получават върху ААВВ акредитирана апаратура за кръвнабанка. Пробата се взима чрез стандартни Spectra процедури. Всички манипулации или процедури описани подолу се осъществуват при стандартни лабораторни процедури и методи за сигурност. Записват се номера на единицата и типа на кръвта. Всички проби се използуват в период от 24 след взимането на кръвта. Следва се асептична процедура за всяко прехвърляне на проби и етапи на процесинг.

Пробата се прехвърля в 500 mis PVC трансферна опаковка и се центрофугира при 5000 х g за пет минути, за пакетиране на пелетите. След това плазмата се отстранява от пелетата тромбоцити, при използуване на стандартна преса за тромбоцити. Плазмата се задържа за последващо използуване. Отстранената плазма от клетъчната пелета се смесва след това с резервния разтвор Isolyte S, pH 7,4; McGraw, Inc. Този сток разтвор на средата се изготвя чрез добавяне на предварително определено количество 7,8диметил-Ю-рибитил изоалоксазин към Isolyte S, до получаване на крайна концентрация от 1,43, 71,4 и 143 μΜ. След прибавянето на 7,8-диметил-Ю-рибитил изоалоксазин сток разтворът се филтрува през 0,22 μΜ стерилен филтър. След това стот разтворът се смесва с плазма от едноименна група в съотношение 70:30 (об/об), за да се осигурят крайни концентрации на 7,8-диметил-Ю-рибитил изоалоксазин от 1,50 и 100 μΜ, съответно. По време на приготвянето на 7,8-диметил10-рибитил изоалоксазин сток разтвори се внивама да не се допусне излагане на светлина. Пробите се приготвят както следва:

μΜ 2 проби

100 μΜ 2 проби μΜ 1 проба

Пелетата от тромбоцити, след това, се ресуспендира в ♦ сместа плазма: среда до първоначалния обем на първоначалната проба. Пробата се свързва към поточно устройство, включващо контейнер за клетки и фоточувствително съединение, контейнер за средата, като посочените контейнери са свързани чрез линия с клапани към единична линия за смесване на клетки/фоточувствително съединение и средата, снабдено с помпа. Смесените клетки/фоточувствително съединение и среда се пропускат през кювета държана от държач с огледални стени, облъчвана от източник на светлина. Тази камера за облъчване е снабдена ф със сонда за температурата. След преминаване през кюветата течноста се събира в торбичка за продукт.

Тръбопроводният комплект първоначално се напълва с Isolyte S среда. Пет минути преди започването на потока с тестовата проба, светлинният източник се активира. Температурата се следи по време на този интервал и се поддържа под 32°С в камерата за облъчване.

Скороста на потока за пробата през камерата за облъчване се определя чрез картата на таблица 4. Скоростите на потока, които осигуряват нива на общо облъчване 1,5 и 9

J/cm² се използуват съгласно следващата матрица за тестване:

Проба тур # 1: 7,8-диметил-Ю-рибитил изоалоксазин Концентрация = 1 μΜ

A. +7,8-диметил-Ю-рибитил изоалоксазин+ 1 J/cm²

B. +7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин+ 9 J/cm²

Проба тур # 2 : 7,8-диметил-Ю-рибитил изоалоксазин Концентрация = 100 μΜ

A. +7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин+ 1 J/cm²

B. +7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин+ 9 J/cm²

Проба тур # 3 : 7,8-диметил-Ю-рибитил изоалоксазин Концентрация = 50 μΜ

А. +7,8-диметил-Ю-рибитил изоалоксазин+ 5 J/cm²

Проба тур # 4 : Контролна проба, 7,8-диметил-Ю-рибитил изоалоксазин = 0 μΜ

А. +Поток-11\/-7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин

Всички проби се идентифицират с поредния номер на тура и буквено означение на пробата съответстващо на условията на третиране (например, 1А). Всеки комплект от проби се пропуска общо в две повторения. Реда, в който се третират пробите се определя чрез определяне съгласно генератор на произволно число.

Обем на проба от 20 mis за условие на тура се събира за всяка проба. Тези проби се събират в пликчета за проби от пластифициран цитрат (53 mis от общия обем) и се съхраняват за анализ. Температурата на пробите и камерата за облъчване се записват в началото, по средата и в края на всеки тур.

Първоначална аликвотна част от всеки препарат се отстранява след третирането за анализ. Параметрите за анализ включват брой клетки, pH, рСО₂, рО₂, завъртане на тромбоцитите, HSR и GMP-140 анализ. Останалата част от пробата се поставя в „край-над-край“ устройство за Q разбъркване на тромбоцити в +22 инкубатор и се съхранява пет дни след третирането. На петия ден, втора аликвотна част се отсранява и се анализира за същите in vitro параметри.

Използува се следното оборудване : Nikon Labophot микроскоп; Serono-Baker System 9000 Hematology Analyzer; аналитична везна; инкубатор за тромбоцити (+22 Celsius) и ротор; лабораторен хладилник (+4 Celsius); Mistral 3000I Центрофуга; Corning Blood Gas Analyser; Becton-Dickinson FACSCALIBUR Flow Cytometer; камера за UV облъчване; UV радиометър (YVX Radiometer, UVP, Inc.); EFOS Ultracure 100SS Plus (филтри за нропускане на максимална дължина на вълната 365 nm на изхода и 340 nm); и температурна проба (термодвойка).

Резултатите за всяка променлива на теста се сравняват за определеното условие на енергия на излагане и концентрация на 7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин. Провежда се директно сравняване към нетретирани контролни проби и се определят значителни разлики чрез вероятност р>0,05 от паралелен студенски Т-тест анализ.

Резултатите от тези изследвания се обобщават както следва:

1. Концентрация на фоточувствително съединение в излишък от 10 μΜ и концентрации на тромбоцити над 1,5 +06/μΙ_, има спад в pH пробата на втория ден. pH рязко

намалява след втория ден от съхранението, като достига недопустими нова (< 6,5) на третия ден от съхранението. Всички други параметри in vitro следват образеца наблюдаван при pH пробата.

2. Намаляването при pH пробата се проявява без значение дали пробата е излагана на UV светлина.

3. Концентрации на тромбоцити от 5,4Ε+05/μΙ_, няма спад в pH пробата след продължително съхранение за която и да е изучавана концентрация на фото-чувстиветло съединение до 100 μΜ.

4. Концентрации на фоточувстиветлоното съединение до 10 μΜ, концентрациите на тромбоцити над 1,5Ε+06/μ1_, и нива на UVA до 10 J/cm², измерените свойства на тромбоцитите са сравними с тези на контролните, нетретирани клетки. Те остават сравними на контролните нива след пет или повече дни на съхранение след третирането.

Тези изследвания над действието на тромбоцитите след третиране предоставят ясен прозорец, в който свойствата на клетките се поддържат при нива сравними с тези на нетретирани клетки. Резултатът също сочи, че при промяна на условията на съхранение и на третиране за клетките, този прозорец може да се разшири. Наблуюдаваното действие на

7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин, със или без UV светлина, върху pH проба предполага метаболитен ефект върху тази добавка, което може да се усредни чрез промени при условията на съхранение на пробите.

ПРИМЕР 7

Измерване на разделно натоварване върху червени кръвни клетки, като функция от скороста на потока и хематокрита на пробата

Ниските нива на проникване на UV светлина в пробите от червени кръвни клетки при висок хематокрит повишават необходимоста да се разберат ефектите на преминаващите червени кръвни клетки през тясни отвори на пътя на светлината. Редуцирането на дебелината на пътя на светлината трябва да повиши доставката на UV дози на проби с висок хематокрит. С цел да се потвърди този подход са направени няколко измервания на спада на налягането чрез използуване на отвори с различни размери. Устройства за измерване на налягането са поставени в линия с перисталтична помпа, над и под тясните отвори. Цялостна кръв с различен хематокрит се пропуска през отворите при контролирани скорости на потока. Разликите при отчитането на налягането в двете разположения позволяват директно измерване на спада на налягане през отворите. Чрез използуване на тази стойност и размера на отворите е възможно да се определи разделното натоварване упражнявано от червените кръвни клетки при тяхното преминаване през стеснената клетка, при използуване на следното уравнение:

ΔΡ = 8 μΙΟ Капка на налягане gd³w

T_y=_4jiQ

Разделно натоварване gwd²

За кръв, μ = Вискозитет = 9,9125/(1 -Хематокрит) g = гравитационна константа = 981

Q = Скорост на потока = mls/sec

1, w, d = Размери на отворите в cm

Dpmeas (dynes/cm²)	0Ό	182.1	425.3	789.6
0.08 X 0.012	o o	2Ό,	N	8.7
Dpmeas (dynes/cm²)	77.6	232.9	543.4	957.2
0.08 X 0.010	o V	3.0	7.0	12.3
Dpmeas (dynes/cm²)	95.9	255.8	618.4	1321.9
8000 Χ80Ό	1.5	4.0	9.7	20.7
	0=3.38	0=3.38	0=16.9	Q= 16.9
	I— o T so Ob Τ’* «ф	64% HOT	41% HCT	61% HCT

Z— см co Е <б Q Q с co £ ° Q. С D >>	73.5	146.9	343.0	881.4
0.1 X 0.012	q ΊΓ-	о см		12.0
Dpmeas (dynes/cm²)	60.3	180.9	422.1	884.6
0.1 X 0.010	о т—	3.0	7.0	14.7
гГ' co Е Сб о © е CO Q. С D >	93.7	210.8	593.6	1093.0
0.10 X 0.008	! 2.0	4.5	12.7	23.3
	0=3.38	0=3.38	0=16.9	0= 16.9
	41% НСТ	64% НСТ	41% НСТ	61% НСТ

см*⁴co Е сб о о с co CL С Ο > Ό 4Ζ	49.0	97.9	277.6	620.4
0.15 X I 0.012	q V	o CM	5.7	12.7
Dpmeas (dynes/cm²)	49.2	143.5	341.6	738.1
0.15 X 0.010	CM	3.5	8.3	18.0
Dpmeas (dynes/cm²)	97.4	211.0	497.7	1158.1
0.15 X 0.008	3.0	6.5	15.3	35.7
	0=3.38	0=3.38	0=16.9	Q= 16.9
	41% HCT	64% HCT	41% HCT	ΙΟ I sP Ob r— CD

В предходните експерименти бе определено, че разделно натоварване от 1,000- 2,000 dynes/cm² на интервали от 1 - 10 минути или нива от 5,000 - 7,000 dynes/cm² на интервали от приблизително 10 msec са достатъчни да индуцират хемолиза на червените кръвни клетки. Единствено в случайте на проби с най-висок хематокрит (61%) и най-висока скорост (16,9) стойностите надвишават 1,000 dynes/cm². Това се случва единствено при отвори за най-тясната ширина (0,008 inches).

Стойностите за дълбочината на проникване на светлината, при използуване на предложената конфигурация показват, че доставянето на достатъчна UV енергия за провеждане на процеса на инактивиране на вируси се постига даже и за проби с висок хематокрит.

Резултатите от анализите за разделно натоварване върху проби на червени кръвни клетки подложени на поток показват, че размерите на пътя на потока значително могат да се намалят и високи нива на скороста на потока могат да се поддържат без риск от хемолиза на червените кръвни клетки.

ПРИМЕР 8

Концентрат на тромбоцити се смесва с разтвор за прибавяне към тромбоцити Isolyte S при съотношение 20:80 тромбоцитен концентрат : Isolyte S. Смес от концентрати на тромбоцити и разтвори за прибавяне към тромбоцити се посочват в настоящето като „среда“. Концентрати на тромбоцити без разтвори за прибавяне към тромбоцити се посочват в настоящето като „плазма“. И двете се нараняват с Listeria monocytogenes. След това към всеки се прибавя витамин К5 в количество от 300 цд/mL В. След това всеки се излага на UV, видима или стайна светлина в устройството на кюветата от фигура 7, като резултатите са показани на таблица 6.

Таблица 6

	Log Инактивиране (cfu/mL)
	К5 в среда	К5 в плазма
UV, 40 J/cm²	4.2 Logs	0.1 Logs
VIS, 40 J/cm²	4.2 Logs	0.1 Logs
Дневна светлина	0 Logs	0 Logs

UV светлина = 365 nm

VIS светлина = 300 nm

Патоген = Listeria monocytogenes

Концентрация на К5 = 300 pg/mL

ПРИМЕР 9

Среда и плазма, както са описани по-горе, съдържащи витамин К5 се нараняват с бактерии и се облъчват или се излагат единствено на стайна светлина (К5-светлина), както е показано на таблица 7, и растежа се оценява след три дни инкубиране. Инактивирането на някои видове се вижда при липса на облъчване.

Таблица 7

		Среда	Плазма
	Върхова стойност (cfu/mL)	K5+ светлина	K5светлина	К5+ светлина	К5светлина
Р. aeruginosa	3.4 Logs	-	-	-	-
S.aureus	2.1 Logs	-	-	+	+
S. epidermidis	3.2 Logs	-		-	-
L. monocitoenes	3.5 Logs	-	-	+	+
E.coli	3.1 Logs	-	-	+	-

UV светлина = 365 nm, 40 J/cm² + = растеж установен след три дни инкубиране

- = не се наблюдава растеж след три инкубиране Концентрация на К5 = 300 gg/mL

ПРИМЕР 10

Среда, изготвена от концентрат на тромбоцити, както е описано в пример 8, и Isolyte S, при съотношение 70:30 на Isokyte S : концентрат на тромбоцити и съдържаща 300 pg.mL витамин К5 се поразява с различни видове бактерии и се облъчва с нива на енергия от 30 и 60 J/cm². Инактивирането като функция от енергията на облъчване е посочена в таблица 8 и на фигура 8.

Таб	лица 8
Енергия (J/sm²)	S. aureus	S. epidermidis	L. monocytogenes	E. coli
0	4.3	2.6	2.8	3.5
30	3.6	2.7	2	2
60	3.2	2.5	1	1

ПРИМЕРИ

Към концентрата на тромбоцити, както е описан в пример 8, и към 70:30 средата, както е описана в пример 10, се прибавят 10 μΜ 7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин. Концентрата от тромбоцити и средата се поразяват със S. aureus или S. epidermidis, и се облъчват с 80 J/cm², и инактивирането се измерва както по-горе. Резултатите са показани на фигура 9.

ПРИМЕР 12

Към концентрата на плазма, както е описан в пример 8, съдържащ се в стандартни пликчета за кръв се прибавят 25 μΜ 7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин в прахообразна форма. Пликчето се поразява с бактерии, както е посочено в таблица 9, разбърква се и се излага на 120 J/cm² облъчване. Резултатите на инактивиране са показани в таблица 9.

Таблица 9

Патоген	Log Инактивиране (cfu/mL)
S. aureus	1.7 Logs
S. epidermidis	3.5 Logs
Р. aerugenosa	3.6 Logs
Е. coli	4.1 Logs

ПРИМЕР 13

Към концентрата на тромбоцити, както е описан в пример 8 се прибавя 7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин, алоксазин мононуклеотид, или 7,8-диметил-изоалоксазин, с последващо поразяване със S. aureus или S. epidermidis и облбъчване при

J/cm². Резултатите от инактивирането са показани в таблица 10.

Таблица 10

	Log Инактивира	не (cfu/mL)
	Staphylococcus aureus	Staphylococcus epidermidis
7,8-диметил-1 Орибитил исоалоксазин	1.9 Logs	4.1 Logs
Алоксазин мононуклеотид, 10μΜ	1.6 Logs	5.6 Logs
7-8-диметил алоксазин, 7μΜ	1.6 Logs	2.9 Logs

ПРИМЕР 14

Към концентрата на тромбоцити, както е описан в пример 8 се прибавят 10 μΜ 7,8-диметил-Ю-рибитил изоалоксазин. Аликвотните части не съдържат примеси, 10 тМ аскорбат или 10 mM ΚΙ като „енхансер“ или антиоксидант. Разтворите се поразяват с HSV-2, ФХ174, S. aureus или S. epidermidis и се облбъчват при 80 J/cm². Резултатите са показани фигура 10.

ПРИМЕР 15

Към концентратите на тромбоцити от пример 8 се прибавят различни конценрации на 7,8-диметил-Ю-рибитил изоалоксазин. Тези разтвори се поразяват с вируса на херпес симплекс тип II (HSV-II), покрит вирус с двойно верижна ДНК. Експериментите се повтарят три-кратно. Облъчването се извършщва при 80 J/cm². Осъществяват се всичките три опита на пълно инактивиране. Резултатите са показани фигура 11.

ПРИМЕР 16

Следва се протокола от пример 15 при използуване на S. epidermidis вместо HSV II при енергия на облъчване от 40, 80 и 120 J/cm². Резултатите от инактивирането са показани на фигура 12.

ПРИМЕР 17

Следва се протокола от пример 15 при използуване на Ш ФХ174, бактериофаг с едноверижна ДНК, при различни концентрации на 7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин и енергии на облъчване. Резултатите от инактивирането са показани на фигура 13.

ПРИМЕР 18

Към концентратите на тромбоцити от пример 8 се прибавят 10 μΜ на 7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин. Те се поразяват със S. aureus или ФХ174 и се облъчват с вариращи енергии при 50:50 смес от видима и ултравиолетова свелина. Резултатите са показани фигура 14.

ПРИМЕР 19

Следва се протокола от пример 18 при използуване на S. epidemidis и HSV-II като микроорганизми. Смес 50:50 от ултравиолетова и видима светлина се подават чрез DYMAX източник на светлина. Резултатите от инактивирането са показани на фигура 15.

ПРИМЕР 20

Към концентратите на тромбоцити от пример 8 се прибавят 10 μΜ на 7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин под прахообразна форма. Провеждат се тестове със и без аскорбат. 150 ml от тествания назтвор се поставят в Spectra™ пликче за кръв и се разклаща, и се излага на различни енергии на облъчване, при използуване на 50:50 видима:ултравиолетова светлина. След получаване на 40 J/cm²съдържанието на всяко пликче се прехвърля в ново пликче за да се избегнат грешки дължащи се на микроорганизми, които може да са останали на клинообразното отверстие на пликчето. Резултатите от инактивирането са показани фигура

16. Насочените надолу стрелки показват инактивиране на възможното за откриване ниво (2,5 log титър).

ПРИМЕР 21

Към концентратите на тромбоцити от пример 8 и концентратите на тромбоцити в Isolyte S при 30:70 концентрат на тромбоцити : Isolyte S се прибавят 20 μΜ на 7,8-диметил-10рибитил изоалоксазин. Те се поразяват с вакциния вирус, вирус с покритие и двуверижна ДНК, и се излагат на 60 J/cm2 видима светлина или смесена (50:50) видима и ултравиолетова свелина, при използуване на DYMAX 2000 UV източник на светлина, в продължение на 30 минути. Границата на откриване е 1,5 logs. Резултатите от инактивирането са показани фигура

17. Прави се сравнение без използуване на фоточувствителни съединения, фоточувствителни съединения единствено в Isolyte S среда, тромбоцити в Isolyte S среда, тромбоцити в Isolyte S среда, при използуване на 8-метокси псорален вместо 7,8 диметил-10-рибитил изоалоксазин, и концентрат на тромбоцити в Isolyte S среда (30:70).

ПРИМЕР 22

Проби от концентрат на тромбоцити в Isolyte S среда 30:70, със и без 10 μΜ на 7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин се поразяват с вакциния вирус и се облъчват с 60 J/cm² с 50:50 видима:UV светлина за различни периоди от време и резултатите от инактивирането се показани сравнени на фигура 18.

ПРИМЕР 23

Към проби от концентрат на тромбоцити, както са описани в пример 8 се прибавят 5 μΜ или 50 μΜ 7,8-диметил-10рибитил изоалоксазин. Пробите се поразяват с HIV 1. При използуване на кюветната поточна клетъчна система, показана на фигура 7, пробите се облъчват с 50:50 видима:11У светлина с различна енергия, при използване на EFOS светлинна система. Резултатите от инактивирането са показани на фигура 19.

ПРИМЕР 24

АСН-2 клетки инфектирани с HIV се прибавят към проби от концентрат на тромбоцити в пример 8. Към пробите се прибавят 5 μΜ или 50 μΜ 7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин. Следва се протокола от пример 23 и резултатите от инактивирането са показани на фигура 20. Присъствието на HIV се изследва чрез неговия цитопатичен ефект върху тестовите клетки.

ПРИМЕР 25

Протоколът от пример 24 се следва и присъствието на HIV се изследва чрез количествено измерване на нивото на продукция на р24 антиген. Резултатите от инактивирането са показани на фигура 21.

ПРИМЕР 26

Към проби от концентрат на тромбоцити, както са описани в пример 8 и среда съдържаща 30% концентрат на тромбоцити и 70% PASIII™ среда се прибавят 6 тМ аскорбат и 14 μΜ на 7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин. Пробите се заразяват с HSV-II. Резултатите от инактивирането са показани на фигура 22 и таблица 11.

Таблица 11

Време (минути)	Енергия (UV+VIS) J/sm²	30:70 PC: Среда log от титера на вируса	Енергия (UV+VIS) J/sm²	90:10 PC: Среда log от титера на вируса
0	0	5.6	0	5.6
1.5	5	2.5	40	3.3
3	10	2.5	80	1.5 неоткриваеми вирус
4.5	15	2.3	120	1.5 неоткриваеми вирус
6	20	1.8
9	30	1.6
12	40
24	80
36	120

Лесно ще бъде разбрано от специалистите в областа, че горе-посоченото описание е единствено за целите на илюстриране, и че могат да се направят голям брой промени без да се излиза от обхвата на изобретението. Например, други фоточувствителни съединения освен тези, които са споменати могат да се използуват, за предпочитане, фоточувствителни съединения, които се свързват към нуклеинови киселини и следователно ги предпазват от репликация, и по-предпочитано, тези които не са токсични и нямат токсични разпадни продукти. Освен това, еквиваленти структури на тези описани в настоящето за конструиране на поточна система за деконтаминиране на течности, при използуване на фоточувствителни съединения могат лесно да се разделят, без неоправдано експериментиране за специалистите в областа, следвайки изводите от настоящето.

Claims

1. Метод за третиране на течност за инактивиране на микроорганизми или бели кръвни клетки, които могат да се съдържат в течноста, характеризиращ се с това, че включва (а) към посочената течност се прибавя ефективно за инактивиране количество фоточувствително съединение; (б) течността от етап (а) се излага на смес от ултравиолетова и видима светлина при което се инактивират посочените микроорганизми.

2. Метод, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че фоточувствителното съединение е ендогенно фоточувствително съединение или фоточувствително съединение, базиращо се на ендогенно производно на фоточувствителното съединение и посоченото фоточувствително съединение се прибавя кам посочената течност в количество нетоксично по същество.

3. Метод, съгласно претенция 1 или 2, характеризиращ се с това, че посочената течност съдържа една или две съставни части избрани измежду протеин, кръв, кръвни съставки, перитонеална течност, хранителни продукти и напитки, като посочените напитки са такива за консумация от хора или животни.

4. Метод, съгласно претенция 1 или 2, характеризиращ се с това, че посочената кръв включва кръв отделена от цялостна кръв.

5. Метод, съгласно коя да е претенция от 1 до 3, характеризиращ се с това, че посоченото фоточувствително съединение е ендогенно фоточувствително съединение избрано измежду 7,8-диметил-10-рибитил изоалоксазин, алоксазин мононуклеотид, изоалоксазин-аденозин динуклеотид, витамин К1, витамин К1 оксид, витамин К2, витамин К5, витамин К6, витамин К7, витамин K-S(ll) и витамин L.

6. Метод, съгласно коя да е претенция от 1 до 3, характеризиращ се с това, че посочените микроорганизми се избират измежду HIV вируси, вируси на хепатита, sinbdis вирус, цитомегаловирус, вирус на везикуларния стоматит, херпекс симплекс вирус, вакциния вирус, човешки Тлимфотропен ретровирус, HTLV-III, вирус на лимфаденопатията LAV/IDAV, парвовирус, предаван чрез трансфузия вирус (ТТ), Epstein-Barr вирус, бактериофаги ФХ174, фб, λ, R17, Т₄, Т₂, Р. aeruginosa, S. aureus, S. epidermidis, L. monocytogenes, E. coli, K. pneumoniae u S. marcescens.

7. Метод, съгласно коя да е претенция от 1 до 3, характеризиращ се с това, че посоченото фотооблъчване е със светлина във видимия и/или ултравиолетовия спектър.

8. Метод, съгласно коя да е претенция от 1 до 3, характеризиращ се с това, че течноста съдържаща посоченото фоточувствитулно съединение се прекарва през източник на фотооблъчване при скорост и дълбочина избрани така, че да осигурят проникване на фотооблъчването през течноста и инактивиране на микроорганизмите, или че посочената течност и фоточувствителни съединения се съдържат в контейнер пропусклив на посоченото фотооблъчване и посочената течност се излага на посоченото фотооблъчване.

9. Метод, съгласно коя да е претенция от 1 до 3, характеризиращ се с това, че посоченото фоточувствително съединение се прибавя към антикоагулант и посоченият антикоагулант се прибавя към посочената течност.

10. Метод, съгласно коя да е претенция от 1 до 3, характеризиращ се с това, че към посочената течност се прибавя енхансер преди да се изложи посочената течност на фотооблъчване.

ф

11. Метод за инактивиране на микроорганизми върху повърхност, характеризиращ се с това, че (а) към посочената повърхност се прилага ефективно за инактивиране количество ендогенно фоточувствително съединение или фоточувствително съединение, базиращо се на ендогенно производно на фоточувствителното съединение; и (б) повърхността се излага на фотооблъчване достатъчно да активира фоточувствителното съединение.

12. Метод за третиране на течност за инактивиране на микроорганизми, които могат да се съдържат в нея, като посочената течност съдържа също съставни части избрани измежду протеин, кръв, кръвни съставки, без да се разрушава биологичната активност на тези съставни части, характеризиращ се с това, че към посочената течност се прибавя ефективно за инактивиране нетоксично количество витамин К5, за инактивиране по същество на посочените микроорганизми.

13. Метод за третиране на повърхност за инактивиране на микроорганизми, които могат да присъстват върху нея или които могат да влезат в контакт с нея, характеризиращ се с това, че посочената повърхност се обвива с ефективно за инактивиране нетоксично количество витамин К5, за инактивиране по същество на посочените микроорганизми.

14. Система за третиране на течност за инактивиране на микроорганизми, които могат да присъстват в нея, характеризираща се с това, че включва:

(а) контейнер съдържащ посочената течност и ендогенно фоточувствително съединение или фоточувствително съединение, базиращо се на ендогенно производно на

W фоточувствителното съединение, като посоченият контейнер е снабден със средство за въвеждане, и притежава фотопропускаща повърхност позволяваща течноста, която се съдържа да се излага на такова количество фотооблъчване, достатъчно да активира фоточувствителното съединение;

(б) поне един източник на фотооблъчване за доставяне на достатъчно количесво фотооблъчване на течноста в посочения контейнер от вид и количество избрани да активират фоточувствителното съединение, при което се инактивират присъстващите микроорганизми.

0

15. Системата от претенция 14, характеризираща се с това, че посоченият източник на фотооблъчване доставя светлина във видимия и ултравиолетовия спектър.

16. Устройство за разделяне на цялостна кръв на кръвни съставни части, включващо системата от претенция 14.

17. Система за инактивиране на микроорганизми в течност съдържаща такива микроорганизми включваща :

(а) средство за добавяне на ефективно количество ендогенно фоточувствително съединение или ендогенно фоточувствително съединение, базиращо се на ендогенно производно на фоточувствителното съединение;

(б) фотопропусклив контейнер за посочената течност в течна връзка с посоченото средство за добавяне на фоточувствително съединение, притежаващ дълбочина и дължина избрани да позволят излагане на течноста на етап (а), на такова количество фотооблъчване достатъчно да активира фоточувствителното съединение при избрана скорост на потока;

(в) средство за постигане на посочената избрана скорост на потока на посочената течност през посочения контейнер; и (г) поне един източник на фотооблъчване за доставяне на достатъчно фотооблъчване на течноста в посочения контейнер от вид и количество избрани да активират фоточувствителното съединение.

18. Система за третиране на течност за инактивиране на микроорганизми, които могат да присъстват в нея, включваща :

(а) фоточувствително съединение в прахообразна форма;

(б) фотопропусклив контейнер съдържащ посочената течност и фоточувствителното съединение;

(в) средство за разбъркване на посочения контейнер;

(г) поне един източник на фотооблъчване за доставяне на достатъчно фотооблъчване на течноста в посочения контейнер от вид и количество избрани да активират фоточувствителното съединение, при което се инактивират микроорганизмите.

19. Воден разтвор на добавка към тромбоцити, характеризиращ се с това, че включва ендогенно фоточувствително съединение избрано измежду ендогенни алоксазини, К витамини и витамин L