CN1761483A

CN1761483A - 经改变的自生微生物、疫苗组合物及其使用方法

Info

Publication number: CN1761483A
Application number: CNA2004800070511A
Authority: CN
Inventors: T·W·小杜本斯基; D·G·布罗克施泰特; K·巴赫贾特; J·E·赫斯特; D·库克
Original assignee: Cerus Corp
Current assignee: Anza treatment Co.; Chinook Therapeutics Inc
Priority date: 2003-02-06
Filing date: 2004-02-06
Publication date: 2006-04-19
Also published as: SI1592441T1; CN1758923A; CN1758923B

Abstract

本发明提供了自生微生物，其中的核酸被修饰使得增殖衰减，和/或其中包含遗传突变，减弱了该微生物修复其核酸的能力。还提供了使用该修饰的微生物使抗原呈递细胞荷载、活化和/或成熟的方法。还提供了包含该经修饰的微生物和/或抗原呈递细胞的疫苗组合物以及使用这些疫苗的方法。还可以进一步修饰该微生物使其包含异源抗原，例如肿瘤抗原或者传染性疾病抗原，用作抵御疾病或者传染性疾病的疫苗。

Description

经改变的自生微生物、疫苗组合物及其使用方法

相关申请

本发明要求以下在美国的临时申请的优先权：第60/446,051号(2003年2月6日提交)、第60/449,153号(2003年2月21日提交)、第60/490,089号(2003年7月24日提交)、第60/511,869号(2003年10月15日提交)、标题为“进入非吞噬细胞减毒的利斯特氏菌属、包含利斯特氏菌的疫苗以及它们的使用方法”的临时申请(2004年2月2日提交)，所有内容在此引入作为参考。

发明领域

本发明主要涉及疫苗组合物和免疫疗法。特别地，本发明涉及的是疫苗组合物，这些组合物包含一群经过改变的(modified)自生的微生物，这些微生物可以用于向个体传输特定抗原。在这种组合物中，疫苗针对的是微生物自身或者是整合到微生物中的异源抗原。本发明还涉及的是使用该经改变的微生物荷载和诱导抗原呈递细胞如树突细胞的活化和成熟。

发明背景

已经开发出许多疫苗用于临床，这些疫苗大多数的用途是预防由病毒、细菌和寄生虫导致的传染性疾病。可以使用活的减毒的微生物、灭活的(杀死的)微生物或者微生物自身的组分制备疫苗。活的减毒微生物包含遗传改变，例如毒力因子的删除，导致微生物毒力的减弱。对于灭活的疫苗，可以用化学或者物理方法对微生物进行灭活。理想情况下，这种疫苗不会导致感染但是仍然能够刺激产生所需要的免疫应答。灭活疫苗的实例包括脊髓灰质炎病毒和流感病毒，以及抗霍乱和百日咳的细菌疫苗，当然对于脊髓灰质炎、流感和霍乱也有活的减毒疫苗。为了引发所需的免疫应答，重要的是灭活的微生物在灭活之前要包含正确的抗原。在一些情况中观察到微生物的灭活导致免疫应答的显著降低，原因是需要感染性微生物的基因表达重新开始，以刺激产生最佳的免疫应答。这对于细胞内的细菌是非常重要的。已经用于灭活细菌的方法包括使用丙酮、乙醇、福尔马林、戊二醛、低聚甲醛或者苯酚、加热或者紫外线辐射[Pace等人，Vaccine 16(16)：1563(1998)]。

除了使用微生物疫苗预防由微生物自身导致的传染性疾病，可以对微生物进行改变使其包含编码某种蛋白或者抗原的异源核酸序列。这种重组微生物用作传输载体且可以用作疫苗，以刺激产生对异体抗原的免疫应答。已经显示这些重组疫苗在动物模型上是有效的。经过改变后表达伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)环子孢子蛋白抗原的活的减毒沙门氏菌制备的口服疫苗，可以保护小鼠不感染疟疾[Aggarwal等人，J Exp Med 172(4)：1083(1990)]。类似地，美国专利6,051,237号描述了单核细胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)的重组形式，该细菌生长、传播并表达一种肿瘤特异的抗原，用作癌症疫苗。尽管这种重组疫苗可能是有效的，但是每一个微生物菌株必需进行遗传改变才能制备该疫苗。因此就需要开发出制备安全有效微生物疫苗的方法，它可以用于任何微生物，不论该微生物是否包含重组抗原。对基于树突细胞(DC)的免疫疗法已经进行了广泛的研究，显示其对于多种类型肿瘤的治疗是有临床益处的。目前正在开发多种不同的策略以分离和产生自体树突细胞(DC)，接下来在免疫接种病人之前使这些树突细胞体外荷载抗原或者多肽。除了有效的抗原荷载以外，最近对于理解免疫机制的研究进展强调了用于免疫接种的DC的活化和成熟状态对癌症免疫疗法有效性的重要性。未成熟的DC对于抗原的摄取和加工更为有效，虽然活化的/成熟的DC丧失了这个能力，但是它们在MHC分子存在时将抗原呈递给原初T淋巴细胞的能力更强。实际上，已经发现成熟的DC是有效的诱导初级T淋巴细胞应答的抗原呈递细胞(APC)，克服了外周T淋巴细胞耐受并且提高抗肿瘤的免疫性。尽管开发出了多种不同的方法荷载并刺激DC的活化和成熟，并已经获得了令人鼓舞的临床数据，但是仍然没有标准有效且经济的方法将抗原荷载与DC的活化和成熟组合在一起的方法。

发明概述

本发明涉及的是自生的微生物，其中微生物的增殖受到衰减，而同时保留了足够的微生物基因表达，其中的衰减可以以剂量依赖的方式进行控制。本发明包括了使自生微生物进行这种衰减的方法。本发明包括了包含这些减毒后微生物的疫苗组合物。本发明还提供了改变后微生物，特别是减毒的利斯特氏菌属(Listeria)，的新型用途，即在体外或者离体荷载并且诱导抗原呈递细胞例如树突细胞的活化和成熟。产生的抗原呈递细胞在疫苗和免疫治疗中是有用的。在特别的实施方案中，所提供的疫苗和免疫疗法针对的是癌症。

一方面，本发明提供了包含自生微生物的疫苗，其中该微生物的核酸(例如基因组核酸)经过改变使微生物的增殖受到衰减。在一些实施方案中，微生物增殖的衰减是可以以剂量依赖的方式控制的。在一些实施方案中，微生物中的微生物基因表达基本上不受微生物增殖衰减的影响。在一些实施方案中，疫苗中的微生物表达的抗原水平足以使向个体给予该疫苗之后诱导出针对该抗原的免疫应答。在一些实施方案中，使用与核酸直接发生反应的靶向核酸化合物(或者称为核酸靶向化合物)对核酸进行改变。在一个实施方案中核酸靶向化合物是一种烷化剂，例如β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯。在其他实施方案中，核酸靶向化合物是一种被UVA辐射活化的补骨脂素化合物(例如4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素，这里还被称为S-59)。在一些实施方案中，疫苗中的微生物包含基因突变，该突变减弱了微生物对其经过改变的核酸进行修复的能力。在一些实施方案中，微生物是细菌，例如炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)或者单核细胞增生利斯特氏菌。在一些实施方案中，微生物包含编码抗原的异源核酸序列。在一些实施方案中，疫苗还包含药物上可以接受的载体和/或佐剂。本发明还提供预防或者治疗宿主中疾病的方法，该方法包括向宿主施用有效量的疫苗。本发明还提供了在宿主中诱导针对抗原的免疫应答的方法，该方法包括向宿主施用有效量的疫苗，其中微生物表达抗原。

另一方面，本发明提供包含自生微生物(例如细菌)的疫苗，该微生物中至少一种DNA修复酶有缺陷。在一些实施方案中，自生的微生物在一个或者多个基因中包含基因突变，这些基因选自由以下基因组成的组：phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA或者是上述基因的功能等价物。在一些实施方案中，微生物在uvrA和uvrB(或者uvrA和uvrB的功能等价物，这取决与微生物的种属)中都包含基因突变。在一些实施方案中，微生物的RecA(或者RecA蛋白的功能等价物，这取决与微生物的种属)有缺陷。在一些实施方案中，微生物包含编码抗原(例如癌症抗原或者对于该微生物为外源的传染性疾病抗原)的异源核酸序列。在一些实施方案中，疫苗还包含药物上可以接受的载体或者佐剂。本发明还提供宿主中预防或者治疗疾病的方法，该方法包含向宿主给予有效量的疫苗。本发明还提供了在宿主中诱导针对抗原的免疫应答的方法，该方法包括向宿主施用有效量的疫苗，其中微生物表达抗原。

另一方面，本发明提供了分离的突变利斯特菌株，例如单核细胞增生利斯特氏菌突变株，该突变株包含了基因突变，减弱了该菌株修复其核酸的能力。在一些实施方案中，突变的利斯特氏菌株在至少一种DNA修复酶(例如UvrA和/或UvrB)中有缺陷。在一些实施方案中，突变的利斯特氏菌株在uvrA基因和/或uvrB基因中有缺陷。在一些实施方案中，突变菌株是保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，登录编号PTA-5563的单核细胞增生利斯特氏菌actA^-/uvrAB^-。在其他实施方案中，菌株是保存于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，登录编号PTA-5563的单核细胞增生利斯特氏菌actA^-/uvrAB^-菌株的突变株，其中被保藏菌株的突变株在UvrA，UvrB以及ActA上有缺陷。本发明还提供了包含突变利斯特菌株的疫苗和专职性抗原呈递细胞。还提供了使用改变的利斯特菌株诱导免疫应答以及预防或者治疗疾病的方法。

另一方面，本发明提供了分离的炭疽芽孢杆菌突变株，该突变株包含了基因突变，减弱了该菌株修复其核酸的能力。在一些实施方案中，突变株在至少一种DNA修复酶上(例如UvrA和/或UvrB)中有缺陷。在一些实施方案中，突变株在uvrA基因和/或uvrB基因中有缺陷。在一些实施方案中，突变株的RecA有缺陷。在一些实施方案中，突变株的recA基因中包含基因突变。在一些实施方案中，突变株在lef基因和cya基因中的一个或者全部上包含一个或者多个突变，这些突变降低了菌株的毒性。本发明还提供了包含突变突变株的疫苗和专职性抗原呈递细胞。还提供了使用改变的炭疽芽孢杆菌菌株诱导免疫应答以及预防或者治疗疾病的方法。

在一个实施方案中，本发明包括疫苗，其包含已经与补骨脂素化合物和UVA紫外线发生反应的细菌，其中细菌的增殖受到衰减。在一个实施方案中，在补骨脂素的改变以后细菌的表达足够活跃，以致补骨脂素减毒的细菌可以继续表达蛋白质抗原，其中当细菌向个体施用时，诱发出针对该抗原的免疫应答。在一个实施方案中，所需的免疫应答针对的是细菌自身。在一个实施方案中，细菌是表达异源蛋白质抗原的重组菌株，其中当细菌向个体施用时，诱发出针对异源抗原的免疫应答。可以设计出这种包含异源抗原的疫苗，用于治疗或预防多种不同的疾病，包括传染性疾病、自身免疫疾病、过敏、癌症以及其他过度增生性疾病。

为了治疗或者预防传染性疾病，可以根据本发明的方法制备用作疫苗的致病病原。在一个实施方案中，疫苗可以用本发明中包含异源抗原的微生物进行制备，异源抗原来自致病因子，例如病毒、细菌或者寄生虫。当接受这种细菌载体的健康风险与传染性因子导致可能感染的相关风险相比要小得多时，这种疫苗可能提供一定水平的益处。用于预防或治疗传染性疾病的、通过本发明的方法减毒的异源疫苗，可能还有其他的益处。首先，可能不能从传染性因子自身直接制备减毒活疫苗或者死疫苗。第二，如果需要活疫苗，可能不能既使传染性病原减毒又使其保持正确的免疫应答。

另一个可能性是如果没有细菌载体诱导产生的内在免疫应答，则插入到细菌载体内的抗原在个体内不能刺激产生免疫应答。例如，自体细胞不适当增殖产生的疾病可能含有通常不能刺激产生免疫应答的抗原。通过找到一种方式刺激产生这种针对自体抗原的免疫应答，则有助于抗御这种疾病。在一个实施方案中增殖细胞表达或者过量表达一种抗原，其表达水平高于正常细胞中的表达水平，这样免疫应答基本上是对于增殖细胞特异的。可以使用这种疫苗进行治疗的疾病包括，但是不限于，自身免疫疾病、过敏、癌症和其他细胞增生性细胞疾病。在另一个实施方案中，疫苗可能针对疾病的产物或者与疾病相关的目标，而不是患病的细胞本身。例如可以使用针对血管上皮生长因子(VEGF)的疫苗治疗肿瘤，VEGF对于为肿瘤细胞生长提供营养所需的新血管的产生是必需的。VEGF自身在肿瘤细胞的外围，但是遍布在肿瘤生长的区域，是可行的疫苗攻击目标，疫苗的攻击可以限制肿瘤的生长。另一个实例是一种包含抗原的疫苗，该抗原可以诱发针对与疾病相关的蛋白的应答，所述的蛋白如导致阿尔茨海默氏疾病或克雅氏疾病所特有的淀粉样斑块的蛋白。类似地，疫苗可以靶向参与自身免疫或者过敏应答的蛋白。疫苗可以包含能够诱发针对特异的抗体或者细胞(例如导致自身免疫或者过敏应答的B细胞或者T细胞)的应答的独特型抗原。

在一个实施方案中，本发明包括疫苗组合物，该组合物包含自生微生物群，其中的微生物核酸经过改变使微生物群的增殖受到衰减，而其中的微生物基因表达基本未受影响。在一个实施方案中，微生物基因表达基本上未受影响，这样抗原的表达水平足以在向个体施用该微生物群后刺激产生免疫应答。在一个实施方案中，微生物群的增殖衰减了至少大约0.3log，或者至少大约1log，大约2log，大约3log，大约4log，大约6log，或者至少大约8log。在另一个实施方案中，微生物群的增殖衰减大约从0.3log到＞10log、从大约2log到＞10log、从大约4log到＞10log、从大约6log到＞10log、大约0.3log-8log、大约0.3log-6log、大约0.3log-5log、大约1log-5log或者大约2log-5log。在一个实施方案中，由微生物群表达的抗原为微生物核酸未被改变的微生物群表达的抗原的至少大约10％、大约25％、大约50％、大约75％或者至少大约90％。在一个实施方案中，表达的抗原是来自微生物自身的抗原。在一个实施方案中，微生物包含了编码抗原的异源核酸。在一个实施方案中，抗原是与疾病有关的抗原。在一个实施方案中，抗原与疾病有关，该疾病选自由以下疾病组成的组：传染性疾病、自身免疫疾病、过敏、癌症以及其他过度增生性疾病。在一个实施方案中，抗原是与肿瘤有关的抗原。

在一个实施方案中，肿瘤抗原选自：分化抗原、组织特异抗原、发育抗原、肿瘤相关病毒抗原、癌-睾丸抗原、胚胎抗原、癌蛋白抗原、过量表达蛋白抗原以及突变蛋白抗原。在一个实施方案中，肿瘤抗原选自：间皮素(mesothelin)、Sp17，gp100，EphA2，PR3，PAGE-4，TARP以及SP AS-1。在一个实施方案中，改变微生物核酸的方法选自：暴露微生物于辐射中以及使微生物与引起微生物核酸改变的核酸靶向化合物发生反应。在一个优选的实施方案中，微生物的核酸通过和与核酸能够直接反应的核酸靶向化合物发生反应而被改变。在一个实施方案中，核酸靶向化合物通过选自下列的方式靶向核酸：插入、小沟结合、大沟结合、静电结合以及序列特异结合。在一个实施方案中，核酸靶向化合物包含核酸烷基化剂。在一个优选的实施方案中，核酸靶向化合物是β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯。在一个实施方案中，与核酸直接发生反应的核酸靶向化合物在辐射，优选为UVA紫外辐射，活化的情况下与核酸发生反应。在一个实施方案中，由UVA辐射活化的核酸靶向化合物是补骨脂素。在一个优选的实施方案中，补骨脂素是4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素。在一个实施方案中，核酸靶向化合物间接地导致核酸的改变。在一个实施方案中，核酸靶向化合物在辐射，优选为UVA辐射，活化的情况下间接地导致核酸的改变。在一个实施方案中，微生物包含基因突变。在一个实施方案中，基因突变导致微生物修复其经改变的微生物核酸能力的衰减。在一个实施方案中，基因突变出现的基因选自以下基因组成的组：phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA或者是它们的功能等价基因(取决于微生物的种属)。在一个实施方案中，基因突变出现一个以上选自以下组的基因中：phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA或者是它们的功能等价基因(取决于微生物的种属)。在一个突变出现在recA基因中的实施方案中，不论其自身还是与其他的一个或者多个突变一起，recA突变是一个条件突变。在一个实施方案中，基因突变导致至少一种DNA修复酶活性的衰减，该DNA修复酶选自以下酶组成的组：PhrB，UvrA，UvrB，UvrC，UvrD和RecA。在一个实施方案中，RecA活性的衰减是条件的。在另一个实施方案中，含有这些突变的微生物通过与被UVA辐射活化的补骨脂素发生反应而被改变。在一个优选的实施方案中，补骨脂素是4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素。在一个实施方案中，微生物选自细菌、原生动物和真菌。在一个实施方案中，微生物是细菌。在一个实施方案中，微生物是分支杆菌。在一个实施方案中，分支杆菌是结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。在一个实施方案中，细菌是细胞内细菌。在一个实施方案中，细胞内细菌是炭疽芽孢杆菌。在一个实施方案中，细胞内细菌是鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)。在一个优选的实施方案中，细菌是利斯特氏菌，优选为单核细胞增生利斯特氏菌。在一个实施方案中，利斯特氏菌包含的突变导致利斯特氏菌侵入非吞噬细胞能力的减弱，而对吞噬细胞摄取利斯特氏菌没有显著影响。在一个实施方案中，利斯特氏菌的突变位于内化素(internalin)基因内。在一个实施方案中，利斯特氏菌的突变出现的基因选自：inlA，inlB，以及任何编码内化素的基因。在一个实施方案中，单核细胞增生利斯特氏菌在inlA和inlB两个基因上都包含突变。在一个实施方案中，利斯特氏菌包含的突变使其逃脱受感染细胞的吞噬溶酶体的能力减弱。在一个实施方案中，利斯特氏菌的突变位于hly基因。在一个实施方案中，利斯特氏菌包含的突变导致其肌动蛋白多聚化作用减弱。在一个实施方案中，利斯特氏菌突变位于actA基因中。在一个实施方案中，单核细胞增生利斯特氏菌包含一个以上的突变。在一个优选的实施方案中，利斯特氏菌在actA和inlB两个基因中都有突变，优选是两个基因上的缺失突变。

在一个实施方案中，本发明包括了一种疫苗，该疫苗包含微生物群，其中的微生物核酸通过与核酸靶向化合物发生反应而发生改变，该核酸靶向化合物与核酸直接发生反应，使微生物群的增殖减弱，其中的微生物基因表达基本上未受影响，其中的微生物群中的微生物包含编码肿瘤抗原的异源核酸序列。在一个实施方案中，微生物基因表达基本上未受影响，这样肿瘤抗原的表达水平足以在将该微生物施用到个体后刺激产生免疫应答。在一个实施方案中，微生物群的增殖衰减了至少大约0.3log，或者至少大约1log，大约2log，大约3log，大约4log，大约6log，或者至少大约8log。在另一个实施方案中，微生物群的增殖衰减从大约0.3log到＞10log、从大约2log到＞10log、从大约4log到＞10log、从大约6log到＞10log、大约0.3log-8log、大约0.3log-6log、大约0.3log-5log、大约1-5log或者大约2-5log。在一个实施方案中，由微生物群表达的肿瘤抗原为微生物核酸未被改变的微生物群表达的抗原的至少大约10％、大约25％、大约50％、大约75％或者至少大约90％。在一个实施方案中，肿瘤抗原选自由以下抗原组成的组：分化抗原、组织特异抗原、发育抗原、肿瘤相关病毒抗原、癌-睾丸抗原、胚胎抗原、癌蛋白抗原、过量表达蛋白抗原以及突变蛋白抗原。在一个实施方案中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：间皮素、Sp17，gp100，EphA2，PR3，PAGE-4，TARP，以及SPAS-1。在一个实施方案中，核酸靶向化合物包含一种烷化剂。在一个实施方案中，烷化剂选自由芥子、芥子中间体和芥子等价物组成的组。在一个实施方案中，核酸靶向化合物包含的核酸靶向基团选自以下基团组成的组：嵌入剂、小沟结合物、大沟结合物、静电结合物以及核酸特异结合物。在一个实施方案中，核酸靶向化合物是β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯。在一个实施方案中，核酸靶向化合物在化合物的活化下与核酸直接发生反应。在一个实施方案中，化合物通过辐射被活化。在一个实施方案中，辐射是UVA辐射。在一个优选实施方案中，核酸靶向化合物是由UVA辐射活化的补骨脂素。在一个优选的实施方案中，补骨脂素是4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素。在一个实施方案中，微生物群中的微生物包含基因突变，在一个实施方案中，基因突变导致微生物修复其经过改变的微生物核酸能力的衰减。在一个实施方案中，基因突变出现的基因选自以下基因组成的组：phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA或者是它们的功能等价基因，取决于微生物的种属。在一个实施方案中，基因突变出现一个以上选自以下组的基因中：phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA或者是它们的功能等价基因，取决于微生物的种属。在一个突变出现在recA基因的实施方案中，不论其单独还是与其他的一个或者多个突变一起，recA突变是一个条件突变。在一个实施方案中，基因突变导致至少一种DNA修复酶活性的衰减，该DNA修复酶选自以下酶组成的组：PhrB，UvrA，UvrB，UvrC，UvrD和RecA。在一个实施方案中，RecA活性的衰减是条件的。在另一个实施方案中，含有这些突变的微生物通过与被UVA辐射活化的补骨脂素发生反应而被改变。在一个优选的实施方案中，补骨脂素是4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素。在一个实施方案中，微生物选自细菌、原生动物和真菌。在一个实施方案中，微生物是细菌。在一个实施方案中，细菌是细胞内细菌。在一个优选的实施方案中，细菌是利斯特氏菌，优选为单核细胞增生利斯特氏菌。在一个实施方案中，利斯特氏菌包含的突变导致利斯特氏菌侵入非吞噬细胞能力的减弱，而对吞噬细胞摄取利斯特氏菌没有显著影响。在一个实施方案中，利斯特氏菌的突变位于内化素基因内。在一个实施方案中，利斯特氏菌的突变位于的基因选自由以下基因组成的组：inlA，inlB，以及任何编码内化素的基因。在一个实施方案中，单核细胞增生利斯特氏菌在inlA和inlB两个基因上都包含突变。在一个实施方案中，利斯特氏菌包含的突变使其逃脱受感染细胞的吞噬溶酶体的能力减弱。在一个实施方案中，利斯特氏菌的突变位于hly基因。在一个实施方案中，利斯特氏菌包含的突变使利斯特氏菌肌动蛋白的聚合减弱。在一个实施方案中，利斯特氏菌的突变位于actA基因。在一个实施方案中，单核细胞增生利斯特氏菌包含一个以上的突变。在一个优选的实施方案中，利斯特氏菌在actA和inlB两个基因中都有突变，优选是两个基因上的缺失突变。在一个优选的实施方案中，单核细胞增生利斯特氏菌actA/inlB缺失突变株还包含uvrAB基因内的缺失突变。

在一个实施方案中，本发明包括了一种疫苗，该疫苗包含单核细胞增生利斯特氏菌群，其中的利斯特氏菌核酸通过与经过UVA辐射而被活化的补骨脂素发生反应而被改变，使利斯特氏菌群的增殖衰减，其中的利斯特氏菌基因表达基本上未受显著影响，其中的单核细胞增生利斯特氏菌包含编码肿瘤抗原的异源核酸序列。在一个优选的实施方案中，补骨脂素是4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素。在一个优选的实施方案中，利斯特氏菌的基因表达基本上未受影响，这样肿瘤抗原的表达水平足以在将利斯特氏菌施用到个体后刺激产生免疫应答。在一个实施方案中，利斯特氏菌群的增殖衰减了至少大约0.3log，或者至少大约1log，大约2log，大约3log，大约4log，大约6log，或者至少大约8log。在另一个实施方案中，利斯特氏菌群的增殖衰减从大约0.3到＞10log、从大约2log到＞10log、从大约4到＞10log、从大约6到＞10log、大约0.3-8log、大约0.3-6log、大约0.3-5log、大约1-5log或者大约2-5log。在一个实施方案中，由利斯特氏菌群表达的肿瘤抗原为利斯特氏菌核酸未被改变的利斯特氏菌群表达的抗原的至少大约10％、大约25％、大约50％、大约75％或者至少大约90％。在一个实施方案中，肿瘤抗原选自由以下抗原组成的组：分化抗原、组织特异抗原、发育抗原、肿瘤相关病毒抗原、癌症-睾丸抗原、胚胎抗原、癌蛋白抗原、过量表达蛋白抗原以及突变蛋白抗原。在一个实施方案中，肿瘤抗原选自：间皮素、Sp17，gp100，EphA2，PR3，PAGE-4，TARP，以及SPAS-1。在一个实施方案中，单核细胞增生利斯特氏菌包含基因突变，在一个实施方案中，基因突变导致单核细胞增生利斯特氏菌修复其经过改变的核酸能力的衰减。在一个实施方案中，基因突变位于选自下列的基因：phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA。在一个实施方案中，基因突变位于一个以上选自以下组的基因中：phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA。在一个突变出现在recA的实施方案中，不论其单独还是与其他的一个或者多个突变一起，recA突变是一个条件突变。在一个实施方案中，遗传突变导致至少一种DNA修复酶活性的衰减，该DNA修复酶选自以下酶组成的组：PhrB，UvrA，UvrB，UvrC，UvrD和RecA。在一个实施方案中，RecA活性的衰减是条件的。在一个实施方案中，利斯特氏菌包含的突变导致单核细胞增生利斯特氏菌侵入非吞噬细胞能力的减弱，而对吞噬细胞摄取单核细胞增生利斯特氏菌没有显著影响。在一个实施方案中，基因突变位于内化素基因内。在一个实施方案中，利斯特氏菌的突变位于选自下列的基因：inlA，inlB，以及任何编码内化素的基因。在一个实施方案中，单核细胞增生利斯特氏菌在inlA和inlB两个基因上都包含突变。在一个实施方案中，利斯特氏菌包含的突变使其逃脱受感染细胞吞噬溶酶体的能力减弱。在一个实施方案中，利斯特氏菌的突变位于hly基因。在一个实施方案中，基因突变使利斯特氏菌肌动蛋白的聚合减弱。在一个实施方案中，利斯特氏菌的突变位于actA基因。在一个实施方案中，单核细胞增生利斯特氏菌包含一个以上的突变。在一个优选的实施方案中，利斯特氏菌在actA和inlB两个基因中都有突变，优选是两个基因上的缺失突变。在一个优选的实施方案中，单核细胞增生利斯特氏菌actA/inlB缺失突变株还包含uvrAB基因的缺失突变。

在另一方面，本发明提供了包含自生微生物的专职性(professional)抗原呈递细胞(例如树突细胞)，其中的微生物核酸被改变使微生物的增殖衰减。在一些实施方案中，微生物增殖的衰减是可以以剂量依赖的方式控制的。在一些实施方案中，微生物中的微生物基因表达基本上未受到微生物增殖衰减的影响。在一些实施方案中，疫苗中的微生物表达的抗原水平足以使向个体施用该疫苗之后诱导出针对该抗原的免疫应答。在一些实施方案中，使用与核酸直接发生反应的核酸靶向化合物的反应对核酸进行改变。在一个实施方案中核酸靶向化合物是一种烷化剂，例如β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯。在其他实施方案中，核酸靶向化合物是被UVA辐射活化的补骨脂素化合物(例如4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素，这里还被称为S-59)。在一些实施方案中，疫苗中的微生物包含基因突变，该突变减弱了微生物对其经过改变的核酸进行修复的能力。在一些实施方案中，微生物是细菌。在一些实施方案中，微生物包含编码抗原的异源核酸序列。本发明还提供了包含抗原呈递细胞的疫苗。本发明还提供预防或者治疗宿主中疾病的方法，该方法包含向宿主施用有效量的抗原呈递细胞。本发明还提供了在宿主中诱导针对抗原的免疫应答的方法，该方法包括向宿主施用有效量的抗原呈递细胞，其中的抗原由微生物表达。本发明还提供了在离体和/或体外(不互斥)活化原初T细胞的方法，该方法包括使原初T细胞在适宜的条件下与专职性抗原呈递细胞接触足够的时间以活化原初T细胞。

另一方面，本发明提供了分离的专职性抗原呈递细胞(例如树突细胞)，该细胞包含自生的微生物(例如细菌)，微生物在其至少一种DNA修复酶中有缺陷。在一些实施方案中，微生物包含的基因突变位于选自下列的一种或多种的基因：phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA或者其功能等价物中。例如微生物可能在uvrA和uvrB两个基因中都包含基因突变，或者在uvrA和uvrB的功能等价物中(取决于微生物的种属)包含基因突变。在一些实施方案中，抗原呈递细胞的recA或者其功能等价物有缺陷。在一些实施方案中，微生物包含编码抗原的异源核酸序列。还提供预防或者治疗宿主中疾病的方法，该方法包括向宿主施用有效量的抗原呈递细胞；以及还提供了在宿主中诱导针对抗原的免疫应答的方法，该方法包括向宿主施用有效量的抗原呈递细胞，其中的抗原由微生物表达。

另一方面，本发明提供了用抗原荷载专职性抗原呈递细胞的方法，该方法包括使专职性抗原呈递细胞(体外或者体内)在适宜的条件下与包含有编码该抗原的核酸序列的微生物接触足够的时间以使专职性抗原呈递细胞荷载，其中微生物的核酸经过改变(例如与直接同核酸发生反应的核酸靶向化合物发生反应而改变)，这样微生物的增殖被衰减。

另一方面，本发明提供了使专职性抗原呈递细胞活化和/或成熟的方法，该方法包括使专职性抗原呈递细胞(体外或者体内)在适宜的条件下与包含有编码抗原的核酸序列的自生微生物接触足够的时间以使专职性抗原呈递细胞荷载，其中微生物的核酸经过改变(例如与直接同核酸发生反应的核酸靶向化合物发生反应而改变)，这样微生物的增殖被衰减。

另一方面，本发明提供了预防或者治疗宿主体内疾病的方法，包括以下步骤。(a)使专职性抗原呈递细胞与包含有编码抗原的核酸序列的自生微生物接触使其荷载，其中微生物的核酸经过改变，这样微生物的增殖被衰减；以及(b)向宿主施用有效量的包含荷载的专职性抗原呈递细胞的组合物。在一些实施方案中，微生物与直接同核酸发生反应的核酸靶向化合物发生反应而被改变。

另一方面，本发明提供了使用抗原荷载专职性抗原呈递细胞例如树突细胞的方法，该方法包括在适宜的条件下使细胞在体外或者离体与表达抗原的被改变的微生物接触足够长的时间，以荷载抗原呈递细胞。在一些实施方案中，微生物的增殖受到衰减。在一些实施方案中，尽管微生物的增殖受到衰减，但是微生物保持了足够的基因表达，达到细胞的抗原呈递。抗原呈递可以是MHC I类抗原呈递或者MHC II类抗原呈递。

另一方面，本发明提供了使抗原呈递细胞(例如树突细胞)活化或者成熟的方法，该方法包括在适宜的条件下使抗原呈递细胞在体外或者离体与被改变的微生物接触足够长的时间，使树突细胞活化和/或使抗原呈递细胞成熟。在一个实施方案中，微生物的增殖受到衰减。在另一个实施方案中，尽管微生物的增殖受到衰减，但是微生物保持了足够的基因表达，达到细胞的活化和/或成熟。

另一方面，本发明提供了诱导针对抗原的免疫应答的方法，该方法包括向宿主施用有效量的免疫原性组合物，该组合物包含呈递抗原的抗原呈递细胞(例如树突细胞)，其中的抗原呈递细胞包含被改变的微生物。在一个实施方案中，微生物的增殖受到衰减。在另一个实施方案中，尽管微生物的增殖受到衰减，但是微生物保持了足够的基因表达，实现细胞的抗原呈递。在一个实施方案中，免疫应答是CD8⁺T细胞应答。在另一个实施方案中，免疫应答是CD4⁺T细胞应答。

另一方面，本发明提供了诱导针对抗原的免疫应答的方法，包括以下步骤：(a)在适宜的条件下使抗原呈递细胞(如树突细胞)在体外或者离体与表达该抗原的利斯特氏菌接触足够长的时间使抗原呈递细胞上荷载抗原，以使抗原呈递细胞活化和/或成熟；以及(b)向宿主施用有效量的抗原呈递细胞的组合物。在一个实施方案中，微生物的增殖受到衰减。在另一个实施方案中，尽管微生物的增殖受到衰减，但是与抗原呈递细胞接触的微生物保持了足够的基因表达，实现抗原呈递在抗原呈递细胞上，并且使抗原呈递细胞活化和/或成熟。在一个实施方案中，免疫应答是CD8⁺T细胞应答。在另一个实施方案中，免疫应答是CD4⁺T细胞应答。

另一方面，本发明提供了离体或者体外的专职性抗原呈递细胞，该细胞包含改变的微生物，其中微生物的增殖被衰减。在另一个实施方案中，尽管微生物的增殖受到衰减，但是改变的微生物保持了足够的基因表达，使树突细胞呈递抗原。在一个实施方案中，抗原呈递细胞是树突细胞。

另一方面，本发明提供了包含抗原呈递细胞(例如树突细胞)的疫苗，其中的抗原呈递细胞包含改变的微生物。在一个实施方案中，微生物是利斯特氏菌。在一个实施方案中，利斯特氏菌的增殖被衰减。在另一个实施方案中，尽管利斯特氏菌的增殖受到衰减，但是利斯特氏菌保持了足够的基因表达，使抗原呈递在细胞上。

另一方面，本发明提供了包含抗原呈递细胞(例如树突细胞)以及药物上可以接受的载体的药物组合物，其中的抗原呈递细胞包含改变的利斯特氏菌。在一个实施方案中，利斯特氏菌的增殖被衰减。在另一个实施方案中，尽管利斯特氏菌的增殖受到衰减，但是利斯特氏菌保持了足够的基因表达，使抗原呈递在细胞上。

在前面提到的各个方面中的一些实施方案中，被改变的微生物是被改变的利斯特氏菌。在前面提到的各个方面中的另外的实施方案中，利斯特氏菌是单核细胞增生利斯特氏菌。在其他的实施方案中，利斯特氏菌包含一个或者多个基因的突变，基因选自由以下基因组成的组：phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA。例如在前面提到的方面中的任何一项中，利斯特氏菌可以任选地包含uvrAB基因的突变。在其他实施方案中，利斯特氏菌可以任选地包含uvrAB基因和actA基因的突变。

在前面提到的各个方面中的其他实施方案中，通过使利斯特氏菌与交联剂接触使其减毒。在前面提到的各个方面中的一些实施方案中，交联剂是β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯。在前面提到的各个方面中的其他实施方案中，交联剂是补骨脂素的衍生物，并且使利斯特氏菌与UVA接触。在前面提到的各个方面中的一些实施方案中，交联剂是4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素(这里也被称为″S-59″)。

附图

图1显示了含有OVA抗原的野生型利斯特氏菌DP-L4056的衰减作为补骨脂素S-59浓度(2J/cm²UVA)的函数，以及对OVA抗原向树突细胞系呈递的测量。细菌的对数滴度(log titer)和被呈递的抗原对未被处理的抗原的百分比(数据是对于每DC 2.4细胞100个利斯特氏菌)对S-59的浓度(nM)作图。

图2显示野生型利斯特氏菌DP-L4056(2A)和含有OVA抗原的LLO-突变株DP-L4027(2B)的衰减作为烷化剂化合物I浓度的函数，以及对OVA抗原向树突细胞系呈递的测量。细菌的对数滴度和被呈递的抗原对未被处理的抗原的百分比(数据是对于每个DC 2.4细胞1个利斯特氏菌)对化合物I的浓度(μM)作图。

图3对比了野生型大肠杆菌与修复缺陷菌株CSR 603(uvrA recAphr突变株)的灭活作为S-59浓度(2J/cm²UVA)的函数。细菌的对数滴度对S-59的浓度(nM)作图(对数刻度)。

图4显示了平均肿瘤体积作为将B16OVA肿瘤移植到C57B1/6小鼠中以后天数的函数，小鼠在第三、七和十四天接受了免疫接种。实验的疫苗使用或者未使用S-59进行处理。

图5显示存活率百分比作为将B16OVA肿瘤移植到C57B1/6小鼠中以后天数的函数，小鼠在第三、七和十四天接受了免疫接种。实验的疫苗使用或者未使用S-59进行处理。

图6显示了流式细胞术的结果，显示了TNF-α和IFN-γ阳性的脾细胞群，该细胞群来自接种了表达和没有表达OVA、使用和未用S-59UVA处理(PCT)的野生型利斯特氏菌的小鼠。图6A显示了LLO_190-210特异的细胞群。图6B显示了OVA特异的细胞群。

图7显示了ELISPOT的结果，显示了在使用SL8，LLO_190-201或者LLO_296-304刺激以后，使用所示的野生型利斯特氏菌菌株(用或者未用S-59处理(PCT))进行接种的小鼠的脾细胞中，每2×10⁵个细胞中，形成IFN-γ斑点的细胞数量。

图8显示了缺失和未缺失uvrAB后利斯特氏菌的减毒。对数滴度对使用的补骨脂素S-59的浓度(nM)作图(6J/cm²)。图8A，菌株DP-L4017(L461T LLO突变株)和野生型(DP-L4056)。图8B，菌株DP-L4017和DP-L4029(ΔactA).

图9显示了含有OVA抗原的DP-L4029(ΔactA)利斯特氏菌的减毒作为补骨脂素S-59的浓度的函数，以及对OVA抗原向树突细胞系呈递的测量。亲本株(在这里是ΔactA；9A，9C)与具有uvrAB缺失的菌株(ΔuvrAB；9B，9D)进行比较。细菌的对数滴度和呈递抗原对未处理的抗原的百分比对S-59的浓度(nM)作图。图9A，9B，UVA辐射剂量为0.5J/cm²，漂洗利斯特氏菌一次，然后UVA的剂量为5.5J/cm²，测量每DC2.4细胞一个利斯特氏菌时的抗原呈递。图9C，9D，在S-59存在时培养利斯特氏菌，然后使用6J/cm²UVA辐射，测量每DC2.4细胞10个利斯特氏菌时的抗原呈递。(在图9C和9D中也提供了扩展的图)。

图10显示了³⁵S甲硫氨酸/半胱氨酸掺入到S-59/UVA处理的单核细胞增生利斯特氏菌菌株DP-L4029(ΔactA)和DP-L4029uvrAB(ΔactAΔuvrAB)合成的蛋白中以后的聚丙烯酰胺凝胶。

图11显示了来自接种了经59/UVA处理的(两种方法)单核细胞增生利斯特氏菌DP-L4029(ΔactA)-OVA菌株或者ΔactAΔuvrAB-OVA菌株的小鼠脾细胞，经过OVA特异的抗原SL8、LLO特异的抗原LLO₁₉₀和LLO₂₉₆刺激之后，进行ELISPOT检测。图11A显示了在使用OVA特异的抗原刺激的平板上的斑点形成集落。图11B作图显示了对于所有三种抗原，每2×10⁵个脾细胞中的IFN-γ斑点形成细胞。

图12显示了使用S-59/UVA处理的(两种方法)单核细胞增生利斯特氏菌DP-L4029(ΔactA)-OVA菌株或者ΔactAΔuvrAB-OVA菌株接种小鼠后，使用OVA来源的T细胞表位SL8(12A)、LLO特异的II类抗原LLO_190-201(12B)或者LLO特异的I类抗原LLO_296-304(12C)进行刺激以后，小鼠的脾细胞细胞内细胞因子染色(ICS)检测结果。在图中，S-59/UVA处理的利斯特氏菌标记为“PCT”(表示光化学处理)。

图13显示了小鼠脾脏(13A)或者肝脏(13B)的菌落形成单位的数目。所述小鼠使用S-59/UVA处理的(两种方法)单核细胞增生利斯特氏菌DP-L4029(ΔactA)菌株或者ΔactAΔuvrAB-菌株接种，30天后，使用野生型单核细胞增生利斯特氏菌进行攻击。

图14显示了小鼠脾脏(14A)或者肝脏(14B)的菌落形成单位的数目。所述小鼠使用S-59/UVA处理的(生长中加入补骨脂素、然后UVA处理)单核细胞增生利斯特氏菌DP-L4029(ΔactA)菌株或者DP-L4029ΔactAΔuvrAB-菌株接种小鼠(免疫一、三、五次)，30天后，使用野生型单核细胞增生利斯特氏菌进行攻击。

图15显示了免疫小鼠血清中利斯特氏菌特异抗体的抗体滴度。所述小鼠使用S-59/UVA处理的(生长中加入补骨脂素、然后UVA处理)单核细胞增生利斯特氏菌DP-L4029(ΔactA)菌株或者ΔactAΔuvrAB-菌株接种(免疫一、三、五次)。

图16表示了使用S-59/UVA处理的(生长中加入补骨脂素、然后UVA处理)单核细胞增生利斯特氏菌DP-L4029(ΔactA)菌株或者ΔactAΔuvrAB-菌株接种小鼠(免疫一、三、五次)30天后，使用20xLD₅₀或者100xLD₅₀的野生型单核细胞增生利斯特氏菌进行攻击的。存活百分率(攻击后10天)。

图17显示了来自使用S-59/UVA处理的(生长中加入补骨脂素、然后UVA处理)单核细胞增生利斯特氏菌DP-L4029(ΔactA)-OVAAH1A5菌株或者ΔactAΔuvrAB-OVA AH1A5菌株接种的小鼠并使用抗原LLO91，AH1，AH1A5，或者P815细胞或者CT26细胞刺激。脾脏细胞的ICS检测结果。

图18显示了表明来自小鼠的脾细胞的斑点形成集落以平板的ELISPOT测定的结果。所述小鼠使用S-59/UVA处理的(生长中加入补骨脂素、然后UVA处理)单核细胞增生利斯特氏菌DP-L4029(ΔactA)-OVA AH1A5菌株或者ΔactAΔuvrAB-OVA AH1A5菌株接种，并使用抗原AH1A5(18A)或者AH1(18B)进行刺激。

图19显示了使用S-59/UVA处理的具有或者没有ΔuvrAB突变的DP-L4029进行治疗性接种的已经有CT26肺部肿瘤的小鼠的肺(19A)。对于每个疫苗株，绘图表示了肺部转移灶的数目(19B)。剩余小鼠的存活在图19C中绘出。

图20显示了已经有CT26肺部肿瘤的小鼠接受以下菌株的治疗性免疫接种：单核细胞增生利斯特氏菌ΔactA，ΔactA AH1-A5，ΔactAΔuvrAB AH1-A5以及ΔactAΔinlB AH1-A5。ΔuvrAB菌株或者没有经过处理、或者被热杀死(HK)或者经过S-59UVA(PCT)的处理。收集每个亚组中的小鼠的肺，显示于图20A中。每组中肺部转移灶的数目在图20B中绘出。剩余小鼠的存活在图20C中(亲本株)和图20D中(ΔuvrAB株)绘出。

图21A显示了DC2.4细胞的荧光显微图像，所述的细胞被经过S-59/UVA处理的野生型单核细胞增生利斯特氏菌uvrAB突变体感染，显示了组合的图像(利斯特氏菌和肌动蛋白阳性)以及用罗丹明染色后的图像(只有肌动蛋白阳性)。图21B为与LLO^-相比，位于细胞质内的野生型、ΔuvrAB突变株(活的、热杀死的或者S-59UVA处理的)单核细胞增生利斯特氏菌的百分比。

图22显示了经过S-59/UVA处理的单核细胞增生利斯特氏菌野生型菌株以及ΔuvrAB菌株革兰氏染色后的光学显微照相负片。

图23显示了使用所示的利斯特氏菌株或者载体对照免疫接种小鼠后的靶细胞群。与非特异的靶细胞相比，抗原特异的靶细胞水平降低，表明了由于接种产生的体内T细胞细胞毒性。图23A显示了表达AH1-A5的疫苗在第0天免疫接种的结果(对于S-59UVA处理的菌株还在第1、2天进行免疫接种)。(图23A和23B的上面一行中显示了使用所示的对于AH1靶细胞的疫苗接种小鼠的结果。下面一行中显示了使用所示的对于AH1-A5靶细胞的疫苗接种小鼠的结果。)图23B显示的是在第14天进行重复接种的结果(对于S-59UVA处理的菌株在第15和16天进行免疫接种)，而图23C涉及的是OVA特异应答。

图24显示了具有或者没有uvrAB缺失的炭疽芽孢杆菌Sterne菌株的减毒。绘图表示对数滴度与生长和UVA辐射(6J/cm²)过程中的补骨脂素S-59浓度(nM)的关系。

图25显示了利斯特氏菌uvrAB^-对于S-59/UVA光灭活更为敏感。利斯特氏菌生长到对数中期，用PBS漂洗，加入不同浓度的S-59孵育5分钟，使用2.1J/cm²的UVA光线进行照射。通过在BHI琼脂平板上生长检测利斯特氏菌的存活力。(A)代表性的利斯特氏菌BHI琼脂平板，用100nM的S-59处理。热杀死的利斯特氏菌作为对照；(B)使用不同浓度S-59处理的利斯特氏菌的存活力--在BHI琼脂平板上形成菌落的能力。

图26显示了S-59/UVA处理的不能存活的利斯特氏菌uvrAB菌株保持了它们的代谢活性以及它们基因组全部组分的表达。(A)使用MTT检测测定S-59/UVA灭活的利斯特氏菌uvrAB菌株的代谢活性。活的和热杀死的利斯特氏菌作为对照；(B)使用MTT检测定量测定灭活的利斯特氏菌uvrAB菌株的代谢活性。

图27显示了完全灭活的利斯特氏菌uvrAB菌株保持了它们感染DC以及逃脱吞噬溶酶体的能力。生长在盖玻片上的小鼠DC细胞系，DC2.4，在MOI＝1下37℃感染30分钟。多次漂洗仔细除去细胞外的细菌，加入庆大霉素，令感染的细胞在37℃下继续孵育5小时，防止细胞外细菌的生长。用3.5％甲醛固定DC2.4细胞，然后使用家兔抗利斯特氏菌抗体染色，用山羊抗家兔FITC二抗检测。使用罗丹明-鬼笔环肽检测肌动蛋白，使用DAPI显示细胞核。

图28显示了完全灭活的利斯特氏菌uvrAB菌株有效地荷载抗原进入小鼠骨髓来源DC(BM-DC)的MHC I类途径中。在MOI＝100下，37℃感染第5天的BM-DC 30分钟。多次漂洗仔细除去细胞外的细菌。感染的BM-DC细胞与B3Z共同孵育过夜，通过水解生色底物CPRG来测定活化(吸光度)。

图29显示感染了利斯特氏菌的人未成熟单核细胞衍生的DC使活化标记(29A)和成熟标记(29B)以及分泌促炎细胞因子(29C)上调。在MOI＝1下用利斯特氏菌感染DC 1小时。感染的DC在庆大霉素存在下继续培养24小时，防止细胞外细菌的生长。使用流式细胞术测定表型的改变。使用Cytometric bead array试剂盒(Pharmingen)对细胞上清中的细胞因子水平进行测定。

图30显示了S-59/UVA灭活的利斯特氏菌uvrAB OVA在体内诱导OVA特异的免疫性。用1×10⁸CFU的S-59/UVA灭活的利斯特氏菌uvrABOVA通过静脉内向雌性C57BL/6小鼠给药。S-59/UVA灭活的亲本利斯特氏菌株以及热杀死的利斯特氏菌作为对照。7天后，收获脾脏，通过IFN-γELISPOT对OVA特异的CD8+T细胞应答进行测定。(A)显示了代表性的ELISPOT孔；(B)通过ELISPOT对OVA特异的免疫性进行测定。免疫接种的小鼠的脾脏细胞在存在或者不存在OVA257-264肽的条件下进行培养。

图31显示了异源抗原LLO-OVA/PR3(SEQ ID NO：48)的一级氨基酸序列。该图还显示了OVA H-2K^b表位(SEQ ID NO：49)和PR3HLA A-2I型限制性表位(又名PR1)(SEQ ID NO：50)。

图32显示了化合物4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素(S-59)。

发明详述

本发明涉及了改变的自生微生物和改变的自生微生物在疫苗组合物中的用途，其中微生物的核酸被改变使微生物的增殖受到衰减。在一些实施方案中，微生物基因表达基本上没有受到改变的影响。本发明还涉及在体外或者离体，在抗原荷载和抗原呈递细胞(APCs)的活化/成熟的诱导中改变的微生物的用途。抗原可以是由改变的微生物天然产生的抗原或者是重组微生物表达的异源抗原。产生的抗原呈递细胞适于在疫苗组合物中使用以及用于免疫疗法。通过给予产生的疫苗组合物刺激产生的免疫应答可以是CD4⁺或者CD8⁺免疫应答。

这种被改变的微生物的一种是单核细胞增生利斯特氏菌。发明者对利斯特氏菌进行了改造，使其对于补骨脂素的灭活异常敏感，补骨脂素是一组在紫外线A(UVA)辐射之后会在细菌的基因组形成不可逆的交联，这样这些细菌就不能存活的化合物(参见下面的实施例3)。野生型和同时维持模型抗原的表达的经过改变后的利斯特氏菌增殖的衰减被显示(参见下面的实施例1-2和11)。还表明经过改变的利斯特氏菌提供了抗肿瘤应答(参见下面的实施例4和14-16)以及诱导抗原特异的T细胞应答(实施例5)和体内的细胞毒应答(实施例20)。利斯特氏菌被DC迅速地吞噬，转运到吞噬溶酶体的小室中。这个相遇导致了DC的表型成熟，以及接下来多种免疫刺激性细胞因子包括IFN-γ，IL-12，和TNFα的分泌。发明人现在已经证明使用重组的利斯特氏菌感染未成熟的DC导致DC迅速地活化/成熟，以及所编码异源抗原的MHC I型限制的呈递。此外，吞噬溶酶体中利斯特氏菌疫苗的降解导致编码的抗原通过MHC II型途径进行呈递。(参见下面的实施例)

另外一个这种改变的微生物是炭疽芽孢杆菌。发明人也对其进行了改造，得到了对补骨脂素灭活异常敏感的炭疽芽孢杆菌减毒菌株。(参见下面的实施例21)

因此，本发明提供了包含自生微生物的疫苗，其中该微生物的核酸被改变，使得微生物的增殖受到衰减。在一些实施方案中，微生物增殖的衰减受到剂量依赖方式的控制。在一些实施方案中，微生物中的微生物基因表达基本上不受微生物增殖衰减的影响。在一些实施方案中，疫苗中的微生物表达的抗原水平足以使向个体施用疫苗之后诱导出针对该抗原的免疫应答。在一些实施方案中，核酸和直接与核酸发生反应的核酸靶向化合物发生反应而被改变。在一个实施方案中核酸靶向化合物是一种烷化剂，例如β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯。在其他实施方案中，核酸靶向化合物是一种被UVA辐射活化的补骨脂素(例如4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素，这里还被称为S-59)。在一些实施方案中，疫苗中的微生物包含基因突变，该突变减弱了微生物对其经过改变的核酸进行修复的能力。在一些实施方案中，微生物是细菌，例如炭疽芽孢杆菌或者单核细胞增生利斯特氏菌。在一些实施方案中，微生物包含编码抗原的异源核酸序列。在一些实施方案中，疫苗还包含药物上可以接受的载体和/或佐剂。本发明还提供预防或者治疗宿主中疾病的方法，该方法包含向宿主施用有效量的疫苗。本发明还提供了在宿主中诱导针对抗原的免疫应答的方法，该方法包括向宿主施用有效量的疫苗，其中微生物表达抗原。

本发明还提供了分离的突变体利斯特氏菌株，例如单核细胞增生利斯特氏菌菌株突变株，该突变株包含基因突变，减弱了该菌株修复其核酸的能力。在一些实施方案中，突变的利斯特氏菌株在至少一个DNA修复酶(例如UvrA和/或UvrB)中有缺陷。在一些实施方案中，突变的利斯特氏菌株在uvrA基因和/或uvrB基因上包含基因突变。在一些实施方案中，突变菌株是保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，登录号PTA-5563的单核细胞增生利斯特氏菌ΔactA/ΔuvrAB菌株。在其他实施方案中，菌株是保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，登录号PTA-5563的单核细胞增生利斯特氏菌ΔactA/ΔuvrAB菌株的突变株，其中被保藏的菌株的突变株在UvrA，UvrB以及ActA上有缺陷。本发明还提供了包含突变利斯特氏菌株的疫苗和专职性抗原呈递细胞。还提供了使用改变的利斯特氏菌株诱导免疫应答以及预防或者治疗疾病的方法。

本发明提供了分离的突变炭疽芽孢杆菌菌株，该突变株包含了基因突变，减弱了该菌株修复其核酸的能力。在一些实施方案中，突变的菌株在至少一种DNA修复酶上(例如UvrA和/或UvrB)中有缺陷。在一些实施方案中，突变株在uvrA基因和/或uvrB基因上包含基因突变。在一些实施方案中，突变株的RecA被减弱。在一些实施方案中，突变株的recA基因中包含基因突变。在一些实施方案中，突变株在lef基因和cya基因中的一个或者全部中包含一个或者更多突变，这些突变降低了菌株的毒性。本发明还提供了包含突变株的疫苗和专职性抗原呈递细胞。还提供了使用改变的炭疽芽孢杆菌菌株诱导免疫应答以及预防或者治疗疾病的方法。

此外，本发明提供了包含自生微生物的专职性抗原呈递细胞(例如树突细胞)，其中的微生物核酸被改变使微生物的增殖衰减。在一些实施方案中，微生物增殖的衰减是可以以剂量依赖的方式控制的。在一些实施方案中，微生物中的微生物基因表达基本上未受到微生物增殖衰减的影响。在一些实施方案中，疫苗中的微生物表达的抗原水平足以在向个体施用疫苗之后诱导出针对该抗原的免疫应答。在一些实施方案中，核酸同直接与核酸发生反应的核酸靶向化合物反应对核酸进行改变。在一个实施方案中核酸靶向化合物是一种烷化剂，例如β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯。在其他实施方案中，核酸靶向化合物是被UVA辐射活化的补骨脂素化合物。在一些实施方案中，疫苗中的微生物包含基因突变，该突变减弱了微生物对其经过改变的核酸进行修复的能力。在一些实施方案中，微生物是细菌。在一些实施方案中，微生物包含编码抗原的异源核酸序列。本发明还提供了包含抗原呈递细胞的疫苗。本发明还提供宿主中预防或者治疗疾病的方法，该方法包含向宿主施用有效量的抗原呈递细胞。本发明还提供了在宿主中诱导针对一种抗原的免疫应答的方法，该方法包括向宿主施用有效量的抗原呈递细胞，其中的抗原由微生物表达。本发明还提供了在离体或体外活化原初T细胞的方法，该方法包括使原初T细胞在适宜的条件下与专职性抗原呈递细胞接触足够的时间以活化原初T细胞。

本发明提供了用一种抗原荷载专职性抗原呈递细胞的方法，该方法包括使专职性抗原呈递细胞在适宜的条件下与包含有编码抗原的核酸序列的自生微生物接触足够的时间以使专职性抗原呈递细胞荷载，其中微生物的核酸经过改变，这样微生物的增殖被衰减。

本发明还提供了使专职性抗原呈递细胞活化和/或成熟的方法，该方法包括使专职性抗原呈递细胞在适宜的条件下与包含有编码抗原的核酸序列的自生微生物接触足够的时间以使专职性抗原呈递细胞荷载，其中微生物的核酸经过改变，这样微生物的增殖被衰减。

本发明还提供了预防或者治疗宿主体内疾病的方法，包括以下步骤。(a)使专职性抗原呈递细胞与包含有编码抗原的核酸序列的自生微生物接触使其荷载抗原，其中微生物的核酸经过改变，这样微生物的增殖被衰减；以及(b)向宿主施用有效量的包含已荷载的专职性抗原呈递细胞的组合物。

本发明还提供使抗原呈递细胞，例如树突细胞，荷载抗原的方法，该方法包括在体外或者离体时在适宜的条件下使抗原呈递细胞与表达抗原的被改变的微生物接触足够长的时间，使抗原呈递细胞荷载。

本发明提供使抗原呈递细胞活化和/或成熟的方法，该方法包括在体外或者离体时在适宜的条件下使抗原呈递细胞与改变的微生物接触足够长的时间，以使树突细胞活化和/或成熟和/或使抗原呈递细胞成熟。

本发明提供了诱导针对抗原的免疫应答的方法，该方法包括向宿主施用有效量的免疫原性组合物，该组合物包含呈递抗原的抗原呈递细胞，其中的抗原呈递细胞包含被改变的微生物。

另外，本发明提供了诱导针对抗原的免疫应答的方法，包括以下步骤：(a)在适宜的条件下使抗原呈递细胞在体外或者离体与表达抗原的利斯特氏菌接触足够长的时间使抗原呈递细胞上荷载抗原，以使抗原呈递细胞活化和/或成熟；以及(b)向宿主施用有效量的抗原呈递细胞。在一个实施方案中，微生物的增殖受到衰减。

本发明还提供了离体或者体外专职性抗原呈递细胞，它包含改变的微生物，其中微生物的增殖被衰减。

此外，本发明提供了包含抗原呈递细胞的疫苗(其中的抗原呈递细胞包含改变的微生物)和药物组合物(药物组合物包含抗原呈递细胞和药物上可以接受的载体，其中的抗原呈递细胞包含利斯特氏菌)。

基于微生物的疫苗

本发明涉及了改变的自生微生物和在疫苗组合物中使用改变的自生微生物，其中微生物的核酸被改变使微生物的增殖受到衰减。在一些实施方案中，微生物基因表达几乎没有受到改变的影响。

已经观察到杀死的微生物疫苗经常劣于活的减毒微生物疫苗[Lauvau等人，Science 294：1735-1739(2001)]。在完全杀死的微生物中，微生物基因的重新合成被完全终止。因此将微生物核酸改变到适当的程度使微生物的增殖受到衰减而同时保持足够水平的微生物基因表达，较之杀死的微生物疫苗，可能更为有效，并且提供了一种可以应用于任何微生物载体的疫苗制备方式，不论疫苗的目的是用于微生物载体导致的传染性疾病的预防还是使用微生物载体传输异源抗原。应当理解，使用“微生物”这个术语，正如该术语涉及本发明中的所有实施方案，目的是指自生的微生物而并不包括病毒。这种基于微生物的疫苗可以用于向个体传输特异的抗原。在一个实施方案中，疫苗传输一种以上的抗原。设计这种疫苗的目的是刺激产生对一种或者多种抗原的免疫应答，导致个体对这个(这些)抗原产生免疫。产生的免疫应答可以是抗体介导的应答或者是细胞介导的应答，或者二者兼有。术语“疫苗”意图指预防性疫苗，即该疫苗的施用刺激产生免疫应答，这样如果个体接下来在自然条件下接触到该抗原，则事先形成的免疫应答会增加个体抗御携带抗原的物质(agent)或细胞的能力。术语“疫苗”还意图包括治疗性疫苗，即接受该疫苗的个体已经具有与该疫苗的抗原相关的疾病，这时疫苗可以诱发免疫应答或者增强个体对该抗原已有的免疫应答，以增加个体抗御携带抗原的物质或细胞的能力。这包括对患病细胞如癌细胞的免疫应答，以及对与疾病相关蛋白如朊病毒的免疫应答。在一个实施方案中，自生的微生物选自细菌、原生动物和真菌。在一个实施方案中，自生的微生物是细菌，选自革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、细胞内细菌和分支杆菌。

本发明包括微生物核酸多种不同水平的改变。应当理解微生物核酸的代谢以多种方式出现。微生物的复制涉及整个微生物基因组的DNA的复制以增殖微生物以及接下来DNA分子向分离的细胞中的分配，即细胞分裂产生的细胞都具有整个微生物基因组的完整拷贝。微生物核酸代谢还涉及DNA向RNA的转录与翻译RNA产生蛋白质的组合。微生物基因组的转录涉及将微生物基因组的部分DNA复制为RNA，或者是信使RNA或者是转运RNA。信使RNA的翻译涉及对该RNA的阅读以产生特异的蛋白质或者蛋白质部分。在本发明中依据微生物的性质和所要的用途，将一群微生物的核酸改变到所需的程度。在一些实施方案中，所需的改变程度是使微生物基因组的复制明显衰减，而同时蛋白质的生产保持充分的活性(即微生物是代谢活跃的)。

应当理解不论改变的性质如何，改变的水平可以用微生物基因组每个碱基对出现改变的平均数量表示。例如，如果改变的原因是化合物与核酸的共价结合(加合物)，则改变可以用加合物之间的平均碱基对数表示。本发明的微生物可以改变的水平是大约每10⁴-10⁸对碱基一个改变，还可以是大约每10⁴-10⁷对碱基一个改变，还可以是大约每10⁵-10⁷对碱基一个改变，或可以是大约每10⁵-10⁶对碱基一个改变。在一个实施方案中，改变的水平调整为阻断DNA在微生物群中复制所需的最小改变量，这样该微生物群不表现出可观察到的增殖而同时保持足够的个体基因的转录和翻译活性(即保持了一些代谢活性)，以获得安全和有效的疫苗。

一方面，本发明提供了包含自生微生物的疫苗，其中该微生物的核酸经过改变使微生物的增殖受到衰减。在一些实施方案中，微生物增殖的衰减可以以剂量依赖的方式被控制。在一些实施方案中，微生物中的微生物基因表达基本上不受微生物增殖衰减的影响。在一些实施方案中，疫苗中的微生物表达的抗原水平足以在向个体施用疫苗之后诱导出针对该抗原的免疫应答。在一些实施方案中，核酸同与核酸直接发生反应的核酸靶向化合物发生反应而被改变。在一个实施方案中核酸靶向化合物是一种烷化剂，例如β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯。在其他实施方案中，核酸靶向化合物是被UVA辐射活化的补骨脂素化合物(例如4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素，这里还被称为S-59)。在一些实施方案中，疫苗中的微生物包含基因突变，该突变减弱了微生物对其经过改变的核酸进行修复的能力。在一些实施方案中，微生物是细菌，例如炭疽芽孢杆菌或者单核细胞增生利斯特氏菌。在一些实施方案中，微生物包含编码抗原的异源核酸序列。在一些实施方案中，疫苗还包含药物上可以接受的载体和/或佐剂。本发明还提供宿主中预防或者治疗疾病的方法，该方法包括向宿主施用有效量的疫苗。本发明还提供了在宿主中诱导针对抗原的免疫应答的方法，该方法包括向宿主施用有效量的疫苗，其中的抗原由微生物表达。

本发明还提供了包含单核细胞增生利斯特氏菌菌株突变株或者炭疽芽孢杆菌菌株突变株的疫苗，其中单核细胞增生利斯特氏菌菌株突变株或者炭疽芽孢杆菌菌株突变株包含基因突变使菌株修复其核酸的能力减弱。

抗原呈递细胞疫苗

本发明涉及改变的自生的微生物以及自生的微生物在制备基于抗原呈递细胞的疫苗组合物中的用途，其中微生物的核酸被改变使微生物的增殖衰减。在一些实施方案中，被改变微生物的微生物基因的表达基本未受影响。

在本发明的一个实施方案中，在疫苗中使用的抗原呈递细胞是专职化(professional)抗原呈递细胞。专职化抗原呈递细胞包括巨噬细胞、树突细胞和B细胞。其他专职化抗原呈递细胞包括单核细胞、边缘区肝巨噬细胞(kupffer cells)、小胶质细胞、朗格汉斯细胞、交错突树突细胞、小节树突细胞和T细胞。在一个实施方案中，专职化抗原呈递细胞是树突细胞。在另一个实施方案中，专职化抗原呈递细胞是巨噬细胞或树突细胞(DCs)。在一个实施方案中，专职化抗原呈递细胞是人的细胞。

在一个实施方案中，未成熟的抗原呈递细胞例如DCs分离自病人，且感染了表达抗原的经过改变的微生物。将产生的荷载抗原呈递细胞转移回到病人体内作为一种自体的APC疫苗，这样诱导CD4+或者CD8+免疫应答。

因此制备和使用本发明的抗原呈递细胞疫苗的方法的一个实例如下：从结肠癌病人分离未成熟的DCs，使其感染S-59/UVA灭活的、不能繁育的、代谢活跃的重组利斯特氏菌-CEA疫苗。用利斯特氏菌感染DC导致CEA肿瘤抗原有效荷载进入MHC类型I和类型II途径。利斯特氏菌感染刺激DC迅速活化和成熟，这对于DC成为能够诱导体内的初级T细胞应答的有效APC是至关重要的。成熟的DC上调CD83、辅助刺激分子例如CD80、CD86以及MHC分子的表达。洗涤荷载了利斯特氏菌疫苗的DC，将其作为自体DC疫苗回输到病人体内，刺激产生CEA特异的T细胞应答。

在以下具体实施例中举例说明了特定的实施方案。但是应当理解，这里描述的一般方法和技术可以更广泛地应用到众多不同的经过改变的微生物、抗原和疾病中。本领域内具有一般技术的人员应该能够容易地调整这里描述的教导。

在另一个实施方案中，在体外用表达抗原的改变的微生物感染未成熟的抗原呈递细胞，例如DC。产生的已荷载的抗原呈递细胞用来致敏(prime)T细胞群，然后将该细胞群转运到病人体内，这样诱导出对抗原的CD4+或者CD8+免疫应答。

另一方面，本发明提供了包含自生微生物的专职化抗原呈递细胞(例如树突细胞)，其中的微生物核酸被改变使微生物的增殖衰减。在一些实施方案中，微生物增殖的衰减可以以剂量依赖的方式控制。在一些实施方案中，微生物中的微生物基因表达基本上未受到微生物增殖衰减的影响。在一些实施方案中，疫苗中的微生物表达的抗原水平足以在向个体施用疫苗之后诱导出针对该抗原的免疫应答。在一些实施方案中，核酸同直接与核酸发生反应的核酸靶向化合物发生反应而被改变。在一个实施方案中核酸靶向化合物是烷化剂，例如β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯。在其他实施方案中，核酸靶向化合物是被UVA辐射活化的补骨脂素化合物。在一些实施方案中，疫苗中的微生物包含基因突变，该突变减弱了微生物对其经过改变的核酸进行修复的能力。在一些实施方案中，微生物是细菌。在一些实施方案中，微生物包含编码抗原的异源核酸序列。本发明还提供了包含抗原呈递细胞的疫苗。本发明还提供宿主中预防或者治疗疾病的方法，该方法包括向宿主施用有效量的抗原呈递细胞。本发明还提供了在宿主中诱导针对抗原的免疫应答的方法，该方法包括向宿主施用有效量的抗原呈递细胞，其中的抗原由微生物表达。本发明还提供了在离体和/或体外活化原初T细胞的方法，该方法包括使原初T细胞在适宜的条件下与专职化抗原呈递细胞接触足够的时间以活化原初T细胞。

微生物复制的衰减

本发明涉及改变微生物的核酸使微生物的复制衰减。复制的衰减可以用于提高微生物向个体施用以后的安全水平。微生物增殖的能力可以通过在提供正常生长的条件下培养一群微生物来进行测量。一般认为一群微生物的正常生长是微生物的核酸没有改变的微生物的生长。微生物基因组的改变会导致一些衰减这样微生物不再进行正常生长。一些微生物会在固化的生长培养基上形成集落。这样微生物复制的衰减就可以量度为集落形成单位(CFU)数目的减少。将微生物集落的储液连续稀释直至集落形成单位的数目可以容易地测定(例如50-500CFU)。通常稀释按照10的倍数进行，一个或者更多稀释样品的集落数目用于估计样品的对数滴度。例如，将一等份稀释的微生物储液涂布于生长培养基上，对产生的集落进行计数。计算该稀释液每毫升的集落形成单位(CFU/mL)，原来储液的每毫升集落形成单位(称为滴度)可以从该稀释度进行计算。log数为对数滴度。作为一个实例，涂布1×10⁵倍稀释的一份0.2毫升菌液后有24个集落形成单位，则储液的滴度是1.2×10⁷，或者是7.08对数滴度。衰减的测量可以是对微生物核酸改变之前的微生物滴度与微生物核酸改变之后的滴度进行比较。未改变的微生物的滴度与改变后的微生物滴度的比值的对数即代表对数衰减(简单地说就是两个对数滴度的差值)。例如，如果未改变的微生物滴度是1.2×10⁷，而改变的微生物滴度是4.3×10²，则产生的衰减水平是4.45log。此方法可以用于评价任何微生物的衰减，不论是致病性的还是非致病性的。对于一些微生物，不直接测量它们的生长，而可以进行空斑实验，即测量微生物杀死被其感染的细胞的能力。例如，某些细胞内细菌可以生长在它们所能够感染的哺乳动物细胞层上。在适当的孵育以后，可以观察细胞层上的空斑(细胞层上的透明区域，代表了被杀死的细胞)。进行与上述计算相似的计算，其中用空斑形成单位代替了集落形成单位，以评价改变微生物核酸以后空斑形成单位数目的减少。对于本发明的实施方案，所需的衰减量可以从2倍衰减到更高水平的衰减，包括几乎观察不到增殖的水平，这取决于所需的安全水平和微生物的应用。对于一个给定的稀释度，在一个微生物群中核酸被改变之后出现的菌落(或者空斑)是未改变微生物群时的一半，则复制衰减了两倍(大约0.3log衰减)。在一些实施方案中，衰减至少大约0.3log，大约1log，大约2log，大约3log，大约4log，大约5log，大约6log，或者至少大约8log。在一些实施方案中，衰减范围是从大约0.3到＞10log、从大约2到＞10log、从大约4到＞10log、从大约6到＞10log、大约0.3-8log、大约0.3-7log、大约0.3-6log、大约0.3-5log、大约0.3-4log、大约0.3-3log、大约0.3-2log、大约0.3-1log。在一些实施方案中，衰减范围是大约1到＞10log、1-8log、1-6log、还有大约2-6log、大约2-5log、大约3-5log。在本发明的一个实施方案中，衰减导致了基本上完全的灭活(例如在检测限度内不能够观察到菌落或者空斑)，而其中的微生物基因表达有足够的活性。这样的微生物群可以这样获得：滴定用于改变微生物核酸的药剂的浓度，找到在检测限度内观察不到菌落或者空斑的药剂的最低浓度。

对于致病微生物，也可以用微生物的生物学作用来评价其衰减。例如，微生物的致病性可以通过测量在小鼠或者其他脊椎动物中的半数致死量(LD₅₀)来评价。LD₅₀是注射到脊椎动物中导致该脊椎动物群一半死亡的微生物的量(例如CFU)。可以比较改变的和未改变的微生物的LD₅₀值，作为衰减量的量度。例如，如果未改变的微生物群的LD₅₀是10³个微生物，而核酸被改变以后的微生物群的LD₅₀是10⁵个微生物，微生物由于衰减其LD₅₀提高了100倍，或者2log。在一些实施方案中，LD₅₀提高了2倍到1000倍。在一些实施方案中，使用的减毒株已经有较高的LD₅₀。在这种情况下，改变的微生物的LD₅₀的增加受到的限制是有多少物质能够注入到体内而不会导致伤害。例如，热杀死生物体的LD₅₀不能高出大约1-5×10⁹太多，只因为生物物质在小鼠体内的荷载和/或对于细菌细胞壁组分的炎症反应。衰减程度还可以通过其他生物学作用定量测定，例如组织病理的程度或者血清肝脏酶的水平。通常在临床实验室中测定注射了本发明中的微生物后小鼠血液中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白以及胆红素的水平。对改变的和未改变的微生物在小鼠中或者其他脊椎动物中产生的作用进行比较是一种评价微生物衰减的方式。除了测量微生物对组织的作用以外，从受到感染的组织如肝脏或者脾脏中回收的可存活微生物的数量对于时间的函数也可以用于测量微生物的衰减，即比较未改变的和改变之后的微生物注射小鼠得到的这些数值。

本发明中的微生物的蛋白表达

对微生物的核酸的改变除了使微生物的增殖衰减以外，是受到控制的，这样微生物的基因表达几乎未受影响。在核酸改变后，为了保持基因表达几乎不受影响，微生物的基因表达不需要完全活跃。只需要核酸被改变的微生物群的复制衰减，微生物基因表达就有充分的活性以提供所需微生物蛋白足够水平的表达。足够水平的表达在一定程度上取决于使用微生物的目的。例如如果微生物含有某种要被用作疫苗的抗原，足够表达的定义就是为疫苗提供有效保护性或者治疗性免疫应答的最低表达水平。微生物基因表达也可以通过体外或者体内的方法进行评价，目的是评价这种疫苗是否能够提供有效的免疫应答。一般地，可以对核酸被改变的微生物群与未改变的微生物群的特定抗原进行比较。

一种可能性是测量与微生物群混和在一起的抗原呈递细胞对目标抗原的呈递。微生物可以与适宜的抗原呈递细胞或者细胞系混和在一起，例如树突细胞，而可以测量由树突细胞向识别该抗原的T细胞进行的抗原呈递。如果微生物表达的该抗原有足够的水平，则该抗原会被树突细胞处理为肽段，在MHC I类或者II类分子情形下向CD8+或者CD4+T细胞分别进行呈递。为了检测到被呈递的抗原，可以使用对特定抗原有响应的T细胞克隆或者T细胞系。T细胞还可以是T细胞杂交瘤，其中T细胞与癌细胞系融合而变为无限增殖化的。这种T细胞杂交瘤、T细胞克隆或者T细胞系可以包含CD8+或者CD4+T细胞。抗原呈递细胞可以向CD8+或者CD4+T细胞呈递抗原，这取决于抗原被加工的途径。CD8+T细胞识别MHC I类抗原，而CD4+T细胞识别MHC II类抗原。通过T细胞自身的T细胞受体的特异识别，T细胞被呈递的抗原刺激，导致某些蛋白质的产生，例如IL-2或者干扰素γ(IFN-γ)，这些蛋白可以被定量测定(例如使用ELISA检测)。或者设计杂交瘤使其包含报告基因，例如β半乳糖苷酶，其在T细胞杂交瘤被呈递的抗原刺激之后会被活化。β半乳糖苷酶产量的增加可以很容易地通过其对于底物(例如氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷)的活性测定，反应会导致颜色的改变。颜色的改变可以作为对特异抗原呈递的指示的直接量度(实施例1、2和11)。其他评价本发明微生物疫苗抗原表达的体外和体内的方法可以在实施例5中找到。还可以直接测量本发明的微生物对某种蛋白质的表达。例如放射性标记的氨基酸可以加入到细胞群中，掺入某蛋白的放射性量可以测定。可以分离该细胞群合成的蛋白，例如通过凝胶电泳或者毛细管电泳，例如通过与该蛋白特异的抗体结合检定出目标蛋白，放射性的量可以定量测定以估计该蛋白的表达水平。或者在没有放射性时表达蛋白，用不同的方法检测，例如ELISA检测或者通过凝胶电泳以及Western印迹，使用酶联抗体或者荧光标记的抗体进行检测。

与未改变的微生物相比，尽管对微生物核酸的改变有可能降低蛋白质的表达水平，但是应当理解这种方式仍然提供了有效的疫苗。在本发明的一些实施方案中，重要的是增殖衰减与重组蛋白质表达的结合。疫苗的效力一般与能够被微生物传输的抗原的剂量有关，在有些实例中，需要有微生物一定活跃水平的基因表达。微生物复制的衰减可能有几个log，而微生物的基因表达可能仍然充分保持。如果相同剂量的衰减的微生物与未改变的微生物比较，在衰减的微生物群中得到的抗原表达(通过以上讨论的方法进行测定)至少是未改变的微生物群中抗原表达的大约1％、大约5％、大约10％、大约25％、大约50％、大约75％、或者至少大约90％。因为在复制中可能有几个log的衰减，改变的微生物的剂量可以安全地提高几个log水平，结果是与未改变的微生物相比较，在免疫接种后，衰减的微生物可以提供等量的或者更大量的抗原。

在一些实施方案中，可以对编码蛋白的异源核酸序列进行密码子优化，以与表达该蛋白的细菌宿主的密码子偏好相适合。此外，编码与所表达蛋白相融合的信号肽的序列也可以进行密码于优化，以与该细菌宿主的密码子偏好相适合。在优选的实施方案中，细菌宿主是利斯特氏菌，异源蛋白编码序列以及编码信号肽的序列二者之一或者全部可以进行密码子优化。关于在利斯特氏菌中对抗原和信号序列进行密码子优化的进一步信息，请参见美国申请序号60/532,598，在此引用作为参考。

微生物核酸改变

可以使用多种不同的方法改变微生物群的核酸。可以通过物理方法改变微生物的核酸，例如使用紫外线辐射或者电离辐射。电离辐射例如x射线或者γ射线可以用来在核酸中产生单链或者双链的断裂。紫外线辐射可以用来在核酸中产生嘧啶二聚体。根据前面的详述，估算辐射对复制和蛋白质表达的影响，可以确定辐射的适宜剂量。

也可以使用化学方法改变微生物的核酸，例如与核酸靶向化合物反应。在一个实施方案中，用核酸靶向化合物处理微生物，使微生物的核酸被改变，这样微生物的增殖受到衰减，其中微生物群仍然能够表达所需的蛋白质抗原，表达量足以诱发免疫应答。核酸靶向化合物不止限于改变核酸的特定机制。这种化合物改变核酸的方式或者是与核酸直接反应(即化合物的所有或者一些部分与核酸共价结合)，或者是间接导致核酸的改变(例如通过产生单线态氧或者氧自由基导致氧损伤，通过产生导致损伤的化合物的自由基，或者通过其他使核酸氧化或者还原的机制)。enediynes是一类形成自由基导致DNA双链断裂的化合物中的实例[Nicolaou等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5881-5888(1993)]。与核酸直接反应的化合物可能在该化合物被活化时，例如在该化合物被辐射时反应。间接反应导致核酸改变的化合物可能需要相似的活化以产生该化合物的活化形式或者产生其他的活性形式。尽管对于活化核酸靶向化合物的方法没有限制，但是本发明的一个实施方案包括使用光活化的化合物，与核酸直接发生反应或者产生活性形式例如活性氧(例如单线态氧)，这些活性形式再与核酸反应。

核酸靶向化合物优选地改变核酸，而对于生物样品中的其他组分没有显著改变。这种化合物为核酸提供了足够的改变，而没有显著改变或者损坏细胞膜、蛋白质或者酯类。这种化合物可能对其他的细胞组分进行一些改变，但是改变的程度不显著。这些细胞组分例如细胞膜、蛋白质和酯类，如果它们的生物学功能被充分保留则它们没有发生显著改变。在使用核酸靶向化合物处理微生物时，核酸的改变导致微生物的复制被衰减同时微生物的细胞膜、蛋白质和酯类几乎未受影响，这样微生物的基因表达仍是活跃的(例如基因表达所需的酶没有受到显著影响)，与没有使用化合物处理的微生物相比，微生物的表面基本上保持了相同的抗原性。所以这种化合物在制备灭活微生物用于疫苗时是有用的，因为微生物的增殖被充分衰减，而同时保持了足够的抗原性和免疫原性，这对于疫苗来讲是有用的。由于这些化合物特异地改变核酸，改变可以被控制在所需的水平，这样复制被衰减而保持了足够水平的蛋白质表达。可以通过改变反应参数控制这种改变，例如化合物的浓度、反应介质、控制化合物活化的因素例如光剂量或者pH，或通过控制氧的浓度(或者物理控制，例如脱气或者化学控制例如使用氧清除剂)来控制导致氧损伤的化合物浓度。核酸靶向化合物是任何倾向优先结合核酸的化合物，即具有可测量的对于核酸的亲和性。这种化合物对核酸比对生物样品中的大多数其他组分，特别是例如蛋白质、酶、酯类和膜组分，具有更强的亲和性。核酸靶向提供了改变核酸的特异性，而对于生物样品中的其他组分，例如基因转录和蛋白质翻译体系，则没有显著影响。

化合物可以以多种方式靶向核酸。通过以下方式中的任何一种或者这些方式的组合与核酸结合的化合物被认为是核酸靶向化合物。嵌入、小沟结合、大沟结合、静电引力结合(例如磷酸主链结合)以及序列特异结合(通过大沟或者小沟中的序列识别)都是与核酸非共价结合的方式。包括这些结合方式中一种或者多种的化合物对核酸具有高亲和性。尽管本发明并不限于以下的化合物，具有这些结合核酸方式的化合物的一些实例如下：嵌入剂的实例有吖啶、吖啶酮、原黄素、吖啶黄素、放线菌素、anthracyclinones、β-紫红霉素A、道诺霉素、硫代噻吨酮、米来西D、氨茴霉素、丝裂霉素、棘霉素、醌霉素、三骨菌素、二吖啶、椭圆玫瑰树碱(ellipticene)(包括二聚体、三聚体和类似物)、norphilin A、芴和芴酮、芴二胺、喹吖因、苯并吖啶、吩嗪、phenanthradines吩噻嗪、氯丙嗪、吩噁嗪、苯并噻唑、呫吨和噻吨、蒽醌、蒽吡唑、苯并硫代吡喃吲哚(benzothiopyranoindoles)，3，4-苯并芘、苯并芘diolepoxidie、1-pyrenyloxirane、苯并蒽-5，6-氧化物、苯并二吡喃酮、苯并噻唑、喹啉酮、氯喹、奎宁、苯基喹啉氨甲酰胺、咈喃香豆素(例如补骨脂素、异补骨脂素和它们的硫类似物)、乙啶盐、丙啶、coralyne，椭圆玫瑰树碱阳离子以及衍生物，多环碳氢化合物和它们的环氧衍生物，以及echinimycin；小沟结合物的实例有偏端霉素、丝裂霉素、纺锤霉素、其他lexitropsins，Hoechst 33258和其他Hoechst染料，DAPI(4，6-联脒-2-苯基吲哚)，伯林尼尔(berenil)，以及三芳甲烷染料；小沟结合剂的实例有黄曲霉毒素；静电结合剂的实例有精胺、亚精胺、和其他的多胺；序列特异结合物的实例有核酸或者其类似物，它们通过序列特异的相互作用例如形成三螺旋、形成D-环以及与单链目标直接碱基配对等方式与核酸结合。其他的序列特异化合物包括多聚吡咯化合物、多聚吡咯咪唑化合物、环丙基吡咯吲哚化合物以及相关的小沟结合化合物[Wemmer，Nature Structural Biology，5(3)：169-171(1998)，Wurtz等人，Chemistry&Biology 7(3)：153-161(2000)，Anthon等人，Am.J.pharmacogenomics1(1)：67-81(2001)]。

除了靶向核酸以外，化合物还可以与核酸发生反应，产生与核酸的共价结合。核酸烷化剂是一类可以与核酸共价反应的化合物，包括但是不只限于，芥子(例如单或者二卤代乙胺基团以及单卤代乙基硫基团)、芥子等价物(例如环氧化物、α卤代酮)以及芥子中间产物(例如氮丙啶、吖丙啶鎓及它们的类似物)、硫酸甲酯以及亚硝基脲。核酸烷化剂通常与核酸上的亲核基团反应。是这些化合物使核酸烷化的活性以及靶向核酸的能力二者的结合使得它们具有与核酸特异地共价结合的能力，提供了对用于本发明中微生物的核酸的所需改变。这些化合物的特异性可以通过使用不会进入到微生物中的淬灭剂而得到进一步提高。这种淬灭剂会使与微生物表面的反应淬灭而仍然允许核酸靶向化合物与微生物的核酸反应。对于这种淬灭的讨论可以在美国专利编号6,270,952中找到，该专利公开的内容在这里引用作为参考。可以通过调节化合物的浓度和反应条件来控制对微生物核酸的改变。根据前面的详述，通过估计浓度和反应条件对于复制核蛋白质表达的影响来确定适宜的浓度和反应条件。本发明中使用的化合物的浓度在大约10pM到10mM时是有效的，还有在大约100pM到1mM，还有在大约1nM到10μM，还有在大约1-500nM，还有在大约1-200nM或者大约1-100nM。对于靶向核酸、具有核酸反应性能够与核酸(特别是微生物核酸)发生特异反应的化合物的讨论可以在美国专利编号6,143,490和6,093,725中找到，这些专利公开的内容在这里引用作为参考。

可以通过使用核酸靶向化合物对核酸进行改变，核酸靶向化合物需要辐射的活化才能对核酸进行改变。这种化合物靶向核酸上，如上面所讨论的。这些化合物包括，但是不只限于，吖啶、吖啶酮，anthyrl衍生物，咯嗪(例如核黄素)，苯并三唑衍生物，平面芳香族重氮衍生物，平面芳香腈衍生物，甲苯胺，吖黄素，酚噻嗪(例如亚甲基蓝)、咈喃香豆素，白芷素，补骨脂素，补骨脂素的硫类似物，喹诺酮，喹啉，喹喔啉，萘啶，氟喹啉酮，蒽醌和蒽。许多这些化合物被用作DNA光断裂剂[Da Ros等人，Current Pharmaceutical Design7：1781(2001)]。尽管本发明没有对活化核酸靶向化合物的方法进行限制，但通常这些化合物可以使用特定波长的光进行活化。光的有效波长取决于化合物的性质，其范围可以从大约200到1200nm。对于这些化合物中的一些，活化使得核酸被改变而没有化合物与核酸的直接结合，例如通过在核酸周围产生活性氧。对于这些化合物中的一些，活化导致化合物与核酸直接结合(即化合物共价结合)。这些化合物中的一些可以与核酸反应形成一个链间的交联。补骨脂素是使核酸交联的化合物中的一例。这些化合物通常被UVA光(320-400nm)活化。在本发明中使用的补骨脂素化合物在美国专利编号6,133,460和5,593,823中举例说明，这些专利公开的内容在这里引用作为参考。同样，是核酸靶向和在活化后改变核酸的能力二者的结合使得它们具有与核酸的特异反应性。微生物核酸的改变可以通过调节化合物浓度、反应条件和光剂量来改变。根据前面的详述，对浓度和光剂量对复制和蛋白质表达的影响进行评价，从而确定适当的浓度和光剂量。除了化合物浓度和光照射水平以外，反应还受到样品在UVA紫外光下照射条件的影响。例如在缓冲培养基内辐射微生物群所需的整体浓度与辐射在生长培养基(例如BHI，Triptase Soy Broth)内的微生物群所需的整体浓度就有所不同。光反应会受到培养基内物质的影响，它们可能与补骨脂素发生相互作用，这样就需要更高整体浓度的补骨脂素。此外，使微生物接受有效剂量可能取决于生物体的生长阶段和在该生长阶段有没有该化合物。在一个实施方案中，微生物群在补骨脂素UVA处理时包含生长培养基。在一个实施方案中，补骨脂素加到微生物群中，在补骨脂素和生长培养基存在的条件下培养该微生物，UVA的处理与微生物的生长阶段处于相同时间段。在一个实施方案中，在使用适当剂量的UVA照射之前，使微生物群在补骨脂素存在的条件下生长到OD达0.5-1(1×10⁷到1×10⁹CFU/mL)。补骨脂素化合物在大约10pM-10mM的浓度内是有效的，还有在大约100pM-1mM，还有在大约1nM-10μM，还有在大约1-500nM，还有在大约1-200nM或者大约1-100nM，UVA紫外线的剂量范围从大约0.1-100J/cm²，还有是大约0.1-20J/cm²，还有是大约0.5-10J/cm²，还有是大约0.5-6J/cm²，或者是大约2-6J/cm²。在一个实施方案中，在下列浓度的补骨脂素的生长培养基存在下处理微生物：大约10pM-10mM，还大约1-5000nM，还大约1-500nM，还大约5-500nM或大约10-400nM。在一个实施方案中，在生长培养基存在时处理微生物，使其在补骨脂素存在时生长到OD达0.5-1，补骨脂素的浓度为大约10pM-10mM，还有在大约1-5000nM，还有在大约1-500nM，还有在大约5-500nM或者大约10-400nM。在生长达到OD0.5-1以后，使用UVA紫外线照射该微生物群，照射剂量为大约0.1-100J/cm²，还有是大约0.1-20J/cm²，或是大约0.5-10J/cm²，0.5-6J/cm²，或者是大约2-6J/cm²。

含有异源核酸序列的微生物

可以改变微生物使其包括异源的核酸序列，该序列可以被此微生物表达。异源序列可以编码至少一种特异的蛋白质抗原。可以通过对本领域内的技术人员已知的方法[Sambrook and Russell，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring HarborLaboratory Press，(2000)]改变微生物。可以将微生物改变为含有一个或者多个序列，其编码一种或者多种抗原。编码特异抗原的异源核酸序列不限于严格的核酸序列，它应该是一种足以提供抗原表达的序列，该抗原在向个体施用以后会诱发所需的免疫应答。异源序列可以被表达为与某一疾病相关的抗原。表达这种抗原的微生物可以用于疫苗，其中的疫苗可以用于预防性治疗或者治疗性治疗。可以使用这种疫苗治疗的疾病包括传染性疾病、自身免疫疾病、过敏、癌症以及其他细胞增生型疾病。

可以改变本发明的微生物使其包含编码特异肿瘤抗原的异源核酸序列。已经鉴定出大量的被T细胞识别的肿瘤特异抗原[Renkvist等人，Cancer Immunol Innumother 50：3-15(2001)]。这些肿瘤抗原可以是分化抗原(例如PSMA，酪氨酸酶，gp100)、组织特异抗原(例如PAP、PSA)、发育抗原、肿瘤相关的病毒抗原(例如HPV 16E7)，癌/睾丸抗原(例如MAGE、BAGE、NY-ESO-1)，胚胎抗原(例如CEA、α胎蛋白)、癌蛋白抗原(例如Ras、p53)、过量表达蛋白抗原(例如ErbB2(Her2/Neu)，MUC1)或者突变的蛋白抗原。可以由异源核酸序列编码的肿瘤抗原包括，但是不限于，707-AP，膜联蛋白II，AFP，ART-4，BAGE，β-连环蛋白/m，BCL-2，bcr-ab1，bcr-ab1 p190，bcr-ab1 p210，BRCA-1，BRCA-2，CAMEL，CAP-1，CASP-8，CDC27/m，CDK-4/m，CEA，CT9，CT10，Cyp-B，Dek-cain，DAM-6(MAGE-B2)，DAM-10(MAGE-B1)，ELF2M，EphA2，ETV6-AML1，G250，GAGE-1，GAGE-2，GAGE-3，GAGE-4，GAGE-5，GAGE-6，GAGE-7B，GAGE-8，GnT-V，gp100，HAGE，HER2/neu，HLA-A*0201-R170I，HPV-E7，HSP70-2M，HST-2，hTERT，hTRT，iCE，细胞程序死亡抑制剂(例如survivin)，KIAA0205，LAGE，LAGE-1，LDLR/FUT，MAGE-1，MAGE-2，MAGE-3，MAGE-6，MAGE-A1，MAGE-A2，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A6，MAGE-A10，MAGE-A12，MAGE-B5，MAGE-B6，MAGE-C2，MAGE-C3，MAGE-D，MART-1，MART-1/Melan-A，MC1R，MDM-2，间皮素(mesothelin)，肌球蛋白/m，MUC1，MUC2，MUM-1，MUM-2，MUM-3，neo-polyA-聚合酶，NA88-A，NY-ESO-1，NY-ESO-1a(CAG-3)，PAGE-4，PAP，蛋白酶3(PR3)，P15，p190，Pml/RARα，PRAME，PSA，PSM，PSMA，RAGE，RAS，RCAS1，RU1，RU2，SAGE，SART-1，SART-2，SART-3，SP 17，SPAS-1，TEL/AML1，TPI/m，酪氨酸酶，TARP，TRP-1(gp75)，TRP-2，TRP-2/INT2，WT-1，以及来源于NY-ESO-1和LAGE-1基因的可变翻译的NY-ESO-ORF2和CAMEL蛋白。本发明的微生物包含任何能够引发肿瘤特异免疫应答的肿瘤抗原，包括还没有被检定的抗原。可以将微生物改变为含有一种以上异源序列，其编码一种以上的肿瘤抗原。优选的抗原包括间皮素[Argani等人，Clin Cancer Res.7(12)：3862-8(2001)]，Sp17[Lim等人，Blood.97(5)：1508-10(2001)]，gp100[Kawakami等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：6458(1994)]，PAGE-4[Brinkmann等人，Cancer Res.59(7)：1445-8(1999)]，TARP[Wolfgang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(17)：9437-42(2000)]，EphA2[Tatsumi等人，Cancer Res.63(15)：4481-9(2003)]，PR3[Muller-Berat等人，Clin.Immunol.Immunopath.70(1)：51-9(1994)]以及SPAS-1[U.S.专利申请出版编号20020150588]。

在本发明的一个实施方案中，被改变的微生物表达的异源抗原是CEA。CEA是180kDA的膜细胞间附着糖蛋白，它在很大一部分的人肿瘤中有过量的表达，包括90％的结肠癌、胃癌、胰腺癌、70％的非小型细胞肺癌以及50％的乳腺癌(Hammarstrom，Semin.Cancer Biol.，9：67-81)。研究者对许多不同的免疫疗法进行了研究例如模拟CEA的抗独特型单克隆抗体(Foon等人，Clin.Cancer Res.，87：982-90(1995))或者使用表达CEA的重组痘病毒进行接种(Tsang等人，J.Natl.Cancer Inst.，87：982-90(1995))，不幸的是它们只取得了有限的成功。但是研究人员鉴定了一种HLA^*0201限制表位，CAP-1(CEA605-613)，它被来自免疫接种病人的人T细胞系识别。使用该表位冲击后的DC接种病人不能诱导临床应答(Morse等人，Clin.CancerRes.，5：1331-8(1999))。最近鉴定出一个CEA605-613肽激动剂，其具有一个畸形的天冬氨酸，代替了610位的天冬酰胺(CAP 1-6D)。尽管该氨基酸替代没有改变该肽的MHC结合亲和性，但是使用改变的肽配基(APL)导致在体外CEA特异的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)产量的增加。CAP1-6D-特异的CTL保持了它们识别和裂解表达天然CEA蛋白的肿瘤细胞的能力(Zaremba等人，Cancer Res.，57：4570-7(1997)；Salazar等人，Int.J.Cancer，85：829-38(2000))。Fong等人证明具有结肠癌病人体内诱导出CEA特异的免疫性，这些病人接受了用Flt3-配基扩展的DC与该APL共同孵育后进行的接种。令人鼓舞的是，12个病人中有两人在接种后出现显著的肿瘤消退，这与肽-MHC四聚体⁺T细胞的诱导相互关联(Fong等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，98：8809-14(2001))。一起来看，该工作为以CEA为目标治疗结肠癌的免疫疗法提供了重要的确证。

在另一个实施方案中，被改变的微生物表达的异源抗原是蛋白酶3或者来源于蛋白酶3。例如，在一个实施方案中，抗原包含HLA-A2.1-限制肽PR1(氨基酸169-177；VLQELNVTV(SEQ ID NO：50))。关于蛋白酶3和/或PR1表位的信息可以从以下的参考文献中公开地获得：美国专利编号5,180,819，Molldrem等人，Blood，90：2529-2534(1997)；Molldrem等人，Cancer Research，59：2675-2681(1999)；Molldrem等人，Nature Medicine，6：1018-1023(2000)；以及Molldrem等人，Oncogene，21：8668-8673(2002)，

因此，在一些实施方案中，改变的微生物包含的核酸分子编码的抗原有例如，间皮素，SPAS-1，蛋白酶3，EphA2，SP-17，gp100，PAGE-4，TARP，Her-2/neu，WT-1，NY-ESO-1，PSMA，K-ras或者CEA，或者衍生自这些蛋白的抗原。在一些实施方案中，改变的微生物包含的核酸分子编码的抗原有例如，间皮素，SPAS-1，蛋白酶3，SP-17，gp100，PAGE-4，TARP，WT-1，NY-ESO-1或者CEA，或者衍生自这些蛋白的抗原。在一些实施方案中，改变的微生物包含的核酸分子编码的抗原是人间皮素，或者是衍生自人间皮素的抗原。在其他实施方案中，改变的微生物包含的核酸分子编码人EphA2，或者是衍生自人EphA2的抗原。

可以改变本发明的微生物使其含有编码特异的传染性疾病抗原的异源核酸序列。在一个实施方案中，抗原来自人或者动物病原。病原可选择地是病毒、细菌、真菌或者原生动物。例如，抗原可以是病毒或者真菌或者细菌的抗原。

例如，抗原可以来源于人免疫缺陷病毒(例如gp 120，gp 160，gp41，gag抗原例如p24gag和p55gag，以及来源于HIV的pol，env，tat，vif，rev，nef，vpr，vpu和LTR区域的蛋白)、猫科免疫缺陷病毒或者人或动物的疱疹病毒。在一个实施方案中，抗原来自单纯疱疹病毒(HSV)类型1和2(例如gD，gB，gH，即早蛋白例如ICP27)、来自巨细胞病毒(例如gB和gH)，来自人metapneumovirus毒、来自EB病毒或者来自水痘-带状疱疹病毒(例如gpI，II或III)。(参见例如Chee等人(1990)Cytomegaloviruses(J.K.McDougall，ed.，Springer Verlag，pp.125-169；McGeoch等人(1988)J.Gen.Virol.69：1531-1574；美国专利5,171,568号；Baer等人(1984)Nature310：207-211；以及Davison等人(1986)J.Gen.Virol.67：1759-1816.)

在另一个实施方案中，抗原来自肝炎病毒例如乙型肝炎病毒(例如乙肝表面抗原)，甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒或者庚型肝炎病毒。参见例如WO 89/04669；WO90/11089；和WO 90/14436。HCV基因组编码几种病毒蛋白，包括E1和E2。参见例如Houghton等人，Hepatology 14：381-388(1991).

属于病毒抗原的抗原可以选择性地来自以下各科中的任何一种：细小核糖核酸病毒科(例如脊髓灰质炎病毒病毒、鼻病毒等)；杯状病毒科；披膜病毒科(例如风疹病毒、登革病毒等)；黄病毒科；冠状病毒科；呼肠孤病毒科(例如轮状病毒等)；双RNA病毒科；弹状病毒科(例如狂犬病毒等)；正黏病毒科(例如流感病毒A、B、C型等)；线状病毒科；副黏病毒科(例如腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞体毒素、副流感病毒等)；布尼亚病毒科(Bunyaviridae)；沙粒病毒科；逆转录病毒科(例如HTLV-I；HTLV-11；HIV-1(也被称为HTLV-111，LAV，ARV，hTLR，等))，包括但是不限于来自以下分离株的抗原：HIVIllb，HIVSF2，HTVLAV，HIVLAI，HIVMN)；HIV-1CM235，HIV-1；HIV-2等；猴免疫缺陷病毒(SIV)；乳头瘤病毒，蜱传脑炎病毒等。参见例如Virology，第三版(W.K.Joklik编1988)；Fundamental Virology，第二次增补版(B.N.Fields andD.M.Knipe，eds.1991)，中对这些病毒和其他病毒的描述。

在另一些实施方案中，抗原来自细菌病原例如分支杆菌属、芽孢杆菌属、耶尔森氏菌属、沙门氏菌属、奈瑟氏菌属，疏螺旋体属(例如，OspA或者OspB或者它们的衍生物)，衣原体或者博德特氏杆菌属(例如P.69，PT和FHA)，或者来自寄生虫例如疟原虫属或者弓形虫属。在一个实施方案中，抗原来自结合分支杆菌(例如ESAT-6，85A，85B，72F)，炭疽芽孢杆菌(例如PA)，或者鼠疫耶尔森氏菌(例如F1，V)。此外适于用于本发明的抗原可以从导致以下疾病的病原中获得或者衍生，这些疾病包括，但是不限于，白喉，百日咳，破伤风，结核，细菌性或者真菌性肺炎，中耳炎，淋病，霍乱，伤寒，脑膜炎，单核细胞增多症，鼠疫，痢疾或者沙门氏菌病，军团杆菌病、lyme氏疏螺旋体病，麻风病，疟疾，钩虫病，盘尾丝虫病、血吸虫病，锥虫病，利什曼病，Giardia，阿米巴病，丝虫病，Borelia以及旋毛虫病。

可以改变本发明的微生物使其含有编码自身免疫疾病特异抗原的异源核酸序列。在T细胞介导的自身免疫疾病中，T细胞对于自身抗原的应答导致了自身免疫疾病。用于利用本发明的疫苗治疗自身免疫疾病的抗原可以以造成自身免疫应答的T细胞作为目标。例如抗原可以是对于那些导致自身免疫应答的T细胞特异的T细胞受体的一部分、独特型，其中掺入到本发明疫苗中的抗原会引发对那些导致自身免疫应答的T细胞特异的免疫应答。除去那些T细胞是一种减轻自身免疫疾病的治疗机制。另一种可能性是掺入产生免疫应答的抗原，这些抗原产生的免疫应答针对的是自身免疫疾病中针对自身抗原产生的抗体，或者是分泌这些抗体的特异B细胞克隆。例如独特型抗原可以掺入到微生物中，这样会产生抗独特型免疫应答，该应答针对的是这种B细胞和/或在自身免疫疾病中与自身抗原反应的抗体。可以用本发明中的疫苗微生物治疗的自身免疫疾病包括，但是不限于，类风湿性关节炎，多发性硬化症、克罗恩氏病(节段性回肠炎)、狼疮、重症肌无力、白癫风、硬皮病、银屑病、寻常性天疱疮、肌纤维痛、结肠炎和糖尿病。治疗过敏应答，可以采取相似的方法，其中掺入到疫苗微生物中的抗原针对的是T细胞、B细胞或者在调节过敏反应中起作用的抗体。在一些自身免疫疾病中，例如银屑病，该疾病导致了细胞增生型细胞生长，表达的抗原也会成为疫苗攻击的对象。也考虑能够产生这种针对细胞增生型细胞的免疫应答的抗原。

本发明的微生物包含的抗原针对的不是疾病中有功能障碍的细胞，而是与疾病有关的独特的蛋白质结构。这方面的一个实例是使用以上讨论的独特型抗原靶向抗体、B细胞或者T细胞。另一种可能性是针对由于某种疾病产生的独特的蛋白质结构。这方面的一个实例是掺入抗原会产生对导致淀粉样斑块发生的蛋白的免疫应答，淀粉样斑块在阿尔茨海默氏病，克雅氏病(CJD)以及牛海绵状脑病(BSE)中会观察到。尽管这一方法可能只能使斑块的形成减少，但是对于类似CJD的疾病而言有可能提供一种有疗效的疫苗。该疾病是由于朊蛋白的感染性形式所导致的。疫苗掺入了是针对朊蛋白感染性形式的抗原，这样由疫苗产生的免疫应答就可以消除、降低或者控制导致CJD的感染性蛋白。

含有突变的微生物

在一个实施方案中，本发明包括了包含微生物的疫苗，其中微生物的核酸被改变使微生物的增殖受到衰减，其中的微生物群体仍然能够表达所需的蛋白，表达水平足以诱发免疫应答，并且其中的微生物被至少一种基因突变进一步地衰减。微生物中的突变可能影响微生物的许多性质。在一些情况下，突变影响微生物侵入某些细胞的能力。例如，某些细胞内细菌可以侵入许多不同的细胞类型，这取决于细菌上存在的受体。突变可能改变某些受体的表达，这样细菌就会被某些细胞摄入而不被其他细胞摄入。作为这方面的一个实例，利斯特氏菌通常被吞噬细胞摄取，并且也活跃地侵入非吞噬细胞(例如肝细胞)。可以使用利斯特氏菌的突变，这样对非吞噬细胞的侵入被显著降低或消除，而吞噬细胞的摄取仍然足够活跃。这样的突变可能提供更好的免疫应答，因为疫苗会被吞噬细胞优先摄取，这对于向免疫系统呈递细菌抗原是重要的。应当理解突变可以发生在任何基因上，导致微生物侵入某些类型细胞能力的衰减，这可以由利斯特氏菌中内化素基因(例如inlA，inlB)的突变来说明。在其他细菌中可能存在相似的基因(例如在沙门氏菌属，炭疽芽孢杆菌属，和耶尔森氏菌属中的侵袭素基因)，这些基因的突变也包括在本发明中。突变可能影响到微生物的其他性质，例如毒力因子或者使微生物生长和扩散的基因，这样就降低了微生物的毒性。例如，利斯特氏菌的actA基因突变导致宿主细胞肌动蛋白聚合的缺陷，这抑制了利斯特氏菌向其他细胞的扩散。利斯特氏菌的hly基因(利斯特溶素(listeriolysin)(LLO)蛋白)突变影响了利斯特氏菌逃脱受感染细胞吞噬溶酶体的能力。利斯特氏菌的plcA或plcB基因发生突变影响了利斯特氏菌从细胞向细胞的扩散。耶尔森氏菌的yop基因发生突变影响了耶尔森氏菌防止被巨噬细胞吞噬的能力。在另一个实施方案中，基团突变减弱了某些抗原的表达，例如通常导致对微生物自身产生免疫应答的抗原。如果用于疫苗的微生物包含异源抗原，目的是刺激产生针对异源抗原的强烈免疫应答，而与未突变的微生物相比，对于传输微生物的免疫应答下降，则这样的突变是有用的。在一个实施方案中，通过一个以上基因的突变使微生物减毒。在一个实施方案中，突变中的一个位于利斯特氏菌的内化素基因或者其他细菌的相似基因上。在一个实施方案中，突变位于一个或者多个利斯特氏菌的内化素基因或者其他细菌的相似基因上。在一个实施方案中，突变之一位于actA基因上。在一个实施方案中，微生物包含单核细胞增生利斯特氏菌，它在actA基因上具有突变，并且在一个或者多个内化素基因上有突变。在一个优选的实施方案中，单核细胞增生利斯特氏菌在actA基因和inlB基因上含有突变，优选地，单核细胞增生利斯特氏菌包含actA/inlB缺失突变(在这里既可以表示为ΔactAΔinlB，又可以表示为actA^-inlB^-)。多种利斯特氏菌的基因的序列，包括那些在这里进行描述的基因的序列可以在Genbank登录号NC_003210中找到。

微生物可能含有突变，该突变显著降低了微生物修复对它们的核酸改变的能力。这种突变可以位于参与微生物DNA修复机制的多种不同的基因中[Aravind等人，Nucleic Acids Research 27(5)：1223-1242(1999)]。在修复对其核酸造成的损伤的能力上有缺陷的微生物，为本发明的微生物的使用提供了更进一步的安全性和有效性。使用适当的修复缺陷突变体，微生物对核酸的改变极度敏感。可以较小幅度地改变微生物的核酸而仍然保证所需的增殖衰减。这提供了更大的对效力进行操作的窗口，这样微生物核酸的表达仍然足够以产生所需的蛋白。在需要抗原的重新表达时，这提供了可以引发有效免疫应答的疫苗。它还提供了更高水平的安全性，因为已经获得的增殖衰减不会因为对于改变核酸的修复而受到损害。在另一个实施方案中，基因突变改变了微生物对核酸靶向化合物处理的易感性，例如改变微生物对于该化合物的通透性或者改变化合物接触和结合微生物核酸的能力。这种突变还可能影响增殖衰减这一过程的效力，而同时使微生物的基因表达基本上不受影响。

为了详细阐明使用修复缺陷突变体的优势，可以考虑微生物增殖衰减的机制。微生物核酸通过链断裂或者嘧啶二聚体，或者通过化学修饰例如单加合物或者交联而被改变。如果对于这些改变的修复机制完好无缺，则需要一定数量的改变才能达到有效的增殖衰减。对核酸改变得越大，蛋白质表达减少得越多。尽管衰减增殖所需的改变水平与终止蛋白质表达所需的改变水平相比要低得多，蛋白质的表达仍然会有一定程度的下降，很可能到达一个不能被接受的水平。使用修复缺陷突变体显著降低了衰减增殖所需的水平，这样低水平的核酸改变就会导致充分的增殖衰减。由于核酸的改变少得多，蛋白质表达受到的影响减小，目标蛋白的表达水平提高。这种修复缺陷突变体可能在制备疫苗中是非常有用的，例如针对微生物自身的疫苗，这时可以通过对核酸进行微小的改变提高疫苗的安全性，而仍然保留足够高水平的蛋白质表达，特别是免疫应答所针对的抗原的表达。在一个实施方案中，修复缺陷突变体不能制造PhrB(一种光裂解酶)，PhrB的作用是修复嘧啶二聚体。例如，突变可以位于phrB基因或者功能等价的基因中(这取决于微生物的种属)。这种突变体可以与紫外线辐射(例如UVB，UVC)微生物联合使用，在微生物的核酸中产生嘧啶二聚体。在一个实施方案中修复缺陷突变体不能修复链间交联。这种突变体包含，但是不限于，uvr基因即uvrA，uvrB，uvrC，和uvrD以及recA基因，或者功能等价的基因(这取决于微生物的种属)的突变。突变可以出现在这些基因中的一个或者多个中。这些突变导致了相应的酶UvrA(ATP酶)，UvrB(解旋酶)，UvrC(核酸酶)，UvrD(解旋酶II)以及RecA(重组酶)的活性的减弱。这些突变体可以与交联化合物例如补骨脂素联合使用。因为微生物核酸在一些位置是交联的，而这些交联不能够被修复，所以微生物由于最初的核酸链不能够分开而不能复制。由于交联不能被修复，所以只需要非常少的交联，微生物核酸的大部分仍然可以进行转录，蛋白质的表达没有出现显著改变。在一个优选的实施方案中，一群不能修复链间交联的修复缺陷微生物突变体进行适当的交联，这样几乎该群中每一个微生物都含有至少一个交联，这样复制的衰减几乎是完全的，其中该群体的微生物基因表达是足够活跃的。在一个实施方案中，recA基因的突变是一个条件突变。在这种突变中，recA基因的突变导致recA的活性仅仅在某些条件下(即非允许条件)减弱，例如微生物群体适宜的pH或者温度。包含条件recA突变的微生物可以在允许条件下进行培养，目的是使微生物生长到足够水平，然后将其置于非允许条件中进行处理改变核酸，然后在非允许条件下保存，这样核酸的损伤不能得到充分的修复。作为这个方面的一个实例，将recA温度敏感突变体在30℃培养，这时它生长得很好，在42℃处理以改变核酸，42℃对于recA是非允许的，这使得微生物对于例如补骨脂素的交联等处理非常敏感。尽管经过处理的微生物可以在非允许条件下储存，但是有可能在免疫接种以后，环境可能允许recA的表达，导致一些修复，出现安全性问题。可以构建recA处于lac阻遏物控制下的微生物，这样在灭活和/或免疫步骤以前需要生长的时候，菌株的生长可以被异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导。在灭活和/或免疫步骤时，不再进一步添加IPTG或者从菌株的环境中除去IPTG，则recA表达的可能性可以被消除。

在一个实施方案中，微生物包含至少一个突变，该突变显著降低了微生物修复其核酸的改变的能力；微生物还至少包含一个与修复机制无关的突变。与修复机制无关的突变可能影响微生物的多种性质，例如微生物侵入某些细胞的能力，使微生物生长或者扩散的毒力因子或者基因中的突变，或者使某些抗原表达减弱的突变。这些突变在以上有所讨论，它们包括，但是不限于以下基因的突变：利斯特氏菌的内化素基因(例如inlB)，actA基因，hly基因，plcA基因，或者plcB基因；侵入基因(例如沙门氏菌属，炭疽芽孢杆菌和耶尔森氏菌属)或者耶尔森氏菌属的yop基因。在一个实施方案中，微生物包含具有actA基因突变的单核细胞增生利斯特氏菌。在一个实施方案中，单核细胞增生利斯特氏菌包含actA基因的突变和内化素基因的突变。在一个实施方案中，单核细胞增生利斯特氏菌包含actA突变和uvrAB突变，优选为actA/uvrAB缺失突变(可以称作ΔactAΔuvrAB或者actA^-uvrAB^-)。在一个实施方案中，单核细胞增生利斯特氏菌包含actA突变，inlB突变和uvrAB突变，优选为actA/inlB/uvrAB缺失突变。在一些其他的实施方案中，微生物包含具有uvrB突变，例如缺失的炭疽芽孢杆菌。

在另一个实施方案中，本发明提供了分离的利斯特氏菌突变株，例如单核细胞增生利斯特氏菌突变株，它包含的基因突变使其修复其核酸的能力减弱。在一些实施方案中，利斯特氏菌突变株在至少一个DNA修复酶(例如UvrA和/或UvrB)中有缺陷。在一些实施方案中，利斯特氏菌突变株包含的基因突变位于uvrA基因和/或uvrB基因中。在一些实施方案中，突变菌株是保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，编号PTA-5563的单核细胞增生利斯特氏菌ΔactAΔuvrAB菌株。在其他实施方案中，菌株是保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的编号PTA-5563的单核细胞增生利斯特氏菌ΔactAΔuvrAB菌株的突变株，其中被保藏菌株的突变株在UvrA，UvrB以及ActA上有缺陷。

在一些实施方案中，本发明提供了在至少一个DNA修复酶上有缺陷(相对于野生型)的自生的微生物。在一些实施方案中，相对于野生型，在至少一个DNA修复酶上有缺陷的自生的微生物，其DNA修复减弱。在一些实施方案中，相对于野生型，该微生物修复DNA的能力降低了至少大约10％，至少大约25％，至少大约50％，至少大约75％，或者至少大约90％。评价微生物修复其DNA能力的方法对于本领域内具有普通技术的人员是众所周知的。在一些实施方案中，微生物在以下酶中的一种或者多种上有缺陷：PhrB，UvrA，UvrB，UvrC，UvrD，和RecA。在一些实施方案中，微生物在UvrA、UvrB上有缺陷或者二者都有缺陷。在一些实施方案中，微生物在RecA或者其功能等价物上有缺陷。在一些实施方案中，微生物在选自以下基因组成的组的一个或者多个基因中包含基因突变：phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA，或者在上述基因的功能等价物的一个或者多个中包含基因突变。在一些实施方案中，微生物在uvrA和uvrB二基因上，或者二者的功能等价物上都有基因突变。在一些实施方案中，微生物在recA基因上有遗传突变。在一些实施方案中，微生物是细菌。在一些实施方案中，微生物是结核分支杆菌、单核细胞增生利斯特氏菌或者炭疽芽孢杆菌。

本发明还提供了分离的单核细胞增生利斯特氏菌突变株，该突变株包含了基因突变，减弱了该菌株修复其核酸的能力。在一些实施方案中，突变的菌株在至少一个DNA修复酶(例如UvrA和/或UvrB)中有缺陷。在一些实施方案中，突变的菌株在uvrA基因和/或uvrB基因中包含基因突变。在一些实施方案中，uvrA基因或uvrB基因被删除，或者都被删除。在一些实施方案中，突变株的RecA减弱。在一些实施方案中，突变株的recA基因包含基因突变。在一些实施方案中，突变体微生物是保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的编号PTA-5563的单核细胞增生利斯特氏菌actA^-/uvrAB^-菌株，或者是保藏的菌株的突变株，突变株在UvrA，UvrB以及ActA上有缺陷。

本发明还提供了炭疽芽孢杆菌的分离突变株，该突变株包含了基因突变，减弱了该菌株修复其核酸的能力。在一些实施方案中，突变的菌株在至少一种DNA修复酶上(例如UvrA和/或UvrB)中有缺陷。在一些实施方案中，突变株在uvrA基因和/或uvrB基因中有缺陷。在一些实施方案中，uvrA基因(SEQ ID NO：18)或者uvrB基因(SEQID NO：19)被删除或者二者均被删除。在一些实施方案中，突变株的RecA减弱。在一些实施方案中，突变株的recA基因中包含基因突变。在一些实施方案中，突变株的recA上的突变使得recA的蛋白表达变得温度敏感。在另一些实施方案中，构建炭疽芽孢杆菌的突变株，使其在lac阻遏物(可被IPTG诱导)的控制下，这样允许recA蛋白在生长中表达，但是不能在灭活(例如使用S-59/UVA)和/或免疫接种以后表达。在一些实施方案中，突变株在lef基因和cya基因中的一个或者全部中包含一个或者更多突变，这些突变降低了菌株的毒性。

对于本发明中的任何微生物，使用补骨脂素对修复缺陷(例如uvr缺陷)细菌的DNA进行改变可以通过调整化合物浓度、反应条件和光照剂量进行控制。根据前面的详述，对浓度、反应条件和光照剂量对复制和蛋白质表达的影响进行估计，从而确定适当的浓度、反应条件和光剂量。使用修复缺陷突变体对于增殖提供了额外的控制，同时保持了足够的蛋白质表达，这样浓度、反应条件和光照剂量等参数可以在一个更广的条件范围内进行调整，以提供适宜的微生物群体。例如会有一个更广泛的核酸改变强度范围，在这个范围中，增殖可以被完全抑制而几乎不影响蛋白的表达。与非修复缺陷突变株相比，完全抑制修复缺陷突变株的最低改变水平要低得多(参见实施例3，7，11和21)。因此改变的水平可以高于终止增殖所需的最低水平(保证了完全的灭活)，而改变的水平仍然低于对蛋白质表达有损害的水平。这样，尽管本发明对于非修复缺陷菌株已经是有效的，但是uvr缺陷菌株在制备目的微生物群(这些微生物有效作为疫苗)时提供了更大的弹性。补骨脂素化合物在10pM到10mM的浓度内是有效的，还有在大约100pM-1mM，还有在大约1nM到10μM，还有在大约1-500nM，还有在大约1-200nM或者大约1-100nM，UVA紫外线的剂量范围从大约0.1-100J/cm²，还有是大约0.1-20J/cm²，还有是大约0.5-10J/cm²，或大约0.5-6J/cm²，或者是大约2-6J/cm²。在一个实施方案中，在下列浓度的补骨脂素的生长培养基存在时处理微生物：大约10pM-10mM，还大约1-5000nM，还大约1-500nM，还大约5-500nM或大约10-400nM。在一个实施方案中，在生长培养基存在时处理微生物，使其在补骨脂素存在时生长到OD 0.5-1，补骨脂素的浓度为大约10pM-10mM，还有在大约1-5000nM，还有在大约1-500nM，还有在大约5-500nM或者大约10-400nM。在生长达到OD0.5-1以后，使用UVA紫外线辐射该微生物群，辐射剂量为大约0.1-100J/cm²，还有是大约0.1-20J/cm²，或是大约0.5-10J/cm²，0.5-6J/cm²，或者是大约2-6J/cm²。

为了在任何微生物中，特别是uvr缺陷突变细菌中，产生初级的补骨脂素交联，可以先用一剂量的补骨脂素和UVA照射形成加合物，然后再单独使用另一剂量的UVA使一些或者大部分单加合物转化为交联物。补骨脂素的光化学是：吸收了具有适当能量的光子会首先形成单加合物。再吸收另外的光子会将该单加合物转化为交联物，这时呋喃侧单加合物会正确地嵌入在DNA双螺旋中[Tessman等人，Biochemistry 24：1669-1676(1985)]。可以在所需的补骨脂素浓度下使用低剂量的UVA照射样品，未反应的补骨脂素可以通过例如洗涤、透析或者超滤细菌除去。含有补骨脂素加合物(单加合物和交联物)的细菌可以进一步使用UVA照射将一些或者大部分的单加合物转化为交联物，而不会导致在细菌中加入大量额外的加合物。这使得可以在初次照射中有控制地加入少量的补骨脂素加合物，然后使用二次照射使加合物中的绝大部分转化为交联物。这在足够低的水平上提供了微生物基因组的改变，其中形成的加合物中大部分是交联物。这对于阻断uvr缺陷突变体的复制是非常有效的。在这种实施方案中，补骨脂素化合物在10pM-10mM的浓度是有效的，还有在大约100pM-1mM，还有在大约1-500nM，还有在大约1-200nM或者大约1-100nM，UVA紫外线的剂量范围从大约0.1-10J/cm²，还有是大约0.1-2J/cm²，或大约0.5-2J/cm²。通过例如将细菌漂洗、透析或者超滤除去未反应的大部分补骨脂素后，用UVA照射细菌，照射剂量为大约0.1-100J/cm²，还有是大约0.1-20J/cm²，或大约0.5-10J/cm²，或者是大约2-6J/cm²。

疫苗组合物及体内效力

本发明的疫苗组合物包含核酸发生了改变的微生物，和/或包含由于感染了微生物而已经被抗原荷载的和/或活化的/成熟的抗原呈递细胞，所述微生物其核酸被改变以致微生物的增殖被衰减而微生物的基因表达几乎未受影响，如前面所讨论的。本发明的疫苗组合物可以用于在个体中刺激产生免疫应答。制剂可以通过多种不同的给药途径向个体施用。施用这种疫苗组合物的方法在本领域内是已知的，包括口、鼻、静脉内、皮内、腹膜内、肌肉内、淋巴内以及皮下等给药途径。疫苗组合物还可以包含本领域内已知的额外组分以增强对于疫苗的免疫应答，例如佐剂或者T细胞共刺激分子。本发明还包括包含本发明药物组合物的药物。即将接受这种疫苗治疗的个体是任何的脊椎动物，优选是哺乳动物，包括家养动物，用于体育的动物和包括人的灵长类动物。疫苗可以作为预防药物施用，这时个体接受免疫接种目的是保护个体不罹患某种疾病。尽管疫苗可以给服给任何个体，但是在一些情况下，例如癌症疫苗，接受治疗的个体可能要限于那些具有高度罹患癌症风险的个体。疫苗还可以作为治疗药物施用，这时具有某种疾病的个体接受免疫接种目的是提高个体对该疾病或者疾病相关蛋白的免疫应答。在该实施方案中，疫苗可能导致与疾病相关的物理症状的减轻。例如接种癌症疫苗可能使肿瘤的生长停止，优选为减少平均肿瘤体积，更为优选是消灭任何的肿瘤。在一个实施方案中，平均肿瘤体积减小了至少大约5％，还有大约10％，还有大约25％，还有大约50％，还有大约75％，还有大约90％，或者大约100％。类似地，接种可能导致肿瘤转移的停止，优选为肿瘤转移数量的下降。癌症疫苗的额外作用有延长个体的平均存活时间。对于人类，平均存活时间可能延长至少大约3个月，还有至少大约6个月，或者至少大约12个月。

疫苗的配制在本领域内是已知的，它包含多种添加剂，例如防腐剂、稳定剂、佐剂、抗生素和其他物质。加入防腐剂，例如柳硫汞或者2-苯氧基乙醇，减缓或者终止由于疏忽的污染导致的细菌或者真菌的生长，特别是污染在用于多次使用或给药的疫苗瓶中可能出现。加入稳定剂，例如乳糖或者谷氨酸单钠盐(MSG)，目的是使疫苗制剂在多种不同条件下保持稳定，例如温度的变化或者冻干过程。加入佐剂例如氢氧化铝或者磷酸铝，以提高疫苗引发、增加或者延长免疫应答的能力。其他的物质例如细胞因子、化学因子以及细菌核酸序列如CpG，也是可能的疫苗佐剂。加入抗生素例如新霉素和链霉素的目的是阻止可能有害菌的生长。疫苗中还可能包含悬浮液体例如无菌水或者盐水。疫苗中还可能含有生产过程中带来的少量残留物质，例如细胞或者细菌蛋白，卵(egg)蛋白(使用卵生产的蛋白)，DNA或者RNA，或者来自加工类毒素过程中的甲醛。

疫苗的效力可以在个体体内进行评价，例如在小鼠体内。小鼠模型被认为是人体效力的模型，在评价和测定本发明的疫苗时是有用的。使用小鼠模型证明了疫苗在任何个体内产生效果的能力。可以通过疫苗提供针对某种疾病的预防性或者治疗性作用的能力来评价疫苗。例如，对于感染性疾病，一群小鼠可以用所需量的本发明中的适当疫苗进行接种，其中的微生物表达传染性疾病相关的抗原。抗原可以来自传输微生物自身或者是异源抗原。接下来用与疫苗抗原相关的感染性病原感染小鼠，评价疫苗对感染的抵御。可以参照对照群体(或者未进行免疫接种，或者只接种了载体，或者接种的微生物不含有正确的抗原)观察感染性疾病的发展。

对于癌症疫苗，可以利用肿瘤细胞模型，可以在使用本发明中的含有所需肿瘤抗原的微生物对小鼠进行免疫接种之前(治疗模型)或之后(预防模型)，将表达有所需肿瘤抗原的肿瘤细胞系注射到小鼠中。使用含有肿瘤抗原的微生物进行免疫接种可以与未进行接种的、接种了载体的或者接种了表达不相关抗原的微生物的对照群体进行比较。此外，本发明疫苗的相对效力可以与微生物核酸未被改变的微生物群进行比较。在这种模型中疫苗的有效性可以用肿瘤体积作为肿瘤注射后时间的函数或者存活群体作为肿瘤注射后时间的函数进行评价(例如实施例4)。在一个实施方案中，接种了核酸被改变的微生物的小鼠的肿瘤体积比未进行接种的、接种了载体的或者接种了表达不相关抗原的微生物的小鼠的肿瘤体积低大约5％、大约10％、大约25％、大约50％、大约75％、大约90％或者大约100％。在另一个实施方案中，在向小鼠体内移植肿瘤后至少大约10天、大约17天、或者大约24天，即观察到这种肿瘤体积的差异。在一个实施方案中，接种了核酸被改变的微生物的小鼠，相对于未进行接种的、接种了载体的或者接种了表达不相关抗原的微生物的小鼠，其存活时间至少长大约2天、大约5天、大约7天或者至少大约10天。除了对本发明的疫苗产生有效的免疫应答以外，改变的微生物提供了额外的安全性，这样与相应的未改变的微生物相比，可以施用更高的剂量。在本发明的一个实施方案中，使用核酸被改变的微生物进行接种，微生物的剂量与相应的未改变的微生物的剂量相同。在另一个实施方案中，核酸被改变的微生物的接种剂量与相应的未改变的微生物相比，可以安全地提高大约2倍、大约5倍、大约10倍、大约10²倍、大约10³倍、或者至少大约10⁴倍，而对核酸改变的微生物同样观察到上面讨论的肿瘤体积的减小和平均存活时间的延长。

使用方法

本发明提供了多种不同的使用这里描述的被改变的微生物、抗原呈递细胞、疫苗和药物组合物的方法。例如，提供了使用这里描述的被改变的微生物、抗原呈递细胞、疫苗和药物组合物以诱导免疫应答和/或治疗或预防疾病的方法。还提供了使用改变的微生物和/或突变菌株制备疫苗和其他组合物的方法。

例如，一方面，本发明提供了在宿主体内诱导针对抗原的免疫应答的方法，该方法包括向宿主施用有效量的组合物，组合物包含表达抗原的自生的微生物，其中的微生物核酸被改变使微生物的增殖受到衰减。在一些实施方案中，包含微生物的组合物是疫苗。在一些实施方案中，包含微生物的组合物是专职化抗原呈递细胞。抗原对于微生物可以是异源的或者是自身的，如上面描述的。在一些实施方案中，微生物的核酸通过与核酸直接反应的核酸靶向化合物发生反应而被改变。

本发明还提供了在宿主体内诱导针对抗原的免疫应答的方法，该方法包括向宿主施用有效量的组合物，组合物包含表达抗原的单核细胞增生利斯特氏菌突变株，其中的突变株包含基因突变使其修复其核酸的能力减弱。抗原可以是利斯特氏菌的或者非利斯特氏菌的抗原。在一些实施方案中，利斯特氏菌的核酸被改变使微生物的增殖衰减(例如通过S-59/UVA处理)。

本发明还提供了在宿主体内诱导针对抗原的免疫应答的方法，该方法包括向宿主施用有效量的组合物，组合物包含表达抗原的炭疽芽孢杆菌突变株，其中的突变株包含基因突变使其修复其核酸的能力减弱。在一些实施方案中，芽孢杆菌的核酸被改变使微生物的增殖衰减(例如通过S-59/UVA处理)。

本发明还提供了预防或者治疗宿主疾病的方法，该方法包括向宿主施用有效量的组合物，组合物包含表达抗原的自生的微生物，其中的微生物核酸被改变使微生物的增殖受到衰减。在一些实施方案中，包含微生物的组合物是疫苗。在一些实施方案中，包含微生物的组合物是专职化抗原呈递细胞。

本发明还提供了预防或者治疗宿主疾病的方法，该方法包括向宿主施用有效量的组合物，组合物包含单核细胞增生利斯特氏菌突变株，其中的突变株包含基因突变使其修复其核酸的能力减弱。在一些实施方案中，利斯特氏菌的核酸被改变使微生物的增殖衰减(例如通过S-59/UVA处理)。在一些实施方案中，疾病是传染性疾病。在另一些实施方案中，疾病是癌症。

本发明还提供了预防或者治疗宿主疾病的方法，该方法包括向宿主施用有效量的组合物，组合物包含炭疽芽孢杆菌突变株，其中的突变株包含基因突变使其修复其核酸的能力减弱。在一些实施方案中，芽孢杆菌的核酸被改变使微生物的增殖衰减(例如通过S-59/UVA处理)。

本发明还提供了用于医疗用途的自生的微生物，其中微生物的核酸被改变使微生物的增殖衰减和/或微生物的DNA修复酶出现缺陷。应当理解医疗用途包括治疗性和预防性(例如用于疫苗)的医疗应用。在一些实施方案中，微生物通过和直接同核酸反应的核酸靶向化合物发生反应而被改变，使微生物的增殖衰减。在一些实施方案中，微生物是单核细胞增生利斯特氏菌或者炭疽芽孢杆菌。

在其他方面，本发明提供了专职化抗原呈递细胞用于医疗用途，其中的抗原呈递细胞包含自生的微生物，其中微生物的核酸被改变使微生物的增殖衰减和/或微生物的DNA修复酶出现缺陷。在一些实施方案中，微生物通过和直接同核酸反应的核酸靶向化合物发生反应而被改变，使微生物的增殖衰减。在一些实施方案中，微生物是单核细胞增生利斯特氏菌或者炭疽芽孢杆菌。

本发明还提供了突变的单核细胞增生利斯特氏菌菌株用于医疗用途，其中的突变单核细胞增生利斯特氏菌菌株包含基因突变，使其修复其核酸的能力减弱。

此外，本发明提供了突变的炭疽芽孢杆菌菌株用于医疗用途，其中的突变炭疽芽孢杆菌菌株包含基因突变，使其修复其核酸的能力减弱。

本发明还提供了自生的微生物用于药物的生产的用途，药物针对的是与该自生的微生物无关的和/或并非该自生的微生物导致的疾病，其中的微生物核酸被改变使微生物的增殖受到衰减。在一些实施方案中，疾病是癌症。在一些实施方案中，疾病是与自生的微生物无关的传染性疾病。

本发明还提供了自生的微生物用于药物的生产的用途，药物针对的是与该微生物无关的和/或并非该微生物导致的疾病，其中的微生物至少一个DNA修复酶具有缺陷。在一些实施方案中，疾病是癌症。在一些实施方案中，疾病是与微生物无关的传染性疾病。

此外，本发明还提供了专职化抗原呈递细胞用于药物的生产的用途，药物针对的是与自生的微生物无关的和/或并非该自生的微生物导致的疾病，其中的抗原呈递细胞包含自生的微生物，其中微生物的核酸被改变使微生物的增殖衰减和/或其中的微生物至少有一个DNA修复酶具有缺陷。在一些实施方案中，疾病是癌症。在一些实施方案中，疾病是与自生的微生物无关的传染性疾病。

本发明还提供了单核细胞增生利斯特氏菌突变株用于药物的生产的用途，药物针对的是与单核细胞增生利斯特氏菌无关的和/或者并非由单核细胞增生利斯特氏菌导致的疾病，其中的单核细胞增生利斯特氏菌突变株包含基因突变使其修复其核酸的能力减弱。在一些实施方案中，疾病是癌症。在一些实施方案中，疾病是与单核细胞增生利斯特氏菌无关的传染性疾病。

另一方面，本发明提供了活化原初T细胞的方法，该方法包括使原初T细胞在适宜的条件下与专职化抗原呈递细胞接触足够的时间以活化原初T细胞，其中的抗原呈递细胞包含自生的微生物，其中微生物的核酸被改变使微生物的增殖衰减。该方法的接触步骤可以在体外或者体内进行。活化原初T细胞的适宜条件和足够的时间对于本领域内具有普通技术的人员是已知的。此外，这种条件在特异的实施例中予以举例，见下面。

还提供了使用抗原荷载专职化抗原呈递细胞的方法。该方法包括使专职化抗原呈递细胞在适宜的条件下与包含有编码抗原的核酸序列的自生微生物接触足够的时间以使专职化抗原呈递细胞(例如树突细胞)荷载，其中微生物的核酸被改变使微生物的增殖衰减和/或其中微生物至少有一个DNA修复酶具有缺陷。该方法的接触步骤可以在体外、离体或者体内进行。抗原对于微生物可以是异源的或者是自体抗原。荷载抗原呈递细胞的适宜条件和足够的时间对于本领域内具有普通技术的人员一般是已知的。此外，这种条件在特异的实施例中予以举例，见下面。

另一方面，本发明提供了使专职化抗原呈递细胞活化和/或成熟的方法，该方法包括使专职化抗原呈递细胞(体外、离体或者体内)在适宜的条件下与包含有编码抗原的核酸序列的自生微生物接触足够的时间以使专职化抗原呈递细胞活化和/或成熟，其中微生物的核酸经过改变，这样微生物的增殖被衰减。该方法的接触步骤可以在体外或者体内进行。抗原对于微生物可以是异源的或者是自体抗原。使抗原呈递细胞活化和/或成熟的适宜条件和足够的时间对于本领域内具有普通技术的人员一般已知的。此外，在特异的实施例中提供了这种条件的实例，见下面。

另一方面，本发明提供了在宿主中预防或者治疗疾病的方法，该方法包括以下步骤：(a)使专职化抗原呈递细胞与包含有编码抗原的核酸序列的自生微生物接触使其荷载抗原，其中微生物的核酸经过改变，这样微生物的增殖被衰减；以及(b)向宿主施用有效量的包含荷载的专职化抗原呈递细胞的组合物。

另一方面，本发明提供了在宿主中诱导针对抗原的免疫应答的方法，包括以下步骤：(a)使抗原呈递细胞与自生的微生物接触而荷载抗原，该微生物包含编码抗原的核酸序列，其中的微生物核酸被改变这样微生物的增殖被衰减；以及(b)向宿主施用有效量的包含荷载的专职化抗原呈递细胞的组合物。

试剂盒

本发明还提供了试剂盒(或者生产的物质)，试剂盒包含本发明的改变的微生物以及突变菌株。

一方面，本发明提供了试剂盒，其包含(a)组合物，它包含突变的单核细胞增生利斯特氏菌菌株，该菌株包含基因突变使其修复其核酸的能力减弱；突变的炭疽芽孢杆菌菌株，该菌株包含基因突变使其修复其核酸的能力减弱；或者自生的微生物，其中的微生物核酸被改变这样微生物的增殖被衰减；以及(b)使用本发明的组合物预防或者治疗宿主中疾病的用法说明。在一些实施方案中，说明标注在标签上。在其他实施方案中，说明在试剂盒内包含的插页中。

在另一个方面，本发明提供了试剂盒，包含(a)组合物，它包含突变的单核细胞增生利斯特氏菌菌株，该菌株包含基因突变，使其修复其核酸的能力减弱；突变的炭疽芽孢杆菌菌株，该菌株包含基因突变使其修复其核酸的能力减弱；或者自生的微生物，其中的微生物核酸被改变这样微生物的增殖被衰减；以及(b)将组合物施用给宿主的说明书。在一些实施方案中，说明标注在标签上。在其他实施方案中，说明在试剂盒内包含的插页中。

在另一个方面，本发明提供了试剂盒，包含(a)组合物，它包含突变的单核细胞增生利斯特氏菌菌株，该菌株包含基因突变使其修复其核酸的能力减弱；突变的炭疽芽孢杆菌菌株，该菌株包含基因突变使其修复其核酸的能力减弱；或者自生的微生物，其中的微生物核酸被改变这样微生物的增殖被衰减；以及(b)选择欲施用组合物的宿主的说明书。在一些实施方案中，说明标注在标签上。在其他实施方案中，说明在试剂盒内包含的插页中。

在前面提到的每个方面的一些实施方案中，组合物是疫苗。在前面提到的每个方面的一些实施方案中，组合物是专职化抗原呈递细胞。在前面提到的每个方面的一些实施方案中，自生的微生物的核酸通过和直接与核酸反应的核酸靶向化合物发生反应而被改变。在一些实施方案中，微生物经过S-59/UVA处理。在一些实施方案中，微生物的DNA修复酶有缺陷。

本发明的其他实施方案

在一个实施方案中，本发明包括疫苗组合物，该组合物包含自生的微生物，其中的微生物核酸经过改变使微生的增殖受到衰减，和/或包含抗原呈递细胞，抗原呈递细胞通过被自生的微生物感染而被抗原荷载和/或活化或成熟，该微生物核酸被改变使微生物的增殖衰减，其中微生物的基因表达基本上未受影响。在一个实施方案中，微生物的基因表达基本上未受影响，这样微生物表达的抗原水平足以使施用该微生物给个体之后诱导出免疫应答。在一个实施方案中，微生物群的增殖衰减了至少大约0.3log，至少大约1log，大约2log，大约3log，大约4log，大约6log，或者至少大约8log。在另一个实施方案中，微生物群的增殖衰减大约从0.3到＞10log、大约从2到＞10log、大约从4到＞10log、大约从6到＞10log、大约0.3-8log、大约0.3-6log、大约0.3-5log、大约1-5log或者大约2-5log。在一个实施方案中，由微生物表达的抗原至少为微生物核酸未被改变的微生物表达的抗原量的大约10％、大约25％、大约50％、大约75％或者至少大约90％。在一个实施方案中，表达的抗原是来自微生物自身的抗原。在一个实施方案中，微生物包含编码抗原的异源核酸序列。在一个实施方案中，抗原是与疾病有关的抗原。在一个实施方案中，抗原与选自下列的疾病有关：传染性疾病、自身免疫疾病、过敏、癌症以及其他细胞增生型疾病。在一个实施方案中，抗原是肿瘤相关的抗原。在一个实施方案中，肿瘤抗原选自由以下抗原组成的组：分化抗原、组织特异抗原、发育抗原、肿瘤相关病毒抗原、癌-睾丸抗原、胚胎抗原、癌蛋白抗原、过量表达蛋白抗原以及突变蛋白抗原。在一个实施方案中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：间皮素、Sp17，gp100，PR3，PAGE-4，TARP，WT-1，NY-ESO-1以及SPAS-1。在一个实施方案中，微生物核酸通过选自以下的方法改变：暴露微生物于辐射中以及使微生物与引起微生物核酸改变的核酸靶向化合物发生反应。在一个优选的实施方案中，微生物的核酸通过和直接与核酸反应的核酸靶向化合物发生反应而被改变。在一个实施方案中，核酸靶向化合物通过选自以下的方式靶向核酸：嵌入、小沟结合、大沟结合、静电结合以及序列特异结合。在一个实施方案中，核酸靶向化合物包含核酸烷化剂。在一个优选的实施方案中，核酸靶向化合物是β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯。在一个实施方案中，与核酸直接发生反应的核酸靶向化合物在辐射，优选为UVA辐射，活化的情况下发生反应。在一个实施方案中，由UVA辐射活化的核酸靶向化合物是补骨脂素。在一个优选的实施方案中，补骨脂素是4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素。在一个实施方案中，核酸靶向化合物间接地导致核酸的改变。在一个实施方案中，核酸靶向化合物在辐射，优选为UVA辐射，活化的情况下间接地导致改变。在一个实施方案中，微生物包含基因突变。在一个实施方案中，基因突变导致微生物修复其经过改变的微生物核酸能力的衰减。在一个实施方案中，基因突变出现的基因选自以下基因组成的组：phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA或者是它们的功能等价基因(取决于微生物的种属)。在一个实施方案中，突变出现在选自下列基因的一个或多个中：phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA残基功能等价基因。在一个实施方案中，基因突变导致DNA修复酶活性的衰减，该DNA修复酶选自由以下酶组成的组：PhrB，UvrA，UvrB，UvrC，UvrD和RecA。在另一个实施方案中，含有这些突变的微生物通过与被UVA辐射活化的补骨脂素发生反应而被改变。在一个优选的实施方案中，补骨脂素是4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素。在一个实施方案中，微生物选自由细菌、原生动物和真菌组成的组。在一个实施方案中，微生物是细菌。在一个实施方案中，微生物是细胞内细菌。在一个优选的实施方案中，细胞内细菌是利斯特氏菌，优选为单核细胞增生利斯特氏菌。在一个实施方案中，利斯特氏菌包含突变，导致利斯特氏菌侵入非吞噬细胞能力的减弱，而对吞噬细胞摄取利斯特氏菌没有显著影响。在一个实施方案中，利斯特氏菌的突变位于内化素基因内。在一个实施方案中，利斯特氏菌的突变出现的基因选自由以下基因组成的组：inlA，inlB，以及任何编码内化素的基因。在一个实施方案中，单核细胞增生利斯特氏菌在inlA和inlB两个基因上都包含突变。在一个实施方案中，利斯特氏菌包含的突变使其逃脱受感染细胞吞噬溶酶体的能力减弱。在一个实施方案中，利斯特氏菌的突变位于hly基因。在一个实施方案中，利斯特氏菌包含使利斯特氏菌肌动蛋白的聚合减弱的突变。在一个优选的实施方案中，利斯特氏菌的突变位于actA基因。在一个实施方案中，利斯特氏菌的突变位于actA基因和一个或者多个的内化素基因中。在一个优选的实施方案中，利斯特氏菌包含在actA和inlB基因中的突变，优选地，利斯特氏菌包含actA/inlB缺失突变。在一个优选的实施方案中，单核细胞增生利斯特氏菌actA/inlB缺失突变体还包含uvrAB基因上的缺失突变。

在一个实施方案中，本发明包括疫苗组合物，该组合物包含细菌，其中细菌的核酸经过改变使细菌的增殖受到衰减，其中细菌基因表达基本未受影响。在一个实施方案中，细菌的基因表达基本上未受影响，这样表达的抗原水平足以使个体在接受细菌之后刺激对该细菌的免疫应答。在一个实施方案中，细菌增殖衰减至少大约0.3log，还有至少大约1log，大约2log，大约3log，大约4log，大约6log或者至少大约8log。在另一个实施方案中，微生物的增殖衰减从大约0.3到＞10log、从大约2到＞10log、从大约4到＞10log、从大约6到＞10log、大约0.3-8log、大约0.3-6log、大约0.3-5log、大约1-5log或者大约2-5log。在一个实施方案中，由细菌表达的抗原至少为细菌核酸未被改变的细菌表达的抗原量的大约10％、大约25％、大约50％、大约75％或者至少大约90％。在一个实施方案中，细菌核酸通过选自以下的方法改变：暴露细菌于辐射中以及使细菌与引起细菌核酸改变的核酸靶向化合物发生反应。在一个优选的实施方案中，细菌的核酸通过和直接与核酸反应的核酸靶向化合物发生反应而被改变。在一个实施方案中，核酸靶向化合物通过选自以下方式靶向核酸：嵌入、小沟结合、大沟结合、静电引力结合以及序列特异结合。在一个实施方案中，核酸靶向化合物包含核酸烷化剂。在一个优选的实施方案中，核酸靶向化合物是β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯。在一个实施方案中，与核酸直接发生反应的核酸定位化合物在辐射，优选为UVA辐射，活化的情况下发生反应。在一个实施方案中，由UVA辐射活化的核酸靶向化合物是补骨脂素。在一个优选的实施方案中，补骨脂素是4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素。在一个实施方案中，核酸靶向化合物间接地导致核酸的改变。在一个实施方案中，核酸靶向化合物在辐射，优选为UVA辐射，活化的情况下间接地导致核酸的改变。在一个实施方案中，细菌包含基因突变。在一个实施方案中，基因突变导致细菌修复其经过改变的细菌核酸能力的衰减。在一个实施方案中，基因突变位于选自以下的基因：phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA或者是它们的功能等价基因(取决于微生物的种属)。在一个实施方案中，基因突变出现在一个或者多个选自以下组的基因中：phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA或者是它们的功能等价基因。在一个实施方案中，遗传突变导致DNA修复酶活性的衰减，该DNA修复酶选自以下酶组成的组：PhrB，UvrA，UvrB，UvrC，UvrD和RecA。在一个优选的实施方案中，含有这些突变的细菌通过与被UVA辐射活化的补骨脂素发生反应而被改变。在一个优选的实施方案中，补骨脂素是4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素。在一个实施方案中，细菌选自由革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、细胞内细菌和分支杆菌组成的组。在一个实施方案中，细菌选自以下细菌组成的组：炭疽芽孢杆菌，霍乱弧菌(Cholera)，百日咳博德特氏菌，白喉棒状杆菌，大肠杆菌，布氏疏螺旋体(Lyme)，肺炎链球菌，沙门氏菌，葡萄球菌属，结核分支杆菌，牛布鲁氏菌，山羊布鲁氏菌，流感嗜血杆菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，鼠疫耶尔森氏菌，志贺氏菌属，土拉热弗朗西丝氏菌和酿脓链球菌。在一个实施方案中，细菌是分支杆菌。在一个实施方案中，分支杆菌是结核分支杆菌。在一个实施方案中，结核分支杆菌包含uvrAB缺失突变。在一个实施方案中，结核分支杆菌包含recA条件突变。在一个实施方案中，细菌是细胞内细菌。在一个实施方案中，细胞内细菌是炭疽芽孢杆菌。在一个实施方案中，炭疽芽孢杆菌包含uvrAB缺失突变。在一个实施方案中，炭疽芽孢杆菌包含recA条件突变。一个实施方案中，细胞内细菌是鼠疫耶尔森氏菌。在一个实施方案中，鼠疫耶尔森氏杆菌包含uvrAB缺失突变。在一个实施方案中，鼠疫耶尔森氏菌包含recA条件突变。

本发明包括包含以上组合物的药物和使用以上组合物(例如个体疫苗)的方法。在一个实施方案中，本发明包括使用本发明疫苗的方法，该方法包括向个体施用疫苗。在一个实施方案中，免疫接种通过施用疫苗进行，施用的途径选自以下途径组成的组：口、鼻、静脉内、皮内、腹膜内、肌肉内、淋巴内以及皮下等给药途径。在一个实施方案中，疫苗使用预防性方案施用，个体没有出现疫苗所针对的疾病的征兆。在一个实施方案中，疫苗使用治疗性方案施用，个体出现疫苗所针对的疾病的症状。在一个实施方案中，疫苗包含了针对癌症的肿瘤抗原，且治疗性免疫接种使癌症的症状减轻。在一个实施方案中，接种的个体的平均肿瘤体积减少了至少大约5％，还有是大约10％，还有是大约25％，还有是大约50％，还有是大约75％，还有是大约90％，或者大约100％。在一个实施方案中，使用预防性的或者治疗性的方案向小鼠施用疫苗，其中的小鼠是模型系统，可以将肿瘤细胞移植到小鼠以在其中形成肿瘤，其中的疫苗含有至少一种移植肿瘤的抗原。在向小鼠施用疫苗之后(预防性方案)或者之前(治疗性方案)向小鼠中植入肿瘤。在一个实施方案中，使用预防性或者治疗性方案进行免疫接种的小鼠中的平均肿瘤体积，小于未进行接种的、接种了表达无关抗原的相似疫苗载体的相似小鼠(对照小鼠)体内的肿瘤体积。在一个实施方案中，在进行免疫接种的小鼠中的平均肿瘤体积，与对照小鼠中的平均肿瘤体积相比，减少了至少大约5％，大约10％，大约25％，大约50％，大约75％，大约90％，或者大约100％。在一个实施方案中，使用预防性或者治疗性方案进行接种的小鼠的平均存活时间比对照小鼠长至少大约2天，大约5天，大约7天或者至少大约10天。

在一个实施方案中，本发明包括了制备疫苗组合物的方法，该方法包括处理微生物群使微生物的核酸被改变，这样微生物群的增殖被衰减，其中的微生物基因表达基本上未受影响。在另一个实施方案中，本发明包括了制备疫苗组合物的方法，该方法包括处理微生物群使微生物的核酸被改变，这样微生物群的增殖被衰减，其中的微生物基因表达基本上未受影响，然后使用该微生物群用抗原荷载抗原呈递细胞，并且诱导抗原呈递细胞的活化/成熟。在一个实施方案中，使用辐射处理微生物群。在一个实施方案中，通过与间接引起核酸改变的核酸靶向化合物发生反应，对微生物群进行处理。在另一个实施方案中，核酸靶向化合物通过辐射被活化，其中化合物的活化导致核酸的间接改变。在另一个实施方案中，核酸靶向化合物的活化产生了改变核酸的活性氧。在一个实施方案中，通过和能与核酸直接发生反应的核酸靶向化合物发生反应，对微生物群进行处理。在一个实施方案中，核酸靶向化合物的反应浓度是大约10pM-10mM，还有是大约100pM-1mM，还有是大约1-500nM，还有是大约1-200nM或者是大约1-100nM。在一个实施方案中，核酸靶向化合物是烷化剂。在一个实施方案中，烷化剂选自由以下各项组成的组：芥子、芥子中间产物、芥子等价物。在一个实施方案中，核酸靶向化合物包含核酸靶向基团，该基团选自以下各项组成的组：嵌入剂、小沟结合物、大沟结合物、静电结合物以及序列特异结合物。在一个实施方案中，核酸靶向化合物在其被活化后与核酸直接发生反应。在一个实施方案中，化合物被辐射活化。在一个实施方案中，辐射是UVA辐射。在一个优选的实施方案中，核酸靶向化合物是被UVA辐射活化的补骨脂素化合物。在一个实施方案中，补骨脂素化合物的浓度是大约10pM-10mM，还有是大约100pM-1mM，还有是大约1-500nM，还有是大约1-200nM或者1-100nM；UVA辐射的剂量是大约0.1-100J/cm²，还有是大约0.1-20J/cm²，还有是大约0.5-5J/cm²，还有是大约2-4J/cm²。在一个实施方案中，微生物增殖衰减至少大约0.3log，还有至少大约1log，大约2log，大约3log，大约4log，大约6log或者至少大约8log。在另一个实施方案中，微生物的增殖衰减从大约0.3到＞10log、从大约2到＞10log、从大约4到＞10log、从大约6到＞10log、大约0.3-8log、大约0.3-6log、大约0.3-5log、大约1-5log或者大约2-5log。在一个实施方案中，由该微生物群表达的抗原至少为微生物群未被处理使核酸发生改变时抗原量表达的大约10％、大约25％、大约50％、大约75％或者至少大约90％。在一个实施方案中，表达的抗原是来自微生物自身的抗原。在一个实施方案中，微生物是结核分支杆菌且抗原来自结核分支杆菌。在一个实施方案中，微生物是炭疽芽孢杆菌且抗原来自炭疽芽孢杆菌。在一个实施方案中，微生物包含编码抗原的异源核酸序列。在一个实施方案中，抗原是与疾病有关的抗原。在一个实施方案中，抗原与选自以下的疾病有关：传染性疾病、自身免疫疾病、过敏、癌症以及其他细胞增生型疾病。在一个实施方案中，抗原是肿瘤相关的抗原。在一个实施方案中，肿瘤抗原选自由以下抗原组成的组：分化抗原、组织特异抗原、发育抗原、肿瘤相关病毒抗原、癌-睾丸抗原、胚胎抗原、癌蛋白抗原、过量表达蛋白抗原以及突变蛋白抗原。在一个实施方案中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：间皮素、Sp17，gp100，PR3，PAGE-4，TARP，WT-1，NY-ESO-1以及SPAS-1。在一个实施方案中，微生物包含基因突变。在一个实施方案中，基因突变导致微生物修复其经过改变的微生物核酸能力的衰减。在一个实施方案中，基因突变出现在选自以下基因组成的组的基因中：phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA或者是它们的功能等价基因(取决于微生物的种属)。在一个实施方案中，基因突变出现在一个或者多个选自以下组的基因中：phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA或者是它们的功能等价基因。在一个实施方案中，基因突变导致DNA修复酶活性的衰减，该DNA修复酶选自以下酶组成的组：PhrB，UvrA，UvrB，UvrC，UvrD和RecA。在另一个实施方案中，使用被UVA辐射活化的补骨脂素处理具有这些突变的微生物。在一个实施方案中，微生物选自由细菌、原生动物和真菌组成的组。在一个实施方案中，微生物是细菌。在一个实施方案中，微生物是细胞内细菌。在一个优选实施方案中，细菌是利斯特氏菌，优选为单核细胞增生利斯特氏菌。在一个实施方案中，利斯特氏菌包含突变，导致利斯特氏菌侵入非吞噬细胞能力的减弱，而对吞噬细胞摄取利斯特氏菌没有显著影响。在一个实施方案中，利斯特氏菌的突变位于内化素基因内。在一个实施方案中，利斯特氏菌的突变出现的基因选自由以下基因组成的组：inlA，inlB，以及任何编码内化素的基因。在一个实施方案中，单核细胞增生利斯特氏菌在inlA和inlB两个基因上都包含突变。在一个实施方案中，利斯特氏菌包含突变使其逃脱受感染细胞吞噬溶酶体的能力减弱。在一个实施方案中，利斯特氏菌的突变位于hly基因。在一个实施方案中，利斯特氏菌包含的突变使利斯特氏菌肌动蛋白的聚合减弱。在一个优选的实施方案中，利斯特氏菌突变位于内化素基因中。在一个实施方案中，利斯特氏菌在actA基因和一种或多种内化素基因中包含突变。在一个优选的实施方案中，利斯特氏菌在actA和inlB两个基因中都有突变，优选地，利斯特氏菌包含actA/inlB缺失突变。在一个优选的实施方案中，单核细胞增生利斯特氏菌actA/inlB缺失突变体还包含uvrAB基因上的缺失突变。

实施例

实施例1

补骨脂素处理利斯特氏菌株提供了增殖衰减同时保持了OVA抗原的表达

许多经过改变表达卵清蛋白(异源的鸡OVA抗原)的单核细胞增生利斯特氏菌菌株，与4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素(S-59，由固体(Ash-Stevens，Riverview，MI)制备的3mM溶液(Ben Venue，Cleveland，OH)，(参见美国专利5,399,719)和UVA(320-400nm)反应。检测产生的利斯特氏菌，估计可生存的利斯特氏菌的对数滴度降低以及OVA抗原在利斯特氏菌中的表达。利斯特氏菌株由University of California，Berkeley的Dan Portnoy博士提供，其被改变以含有OVA抗原，如实施例8中讨论的。这些菌株是DP-L4056(野生型)，DP-L4029(10403S ΔactA，在ActA基因中的噬菌体去除缺失突变，参见Skoble等人，Journal of CellBiology，150：527-537(2000)以及Lauer等人，Journal ofBacteriology 184(15)：4177-4186(2002))，DP-L4364(10403SΔlplA，磷酯酶A基因的缺失突变)以及DP-L4017(10403S hly_L461T，溶血素基因中的点突变，参见Glomski等，Journal of Cell Biology156(6)：1029-1038，(2002)).菌株在37℃、300rpm下在BHI培养基(Brain Heart Infusion，Fisher Scientific)上生长至浓度为大约1×10⁹CFU/mL(600nm吸光度为0.5)。每个菌株取两份1.0毫升分别转移到15毫升的试管中。每个管在4℃2300g离心20分钟。去掉上清，在两管中分别加入含有和不含S-59的含有1％BSA的5毫升PBS(磷酸盐缓冲液，Hyclone)(1×10⁸CFU/mL)。加入的S-59的浓度为100nM。将样品置于6孔培养板上，用UVA辐射，辐射剂量为2J/cm²(FXl019辐射装置，Baxter Fenwal，Round Lake，IL)。然后将每一个样品转移到一个15毫升的管内，按上述离心，去掉上清。用5毫升PBS漂洗，离心去掉上清，将最终的菌体沉淀用0.5毫升PBS重悬。从每个样品中取100微升通过连续稀释测量其细菌滴度。每个稀释度涂布于一块LB(Luria-Bertani，Q-Biogene，Carlsbad，CA)平板上，37℃孵育过夜，计数菌落以测定细菌滴度。

使用小鼠DC 2.4细胞系(来自Dana Farber Cancer Institute的树突细胞系，参见Shen等人，J Immunol 158(6)：2723-30(1997))和B3Z T细胞杂交瘤(从University of California，Berkeley的Shastri博士处获得)对细菌样品的抗原呈递进行测定。B3Z是lacZ可诱导的CD8+T细胞杂交瘤，它在MHC I类分子的背景下识别OVA抗原以后会表达β-半乳糖苷酶基因。使用CPRG(氯酚红-β-D-吡喃半乳糖糖苷(galactopyranoside)，Calbiochem，La Jolla，CA)，β-半乳糖苷酶的底物的代谢对产生的β-半乳糖苷酶水平进行测定，这一水平与DC2.4细胞呈递的OVA抗原含量直接相关。DC2.4细胞和B3ZT细胞杂交瘤在RPIM 1640培养基(RPMI，Invitrogen)中维持，加入10％FBS(胎牛血清，HyClone)。在96孔培养板的孔中加入200微升DC2.4细胞(每孔1×10⁵个DC 2.4细胞)。细菌样品进行连续稀释(50微升储液加入450微升PBS进行稀释，直至1×10⁵CFU/mL)(对于S-59处理的样品使用等价的CFU，即在S-59处理之前的菌落形成单位的数目)。每个稀释度20微升转移到含有DC2.4细胞的孔中，得到大约1×10⁴，1×10⁵，1×10⁶，1×10⁷，或者1×10⁸CFU/mL，此外，只加入20微升PBS作为阴性对照。样品在37℃下5％二氧化碳中孵育1小时。用PBS漂洗培养板3次去除细胞外的细菌。每孔中加入200微升B3Z T细胞(1×10⁵个细胞)和100微克/毫升庆大霉素(Sigma)。100nM的SL8 OVA_257-264肽(SL8OVA抗原，SIINFEKL，SEQ IDNO：1，Invitrogen，San Diego，CA)加入到含有DC2.4和B3Z细胞各1×10⁵细胞的孔中，作为阳性对照。样品在37℃下5％二氧化碳中孵育过夜。培养板在400g下离心3分钟，用250微升的PBS漂洗每一个孔。每孔中加入100微升含有100μM 2-巯基乙醇，9mM氯化镁，0.125％Igepal CA-630((八苯氧基)聚乙氧基乙醇((octaphenoxy)polyethoxyethanol)，Sigma)和0.15mM CPRG的PBS。样品在37℃下孵育至少4小时。使用读板仪在595nm下测量光吸收值，参考波长是655nm。S-59处理的和未处理的细菌滴度和抗原呈递结果(每个DC2.4细胞100个细菌细胞)在表1中给出。结果表明，在每个DC2.4细胞中加入100个细菌细胞的水平下，抗原呈递是未处理样品的55-85％。由于细菌的滴度下降了大约10⁴，这表明利斯特氏菌在增殖有明显衰减的情况下仍然保留了充分的抗原呈递。

表1使用100nM补骨脂素S-59和2J/cm² UVA紫外线处理的、表达OVA抗原的利斯特氏菌的Log衰减和抗原呈递

利斯特氏菌菌株	Log衰减	被呈递抗原的百分比*
利斯特氏菌菌株	Log衰减	被呈递抗原的百分比*	DP-L4056	4.02	74.6
DP-L4029	4.14	54.9	DP-L4056	4.02	74.6
DP-L4029	4.14	54.9	DP-L4364	4.53	84.3
DP-L4017	4.11	55.2	DP-L4364	4.53	84.3

*表达为未处理的百分比，在每个DC2.4细胞100个利斯特氏菌时测量。

使用DP-L4056野生型菌株进行相似的步骤。使用100，200，400，800或者1000nM S-59处理细菌，根据上面的详述测定剩余的滴度和抗原呈递。细菌滴度和抗原呈递结果(每个DC2.4细胞100个利斯特氏菌)在表2中给出，并在图1中作图。这一数据表明在利斯特氏菌生长受到衰减的一个广阔范围内都有显著的抗原呈递，包括增殖受到完全抑制时(即到达检测限度时)也有抗原呈递。

表2使用不同浓度补骨脂素S-59和2J/cm² UVA处理的、表达OVA抗原的利斯特氏菌株DP-L4056的Log衰减和抗原呈递。

S-59浓度(nM)	Log滴度	Log衰减	被呈递抗原的百分比*
S-59浓度(nM)	Log滴度	Log衰减	被呈递抗原的百分比*	01002004008001000	8.644.343.102.48＜1＜1	04.305.546.16＞7.64＞7.64	-75.058.930.323.65.6

实施例2

DNA靶向烷化剂处理利斯特氏菌株提供了增殖衰减而同时保持了OVA抗原的呈递

采用与实施例1中相似的步骤，只使用化合物β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯(化合物1，ChemSyn，Harrisonville，MO，参见美国专利6,093,725)。使用的利斯特氏菌株是DP-L4056和DP-L4017。化合物1(浓度为1mM，溶于酸性BBS(blood bank saline)中，即每100毫升BBS中加入135微升1.48M的磷酸)加入到5毫升1×10⁸CFU/mL的大肠杆菌中，至终浓度为0，0.5，1，2，5，和10μM。样品在室温下孵育2小时。孵育以后，根据实施例1测定细菌滴度和抗原呈递。对于抗原呈递，将利斯特氏菌株稀释到1×10²，1×10³，1×10⁴，1×10⁵，1×10⁶，或者1×10⁷CFU/mL。相对于未处理的细菌(每个DC2.4细胞1个利斯特氏菌)的log滴度、log衰减和抗原呈递的百分比作为化合物1浓度的函数，在表3中和图2A和B中给出。结果表明化合物1在例如1μM时，对于既使利斯特氏菌出现显著的增殖衰减又保留足够的抗原呈递也是有效的。

表3使用不同浓度化合物1处理的利斯特氏菌的Log衰减和抗原呈递

[化合物1]	Log衰减		被呈递抗原的百分比*
[化合物1]	Log衰减		被呈递抗原的百分比*		μM	DP-L4056	DP-L4017	DP-L4056	DP-L4017
0.512510	1.043.476.47＞7.0＞7.0	1.023.436.52＞7.0＞7.0	56.635.018.53.7未测量	70.043.025.42.0未测量	μM	DP-L4056	DP-L4017	DP-L4056	DP-L4017

*表达为未处理的百分比，在每个DC2.4细胞1个利斯特氏菌时测量。

实施例3

补骨脂素处理大肠杆菌uvrAB突变体和野生型之后增殖衰减的比较

用补骨脂素处理修复核酸损伤能力有缺陷的大肠杆菌突变株和处理野生型大肠杆菌菌株进行比较。大肠杆菌菌株AB1157(野生型)和CSR603(uvrA，recA，phr突变株，从University of North CarolinaAziz Sancar博士处获得，参见Harm，Mutation Research 60：263-270(1979))。本实施例比较了AB1157和突变株CSR603的衰减，细菌培养在3毫升添加链霉素的LB培养基中，在37℃下环形振荡器中250rpm振荡过夜。2毫升的过夜培养物加入到100毫升的LB培养基中，在30℃下在振荡器上振荡大约5小时，直至600nm光吸收达到0.90D，即大约1×10⁹CFU/mL。对于每个菌株，取大约0.5毫升的细菌储液加入到15毫升的试管中，4℃2300g离心20分钟。去掉上清，用含有0、1、10、100和1000nM补骨脂素S-59的5毫升PBS重悬沉淀。每个样品转移到6孔培养板中，根据实施例1进行辐射。根据实施例1对样品进行连续稀释，测定滴度。结果在表4和图3中给出。结果表明，对于一个给定的补骨脂素浓度，补骨脂素对uvrABC突变体的处理使细菌的增殖产生更大的衰减(即剩余的滴度降低)。

表4使用补骨脂素处理后野生型大肠杆菌与uvrABC突变株衰减的比较

[S-59]nM	细菌log滴度Log衰减
	细菌log滴度Log衰减				野生型	uvrABC突变株	野生型	uvrABC突变株
	01101001000	8.08.087.997.574.91	7.755.524.683.1＜1	-00.010.433.09	野生型	uvrABC突变株	野生型	uvrABC突变株	-2.233.074.9＞6.65

实施例4

使用经过S-59处理和未经处理的利斯特氏菌株对小鼠进行治疗性接种

为了评价经S-59处理的利斯特氏菌作为疫苗的有用性，使用C57B1/6小鼠黑色素瘤肿瘤模型。C57B1/6小鼠(Charles River，Hollister，CA)剔毛，皮下移植悬于100微升HBSS的2×10⁵个B16.Fl0.Mo520.10细胞(表达B16-OVA的黑色素瘤细胞，从University of Massuchesetts，Kenneth Rock博士处获得，参见Mandl等人，Proc Natl Acad Sci USA 95：8216(1998))。含有OVA抗原的单核细胞增生利斯特氏菌菌株DP-L4056和DP-L4017使用S-59处理或者不作处理(20nM S-59，如实施例1进行UVA辐射)。此外，没有OVA抗原的野生型菌株DP-L4056作为对照。确定S-59处理的样品的log滴度，以测定由于补骨脂素处理造成的log衰减(表6)。将利斯特氏菌重悬于HBSS(Hanks平衡盐培养基，Gibco)中，腹膜接种每组10-12只小鼠每个菌株100微升，接种3次，有一组小鼠注射HBSS载体。不同菌株的接种剂量(每次接种的总CFU数目)在表6中给出。给出的剂量对应的是未使用S-59处理的利斯特氏菌的0.1LD₅₀以及使用S-59处理的利斯特氏菌的最高可能剂量。在肿瘤移植后的第3、10和17天进行接种。观察小鼠是否出现可触摸到的肿瘤。一旦观察到有肿瘤出现，则每周测量两次肿瘤的两个相互垂直的直径。如果肿瘤的大小在任何方向达到了20mm，则处死小鼠。在图4和表5中表示了平均肿瘤体积作为B16-OVA移植后天数的函数。每组中小鼠的存活百分比在图5中绘出，平均存活在表6中给出。本实施例显示可以给小鼠安全施用经高剂量的S-59处理过的利斯特氏菌菌株，而仍产生好的抗肿瘤应答。

表5移植B16-OVA并使用鉴定出的利斯特氏菌株进行接种的小鼠在移植后不同时间时的肿瘤体积。

平均肿瘤体积(mm²)

疫苗样品	第10天	第13天	第17天	第20天	第24天
疫苗样品	第10天	第13天	第17天	第20天	第24天	HBSSDP-L4056DP-L4056-OVADP-L4056-OVA+S-59DP-L4017-OVADP-L4017-OVA+S-59	48.235.334.618.922.733.5	158.8123.631.814.626.856.7	515.1571.836.614.973.879.3	16031304101.346.2164.6146.3	24442123404.8210.4689.5464.0

表6使用和未用20nM S-59处理(2J/cm²UVA)的利斯特氏菌株的接种剂量和平均存活时间。

疫苗样品	剂量(CFU)	平均存活时间(天)	Log滴度的降低
疫苗样品	剂量(CFU)	平均存活时间(天)	Log滴度的降低	HBSSDP-L4056DP-L4056-OVADP-L4056-OVA+S-59DP-L4017-OVADP-L4017-OVA+S-59	-5×10³2×10³1×10⁸1×10⁷1×10⁸	2022.530303032	---3.76-4.27

*数值是三次制备物的平均值

实施例5

接种以后对抗原特异的免疫应答的测定

可以使用多种不同的体外和体内方法评价本发明的疫苗。用基于利斯特氏菌的疫苗对这些方法进行举例说明，但是这些方法可以用于评价本发明中基于任何微生物的疫苗的潜在效力。

一些检测涉及对抗原特异的T细胞的分析，这些细胞来自已经进行接种的小鼠的脾脏。免疫接种C57B1/6小鼠，例如通过腹膜注射0.1LD₅₀利斯特氏菌-OVA菌株，这里的利斯特氏菌可能经过处理使增殖衰减(例如S-59处理)。免疫接种7天以后，收集小鼠的脾脏细胞(通常每组3只小鼠)，方法是通过将脾脏置于冰冷的RPMI 1640培养基中，制备单细胞悬液。作为另一种可能性，可以类似地收集小鼠的淋巴结，制备成单细胞悬液，替代以下描述的检测中的脾脏细胞。通常通过静脉内和腹膜给药的疫苗用脾脏细胞进行评价，而对于肌肉内、皮下或者皮内给药的疫苗则可用脾脏细胞和淋巴结细胞进行评价。

除非特别说明，在这些实施例中使用的所有抗体都可以从Pharmingen，San Diego，CA获得。

ELISPOT检测

使用ELISPOT检测，在小鼠模型中用具有OVA抗原的利斯特氏菌株进行免疫接种以后，测定抗原特异的T细胞的定量产生频率。进行评价的抗原特异的T细胞是OVA特异的CD8+或者LLO特异的CD8+或者CD4+T细胞。该OVA抗原模型测定了对于插入到疫苗中的异源肿瘤抗原的免疫应答，肿瘤抗原可以用任何目标抗原代替。LLO抗原是利斯特氏菌特异的，可以用任何用作疫苗载体的微生物载体上的适当抗原代替。通过检测识别特异抗原的细胞因子(例如IFN-γ)的释放来测定特异的T细胞。用抗小鼠的IFN-γ单克隆抗体(mAb R4；5μg/mL)包被PVDF材质的96孔板(BD Biosciences，San Jose，CA)，4℃过夜。漂洗96孔板，在室温下用200微升的完全RPMI封闭2小时。每孔加入2×10⁵个来自接种小鼠(或者未进行接种的对照小鼠)的脾脏细胞，在37℃下，在大约0.01到10μM的不同浓度的肽的存在下孵育20到22小时。使用的肽有SL8(OVA的MHC I类表位)，LLO₁₉₀(NEKYAQAYPNVS，SEQ ID NO：2，Invitrogen)，它是利斯特氏菌溶胞素O(利斯特氏菌的抗原)的MHC II类表位，或者是LLO₂₉₆(VAYGRQVYL，SEQ ID NO：3)，它是利斯特氏菌溶胞素O的MHC I类表位。漂洗后，平板中用对IFN-γ特异的生物素化的二抗(XMG1.2)孵育，二抗用PBS稀释至0.5μg/ml。室温孵育2小时以后，漂洗96孔板，加入1nm金山羊抗生物素缀合物(GAB-1；1∶200稀释；Ted Pella，Redding，CA)37℃孵育1小时，该缀合物用含有1％BSA的PBS稀释。在彻底漂洗以后，平板与底物(Silver Enhancing Kit；每孔30微升；Ted Pella)，在室温下孵育2到10分钟，进行斑点显影。然后使用蒸馏水冲洗96孔板，终止底物的反应。平板在空气中干燥后，使用自动化的ELISPOT读板仪(CTL，Cleveland，OH)计数每孔中的斑点。对于OVA特异的T细胞或者利斯特氏菌特异的T细胞，细胞因子的应答表示为每106个脾脏细胞的IFN-γ斑点形成细胞(SFCs)的数目。

细胞内细胞因子染色检测(ICS)：

为了进一步评估抗原特异的CD8+或者CD4+T细胞的数目，将结果与ELISPOT检测得到的结果联系起来，进行ICS，通过流式细胞术分析对细胞进行评价。接种小鼠和对照组小鼠的脾脏细胞与SL8(刺激OVA特异的CD8+细胞)或者LLO₁₉₀(刺激LLO特异的CD4+细胞)，在Brefeldin A(Pharmningen)存在的情况下共同孵育5小时。Brefeldin A抑制了T细胞被刺激以后产生的细胞因子的分泌。与一种无关的MHC I类肽共同孵育的脾脏细胞用作对照。用20ng/mL PMA(佛波醇-12-豆蔻酸-13-乙酸酯，Sigma)和2μg/mL离子霉素(Sigma)刺激的脾脏细胞用作IFN-γ和TNF-α细胞内细胞因子染色的阳性对照。为了检测细胞质的细胞因子表达，用FITC-抗-CD4mAb(RM 4-5)和PerCP-抗-CD8mAb(53-6.7)对细胞进行染色，用Cytofix/CytoPerm溶液(Pharmingen)进行固定和通透化，用PE-缀合的抗-TNF-αmAb(MP6-XT22)和APC-缀合的抗-IFN-γmAb(XMG1.2)在冰上染色30分钟。细胞内表达IFN-γ和/或TNF-α的细胞的百分比由流式细胞术(FACScalibur，Becton Dickinson，Mountain View，CA)测定，使用CELLQuest软件(Becton DickinsonImmunocytometry System)进行数据分析。由于FACScalibur可以区别不同抗体上的荧光标记，通过门控那些被抗IFN-γ或者抗TNF-α之一或两者染色的CD8+和CD4+，可以鉴定出合适的细胞。该方法也可以用于测定微生物疫苗的免疫原性，其中用树突细胞群或者另一个抗原呈递细胞如巨噬细胞群与微生物载体共同孵育。得到的抗原呈递细胞注射到小鼠的脚中，根据上述检测来自淋巴结的细胞群中的T细胞。

在受到刺激的脾脏细胞中细胞因子的表达

也可以检测对照和接种的C57B1/6小鼠的脾脏细胞中细胞因子的分泌水平。使用SL8或者LLO₁₉₀刺激脾脏细胞24小时。使用无关肽HSV-gB²(Invitrogen，SSIEFARL，SEQ ID NO：4)进行刺激作为对照。收集经过刺激的细胞的上清，使用ELISA检测(eBiosciences，CO)或者细胞计数珠阵列试剂盒(Pharmingen)，确定辅助性T细胞1和辅助性T细胞2细胞因子的水平。

细胞毒T细胞活性的测定

还可以通过对OVA特异的CD8+T细胞的细胞毒活性进行测定，从而对它们进行评价，可以在体外测定或者直接在C57B1/6小鼠中进行体内测定。CD8+T细胞以抗原特异的方式识别并且裂解它们的各自的靶细胞。体外细胞毒性使用铬释放检测进行确定。使用辐射过的EG7.OVA细胞(表达OVA的转染EL-4肿瘤细胞系，ATCC，Manassas，VA)或者100nM SL8按照10∶1的比例刺激原初的和利斯特氏菌-OVA(内标)接种的小鼠的脾脏细胞，目的是使OVA特异的T细胞在脾脏细胞群中进行扩增。培养7天之后，用标准的4小时⁵¹Cr释放实验使用EG7.OVA或者SL8冲击的EL-4细胞(ATCC，Manassas，VA)作为靶细胞，EL-4细胞自身作为阴性对照，测定效应细胞的细胞毒性。YAC-1细胞系(ATCC，Manassas，VA)用作靶细胞，以确定NK细胞的活性，目的是区别由于T细胞造成的活性和由于NK细胞造成的活性。特异性细胞毒性的百分比如下计算：100×(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)。在没有效应细胞的情况下孵育靶细胞以测定自发释放。使用0.1％的Triton X-100裂解细胞确定最大释放。如果自发释放小于20％的天然释放，则认为实验有效，可以进行分析。

来自原初C57B1/6小鼠的脾脏细胞分成两等份，用于体内测定OVA特异的CD8+T细胞的细胞毒活性。每一组细胞使用特异肽冲击，或者是靶物(SL8)或者是对照(HSV-gB²)，浓度为0.5μg/ml，在37℃作用90分钟。然后用培养基漂洗细胞3次，再用PBS+0.1％BSA漂洗两次。使用温暖的PBS+0.1％BSA(10毫升或者更少)将细胞重悬至1×10⁷个/毫升，用于用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE，Molecular Probes，Eugene，OR)进行标记。在靶细胞悬液中加入1.25微升的5mM CFSE储液，用旋涡振荡混和样品。在对照细胞悬液中，加入10倍稀释的CFSE储液，用旋涡振荡混和样品。细胞在37℃孵育10分钟。加入大量(大于40毫升)冰冷的PBS终止染色。室温下用PBS漂洗细胞两次，然后重悬并计数。每种细胞悬液稀释到50×10⁶个/毫升，每种混合100微升并通过尾静脉对原初的或者已接种的小鼠进行注射。12-24小时以后，收获脾脏，使用流式细胞术分析总共5×10⁶个细胞。计数高的(靶)和低的(对照)荧光峰，二者的比例用于建立靶细胞裂解的百分比。体内细胞毒性检测可以对抗原特异T细胞的裂解活性进行检测而不需要在体外重新刺激。而且这一检测评价的是T细胞在它们天然环境中的功能。

实施例6

用ELISPOT和ICS对经过S-59处理和未经处理的利斯特氏菌DP-L4056接种小鼠后的脾脏细胞进行分析

使用S-59处理或者不处理制备具有或者没有OVA抗原的利斯特氏菌DP-L4056菌株，按照实施例4对C57B1/6小鼠进行接种(也包括HBSS对照)，区别是静脉内给药。根据表7和表8列出的剂量对原初小鼠进行接种。接种后12天收获脾脏。根据实施例5使用ICS和ELISPOT检测对脾脏进行分析。此外，还对这些利斯特氏菌的LD₅₀进行测定。对于LLO₁₉₀特异的CD4⁺T细胞和OVA特异的CD8⁺T细胞的ICS检测结果，TNF-α和IFN-γ均为阳性的细胞的百分比，在表7和图6A、B中给出。ELISOPT检测结果，每2×10⁵脾脏细胞的IFN-γSFC，在表8和图7中给出。这些结果表明，经S-59处理的具有OVA的样品，当其剂量超过没有用S-59处理的样品100倍时，刺激产生了OVA特异的应答。尽管在较低剂量时没有观察到阳性OVA特异的应答，但这仍然为安全性的提高提供了余地，因为S-59处理的样品衰减了4log。此外，S-59处理的样品其LD₅₀相对于未处理样品高10³倍，表明即使在高出100倍的剂量水平时，它的安全性仍然比未处理的利斯特氏菌高10倍。

表7使用具有或者没有OVA、使用或者未使用S-59处理的DP-L4056接种小鼠，既是TNF-α阳性又是IFN-γ阳性的小鼠脾脏细胞的百分比

疫苗样品	S-59处理	疫苗剂量	TNF-α/IFN-γ阳性的百分比
			TNF-α/IFN-γ阳性的百分比		LLO	OVA
			HBSSDP-L4056DP-L4056DP-L4056-OVADP-L4056-OVADP-L4056-OVADP-L4056-OVADP-L4056-OVA	否否是否是是是是	LLO	OVA	1×10⁵1×10⁵1×10⁵1×10⁵1×10⁶1×10⁷1×10⁸	0.001.490.631.780.020.060.190.14	0.020.010.021.790.020.080.830.50

表8使用具有或者没有OVA，使用或者未使用S-59处理的DP-L4056免疫接种小鼠，每10⁶个小鼠的脾脏细胞中的IFN-γSFC

疫苗样品	剂量	对于指定肽，每2×10⁵个脾细胞的SFC
		对于指定肽，每2×10⁵个脾细胞的SFC				对照	SL8	LLO₁₉₀	LLO₂₉₆
		HBSSDP-L4056DP-L4056+S-59DP-L4056-OVADP-L4056-OVA+S-59DP-L4056-OVA+S-59DP-L4056-OVA+S-59DP-L4056-OVA+S-59	1×10⁵1×10⁵1×10⁵1×10⁵1×10⁶1×10⁷1×10⁸	3651134410	47329287172171	对照	SL8	LLO₁₉₀	LLO₂₉₆	31761042389105997	3318731741124

实施例7

构建pKSV7-d1BsrFI uvrAB用于通过等位交换从利斯特氏菌中删除uvrAB。

不能修复由于补骨脂素和UVA处理诱导产生的DNA损伤的利斯特氏菌突变株，通过基本上删除利斯特氏菌中的紫外线抗性(uvr)AB基因(uvrAB)而获得。这些突变体已知为DNA修复突变体，或者核苷酸切除修复(NER)突变体。通过等位交换从利斯特氏菌中缺失uvrAB[Camilli等人，Molecular Microbiology 8：143-147(1993)]。作为一个uvrAB能够从任何利斯特氏菌中删除的示例，将uvrAB从表9中所示的单核细胞增生利斯特氏菌菌株中删除。

表9用于通过等位交换删除uvrAB的亲本单核细胞增生利斯特氏菌菌株

利斯特氏菌株	基因型	参考文献
利斯特氏菌株	基因型	参考文献	DP-L4056	10403S，野生型，噬菌体去除	Lauer等人，J.Bacteriol.184：4177-4186(2002)
DP-L4017	10403S，L461TLLO	Glomski等人，J.Cell Biol.156：1029-1038(2001)	DP-L4056	10403S，野生型，噬菌体去除	Lauer等人，J.Bacteriol.184：4177-4186(2002)
DP-L4017	10403S，L461TLLO	Glomski等人，J.Cell Biol.156：1029-1038(2001)	DP-L4029	10403S，ΔactA噬菌体去除	Lauer等人，J.Bacteriol.184：4177-4186(2002)；Skoble等人，J Cell Biol.150：527-38(2000)

在利斯特氏菌中和其他细菌菌株中，由UV和其他药剂造成的DNA损伤后的核苷酸切除修复(NER)所需的ABC核酸外切酶复合体中的3个蛋白，有两个由uvrA基因和uvrB基因编码。uvrA和uvrB基因组成了利斯特氏菌基因组中的同一个操纵子，这样在表9中所示的利斯特氏菌株中可以一起删除。uvrA基因在利斯特氏菌中的图上定位为2562547号核苷酸到2565461号核苷酸(SEQ ID NO：5)；uvrB基因在利斯特氏菌中的图上定位为2565469号核苷酸到2567459号核苷酸(SEQ ID NO：6)[Glaser等人，Science 294：849-852(2001)]。为了通过等位交换删除uvrAB，首先用PCR扩增出uvrAB基因，使用的正向和反向引物分别位于uvrAB上下游的大约900bps处。使用DP-L4056作为模板和PCR引物Lm-2561677F(SEQ ID NO：7)和Lm-2568330R(SEQ ID NO：8)产生利斯特氏菌的uvrAB扩增子，该扩增子长6654bp，包括了利斯特氏菌的2561677号到2568330号核苷酸(SEQ ID NO：9)。利斯特氏菌野生型菌株DP-L4056在30℃培养过夜，培养基是Brain Heart Infusion培养基(BHI，Difco)，将10微升漂洗后的细菌悬液(3毫升过夜培养物离心后，用5毫升PBS重悬菌体，再次离心，最后用1毫升PBS再次重悬利斯特氏菌菌体沉淀而制备)，加入到一个终体积为100微升的PCR反应体系中，体系中还含有0.2μM的每种引物Lm-2561677F和Lm-2568330R，2μL pf Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)以及脱氧核苷酸三磷酸，缓冲液和硫酸镁，这些物质的添加根据供应商的建议。在TAE缓冲液中进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色后在紫外光下观察，存在6654bp的单一条带，证实了PCR反应成功进行。使用GeneClean(Qbiogene，Carlsbad，CA)从PCR反应体系中纯化出扩增子产物，纯化后的终体积为50微升。接下来将扩增子插入到pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，在连接混合物中使用5微升纯化的uvrAB扩增子。限制性内切酶购自New England Biolabs(Beverly，MA)。通过使用BsrFI(NewEngland Biolabs)酶切，进行1％的琼脂糖/TAE电泳，产生4612，1388，1094，181，886和2424bp的片段而鉴定正确构建的pCR2.1-TOPO-uvrAB质粒。

接下来使用质粒pCR2.1-TOPO-uvrAB产生用于等位交换的质粒，其中uvrAB基因的2562709位到2567320位核苷酸(4612bp)被删除。所有的用于重组质粒构建的限制性酶和T4连接酶购自NewEngland Biolabs。为了完成uvrAB序列的删除，使用HindIII，BsrFI和BglII对一份pCR-TOPO/uvrAB质粒(大约2微克)进行消化，得到的1092bp的片段用1％琼脂糖/TAE凝胶电泳和GeneClean进行纯化。同时另外一份(大约2微克)用XhoI，BsrFI和BglII消化，得到的1050bp的片段用1％琼脂糖/TAE凝胶电泳和GeneClean进行纯化。上述1092bp和1050bp两个片段含有相容的BsrFI末端，将其连接在一起，得到的2142bp的产物用GeneClean进行纯化。2142bp连接产物的一部分使用PstI酶切，得到的1486bp片段用1％琼脂糖/TAE凝胶电泳和GeneClean进行纯化。2142bp连接产物的另一部分使用KnpI和PstI酶切，得到的622bp的片段用1％琼脂糖/TAE凝胶电泳和GeneClean进行纯化。用于等位交换的亲本质粒载体，pKSV7[Camilli等人，Molecular Microbiology 8：143-147(1993)]使用KpnI和PstI消化，然后用小牛肠碱性磷酸酯酶(CIAP，New England Biolabs)处理，然后将具有KpnI和PstI相容末端的622bp的片段插入pKSV7质粒载体中，得到pKSV7-K/P-338。接下来，将具有PstI相容末端的1486bp的片段插入到用PstI消化和CIAP处理的pKSV7-K/P-338载体构建体中。使用KpnI和HindIII消化后产生大小为1253bp、865bp和6.9kb片段，证明1486bp片段以正确方向插入。产生的质粒构建体被称为pKSV7-dlBsrFI uvrAB。对该pKSV7重组质粒中的利斯特氏菌的dlBsrFI uvrAB部分进行测序，以证实利斯特氏菌序列的保真性以及uvrAB基因中2562709位到2567320位核苷酸的被精确删除(从uvr对应的2562547位到2567459位核苷酸中删除)。删除的区域是SEQ ID NO：10，剩余的扩增子序列在SEQ ID NO：11中给出。

使用pKSV7-dlBsrFI uvrAB质粒的等位交换，删除利斯特氏菌菌株DP-L4056，DP-L4017和DP-L4029(表9)中的uvrAB基因，如以前所描述的[Camilli等人，Molecular Microbiology 8：143-147(1993)]。质粒pKSV7-dlBsrFI uvrAB通过电穿孔引入到利斯特氏菌菌株DP-L4056，DP-L4017和DP-L4029中。用于电穿孔的感受态利斯特氏菌株制备如下：首先在BHI中生长分离细菌菌落的10毫升的过夜培养物，37℃振荡。然后将2毫升的过夜培养物接种到250毫升的摇瓶中的100毫升的0.5M蔗糖/BHI(过滤除菌)培养基中，得到每个菌株的对数期培养物。培养物在37℃振荡2-3小时直至细菌的密度OD₆₀₀达到0.2，到达对数中期生长阶段。接下来，处理培养物，产生没有肽聚糖细胞壁的细菌，称为原生质球。在对数生长中期的培养物中加入100微升的青霉素G储液(10mg/mL，过滤除菌)，在37℃振荡2小时。原生质球培养物在100毫升的离心瓶中沉淀，用45毫升冰冷的HEPES/蔗糖储液(1mM HEPES，pH 7.0/0.5M蔗糖，过滤除菌)重悬，然后再次离心沉淀。细菌沉淀用20毫升的HEPES/蔗糖溶液重悬，转移到40毫升的离心管中，沉淀，用10毫升HEPES/蔗糖溶液重悬。在细菌悬液中加入100微升的10mg/mL溶菌酶储液，充分混和，培养物在37℃孵育15分钟，不振荡，每隔5分钟轻轻颠倒混和。然后在5000rpm(3000xg)离心溶菌酶处理的培养物，4℃10分钟，然后重悬于10毫升HEPES/蔗糖溶液，重复该过程两次，每次仔细并完全地重悬。最后一步用500微升HEPES/蔗糖溶液重悬菌体，得到电感受态的利斯特氏菌。

2微克的pKSV7-dlBsrFI uvrAB质粒DNA加入到10微升的DP-L4056，DP-L4017和DP-L4029电感受态利斯特氏菌中，将溶液加入到0.1厘米的电转化小杯中进行电穿孔。将电转化小杯置于电穿孔装置中，设置参数为1kV，400欧姆，25μFD，然后脉冲。这通常导致时间常数为5毫秒。立刻将细胞加入到1毫升预先温热到30℃的BHI/蔗糖培养基中，然后30℃孵育1小时，不振荡。孵育之后，沉淀细菌，用200mlBHI培养基重悬，将悬液涂布于含有10μg/ml氯霉素(BHI/CM10)的BHI琼脂平板上。然后将平板在30℃孵育过夜，之后即可见对应于pKSV7-dlBsrFI uvrAB质粒的转化子菌落。由于pKSV7质粒含有温度敏感的利斯特氏菌复制子，所以平板必须在30℃孵育，才能看到氯霉素抗性菌落。

用包含在uvrAB中4612bp缺失的pKSV7-dlBsrFI uvrAB质粒进行电穿孔转化的利斯特氏菌菌株DP-L4056，DP-L4017和DP-L4029中天然的uvrAB基因的等位交换分两步完成：首先是质粒整合，然后是质粒切除(包括天然的uvrAB)以及去除(curing)，这在以前有所描述[Camilli等人，Molecular Microbiology 8：143-147(1993)]。选择来自使用pKSV7-dlBsrFI uvrAB质粒DNA电穿孔的利斯特氏菌菌株DP-L4056，DP-L4017和DP-L4029的每一种中的两个分离的氯霉素抗性菌落，将它们分别划线在新鲜的BHI/CM10平板上，在30℃孵育过夜。第二天，从每块平板上挑选菌落，接种于250毫升摇瓶中的10毫升BHI/CM10培养基中，然后在30℃振荡下孵育过夜。然后使用10微升每种过夜培养物接种10毫升新鲜BHI/CM10培养基(1∶1000稀释)，然后在41℃振荡培养直至培养物达到稳定生长期。每种培养物取10微升后，使用剩余的利斯特氏菌过夜培养物制备质粒，保证pKSV7-dlBsrFI uvrAB质粒DNA的存在。10微升的稳定生长期培养物接种预热到41℃的10毫升新鲜BHI/CM10培养基中，然后在41℃振荡孵育过夜。然后从每一个41℃过夜培养物种取样，划线在预热到41℃的BHI/CM10平板上，以产生独立的菌落。由于pKSV7质粒含有温度敏感的利斯特氏菌复制子，所以在41℃孵育选出的菌落是由于pKSV7-dlBsrFI uvrAB质粒与利斯特氏菌基因组的天然uvrAB基因的同源重组整合，这样氯霉素抗性标记在细菌细胞的生长和分裂中扩增和表达而产生。这时利斯特氏菌株对于uvrAB基因是部分二倍体，由天然的uvrAB基因和4612bp删除的uvrAB基因组成，由于pKSV7-dlBsrFI uvrAB质粒通过同源重组整合产生。

对于用pKSV7质粒切除和除去(curing)天然的uvrAB基因，从上述步骤中每一个41℃培养的BHI/CM10平板上选择单菌落，接种不含氯霉素的10毫升BHI培养基，在30℃振荡培养过夜。然后在10毫升不含氯霉素的新鲜BHI培养基中1∶1000稀释培养物。然后再次在30℃培养过夜，振荡6小时。此步骤重复两次。由于部分二倍体中间体菌株在没有药物选择压力的条件下传代多次，培养温度是pKSV7质粒复制子的允许温度，则出现整合的pKSV7质粒自发切除，最终从先前细菌中除去质粒[Camilli等人，Molecular Microbiology 8：143-147(1993)]。在第三次1∶1000稀释和6小时孵育阶段之后，从每个培养物中取样，划线于BHI平板上(没有氯霉素)用于产生独立的菌落，然后在37℃孵育过夜。用牙签从每个BHI平板上选取100个独立的菌落，每个菌落先后在BHI/CM10平板和BHI平板上划5毫米长的线。用格子标记平板，使每对相配的BHI/CM10和BHI平板是相同的复制品。BHI/CM10和BHI一式两份的平板在37℃孵育过夜。使用pKSV7-dlBsrFI uvrAB质粒DNA电穿孔转化DP-L4056，DP-L4017或者DP-L4029菌株后产生的两种氯霉素抗性菌落的大约5％的同时涂布在BHI/CM10和BHI平板上的菌落表现为药物敏感(即只在BHI平板上生长)。这些药物敏感菌落代表了含有4612bp uvrAB基因缺失的候选菌株。每种药物敏感菌落重新划线于BHI/CM10和BHI平板上，37℃孵育过夜，以得到独立的菌落，以保证候选克隆是纯的和药物敏感的。对氯霉素敏感克隆进行PCR，使用Lm-2561677F和Lm-2568330R引物(同前)，目的是鉴定出还包含uvrAB删除的克隆。具有天然uvrAB基因的扩增子大小为6654bp而具有删除uvrAB基因的扩增子大小是2042bp；大约50％的氯霉素敏感克隆也含有删除的uvrAB基因。选择两个来自DP-L4056，DP-L4017和DP-LA029包含uvrAB删除的菌株的克隆用于进一步鉴定。每一个uvrAB突变体菌株制备甘油储备物(30℃的过夜培养物用无菌的LB/40％甘油1∶1进行稀释)，在-80℃保存。这些菌株的名称在表10中给出。DP-L4029uvrAB(actA/uvrAB)于2003年10月3日保存于ATCC，编号PTA-5563。

表10通过等位交换产生的利斯特氏菌株uvrAB突变株。

利斯特氏菌株uvrAB突变株亲本利斯特氏菌株

L4056/uvrAB克隆1 DP-L4056

L4056/uvrAB克隆2 DP-L4056

L4017/uvrAB克隆1 DP-L4017

L4017/uvrAB克隆2 DP-L4017

L4029/uvrAB克隆1 DP-L4029

L4029/uvrAB克隆2 DP-L4029

为了证明对S-59补骨脂素和UVA光的敏感性提高，将1×10⁹CFU的表10中所示的利斯特氏菌菌株uvrAB突变体制备物，分别使用2，20，100和500nM S-59(对于克隆L4017/uvrAB的两个克隆和L4056/uvrAB的两个克隆)或者2，10，20和100nM S-59(对于克隆L4017/uvrAB的克隆1和L4029/uvrAB的两个克隆)处理，UVA的辐射剂量为6J/cm²(FX1019)，将稀释液涂布在BHI平板上，测试菌株的存活能力，完全如实施例1中所述。本研究的结果在表11A-B中(log衰减作为S-59剂量的函数)和图8A-B中(剩余的log滴度作为S-59剂量的函数)给出。结果清除地表明，与亲本菌株比较，表10给出的DNA NER修复突变菌株对于使用补骨脂素和UVA辐射的光化学衰减，具有明显更高的易感性。这一数据提供了无可争议的证据表明，与它们同源的对应菌株相比，对于uvrAB突变体菌株可以使用明显低得多的S-59补骨脂素使uvrAB突变体细菌失活到同与它们同源的对应菌株失活相当的程度。

表11A在所指定的S-59浓度下辐射(6J/cm²UVA)后的单核细胞增生利斯特氏菌菌株的log衰减

	0nM S-59时的log滴度	单核细胞增生利斯特氏菌株的log衰减S-59浓度(nM)
	0nM S-59时的log滴度	单核细胞增生利斯特氏菌株的log衰减S-59浓度(nM)				利斯特氏菌菌株DP-L4017L4017/uvrAB克隆1L4017/uvrAB克隆2DP-L4056L4056/vurAB克隆1L4056/uvrAB克隆2	7.817.677.688.367.657.84	20.661.821.961.182.041.96	202.58＞6.67＞6.683.10＞6.65＞6.84	100＞6.81＞6.67＞6.68＞6.36＞6.65＞6.84	500＞6.81＞6.67＞6.68＞6.36＞6.65＞6.84

表11B在所指定的S-59浓度下辐射(6J/cm²UVA)后的单核细胞增生利斯特氏菌菌株的log衰减

	0nM S-59时的log滴度	单核细胞增生利斯特氏菌株的log衰减S-59浓度(nM)
	0nM S-59时的log滴度	单核细胞增生利斯特氏菌株的log衰减S-59浓度(nM)				利斯特氏菌菌株DP-L4017L4017/uvrAB克隆1DP-L4029L4029/uvrAB克隆1L4029/uvrAB克隆2	8.628.678.688.598.6	20.561.090.481.781.50	100.974.441.105.996.60	202.33＞7.672.98＞7.59＞7.63	100＞7.62＞7.67＞7.68＞7.59＞7.63

可以直接使用uvrAB突变菌株作为亲本株，在其中加入编码与恶性或者传染性疾病有关的异源抗原的表达盒。在这种背景下，在使用S-59和UVA光进行光化学衰减后，细菌保持了其进行MHC I类限制应答的能力，因为尽管通过交联使细菌复制其DNA的能力丧失，但是表达其遗传互补残留物的能力基本上保持完好。而且，由于使uvrAB突变体失活所需的DNA交联大大减少，就构成一剂疫苗的细菌基因组群而言，任何一个基因的表达都不会受到显著的影响，原因是DNA交联的水平很低，导致某个给定基因的表达基本上没有被中断。最后，uvrAB突变可以与任何其他衰减突变组合在一起，目的是将光化学和遗传衰减组合起来得到一个安全有效的疫苗平台。在这里描述的组合物中，uvrA、uvrB或uvrC基因或者任何涉及NER的利斯特氏菌基因，都可以单独或者以任何组合被突变，这样蛋白的有功能形式不能被表达。这些组合物可以作为一种方法，得到安全有效的疫苗，该疫苗来自挑选出的细菌病原，目的是在接受疫苗接种的个体中保护不受野生型抗原的攻击。或者，这些组合物可以作为一种方法，得到安全有效的重组疫苗平台，用于表达与任何目的恶性或者传染性疾病有关的异源抗原。

实施例8

通过等位交换或者位点特异整合载体向目的利斯特氏菌株中的基因组中插入抗原表达盒

在实施例7中描述的菌株，任何目的利斯特氏菌菌株，或者任何细菌菌株，可以被进一步改变以表达与恶性或者传染性疾病有关的异源蛋白或抗原。异源蛋白的表达可以通过含有复制子的质粒，该复制子与目的宿主细菌相容，这样质粒可以稳定地维持。或者可以使用多种不同的方法，包括如实施例7中描述的等位交换或者使用随机或位点特异整合的载体(这些载体来自目的转座子或者细菌噬菌体)，将原核表达盒稳定整合进入宿主细菌的基因组中。

作为一个实例，这里描述了来自如实施例7中描述的uvrAB核苷酸切除修复(NER)突变体菌株--重组单核细胞增生利斯特氏菌的来源过程，使用了位点特异整合载体pPL2，该载体来自利斯特氏菌噬菌体PSA(来自ScottA的噬菌体)[Lauer等人，J.Bacteriol.184：4177-4186(2002)]。特别地，对pPL2整合载体进行改造，使其表达鸡卵清蛋白(OVA)模型抗原作为融合配偶体，与利斯特氏菌溶胞毒素O(LLO)蛋白的氨基末端部分融合，该蛋白包括分泌信号以及PEST序列[Decatur和Portnoy，Science 290：992-995(2000)]，但是缺少溶血素活性，该蛋白与OVA按照读码框融合。截短的LLO-OVA融合蛋白的表达由hly启动子引导，hly启动子是依赖于prfA的启动子，引导利斯特氏菌毒力基因，包括LLO的表达。该载体称为pPL2/LLO_{ss- PEST}-OVA。pPL2载体整合到利斯特氏菌的tRNA^Arg基因中，整合方式使得tRNA基因的天然序列在成功整合之后得以恢复，这样使其天然表达的功能保持完好。

构建pPL2/LLO_ss-PEST-OVA的第一步是从DP-L4056野生型利斯特氏菌的基因组DNA中一起扩增出hly启动子和LLO_ss-PEST序列，通过PCR使用正向引物KpnI-LLO核苷酸1257-1276(SEQ ID NO：12)和反向引物XhoI-LLO1665R(SEQ ID NO：13)的引物对。426bp的扩增子用GeneClean纯化，用KpnI和XhoI消化，然后连接到pPL2质粒中，该质粒事先用KpnI和XhoI消化，小牛肠碱性磷酸酯酶(CIAP)处理，GeneClean纯化。含有LLO_ss-PEST序列的正确质粒通过用KpnI和XhoI消化和1％琼脂糖/TAE电泳来确证，产生的DNA片段为418bp和6112bp。这个中间质粒DNA构建体称为pPL2/LLO_ss-PEST。

可以从很多本领域内使用的那些质粒，包括来自DP-E3616大肠杆菌[Higgins等人，Mol.Molbiol.31：1631-1641(1999)]的pDP3616质粒DNA，中通过PCR扩增出OVA序列，使用正向引物XhoI-NcoI OVA cDNA核苷酸174-186(SEQ ID NO：14)和反向引物XhoI-NotI-HindIII(SEQ ID NO：15)的引物对。

1013bp的扩增子用GeneClean纯化，用XhoI和NotI消化，连入用XhoI和NotI消化、CIAP处理、GeneClean纯化的pPL2/LLO_ss-PEST质粒中。含有LLO_ss-PEST和OVA序列的正确质粒构建体通过用KpnI、XhoI和NotI消化和1％琼脂糖/TAE电泳来确证，产生的DNA片段为994bp，1560bp和6039bp。通过测序确证质粒pPL2/LLO_ss-PEST-OVA中LLO和OVA区域的精确预期序列。

pPL2/LLO_ss-PEST-OVA质粒插入到从实施例7中描述的目的利斯特氏菌uvrAB突变株的基因组的tRNA^Arg基因中，完全根据以前描述的方法进行[Lauer等人，J.Bacteriol.184，4177-4186(2002)]。简而言之，首先将质粒pPL2/LLO_ss-PEST-OVA，通过电穿孔或者化学方式，引入大肠杆菌宿主菌株SM10[Simon等人，Bio/Technology 1：784-791(1983)]中。接下来，将质粒pPL2/LLO_ss-PEST-OVA从转化的SM10中通过结合转移到目的利斯特氏菌中。在含有7.5微克每毫升氯霉素和200微克每毫升链霉素的药物选择BHI琼脂平板上孵育后，目的克隆通过在含有相同组合物的平板上传代三次进行纯化。为了证实pPL2载体整合在噬菌体结合位点处，挑取单个菌落，用PCR进行筛选，使用的引物对是正向引物NC16(SEQ ID NO：16)和反向引物PL95(SEQID NO：17)。具有pPL2/LLO_ss-PEST-OVA质粒插入到目的利斯特氏菌uvrAB突变株基因组的tRNA^Arg基因中的目的菌落，会产生499bp的特征性DNA扩增子。

包含稳定整合的pPL2/LLO_ss-PEST-OVA的重组利斯特氏菌uvrAB突变株，对其被抗原呈递细胞摄取的能力以及接下来通过MHC I类途径呈递OVA的能力进行检测，使用克隆的衍生自C57B1/6的树突细胞系DC2.4，如实施例1中的描述。利斯特氏菌被胞吞之后，DC2.4细胞在I类分子上对OVA多肽的呈递，在与B3Z细胞共同孵育后测定，也按照实施例1中的描述进行。这些步骤证实重组的利斯特氏菌菌株是有功能的，可以按照本发明中包含的实施例中的描述进一步使用。

这样，本实施例提供了说明指导，用于将编码与目的传染性和恶性疾病有关的任何所需抗原的原核表达盒引入在含有在uvrAB基因中有缺失的DNA修复突变利斯特氏菌菌株中。所述的重组利斯特氏菌菌株可以通过使用补骨脂素处理而被灭活，如实施例1中的描述，并且接下来可以用于多种不同的应用，包括例如针对传染性和恶性疾病的预防性和治疗性疫苗。

实施例9

来自核苷酸切除修复(NER)突变体的细菌疫苗

本发明中描述的实施例举例说明了疫苗组合物的效力，其通过对编码涉及传染性和恶性疾病的抗原的重组传输平台进行光化学处理达到基因组灭活。根据该组合物，尽管基因组被灭活且在复制中不能分离，但转录基本上保持完好，这使得在接受接种的个体中出现抗原表达的重新开始，以及对病原特异免疫应答(包括CD8+细胞毒T细胞(CTL))的最佳诱导。而且如实施例7中所描述的，通过在该组合物中使用疫苗平台，其中通过任何手段(包括遗传工程删除)使DNA核苷酸切除修复(NER)机制失活，这些突变体对光化学失活的敏感性显著提高。

DNA修复突变体失活所需的DNA交联明显较少，其结果是就组成一剂疫苗的细菌基因组群而言，任何一个基因的表达都不会受到显著影响，原因是低水平的DNA交联使得在某个给定基因上基本上没有表达的中断。

因此，使用了来自病原的细菌平台并且以基因为基础的疫苗的整体效用，可以通过将光化学灭活与NER有缺陷的载体相结合而显著提高。尽管灭活的疫苗不会导致疾病，但它仍然保持其诱导有效免疫力(包括T细胞介导的对于载体表达的异源抗原特异的细胞免疫)的有效能力。而且，为了获得将光化学和遗传突变组合在一起的安全有效的疫苗平台，可以将uvrAB突变与任何其他的衰减突变组合在一起。

显而易见地，这些组合物可以作为得到安全有效疫苗的途径，该疫苗来自目的细菌病原，在接受疫苗接种的个体中保护不受野生型抗原的攻击。根据这一应用，在许多情况下从某种病原的减毒的有生活力形式获得安全有效的疫苗是行不通的，原因是疫苗在接受疫苗的某些个体中的反应性和疾病的致病原性仍然很高的可能性。尽管与目的细菌病原有关的亚单位疫苗或灭活疫苗可能是安全的，但另一方面这些疫苗常常没有效用，因为它们不能有效地诱发广泛、深入和持久的病原特异的免疫应答，而这种应答正是保护接受免疫接种的个体不受所述的病原的野生型攻击所必需的。因此，在本领域内众所周知的是，迫切需要将安全性与在接受接种的个体中诱发保护性免疫应答的有效能力相结合的疫苗组合物。

同样地，致病性微生物的核苷酸切除修复(NER)途径的突变体，提供了组合物，该组合物可以用于安全有效的疫苗，该疫苗在接受所述微生物免疫接种的个体中诱发针对攻击的保护，所述微生物的量足以在未接种的个体中导致疾病。NER由依赖ATP的核酸酶催化，该酶由3个亚基组成，被称为ABC切除核酸酶，3个亚基由uvrA，uvrB和uvrC基因编码。这三个uvr基因中任何一个或者多个基因的突变导致细胞，包括病原性微生物，对使用补骨脂素和UVA光的光化学灭活极端敏感。

作为一个实例，提供了炭疽芽孢杆菌--炭疽病的病原--的uvr基因的突变。目前得到许可的用于人类的非细胞炭疽疫苗是基于用氢氧化铝吸附(美国疫苗)或者用磷酸铝沉淀(英国疫苗)减毒的炭疽芽孢杆菌的无菌培养物上清。众所周知这些疫苗的效果相当微弱，它们需要至少6次免疫才能有保护效果，并且需要每年进行加强免疫。

在这里描述的组合物中，uvrA，uvrB或uvrC基因，或者任何涉及NER的炭疽芽孢杆菌基因，它们可以单独或以任意组合被突变，使得该蛋白的有功能形式不被表达。

作为一个实例，可以通过例如实施例7中描述的等位交换，使uvrA，uvrB或uvrC基因，或者任何涉及NER的炭疽芽孢杆菌基因发生突变。尽管炭疽芽孢杆菌的uvr基因不是通过定位删除和对产生突变株的表型进行特征描述而鉴定出来的，这些uvr基因可以通过用相关生物体的基因组进行同源搜索来进行鉴定，在这些生物体中uvr基因是已知的。例如，炭疽芽孢杆菌的基因组，即主要染色体和两个毒力质粒，可以与同炭疽芽孢杆菌同属一个属的相关细菌，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)进行比较。代表Florida.炭疽芽孢杆菌分离株(Read等人2002.Science 296，2028-2033)的主染色体的基因组支架的GenBank登录编号为AAAC010000001。枯草芽孢杆菌的GenBank登录编号是NC-000964。枯草芽孢杆菌uvrA基因包括核苷酸3609064到3611997，而枯草芽孢杆菌uvrB基因包括核苷酸3612005到3613990。使用枯草芽孢杆菌uvrA和uvrB编码序列与炭疽芽孢杆菌的序列进行BLAST搜索。这个分析在炭疽芽孢杆菌的基因组中鉴定出了具有72％序列一致性的区域，该区域对应于炭疽芽孢杆菌的uvrA和uvrB基因。炭疽芽孢杆菌的uvrA基因在图上定位为226021-228783位核苷酸，与枯草芽孢杆菌uvrA基因有72％的序列同源性(2082/2867相同序列同源性比对)。炭疽芽孢杆菌的uvrB基因在图上定位为228864-230771位核苷酸，与枯草芽孢杆菌uvrB基因有72％的序列同源性(1401/1925相同序列同源性比对)。因此，炭疽芽孢杆菌uvrAB基因包括炭疽芽孢杆菌主要染色体的226021到230771位核苷酸。

可以根据实施例7中描述的对于单核细胞增生利斯特氏菌uvrAB基因的删除方法，对炭疽芽孢杆菌包括主要细菌染色体226021到230771位核苷酸的uvrAB基因进行删除。简而言之，炭疽芽孢杆菌基因组中包括该区域以及上下游各1000bp的区域由PCR扩增，接下来克隆到pKSV7等位交换质粒载体中。另一种方法是，将pKSV7等位交换质粒载体中的利斯特氏菌温度敏感复制子替换为芽孢杆菌属特异的或者炭疽芽孢杆菌特异的温度敏感复制子。使用特异定位于uvrAB区域中的便利的限制性内切酶识别位点，可以删除uvrA，uvrB，或者所有uvrAB基因序列中的任何部分。最后将等位交换质粒引入炭疽芽孢杆菌中，根据实施例7中的描述筛选NER突变体。任何挑选出的炭疽芽孢杆菌菌株都可以用作亲本菌株，用于产生NER缺陷的疫苗，包括，例如以下的菌株：Ames，Vollum，A1.a/10，A1.b/23，A2/29，A3.a/34，A3.b/57，A4/69，B/80，Δsterne，VN41Δ1，Dames，NNR1Δ1，和DNH1。此外，可以向挑选出的NER突变体炭疽芽孢杆菌菌株的基因组中引入其他的衰减突变，使疫苗组合物组合光化学失活和遗传失活。这种炭疽芽孢杆菌疫苗组合物能够诱导针对已知的炭疽免疫性和保护性相关因素的免疫应答，这些因素包括致死因子(LF)、水肿因子(EF)以及保护性抗原(PA)。另外，由于NER突变体疫苗组合物的表达特征保持完好，针对其他未知的炭疽免疫性和保护性相关因素(包括那些从两个毒力质粒pXO1和pXO2以及主要染色体上表达的因素)的免疫应答也被诱导。

这里描述的用炭疽芽孢杆菌作为实例，使用NER突变体作为疫苗组分的组合物，可以根据感染的途径即皮肤、胃肠道和呼吸系统感染，用于三种类型炭疽的预防性或者治疗性免疫接种设置。而且，应当意识到可以采纳制备炭疽芽孢杆菌的NER突变体用于获得安全有效疫苗的途径，以得到针对任何使用NER的微生物病原的安全有效的疫苗。

实施例10

本发明的疫苗用人的癌症体内治疗的用途

作为治疗或者预防人癌症的实例，向个体施用疫苗，该疫苗包含微生物群体，其中的微生物核酸被改变，这样微生物群体的增殖被衰减，其中的微生物基因表达基本未受影响。微生物可以根据实施例7和8中的实验方案进行制备，其中任何所需的编码人肿瘤抗原的原核表达盒，通过使用例如实施例8中描述的pPL2整合载体或者该载体的任何改变形式、或者任何本领域内人员通晓的方法，插入到微生物中。产生的微生物群可以以其天然未纯化的形式配制，或者优选地以纯化形式配制。它们可以制备为液体悬液或者冻干并重悬于适宜的载体中用于给药。此外，它们可以与添加剂例如防腐剂(例如柳硫汞、2-苯氧基乙醇)、稳定剂(例如乳糖、谷氨酸单钠盐)、佐剂(例如氢氧化铝、磷酸铝、细胞因子)、抗生素(例如新霉素、链霉素)或者其他物质一起配制。可以将制剂重悬或者用适宜的稀释液如无菌水、盐水、等渗缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲至生理pH)或者其他适宜的稀释液稀释。

可以通过多种途径施用疫苗，包括口、鼻、静脉内、皮内、腹膜内、肌内、淋巴内和皮下途径，以及与给定的恶性或者传染性疾病相应的任何途径。向个体施用有效量的疫苗用于治疗。对于治疗性治疗，有效量是指将产生所需免疫应答的剂量，其中的免疫应答或者减缓了目标肿瘤的生长、减小了肿瘤大小或者优选地完全根除肿瘤。疫苗的施用可以在适当的间隔重复进行，也可以同时在接受接种的个体的多个不同的位置同时进行。对于预防性治疗，有效量是指产生保护性免疫应答的剂量，这样个体发生癌症的可能性显著降低。免疫程序可以包含单剂、或者在适宜的间隔重复进行直至产生了保护性免疫应答。

对于个体的治疗性治疗可以在已经被诊断为患有癌症的个体身上开始，作为一种起始治疗，或者可以与其他治疗联合使用。例如，已经通过外科手术去掉肿瘤的个体或者已经使用放疗或化疗进行治疗的个体可以使用疫苗治疗，以减少或者去除个体中任何残留的肿瘤，或者降低癌症复发的风险。对于个体的预防性治疗可以在或者由于环境条件或者由于遗传诱因使患有某种癌症的风险升高的个体开始。

实施例11

具有或者没有uvrAB突变的利斯特氏菌DP-L4029菌株在S-59补骨脂素UVA处理之后的抗原呈递。

使用实施例8中的步骤，改变实施例7中的利斯特氏菌DP-L4029uvrAB突变体克隆1使其表达OVA抗原。使用不同浓度补骨脂素S-59处理该菌株或者经过改变表达OVA的DP-L4029菌株。利斯特氏菌株在37℃生长过夜，然后取2毫升稀释到100毫升BHI中，在37℃生长大约4小时至OD600达到0.5(大约1×10⁹CFU/mL)。每个利斯特氏菌株取5毫升的一份培养物加入到15毫升的试管中，2300g离心20分钟，去掉上清，然后用5毫升PBS重悬细菌，达到大约1×10⁹CFU/mL。对于uvrAB突变体菌株，取33.3微升3mM S-59储液，用10毫升PBS稀释，得到10μM的溶液，取合适量的该稀释液加入到利斯特氏菌中使终浓度达10，20，30，40，50，60，70，80，90和100nM；而对于DP-L4029，加入S-59至终浓度为100，200，400，800和1000nM，终体积为5毫升。将这些转移到6孔培养板中，用0.5J/cm²(FX1019UVA装置)辐射。样品转移到15毫升的试管中，加入5毫升PBS，2300g离心20分钟洗掉未反应的补骨脂素。除去上清，用5毫升PBS重悬细菌，并将其转移到新的6孔培养板中。使用5.5J/cm²剂量的UVA辐射样品，目的是将补骨脂素单加合物转化为交联物。还将每种利斯特氏菌株的样品在72℃处理3小时将其杀死。根据实施例1对log滴度和OVA抗原的呈递进行测定。S-59处理的样品的结果在表12A和图9A和9B中给出(抗原呈递是在每个DC2.4细胞1个利斯特氏菌，计算没有减去背景水平)。两种热杀死菌株的结果显示，其滴度低于检测限度(完全灭活)，并且在B3Z检测中，热杀死的细菌不呈递OVA抗原。结果显示uvrAB突变体即使在其增殖已经衰减到检测限度的水平，也表现了很强的抗原呈递，相反非uvrAB突变体菌株由于增殖衰减(增殖衰减大约到了背景水平，基本上完全灭活)的结果，抗原呈递显示了较大的下降。这证明在补骨脂素衰减的利斯特氏菌中，uvrAB突变体保持了MHC I类的呈递，所以应该提供疫苗，该疫苗具有有效的免疫应答以及显著提高的安全水平。

表12A使用不同浓度补骨脂素S-59处理、UVA照射的利斯特氏菌株Log衰减和OVA抗原呈递

[S-59]	log衰减		被呈递的OVA抗原的百分比*
	log衰减		被呈递的OVA抗原的百分比*		DP-L4029	DP-L4029	DP-L4029	DP-L4029
	nM1020304050607080901002004008001000	-OVA3.855.486.78＞7.78＞7.78	uvrAB-OVA2.473.935.286.446.92＞7.62＞7.62＞7.62＞7.62＞7.62	-OVA5047191313	DP-L4029	DP-L4029	DP-L4029	DP-L4029	uvrAB-OVA84847676688484889292

使用相同的菌株进行另一项研究。在该研究中将利斯特氏菌培养在BHI中，37℃过夜。过夜培养物稀释50倍于BHI，在37℃300rpm培养至OD₆₀₀达到0.5，这时将50毫升的溶液转移到洁净的摇瓶中，加入S-59至表12B所示的水平。将这些样品在37℃300rpm孵育大约1小时(OD₆₀₀达到约1.0，大约相当于1×10⁹/mL)。取出1毫升检测其滴度，剩余的转移到150毫米的培养皿中，在6J/cm²(FX1019)下辐射。根据前面的描述，确定辐射后每个样品的滴度以及OVA抗原的呈递。结果在表12B中以及图9C和9D中给出(抗原呈递是在每个DC2.4细胞10个利斯特氏菌，计算没有减去背景水平)。结果显示对于亲本株，在基本上完全被灭活时，抗原呈递处于背景水平，而对于uvrAB突变株，有大约10倍的S-59浓度范围，在该浓度范围中具有几乎完全的灭活和充分的抗原呈递。

表12B在细菌生长过程中使用不同补骨脂素S-59浓度处理、UVA照射的利斯特氏菌株Log衰减和OVA抗原呈递。

	log衰减		被呈递的OVA抗原的百分比*
	log衰减		被呈递的OVA抗原的百分比*		[S-59]	DP-L4029	DP-L4029	DP-L4029	DP-L4029
μM0.0250.050.10.20.250.40.50.81.01.62.03.24.06.48.016.0	-OVA2.005.287.57＞8.38＞8.38＞8.38＞8.38	uvrAB-OVA3.645.70＞8.10＞8.10＞8.10＞8.10＞8.10＞8.10＞8.10	-OVA50311411101011	uvrAB-OVA918687867450351611	[S-59]	DP-L4029	DP-L4029	DP-L4029	DP-L4029

*为未处理的百分比，在每DC2.4细胞10个利斯特氏菌测量的。

实施例12

S-59/UVA处理的单核细胞增生利斯特氏菌DP-L4029与DP-L4029uvrAB蛋白合成的比较。

单核细胞增生利斯特氏菌DP-L4029以及DP-L4029uvrAB在BHI中37℃下培养过夜。然后1∶50稀释于BHI，在37℃300rpm培养至OD600达到0.5，这时50毫升的溶液转移到一个洁净的摇瓶中，加入S-59至2500nM(对于4029菌株)和200nM水平(对于4029uvrAB突变体菌株)。这些样品在37℃300rpm下孵育大约1小时(OD600大约为1.0)。取出1毫升培养物检测其滴度，剩余的培养物转移到150毫米的培养皿中，在6J/cm²(FX1019)下辐射。测定了辐射后每个样品的滴度，以评价灭活的水平，结果是基本上完全灭活。已经确定本处理是使两种菌株灭活到检测限度的大致最低的S-59剂量。根据OD₆₀₀对滴度CFU/mL生长曲线，每个菌株取1×10¹⁰个细菌，转移到15毫升的离心管中。样品在4℃下2300g离心20分钟，去掉上清，用50毫升PBS洗涤沉淀。这一步骤共重复3次洗涤。最后的沉淀用2毫升不含甲硫氨酸或者半胱氨酸的DMEM(Gibco)重悬，37℃ 5％二氧化碳的孵箱中振荡孵育30分钟。样品在2毫升离心管中，1600rpm离心2分钟。去掉上清，加入2毫升不含甲硫氨酸或者半胱氨酸的DMEM。加入80μCi的³⁵S甲硫氨酸-半胱氨酸(Perkin Elmer LifeSciences)，样品在37℃ 5％二氧化碳的孵箱中振荡孵育30分钟。同上离心样品，去掉上清。每份上清取50微升上样于SDS-PAGE凝胶(Invitrogen，NuPage 4-12％Bis-Tris胶)中相邻的泳道中，100伏电泳大约1.5小时。用10％乙酸和30％乙醇固定凝胶，然后浸泡在enhancer(Enlightning，NEN Life Sciences)中15分钟。凝胶在80℃干燥3小时，通过在X光片中曝光以显示条带。两项研究的结果在图10中给出，表明uvrAB突变体菌株有大量的蛋白质合成，而亲本菌株只有有限的蛋白质合成。

实施例13

在利斯特氏菌的生长中，在存在S-59或者不存在的情况下对S-59/UVA灭活进行比较。

比较两种灭活单核细胞增生利斯特氏菌菌株的方法。在第一种方法中，利斯特氏菌在BHI中37℃下300rpm培养过夜，然后1∶50稀释于BHI中，在37℃300rpm培养至OD₆₀₀达到0.7-1.0。离心，并用含1％BSA的PBS重悬至1×10⁹/ml。对于亲本株，加入S-59至120nM，对于uvrAB突变株，加入S-59至30nM。样品在冰上孵育大约60分钟，然后转移到150毫米的培养皿中，在6J/cm²剂量(FX1019)下辐射。在第二种方法中，利斯特氏菌进行相似的培养至OD₆₀₀达到0.5，这时50毫升菌液转移到一个洁净的摇瓶中，对于亲本株，加入S-59至2500nM，对于uvrAB株，加入S-59至200nM。样品在37℃300rpm孵育大约1小时(OD₆₀₀大约1.0，大约1×10⁹/mL)。取出1毫升样品测定滴度，剩余的样品转移到150毫米的培养皿中，同第一种方法进行辐射。每一个样品测定辐射后的滴度，结果是所有样品的增殖基本上完全被抑制(大于8log的灭活)。在一项用DP-L4029和DP-L4029uvrAB的研究中，用第二种方法处理包含大约1×10¹¹个细菌的整个样品，将整个样品涂板，显示大约9log的亲本株被杀死而大于10log的uvrAB突变株被杀死。四种不同的利斯特氏菌制备物的结果在表13中给出。

表13使用S-59/UVA灭活单核细胞增生利斯特氏菌actA^-以及actA^-uvrAB^-，对整个样品进行测量，以测定log滴度灭活。

	批	处理时的滴度	残留的菌落	Log灭活
	批	处理时的滴度	残留的菌落	Log灭活	actA-2.5μM S-596J/cm²actA-uvrAB^-200nM S-596J/cm²	12341234	1.0×10¹¹1.1×10¹¹1.1×10¹¹1.1×10¹¹1.0×10¹¹1.1×10¹¹1.1×10¹¹1.1×10¹¹	1002820016001101	99.68.78.811101111

在一项研究中，使用单核细胞增生利斯特氏菌DP-L4029-OVA和DP-L4029uvrAB-OVA比较了两种方法。同上制备样品，2300g离心20分钟，去掉上清，细菌用PBS洗一次。离心和去掉PBS漂洗液后，最终的沉淀用含8％DMSO的PBS重悬，然后迅速置于冻存管中，用液氮或者干冰冷冻，储存于-80℃。每组三只小鼠(C57B1/6)静脉内注射200微升的1×10⁸个利斯特氏菌(冻存的储液大约1∶40稀释于HBSS中)。除了用S-59/UVA处理的菌株以外，还使用活的和热杀死的DP-L4029uvrAB-OVA，以及HBSS对照进行注射。对于两种S-59方法的比较，在0天注射小鼠。对于用第二种方法制备的样品，另取数组小鼠，在第2、3天或者第2、3、4和5天注射。所有的小鼠在接种后第7天处死，取出脾脏进行分析。用实施例5中描述的ELISPOT方法检测脾脏细胞的OVA特异的免疫应答，使用SL8(OVA特异的)刺激细胞群。结果在图11A中显示，表明通过第二种方法制备的利斯特氏菌，不论是亲本株还是uvrAB突变株，都较第一种方法制备的菌株具有更有效的OVA特异的免疫应答。还使用LLO II类抗原LLO190或者I类抗原LLO296进行刺激，进行ELISPOT检测。比较了所有三种抗原的ELISPOT结果在图11B中显示，表明LLO特异的CD4⁺应答与OVA特异的应答相似。还使用实施例5中描述的ICS检测了脾脏细胞，使用SL8、LLO190或者LLO296刺激。结果在图12A-C中显示，结果表明在第二种方法中，对于OVA和LLO都出现了更强的免疫应答。数据还表明uvrAB菌株较亲本株具有增强的应答。在两个菌株中，在接下来的日子里增加免疫接种，对OVA和LLO抗原都产生增强的应答(1天与3天)。

在另一项研究中，评价DP-L4029和DP-L4029 uvrAB菌株在小鼠中提供针对野生型攻击的保护性免疫性的能力。Balb/c小鼠分组根据表14中的描述进行接种，使用HBSS、DP-L4056野生型(+/-热杀死)、DP-L4027(LLO删除)、DP-L4029S-59/UVA处理(以上的第一种和第二种方法)、DP-L4029uvrAB S-59/UVA处理(以上的第一种和第二种方法)。接种后27天，每组中3只小鼠使用2×LD₅₀、6只小鼠使用100×LD₅₀的野生型单核细胞增生利斯特氏菌攻击。攻击后3天，处死用2×LD₅₀攻击的小鼠，分离脾脏和肝脏，并进行培养，使利斯特氏菌生长。每只小鼠的脾脏或者肝脏在含0.5％Triton X-100(Sigma)的无菌蒸馏水中匀浆。将连续10倍稀释液涂布于含有链霉素(50μg/mL)BHI琼脂平板上，37℃孵育过夜。测定每个脾脏或者肝脏的菌落形成单位数目，作为对野生型菌株攻击免疫性的指示。图13A和B显示与HBSS(未免疫接种)对照相比，S-59/UVA处理的样品给出了大约每个器官3log的CFU下降，与第一种方法制备的样品相比，第二种方法制备的样品显示了更大的CFU下降。此外，处理的uvrAB突变株比处理的亲本株表现出略高的CFU下降。尽管CFU的降低不如用野生型免疫接种的效果，但是S-59/UVA处理的菌株也显示了一些降低CFU的效力，而CFU的降低一般与保护性免疫性相关。使用100×LD₅₀攻击的6只小鼠继续观察10天，监测其存活，只有一只使用了野生型利斯特氏菌免疫接种的小鼠存活。

表14Balb/c小鼠的免疫剂量，用于测定保护性免疫性，比较两种S-59/UVA方法

疫苗组合物	S-59/6J/cm²UVA方法	接种剂量(200微升IV)
疫苗组合物	S-59/6J/cm²UVA方法	接种剂量(200微升IV)	HBSSDP-L4056DP-L4027DP-L4029DP-L4029DP-L4029uvrABDP-LA029uvrABDP-L4056热杀死	---方法1(120nM S-59在PBS中)方法2(2500nM S-59在BHI中)方法1(30nM S-59在PBS中)方法2(200nM S-59在BHI中)-	-5×10³1×10⁸1×10⁸1×10⁸1×10⁸1×10⁸1×10⁹

在Balb/c小鼠中进行另外一项研究，使用HBSS，DP-L4056野生型(+/-热杀死)，DP-L4027(LLO删除)，DP-L4406actA(actA/inlB双缺失突变体，于2003年10月3日保存，ATCC编号PTA-5562)，DP-L4029+S-59/UVA(第二种方法)，DP-L4029uvrAB+/-S-59/UVA处理(只用第二种方法)或者+热杀死的，对于S-59和热杀死的菌株，每天接种连续进行1、3或5天。剂量总结与表15中。第一次免疫接种后29天，每组3只小鼠使用20×LD₅₀、6只小鼠使用100×LD₅₀的野生型单核细胞增生利斯特氏菌攻击。这些小鼠监测其10天的存活。第一次免疫接种后32天，每组另外3只小鼠使用2×LD₅₀野生型攻击，3天后处死，分离脾脏和肝脏，并进行培养，使利斯特氏菌生长。此外，进行ELISA检测测定小鼠血清中抗利斯特氏菌的抗体滴度。在碳酸氢钠缓冲液中的冷冻ground利斯特氏菌涂板并且与连续稀释的免疫小鼠的血清一起孵育，然后用缀合HRP的山羊抗小鼠抗体检测结合上的抗体。加入HRP的底物，抗体水平通过定量测定颜色的改变而确定。这些与原初小鼠比较，评价利斯特氏菌特异的抗体，如果样品的测量值高于原初小鼠血清样品测量值1个sd(Standarddeviation)，则认为样品是利斯特氏菌阳性。每个脾脏或者肝脏的CFU在图14A和B中显示，抗利斯特抗体滴度在图15中显示，存活结果在图16中显示。本研究表明S-59处理的uvrAB菌株接种3次或者5次，具有良好的CFU降低和保护性免疫性，接近未处理的uvrAB菌株的结果，并且几乎与野生型菌株同样有效。

表15使用S-59/UVA处理的菌株进行多次免疫接种Balb/c小鼠用于测定保护性免疫性。

疫苗组合物	处理	接种的天数	接种剂量(200微升IV)
疫苗组合物	处理	接种的天数	接种剂量(200微升IV)	HBSSDP-L4056DP-L4056热杀死的DP-L4029DP-L4029uvrABDP-L4029uvrABDP-b4029uvrABDP-L4029uvrABDP-L4029uvrABDP-L4029uvrABDP-L4029uvrABDP-L4027DP-L4406actA	---S-59方法2S-59方法2S-59方法2S-59方法2-热杀死热杀死热杀死-	1111135113511	-5×10³1×10⁹1×10⁸1×10⁸1×10⁸(第0天)2×10⁷(第2-3天)1×10⁸(第0天)4×10⁷(第2-5天)5×10⁶1×10⁹1×10⁹(第0天)2×10⁸(第2-3天)1×10⁹(第0天)4×10⁸(第2-5天)1×10⁸5×10⁷

实施例14

使用S-59/UVA处理的菌株在小鼠模型中破坏免疫耐受的证明

使用实施例13中的第二种方法用S-59/UVA处理表达Gp-70-AH1A5和OVA的DP-L4029和DP-L4029uvrAB菌株。Gp-70是一种小鼠自体抗原，由CT-26肿瘤细胞表达。AH1A5是天然序列中的一个单碱基突变，在活菌株中表达时会诱导免疫应答[AH1肽是SPSYVYHQF(SEQ ID NO：20)，AH1A5肽是SPSYAYHQF(SEQ ID NO：21)]。在一项预防性免疫接种研究中，根据表16对每组8只Balb/c小鼠进行静脉内接种(100微升)(第一组接种完成后7天，处死每组3只小鼠，收集脾脏)。初次接种21天后，每组剩余的5只小鼠静脉内注射1×10⁵个CT-26结肠上皮肿瘤细胞(ATCC)并监测其存活。

表16疫苗株和处理程序

组	疫苗株	处理	接种时间	每次接种量
组	疫苗株	处理	接种时间	每次接种量	123456789101112	HBSS对照DP-L4029DP-L4029 AH1A5/OVADP-L4029 AH1A5/OVADP-L4029 AH1A5/OVADP-L4029 AH1A5/OVADP-L4029 AH1A5/OVADP-L4029 uvtAB AH1A5/OVADP-L4029 uvrAB AH1A5/OVADP-L4029 uvrAB AH1A5/OVADP-L4029 uvrAB AH1A5/OVADP-L4029 avrAB AH1A5/OVA	---热杀死热杀死S-59/UVAS-59/UVA-热杀死热杀死S-59/UVAS-59/UVA	0，14，150，14，150，14，150，140，1，2，140，140，1，2，140，14，150，140，1，2，140，140，1，2，14	-1×10⁷1×10⁷3×10⁸1×10⁸3×10⁷1×10⁷1×10⁷3×10⁸1×10⁸3×10⁷1×10⁷

根据实施例5，用ICS对收集的脾脏细胞的T细胞群进行分析，使用LLO91，AH1，AH1/A5肽或者P815和CT26细胞(使用150mM S-59和3J/cm² UVA使其完全灭活)刺激细胞。P815细胞作为CT26全细胞刺激的阴性对照，因为P815不表达gp70抗原。结果在图17中表示，表明处理的uvrAB突变株产生了AH1A5或者AH1特异的免疫应答，此应答可以被增加的免疫接种提高。还用根据实施例5的ELISPOT检测对细胞进行分析。使用AH1A5或者AH1肽刺激细胞。结果在图18A、B中表示，表明使用uvrAB突变株产生了对AH1A5或者AH1的免疫应答。

实施例15

使用补骨脂素减毒的uvrAB缺失利斯特氏菌株对小鼠进行治疗性免疫接种。

使用B16.F10.MO5.10.H3(OVA+，这是一个实施例4中使用的细胞的亚克隆，它表达OVA的均一性有所提高)黑色素肿瘤细胞(1×10⁶每100微升HBSS，静脉内)注射到C57B1/6小鼠中以建立肺部转移灶。使用单核细胞增生利斯特氏菌菌株DP-L4029-OVA，DP-L4027-OVA，DP-L4038-OVA(actA/461T双突变体)，以及DP-L4029uvrAB-OVA接种每组10只小鼠。使用或者不用S-59处理DP-L4029uvrAB-OVA菌株(用实施例13中的方法一得到8log以上的杀死)；热杀死的DP-L4029-OVA以及HBSS作为对照。在肿瘤移植后第三天，对小鼠进行免疫接种(静脉内100微升HBSS中的样品)，使用的剂量在表16中给出。在肿瘤移植30天后，每组处死5只小鼠，收集肺脏。计数每个肺脏中的转移灶。每组剩余的5只小鼠继续监测其存活。每个肺脏中的转移灶数目以及中值存活时间在表17中给出。在图19A中显示了actA^-，actA^-OVA，以及actA^-uvrAB^-OVA S-59/UVA处理和热杀死菌株的肺脏，肺脏转移灶的数目在图19B中作出，存活情况在图19C中作出。此数据显示S-59/UVA处理的uvrAB突变株可以作为治疗性疫苗施用，可以导致肺脏转移灶的显著下降，并且与未免疫接种的、热杀死的对照或者没有OVA的DP-L4029相比，存活时间延长。

表17在OVA肺部肿瘤模型中的小鼠治疗性免疫接种

疫苗株	剂量(CFU)	每个肺脏中的转移灶平均数	中值存活天数
疫苗株	剂量(CFU)	每个肺脏中的转移灶平均数	中值存活天数	HBSSDP-L4029DP-L4029-OVADP-L4029-OVA热杀死DP-L4029uvrAB-OVADP-L4029uvrAB-OVADP-L4029uvrAB-OVA(S-59)DP-L4029uvrAB-OVA(S-59)DP-L4027-OVADP-L4038-OVA	-2×10⁷2×10⁷1×10⁹2×10⁷2×10⁵1×10⁹2×10⁵2×10⁷2×10⁷	1738132503411134252	34395132534545364851

实施例16

使用表达gp70小鼠抗原的S-59灭活的利斯特氏菌株进行治疗性免疫接种

将经过改变表达人抗原(该人抗原与本实验无关)的CT26肿瘤细胞(表达AH1)，注射到Balb/c小鼠中(100μL HBSS中含有2×10⁵个细胞，静脉内途径)，建立肺脏转移灶。单核细胞增生利斯特氏菌菌株DP-L4029，DP-L4029-AH1A5，DP-L4029uvrAB-AH1A5，以及DP-L4406actA-AH1A5(actA/inlB双突变体)用于接种每组13只小鼠。AH1A5菌株还表达OVA抗原。使用未经处理的、热杀死的或者S-59处理(实施例13中的第二种方法)的DP-L4029uvrAB-AH1A5菌株。肿瘤移植后4天按照表18开始对小鼠进行免疫接种(静脉内，100微升，HBSS)。肿瘤移植后19天，每组3只小鼠处死，收集肺脏。计数每个肺脏中的转移灶。每组剩余的10只小鼠继续监测其存活。肺脏中转移灶的结果在图20A(肺脏照片)和20B(绘出了肺脏中的转移灶数目)中显示，存活结果在表18中以及图20C(ΔactA样品)和20D(ΔactAΔuvrAB样品)中给出。AH1A5抗原是小鼠的内源抗原，这样任何免疫接种效果都会打破小鼠中的免疫耐受。结果表明S-59处理的uvrAB突变株能够打破小鼠中的耐受，使肺脏的转移灶显著下降，且存活延长。与单次接种相比，在三天接种的治疗效果有所提高(三天接种的疫苗总剂量与一天接种的总剂量相等)。

表18使用经过改变表达AH1A5的利斯特氏菌对小鼠进行治疗性接种

疫苗株	接种时间	剂量(CFU)	中值存活时间(天)	第43天的存活数目
疫苗株	接种时间	剂量(CFU)	中值存活时间(天)	第43天的存活数目	HBSSDP-L4029DP-L4029-AH1A5DP-L4029-AH1A5热杀死DP-L4029-AH1A5热杀死DP-L4029-AH1A5 S-59/UVADP-L4029-AH1A5 S-59/UVADP-L4029uvrAB-AH1A5DP-L4029uvrAB-AH1A5热杀死DP-L4029uvrAB-AH1A5热杀死DP-L4029uvrAB-AH1A5 S-59/UVADP-L4029uvrAB-AH1A5 S-59/UVADP-L4406actA-AH1A5	第4天第4天第4天第4天第4、5、6天第4天第4、5、6天第4天第4天第4、5、6天第4天第4、5、6天第4天	-1×10⁷1×10⁷3×10⁸1×10⁸3×10⁷1×10⁷1×10⁷3×10⁸1×10⁸3×10⁷1×10⁷1×10⁷	2224＞432122.527.523.5＞43232431＞43＞43	0010013210114810

实施例17

使用荧光显微术对S-59/UVA处理的单核细胞增生利斯特氏菌在树突细胞中的定位进行估计。

通过荧光显微术对单核细胞增生利斯特氏菌在抗原呈递细胞内的摄取和分布进行评价。树突细胞系DC2.4在培养皿中的盖玻片上培养，培养密度为5×10⁵个细胞每皿，培养基是RPMI完全培养基，即RPMI-1640(Gibco)添加10％FBS(Hyclone)，1x非必需氨基酸(Cellgro)，5×10⁴I.U.青霉素/5×10⁴微克链霉素(IrvineScientific)，2mM L-谷氨酰胺(Irvine Scientific)和1nM丙酮酸钠(Sigma)，在37℃孵育过夜(可以对其他细胞系例如巨噬细胞J774，采用相似的处理)。稳定生长期的利斯特氏菌株(DP-L4056，DP-L4027(LLO-)和DP-L4056uvrAB)的培养物制备如下：取一个细菌菌落接种于3毫升BHI培养基，在30℃培养过夜。

利斯特氏菌的过夜培养物1∶20稀释于新鲜的BHI培养基，再在30℃培养至OD₆₀₀达到0.5到0.6得到稳定生长期培养物。取大约1毫升的DP-L4056和DP-L4056uvrAB菌株的过夜培养物在72℃处理3-4小时，将其杀死。融化补骨脂素灭活的DP-L4056和DP-L4056uvrAB利斯特氏菌株(根据实施例13的第二种方法制备)的冻存储备物，在37℃复苏1小时到稳定期。在感染前，读取所有利斯特氏菌制备物的OD₆₀₀值，计数每个盖玻片上的DC2.4细胞数目，并计算每个菌株的感染复数(MOI，每个DC 2.4细胞的细菌数目)。使用新鲜的对数生长期培养物感染细胞，感染复数为5；热杀死的培养物MOI为20；S-59/UVA处理的菌株MOI为10。

将盖玻片转移到24孔的培养皿中用无青霉素/链霉素的RPMI培养基漂洗3次，然后将要提供所需MOI的适当稀释度的利斯特氏菌菌株与细胞在无青霉素/链霉素的培养基中，37℃下孵育30分钟。然后盖玻片用没有青霉素/链霉素的培养基漂洗3次，在37℃再孵育30分钟。孵育结束时，漂洗盖玻片，用含有50μg/ml庆大霉素的培养基中在37℃孵育4小时。然后用PBS漂洗盖玻片，在3.5％甲醛/PBS中室温固定15分钟。固定后，盖玻片用TBS-Tx缓冲液(25mM Tris-HClpH 8.0，150mM NaCl，0.1％Triton X-100)漂洗/透化，用1％BSA/TBS-Tx在室温下封闭15分钟。用兔抗利斯特氏菌O抗原的抗血清(Difco)室温染色盖玻片30分钟，然后用TBS-Tx缓冲液漂洗。然后用荧光素标记的抗兔二抗(Vector Laboratories)对样品进行染色，用罗丹明-鬼笔环肽(Molecular Probes)对肌动蛋白进行染色。盖玻片用TBS-Tx漂洗，装到VectaShield+DAPI-hardset(VectorLaboratories)中的载玻片上，对细胞核进行染色。使载玻片干燥至少8小时，使用Nikon TE 300-U倒置显微镜观察细胞。使用CCD HamamatsuC4742-95-12NR照相机照相，使用Phase 3 Imaging Systems的Image-Pro软件对图片进行分析。

每一个视野照三张照片：一张使用UV-2E/C滤光片(CHROMATechnology Corp，观察DAPI/细胞核)；第二张使用HYQ TRITC滤光片(CHROMA Technology Corp，观察肌动蛋白)；第三张使用B-1A(HYQ-FITC)滤光片(CHROMA Technology Corp，观察利斯特氏菌)。三张照片合并，以确定利斯特氏菌的染色是否与肌动蛋白的染色位置一致。不能逃脱吞噬溶酶体的利斯特氏菌呈现绿色而能够逃脱吞噬溶酶体达到胞浆中的利斯特氏菌能够使肌动蛋白成核，因此由于肌动蛋白(红色)和利斯特氏菌(绿色)位于同一位置而呈现黄色。为了定量确定能够逃脱溶酶体的利斯特氏菌的百分比，先计数视野中的利斯特氏菌总数，再计数黄色细菌或者从罗达明照片(参见图21A)对肌动蛋白的存在进行确证，从而确定呈现黄色的利斯特氏菌的数目。逃脱吞噬细胞溶酶体的利斯特氏菌的数目除以计数的利斯特氏菌总数，计算逃脱吞噬细胞溶酶体的利斯特氏菌的百分比，如表19中给出和图21B中表示的。结果表明热杀死的菌株以及S-59/UVA处理的野生型菌株与LLO^-菌株的行为相似，即不能逃脱吞噬细胞溶酶体，而S-59/UVA处理的uvrAB突变体具有明显的逃脱吞噬细胞溶酶体的能力。

表19DP-L4056(+/-S-59/UVA，热杀死)，DP-L4027，以及DP-L4056uvrAB(+/-S-59/UVA，热杀死)逃脱吞噬溶酶体的利斯特氏菌的百分比

利斯特氏菌株	处理	计数的利斯特氏菌	细胞质中的利斯特氏菌	逃脱吞噬溶酶体的％
利斯特氏菌株	处理	计数的利斯特氏菌	细胞质中的利斯特氏菌	逃脱吞噬溶酶体的％	DP-L4056DP-L4056DP-L4056DP-L4056 uvrABDP-L4056 uvrABDP-L4056 uvrABDP-L4027	无热杀死S-59/UVA无热杀死S-59/UVA无	8551896427951621047343	5210147004935	6100.1659046.91.4

实施例18

使用革兰氏染色观察S-59UVA处理的单核细胞增生利斯特氏菌uvrAB^-菌株

单核细胞增生利斯特氏菌的野生型和uvrAB^-菌株培养至OD₆₀₀达0.5，这时转移50毫升的溶液到一个洁净的摇瓶中，加入S-59，对于野生型菌株加入的浓度为2500nM，对于uvrAB^-突变菌株加入的浓度为200nM。这些样品在37℃300rpm孵育大约1小时(OD₆₀₀大约1.0，大约1×10⁹/mL)。取1毫升的样品检测滴度，剩余的样品转移到150毫米的培养皿中，用6J/cm²UVA(FX-1019)辐射，使两种菌株的灭活都在8log以上。处理的菌株根据实施例13的描述冷冻储存。冻存的菌株融化，在一个15毫升的试管中以1∶10的比例稀释于BHI培养基至浓度为大约1-2×10⁹个每mL。37℃300rpm孵育，在0，2，4，6，8小时以及过夜(大约18小时)分别取等分试样。样品涂布在玻璃载玻片上(大约50微升)，在空气中干燥。将涂片通过火焰三次，使其固定，冷却后用Fisher Gram Stain Set(目录编号282-407)进行革兰氏染色。在显微镜下观察载玻片，进行照相，负片在图22中显示。这清楚表明了经过处理的修复缺陷菌株的独特性质，它们表现为链状表明基因的表达，但是不能分裂所以细菌不能增殖。

实施例19

其他突变体利斯特氏菌株的构建

制备突变体利斯特氏菌株。利斯特氏菌株来自10403S(Bishop等人，J Immunol.139：2005(1987))。使用已有的方法(Camilli等人，Mol.Microbiol.8：143(1993))通过SOE-PCR以及等位交换产生按读码框缺失所示基因的利斯特氏菌株。突变菌株LLO L461T(DP-L4017)在Glomski等，J.Cell.Biol.156：1029(2002)中有所描述，在这里引用作为参考。actA^-突变体(DP-L4029)是其噬菌体已经去除(cured)的(噬菌体去除在Lauer等人，J.Bacteriol.184：4177(2002)；和美国专利出版编号2003/0203472中有所描述)DP-L3078菌株(在Skoble等人，J.of Cell Biology，150：527-537(2000)有所描述，这里将其作为整体引用作为参考)。LLO^-突变体(DP-L4027)(Lauer等人，J.of Bacteriology，184：4177-4186(2002))，以及LLO Δ26(DP-L4042)(Decatur等，Science 290：992(2000))以前都有所描述。actA^-uvrAB^-菌株的构建在未决的美国临时申请60/446,051中描述为L4029/uvrAB(参见例如该申请中的实施例7)，该申请于2003年2月6日提交。DP-L4029uvrAB(actA^-/uvrAB^-)于2003年10月3日保存于ATCC，编号PTA-5563。

构建pKSV7-dl inlB用于在利斯特氏菌中通过等位交换删除inlB可以通过等位交换实现从利斯特氏菌DP-L4029(或者其他挑选出的突变体菌株或者野生型利斯特氏菌)中删除inlB，这在Camilli等，Mol.Microbiol.8：143-147(1993)中有所描述。重叠PCR可以用于制备用于等位交换步骤的构建体。内化素B基因的来源是由GenBank登录号AL591975(单核细胞增生利斯特氏菌菌株EGD，完整基因组，片段3/12；inlB基因区域：核苷酸97008-98963)列出的序列和/或登录号NC_003210(单核细胞增生利斯特氏菌菌株EGD，完整基因组，；inlB基因区域：核苷酸457008-458963)列出的序列。两个序列在这里整体引用作为参考。

在初级PCR反应中，用以下的模板和引物将利斯特氏菌inlB基因5′端和3′端上游和下游大约1000bp的序列分别扩增出来。

模板：DP-L4056或者DP-L4029基因组DNA

引物对1(用于扩增出inlB 5′端上游的区域)：

Lm-96031F：5′-GTTAAGTTTCATGTGGACGGCAAAG(SEQ ID NO：22)(Tm：72℃)

Lm-(3′inlB-R+)97020R：5′- AGGTCTTTTTCAGTTAACTATCCTCTCCTTGATTCTAGTTAT(SEQ ID NO：23)(Tm：114℃)

(划线的序列与InlB羧基端下游的区域互补。)

(扩增子大小1007bp)

引物对2(用于扩增出inlB 3′端下游的区域)：

Lm-(5′inlB-F+)98911F：

5′- CAAGGAGAGGATAGTTAACTGAAAAAGACCTAAAAAAGAAGGC(SEQ ID NO：24)(Tm：118℃)(划线的序列与InlB氨基端上游的区域互补。)

Lm-99970R：5′-TCCCCTGTTCCTATAATTGTTAGCTC(SEQ ID NO：25)(Tm：74℃)

(扩增子大小1074bp)

在二级PCR反应中，初级PCR反应的扩增子通过重叠PCR融合在一起，重叠PCR利用了引物对1中的反向引物和引物对2中的正向引物之间的互补性。结果是inlB编码序列97021-98910核苷酸＝1889bps被精确删除。在二级PCR反应中，使用以下的模板和引物：

模板：纯净的初级PCR反应产物

引物对：

Lm-96043F：5′-GTGGACGGCAAAGAAACAACCAAAG(SEQ ID NO：26)(Tm：74℃)

Lm-99964R：5′-GTTCCTATAATTGTTAGCTCATTTTTTTC(SEQ ID NO：27)(Tm：74℃)

(扩增子大小2033bp)

完成构建过程的实验方案如下：

初级PCR反应(三个温度循环)使用Vent DNA聚合酶(NEB)以及10微升漂洗后的30℃的利斯特氏菌DP-L4056或DP-L4029过夜培养物进行。利斯特氏菌扩增子的预期大小(1007bps和1074bps)，通过1％的琼脂糖凝胶检测。初级PCR反应使用凝胶纯化，用GeneClean(BIO 101)洗脱DNA。

二级PCR反应使用大致等量的每个初级PCR产物作为模板(约5微升)。二级PCR反应的利斯特氏菌扩增子的预期大小由1％琼脂糖凝胶确证(2033bp)。用Taq聚合酶在利斯特氏菌dl inlB扩增子的3′端加上腺嘌呤核苷酸残基。

然后将利斯特氏菌dl inlB扩增子插入到pCR2.1-TOPO载体中。使用XhoI和KpnI对pCR2.1-TOPO-dl inlB质粒DNA进行酶切，凝胶纯化2123bp的片段。KpnI/XhoI 2123bp片段插入经KpnI和XhoI酶切、CIAP处理的pKSV7载体中(pKSV7-dlinlB)。然后确认pKSV7-dlinlB中dl inlB序列的保真性。使用pKSV7-dl inlB质粒，通过等位交换在所需的利斯特氏菌株中删除inlB基因。

抗原表达菌株的构建。制备表达截短形式的模型抗原卵清蛋白(OVA)的突变利斯特氏菌株，制备来自小鼠结肠癌(CT26)的免疫优势表位，称为AH1(SPSYVYHQF；SEQ ID NO：20)，以及其改变后的表位AH1-A5(SPSYAYHQF；SEQ ID NO：21；Slansky等，Immunity，13：529-538(2000))。使用pPL2整合载体(Lauer等，J.Bacteriol.184：4177(2002)；美国专利出版编号2003/0203472)，得到OVA和AH1-A5/OVA重组利斯特氏菌株，菌株中含有一个拷贝整合到利斯特氏菌基因组的一个无害的位置上。

表达OVA的利斯特氏菌(DP-L4056)的构建。首先制备整合载体pPL2/LLO-OVA，该载体中含有由删除了溶血素的LLO与截短的OVA融合后组成的抗原表达盒。将pPL2/LLO-OVA引入噬菌体去除(cured)的单核细胞增生利斯特氏菌菌株DP-L4056的PSA(Phage From ScottA)附着位置tRNA^Arg-attBB′中。

使用以下模板和引物用PCR扩增删除了溶血素的LLO：

来源：DP-L4056基因组DNA

引物：

正向(KpnI-LLO核苷酸1257-1276)：

5′-CTCT GGTACCTCCTTTGATTAGTATATTC(SEQ ID NO：28)(Tm：LLO-特异：52℃.全长：80℃)

反向(BamHI-XhoI-LLO核苷酸2811-2792)：

5′-CAAT GGATCCCTCGAGATCATAATTTACTTCATCCC(SEQ ID NO：29)(Tm：LLO-特异：52℃。全长：102℃)

使用以下模板和引物用PCR扩增出截短的OVA：

来源：pDP3616质粒DNA，来自DP-E 3616大肠杆菌(Higgins等，Mol.Molbiol.31：1631-1641(1999)).

引物：

正向(XhoI-NcoI OVA cDNA 核苷酸174-186)：

5′-ATTT CTCGAGT CCATGGGGGGTTCTCATCATC(SEQ ID NO：30)(Tm OVA-特异：60℃.全长：88℃.)

反向(XhoI-NotI-HindIII)：

5′-GGTG CTCGAGT GCGGCCGCAAGCTT

(SEQ ID NO：31)(Tm：全长：82℃)

完成构建过程的一个实验方案包括首先使用KpnI和BamHI酶切LLO扩增子，将KpnI/BamHI载体插入到pPL2载体中(pPL2-LLO)。然后用XhoI和NotI酶切OVA扩增子，将其插入XhoI/NotI酶切的pPL2-LLO中(注意：pPL2载体不含有任何XhoI位点；pDP-3616含有一个XhoI位点，这在设计OVA反向引物时已经利用上了)。通过限制性酶切分析(KpnI-LLO-XhoI-OVA-NotI)和测序证实构建体pPL2/LLO-OVA。质粒pPL2/LLO-OVA通过转化引入到大肠杆菌中，然后通过接合引入并且整合到利斯特氏菌(DP L4056)中，完全按照Lauer等所描述的(或者引入另一个所需的利斯特氏菌菌株中，例如inlB突变株或者inlB^-actA^-双突变株)。

也可以在实施例8中的美国临时申请(标题为“基于自生的微生物的疫苗组合物”，美国申请号60/511,869，2003年10月15日提交)中找到关于插入表达OVA的抗原表达盒的描述。

表达AH1/OVA或者AH1-A5/OVA的利斯特氏菌菌株的构建。为了制备表达AH1/OVA或者AH1-A5/OVA抗原序列的利斯特氏菌，首先从寡聚核苷酸制备编码抗原的插入物，然后将其连接到载体pPL2-LLO-OVA(如前述制备)中。

在制备AH1或者AH1-A5插入物时使用了以下的寡聚核苷酸：AH1表位插入物(ClaI-PstI相容末端)

上链寡聚核苷酸(AH1 Top)

5′-CGATTCCCCTAGTTATGTTTACCACCAATTTGCTGCA(SEQ ID NO：32)

下链寡聚核苷酸(AH1 Bottom)：

5′-GCAAATTGGTGGTAAACATAACTAGGGGAAT(SEQ ID NO：33)

AH1-A5表位插入物(ClaI-AvaII相容末端)

AH1-A5表位的序列是SPSYAYHQF(SEQ ID NO：21)

(5′-AGT CCA AGT TAT GCA TAT CAT CAA TTT-3′(SEQ ID NO：34)).

上：5′-CGATAGTCCAAGTTATGCATATCATCAATTTGC(SEQ ID NO：35)

下：5′-GTCGCAAATTGATGATATGCATAACTTGGACTAT(SEQ ID NO：36)

对于给定表位的寡聚核苷酸对按照等摩尔的比例混和在一起，95℃加热5分钟。然后使寡聚核苷酸混合物缓慢冷却。然后将退火的寡聚核苷酸对以200∶1的摩尔比与使用相应限制性内切酶酶切的pPL2-LLO/OVA质粒连接。可以通过限制性酶切和/或测序对新构建体进行确证。

然后可以通过转化将质粒引入到大肠杆菌中，再通过接合引入并整合进入利斯特氏菌(DP-L4056)中，完全按照Lauer等人的描述。(或者引入另一个所需的利斯特氏菌菌株中，例如inlB突变株或者inlB^-actA^-双突变株)。

实施例20

接种了单核细胞增生利斯特氏菌的小鼠的体内细胞毒活性评价

进行一系列研究评价免疫接种的小鼠在体内裂解抗原特异的靶细胞的能力。在第一项研究中，使用单核细胞增生利斯特氏菌菌株DP-L4029(actA^-)，表达AH1/A5的DP-L4029以及表达AH1/A5的DP-L4029uvrAB^-，通过静脉内(IV)接种Balb/c小鼠。还根据实施例13中的第二种方法，使用S-59UVA处理表达AH1/A5的菌株。表达AH1-A5的利斯特氏菌构建体还表达LLO和OVA。第0天对所有的组进行接种，对S-59处理的菌株在第1和第2天进行补充接种，接种剂量(0.1 LD₅₀)在表20中指明。对于每个菌株和对照，接种两组各三0只小鼠。收集20只原初Balb/c小鼠的脾脏，用RPMI 1640培养基制备靶细胞群。解离细胞，裂解红细胞。计数白细胞，将其均分为等量的四群。每一组使用一种特异的肽脉冲，或者是靶肽AH1(SPSYVYHQF(SEQ ID NO：20)，来自SynPep，Dublin，CA)，或者是靶肽AH1-A5(SPSYAYHQF(SEQ ID NO：21)，SynPep)，或两组对照群(β-gal，TPHPARIGL(SEQ ID NO：37)，浓度为0.5μg/mL，37℃处理90分钟。然后用培养基漂洗细胞三次，PBS+0.1％BSA漂洗两次。细胞用温热的PBS+0.1％BSA(10毫升或者更少)重悬至1×10⁷每毫升，用于羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE，Molecular Probes，Eugene，OR)的标记。在靶细胞悬液中加入1.25微升的5mM CFSE储液，旋涡振荡混合样品。在对照细胞悬液中，加入10倍稀释的CFSE储液，旋涡振荡混合样品。细胞在37℃孵育10分钟。加入大量(大于40毫升)冰冷的PBS终止染色。细胞在室温下用PBS漂洗两次，然后重悬并且计数。每细胞悬液稀释至50×10⁶每毫升，第6天，每一种细胞群混匀后取100微升通过尾静脉注射原初或者已接受接种的小鼠。对于每一种菌株或者对照，每组3只小鼠注射β-gal和AH-1，或者β-gal和AH1-A5。12-24小时后，收集脾脏，用流式细胞术分析总共5×10⁶个细胞。计数高(靶)和低(对照)荧光峰，用二者的比例得到相对于HBSS对照细胞群的靶细胞裂解百分比。这些结果在表20中以及图23A中给出。(在本实施例中的表格显示了三只小鼠的平均值，而图是所指样品的代表性柱状图，使用的是单只小鼠(不一定是同一只小鼠)。)使用S-59处理的uvrAB^-突变株接种后对AH1显示了略好的应答，而与S-59处理的actA^-菌株相比，S-59处理的uvrAB^-突变株对AH1-A5的应答明显升高。

表20使用S-59处理的菌株在第0天以及第2和第3天接种Balb/c小鼠，小鼠的体内细胞毒性

免疫接种	S-59	免疫接种剂量	靶细胞杀死的百分比
			靶细胞杀死的百分比		AH1	AH1-A5
			HBSSactA^-actA^-AH1-A5actA-uvrAB-AH1-A5actA^-AH1-A5actA^-uvrAB^-AH1-A5	----++	AH1	AH1-A5	100微升5×10⁶5×10⁶5×10⁶每天1×10⁷每天1×10⁷	03.817.933.67.18.7	07.277.285.13.956.1

在第14天对所有的组增加免疫一次，对S-59处理的菌株在第15和16天增加免疫，重复本研究。标记的靶细胞在第20天注射。结果在表21中和图23B中显示。对S-59处理的uvrAB^-突变株的应答可以通过增强免疫而显著提高，而对S-59处理的actA^-菌株则不是这样。

表21使用S-59处理的菌株在第0、14天以及第2、3和15、16天免疫接种Balb/c小鼠，小鼠的体内细胞毒性

免疫接种	S-59	免疫接种剂量	靶细胞杀死的百分比
			靶细胞杀死的百分比		AH1	AH1-A5
			HBSSactA^-actA^-AH1-A5actA^-uvrAB^-AH1-A5actA^-AH1-A5actA^-uvrAB^-AH1-A5	----++	AH1	AH1-A5	100微升5×10⁶5×10⁶5×10⁶每天1×10⁷每天1×10⁷	01.427.452.93.619.2	0-5.996.497.05.784.5

使用actA^-、表达OVA的actA^-以及表达OVA的actA^-uvrAB^-进行相似的研究，对于表达OVA的菌株使用或者不用S-59处理。本研究使用C57B1/6小鼠。在第0天对每组6只小鼠进行免疫接种(对于S-59处理的菌株，还在第1和2天进行接种)，在第6天每组中取3只注射标记的靶细胞。剩余的小鼠在第14天接种(对于S-59处理的菌株还在15和16天接种)并在第20天注射标记的靶细胞。在本研究中，原初靶脾脏细胞用β-gal(低CFSE)或者SL8(高CFSE)进行脉冲。结果在表22和图23C中显示。同样，使用加强免疫显著提高了对S-59处理的uvrAB^-突变株的应答。

表22根据表中所示免疫接种Balb/c小鼠的体内细胞毒性

免疫接种	S-59	免疫接种剂量	靶向细胞杀死的百分比
			靶向细胞杀死的百分比		初次免疫	加强免疫
			HBSSactA^-actA^-OVAactA-uvrAB^-OVAactA^-OVAactA^-uvrAB^-OVA	----++	初次免疫	加强免疫	100微升1×10⁷1×10⁷1×10⁷每天1×10⁸每天1×10⁸	0-6.698.999.5046.5	00.197.198.1084.8

实施例21

对uvrAB删除或者没有uvrAB删除的炭疽芽孢杆菌进行S-59/UVA处理

使用实施例7-9中以及Camilli等人，Molecular Micro.，8：143-147(1993)中详细描述的等位交换方法，改变炭疽芽孢杆菌Sterne菌株。该菌株的毒力被衰减(pXO1⁺，pXO2^-)。

鉴定出了炭疽芽孢杆菌的uvrAB基因(GenBank登录号AE017040，炭疽芽孢杆菌Ames菌株，完整基因组共18部分中的第17部分，uvrAB的编码序列：核苷酸212613-217471)，使用拼接重叠延伸(SOE)PCR以及以下描述的方法构建了基于pKSV7、含有uvrAB基因删除的质粒(pKSV7-dl uvrAB)：

初级PCR反应：将炭疽芽孢杆菌uvrAB基因5′端和3′端上游和下游大约1000bp的序列分别扩增出来。

模板：炭疽芽孢杆菌Sterne基因组DNA

引物对1：uvrB基因5′端上游1000bp的扩增。

(扩增子大小1029bp)

Ba-225099F：5′-CTGTGCTTTGCGAATGGAAAGAAGC(SEQ ID NO：38)(Tm：74℃)

Ba-(3′uvrA-R+)226109R：

5′- GTTTTCATTCATACACTTAGACAAGCGTTGGCTTTTGCACTTC(SEQ ID NO：39)(Tm 120℃)(划线的序列与uvrA羧基端下游的区域互补。)或者Ba-226109R：5′-GACAAGCGTTGGCTTTTGCACTTC(SEQ ID NO：40)(Tm：72℃).

引物对2：uvrA 3′端下游区域的扩增。

(扩增子大小990bp)

Ba-(3′uvrA-R+)230779F：5′- CAAAAGCCAACGCTTGTCTAAGTGTATGAATGAAAACCGAGTGG(SEQ ID NO：41)(Tm：126℃)(划线的序列与uvrB氨基端上游的区域互补。)

或者

Ba-230779F：5′-AAGTGTATGAATGAAAACCGAGTGG(SEQ ID NO：42)(Tm：70℃)

Ba-231769R：5′-CATATAAAGGTTCCACAATTGCCTTTTC(SEQ ID NO：43)(Tm：76℃)

二级PCR反应：初级PCR反应的扩增子通过SOE PCR融合在一起，SOE PCR利用了引物对1中的反向引物和引物对2中的正向引物之间的互补性。结果是uvrAB编码序列226110-230779核苷酸＝4670bps被精确删除。

模板：纯净的初级PCR反应产物

引物对：(扩增子大小1973bp)

Ba-225118F：5′-GAAGCAGAAATGAAGCCAATACTCAATC(SEQ ID NO：44)(Tm：78℃)

Ba-231761R：5′-GGTTCCACAATTGCCTTTTCAATAATC(SEQ ID NO：45)(Tm：74℃)

构建：初级PCR反应(三个温度循环)使用Vent DNA聚合酶(NEB)以及Sterne菌株基因组DNA。用或者不用拼接重叠延伸(SOE)中使用的引物，进行四个初级PCR反应。(如果含有Ba-(3′uvrA-R+)226109R或Ba-(3′uvrA-R+)226109R引物的反应不能产生明显的扩增子产物，则将这些引物用于通过Ba-225099F/Ba-226109R或者Ba-230779F/Ba-231769R引物对扩增出的扩增子。)通过1％的琼脂糖凝胶确证炭疽芽孢杆菌初级扩增子的预期大小(1029bps和990bps)。初级PCR反应产物使用S6层析柱(BioRad)或者GeneClean(BIO 101)纯化。

二级PCR反应使用大致等量的每个初级PCR产物作为模板(约5微升)。二级PCR反应的利斯特氏菌扩增子的预期大小(1973bps)由1％琼脂糖凝胶确证。

炭疽杆菌dl uvrAB扩增子插入到pCR2.1-Blunt II-TOPO载体中。使用KpnI和PstI酶切质粒pCR2.1-TOPO-dl uvrAB，凝胶纯化2033bp的片段。将KpnI/PstI 2033bp的片段插入到用KpnI和PstI酶切，CIAP处理的pKSV7载体中(pKSV7-dl uvrAB)。对pKSV7-dl uvrAB中dl uvrAB序列的保真性进行确证。

使用pKSV7-dl uvrAB质粒，通过等位交换从炭疽芽孢杆菌Sterne中删除uvrAB基因。通过电穿孔将pKSV7-dl uvrAB质粒引入炭疽芽孢杆菌Sterne菌株中，筛选氯霉素抗性。使用一个冷冻步骤进行电穿孔，显著提高电穿孔的机率。炭疽芽孢杆菌培养物在添加0.5％甘油的3毫升BHI培养基中37摄氏度振荡培养过夜。将0.5毫升的培养物转移到添加0.5％甘油的50毫升BHI培养基中(OD₆₀₀＝0.1)，在500毫升的摇瓶中。37摄氏度下200rpm孵育样品。(或者0.1-0.2毫升培养物转移到25毫升BHI 0.5％甘油中，用250毫升摇瓶)。在OD₆₀₀＝0.6-0.8(大约1小时45分钟)，用500毫升一次性的无菌过滤装置收获细菌。细菌用25毫升的冷电穿孔缓冲液(1mM HEPES 10％甘油pH 7.4)漂洗三次。细胞用1/20原来培养物体积的缓冲液重悬(50毫升培养物用2.45毫升电穿孔缓冲液重悬)，置冰上备用。取1微克(1到5微升小提质粒的产物)的“非常纯净的”未甲基化的质粒DNA加入到0.2毫升细胞悬液中，置于0.2厘米具盖电穿孔小杯中(对照＝没有DNA)。然后将样品在冰上放置15分钟。然后在25μFD，200Ω，2.5kV(或者将0.4毫升细胞置于0.4厘米的小杯中400Ω)脉冲。时间常数大约为4-5毫秒。在脉冲后立即加入1毫升的BGGM(含有10％甘油、0.4％葡萄糖和10mM氯化镁的BHI)。细胞转移到无菌的聚丙烯试管中，在37℃下孵育1.5小时，振荡。沉淀细胞，用200微升的BGGM重悬，涂布于选择培养基上。

41℃下pKSV7-dl uvrAB整合进入炭疽芽孢杆菌染色体中。在允许温度下，使pKSV7-dl uvrAB切下并且去除，产生氯霉素敏感的菌落。设计PCR引物来检测染色体上的删除。20％的氯霉素敏感菌落在炭疽芽孢杆菌染色体中带有缺失。对uvrAB^-菌株进行PCR分析，表明其保留了pXO1毒力质粒。

两个uvrAB^-克隆(克隆8和克隆32A)使用S-59处理，同时处理亲本株，将菌株接种于BHI中在37℃下300rpm培养至OD₆₀₀达到0.3，这时将50毫升的菌液转移到一个洁净的摇瓶中，根据表23中所示的浓度加入S-59。这些样品在37℃下300rpm剧烈振荡大约1小时(OD₆₀₀大约1.0，大约1×10⁹/mL)。取出1毫升测量滴度，剩余的培养物转移到150毫米的培养皿中，在6J/cm²(FX-1019)UVA的剂量下辐射，与亲本株相比，产生6log的滴度下降，如下面表23和图24中所示。这证明炭疽芽孢杆菌对于补骨脂素处理的敏感性与在单核细胞增生利斯特氏菌uvrAB^-菌株中观察到的敏感性相似。

表23使用补骨脂素S-59UVA处理对炭疽芽孢杆菌Sterne菌株和uvrAB^-突变株的衰减

细菌log滴度				Log衰减
细菌log滴度				Log衰减			S-59nM	Sterne	uvrAB^-(1)	uvrAB^-(2)	Sterne	uvrAB^-(1)	uvrAB^-(2)
025501002004005001000150025005000	8.26---6.84-5.293.11111	8.137.466.313.1111-1---	8.317.456.283.6811-1---	----1.42-2.975.15＞7.26＞7.26＞7.26	-0.671.825.02＞7.13＞7.13-＞7.13---	-0.862.034.63＞7.31＞7.31-＞7.31---	S-59nM	Sterne	uvrAB^-(1)	uvrAB^-(2)	Sterne	uvrAB^-(1)	uvrAB^-(2)

实施例22

本发明的疫苗在人癌症的体内治疗中的用途

作为治疗或者预防人癌症的一个实例，向个体施用疫苗，该疫苗包含通过微生物感染而荷载并被活化的抗原呈递细胞，该微生物被改变使其增殖受到衰减，其中的微生物基因表达几乎未受影响。可以根据实施例4和5中的实验方案制备微生物，其中通过使用例如实施例8中描述的pPL2整合载体或者其任何修饰产物，或者使用任何对于本领域内人员熟知的方法将任何所需的编码人肿瘤抗原的原核表达盒插入到微生物中。使用例如这里概述的方法对抗原呈递细胞(APCs)进行荷载和活化。

产生的APC疫苗可以以其天然未纯化的形式配制，或者优选地，以纯化的形式配制。它们可以制备为液体悬液。此外，它们可以与添加剂例如防腐剂(例如柳硫汞、2-苯氧基乙醇)、稳定剂(例如乳糖、谷氨酸单钠盐)、佐剂(例如氢氧化铝、磷酸铝、细胞因子)、抗生素(例如新霉素、链霉素)或者其他物质一起配制。可以将制剂重悬或者稀释于于适宜的稀释液中如无菌水、盐水、等渗缓冲盐溶液(例如磷酸盐缓冲pH至生理pH)或者其他适宜的稀释液。

可以通过多种途径施用疫苗，包括口、鼻、静脉内、皮内、腹膜、肌内、淋巴内和皮下途径，以及与给定的恶性或者传染性疾病有关的任何途径。向个体施用有效量的疫苗用于治疗。对于治疗性治疗，有效量是指能够产生所需免疫应答的剂量，其中的免疫应答或者减缓了目标肿瘤的生长、减小了肿瘤大小或者优选地完全根除肿瘤。疫苗的施用可以在适当的间隔重复进行，也可以在接受接种的个体的多个不同的位置同时进行。对于预防性治疗，有效量是指产生保护性免疫应答的剂量，使个体发生癌症的可能性显著降低。免疫程序可以包含单剂、或者在适宜的间隔重复进行直至产生保护性免疫应答。

对于个体的治疗性治疗可以从一个已经被诊断为患有癌症的个体开始，作为一种起始治疗，或者可以与其他治疗联合使用。例如，已经通过外科手术去掉肿瘤的个体或者已经使用放疗或化疗进行治疗的个体可以使用疫苗治疗，以减少或者去除个体中任何残留的肿瘤，或者降低癌症复发的风险。对于个体的预防性治疗可以从由于环境条件或者由于遗传诱因使患有某种癌症的风险升高的个体开始。

实施例23

基于减毒利斯特氏菌株的重组肿瘤抗原分泌疫苗的产生

将鸡卵清蛋白(OVA)与截短形式的利斯特氏菌溶胞素(LLO)融合以促进抗原分泌以及MHC I型加工过程在研究中作为模型抗原以评价挑选出的减毒利斯特氏菌菌株的免疫原性。使用专有的pPL2整合载体，将肿瘤抗原表达盒位点特异地插入到一组减毒利斯特氏菌株染色体上的无害位点中。重组的利斯特氏菌菌株表达和分泌预测的经过改变的LLO-OVA融合蛋白，这由Western印迹分析确定(结果未显示)。这些重组子中的每一个在液体培养基内生长以及细胞内生长的动力学与其亲本都没有差异。而且，重组的表达OVA的菌株，其静脉内注射的IVLD₅₀与未改变的亲本菌株相比，变化在两倍以内(表24)。

表24所选择的单核细胞增生利斯特氏菌菌株

菌株	基因型	表型	亲本株的LD₅₀	表达OVA菌株的LD₅₀	衰减倍数/亲本株
菌株	基因型	表型	亲本株的LD₅₀	表达OVA菌株的LD₅₀	衰减倍数/亲本株	DP-L4056	10403S噬菌体去除	野生型	5×10⁴	1×10⁵	2
DP-L4029	ΔactA	按读码框删除actA基因(actA)；菌株在细胞内生长；但是不从细胞扩散至细胞	1×10⁸	1×10⁸	1	DP-L4056	10403S噬菌体去除	野生型	5×10⁴	1×10⁵	2
DP-L4029	ΔactA	按读码框删除actA基因(actA)；菌株在细胞内生长；但是不从细胞扩散至细胞	1×10⁸	1×10⁸	1	L4029-uvrAB	ΔactA；ΔuvrAB	按读码框删除actA基因(actA)和uvrAB(uvrAB)基因；菌株在细胞内生长；但是不从细胞扩散至细胞；对DNA损伤例如由补骨脂素诱导的DNA交联的易感性增加	1×10⁸	1×10⁸	1

整合载体促进多重组利斯特氏菌疫苗候选物的快速产生。可以同时将单一构建体配成任何数目的独特遗传背景以快速产生同源菌株。

实施例24

补骨脂素诱导的DNA交联产生不能存活但是代谢活跃的利斯特氏菌。

为了保证基于利斯特氏菌的离体抗原传输平台的安全性，除了使用遗传衰减的利斯特氏菌以外，发明者还对利斯特氏菌株进行改造，使其可以被补骨脂素的处理完全灭活，而仍然代谢活跃，这样就保留了其感染细胞、逃脱吞噬细胞溶酶体以及促进编码抗原通过I类途径呈递的能力。改造后的利斯特氏菌株对补骨脂素的灭活极为敏感，补骨脂素是一组化合物，在使用UVA照射后，它们在细菌的基因组中形成不可逆的交联，这样细菌不能增殖。不能修复补骨脂素介导的DNA损伤的利斯特氏菌突变株通过删除紫外线抗性(uvr)AB基因(uvrAB)产生，uvrAB对于利斯特氏菌和其他细菌的核苷酸切除修复是必需的(Sancar等，Ann.Rev.Biochem.，57：29-67(1988))。补骨脂素S-59是在被称为Helinx的DNA交联技术(Lin，L.，Psoralenphotochemical treatment of platelets，Science and Medicine，1998；Hei等人，Transfusion，39：239-48(1999))中使用的众多Cerus化合物中的一种。在使利斯特氏菌uvrAB删除突变株灭活到检测限度以下的补骨脂素浓度下，亲本未突变菌株的DNA修复机制保持完好，它对UVA光灭活的敏感性要低4个log以上(图25B)。S-59/UVA灭活的利斯特氏菌uvrAB保持了其线粒体活性(这由MTT检测确定)并且保持了它们表达它们整个基因组成分的能力(这由³⁵S甲硫氨酸标记的脉冲追踪实验确定)(图26和图10)。S-59/UVA灭活的利斯特氏菌uvrAB连续表达它们基因组的全部成分，而灭活的亲本株不能。灭活亲本株的表达水平显著减弱，表明用完全灭活所需的S-59浓度的S-59/UVA处理，显著降低了利斯特氏菌基因产物的表达，包括编码的肿瘤抗原表达也可能降低。

实施例25

不能存活的利斯特氏菌uvrAB菌株保留了感染DC和逃脱吞噬溶酶体的能力。

除了保存代谢能力，重要的是证明S-59/UVA灭活的利斯特氏菌uvrAB菌株在感染树突细胞(DC)后使抗原有效荷载进入MHC I类途径。发明者现在已经证明使用利斯特氏菌突变株(DP-L4027)(由于编码LLO的hly基因的删除，该菌株不能逃脱吞噬溶酶体)感染DC，已经不能在MHC I类分子的存在下呈递抗原。

为了证明利斯特氏菌uvrAB感染的DC逃脱吞噬溶酶体，发明者利用了细胞质中的利斯特氏菌被宿主细胞的肌动蛋白丝，即所谓的“肌动蛋白云”包围的事实，“肌动蛋白云”可以通过荧光显微术看到。在利斯特氏菌表面的肌动蛋白聚合由细菌的ActA蛋白以及其他的宿主细胞因子介导。使用野生型利斯特氏菌、S-59/UVA灭活的利斯特氏菌uvrAB、以及利斯特氏菌ΔLLO(DP-L4027)感染小鼠的DC细胞系DC2.4，感染复数(MOI)为1，37℃感染30分钟。小心漂洗几次将细胞外的细菌除去，将DC在37℃下继续孵育5小时，加入庆大霉素防止细胞外细菌的生长。使用野生型利斯特氏菌或者完全灭活的利斯特氏菌uvrAB感染的DC2.4细胞，显示典型的肌动蛋白云或者肌动蛋白彗状尾，这是利斯特氏菌位于细胞质内的典型特点(图27)。但是，在感染了利斯特氏菌LLO缺失突变体的DC2.4细胞中，不能看到肌动蛋白和利斯特氏菌共定位，表明细菌不能逃脱吞噬溶酶体。这一结果证明这些DNA修复突变株保留了逃脱吞噬溶酶体、并且进入到被感染细胞的胞浆中的能力，在胞浆中抗原可以被分泌，这是通过MHC I类途径进行直接抗原呈递所需的步骤。还请参见上面的实施例17以及图21。

实施例26

不能存活的利斯特氏菌uvrAB有效荷载抗原进入被感染树突细胞(DC)的MHC I类途径

由于在感染细胞内，S-59补骨脂素灭活的利斯特氏菌uvrAB菌株具有逃脱吞噬溶酶体的独特能力，位于胞浆的利斯特氏菌分泌的基因产物被加工并且通过MHC I类途径呈递。为了检测S-59/UVA灭活的利斯特氏菌uvrAB荷载抗原进入DC细胞的MHC I类途径中的能力，使用表达OVA的利斯特氏菌株L4029uvrAB OVA感染DC2.4细胞，感染复数(MOI)为1，利斯特氏菌株L4029uvrAB OVA使用不同浓度的S-59灭活。亲本利斯特OVA菌株以及热杀死的利斯特uvrAB OVA菌株作为对照。利斯特氏菌被胞吞之后，OVA肽被DC2.4细胞在I类分子上的呈递，通过与B3Z细胞共同孵育进行测量。B3Z细胞是可被LacZ诱导的CD8⁺T细胞杂交瘤，它对于小鼠K^bI类分子上具有的OVA_257-264(SL8)表位是特异的(Sanderson，Int.Immunol.，6：369-76(1994))。SL8向B3Z细胞的I类限制呈递导致β-gal被B3Z诱导合成。可以通过生色底物CPRG的水解来测量产生的β-gal的量，这指示了在抗原呈递细胞表面的SL8/K^b复合物的量。如图9A和9B所示，S-59/UVA灭活的利斯特氏菌uvrAB OVA菌株，而非其来源的亲本株，保持了荷载抗原进入MHC I类途径中的能力，这与其增殖的能力无关。(这与实施例11中描述的数据相同)。即使使用70-100nM的S-59进行完全灭活，仍然保留了90％以上的B3Z活化。相反，DNA修复保持完好的亲本利斯特氏菌OVA菌株，在使用较高浓度的S-59灭活时，丧失了其活化B3Z T细胞杂交瘤的能力。与利斯特氏菌uvrAB OVA菌株相反，B3Z的活化以及亲本利斯特氏菌OVA菌株在BHI琼脂平板上形成菌落的能力是紧密相关的，提示只有能够存活的利斯特氏菌OVA才能感染DC2.4细胞并且荷载抗原进入MHC I类途径中。另外，热杀死的利斯特氏菌uvrAB OVA不能使B3Z活化。该结果证明，使用S-59/UVA灭活、经过改变抑制其修复由补骨脂素介导DNA损伤的能力的利斯特氏菌，利斯特氏菌荷载抗原进入MHC I类途径中的能力可以与对于增殖的需要无关。

为了检测利斯特氏菌uvrAB OVA荷载抗原进入初级DC细胞MHC I类途径中的能力，使用完全灭活的S-59/UVA处理的利斯特氏菌uvrABOVA感染未成熟的小鼠BM-DC细胞。可存活的利斯特氏菌uvrAB OVA，亲本株以及L4027株作为对照。如图28中所示，感染表达OVA的菌株但不是亲本株的BM-DC，在体外刺激B3Z细胞。在活的和不能存活的S-59/UVA处理的利斯特氏菌uvrAB突变株(L4029uvrAB OVA)之间未观察到显著区别，这提示在细菌逃脱吞噬溶酶体进入胞浆以后，初级DC的MHC I类分子被有效地荷载了来自利斯特氏菌的肽，尽管利斯特氏菌uvrAB株无增殖能力。重要的是，热杀死灭活的利斯特氏菌actAOVA不能产生任何明显的OVA肽在MHC I类途径中的呈递，这提示DC细胞与热杀死的细菌共同孵育不会使MHC I类分子出现任何明显的抗原荷载。

实施例27

利斯特氏菌直接感染并且活化人DC细胞

为了开发出有效的抗原传输平台，广泛认为除了有效地将抗原传输进入MHC I类途径中以外，还需要DC的活化/成熟。原位的未成熟DC细胞位于外围组织中，在那里它们不断地摄取并且加工抗原，但是只有遇到了一种活化刺激，例如由细菌提供的活化刺激，才使活化/成熟过程开始，引起化学因子受体的调节和DC细胞迁移到流入淋巴结的T细胞区域。我们分析了野生型利斯特氏菌(L4056)诱导人单核细胞衍生的DC细胞表型成熟和产生细胞因子的能力。如图29所示，人未成熟的DC遇到利斯特氏菌使活化标记CD86和HLA-DR上调(图29A)，也使成熟标记CD83上调(图29B)。此外，人未成熟DC细胞与利斯特氏菌接触，提高了它们的免疫刺激能力，这可以由它们分泌高水平促炎细胞因子(例如IL-12p70和TNF-α)的能力显示出来(图29C)。

实施例28

S-59/UVA灭活的利斯特氏菌uvrAB OVA在体外诱导OVA特异的免疫性

我们测定了S-59/UVA灭活的利斯特氏菌uvrAB OVA疫苗在体内诱导OVA特异的免疫性的能力。1×10⁸个S-59/UVA灭活的利斯特氏菌uvrAB OVA通过静脉内接种雌性C57BL/6小鼠。免疫后7天检测OVA特异的免疫性的诱导。引人注目的是，接种S-59/UVA灭活的利斯特氏菌uvrAB OVA的小鼠出现非常显著的OVA特异的CD8⁺T细胞应答，而接种亲本利斯特OVA菌株的小鼠没有出现应答，如图30所示。此外，使用热杀死的利斯特氏菌uvrAB OVA免疫接种小鼠不能诱导产生OVA特异的免疫性。

实施例29

两个表达全长CEA(含有天然的(CAP1)或者增强激动剂细胞毒T淋巴细胞表位(CAP1-6D))的重组减毒利斯特actA/uvrAB菌株的构建

CEA是一个180kDa大的蛋白质，在内胚层衍生的消化系统上皮和胚胎结肠的腺癌中发现。CEA通过一个GPI锚定物附着在细胞膜上。该蛋白含有7个类似免疫球蛋白的结构域，在C端具有与非特异性交叉反应蛋白NCA的同源性，NCA是癌胚抗原基因家族的一个成员。我们提议构建全长的CEA，其中含有HLA^*A0201-限制性-CEA天然T细胞表位CAP1(YLSGA NLNL)(SEQ ID NO：51)或者增强的激动剂细胞毒T淋巴细胞肽CAP1-6D(YLSGA DLNL)(SEQ ID NO：52)(Zaremba等人，Cancer Res.，57：4570-7(1997))，其已经证明在癌症患者中有更强的诱导CEA特异的免疫性的能力(表25)(Fong等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，98：8809-14(2001))。

表25

	质粒	抗原	T细胞表位
	质粒	抗原	T细胞表位	12	pPL2CEA wtpPL2CEA-610D	全长的CEA全长的CEA	CAP1CAP1-6D

CEA肿瘤抗原表达质粒在pPL2主链上构建，pPL2能位点特异地整合到利斯特基因组中(Lauer等人，J.Bacteriol.，184：4177-86(2002))。构建两个质粒，使来自利斯特氏菌LLO的分泌信号和PEST元件与全长的CEA cDNA形成基因融合。从基因构建体的5′端开始，融合蛋白由LLO的N末端区域组成，以促进细菌分泌信号与CEA的融合。通过重叠PCR使结构域之间精确连接。所有质粒构建体的保真性通过DNA测序确证。

实施例30

包含pPL2CEAwt和pPL2CEA-610D整合到利斯特氏菌株L4029uvrAB(ΔactA，ΔuvrAB)中的两个减毒的重组利斯特氏菌株的产生，以及CEA抗原表达和分泌的确证

根据以前Lauer等人，J.Bacteriol.，184：4177-86(2002)的描述将pPL2-CEA构建体整合到利斯特氏菌L4029uvrAB突变株基因组中的tRNA^Arg基因旁边。简而言之，首先通过转化将质粒引入大肠杆菌SM10菌株中，然后再通过接合将质粒引入到所需的利斯特氏菌株中。利斯特氏菌的转化接合子使用氯霉素(pPL2)和链霉素(利斯特氏菌株)选择培养基筛选；该过程的效率大约是1×10^-4。为了保证转化接合子的纯度，以及保证pPL2主链整合到细菌染色体中，挑选有限的候选菌落，划线到新鲜的选择培养基上，连续传3次，通过菌落PCR确证CEA构建体精确整合进入利斯特基因组中。

对全细胞裂解物以及TCA沉淀的细菌培养物液体部分进行Western印迹分析，确定LLO-CEA融合蛋白的抗原表达和分泌。使用LLO特异的兔多克隆抗体和CEA特异的单克隆抗体确证重组利斯特氏菌表达和分泌LLO-CEA融合蛋白。可以比较表达CEA的重组利斯特氏菌菌株以及它们的亲本菌株的生物学性质。将稳定生长期的培养物1∶100稀释于新鲜培养基接种之后测定脑心浸液(BHI)培养基中的生长动力学。以前我们曾经在利斯特氏菌中表达过类似大小或者更大的蛋白质。但是在细菌中哺乳动物基因产物的重组蛋白表达可能产生问题，这取决于每一个特定的蛋白。如果利斯特氏菌中CEA的表达产生问题，则可以构建表达CEA片段或者T细胞小表位(mini-epitope)的利斯特氏菌株。HLA^*A0201-限制性-CEA天然T细胞表位CAP1(YLSGA NLNL)(SEQ ID NO：51)或者增强的激动剂细胞毒T淋巴细胞肽CAP1-6D(YLSGA DLNL)(SEQ ID NO：52)与已经构建的表达构建体中的卵清蛋白(OVA)形成读码框融合，这样来自利斯特氏菌LLO的分泌信号和PEST元件与OVA形成基因融合。T细胞小表位的表达和免疫原性是保守的，如以前使用gp70T细胞小表位，AH1和AH1-A5以及B16Trp1，Trp2，和gp100所证明的(数据未显示)。

实施例31

通过S-59/UVA处理使利斯特氏菌actA/uvrAB CEA完全失活，同时仍然保留最佳的代谢活性、肿瘤抗原表达、对抗原呈递细胞的感染以及逃脱吞噬溶酶体的条件的建立

使用最少量的交联最好地保持了由于基因表达的代谢活性。完全灭活利斯特氏菌actA/uvrAB CEA疫苗，而使抗原表达水平保持完好的最小量的S-59/UVA处理条件可以容易地建立。灭活条件的一个实例是在OD₆₀₀＝0.5的对数期培养物中加入S-59补骨脂素至200nM，然后在培养物的光密度达到1时使用6J/m²的UVA进行灭活。通过改变S-59的浓度、UVA剂量、UVA处理之前S-59的处理时间以及在利斯特氏菌actA/uvrAB CEA菌株生长过程中进行处理的时刻，优化灭活的条件。亲本利斯特氏菌株作为对照。根据细菌无法在BHI琼脂平板上形成菌落来确定利斯特氏菌的灭活(log杀死)。此外，可以使用³⁵S脉冲追踪实验确证S-59/UVA灭活的利斯特氏菌表达CEA以及毒力因子如LLO和p60，从而测定在S-59/UVA灭活后新表达的蛋白的合成和分泌。使用³⁵S代谢标记表达LLO和p60可以根据常规进行。S-59/UVA灭活的利斯特氏菌actA/uvrAB CEA在³⁵S甲硫氨酸存在的条件下孵育1小时。确定全细胞裂解物、TCA沉淀的细菌培养物液体中LLO-CEA融合蛋白、内源LLO以及p60的抗原表达和分泌。使用LLO-、p60-以及CEA-特异的单克隆抗体进行免疫沉淀，以确证重组利斯特氏菌在灭活后持续的表达和分泌。S-59/UVA灭活的利斯特氏菌actA/uvrAB CEA的表达水平与我们现在的诱导有效抗原特异T细胞应答的利斯特氏菌OVA疫苗株进行比较。人们可以选择S-59/UVA条件，在该条件下能够出现可重复的完全灭活，而对所分析的基因产物的表达水平只有有限的影响。

实施例32

建立使用灭活(S-59/UVA)利斯特氏菌actA/uvrAB CEA疫苗感染人未成熟树突细胞(DC)(结果是在MHC I类分子的情况下出现有效的CEA呈递)的实验方案以及疫苗株。

根据三次独立试验的结果，确定离体感染DC的最佳条件：(1)人未成熟DC在感染后的表型和细胞因子特征的改变；(2)被利斯特氏菌感染的DC诱导同种异型T淋巴细胞应答的能力；以及(3)利斯特氏菌actA/uvrAB CEA感染的DC在体外刺激CEA特异的HLA^*A0201-限制的T细胞系的效力。

1.确定和比较使用活的和完全灭活的利斯特氏菌CEA菌株感染的人未成熟DC细胞表型和细胞因子分泌特征。使用通常使用的活化信号例如LPS，TNF-α和α-CD40比较被利斯特氏菌感染的人DC的活化。

可以鉴别和优化S-59/UVA灭活的利斯特氏菌actA/uvrAB CEA菌株感染和活化初级人DC的效率。根据以前的描述，从未动员的(unmobilized)外周血液富集人DC细胞(Fong等人，J.Virol.，76：11033-41(2002)。简而言之，在Ficoll-Hypaque(Pharmacia，Uppsala，Sweden)中进行离心获得PBMC，然后根据Mayordomo等人，Nat.Med.，1：1297-302(1995)，使用Percoll(Pharmacia)密度离心完全去除单核细胞。完全去除单核细胞的PBMC在添加了10％混和人AB血清且没有添加外源细胞因子的RPMI 1640(BioWhittaker，Walkersville，MD)中孵育。在37℃潮湿的含10％二氧化碳的孵箱内培养24小时后，通过使用15％(w/v)的三碘苯甲酰氨基葡萄糖(Sigma，St.Louis，MO)密度梯度离心从淋巴细胞中进一步富集DC。富集的DC细胞群的表型通过流式细胞术(有HLA-DR表达，没有CD3，CD14，CD19和CD56的表达)和葡聚糖的摄取进行确证。为了检测利斯特氏菌对DC的感染性，在不同MOI下DC与S-59/UVA灭活的利斯特氏菌actA/uvrAB CEA菌株共同孵育1小时。使用活的利斯特氏菌作为对照。在充分漂洗除去任何细胞外的利斯特氏菌以后，感染的DC在50μg/ml庆大霉素存在下进一步孵育，以杀死细胞外的细菌。通过使用流式细胞术在感染后的不同时刻确定细胞表面CD80，CD83，CD86和MHC II类分子的表达情况，对利斯特氏菌ΔactAΔuvrAB CEA菌株感染DC细胞后的表型改变进行测定。使用细胞计数珠阵列试剂盒(Pharmingen)对感染的DC细胞培养物上清中辅助性T细胞1和辅助性T细胞2类型细胞因子的表达进行测定。感染和活化的条件与通常使用的刺激物例如LPS、TNF-α和α-CD40比较。选出的感染条件导致人DC在体外有效的和持续的刺激和活化以及细胞因子的分泌，这些性质要与活的亲本利斯特氏菌株诱导的结果非常相似。如果在不使用细胞因子时从外周血液中分离的DC的整体感染性低，则可以检测在密度梯度离心之前的DC感染。另外，将评价其他的DC来源例如单核细胞衍生的DC对不能存活的和活的利斯特氏菌的感染性。简而言之，使用负筛选富集人单核细胞，用培养基(RPMI-1640+10％FCS)悬浮至1×10⁶细胞/毫升，添加1000U/mlGM-CSF和1000U/mlIL-4。6-7天的培养之后，使用流式细胞术和葡聚糖摄取对体外培养的DC细胞群的表型进行确认。如以前所述对单核细胞衍生的DC在利斯特氏菌感染之后的表型改变以及细胞因子的分泌特征进行测定。

2.确定和比较使用活的或者完全灭活的利斯特氏菌CEA菌株感染的人未成熟DC细胞，在体外活化同种异型T细胞的刺激能力

为了检测利斯特氏菌感染的DC细胞群的刺激能力，可以用混和白细胞反应(MLR)确定它们刺激初级同种异体反应性T细胞的能力。广泛认为APC诱发体内免疫应答的相对效力(它取决于APC的活化/成熟状态)反映在它们在体外刺激一种同种异型T细胞应答的能力上(Jung等人，Immunity，17：211(2002))。简而言之，分离DC并且用完全灭活的利斯特氏菌actA/uvrAB CEA使其感染。被感染细胞群的表型通过流式细胞术进行确认。不同数目的经过辐射的(3000rad)DC与5×10⁴个同种异型底平效应器细胞在96孔U型底平板(Costar，Cambridge，MA)中共同培养。来自随机供体的PBMC作为效应器细胞。6天后，培养物用1μCi的[³H]胸腺嘧啶脉冲18小时。将细胞收获到玻璃纤维纸上，通过用液闪计数器测量放射性来测定[³H]胸腺嘧啶的掺入。比较感染了不能存活的利斯特氏菌的DC和感染了活利斯特氏菌的DC以及使用刺激物例如LPS、TNF-α和α-CD40活化的DC的刺激能力。

3.评价利斯特氏菌感染的人DC细胞在体外活化CEA特异的HLA^*A0201限制性T细胞系的效力。比较感染了活的或者完全灭活的利斯特氏菌的未成熟人DC与肽脉冲的DC。

DC的表型改变、细胞因子分泌特征以及同种异型刺激能力是对DC在体内刺激抗原特异的T细胞应答的能力的间接量度。DC呈递由完全灭活的利斯特氏菌actA/uvrAB CEA菌株表达的重组肿瘤抗原的能力是根据CEA特异的HLA^*A0201限制性T细胞系的活化进行评价的(该细胞系由L.Fong制备，未发表的数据)。简而言之，根据Milestone3-1中的描述，从HLA^*A0201阳性的供体的外周血液中分离DC。不同数目的经过辐射的(3000rad)DC与5×10⁴个CEA特异的HLA^*A0201限制性T细胞在96孔U型底平板(Costar，Cambridge，MA)中共同培养。24小时后收集细胞上清。根据IFN-γ，GM-CSF或者IL-2的分泌测量T细胞的活化。使用商品化的细胞计数珠阵列试剂盒(Pharmingen)测定分泌的细胞因子。比较感染了不能存活的利斯特氏菌的DC和感染了活利斯特氏菌的DC以及使用刺激物例如LPS、TNF-α和α-CD40活化的DC的刺激能力。

实施例33

利斯特氏菌荷载的初级人DC在体外致敏CEA特异的免疫性能力的确证以及选择用于进一步开发的首要(lead)利斯特氏菌株

为了确证S-59/UVA灭活的利斯特氏菌感染的DC能够在体外致敏CEA-特异的原初CD8⁺T细胞应答，使用在已经确立的最佳条件下用利斯特氏菌actA/uvrAB CEA菌株感染的人未成熟DC，在体外刺激原初T细胞。含有天然或者改变的T细胞表位的首要利斯特氏菌actA/uvrABCEA菌株的选择是根据其诱导原初CEA-特异的T细胞应答的能力，这是由三种互相独立的检测测定的：(1)[³H]胸腺嘧啶掺入到接触过DC的T细胞培养中；(2)被致敏的CEA特异的T细胞培养物的细胞毒活性，通过⁵¹Cr释放试验进行测量；以及(3)CEA特异的T细胞的频率，由肽：MHC四聚体染色测定。通过DC的表型改变来确证最佳的感染，表型改变通过使用流式细胞术，测定CD80，CD83，CD86，以及MHC II类分子的细胞表面表达以及通过检测由被感染的DC分泌的细胞因子的特征来测定。对于初级T细胞应答的诱导，恒定数目的CD45RA⁺T淋巴细胞(2×10⁵/孔)与不同数目的经过辐射的(3,000R)荷载利斯特氏菌的DC在96孔圆底微量滴定板中共同孵育7天。6天后使用1μCi的[³H]胸腺嘧啶脉冲培养物18小时。将细胞收获到玻璃纤维纸上，通过用液闪计数器(Wallac，Turku，Finland)测量放射性来确定[³H]胸腺嘧啶的掺入。此外，通过细胞毒T细胞测定来检测CEA特异的T细胞的诱导。简而言之，5×10⁶ CD45RA⁺T淋巴细胞与经过辐射的(3,000R)利斯特氏菌荷载的DC同时培养，比例是10∶1，使用24孔板(Costar)，培养密度为5×10⁶细胞/1.5毫升培养基。7天后通过标准的4小时⁵¹Cr释放试验评价T细胞的细胞毒活性。简而言之，靶细胞系SW403，SW1417，A375和T2与250μCi的[⁵¹Cr]共同孵育2小时。在标记步骤中，T2细胞还在HLA^*0201限制性目标肽CAP1和CAP1-6D存在或者不存在的情况下孵育。使用RPMI漂洗靶细胞系三次，将靶细胞以每孔5000的密度一式三份加入96孔U型底板(Costar)中。在描述的效应细胞/靶细胞的比例下，将效应细胞与⁵¹Cr标记的靶细胞共同孵育。4小时培养后，收获上清，在Microbeta计数器(Wallac，Turku，Finland)中计数。百分比特异裂解的计算按照如下的公式：100％×(试验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)。根据靶细胞在含有0.5％Triton X-100(Sigma)的PBS中的裂解测定最大释放。最后，可以确定使用呈递CAP1或者CAP1-6D的MHC/四聚体在体外接触后CEA特异的T细胞频率，方法在以前有所描述(Fong等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，98：8809-14(2001))。在分析体外致敏的T细胞培养物的同时，分析体外致敏前获得的冷冻保存的CD45RA⁺T细胞。用相应的HLA*A0201藻红素标记的MHC/四聚体对总计1×10⁶个细胞进行染色，室温进行30分钟。CD8的抗体(用作阳性门控)以及CD4，CD14，CD19和CD56的抗体(阴性门控)按照推荐的浓度加入，4摄氏度孵育30分钟。染色后，样品漂洗两次，使用四色流式细胞术分析。我们在以前曾获得四聚体染色的背景。使用同样的方法测定了20名志愿献血者，结果是对于CEA_605-613和610D四聚体分别为0.30％±0.18％和0.27％±0.14％(Fong等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，98：8809-14(2001))。

实施例34

使用蛋白酶3或者PR1作为异源抗原

尽管以上特别的实施例中概述的一些方法描述了使用CEA抗原作为改变的利斯特氏菌表达的抗原，本领域内的普通技术人员可以容易地认识到可以使用相似的方法制备表达不同抗原(例如蛋白酶3或者蛋白酶3衍生的抗原)的改变的利斯特氏菌，用来在体外或者离体感染树突细胞，以达到荷载和活化/成熟的目的。本领域内的普通技术人员还会认识到产生的DC疫苗可能可以施用给动物或者病人，以诱导针对蛋白酶3和/或PR1的免疫应答。

例如，可以使用包含编码蛋白酶3基因和/或PR1表位的pPL2载体骨架等，将抗原表达序列整合到以上实施例中描述的L4029-uvrAB利斯特氏菌株的基因组中，使其改变。在一个实例中，PR1抗原可以作为融合蛋白的一部分(例如LLO-OVA/PR1融合蛋白，该蛋白包含截短的LLO序列与OVA融合，其中嵌入了PR1表位)表达。这种可以被改变的利斯特氏菌表达的抗原性蛋白(LLO-OVA/PR3)的序列在图31中给出。

实施例35

突变体利斯特氏菌逃脱吞噬溶酶体以及促进I类抗原呈递能力的测量

以下给出的示例性实验方案，用于评价一个特定候选利斯特氏菌突变株逃脱抗原呈递细胞吞噬溶酶体并促进I类抗原被细胞呈递的能力：首先在盖玻片上培养DC2.4细胞。然后用所需的利斯特氏菌株感染细胞(MOI＝100)。感染后0.5小时(0.5hpi)，润洗细胞，洗掉没有感染的利斯特氏菌。1hpi时，加入50微克每毫升的庆大霉素。5hpi时，漂洗盖玻片，在3.5％甲醛中固定。封闭后，用兔抗利斯特氏菌抗体(Difco)染色，用山羊抗兔FITC二抗(Vector Labs)检测。用罗丹明-鬼笔环肽(MoleGular Probes)检测肌动蛋白。将盖玻片装在Vectamount+DAPI(Vector Labs)上面，进行检查。还请参见上面的实施例17和实施例25。

实施例36

来源于人单核细胞的树突细胞的制备以及用利斯特氏菌疫苗的感染

以下给出一个示例性实验方案，概述了来源于人单核细胞的树突细胞的制备以及用利斯特氏菌疫苗的感染：

材料：人外周血(优选为来自供血者的血沉棕黄色层)；Ficoll-Hypaque(Amersham)；无钙镁的dPBS(MediaTech)；添加L谷氨酰胺的RPMI-1640(MediaTech)；胎牛血清，精纯并热灭活的(HyClone)；人GM-CSF(R&D Systems)储液，浓度为500U/微升，储存于-20℃；人IL-4(R&D Systems)储液，浓度为200U/微升，储存于-20℃；Costar24孔板(Fisher)。

单核细胞分离培养基(MIM)：50毫升的NaCl溶液(500mL dH₂O，43.84g NaCl(1.5M))加入到450mL Percoll中混匀，制成溶液1(等渗Percoll)。将1000mL dH₂O，205.6mg NaH₂PO₄*2H₂O(1.49mM)，1.30g Na₂HPO₄(9.15mM))，8.18g NaCl(139.97mM)，和3.82gC₆H₅Na₃O₇*2H₂O(13mM)混和，调节pH至7.2，制成溶液2(PBS/柠檬酸)。然后将250mL等渗Percoll与250mL PBS/柠檬酸混和。溶液过滤除菌，4℃储存。

培养基：RPMI-1640w.GlutaMax(Gibco)+10％胎牛血清(使用HyClone的精纯、热灭活的FCS)。

方法：Ficoll和MIM预热至室温。每个250ml conical管中加入20毫升Ficoll。用dPBS将血液稀释2倍，混匀。将25毫升血液加在每管中Ficoll的上面成为一层。18-20℃下400g离心试管30分钟。

将单核界面从离心产生的梯度中小心收集出来，放入洁净的50毫升试管中，补充dPBS至满。100g离心试管15分钟。沉淀是淋巴细胞和单核细胞，血小板仍然悬浮。将上清虹吸去掉。再重复上述的补充dPBS至满、离心和虹吸的步骤两次，共漂洗三次。

沉淀用20毫升dPBS重悬。悬液加在20毫升的MIM上面形成一层。样品在室温下400g离心35分钟。从交界面中收获单核细胞，转移到含有培养基的洁净试管中。如果培养DC的目的是感染细菌，则不要使用抗生素。

样品在400g离心10分钟，吸去掉上清。沉淀用dPBS漂洗4次。最后一次漂洗以后，细胞沉淀用RPMI-1640+10％FCS重悬。然后将样品置于血细胞计数器上，使用台盼蓝或者自动计数器计数。将细胞悬液稀释至1×10⁶个细胞每毫升。每毫升的细胞悬液中加入500U GM-CSF和200U IL-4(如果根据上面的描述制备储液，则每毫升细胞悬液加1微升储液)。每孔取1毫升加入到Costar 24孔板中。板在37℃、5％二氧化碳、100％相对湿度下放置48小时。

第二天，制备树突细胞的饲养培养基。对于每个培养孔，饲养培养基由0.5毫升培养基(使用前预热至37℃)添加500U/mL GM-CSF和200U/mLIL-4组成。从每一个培养孔的上层吸出0.5毫升，用0.5毫升的新鲜饲养培养基替代。将培养板置于37℃、5％二氧化碳、100％相对湿度下再放置48小时。在第4天重复补饲。第五天细胞就可以使用了。细胞必须永远保存在含有GM-CSF和IL-4的培养基中，否则它们就会回复为巨噬细胞。在细胞计数器上检查树突细胞的表型，检查它们的HLA-DR、CD1a、CD83和CD86。

利斯特氏菌对人DC的感染：

第5天，沉淀树突细胞(DC)，用含有GM-CSF和IL-4的培养基重悬至每毫升2×10⁶个细胞。在24孔培养板的每孔中加入500微升的悬液。500微升中加入成熟刺激物或者细菌。使用1微克LPS作为成熟刺激物对照。(可以加入1000U的IFN-γ或者1微克的sCD40L，增强该应答)。对于利斯特氏菌的感染，每个DC细胞使用10-100个利斯特氏菌。感染细胞1小时，然后洗掉细胞外的细菌，将细胞重悬于含50微克每毫升庆大霉素的培养基中。可以加入sCD40L提高DC的存活，促进更大量的IL-12p70的释放。可以加入1000U/mL IFN-γ促进成熟与IL-12p70的分泌。在细胞计数器上检查树突细胞的表型，检查它们的HLA-DR、CD1a、CD83和CD86。

实施例37

不产芽孢的炭疽芽孢杆菌疫苗菌株

spoIIE按读码框删除。炭疽芽孢杆菌的spoIIE区域是通过与枯草芽孢杆菌中的相同基因的同源性而鉴定出来的。为了分离出炭疽芽孢杆菌SpoIIE按读码框删除株，首先用PCR将spoIIE基因扩增，克隆到pCR-Blunt-II-TOPO(Invitrogen)中。然后通过重叠延伸(SOE)(Horton等人，Biotechniques 8：528-35(1990))使用基因拼接技术将大部分的spoIIE基因删除。这个按读码框删除的sopIIE基因克隆到穿梭载体pKSV7中，该载体携带氯霉素抗性基因，不能在42℃复制(Smith等人，Biochimie，74：705-11(1992))。含有删除spoIIE基因的pKSV7通过电穿孔进入炭疽芽孢杆菌，细胞在42℃有氯霉素的条件下生长，筛选质粒通过同源重组整合到spoIIE基因中的菌株。然后在30℃没有氯霉素选择的条件下培养，使质粒切除并丧失。应该发现约有1％的氯霉素敏感菌株，其中大约有一半应该含有删除的spoIIE等位基因(Camilli等人，(1993))。通过PCR和Southern印迹分析确证删除的存在。

spoIIE/uvrAB双删除菌株。从spoIIE删除菌株开始，再进行按读码框的uvrA和uvrB基因删除。同样，扩增出目标基因，克隆到pCR-Blunt II-TOPO中。然后我们使用SOE技术将大部分的uvrA和uvrB基因删除。按读码框删除的uvrAB区域克隆到pKSV7中，将该构建体电穿孔转移到炭疽芽孢杆菌spoIIE删除菌株中。在42℃筛选氯霉素抗性，用来选择质粒整合进入uvrAB区域。30℃没有药物选择的条件下培养，促进丧失了该质粒的分离子的生长。挑取氯霉素敏感菌落，通过PCR检测uvrAB区域的丢失，用Southern印迹分析对丢失进行确证。

实施例38

温度敏感的炭疽芽孢杆菌recA突变株

为了产生在30℃下生长良好而在42℃时对补骨脂素非常敏感的温度敏感炭疽芽孢杆菌recA突变株，在炭疽芽孢杆菌中进行突变，该突变与大肠杆菌recA温度敏感突变体recA44(Kawashima等人，193：288-92(1984))的V246M突变相似。为了制备该炭疽芽孢杆菌突变体，将在大肠杆菌和炭疽芽孢杆菌之间保守的序列245KVVKNK250(SEQ ID NO：46)进行突变。使用Stratagene Quick Change试剂盒，用错配寡聚核苷酸突变，将V246M突变引入克隆的炭疽芽孢杆菌recA基因中。通过序列分析确证突变，突变的基因克隆到pKSV7中，目的是使这些基因通过等位交换引入到炭疽芽孢杆菌spoIIE uvrAB的染色体中。另一种方法是，将来自炭疽芽孢杆菌菌株的recA基因删除，替换为大肠杆菌的recA44(ts)等位基因。(已知炭疽芽孢杆菌recA基因在大肠杆菌中起作用(Ko等人，J.Bacteriol 184：3917-22(2002)))。

实施例39

将突变引入到炭疽芽孢杆菌抗原活性位点中

致死因子突变H686A使其蛋白酶活性失活，且水肿因子突变K346Q和K353Q(一起)使其腺苷酸环化酶活性失活(Brossier等人，Infect.Immun.，68：1781-6(2000))。将这些突变引入将要用于疫苗的炭疽芽孢杆菌菌株中，例如spoIIE uvrAB和spoIIE uvrAB recA ts菌株中。克隆lef(致死因子)和cya(水肿因子，腺苷酸环化酶)基因，使用Quick Change试剂盒(Stratagene)进行突变产生突变的基因。突变的基因然后转到pKSV7中，最终通过等位交换引入到宿主pXO1的质粒中。

实施例40

使用SOS调控序列用于高水平表达保护性抗原

Cheo等人(Cheo等人，J.Bacteriol.，175：5907-15(1993))的研究显示，共有序列GAACN4GTTC(SEQ ID NO：47)确定了枯草芽孢杆菌中SOS应答的基因的LexA阻遏物位点。要定位炭疽芽孢杆菌recA和uvrAB基因启动子上游中相似的共有序列，它们是SOS调控子的一部分。为了制备高水平表达保护性抗原的炭疽芽孢杆菌菌株，将保护性抗原基因置于SOS调控序列的控制下，并引入炭疽芽孢杆菌spoIIE uvrAB菌株中，这样在使用补骨脂素处理时会导致高水平的保护性抗原的形成。为了将这个人工基因插入到炭疽芽孢杆菌染色体中，使用整合载体例如pPL2(Lauer等人，J.Bacteriol.，184：4177-86(2002))。将目标基因，在这里是启动子控制下的保护性抗原基因，插入到多克隆位点中。质粒从大肠杆菌中接合到炭疽芽孢杆菌菌株中。由于质粒不能在革兰氏阳性细菌中复制，它只能通过整合到染色体中而维持。pPL2载体含有来自单核细胞增生利斯特氏菌的噬菌体整合酶以及噬菌体结合位点，所以必须进行改变，将来自单核细胞增生利斯特氏菌的噬菌体整合酶基因以及噬菌体结合位点删除，代之以来自炭疽芽孢杆菌噬菌体，例如γ噬菌体(Brown等人，J.Infect Dis.，96：34-9(1955))的相似元件。而且，pPL2载体通常含有氯霉素抗性基因用于筛选。由于药物抗性基因对于疫苗工作来讲是不能有的，所以也要删除。其中一个药物抗性基因用D-丙氨酸消旋酶基因代替，该基因可以合成D-丙氨酸，使D-丙氨酸营养缺陷子在不添加D-丙氨酸的丰富培养基中生长。另一个药物抗性基因被谷氨酰胺合成酶基因替代，该基因合成谷氨酰胺合成酶，使谷氨酰胺合成酶突变细菌在没有谷氨酰胺合成酶的营养培养基上生长。

实施例41

炭疽芽孢杆菌突变株示例

使用以上实施例中描述的方法的组合，制备出多种不同的突变体炭疽芽孢杆菌菌株。将要用于疫苗组合物中的炭疽芽孢杆菌突变株示例在表26中列出。

表26炭疽芽孢杆菌菌株和候选疫苗

菌株和/或基因型	相关的性质和表型	用途和疫苗菌株编号
菌株和/或基因型	相关的性质和表型	用途和疫苗菌株编号	Ames pXO1+/pXO2+	具有完全毒力的野生型炭疽芽孢杆菌(产毒且具荚膜)	构建所有疫苗候选株的起始宿主菌株生产毒性的芽孢，用于小鼠和豚鼠的攻击实验
sterne pXO1+/pXO2-	产毒但不具荚膜	生产毒性的芽孢，用于小鼠和豚鼠攻击实验	Ames pXO1+/pXO2+	具有完全毒力的野生型炭疽芽孢杆菌(产毒且具荚膜)	构建所有疫苗候选株的起始宿主菌株生产毒性的芽孢，用于小鼠和豚鼠的攻击实验
sterne pXO1+/pXO2-	产毒但不具荚膜	生产毒性的芽孢，用于小鼠和豚鼠攻击实验	SpoIIE pXO1+/pXO2+	不产生芽孢；产毒且具荚膜	疫苗菌株#1
SpoIIE/uvrAB pXO1+/pKO2+	不产生芽孢；NER-¹(对S-59/UVA的敏感性增强)产毒且具荚膜	疫苗菌株#2	SpoIIE pXO1+/pXO2+	不产生芽孢；产毒且具荚膜	疫苗菌株#1
SpoIIE/uvrAB pXO1+/pKO2+	不产生芽孢；NER-¹(对S-59/UVA的敏感性增强)产毒且具荚膜	疫苗菌株#2	SpoIIE/uvrAB/recA ts³pXO1+/pXO2+	不产生芽孢；NER-(对S-59/UVA的敏感性增强)产毒且具荚膜	疫苗菌株#3
SpoIIE/uvrAB/recA tspXO1+/pXO2+	不产生芽孢；NER-/条件HR-⁴(对S-59/UVA的敏感性增强)产毒且具荚膜	疫苗菌株#4	SpoIIE/uvrAB/recA ts³pXO1+/pXO2+	不产生芽孢；NER-(对S-59/UVA的敏感性增强)产毒且具荚膜	疫苗菌株#3
SpoIIE/uvrAB/recA tspXO1+/pXO2+	不产生芽孢；NER-/条件HR-⁴(对S-59/UVA的敏感性增强)产毒且具荚膜	疫苗菌株#4	spoIIE/uvrAB/pXO1(lef686/cya346/35)/pXO2+	不产生芽孢；NER-(对S-59/UVA的敏感性增强)具英膜不产毒(LF/EF功能结构域突变)	疫苗菌株#5
spoIIE/uvrAB/recA ts/pXO1(lef686/cya346/35)/pXO2+	不产生芽孢；NER-/条件HR-(对S-59/UVA的敏感性增强)具荚膜不产毒(LF/EF功能结构域突变)	疫苗菌株#6	spoIIE/uvrAB/pXO1(lef686/cya346/35)/pXO2+	不产生芽孢；NER-(对S-59/UVA的敏感性增强)具英膜不产毒(LF/EF功能结构域突变)	疫苗菌株#5
spoIIE/uvrAB/recA ts/pXO1(lef686/cya346/35)/pXO2+	不产生芽孢；NER-/条件HR-(对S-59/UVA的敏感性增强)具荚膜不产毒(LF/EF功能结构域突变)	疫苗菌株#6	spoIIE/uvrAB/pXO1(lef686/cya346/35)/pXO2+/Pro_S-59-PA	不产生芽孢；NER-(对S-59/UVA的敏感性增强)具荚膜不产毒(LF/EF功能结构域突变)可被S-59补骨脂素诱导的PA	疫苗菌株#7
spolIE/uvrAB/recA ts/pXO1(lef686/cya346/35)/pXO2+/Pro_S-59-PA	不产生芽孢；NER-/条件HR-(对S-59/UVA的敏感性增强)具荚膜不产毒(LF/EF功能结构域突变)可被S-59补骨脂素诱导的PA	疫苗菌株#8	spoIIE/uvrAB/pXO1(lef686/cya346/35)/pXO2+/Pro_S-59-PA		疫苗菌株#7

¹NER，核苷酸切除修复

³将获得在lacI可抑制启动子控制下的条件recA菌株，

⁴HR，同源重组

实施例42

在补骨脂素灭活的炭疽芽孢杆菌菌株中蛋白质表达水平，包括保护性抗原和荚膜的性质描述

为了显示灭活的炭疽芽孢杆菌菌株仍然可以进行代谢，将细胞在含有碳酸氢盐的基本培养基(Thorne等人，J.Gen.Microbiol.，17：505-16(1957))中孵育。孵育后离心去掉细胞，保留上清。上清进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。用考马斯亮蓝染色后，显示保护性抗原来，用Western印迹(Brossier等人，Infect.Immun.，68：5731-4(2000))以及质谱证实其存在。此外，使用Lenz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，100：12432-12437(2003)中描述的方法，用质谱鉴定在这些条件下分泌出的其他蛋白质。为了检测在这些条件下是否合成出多聚谷氨酸荚膜，将编码荚膜合成基因的pXO2通过转导引入到这些菌株中(Green等人，Infect.Immun.，49：291-7(1985)。用火箭免疫电泳测量英膜(Uchida等人，Mol.Microbiol，23：1229-40(1997))。

实施例43

减毒炭疽芽孢杆菌菌株免疫接种的Swiss Webster和A/J小鼠的体液和粘膜应答

小鼠免疫接种。通过肌肉内(IM)或者皮下(SC)途径用S-59/UVA疫苗注射小鼠，确定哪种途径免疫产生最好的细菌特异的体液和细胞应答。也检验小鼠的鼻内(IN)免疫接种，评价候选疫苗诱导的粘膜应答。根据以前的描述(Boyaka等人，J.Immunol.，170：5636-43(2003))，取5微升的指定疫苗制品，鼻内免疫接种到轻微麻醉的小鼠的每个鼻孔中。小鼠免疫接种0.1LD₅₀剂量的候选疫苗。8个S-59/UVA灭活的候选疫苗中的任何一个，如果对其中值致死水平未观察，则起始给药剂量是10⁸个颗粒。通过一种以上途径免疫接种的小鼠，其组合免疫剂量不超过0.1LD₅₀剂量，或者不超过10⁸个颗粒。进行多次免疫接种的小鼠在所有的注射中，疫苗剂量保持一致。由于连续三天使用S-59/UVA灭活的利斯特氏菌uvrAB株进行免疫接种产生的体液和细胞免疫性要比单次免疫接种高，所以对于炭疽芽孢杆菌菌株疫苗采取同样的措施。在初次免疫接种后第14和第28天对小鼠进行加强免疫。

抗PA、LF、EF、荚膜和全细菌抗体的定量对使用不同候选疫苗进行免疫接种的小鼠体内的粘膜和抗体应答进行研究。免疫前以及每次免疫接种后1周从眼眶后静脉丛中取血清(我们有IACUUC的许可，对于每只小鼠进行最多5次眼眶后静脉丛操作，每周取血不超过一次，并且从两只眼中交替取血)。最后一次免疫接种后一周，处死时取唾液和鼻冲洗液，测量IgA的水平。在最后一次免疫接种后45天，对由候选疫苗诱导的体液和粘膜免疫的持久性进行研究。使用酶联免疫吸附检测测定(ELISA)对PA、荚膜和营养性细菌(Sterne株)的体液和粘膜应答，按照以前出版的方法进行(Ballard等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，93：12531-4(1996)；Rhie等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，100：10925-30(2003))。简而言之，首先用5微克纯化的PA，LF，EF以及缀合有多聚γ-D-谷氨酸(PGA)荚膜(根据以前的描述进行制备，Rhie等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，100：10925-30(2003))的BSA包被Immulon 96孔Maxisorp板(Nalge Nunc)，或者用研棒研钵在液氮条件下研磨S-59补骨脂素/UVA灭活的细菌研磨物包被，4℃下，包被物在50mM碳酸盐缓冲液(pH9.6)中包被16小时，然后用TSTA缓冲液(50mMTris[pH 7.6]，142mM NaCl，0.05％叠氮钠，0.05％Tween 20，2％牛血清白蛋白)封闭。小鼠的血浆或者粘膜分泌物进行连续2倍稀释，加入到分别用PA、PGA-BSA或者Sterne菌包被的96孔板中。通过与同型特异的过氧化物酶山羊抗小鼠μ、γ或者α重链特异的抗体〔来自SouthernBiotechnology Associates(Birmingham，AL)〕共同孵育，检测待检抗体与被固定抗原的结合。生物素化的大鼠抗小鼠γ1(克隆G1-7.3)，γ2a(克隆R19-15)，γ2b(克隆R12-3)，或者γ3(克隆R40-82)重链特异的单抗(BD PharMingen，San Diego，CA)，以及链亲和素缀合的过氧化物酶用于IgG抗体亚类的分析(Cole，J.Bacteriol，107：846-52(1971)；Cole等人，Basic Life Sci.，5B：487-95(1975))。加入ABTS底物(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)进行生色反应。终点滴度表示为OD415值较对照未免疫接种小鼠的OD415值大两个sd时log₂稀释度的倒数。

使用酶联免疫斑点(ELISPOT)测定检测抗体分泌细胞。使用ELISPOT测定PA特异的Ig分泌淋巴细胞的频率(Boyaka等人，J.Immunol.，170：5636-43(2003))。简而言之，迅速将免疫接种的和对照小鼠的脾脏或颈部淋巴结取出，置于冰冷的RPMI1640培养基中，制备单细胞悬液。用2.5微克每毫升的纯化PA(List BiologicalLaboratories，Campbell，CA)过夜包被PVDF材质的96孔板(BDBiosciemces，San Jose)。洗涤96孔板，在37℃用200微升完全RPMI封闭2小时，将细胞悬液进行连续稀释，加入到96孔板中。细胞在37℃，5％二氧化碳中在板上孵育6小时。使用同型特异的生物素标记的抗小鼠μ、γ或者α重链特异的抗体(Southern BiotechnologyAssociates)检测抗原特异的抗体形成细胞(AFC)。室温孵育2小时后，漂洗96孔板，加入山羊抗生物素：1nm金缀合物(GAB1；Ted Pella)室温作用1小时。充分漂洗后，每孔中加入30微升银底物(SilverEnhancing Kit；Ted Pella)，监测斑点的形成。每孔中的斑点使用自动的ELISPOT读板仪(CTL，Cleveland)计数。体液应答表示为每10⁶个脾脏或者淋巴结细胞中抗体形成细胞的数目。

毒素中和试验。对候选疫苗免疫小鼠诱导出的中和抗体保护J774巨噬细胞细胞系不受致命毒素(PA+LF)(Mock等人，Annu.Rev.Microbiol.，55：647-71(2001)；Boyaka等人(2003)；Rhie等人(2003))损害的能力进行测定。简而言之，将J774细胞(ATCC，Manassus，VA)加入到96孔平底板(Nunc)中，每孔5×10⁴个细胞，在37℃5％二氧化碳中孵育12小时。待测血清或者粘膜分泌物在TSTA缓冲液中进行连续两倍稀释。在抗血清稀释液中加入PA和LF(400ng/ml PA和40ng/ml LF)。孵育1小时后，抗血清/致命毒素复合物混合物加入到细胞悬液中，继续孵育5小时。通过MTT试验(在540nm测量光吸收)监测细胞的活力。试验作三个平行，每个板上还包括一个阴性对照(正常血清)和一个阳性对照(单抗14B7和1G3)(Mikesell等人，Infect Immun.，39：371-6(1983)；Starnbach等人，Nature，9，(2003))。计算每三个样品稀释度的平均值和标准偏差。终点表示为与正常对照血清相比表现出50％炭疽毒素中和的最高的血清稀释度。

实施例44

使用经过改变的炭疽芽孢杆菌免疫接种的A/J小鼠中，PA-，LF-和EF-特异的CD4+T细胞介导的应答的性质

T细胞增殖。使用免疫接种的和原初A/J小鼠的PBMC、脾脏和淋巴结细胞测定CD4+T细胞增殖。根据以前的描述(Boyaka等人，J.Immunol，162：122-8(1999)；Lillard等人，J.Immunol.，166：162-169(2001)；Little等人，Infect.Immun.，65：5171-5(1997))，将脾脏和颈部淋巴结分散以获得单细胞悬液。使用小鼠CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec(Auburn，CA))，通过负选择分离CD4+T细胞。来自每一只小鼠脾脏、混和的淋巴结或者PBMC纯化的CD4+T细胞，以4×10⁶个细胞/毫升的密度进行培养，在T细胞耗尽的、不分裂的同源原初脾脏滋养细胞的存在下(8×10⁶，细胞/毫升)，在完全RPMI(RPMI补充10％FBS，10mM Hepes，2mM L-谷胺酰胺，1mM丙酮酸钠，非必需氨基酸，23.8mM碳酸氢钠，5×10^-5Mμ-巯基乙醇，100U/ml青霉素和100微克每毫升链霉素)用不同浓度的PA，LF或者EF进行刺激。使用S-59补骨脂素进行短暂的光化学处理，使脾脏滋养细胞的复制停止。细胞在37℃5％二氧化碳中孵育4天，然后加入0.5μCi的氚胸腺嘧啶([³H]TdR)，最后再孵育18-20小时。将细胞收获在玻璃纤维纸上，用液闪计数器(Wallac，Turku，Finland)测量放射性，测出掺入的胸腺嘧啶的量。

PA-，EF-或者LF-诱导的细胞因子应答的分析。使用小鼠CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec(Auburn，CA))，通过负选择分离CD4+T细胞。来自每一只小鼠的脾脏或者淋巴结的纯化的CD4⁺T细胞在圆底96孔板上培养，每孔1×10⁵个细胞，然后在T细胞耗尽的、不分裂的同源原初脾脏滋养细胞的存在下(每孔1×10⁵个细胞)，在完全RPMI中使用不同浓度的PA，LF或者EF进行刺激。使用S-59进行短暂的光化学处理，使T细胞耗尽的脾脏滋养细胞的复制停止。T细胞培养在37℃5％二氧化碳中孵育2天。使用Th1/Th2细胞计数珠阵列试剂盒(BD Pharmingen，San Diego，CA)测定来自抗原刺激的CD4+T细胞上清中辅助性T细胞1和辅助性T细胞2细胞因子的表达。

实施例44

使用改变的炭疽芽孢杆菌疫苗接种Swiss Webster和A/J小鼠，最后一次免疫后45天对芽孢和致命毒素攻击保护程度的性质研究

小鼠对致命毒素攻击的保护。使用挑选出的候选疫苗免疫小鼠，然后通过尾静脉注射致命毒素进行攻击，如以前所描述的(Price等人，Infect.Immun.，69：4509-15(2001)；Rhie等人(2003))。根据描述(Rhie等人(2003))将重组PA和LF重组蛋白(List BiologicalLaboratories，Campbell，CA)混和，制备致命毒素。致命毒素在每只小鼠的静脉内注射LD₅₀大约是12微克的PA与6微克的LF混和。在已发表的数值的0.1-10LD₅₀剂量范围内通过尾静脉注射小鼠，测定新鲜制备的致病毒素对小鼠的平均致死性。保护研究可能将使用的致命毒素攻毒的剂量在LD₅₀剂量的5-10倍范围之间。在本模型中，未经保护的小鼠24小时内死亡。最初，炭疽致死是这样确证的：选择死亡的小鼠，将其血液涂布在胰蛋白大豆琼脂平板上，37℃孵育过夜。在平板上注意观察2-3毫米、具有典型炭疽样“毛玻璃”外表的菌落。所有用致命毒素处理的小鼠进行每日监测，2周后终止实验，处死所有的小鼠。

芽孢制备。根据描述(Barnard and Friedlander，1999)制备Sterne菌株的芽孢。简而言之，将单菌落接种在5毫升FA培养基(3.3％胰蛋白胨，2％酵母提取物[对水透析过夜]，0.2％L-组氨酸，0.8％Na₂HPO₄，0.4％KH₂PO₄，0.74％NaCl)中，在100毫升的瓶中，37℃振荡5小时。将0.1毫升的培养物铺在L琼脂平板上，37℃孵育。从平板上刮取细菌菌苔，用无菌水充分漂洗，60℃热激30分钟，水洗，根据以前的描述(Palucka等人，Nature Medicine，5：868-870(1999))用58％的Renografin-76(Bristo1-Myers Squibb，Princeton，N.J.)水溶液进行纯化，再用水洗一次。然后10000g离心将芽孢沉淀，重悬于含1％苯酚的水中。根据发表的数据，该过程的产量在每平板0.5×10⁹到5.0×10⁹个芽孢的范围内。

小鼠对致命芽孢攻击的保护。在剂量范围10³到10⁸个芽孢之间，确定肌肉内(IM)注射的热激的Sterne菌株芽孢的LD₅₀数值。为了评价接受接种的小鼠对吸入炭疽的保护，攻击实验如下进行：根据以前的描述(Brook等人，J.Med.Microbiol.，50：702-11(2001))将芽孢通过气管内途径给药。简而言之，将固定好并且麻醉的小鼠的舌头轻轻拉出，两侧用钳子固定，使用安装钝头1.5英寸的22号针头(从针尖以轻微角度弯折大约1英寸)注射器输运疫苗。我们预计经IM或者IT途径的Sterne菌株LD₅₀数值在A/J小鼠中大约是10³，在SwissWebster小鼠中至少高10倍。保护研究包括最高达100LD₅₀剂量的芽孢攻击。所有用芽孢处理的小鼠每日监测，2周后终止实验，处死所有的小鼠。在所有的攻击实验中，到死亡的平均时间在未存活的组中测定。

实施例45

利斯特氏菌疫苗在小鼠中对表达OVA模型抗原的痘病毒(vaccinia)攻击的保护性免疫性

本发明的疫苗对于利斯特氏菌的攻击显示了保护性免疫。为了进一步阐明疫苗免疫以及针对病原的保护，使用表达或者不表达OVA抗原和用S-59UVA处理(实施例13中的第二种方法，见前面)或者不处理的利斯特氏菌疫苗，对另外一种微生物，例如表达OVA抗原(VV-OVA)的痘病毒，产生免疫。这将证明使用利斯特氏菌疫苗可以获得对其他微生物的抗原特异免疫作用。

从La Jolla Research Institute获得表达OVA的痘病毒(vaccinia)(WR株)，它是使用Opticell培养小室(BioCrystal，OH)在Vero细胞中制备的。Opticell小室中接种Vero细胞，培养基是Eagle′s基本必需培养基，补充L-谷氨酰胺，P/S(青霉素/链霉素)，NEAA(非必需氨基酸)，NaHCO₃，和10％FBS。当细胞达到75％铺满时，去掉生长培养基，替换为含有大约1×10⁵PFU/mL VV-OVA的新鲜培养基。当单层细胞显示大于50％的细胞病变时，收获细胞和上清，冻融三次，澄清后在-80℃储存。在Vero-76细胞上进行空斑试验测定滴度。卵清蛋白在痘病毒中的表达在注射到小鼠中之前，通过Western印迹进行确证。

根据表27，通过静脉内接种C57B1/6小鼠(每组3只)，在第7天通过腹膜内途径注射1×10⁷PFU的VV-OVA进行攻击。在第12天，对小鼠实施安乐死，收获卵巢，观察大体病理。卵巢还用于痘病毒空斑形成单位的测定。来自每只小鼠的成对卵巢在1毫升缓冲液中匀浆，进行三次冷冻(液氮)融化(37℃)循环，每次循环之间进行旋涡振荡，然后储存于-80℃。检测时，将样品融化，4℃离心除去残渣，进行连续稀释，加到Vero细胞上。Vero-76细胞培养在6孔组织培养板中。当细胞达到70-85％铺满时，把每孔中的培养基吸出来，然后将1毫升适当稀释度的卵巢匀浆制备物接种在细胞上。至少1小时以后，吸出培养基，替换为3毫升1∶1的2x生长培养基：1.5％琼脂糖。培养3-4天后计数空斑。

表27使用表达OVA的单核细胞增生利斯特氏菌菌株接种小鼠，并且用表达OVA的痘病毒攻击

疫苗株	处理	免疫接种时间	免疫接种剂量^*
疫苗株	处理	免疫接种时间	免疫接种剂量^*	HBSSΔactAΔactAΔactA OVAΔactA OVAΔactAΔuvrABΔactAΔuvrABΔactAΔuvrAB OVAΔactAΔuvrAB OVAΔactAΔuvrAB OVA	--S-59 UVA-S-59 UVA-S-59 UVA-S-59 UVA热杀死	000，1，200，1，20，1，20，1，20，1，2	100微升1×10⁷1×10⁸1×10⁷1×10⁸1×10⁷1×10⁸1×10⁷1×10⁸1×10⁹

^*初次接种剂量，第1、2天的剂量要低10倍。所有的剂量都是在100微升的HBSS中。

这里引用的所有出版物、专利、专利申请和登录编号(包括多聚核苷酸和多肽的序列)在这里以其整体引用作为参考，用于所有的目的，其范畴与每个独立的出版物、专利、专利申请特别地、单独地指明在这里引用作为参考是相当的。

关于保藏的微生物或其它生物材料的说明

(PCT实施细则第13条之二)

A.以下所作的说明涉及说明书第92页第10-11行的微生物DP-L4029uvrAB。

D.本说明所适用的指定国(如果本说明不用于所有指定国)
D.本说明所适用的指定国(如果本说明不用于所有指定国)

E.单独提交的说明(如果不适用则留空)
E.单独提交的说明(如果不适用则留空)	以下说明将在以后提交给国际局(指明说明的一般性质，如“保藏编号”)

PCT/RO/134表

ATCC

10801 University Blvd·Manassas，VA 20110-2209·Telephone：703-365-2700·FAX：703-365-2745

BUDAPEST TREATY ON THE IN TERNATIONAL RECOGNITION OF

THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES OF PATENTPR OCEDURE

INTERNATIONAL FORM

RECE IPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSIT ISSUED PURSUANT TO RULE 7.3

AND VIABILITY STATEMENT ISSUED PURSUANT TO RULE 10.

To：(Name and Address of Depositor or Attorney)

Cerus Corporation

Attn：John Tessman

2411 Stanwell Drive

Concord，CA 94520

Deposited on Behalf of：Cerus Corporation

Identification Reference by Depositor： Patent Deposit Designation

Listeria monocytogenes actA/inIB double mutant：actA/inIB PTA-5562

Listeria monocytogenes actA/uvrAB double mutant：actA/uvrAB PTA-5563

The deposits were accompanied by：＿a scientific description_a proposed taxonomic description indicatedabove.The deposits were received October 3，2003 by this International Depository Authority and have beenaccepted.

AT YOUR REQUEST： X We will inform you of requests for the strains for 30 years.

The strains will be made available if a patent office signatory to the Budapest Treaty certifies one′s right toreceive，or if a U.S.Patent is issued citing the strains，and ATCC is instructed by the United States Patent &Trademark Office or the depositor to release sald strains.

If the cultures should die.or be destroyed during the effective term of the deposit，it shall be yourresponsibility to replace them with living cultures of the same.

The strains will be maintained for a period of at least 30 years from date of deposit，or five years after themost recent request for a sample，whichever Is longer.The United States and many other countries aresignatory to the Budapest Treaty.

The viability of the cultures cited above was tested October 15，2003，.On that date，the cultures were viable.International Depository Authority：American Type Culture Collection，Manassas，VA20 110-2209 USA.

Signature of person having authority to represent ATCC：

Date： November 10，2003

Marie Harris，Patent Specialist，ATCC Patent Depository

cc：Alicia Hager

(Ref:Docket or Case No.：28217-3002900)

关于保藏的微生物或其它生物材料的说明

(PCT实施细则第13条之二)

A.以下所作的说明涉及说明书第109页第13-14行的微生物DP-L4406actA。

PCT/RO/134表

ATCC

BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF

THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES OF PATENT PROC EDURE

INTERNATIONALFORM

RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSIT ISSUED PURSUANT TO RULE 7.3

AND VIABILITY STATEMENT ISSUED PURSUANT TO RULE 10.

To：(Name and Address of Depositor or Attorney)

Cerus Corporation

Attn：John Tessman

2411 Stanwell Drive

Concord，CA 94520

Deposited on Behalf of：Cerus Corporation

Identification Reference by Depositor： Patent Deposit Designation

Listeria monocytogenes actA/inIB double mutant：actA/inIB PTA-5562

Listeria monocytogenes actA/uvrAB double mutant：actA/uvrAB PTA-5563

The deposits were accompanied by：＿a scientific description_a proposed taxonomic description indicatedabove.Tbe deposits were received October 3，2003 by this International Depository Authority and have beenaccepted.

The strains will be made available if a patent office signatory to the Budapest Treaty certifies one′s right toreceive，or if a U.S.Patent is issued citing the strains，and ATCC is instructed by the United Sta tes Patent&Trademark Ofrice or the depositor to release said strains.

If the cultures should die or be destroyed during the effective term of the deposit，it shall be yourresponsibility to replace them with living cultures of the same.

The strains will be maintained for a period of at least 30 years from date of deposit，or five year-s after themost recent request for a sample，whichever is longer.The United States and many other countries aresignatory to the Budapest Treaty.

The viability of the cultures cited above was tested October 15，2003.On that date，the cultures were viable.International Depository Authority：American Type Culture Collection，Manassas，VA 20110-2209 USA.

Signature of person having authority to represent ATCC：

Date： November 10，2003

Marie Harrls，Patent Specialist，ATCC Patent Depository

cc：Alicia Hager

(Ref：Docket or Case No.：28217-3002900)

序列表

<110>CERUS CORPORATION

DUBENSKY Jr.，Thomas W.

BROCKSTEDT，Dirk G.

BAHJAT，Keith

HEARST，John E.

COOK，David

<120>修饰的自生的微生物、疫苗组合物及其使用方法

<130>282172002840

<140>Not Yet Assigned

<141>2004-02-06

<150>US 60/446,051

<151>2003-02-06

<150>US 60/449,153

<151>2003-02-21

<150>US 60/490,089

<151>2003-07-24

<150>US 60/511,869

<151>2003-10-15

<150>Not Yet Assigned

<151>2004-02-02

<160>52

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>8

<212>PRT

<213>鼠

<400>1

Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu

1 5

<210>2

<211>12

<212>PRT

<213>单核细胞增生利斯特氏菌

<400>2

Asn Glu Lys Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser

1 5 10

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>鼠

<400>3

Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu

1 5

<210>4

<211>8

<212>PRT

<213>单纯疱疹病毒

<400>4

Ser Ser Ile Glu Phe Ala Arg Leu

1 5

<210>5

<211>2915

<212>DNA

<213>单核细胞增生利斯特氏菌

<400>5

atcacgaaaa atcccgctta tattttgaat aagcgggatt ttgattattt tttcttagct 60

gttgcaattc gttcttccgt gcgttcttta tcgcgttcta aaattggttt caagtattta 120

cctgtataag atttttttga gcgagcgatt ttttcaggtg tgccggttgc aataatttga 180

ccgccaccat cgccaccttc tggacctaaa tcaatcaagt aatcagcttg tttgataacg 240

tcaagattat gctcaataac aagtactgta tcgccattct cttctacaag tctttgtaat 300

actttgagta aacgaccaat atcatctgcg tggagtccgg tagttggttc atccagaata 360

tagaaagatt ttccgttact acgtttatga agttccgaag ctagtttgac gcgctgcgct 420

tcaccacctg aaagcgtagt tgcaggttgt ccaagtcgaa tatagccaag accaacatct 480

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cctgaacctg aaagcccagt cataactact aatttgtctc taggaatctc tacatcaatg 2700

ttttttaagt tatgggctct tgcaccctga attactattt tctctttatc caatttcgct 2760

tcatccttcc gcttttattt ccagtaaagc atcgcgaagt tcagcagcac gttcgaaatc 2820

aagtgcttta gctgcttctt tcatttcatg ttccatacct tcaatgaata catcgcgttc 2880

tttcttagac attttgctta aatcatgttg cttcactgct tctctttcat ctgcggcaga 2940

agtcgctgcg atgataccac gaatttcttt tttgattgtt tttggcgtaa tgccgtgttt 3000

ttcattatat tcaatttgga ttttacgacg gcgttctgtt tcgccaatag aattgcgcat 3060

cgaatcggtc attttatcag catacatgat tactcgaccg ttttcattac gagcagctcg 3120

acccattgtt tgaattaagg aacgctcgga acgaaggaat ccttctttgt ccgcatctaa 3180

aatagcgaca agagatactt caggtaaatc gattccttca cgaagtaagt taattccaac 3240

gataacatca tacacaccaa gtcgaaggtc acgaatgatt tcgattcgct cgagcgtctt 3300

cacttccgag tggagatact gtactttaac accagcttct ttgagatagt tggttaaatc 3360

ctcggacatt tttttcgtta aggtggtgat taaaacacgt tcatttttct cgacgcgatc 3420

gttaatctca tccattaagt catcaatttg tccttgaatc ggacggattt ctacgattgg 3480

gtctagcaag ccagttggtc gaatgatttg ttcaatgaca tctggatttt tttctaattc 3540

gtaagggcct ggtgtagcgg atataaacat aatttgattg atatgcttct caaattcttc 3600

taaacgaagc ggcctattat ctagagcgct aggcaatcta aagccatgat caactagcat 3660

ttgttttctg gcttggtccc cgttaaacat accacgaatt tgcggcatcg taacgtgtga 3720

ctcatcaatt accatttgga aatcatctgg gaagtaatcg agtaacgtgt atggtgtaac 3780

tcccgctgga cgaagggata aatgtctaga atagttctca ataccagagc aatagcccat 3840

ttcttccatc atttccaaat cataattcgt tcgctgttca aggcgctgag cttctagcaa 3900

tttattatct gcacgtaaaa ctttaagacg gtcttcgagt tcagctttta tattaacaat 3960

tgcttttttc ataatatcag gtctggtgac aaagtgagat gccgggaaaa tggaaacatg 4020

ttctctttct cctataattt caccagtaag tgcatctact tctctaattc gttcaatttc 4080

atcaccgaaa aattcaatcc gcatacagtg ttcatctctt gaagctggga aaatttcgac 4140

aacatcaccg cgaacacgga agcgtccacg ttgaaaatct atatcatttc gatcatattg 4200

aatatctact aatttgcgca gtagctgatc acggctaatt tccatgccaa cacgaagcga 4260

aacgagcatc tctccatatt caatcggcga acctaagcca tagatacacg atacactcgc 4320

aatgataatt acatcgcgac gttcaaaaag cgcagcagta gcagagtgac gaagcttatc 4380

gatttcatca ttgatacttg catctttttc gatatatgtg tcactttgcg gaacataggc 4440

ttctggttga tagtaatcat agtaactgac aaaatattct acagcgttat ttgggaaaaa 4500

ctctttaaac tcgctataca gctgtcccgc taacgtctta ttgtgagcca tgacaagtgt 4560

cggcttattt acttcttgaa tcacattgga tacggtaaaa gttttccctg ta 4612

<210>11

<211>2042

<212>DNA

<213>单核细胞增生利斯特氏菌

<400>11

gcaagtatac agttaagttt gtaacgattt gttttgattt agactcaaaa cgtaaagttt 60

cttcatctac acgtaaagtc gttttatcaa agaagatttt aagtgcttca tcttctggat 120

attctttgaa tagtttaatc atcgcgtgaa ctttgatatc gttcgaatcg gatggtttaa 180

attcaatatt accattagca atttcgaatt ctaaaataga aagtgttgtg tcatgataaa 240

tgaaatcacg ttcgattttc gttgaagtta agaacgggaa tggcatatct ttcacttgtt 300

taaatgcact atttaggaaa gaaccgattt tttcaccagc ttgggataaa tcattaacca 360

tattgcgcat ggagtcttca cgatctttag aagaattttc gccgccttct tcttcatctc 420

tttcatgatt ttctggagtc ggttctgggc gtcttttacg actttttgga ggtgtataag 480

gatttccttg attgttccaa cctttactgt aatcatatga tggttcttct tttgtttctt 540

cttcgatttg ttcttcttct ctcggagctg cagatcgacg aatattttct tttgctgctg 600

ttttaccttc ttttttggaa atattttcaa gtagagtaag ggcttcttca gtggatataa 660

taccttgttt tactaattcg agaatacgtt tacgttcatt ttccattttc atttcctcct 720

ataatttagg ctaaactatt ttaggcttgc tttcacatgc aagtgacata tctgttttat 780

ctatgactct attatgaagg aaaatataat ttctgtcata caaccagagg atgattattt 840

gtttggactt tgggtggttt ggtcttaaga atcacgaaaa atcccgctta tattttgaat 900

aagcgggatt ttgattattt tttcttagct gttgcaattc gttcttccgt gcgttcttta 960

tcgcgttcta aaattggttt caagtattta cctgtataag atttttttga gcgagcgatt 1020

ttttcaggtg tgccggttgc accaagtaaa gtttggtgtt tcaagccttt ttttaatccc 1080

gcaactaatt gttctatcgc tctaggttgg tctccttgtg ggctatactt agaaactaac 1140

tcaaatttat ccttcaactc ggattccccc tattctgtat ctgtccgatt ctggtatctg 1200

aaaagctttg tttgtaaaag gtctagcaaa gcaaaaagcg gatttttcag atccgttaat 1260

gtttctattt tatcataaat attttaatta gcctagcaaa aaccgaacat attttcgcat 1320

ttgttgaaaa ataaaaaacg caacctgttg attacgcttt tctttatttt atcactttta 1380

cgcttttcta cctatatatt tgctttgtta aaaatcactg ccactcttct ttaaacgtcg 1440

cagcatatac gttgcaagca caaaaccaat ggtcatcgaa aaagcatcaa taataattag 1500

ccacatagaa ctcgtataac ctaacttggc agaagcagca atcaaaatca ccatcaaaag 1560

caagccgaca taacgattat aagtgattct cgcaaaaaga ataacaagga ggcaagggaa 1620

aataagcgca gatataattt gatccatctt acgttcctcc ccctttttta tgcgtctcgt 1680

aatgctttgg tcgttatttc cgttgtaagc tgtggtaatt ctgttttttc gatacctttt 1740

tcagcaagca tatctggtaa aatttctttt aaaaagtact taacgctcgc catttctcgg 1800

tactcataaa tggttgcaag tgcctcacta tagatttcca caaaaatatt ttctggattt 1860

cctttttgaa tttcgccaaa ggattcatat aacaaatcta ctttatcaga aattgcgagg 1920

attttccctt ccaacgtact gtccttacct tcttttagca aatgacgata aatcggctgg 1980

tacgtttctg gaatttcccg ttcaataaag ttttttgtca tgctttcttc cacttcggaa 2040

ag 2042

<210>12

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>12

ctctggtacc tcctttgatt agtatattc 29

<210>13

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>13

ctcctcgaga tccgcgtgtt tcttttcgat tg 32

<210>14

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>14

ctcctcgagt ccatgggggg ttctcatcat c 31

<210>15

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>15

ctcctcgagt gcggccgcaa gctt 24

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>16

gtcaaaacat acgctcttat c 21

<210>17

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>17

acataatcag tccaaagtag atgc 24

<210>18

<211>2762

<212>DNA

<213>炭疽芽孢杆菌

<400>18

actacttgct ctggcgttcc ggaagcaacg atttgtccac ctttgtctcc gccttctggt 60

ccaaggtcaa cgatataatc cgctgtttta attacatcta aattatgttc aatgacaagt 120

accgtctcac cgctctcaac aagacgttgc agcacttcta gaagacgggc gatatcatgc 180

gcatgtaaac cagtcgttgg ctcgtctaaa atgtatagtg tacgtcctgt agaacgacgg 240

tgtaattcag aagctaattt cacacgctgt gcttcaccac cagataaagt cgtggctggt 300

tgccctaatt tcatataacc aagcccaacg tctacaagcg tttgaagttt acgtttaatt 360

tttgggatat tagcgaagaa ctctactccg tcttcaatcg tcatccctaa cacttcagaa 420

atgtttttat ctttatattt cacttctaac gtttcacggt tgtaacgttt accgtgacaa 480

acttcacacg gaacgtatac gtctggtaag aagtgcatct caattttaat aattccatca 540

ccacggcacg cttcacaacg tccacctttt acgttaaagc tgaaacgccc tttttgatat 600

ccgcgcactt tcgcttcatt cgtttgcgca aacacatcac gaatatcatc gaacacacct 660

gtataggttg ctggattaga acgtggtgta cgaccgattg gcgattgatc aatatcgata 720

actttatcta aatgctcaag acctttaatt tctttatgag tacctggctt cgctttcgct 780

ttatataact tttgcgctaa cgatttatat agtacttcat taatcatcgt acttttacct 840

gatccagata cacccgttac cgctacaaac gtaccaagcg ggaatgacat cttcgcgttc 900

tttaagttat tctcttttgc accgacaatc tccactttac gtccatcacc tttacgtctt 960

tcaagtggaa ctggaataaa ctctttaccg cttaaatact tacctgttag tgaattctca 1020

tcttgcatca cttcagctgg tgtacccgct gatacaactt gtccaccgtg aatacctgcg 1080

ccaggcccga tatccagtaa ataatcagct gccatcatcg tatcttcatc atgctcaaca 1140

acaattaacg tattacctaa atcacgcatt tcttgcaatg tacgaataag acgatcgtta 1200

tcgcgctgat gcaaaccgat agaaggctca tcaagaatgt aaagcacccc agtaagacgc 1260

gaaccaattt gcgttgctaa acgaatacgt tgcgcctcac caccagataa agttcctgcg 1320

gcacgactta acgttaaata atctaaacca acgtttacta agaacccaac gcgctcttga 1380

atttctctta aaattaaatg ggcaattttt tgttgtttct ctgttagctc cacatttgag 1440

aagaattcct gtacttcttg aacagaatac ttcgttacat cagcaatcgt ttttccgcca 1500

acgaaaacag ctaaactttc aggctttaag cgtccgcctt tacacttcgg acaagcttgt 1560

tctgccatat acttttccat ttgctcacga atgtaatccg aactcgtctc acgataacga 1620

cgttcaatat ttggaataac accttcaaat aaaatctcat tttcctttac ttgaccaaat 1680

tcatttacat agcggaaata aactttctct tcaccgcttc cgtacaacac tttatcaaat 1740

aaatctttcg gtatatcttt tacaggcaca tccatatcca cgccataatg attacataca 1800

gattgtaaaa gctgtgggta atattgtgaa cttgtcggtt cccaaggcgc aatcgcatgc 1860

tcatttaatg ataaatccca gttcggaata acaagttcta aatctacctc taactttgag 1920

ccaagcccat cacaagaagg acatgcaccg aacggactat tgaatgagaa catacgcggc 1980

tctaattctc caattgaaaa accacaatgc ggacaagcat gatgttcact aaatagaagc 2040

tcctcttctc ccataacatc gattaacact cgtcccccgc caagctttaa tgcactttca 2100

agagaatcag caagacggct tgcgattcct tcttttacaa caatacggtc aattacaact 2160

tcaatagaat gcttcttatt tttatctaac gcaatatctt cagacacatc gagcatttca 2220

ccatcaacac gtacacgaac ataaccttgc ttcttaatat cttcaagtac ttttacatgt 2280

gcacctttac gcccagaaac gataggagct aacacttgta atttcgtacg ttcagggtac 2340

tcaagtacac ggtctaccat ttgctctact gtttgcgatg taatttcaat gccatgattc 2400

ggacaaattg gcgtaccaat tcgcgcaaat aataaacgta agtaatcata aatctccgtt 2460

accgttccaa cagttgaacg cggattacga ctcgtcgttt tttgatcgat tgaaatcgct 2520

ggagataagc cttcaatcgt atctacatcc ggcttatcca tttgccctaa aaactggcgt 2580

gcatacgcag ataacgattc tacgtatctg cgctgccctt ctgcataaat cgtatcaaat 2640

gctaatgagg atttccctga accagacaat cctgttacaa cgacaagttg atttctcgga 2700

atggttacat caatattttt taagttatgt gctctagcac cttttacaac gataaaatcc 2760

tt 2762

<210>19

<211>1908

<212>DNA

<213>炭疽芽孢杆菌

<400>19

tgcttttgct gcttctttca tttctgcttc catcttcgca attgtctttt cacgctcttt 60

tttcgtcatc ttcttagctg gcgtcgcttc atatgtttcc ggctcttcag cagctgtcgt 120

tgcacggatt acatcacgca cacctttttg aatcgttttc ggcgtaatac catgctcttc 180

attgtaagct tcttgtatac tacgacgacg cttcgtctct tcaatcgcaa tccccatcga 240

tctcgttata cgatctgcgt acataataac gcgaccgttt tcattacgtg ctgcacggcc 300

aattgtttga attaacgaac gctctgaacg caagaatcct tccttatcgg catctaaaat 360

agctacaagg gatacttctg gaatatctaa tccttctcgc aataagttaa taccaacgag 420

aacatcaaac ttaccaaggc gaagatctcg tataatttca atacgttcta acgttttcac 480

ttcagaatgc agataattca ccttaattcc tacatctttt aagtagtctg ttaaatcctc 540

tgacatcttc ttcgttaaag ttgtaattaa tacacgttca ttttttgcaa tgcgatcttg 600

aatctctcct aatagatcgt caatctgccc ttcaattggt cgtatatcaa ttggcggatc 660

taaaagccct gttggacgaa taatttgttc tattacttct ggcgactgct ctaattcata 720

cggtcctggc gttgctgaaa cgtaaataac ttgattcgtt ttctcttcaa actcatcaaa 780

tgtgagcggt ctattatcta aagctgatgg cagacggaat ccatgatcca caagcacttg 840

tttacgcgct tggtccccgt tatacatcgc tcttacttgc ggcactgata cgtgggactc 900

atccataacg attaagaaat ctttcgggaa atagtctaat aacgtatacg gcgttgcacc 960

cgctggacga agtgttaaat gacgggaata gttttcaatc cctgaacaaa agcccatctc 1020

gcgcatcatt tctaaatcat aacgtgtacg ctgttctata cgctgcgctt ctaacaactt 1080

accgttatca tttaattcct ttaaacgctc ttctaattct ttttcgatat tttcaatagc 1140

gaccttcatc ttttcttcac gtgtaacgaa gtgagatgct gggaagattg ctacatgatc 1200

acgttctgct aatacttctc ccgttaaagc atttacttcg cgaatacgat caatttcatc 1260

gccaaaaaac tcaattcgaa tgcaatgctc gtcaagtgat gccgggaaga tttcaactac 1320

atctccgcgc acgcggaatg taccacgctt gaaatcaata tcattacgtc catactgcac 1380

atcaacaagt tcacgaagca attgattgcg gtccttttcc ataccaactc gaagtgaaac 1440

aactaactcg cggtattctt ctggagaacc taaaccatat atacacgaaa cactcgcaac 1500

aataattaca tcatcccgtt caaataatgc ggacgttgct gagtgacgca atttatcgat 1560

ttcatcatta atctgcgcgt ctttttcaat aaacgtatct gtttgtggca catacgcttc 1620

tggctgataa taatcgtaat aactaacaaa atattcaact gcattattcg ggaaaaagtc 1680

tttcaactca ctatataact gtcctgctaa cgttttattg tgagccatga caagcgttgg 1740

cttttgcact tctttaatga catttgaaat cgtaaatgtc ttacccgttc ctgtcgcccc 1800

aagcaacact tgctttttct ttccactatt aattccctct acaagcttct ctatagctac 1860

cggctgatca ccttgcgggg aatacgctga gacaatttca aattgacg 1908

<210>20

<211>9

<212>PRT

<213>鼠

<400>20

Ser Pro Ser Tyr Val Tyr His Gln Phe

1 5

<210>21

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>21

Ser Pro Ser Tyr Ala Tyr His Gln Phe

1 5

<210>22

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>22

gttaagtttc atgtggacgg caaag 25

<210>23

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>23

aggtcttttt cagttaacta tcctctcctt gattctagtt at 42

<210>24

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>24

caaggagagg atagttaact gaaaaagacc taaaaaagaa ggc 43

<210>25

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>25

tcccctgttc ctataattgt tagctc 26

<210>26

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>26

gtggacggca aagaaacaac caaag 25

<210>27

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>27

gttcctataa ttgttagctc atttttttc 29

<210>28

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>28

ctctggtacc tcctttgatt agtatattc 29

<210>29

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>29

caatggatcc ctcgagatca taatttactt catccc 36

<210>30

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>30

atttctcgag tccatggggg gttctcatca tc 32

<210>31

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>31

ggtgctcgag tgcggccgca agctt 25

<210>32

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>32

cgattcccct agttatgttt accaccaatt tgctgca 37

<210>33

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>33

gcaaattggt ggtaaacata actaggggaa t 31

<210>34

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>34

agtccaagtt atgcatatca tcaattt 27

<210>35

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>35

cgatagtcca agttatgcat atcatcaatt tgc 33

<210>36

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>36

gtcgcaaatt gatgatatgc ataacttgga ctat 34

<210>37

<211>9

<212>PRT

<213>E.coli

<400>37

Thr Pro His Pro Ala Arg Ile Gly Leu

1 5

<210>38

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>38

ctgtgctttg cgaatggaaa gaagc 25

<210>39

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>39

gttttcattc atacacttag acaagcgttg gcttttgcac ttc 43

<210>40

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>40

gacaagcgtt ggcttttgca cttc 24

<210>41

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>41

caaaagccaa cgcttgtcta agtgtatgaa tgaaaaccga gtgg 44

<210>42

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>42

aagtgtatga atgaaaaccg agtgg 25

<210>43

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>43

catataaagg ttccacaatt gccttttc 28

<210>44

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>44

gaagcagaaa tgaagccaat actcaatc 28

<210>45

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>45

ggttccacaa ttgccttttc aataatc 27

<210>46

<211>6

<212>PRT

<213>炭疽芽孢杆菌

<400>46

Lys Val Val Lys Asn Lys

1 5

<210>47

<211>12

<212>DNA

<213>炭疽芽孢杆菌

<220>

<221>misc_特征

<222>5，6，7，8

<223>n＝A，T，C或G

<400>47

gaacnnnngt tc 12

<210>48

<211>331

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>48

Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu

1 5 10 15

Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys

20 25 30

Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser

35 40 45

Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Ser Pro

50 55 60

Ser Tyr Val Tyr His Gln Phe Ala Ala Asp Gln Ala Arg Glu Leu Ile

65 70 75 80

Asn Ser Trp Val Glu Ser Gln Thr Asn Gly Ile Ile Arg Asn Val Leu

85 90 95

Gln Pro Ser Ser Val Asp Ser Gln Thr Ala Met Val Leu Val Asn Ala

100 105 110

Ile Val Phe Lys Gly Leu Trp Glu Lys Thr Phe Lys Asp Glu Asp Thr

115 120 125

Gln Ala Met Pro Phe Arg Val Thr Glu Gln Glu Ser Lys Pro Val Gln

130 135 140

Met Met Tyr Gln Ile Gly Leu Phe Arg Val Ala Ser Met Ala Ser Glu

145 150 155 160

Lys Met Lys Ile Leu Glu Leu Pro Phe Ala ser Gly Thr Met Ser Met

165 170 175

Leu Val Leu Leu Pro Asp Glu Val Ser Gly Leu Glu Gln Leu Glu Ser

180 185 190

Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr Val Leu Gln Glu Leu

195 200 205

Asn Val Thr Val Arg Thr Ser Ser Asn Val Met Glu Glu Arg Lys Ile

210 215 220

Lys Val Tyr Leu Pro Arg Met Lys Met Glu Glu Lys Tyr Asn Leu Thr

225 230 235 240

Ser Val Leu Met Ala Met Gly Ile Thr Asp Val Phe Ser Ser Ser Ala

245 250 255

Asn Lau Ser Gly Ile Ser Ser Ala Glu Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala

260 265 270

Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg Glu Val Val

275 280 285

Gly Ser Ala Glu Ala Gly Val Asp Ala Ala Ser Val Ser Glu Glu Phe

290 295 300

Arg Ala Asp His Pro Phe Leu Phe Cys Ile Lys His Ile Ala Thr Asn

305 310 315 320

Ala Val Leu Phe Phe Gly Arg Cys Val Ser pro

325 330

<210>49

<211>8

<212>PRT

<213>红原鸡(Gallus gallus)

<400>49

Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu

1 5

<210>50

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>50

Val Leu Gln Glu Leu Asn Val Thr Val

1 5

<210>51

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>51

Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu

1 5

<210>52

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>52

Tyr Leu Ser Gly Ala Asp Leu Asn Leu

1 5

Claims

1.包含自生微生物的疫苗，其中该微生物的核酸通过与直接与核酸发生反应的核酸靶向化合物发生反应而被改变，这样微生物的增殖被衰减。

2.权利要求1的疫苗，其中的核酸靶向化合物是核酸烷化剂。

3.权利要求2的疫苗，其中的核酸烷化剂是β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯。

4.权利要求1的疫苗，其中的核酸靶向化合物通过辐射被活化。

5.权利要求4的疫苗，其中的核酸靶向化合物是被UVA辐射而活化的补骨脂素化合物。

6.权利要求5的疫苗，其中的核酸靶向化合物是4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素。

7.权利要求1的疫苗，其中所述微生物包含基因突变，该突变使微生物修复其被改变的核酸的能力减弱。

8.权利要求7的疫苗，其中所述微生物在DNA修复酶上有缺陷。

9.权利要求8的疫苗，其中的基因突变位于一个或者多个选自以下的基因上：phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA，或者位于选自以下的一个或者多个基因的功能等价物上：phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA。

10.权利要求9的疫苗，其中所述微生物包含基因突变，位于uvrA和uvrB上，或者位于uvrA和uvrB的功能等价物上。

11.权利要求8的疫苗，该疫苗对于RecA，或者RecA功能等价物是缺陷的。

12.权利要求1的疫苗，其中的微生物是细菌。

13.权利要求12的疫苗，其中的微生物是结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。

14.权利要求12的疫苗，其中的微生物是炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)。

15.权利要求12的疫苗，其中的微生物是单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)。

16.权利要求15的疫苗，其中的微生物在uvrA和uvrB上至少包含一个突变。

17.权利要求16的疫苗，其中的微生物还在actA基因或inlB基因或者两个基因上包含突变。

18.权利要求1的疫苗，其中的微生物包含编码抗原的异源核酸序列。

19.权利要求1的疫苗，其中疫苗还包含药物上可接受的载体或者佐剂。

20.在宿主中预防或者治疗疾病的方法，该方法包括向宿主施用有效量的权利要求1中的疫苗。

21.在宿主中诱导针对抗原的免疫应答的方法，该方法包括向宿主施用有效量的权利要求1中的疫苗，其中的微生物表达该抗原。

22.分离的专职性抗原呈递细胞，该细胞包含自生的微生物，其中该微生物的核酸通过与直接与核酸反应的核酸靶向化合物发生反应而被改变，这样微生物的增殖被衰减。

23.权利要求22的专职性抗原呈递细胞，它是树突细胞。

24.权利要求22的专职性抗原呈递细胞，其中的核酸靶向化合物是核酸烷化剂。

25.权利要求24的专职性抗原呈递细胞，其中的核酸烷化剂是β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[二(2-氯乙基)氨基]乙酯。

26.权利要求22的专职性抗原呈递细胞，其中的核酸靶向化合物通过辐射而活化。

27.权利要求26的专职性抗原呈递细胞，其中的核酸靶向化合物是被UVA辐射活化的补骨脂素化合物。

28.权利要求27的专职性抗原呈递细胞，其中的核酸靶向化合物是4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素。

29.权利要求22的专职性抗原呈递细胞，其中的微生物包含基因突变，该突变使微生物修复其被改变的核酸的能力减弱。

30.权利要求29的专职性抗原呈递细胞，其中的微生物在DNA修复酶上有缺陷。

31.权利要求30的专职性抗原呈递细胞，其中的基因突变位于一个或者多个选自以下组的基因上：phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA，或者位于选自以下组的一个或者多个基因的功能等价物上：phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA。

32.权利要求31的专职性抗原呈递细胞，其中的微生物包含基因突变，位于uvrA和uvrB上，或者位于uvrA和uvrB的功能等价物上。

33.权利要求31的专职性抗原呈递细胞，其中的微生物对于RecA，或者RecA功能等价物是缺陷的。

34.权利要求23的专职性抗原呈递细胞，其中的微生物是细菌。

35.权利要求34的专职性抗原呈递细胞，其中的微生物是结核分支杆菌。

36.权利要求34的专职性抗原呈递细胞，其中的微生物是单核细胞增生利斯特氏菌。

37.权利要求32的专职性抗原呈递细胞，其中的微生物在uvrA和uvrB上包含至少一个突变。

38.权利要求22的专职性抗原呈递细胞，其中的微生物包含编码抗原的异源核酸序列。

39.包含权利要求22的专职性抗原呈递细胞的疫苗。

40.在宿主中预防或者治疗疾病的方法，该方法包括向宿主施用有效量的权利要求22的专职性抗原呈递细胞。

41.在宿主中诱导针对抗原的免疫应答的方法，该方法包括向宿主施用有效量的权利要求22的专职性抗原呈递细胞，其中的微生物包含编码表达该抗原的核酸序列。

42.在体外活化原初T细胞的方法，该方法包括在适宜的条件下，使原初T细胞与权利要求22的专职性抗原呈递细胞接触足够长的时间，以活化原初T细胞。

43.用抗原荷载专职性抗原呈递细胞的方法，该方法包括使专职性抗原呈递细胞在体外在适宜的条件下与包含有编码该抗原的核酸序列的自生微生物接触足够的时间，以使专职性抗原呈递细胞荷载，其中的微生物核酸通过与直接与核酸反应的核酸靶向化合物发生反应而被改变，这样微生物的增殖被衰减。

44.使专职性抗原呈递细胞活化和/或成熟的方法，该方法包括使专职性抗原呈递细胞在体外在适宜的条件下与包含有编码抗原的核酸序列的自生微生物接触足够的时间，以使专职性抗原呈递细胞活化和/或成熟，其中的微生物核酸通过与直接与核酸发生反应的核酸靶向化合物发生反应而被改变，这样微生物的增殖被衰减。

45.预防或者治疗宿主体内疾病的方法，包括以下步骤：(a)使专职性抗原呈递细胞与包含有编码抗原的核酸序列的自生微生物接触使其荷载抗原，其中的微生物核酸通过与直接与核酸发生反应的核酸靶向化合物发生反应而被改变，这样微生物的增殖被衰减；以及(b)向宿主施用有效量的包含负载的专职性抗原呈递细胞的组合物。

46.在宿主体内诱导对于抗原的免疫应答的方法，包括以下步骤：(a)使专职性抗原呈递细胞与包含有编码抗原的核酸序列的自生微生物接触使其荷载抗原，其中的微生物核酸通过与直接与核酸反应的核酸靶向化合物发生反应而被改变，这样微生物的增殖被衰减；以及(b)向宿主施用有效量的包含负载的专职性抗原呈递细胞的组合物。

47.分离的突变单核细胞增生利斯特氏菌菌株，该菌株包含基因突变，该突变使其修复其核酸的能力减弱。

48.权利要求47的突变体菌株，它在至少一种DNA修复酶上有缺陷。

49.权利要求47的突变菌株，它的UvrA，UvrB失活或者UvrA和UvrB二者均失活。

50.权利要求49的突变菌株，它在uvrA基因、uvrB基因或者uvrA和uvrB两个基因上包含基因突变。

51.权利要求47的突变菌株，其中该菌株的细菌的核酸已经被改变，使得细菌的增殖被衰减。

52.权利要求47的突变菌株，它选自由以下菌株组成的组：保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的编号为PTA-5563的单核细胞增生利斯特氏菌actA^-/uvrAB^-菌株，或者所保藏的菌株的突变株，该突变株在UvrA、UvrB以及ActA上具有缺陷。

53.权利要求52的突变菌株，它是保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的编号PTA-5562的单核细胞增生利斯特氏菌actA^-/inlB^-菌株。

54.包含(a)权利要求47的突变菌株以及(b)药物上可以接受的载体或者佐剂的疫苗。

55.在宿主中诱导针对抗原的免疫应答的方法，该方法包括向宿主施用有效量的包含权利要求47的菌株的组合物，其中的菌株包含编码该抗原的核酸分子。

56.在宿主中预防或者治疗疾病的方法，该方法包括向宿主施用有效量的包含权利要求47的菌株的组合物。

57.包含权利要求47的菌株的专职性抗原呈递细胞。

58.分离的突变炭疽芽孢杆菌菌株，该菌株包含基因突变，该突变使其修复其核酸的能力减弱。

59.权利要求58的突变菌株，它至少在一种DNA修复酶上有缺陷。

60.权利要求59的突变菌株，它的UvrA、UvrB减弱或者UvrA和UvrB二者均减弱。

61.权利要求60的突变菌株，它在uvrA基因、uvrB基因或者uvrA和uvrB两个基因上包含基因突变。

62.权利要求58的突变菌株，它在lef基因、cya基因或者两个基因中包含一个或者多个降低该菌株毒性的突变。

63.权利要求58的突变菌株，其中该菌株的细菌的核酸已经被改变，使得细菌的增殖被衰减。

64.在宿主中诱导针对炭疽芽孢杆菌抗原的免疫应答的方法，该方法包括向宿主施用有效量的包含权利要求58的突变菌株的组合物。

65.在宿主中预防或者治疗炭疽芽孢杆菌感染的方法，该方法包括向宿主施用有效量的包含权利要求58的突变菌株的组合物。

66.包含自生的微生物的疫苗，所述的微生物至少在一种DNA修复酶上有缺陷。

67.权利要求66的疫苗，其中的微生物包含基因突变，该突变位于一个或者多个选自以下组的基因上：phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA，或者位于选自以下组的一个或者多个基因的功能等价物上：phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA。

68.权利要求67的疫苗，其中的微生物包含基因突变，位于uvrA和uvrB上，或者位于uvrA和uvrB的功能等价物上。

69.权利要求66的疫苗，其在RecA或者RecA的功能等价物上有缺陷。

70.权利要求66的疫苗，其中的微生物是细菌。

71.权利要求66的疫苗，其中的微生物包含编码抗原的异源核酸序列。

72.权利要求66的疫苗，其中的疫苗还包含药物上可接受的载体或者佐剂。

73.在宿主中预防或者治疗疾病的方法，该方法包括向宿主施用有效量的权利要求66的疫苗。

74.在宿主中诱导针对抗原的免疫应答的方法，该方法包括向宿主施用有效量的权利要求66的疫苗，其中的微生物表达该抗原。

75.分离的专职性抗原呈递细胞，该细胞包含自生的微生物，所述的微生物至少在一种DNA修复酶上有缺陷。

76.权利要求75的抗原呈递细胞，其中的微生物包含基因突变，该突变位于一个或者多个选自以下组的基因上：phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA，或者位于选自以下组的一个或者多个基因的功能等价物上：phrB，uvrA，uvrB，uvrC，uvrD和recA。

77.权利要求76的抗原呈递细胞，其中的微生物包含基因突变，位于uvrA和uvrB上，或者位于uvrA和uvrB的功能等价物上。

78.权利要求75的抗原呈递细胞，其在RecA或者RecA的功能等价物上有缺陷。

79.权利要求75的抗原呈递细胞，其中的微生物是细菌。

80.权利要求75的抗原呈递细胞，其中的微生物包含编码抗原的异源核酸序列。

81.在宿主中预防或者治疗疾病的方法，该方法包括向宿主施用有效量的权利要求75的抗原呈递细胞。

82.在宿主中诱导针对抗原的免疫应答的方法，该方法包括向宿主施用有效量的权利要求75的抗原呈递细胞，其中的微生物表达该抗原。

83.用于医疗用途的自生的微生物，其中的微生物核酸通过与直接与核酸反应的核酸靶向化合物发生反应而被改变，这样微生物的增殖被衰减。

84.用于医疗用途的抗原呈递细胞，其中的抗原呈递细胞包含自生的微生物，其中的微生物核酸通过与直接与核酸反应的核酸靶向化合物发生反应而被改变，这样微生物的增殖被衰减。

85.用于医疗用途的突变单核细胞增生利斯特氏菌菌株，其中的突变单核细胞增生利斯特氏菌菌株包含基因突变，该突变使其修复其核酸的能力减弱。

86.用于医疗用途的自生的微生物，其中的微生物至少在一种DNA修复酶上有缺陷。

87.权利要求86的微生物，它是炭疽芽孢杆菌或者单核细胞增生利斯特氏菌。

88.用于医疗用途的抗原呈递细胞，其中的抗原呈递细胞包含自生的微生物，其中的微生物至少在一种DNA修复酶上有缺陷。

89.试剂盒，该试剂盒包含(a)包含权利要求47的突变单核细胞增生利斯特氏菌菌株、权利要求58的突变炭疽芽孢杆菌菌株或者自生的微生物的组合物，其中自生的微生物的核酸与核酸靶向化合物发生反应而已经被改变；以及(b)使用本发明的组合物用于预防或者治疗宿主中的疾病的用法说明。