CN111770767B - 用于从生物流体中去除纤溶蛋白的体外设备和基质、其方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本公开的主题提供了用于从生物流体中耗尽纤溶剂的特定组合物、缀合物、设备、套件和系统。本公开的主题还涉及缺乏纤溶活性的所得生物流体产品、其治疗方法和用途。所述缀合物包含粒子、至少一个接头和至少一种氨基酸、其衍生物或其类似物，所述氨基酸、其衍生物或其类似物是4‑(氨基甲基)‑环‑己烷‑甲酸(氨甲环酸)、ε‑氨基己酸、赖氨酸、环己烷甲酸和4‑甲基‑环己烷甲酸中的至少一者。可使用多种不同的缀合物(例如，粒度或接头类型不同的缀合物)。

Description

用于从生物流体中去除纤溶蛋白的体外设备和基质、其方法 和用途
技术领域
本发明属于凝血和输血医学领域。更具体地，本发明提供了用于从生物流体中耗尽纤溶剂的特定设备和基质、所得的缺乏纤溶活性的生物流体产品、其方法和用途。
背景技术
下面列出了被认为是与本公开的主题有关的背景技术的参考文献。
Selighson U等人，Classification,Clinical Manifestations&Evaluation ofDisorders of Hemostasis.在：Williams Hematology，第8版，2010年，第2322-2330页中。
Abdel-Wahab OI等人，Effect of fresh-frozen plasma transfusion onprothrombin time and bleeding in patients with mild coagulationabnormalities.Transfusion 2006；46:1279-1285。
Holland LL等人，Toward rational fresh frozen plasma transfusion:Theeffect of plasma transfusion on coagulation test results.Am J Clin Pathol2006；126:133-139。
Meheux CJ等人，Efficacy of Intra-articular Platelet-Rich PlasmaInjections in Knee Osteoarthritis:A Systematic Review.Arthroscopy,2016,32,495-505。
Pap G等人，Expression of stromelysin and urokinase type plasminogenactivator protein in resection specimens and biopsies at different stages ofosteoarthritis of the knee.PathoI.Res.Pract.2000,196:219-226。
美国专利号7,125,569。
美国专利号3,998,946。
本文中对以上参考文献的认可不应被推断为意指这些参考文献以任何方式与本公开的主题的可专利性有关。
发明背景
正常止血是非常微妙地平衡的系统。血液在发挥其应有的功能时在脉管系统中保持为流体状态，但在密封伤口的需要出现时迅速凝结。在20世纪60年代，两个小组提出了一种凝块形成模型，该凝块形成模型设想了一系列连续步骤，在所述一系列连续步骤中一种凝结(凝血)因子的激活导致另一种凝结因子的激活，最终导致凝块形成。当这些凝血因子通过依序激活使得凝块形成时，称为纤溶系统的对应系统被进一步激活而变成凝块溶解(裂解)的原因。此种纤溶系统包含抗凝蛋白(纤溶酶原激活物、纤溶酶原和纤溶酶)，所述抗凝蛋白在依序激活后导致凝块裂解(Selighson U等人)。
由于凝血因子缺乏而引起的止血功能失效导致凝块形成受损(或不足)。同样，过度纤溶活性的结果导致所形成的凝块迅速且不当地溶解。另一方面，过度刺激凝血级联或抑制纤溶系统将会导致形成病理性凝块。因此，上述系统中每个系统失效的结果可能是出血或凝血趋势增加。
替代疗法可有效地治疗出血性病症，然而这种治疗可能还不够。在假设输送血浆将改善止血并且将纠正和/或防止出血的前提下，将新鲜冷冻血浆(FFP)经常地输给出血患者或凝血测试时间延长的患者。在麻省总医院(Massachusetts General Hospital)(Abdel-Wahab OI等人)进行的前瞻性审核中，检验了FFP对凝血参数，诸如凝血酶原时间(PT)和国际标准化比值(INR)的影响。数据显示，在这种背景下FFP的输送未能校正99％患者的PT，并且只有15％的患者的INR被校正为正常的至少一半。同样，Holland等人报告说FFP无法随时间推移改变INR。他们提出假设，FFP无法校正INR是由于受体血浆稀释了输注的FFP中存在的凝血因子而导致的。FFP含有凝血和纤溶系统的所有组分(蛋白质)，因此理论上适合于治疗遗传性或获得性凝血因子缺乏症患者的出血症状。另外，该产品被认为可防止患有凝血病的受试者在手术程序之前、期间和之后出血。然而，由于这些血浆源性产品除凝血因子外还含有纤溶蛋白，因此它们有可能诱使在置换该类产品的凝血因子期间和之后形成的止血凝块发生不希望有的裂解(溶解)现象。
因此，看起来迄今为止用于治疗出血过多的解决方案是有限的。在美国每年有超过192,000位患者由于损伤相关性失血而死亡(根据美国国家创伤研究所(the Nationaltrauma institute)的数据)。创伤手术、分娩、弥散性血管内凝血(DIC)、胃肠道出血等伴随有大量失血。在所有这些情况下，都需要有效地输送血浆来停止出血。然而，最近的研究已表明，血浆输送不能使大量出血停止，而其他治疗则显示出功效低下和死亡风险增加。大多数治疗选项都聚焦于凝血增强，然而，这些对大量出血的治疗导致了结果不足并且在一些情况下发生死亡。相比之下，有几种用于纤溶亢进的治疗，该纤溶亢进也会促成大量出血。当纤溶活性可能比纤维蛋白形成要快，从而威胁凝块完整性时，就会发生纤溶亢进。如今，57％的创伤患者和60％的肝硬化患者呈现出纤溶亢进，因此对于这些没有替代治疗选项的患者而言，增强凝血具有不良结果。开发本公开的主题以产生创新的体外设备，所述体外设备有效且特异性地提取和去除负责纤溶亢进的血浆蛋白。使用本公开的主题的医疗设备，医师可以改善输送的血浆并使止血从纤溶亢进转变为凝血并随后防止大量出血。
美国专利号3,998,946公开了用气相硅溶胶处理血浆或相关产品以去除没有聚合成纤维蛋白的纤维蛋白原、纤溶酶原和纤溶酶以及其他化合物但保留凝血因子II的方法。由于缺乏纤维蛋白原，所得产品不能支持凝块形成，因此不能用于治疗出血和止血病症。
美国专利号7,125,569以及其相应申请和专利公开了使用非常特殊的树脂从蛋白质混合物中仅去除纤溶酶(原)的特定方法。所得产品是出于制备用作生物胶的不含纤溶酶(原)的纤维蛋白原的目的而制备的。然而，所得混合物仍含有组织纤溶酶原激活物(tPA)，并且因此明显地表现出纤溶活性。更具体地，产品中存在的tPA激活了经处理区域中的纤溶酶原，从而导致对新形成的纤维蛋白网进行切割。纤溶酶原通常以高浓度(约2μM)存在于血液中，因此，在任何手术治疗期间的任何血液渗漏都会增加血管外区域中的纤溶酶原浓度。此外，假如在手术治疗期间将此类胶施加到受伤的血管上，则所述生物胶中存在的tPA会接触存在于血液中的纤溶酶原，并由此会激活纤溶级联。因此，在美国专利号7,125,569中公开的不含纤溶酶原的产品仅可作为生物胶用于局部施加，并且与输血中的全身性使用或治疗同纤溶治疗或溶栓治疗相关的出血无关。
因此，在本领域中需要有效的设备和缀合物来从哺乳动物体液，特别是血液、血浆以及其任何产品中耗尽纤溶蛋白。
发明内容
根据第一方面，本公开提供了多种缀合物或包含所述多种缀合物的组合物，每种缀合物包含粒子、至少一个接头和至少一种氨基酸、其衍生物或其类似物，其中所述多种缀合物包括至少两种不同的缀合物。所述氨基酸或其类似物可以是4-(氨基甲基)-环己烷-甲酸(氨甲环酸)、ε-氨基己酸(在此也称为氨基己酸)和赖氨酸中的至少一者，或它们的任何组合，而氨基酸衍生物可以是环己烷甲酸、4-甲基-环己烷甲酸或它们的任何组合中的至少一者。
根据一些其他方面，本公开提供了一种缀合物，所述缀合物包含至少一个粒子、至少一个接头和至少一种氨基酸、其衍生物或其类似物。在一些特定实施方案中，本公开的主题的缀合物可以是以下中的任一项：
其中代表粒子。
在另一方面中，本公开的主题提供了一种用于从哺乳动物体液中耗尽至少一种纤溶蛋白的设备，所述设备包括：
-壳体，所述壳体具有至少一个流体入口端口和至少一个流体出口端口；
-所述壳体包括至少一个腔室，所述至少一个腔室限定了与所述至少一个流体入口端口和所述至少一个流体出口端口流体连通的控制容积；
-所述控制体积容纳多种缀合物中的至少一种、或包含如由本公开的主题所定义的多种缀合物的组合物和如上文所定义的缀合物。
根据本文公开的主题的另一方面，提供了一种用于从哺乳动物体液中耗尽至少一种纤溶蛋白的设备，所述设备包括：
-壳体，所述壳体具有至少一个流体入口端口和至少一个流体出口端口；
-所述壳体包括至少一个腔室，所述至少一个腔室限定了与所述至少一个流体入口端口和所述至少一个流体出口端口流体连通的控制容积；
-所述控制容积容纳多组粒子，所述多组粒子至少包括第一组第一粒子和第二组第二粒子；
-其中所述第一粒子在尺寸上不同于所述第二粒子；
-其中所述第一粒子和所述第二粒子中的至少一者是与氨基酸、其衍生物或其类似物缀合的缀合粒子，其中所述氨基酸或其类似物是4-(氨甲基)-环-己烷-甲酸(氨甲环酸)、ε-氨基己酸和赖氨酸中的至少一者，并且所述其氨基酸衍生物是环己烷甲酸和4-甲基-环己烷甲酸或它们的任何组合。
例如，所述第一粒子和所述第二粒子是缀合粒子，每种缀合粒子与氨基酸、其衍生物或其类似物缀合，其中每种所述氨基酸或其类似物是4-(氨甲基)-环-己烷-甲酸(氨甲环酸)、ε-氨基己酸和赖氨酸中的至少一者，并且所述其氨基酸衍生物是环己烷甲酸和4-甲基-环己烷甲酸或它们的任何组合。
另外地和/或可替代地，例如，所述第一粒子和所述第二粒子是TXA缀合粒子，具体地是环己烷甲酸缀合粒子、4-甲基-环己烷甲酸缀合粒子或它们的任何组合。另外，例如，所述第一粒子和所述第二粒子是TXA缀合粒子。
如本文所用，术语缀合粒子是指经由接头缀合至氨基酸、其衍生物或其类似物的粒子。
另外地或可替代地，例如，所述缀合粒子由上文定义的多种缀合物或组合物限定。
另外地或可替代地，例如，所述壳体包括纵向轴线，并且包括主体部分和成对端盖，所述成对端盖包括具有所述至少一个流体入口端口的入口端盖和具有所述至少一个流体出口端口的出口端盖。
例如，所述控制容积由设定在所述主体部分的相对纵向端的对应屏障构件限定。
例如，所述屏障构件被配置用于防止所述粒子离开所述控制容积。
例如，所述屏障构件被配置用于同时允许所述哺乳动物体液穿过控制容积流通，或者所述屏障构件被配置用于同时允许所述哺乳动物体液穿过所述控制容积流通，其中在所述设备的使用中，所述哺乳动物体液经由所述入口端盖和所述流体入口端口进入所述控制容积，并且在离开所述控制容积之后，经由所述出口端盖和所述流体出口端口流动。
另外地或可替代地，例如，所述屏障构件各自包括多个开口以允许所述哺乳动物体液穿过所述开口流通，所述开口的大小小于所述粒子的大小。
在其他方面中，本公开的主题涉及一种套组，所述套组用于从哺乳动物体液中耗尽至少一种纤溶蛋白，所述套组包括多个设备，其中每个设备如本文公开的主题所定义。所述多个设备中的设备以在所述多个设备的相应所述控制容积之间提供流体连通的方式互连。
本公开的主题的另一方面涉及一种用于从哺乳动物体液中耗尽至少一种纤溶蛋白的套件，所述套件包括：
-如由本公开的主题所定义的至少一个设备，
-盐水贮存器，所述盐水贮存器与所述至少一个入口端口选择性流体连通；
-接受者血浆贮存器和洗涤废物贮存器，其中所述接受者血浆贮存器和所述洗涤废物贮存器与所述至少一个流体出口端口选择性且非同时流体连通。
在另一方面中，本公开的主题提供了一种用于从哺乳动物体液中耗尽至少一种纤溶蛋白的系统，所述系统包括：
-如由本公开的主题所定义的至少一个设备，
-盐水贮存器和供体贮存器，其中所述盐水贮存器和所述供体贮存器与所述至少一个流体入口端口选择性且非同时流体连通；
接受者血浆贮存器和洗涤废物贮存器，其中所述接受者血浆贮存器和所述洗涤废物贮存器与所述至少一个流体出口端口选择性且非同时流体连通。
因此，在另一方面中，本公开的主题涉及一种用于从哺乳动物体液或其任何产品中耗尽至少一种纤溶蛋白的方法。更具体地，所述方法包括以下步骤：(i)对所述体液进行特异于至少一种纤溶蛋白的亲和力耗尽工序；以及(ii)回收在步骤(i)中获得的至少一种纤溶蛋白耗尽的体液。应当注意的是，亲和力耗尽工序可包括使体液与有效量的多种缀合物或包含所述多种缀合物的至少一种组合物接触。或者，可以将体液施加到包含所述多种缀合物的设备、套组、套件或系统或它们的任何组合上。在一些实施方案中，每种缀合物包含至少一个粒子、至少一个接头和至少一种氨基酸、其衍生物或其类似物。在一些特定实施方案中，多种缀合物包含至少两种不同的缀合物，并且其中所述氨基酸、其衍生物或其类似物是4-(氨甲基)-环-己烷-甲酸(氨甲环酸)、ε-氨基己酸赖氨酸，环己烷甲酸和4-甲基-环己烷甲酸中的至少一者。在一些其他特定实施方案中，所述多种缀合物包括至少两种不同的缀合物，并且其中所述氨基酸、其衍生物或其类似物是4-(氨甲基)-环-己烷-甲酸(氨甲环酸)、ε-氨基己酸和赖氨酸中的至少一者。
在另一方面中，本公开的主题提供了一种用于治疗、预防、防治、改善、抑制有需要的受试者的出血、止血病症和与其相关的任何出血或病理疾患的方法。更具体地，所述方法可包括向所述被治疗的受试者施用治疗有效量的至少一种具有降低的纤溶活性的血液和/或血液源性产品的步骤。在一些实施方案中，可通过如本文所述的方法制备所述产品。
附图说明
为了更好地理解本文公开的主题并且例示如何可在实践中实施本公开的主题，现在将仅通过非限制性示例的方式，参考附图来描述实施方案，在附图中：
图1：缀合物2
用于制备缀合物2的化学反应的示意图。
图2：纤溶酶原(PLG)标准曲线
表示用于计算PLG浓度的标准曲线的图。
图3：纤溶酶原耗尽的冷沉淀物
表示在未经处理的冷沉淀物相对于使用ClearPlasma过滤过的冷沉淀物中的纤溶酶原浓度的图。
图4：通过ClearPlasma加上缀合物1(“[缀合至含4％琼脂糖的珠粒的TXA]”)进行的血浆过滤
展示血液流动和血浆与红血细胞分离的示意图。另外，该图解展示了使用ClearPlasma生成了具有降低的tPA水平的纤溶酶原耗尽的血浆。
图5：使用ClearPlasma减少了猪的肝损伤中的失血量
展示在肝破裂后的30分钟以内显现的失血量的直方图。使用学生t检验计算统计数据(双尾分布等方差)。数据是以平均值±标准偏差表示。P<0.05的值被认为是显著的。
图6A至图6L：ClearPlasma加上缀合物1(“缀合至含4％琼脂糖的超流珠粒的TXA”)消除了纤溶活性
对猪进行血浆置换，使用ClearPlasma对血浆进行处理或不作处理。通过TEG评估所得猪的全血的凝血和纤溶状况。
图6A：从对照猪在麻醉前获得的血液的凝血状况。
图6B：来自对照猪在采用0.083μM Wt-tPA的情况下在麻醉前的血液。
图6C：对照猪在麻醉后的血液。
图6D：对照猪在采用0.083μM Wt-tPA的情况下在麻醉后的血液。
图6E：对照猪在血浆置换和纤溶酶原耗尽之前的血液。
图6F：猪在采用0.083μM Wt-tPA的情况下在血浆置换和纤溶酶原耗尽之前的血液。
图6G：猪在血浆置换之前的血液。
图6H：猪在采用0.083μM Wt-tPA的情况下在血浆置换之前的血液。
图6I：对照猪在血浆置换和纤溶酶原耗尽之后的血液。
图6J：猪在采用0.083μM Wt-tPA的情况下在血浆置换和纤溶酶原耗尽之后的血液。
图6K：猪在血浆置换控制之后的血液。
图6L：猪在采用0.083μM Wt-tPA的情况下在血浆置换术之后的血液。
图7A至图7F：TEG分析-ClearPlasma消除了人血浆中的纤溶活性
将流经ClearPlasma的新鲜冷冻血浆流(以PDP表示)的凝血和纤溶状况与通过血栓弹力描记术(TEG)获悉的未经处理的血浆(以FFP表示)的凝血和纤溶状况进行比较。
图7A：FFP显示出未经附加处理下的凝块形成。
图7B：添加组织纤溶酶原激活物(tPA-1.85nM)使得凝块分解。
图7C：图7A和图7B的叠加。
图7D：纤溶酶原耗尽的血浆(PDP)显示出未经附加处理下的凝块形成。
图7E：添加组织纤溶酶原激活物(tPA-1.85nM)并未使得凝块分解。
图7F：图7D和图7E的叠加。
数据示出了代表性实验结果(来自三个独立实验)。
图8：在小鼠剪尾后的出血时间
显示个别小鼠(编号为1至8)在用ClearPlasma、血浆或盐水处理过并经剪尾后的出血时间的图。
图9：每只小鼠的颗粒大小结果(在24小时时)
显示个别小鼠(编号为1至8)在用ClearPlasma、血浆或盐水处理过并经剪尾后的颗粒大小的图。
图10：在小鼠中在剪尾后的出血测试
颗粒大小结果：将来自出血测试的血细胞颗粒离心并吸出上清液。然后使用标尺测量颗粒大小。使用单因素方差分析，接着使用事后LSD/SCHELF来对颗粒大小测量结果进行统计分析(p<0.05被认为是显著的)。
图11A至图11B：ClearPlasma降低了猪的纤溶酶原水平和tPA蛋白水平
在麻醉下使用Haemonetics mcs+系统对母猪进行血浆置换。两种工序均以类似方式进行(经过滤的血液量、经过抗凝剂处理、时间和所收集的血浆量)。
图11A：表示将经ClearPlasma过滤的猪血浆样本(以PDP表示)中的纤溶酶原耗尽与未经过滤的对照血浆中的纤溶酶原耗尽相比较而得的图。
图11B：表示将经ClearPlasma过滤的猪血浆样本(以PDP表示)中的tPA耗尽与未经过滤的对照血浆中的tPA耗尽相比较而得的图。
来自四个独立实验的代表性结果。
图12：设备
示出了根据本公开的主题的第一示例的设备的横截面侧视图。
图12A：示出了根据图12的示例的替代变型的设备的分解等距视图。
图12B：示出了根据图12的示例的替代变型的设备的一部分的横截面细节侧视图。
图13A至图13D：设备
图13A：示出了根据图12的示例的设备的主体部分的俯视图。
图13B：示出了根据图13A的示例的设备的主体部分的侧视图。
图13C：示出了根据图13B的示例的设备的主体部分沿着A-A截取的横截面侧视图。
图13D：示出了根据图13C的示例的设备在“G”处的一部分的横截面细节侧视图。
图14A至图14D：设备的端盖
图14A：示出了根据图12的示例的设备的端盖的俯视图。
图14B：示出了根据图14A的示例的设备的端盖的侧视图。
图14C：示出了根据图14B的示例的设备的端盖沿着A-A截取的横截面侧视图。
图14D：示出了根据图14C的示例的设备在“G”处的一部分的横截面细节侧视图。
图15系统
示意性地示出了根据本公开的主题的示例的系统，所述系统呈洗涤配置。
图16系统
示意性地示出了根据图15的示例的系统，所述系统呈处理配置。
图17试剂盒
示意性地示出了与根据图15的示例的系统相对应的试剂盒。
图18.系统
示意性地示出了根据本公开的主题的另一示例的系统，所述系统包括一系列设备。
图19系统
示意性地示出了根据本公开的主题的另一示例的系统，所述系统包括一系列设备。
具体实施方式
本公开根据其最广泛的方面提供了多种缀合物或包含所述多种缀合物的组合物，每种缀合物具有通式(I)
X-Y-Z (I)
其中：
X是固体支持部分，例如粒子；
Y是连接部分X和Z的化学反应性部分；
Z是包含氨基酸、其衍生物或其类似物中的至少一者的部分；并且
其中每个“-”表示相互作用/缔合，例如包含任选的一个或多个居间原子的化学键，所述任选的一个或多个居间原子用作间隔基或用作选择性引导部分。
如本文所用的术语氨基酸是指含有氨基(-NH2)和羧基(-COOH)基团的化合物(例如，有机化合物)，并且涵盖所述化合物的如本文所详述的任何衍生物或任何类似物。在本公开的上下文中，术语“部分”可指如本文所述起作用的分子的原子、一组原子和任何功能片段。所述部分也可为如本文所述起作用的至少一种材料的物理要素(即，单个原子或多个原子)形式，诸如胶囊、球体、纳米粒子、脂质体等。
“氨基酸类似物”是具有与天然存在的氨基酸相同的化学结构(即，羧基和氨基或R基团)的化合物(在本文中也称为结构类似物)。示例包括高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。在又一些其他实施方案中，术语氨基酸类似物还涵盖功能类似物，特别是执行相同生物学功能的分子。某一氨基酸(例如，赖氨酸)的此类功能类似物的非限制性示例是氨甲环酸(TXA)，其充当赖氨酸的功能类似物，从而通过可逆地结合纤溶酶原上的4至5个赖氨酸受体位点而用作抗纤溶剂。
如本文所用的“氨基酸衍生物”是包含某一氨基酸或其任何类似物(结构类似物和/或功能类似物)的至少一个片段(部分、区段)，例如至少缺少氨基的化合物。在一个具体的示例中，氨基酸衍生物包括氨基酸或其类似物的环己烷甲酸片段，即缺乏氨基的片段。
根据一些实施方案，氨基酸、其衍生物或其类似物可以是4-(氨甲基)-环-己烷-甲酸(氨甲环酸)、ε-氨基己酸、赖氨酸、环己烷甲酸、4-甲基-环己烷甲酸中的至少一者或它们的任何组合。
根据第一方面，本公开提供了多种缀合物或包含所述多种缀合物的组合物，每种缀合物包含粒子、至少一个接头和至少一种氨基酸、其衍生物或其类似物。在一些实施方案中，多种缀合物包括至少两种不同的缀合物。更进一步，在一些实施方案中，氨基酸、其衍生物或其类似物可以是4-(氨甲基)-环-己烷-甲酸(氨甲环酸)、ε-氨基己酸、赖氨酸、环己烷甲酸和4-甲基-环己烷甲酸中的至少一者或它们的任何组合。更进一步，在一些实施方案中，氨基酸、其衍生物或其类似物可为4-(氨甲基)-环-己烷-甲酸(氨甲环酸)、ε-氨基己酸和赖氨酸中的至少一者，或它们的任何组合。在又一些实施方案中，氨基酸、其衍生物或其类似物可为氨甲环酸(TXA)。
如本文所用的缀合物是指由几种要素(组分)构成的化合物，所述几种要素包括均彼此缔合的至少一个粒子、至少一个接头和至少一种氨基酸、其衍生物或其类似物。应当注意的，虽然本申请涉及“至少一个粒子”，但是本文涵盖适用于所要求保护的多种缀合物的任何固体支持物。
本公开的主题的缀合物中的任一缀合物或其任何组合物也可称为物质的组合物。在最一般的术语中，类似于“缀合物”的“物质组合物”两者均可互换使用，是指至少一个粒子、至少一个接头和至少一种氨基酸、其衍生物或其类似物的缔合，所述缔合如下所述产生的性质可归因于物质组合物(或缀合物)的整体，而不是归因于缀合物的处于分离状态的任何组分。
在一些实施方案中，本公开的主题的任何缀合物涵盖至少一个粒子与作为接头的至少一种化学反应性部分缔合和至少一个接头与至少一种氨基酸、其衍生物或其类似物缔合，从而使接头位于粒子与氨基酸、其衍生物或其类似物之间，并因此在一个末端(一个臂)处与粒子缔合并在另一个末端(在第二不同臂)处与氨基酸、其衍生物或其类似物缔合。
如本文所用，术语“缔合”或其任何语言变型是指将两个实体(例如，粒子和接头)保持在一起的化学或物理力。这种力可以是本领域技术人员已知的任何类型的化学或物理键合相互作用。
此类缔合相互作用的非限制性示例是共价键、离子键、配位键、络合、氢键、范德华键，疏水-亲水相互作用等。因此，接头与至少一个粒子的缔合/缀合和接头与氨基酸的缔合/缀合可通过任何化学键合进行，所述化学键合包括共价键合、静电相互作用、酸碱相互作用、范德华相互作用等。如所理解的，如下文进一步详述，粒子和接头的缔合以及接头与氨基酸、其衍生物或其类似物的缔合可以相同或不同。
例如且如下文详述，对于为环己烷甲酸或4-甲基-环己烷甲酸的氨基酸衍生物(即，至少缺乏氨基酸类似物的NH2基团(氨基))，接头可包含氨基(单独或与亚甲基结合，即为-NH2-CH2-，“-”是共价键)。在替代示例中，对于氨基酸或其类似物(即，包含氨基酸的NH2基团(氨基))，接头可不包含氨基(单独或与亚甲基结合，即为-NH2-CH2-，“-”是共价键)。
如上所述，多种缀合物可以由本公开的主题以组合物形式提供。如本文所用的组合物包含多种缀合物，所述多种缀合物包括至少两种不同的缀合物。不同的缀合物应理解为至少一个参数不同。更具体地，由于缀合物变型是在至少一种缀合物组分(例如粒子、接头、氨基酸、其衍生物或其类似物)的至少一个参数或特性方面不同，有时是在至少两种缀合物组分的至少一个参数或特性方面不同，有时是在至少三种缀合物组分的至少一个参数或特性方面不同。因此，多种缀合物中的至少两种不同的缀合物或其组合物可包含不同的粒子和/或不同的接头和/或不同的氨基酸、其衍生物或其类似物。换句话说，本文称为“不同缀合物”的缀合物包含缀合物组分，例如粒子、接头、氨基酸，使得至少一个、至少两个或所有三个组分不是相同的(例如不同)。
在一些实施方案中，至少两种不同的缀合物包含不同的粒子。
在一些实施方案中，至少两种不同的缀合物包含不同的接头。
在一些实施方案中，至少两种不同的缀合物包含不同的氨基酸、其衍生物或其类似物。
在一些实施方案中，至少两种不同的缀合物包含相同的粒子、相同的接头和不同的氨基酸、其衍生物或其类似物。
在一些其他实施方案中，至少两种不同的缀合物包含相同的粒子、不同的接头和相同的氨基酸、其衍生物或其类似物。
在一些其他实施方案中，至少两种不同的缀合物可包含不同的粒子、相同的接头和相同的氨基酸、其衍生物或其类似物。
在一些实施方案中，至少两种不同的缀合物包含不同的粒子和不同的接头。在一些实施方案中，至少两种不同的缀合物包含不同的粒子、不同的接头和相同的氨基酸、其衍生物或其类似物。
在一些实施方案中，至少两种不同的缀合物包含不同的粒子和不同的氨基酸、其衍生物或其类似物。在一些实施方案中，至少两种不同的缀合物包含不同的粒子、不同的氨基酸、其衍生物或其类似物，以及相同的接头。
在一些实施方案中，至少两种不同的缀合物包含不同的接头和不同的氨基酸、其衍生物或其类似物。在一些实施方案中，至少两种不同的缀合物包含不同的接头、不同的氨基酸、其衍生物或其类似物，以及相同的粒子。
在一些实施方案中，至少两种不同的缀合物包含不同的粒子、不同的接头和不同的氨基酸、其衍生物或其类似物。
术语“不同接头”应理解为使得差异可在接头特性(诸如接头的化学式)方面。
如上所述，由本公开的主题提供的多种缀合物或其任何组合物可包含至少两种不同的缀合物、至少三种不同的缀合物、至少四种不同的缀合物、至少五种不同的缀合物、至少六种不同的缀合物、至少七种不同的缀合物、至少八种不同的缀合物、至少十种不同的缀合物，至少11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、25种、30种、35种、40种、45种、50种、55种、60种、65种、70种、75种、80种、85种、90种、95种、100种或更多种不同的缀合物。
更进一步，当提及不同的缀合物时，应当理解为使得差异可为在缀合物或其任何组分(例如粒子、接头和氨基酸)的至少一个特征(特性、参数)方面，例如大小、化学组成、形状、结构、密度、电导率、溶解度、材料等方面。例如，在大小和/或不同组成和/或不同形状和/或不同结构中的至少一者方面不同的粒子、接头或氨基酸中的至少一者被认为是不同的粒子。
令人惊讶地发现，如本文所述包括至少两种不同缀合物的多种缀合物或包含至少两种不同缀合物的组合物可有效地耗尽纤溶蛋白(诸如来自体液的纤溶酶原、纤溶酶和/或tPA，特别是血液、血浆和任何血液制品)。
在一些实施方案中，多种缀合物包含平均粒度介于约10μm或更低至约500μm或更高之间的粒子。具体地为μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm或更高。在一些特定实施方案中，多种缀合物包含平均粒度为至少70μm或更低，有时至少80μm、有时至少90μm、有时至少100μm、有时至少110μm、有时至少120μm、有时至少130μm、有时至少140μm、有时至少150μm的粒子。在一些实施方案中，多种缀合物的平均粒度介于约90μm至约150μm或更高之间。
术语“平均大小”或“平均直径”或“均值大小”是指测得直径的算术平均值，其中直径范围为平均值的±25％。粒子的平均大小可以通过本领域已知的任何方法来测量。
在一些实施方案中，多种缀合物包含至少两个具有不同平均大小的不同粒子。应该注意的是，不受理论的束缚，使用两种或更多种不同大小的粒子(例如珠粒)具有使表面积最大化的优势，因此体液(例如，血浆)主要在珠粒的表面上流动，几乎没有无效空间(dead space)。由于有许多不同大小的珠粒，所以树脂床中的自由空间较少。
另一方面，将树脂紧密填充成几乎没有路径让血浆流动意味着较低的流速。
更具体地，发明人惊奇地发现，不同大小的粒子的混合物可改善微流动性并且在保持相同的流速的同时使更多的血浆暴露于缀合物(树脂)。此外，混合具有至少两种粒度的缀合物可减少珠粒的量，从而使所用缀合物的成本最小化。在一些实施方案中，本公开的主题的缀合物可使用至少两组具有不同大小的粒子形成包含缀合物的树脂。在一些特定实施方案中，粒子可以以介于约0.001:1至约1:10000之间，更具体地介于约0.01:1至1:10000之间、介于约1:1至1:1000之间的比率存在。在又一些实施方案中，所述比率可以是1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000。更具体地，根据本公开的主题的多种缀合物或其组合物的粒子可具有在一些实施方案中呈现的比率介于约1:1至1:10之间，特别地为1:4的至少两种不同大小。在一些实施方案中，本文公开的主题的多种缀合物，在本文中也称为本文公开的主题的树脂，可包含具有平均大小为约90μm或更低的粒子和平均大小为150μm或更高的粒子的不同缀合物的混合物。在又一些其他特定实施方案中，本公开的主题的多种缀合物或组合物可包含具有4:1比率的平均粒度为90μm的粒子和平均粒度为150μm的粒子的缀合物。
如本文所用的术语粒子是指物质的一部分，所述部分具有可附接至化学或生物化合物的表面，是可通过共价键或非共价键附接的小分子或大分子。所述粒子可包含多孔材料。所述粒子例如可为“球形的”(通常是指基本上(近乎)圆球几何形状)或“非球形的”(形状为“细长的”并具有确定的长轴线和短轴线)。粒子的非限制性示例包括珠粒，诸如多糖珠粒、玻璃珠粒、棉珠粒、塑料珠粒、尼龙珠粒、乳胶珠粒、磁性珠粒、顺磁性珠粒、超顺磁性珠粒、淀粉珠粒及类似物、硅珠粒、PTFE珠粒、聚苯乙烯珠粒、砷化镓珠粒、金珠粒或银珠粒中的至少一者。在一些实施方案中，粒子是包括琼脂糖珠粒的珠粒，所述珠粒任选地处于不同材料(琼脂糖)％的不同交联度下。
如此，琼脂糖珠粒涵盖包含不同交联度的琼脂糖的珠粒，例如表示为琼脂糖凝胶珠粒的珠粒。在一些实施方案中，珠粒包括琼脂糖珠粒。在一些实施方案中，珠粒包括琼脂糖凝胶珠粒。在一些实施方案中，多种缀合物包含粒子的组合，所述粒子包括琼脂糖珠粒和琼脂糖凝胶珠粒。根据本公开，应当注意的是，粒子为琼脂糖珠和粒子为琼脂糖凝胶珠粒被认为是具有不同粒子的两种不同的缀合物。
琼脂糖凝胶是交联珠粒状形式的琼脂糖的商品名，是从海藻中提取的多糖聚合物材料。它的品牌名称来自Separation-Pharmacia-Agarose。琼脂糖凝胶是GE Healthcare(以前为Pharmacia、Pharmacia LKB Biotechnology、Pharmacia Biotech、AmershamPharmacia Biotech和Amersham Biosciences)的注册商标。有各种等级和化学性质的琼脂糖凝胶。
如本文所述，多种缀合物可包括至少两种不同的缀合物，所述至少两种不同的缀合物任选地具有拥有不同性质(诸如不同大小、不同形状、不同组成和不同材料)的粒子。在一些实施方案中，所述多种缀合物可包含平均大小为约90μm的琼脂糖珠粒。在一些实施方案中，多种缀合物可包含平均大小为约150μm的琼脂糖珠粒。在一些实施方案中，多种缀合物可包含平均大小为约90μm的琼脂糖凝胶珠粒。在一些实施方案中，多种缀合物可包含平均大小为约150μm的琼脂糖凝胶珠粒。根据本公开，应该注意的是，粒子是平均大小为约90μm的琼脂糖凝胶珠粒和粒子是平均大小为约150μm的琼脂糖凝胶珠粒被认为是具有不同粒子的两种不同的缀合物。
如本文所述的粒子，特别是珠粒，可与化学反应性部分(在本文中称为接头)缔合。如本文所用的接头可以是由原子的任何组装构成的任何化学实体，包括任何长度的低聚和聚合链，所述接头根据一些实施方案能够在一个末端上与粒子结合并在另一个末端上与至少一种氨基酸、其衍生物或其类似物结合。此外，发明人发现粒子表面的接头覆盖可在介于约9至约23μmol珠粒/ml沥干介质之间的范围内。更具体地，应当注意的是，在一些实施方案中，沥干介质在本文中是指干燥的珠粒。
如本文所述，接头能够在一个末端处与粒子结合并且在第二末端处与氨基酸、其衍生物或其类似物结合，因此接头在两侧处均具有官能性末端。换句话说，接头可以是双官能接头。在一些实施方案中，接头是双官能交联剂，并且粒子是与双官能交联剂结合的珠粒。如本文所用，术语“交联剂”是指含有两个或更多个反应性末端的试剂，所述反应性末端能够化学附接至氨基酸、肽、蛋白质或其他分子上的特定官能团(例如伯胺、羧基、巯基等)。
在一些实施方案中，接头(或交联剂)可以是双官能接头或包含所述双官能接头的部分/片段。
如所理解的，取决于各种实验要求，接头可具有不同的长度。长度是指交联剂的分子跨度，即，缀合组分(例如粒子和氨基酸)之间的距离。在一些实施方案中，交联剂是可切割的(即，当需要时，该键可被颠倒或断开，例如EDC)。在一些实施方案中，交联剂是零长度交联剂。在一些实施方式中，交联剂导致直接缀合而不是成为最终交联共价键的一部分。
交联剂可以是同双官能交联剂或异双官能交联剂。同双官能交联剂是在两端具有相同类型反应基团的试剂。胺交联剂(即结合胺反应性基团)可选自例如戊二醛、双(亚氨酸酯)或双(琥珀酰亚胺酯)(也称为NHS酯)。根据一些实施方案，同双官能交联剂(诸如但不限于庚二亚氨酸二甲酯(DMP)或戊二醛)可结合至磁性珠粒上的NH2基团(伯基)和结合至氨甲环酸的NH2基团。巯基交联剂可选自例如马来酰亚胺或吡啶基二硫醇。
在一些实施方案中，交联剂是异双官能交联剂。异双官能交联剂是在任一末端处具有不同类型的反应性基团的试剂，所述异双官能交联剂为例如但不限于胺与巯基交联剂或胺与羧基交联剂。
胺与巯基交联剂可在每个末端处具有NHS酯和马来酰亚胺，或者在每个末端处具有NHS酯和吡啶基二硫醇。可结合胺和巯基的异双官能交联剂的示例选自但不限于N-琥珀酰亚氨基3-[2-吡啶基二硫醇]-丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)或琥珀酰亚胺-4-(对马来酰亚氨基苯基)丁酸酯(SMPB)。
胺与羧基交联剂可具有碳二亚胺。此类碳二亚胺交联剂可激活羧基以与伯胺进行自发反应。这些交联剂可将羧基(谷氨酸根、天冬氨酸根、C末端)缀合至伯胺(赖氨酸、N末端)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。可结合胺和羧基的异双官能交联剂的示例选自但不限于二环己基碳二亚胺(DCC)和(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDAC)。这些交联剂用于缀合羧基(谷氨酸根、天冬氨酸根、C末端)与伯胺(赖氨酸、N末端)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以稳定激活甲酸根进行胺缀合。
在一些实施方案中，接头是芳香系。非限制性示例包括苯甲酸或取代的苯甲酸、苯磺酰氯、苯甲醛、氯甲基苯。
在一些特定实施方案中，所使用的接头是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)。
如上文详述，对于包含氨基酸衍生物(例如环己烷甲酸或4-甲基-环己烷甲酸(即，缺乏氨基酸的NH2基团(氨基))的缀合物，接头可包含氨基(单独或与亚甲基结合，即为-NH2-CH2-，“-”是共价键)。因此，应注意的是，在一些实施方案中，本文所述的接头可包含至少附加氨基或结合至亚甲基的氨基。因此，根据此类实施方案，与氨基酸衍生物结合的接头末端是接头的氨基或接头的亚甲基。换句话说，接头的一个末端与氨基酸衍生物之间的缔合包括环己烷环与氨基或亚甲基的共价键。此类缔合可以通过本领域技术人员已知的任何已知合成方法进行。
在一些实施方案中，珠粒可通过存在于所述珠粒上的间隔物或包衣而与接头缔合。如此，珠粒最初是通过与间隔物/包衣缔合，然后与接头反应而被激活的(“激活的珠粒”)。应当指出的是，有时在间隔物/包衣与至少一种氨基酸直接结合的情况下，还可不需要任何接头。有时，珠粒不具有能够结合至接头的官能团，并且可使用间隔物或包衣。
激活的珠粒是通过用合适的材料预包被珠粒获得的，所述合适的材料具有使得能够与珠粒和与接头和/或氨基酸结合的活性部分。换句话说，珠粒经预包被以包含反应性基团，所述反应性基团使得能够共价结合至接头或氨基酸。
在一些实施方案中，可例如通过用任何包衣材料预包被来激活珠粒。此类材料的非限制性示例包括例如氨基酸、蛋白质、环氧化物、甲苯磺酰基、羧酸、羧化聚乙烯醇。当提及“预包被”时，应理解为预备步骤，所述预备步骤导致珠粒被活性材料包被，所述包被继而使得珠粒能够与氨甲环酸共价结合(即直接结合)或通过至少一个接头结合。在一些实施方案中，珠粒预包被有氨基酸、肽或它们的任何衍生物。经预包被的磁性珠粒可包含例如伯胺(-NH2)、羧基(-COOH)、巯基(-SH)或羰基(-CHO)作为活性基团。在一些实施方案中，将珠粒预包被以包含可与伯氨基或仲氨基反应的部分。在一些其他实施方案中，磁性珠粒包被有聚赖氨酸。
如本文所用，术语“接头”涵盖存在于珠粒上的任何间隔物或预包衣。
在一些实施方案中，接头包含或为原子链，例如直链。在一些实施方案中，接头包含至少1个原子、至少4个原子、有时5个原子、有时10个原子、有时20个原子、有时30个原子、有时40个原子。在一些实施方案中，接头是或包含具有1至40个原子的直链。在一些实施方案中，接头是或包含具有1个原子的直链。在一些实施方案中，接头是包含5个原子的直链。在一些实施方案中，接头是包含15个原子的直链。
在一些实施方案中，接头是包含31个原子的直链。在一些实施方案中，接头是26-(2-羟基-3-甲氧基-丙基氨基)-二十六烷酸2,5-二氧杂-吡咯烷-1-基酯的片段。在一些实施方案中，接头是4-氧杂-戊酸甲酯的片段。在一些实施方案中，接头是亚甲基。
如本文所述，对于氨基酸衍生物，接头在一个末端(与环己烷环反应的末端)处包含氨基或亚甲基(-CH2-)基团。
如所理解的，当接头与氨基酸、其衍生物或其类似物缔合时，接头由于该缔合而被修饰，并且在一些实施方案中包含接头的片段。
接头性质取决于接头内原子的性质。已经发现了包含至少一个具有至少一个孤对电子的原子(诸如氧、氮或硫)的接头。在一些实施方案中，接头包含至少一个氧原子。
在一些其他实施方案中，所述接头与至少一个氨基酸、其衍生物或其类似物之间的缔合可以是共价键合。在一些其他实施方案中，接头与至少一个氨基酸之间的缔合可以通过氨基酸的氮(N)原子与接头的碳(C)原子的键合来实现。如所理解的，在缔合和形成化学键后，氨基(-NH2-)损失一个氢原子，变成-NH-。在一些实施方案中，共价缔合是通过胺、亚胺或酰胺键。在一些实施方案中，氨基酸是氨甲环酸(TXA)。如本文所详述，在一些实施方案中，氨基酸衍生物是环己烷甲酸，并且环己烷甲酸与接头的缔合/相互作用是通过环己烷环和接头的亚甲基实现的。如以下实施例1.1中所详述，在多种缀合物的至少部分中，可以用26-(2-羟基-3-甲氧基-丙基氨基)-二十六烷酸2,5-二氧杂-吡咯烷-1-基酯预包被珠粒。因此，使与26-(2-羟基-3-甲氧基-丙基氨基)-二十六烷酸2,5-二氧杂-吡咯烷-1-基酯缔合的琼脂糖珠粒与至少一种氨基酸或其类似物缔合。缀合物中的接头是26-(2-羟基-3-甲氧基-丙基氨基)-二十六烷酸2,5-二氧杂-吡咯烷-1-基酯的片段，特别是26-(2-羟基-3-甲氧基-丙基氨基)-二十六烷醛的片段。如所理解的，由于26-(2-羟基-3-甲氧基-丙基氨基)-二十六烷酸2,5-二氧杂-吡咯烷-1-基酯与氨基酸或其类似物之间的缔合，所以接头是26-(2-羟基-3-甲氧基-丙基氨基)-二十六烷酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯的片段，特别是26-(2-羟基-3-甲氧基-丙基氨基)-二十六烷醛的片段。
如以下实施例1.2中所详述，在多种缀合物的至少一部分中，珠粒可用氢氧化物预包被，并与琥珀酸酐和吡啶反应，然后与N-羟基琥珀酰胺(NHS)和EDC反应。因此，使与4-(2,5-二氧杂-吡咯烷-1-基)-4-氧代-丁酸甲酯缔合的琼脂糖珠粒与至少一种氨基酸或其类似物缔合。缀合物中的接头是4-(2,5-二氧杂-吡咯烷-1-基)-4-氧代-丁酸甲酯的片段，特别是4-氧杂-丁酸甲酯的片段。
在一些实施方案中，缀合物包含平均大小为90μm的琼脂糖珠粒。在一些实施方案中，接头包含26-(2-羟基-3-甲氧基-丙基氨基)-二十六烷醛。在一些实施方案中，缀合物可具有以下结构(在本文中称为“缀合物1”)：
/>
其中代表粒子，例如琼脂糖珠粒，特别是平均大小为90μm的4％琼脂糖珠粒。
在一些实施方案中，氨基酸是TXA，粒子是平均大小为90μm的琼脂糖珠粒，并且接头包括26-(2-羟基-3-甲氧基-丙基氨基)-二十六烷醛，并且缀合物具有本文中称为缀合物1的结构。在一些实施方案中，其中氨基酸衍生物是环己烷甲酸，粒子是平均大小为90μm的琼脂糖珠粒，并且接头包括26-(2-羟基-3-甲氧基-丙基氨基)-二十六烷酸甲酰胺，并且缀合物具有本文中称为缀合物1的结构。
在一些实施方案中，本公开的主题的缀合物包含平均大小为150μm的琼脂糖凝胶珠粒。在一些实施方案中，接头包含4-氧杂-丁酸甲酯。在一些实施方案中，缀合物可以具有以下结构(在本文中称为“缀合物2”)：
其中代表粒子，例如平均大小为150μm的琼脂糖凝胶珠粒。
在一些实施方案中，氨基酸是TXA，粒子是平均大小为150μm的琼脂糖凝胶珠粒，并且接头包括4-氧杂-丁酸甲酯，并且该缀合物具有在本文中称为缀合物2的结构。
在一些实施方案中，其中氨基酸衍生物是环己烷甲酸，粒子是平均大小为150μm的琼脂糖凝胶珠粒，并且接头包含N-甲基-琥珀酸甲酯，并且缀合物具有在本文中称为缀合物2的结构。
在一些实施方案中，缀合物包含平均大小为150μm的琼脂糖珠粒。在一些实施方案中，接头包含亚甲基。在一些实施方案中，缀合物可以具有以下结构(在本文中称为“缀合物3”)：
其中代表粒子，例如平均大小为150μm的琼脂糖珠粒。
在一些实施方案中，氨基酸是TXA，粒子是平均大小为150μm的琼脂糖珠粒，并且接头包含亚甲基并且缀合物具有本文中称为缀合物3的结构。
在一些实施方案中，其中氨基酸衍生物是环己烷甲酸，粒子是平均大小为150μm的琼脂糖珠粒，并且接头包含二甲胺并且缀合物具有本文中称为缀合物3的结构。
在一些实施方案中，缀合物包含琼脂糖珠粒。在一些实施方案中，接头包含具有15个原子的碳链。在一些实施方案中，接头是十六醛。在一些实施方案中，缀合物可具有以下结构(缀合物4)：
其中代表粒子。
在一些实施方案中，缀合物包含琼脂糖珠粒。在一些实施方案中，接头包含具有15个原子的碳链。在一些实施方案中，接头是十六酸甲酰胺。在一些实施方案中，缀合物可具有以下结构(缀合物4):
根据一些其他方面，本公开提供了至少一种缀合物，所述至少一种缀合物包含至少一个粒子、至少一个接头和至少一种氨基酸、其衍生物或其类似物。在一些实施方案中，本公开的主题的缀合物可以是以下缀合物中的任一者或其任何组合。更具体地，为至少以下项中的一者：
其中代表粒子。
在一些实施方案中，粒子是琼脂糖珠粒或琼脂糖凝胶珠粒。在一些其他实施方案中，粒子的平均粒度具体地介于约10μm或更低至约500μm或更高之间，如上文所定义。更具体地，介于约90μm至约150μm之间。在一些实施方案中，本公开的主题的缀合物可结合至少一种纤溶蛋白，更具体地，所述纤溶蛋白可以是组织纤溶酶原激活物(tPA)和任选地纤溶酶原。
参照图12至图19，根据本公开主题的第一示例，用于处理哺乳动物体液，特别是血浆或全血的设备，是总体上用附图标记100表示的，并且包括壳体300，以及多组粒子，特别是珠粒，所述多组粒子至少包括具有第一粒子或珠粒210的第一组110和具有第二粒子或珠粒220的第二组120。
尽管根据该示例和其他示例的设备特别适用于人血浆(在本文中也可与“人体血浆”互换使用)和/或人全血(在本文中也可与“人血液”互换使用)和/或其任何产品，但是所述设备也可用于治疗其他哺乳动物但非人的血浆或其他哺乳动物但非人的全血，或甚至至少一些类型的动物血浆或动物全血，例如包括至少一些类型的非哺乳动物血浆或非哺乳动物全血。
如本文中将变得更清楚的，作为处理哺乳动物体液的一个示例，所述设备被配置用于耗尽来自哺乳动物体液(例如人血浆和/或人全血和/或其他哺乳动物血浆和/或其他哺乳动物全血)的至少一种纤溶蛋白(例如tPA和/或纤溶酶原)。
壳体300限定纵向轴线AA，并且包括主体部分350和成对端盖，所述成对端盖包括具有流体入口端口330的入口端盖310和具有流体出口端口340的出口端盖320。在该示例的替代变型中，壳体可包括多于一个主体部分，和/或多于一个入口端口，和/或每个主体部分有一个或多于一个入口端口，和/或多于一个出口端口，和/或每个主体部分有一个或多于一个出口端口。
入口端盖310和出口端盖320中的每一者均具有大致截头圆锥形的基部360，所述大致截头圆锥形的基部具有相应的截头圆锥形内表面370和相应的截头圆锥形外表面380。在该示例和至少一些其他示例中，截头圆锥形内表面370和截头圆锥形外表面380被高度抛光。在该示例的替代变型中，截头圆锥形内表面370和/或截头圆锥形外表面380不抛光。
例如，流体入口端口330和流体出口端口340各自从相应的截头圆锥形的基部360突出，并且可以各自装配有合适的相应无泄漏连接器部分335。例如，这种无泄漏连接器部分335可以是卢尔锁(Luer lock)的形式以利于将导管(例如，医用级管)连接至所述无泄漏连接器部分。可替代地，流体入口端口330和流体出口端口340可各自装配有任何其他类型的合适的无泄漏连接器部分335，以利于导管(例如，医用级管道)至其的连接。
在至少该示例中，还参考图14A至图14D，每个截头圆锥形的基部360具有从其相应的小端部312、322至其相应的大端部314、324增加的横截面面积(垂直于纵向轴线AA)。在至少该示例中，每个截头圆锥形的基部360包括多个腹板构件301，所述多个腹板构件从相应的入口端盖310或出口端盖320的内表面径向和轴向向内突出。然而，在该示例的至少一些替代变型中和在其他示例中，可以省略腹板构件。
不受理论束缚，腹板构件301可增强设备100的整体刚度，和/或可帮助使未经处理的体液的流动大致沿着纵向轴线AA对准流入和流出设备100，特别是流入室400。
此外，不受理论束缚，腹板构件301可帮助将屏障构件352、354分别保持或以其他方式维持在纵向端E1、E2处的适当位置，并且更具体地，用于将屏障构件352、354夹紧在壳体300中，介于相应的入口端盖310或出口端盖320与主体部分350之间，如在下面将变得更加清楚的。
腹板构件301各自具有面向组装的设备100中的相应屏障构件352、354的自由端306。如在图14B和图14C中最佳看出的，自由端306在平行于纵向轴线AA的纵向方向上经过相应的大端部314、324从相应的截头圆锥形内表面370突出。
在至少该示例中，流体入口端口330接合至入口端盖310的小末端312，并且流体出口端口340接合至出口端盖320的小末端322。在该示例的替代变型中，流体入口端口330可以在任何其他合适的位置连接至入口端盖310，和/或流体出口端口340可以在任何其他合适的位置连接至出口端盖320。
在该示例中，并且还参考图13A至图13D，主体部分350包括大体上圆柱形的壁355(即，具有横向于设备的纵向轴线AA的圆形横截面)，并且具有纵向相对的端部356、358。
在该示例中，壳体300，特别是包括圆柱形壁355的主体部分350是相对刚性的。相对刚性是指主体部分350在其自身重量下或在容纳有多组粒子以及穿过设备的血浆或其他流体的流时在设备的操作中保持其形状而没有显著变形(例如没有未经训练的观察者的裸眼可见的变形)。
在该示例的替代变型中，主体部分可为半柔性的或完全柔性的(例如，以柔性袋的形式)，和/或主体部分可具有非圆柱形的横截面，例如椭圆形、多边形等。
在该示例和其他示例中，主体部分350的横截面是沿着设备的纵向轴线AA大体上均匀的。在该示例的替代变型中，主体部分350的横截面可替代地为沿着设备的纵向轴线AA是不均匀的—例如所述横截面的形状可以改变和/或所述横截面的大小可以沿着纵向轴线AA改变。例如，主体部分可以具有截头圆锥形的形状，其中主体部分的圆形横截面沿纵向轴线AA的大小不断增大，或者替代地大小不断减小；例如，此类截头圆锥形可以是几乎圆柱形的，具有例如约0.5°或约1°的半角(参见图13C)。
壳体300，特别是主体部分350以及入口端盖310和出口端盖320，可以各自由任何合适的医学上相容的材料制成。例如，此类材料可包括医用级塑料，例如以下中的任何一种：PC(Makrolon 2458)，美国Covestro提供的1745聚碳酸酯；聚丙烯；聚砜；聚醚醚酮(PEEK)。
在至少该示例中，壳体300，特别是主体部分350、入口端盖310和出口端盖320是透明的，即由透明材料制成。然而，在该示例的替代变型中，壳体300，特别是主体部分350和/或入口端盖310和/或出口端盖320是不透明的，例如是半透明或不透明的，或者是透明、半透明或不透明部分的任何组合。
壳体300，特别是主体部分350，包括限定控制体积V的内部腔室400。在该示例中，控制体积V由其外部横向周边P限定，所述外部横向周边P由主体部分的内表面(所述内表面在该示例中为圆柱形内表面)和主体部分350的相对纵向端处的纵向端E1和E2限定。
控制容积V的纵向端E1和E2分别由设定在主体部分350的相对纵向端处的对应屏障构件352、354限定。如本文中将变得更加清楚的，屏障构件352、354被配置用于防止第一粒子210和第二粒子220离开主体部分350，特别是离开控制体积V，特别是经由入口端盖310和流体入口端口330离开，或经由出口端盖和流体出口端口340离开。屏障构件352、354还被配置用于同时允许多种流体，特别是液体，更特别是血浆，并且更特别是人血浆穿过主体部分350，特别是穿过控制体积V流通，具体地，哺乳动物体液经由入口端盖310和流体入口端口330进入控制体积V，并且在离开所述控制体积V之后，经由出口端盖和流体出口端口340流动。
在至少该示例中，屏障构件352、354彼此相似或相同，并且分别为滤盘352A、354A的形式，每个滤盘具有相应的上游表面和相应的下游表面，所述相应的上游表面和所述相应的下游表面由相应的滤盘352A、354A的厚度分开。屏障构件352、354，特别是滤盘352A、354A，包括多个孔隙或其他开口，以允许流体，特别是液体，更特别是体液，更特别是人血浆或人全血(或替代地，任何哺乳动物或非哺乳动物血浆或全血)穿过孔隙流通，所述孔隙的大小小于(a)第一粒子210的平均大小或中值大小或(b)第二粒子220的平均大小或中值大小中的较小者。例如，在第一粒子210或第二粒子220中较小的粒子具有约90μm的有效(平均或中值)直径(例如，较大的粒子具有约150μm的有效(平均或中值)直径)的示例中，孔隙的有效(平均或中值)直径小于90μm，例如以下中的任一者：80μm；70μm；60μm；50μm；40μm；或小于40μm。在粒径的此类示例中，孔隙的有效(平均或中值)直径可在例如45μm至50μm的范围内，或者替代地，孔隙的有效(平均或中值)直径可以在以下范围中的任一范围内：20μm至80μm；30μm至70μm；40μm至55μm；40μm至50μm；40μm至60μm；40μm至70μm；40μm至80μm。
屏障构件352、354为滤盘352A、354A形式的至少一些示例的特征在于所述滤盘352A、354A可快速制造。
该设备的至少一些示例的另一个特征是可以控制穿过设备100的流量。例如，在控制体积V中选择大量粒子(即第一粒子210和第二粒子220)将趋于减小穿过设备100的体液的体积流率，而选择减少控制体积V中的粒子量将降低粒子从体液中耗尽纤溶蛋白的能力和功效。因此，有效地，设备的体积流率可取决于控制体积V中的粒子(即第一粒子210和第二粒子220)的量与当该量的粒子容纳在控制体积V中时可容纳在控制体积V中的体液的体积之比。
在该示例和其他示例的替代变型中，屏障构件可包括例如过滤器，所述过滤器包含纤维或塑料基材，其中配体缀合至所述纤维或塑料基材，在所述纤维或塑料基材中缀合有配体；或者例如合适的膜，例如允许体液在一个方向上而不是在相反方向上流过所述膜的单向膜。
在该示例和其他示例中，滤盘352A、354A可包括以下中的任一者：美国Spectrum公司提供的Spectra编织过滤器(例如包含尼龙、PEEK，聚丙烯、聚酯、不锈钢)，或以色列Yair Technologies提供的/>尼龙网过滤器。
在至少该示例中，屏障构件352、354，特别是滤盘352A、354A，是相对于壳体300，特别是相对于主体部分350，并且任选地还相对于入口端盖310和出口端盖320装配的，从而保持控制容积V的完整性。换句话说，屏障构件352、354，特别是滤盘352A、354A与壳体300，特别是主体部分350之间的连接诸如用于最小化或避免第一粒子210或第二粒子220经由该连接的任何泄漏，同时相对于穿过设备100的体液最大化屏障构件352、354，特别是滤盘352A、354A的暴露面积。此外，屏障构件352、354，特别是滤盘352A、354A是相对于壳体300，特别是相对于主体部分350，并且任选地还相对于入口端盖310和出口端盖320装配的，使得两个屏障构件352、354，特别是两个滤盘352A、354A的模拟相应上游表面面向上游方向，而其相应下游表面面向下游方向。
在至少该示例中，并且具体地参考图13D和图14D，主体部分350的端部356、358中的每一者包括从相应端部356、358的内边缘344径向偏移的凸起的环形肩部359(参见例如图12B、图13C)，从而限定了相应的内部凸耳357和外部凸耳353。屏障构件352、354，特别是滤盘352A、354A中的每一者，具有的外径大于相应内边缘344的外径，但是小于相应的环形肩部359的内径，因此位于相应的内凸耳357上。相应的入口端盖310和出口端盖320均在截头圆锥形的基部360的相应大端部314、324处具有相应的环形边缘351，所述相应的环形边缘351将相应的入口端盖310和出口端盖320分别密封地固定至端部356、358。例如，相应的环形边缘351可以被粘结、热焊接、超声焊接或以其他方式密封地固定至相应的外凸耳353。
在该示例中，相应端部356、358中的每一者的环形肩部359包括具有大体上三角形横截面的突出唇缘359A，所述三角形的顶点背离相应端部356、358，所述大体上三角形横截面在大体上平行于纵向轴线AA的方向上远离主体部分350朝向所述顶点会聚。相应环形边缘351均包括环形凹部351A，当入口端盖310、主体部分350和出口端盖320相对于纵向轴线AA共对准时，该环形凹部351A与突出唇缘359A对齐。
应当注意的是，腹板构件301具有平行于纵向轴线AA的尺寸D(图14C)，使得当相应的入口端盖310或出口端盖320被密封地固定到主体部分350时，相应的屏障构件352、354，特别是滤盘352A、354A相对于壳体300被固定，并且在相应的腹板构件301与相应的内部凸耳357之间处于抵接且任选地夹紧的关系。
在热焊接或超声焊接的过程期间，例如，相应唇部359A变形为与相应环形凹部351A密封连接，从而将相应入口端盖310或出口端盖320密封地固定至主体部分350。
在图13A至图14D的示例的替代变型中，并且参考图12B作为一个此类示例，相应端部356、358中的每一者的环形肩部359具有大致平行于截头圆锥形内表面370的倾斜表面359B(而不是突出唇缘359A)。另一方面，在该示例中，相应环形边缘351各自包括(代替环形凹部351A)突出唇缘351B，当入口端盖310、主体部分350和出口端盖320相对于纵向轴线AA共对准时，所述突出唇缘与外部凸耳353对齐。突出唇缘351B具有大致三角形的横截面，所述三角形的顶点面向相应端部356、358，所述大致三角形的横截面在平行于纵向轴线AA的方向上朝向所述顶点，即朝向主体部分350会聚。在热焊接或超声焊接的过程期间，相应的唇部351B变形为与相应的环形外凸耳353密封连接。
作为非限制性示例，图13A至图13D提供了根据该示例的一种实现方式的主体部分350的各个部分的尺寸数据(以mm为单位)(公差为例如±0.05)。在替代实施方式中，如果是该示例，则可以按比例更改尺寸数据，例如可以按相同比例增加或减少所有带注释的尺寸，例如可以增加50％、100％、150％、200％等等，或减小10％、25％、50％等等。
同样作为非限制性示例，图14A至14D提供了根据该示例的一种实现方式的入口端盖310的各个部分的尺寸数据(以mm为单位)(公差为例如±0.05)，并且类似的尺寸数据加以必要的修改后适用于出口端盖320。在替代实施方式中，如果是该示例，则可以按比例更改尺寸数据，例如可以按相同比例增加或减少所有带注释的尺寸，例如可以增加50％、100％、150％、200％等等，或减小10％、25％、50％等等。
要注意的是，关于图12以及图13A至图14D的示例，主体部分350具有与主体部分350的内径大致相同大小的纵向尺寸(平行于纵向轴线AA)。在该示例的替代变型中，并且参考例如图12A，纵向尺寸可以大于主体部分350的内径。在该示例的其他替代变型中，纵向尺寸可小于主体部分350的内径。
在该示例的替代变型中，壳体300可以一体地形成，并且可以在纵向端部E1和E2中的每一纵向端部处提供横向狭槽，以使得相应的屏障构件352、354，特别是滤盘352A、354A，相对于壳体300横向插入并密封。
在至少该示例中，壳体300，特别是主体部分350，包括设定在圆柱形壁355上的粒子入口端口390，并且被配置为使得控制体积V能够经由粒子入口端口390用上述多组粒子填充，上述多组粒子至少包括第一粒子210的第一组110和第二粒子220的第二组120。粒子入口端口390包括密封盖392，所述密封盖用于在控制体积V中填充有上述多组粒子之后可逆地或永久地密封粒子入口端口390。例如，此类密封盖392具有与粒子入口端口390的互补渐缩锥形内壁394抵接的高度抛光的渐缩杆部393，以及与设定在粒子入口端口390的口部处的环形凸缘399可变形地接合的头部395。
或者，在控制体积V填充有前述多组粒子之后，可将粒子入口端口390以另一种方式可逆地或永久地密封。
通过以下方式来组装设备100：首先相对于壳体300的端部356、358对齐地放置屏障构件352、354，特别是滤盘352A、354A，然后将入口端盖310和出口端盖320密封地固定至主体部分350，从而相对于壳体300接合屏障构件352、354，特别是滤盘352A、354A。可以通过以下方式来测试组件的完整性：在可逆地密封入口端口330和出口端口340的同时将粒子入口端口390耦合至压力源(例如设定为处于1bar表压)，以及检查是否存在任何泄漏，例如通过将壳体300浸入诸如水的液体中，并且可以通过观察从壳体300逸出的气泡来检测任何泄漏。例如，如果可观察到每隔30秒从壳体300逸出至多一个气泡的泄漏，则可认为壳体300是充分密封的。
在设备100的上述示例的至少一些应用中，设备100在被供应给最终用户之前预填充有上述多组粒子。在此类情况下，可以将防腐剂用于上述多组粒子。例如，此类防腐剂可以是20％的乙醇。
在设备100的上述示例的其他可替代应用中，可以由终端用户用前述多组粒子填充设备100。在至少该示例中，控制体积V的大小介于20ml与约35ml之间。
在该示例和其他示例的替代变型中，控制体积V的大小可为不同的，例如小于35ml或大于35ml。例如，可以例如按照线性比例因子来缩放设备的大小，并且因此可以缩放控制体积V的大小。例如，线性比例因子可以是以下值中的任何值：2、3、4、5、10、20、30、40、50，或大于50。替代地，例如，线性因子可以为使得控制体积V的大小是本示例的控制体积V的大小的“n”倍，其中n是以下值中的任一者：2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、150或大于150；相应地或替代地，控制体积V可以被缩放成70ml、100ml、150ml、175ml、200ml、250ml、500ml、1升、1.5升、2升、2.5升、3升、4升、5升或大于5升。
在该示例中，第一粒子210和/或第二粒子220可为缀合粒子(在本文中称为“缀合物”)，并且各自可任选地包括缀合粒子中的任一者或所述缀合粒子的组合物，所述组合物可包含例如至少两种或更多种不同的如本文所公开的缀合物。
在这些示例的至少一些替代变型中，第一组110和第二组120中的仅一组包括缀合粒子，而第一组110和第二组120中的另一组包含非缀合粒子。在这些示例的其他替代变型中，第一组110和第二组120都包含相同的缀合粒子，并且因此实际上仅存在组合的单组缀合粒子。
在至少该示例中，第一粒子210和/或第二粒子220是缀合粒子，其中第一粒子在尺寸上不同于第二粒子。具体地，第一缀合粒子210和第二缀合粒子220在尺寸上不同于第二粒子。在至少一些此类示例中，第一缀合粒子的平均大小不同于第二粒子的平均大小。在又一些实施方案中，第一粒子，特别是缀合物可在化学上不同于第二缀合物。
不受理论束缚，发明人认为包括第一缀合粒子的平均大小不同于第二粒子的平均大小的至少两组颗粒，可导致在所述粒子之间提供间隔，这提供了与所有粒子具有相同大小或相似大小的类似布置相比实质上更不紧凑的布置。继而，与使用相同或相似大小的粒子的类似布置相比，该密实度减小特征为粒子中的每个粒子提供了更大的暴露面积。所述更大的暴露面积继而允许缀合粒子与体液之间更大的相互作用(当使此类体液流过设备100时)，从而提高了粒子从体液中耗尽至少一种纤溶蛋白的有效性。因此，就从体液中耗尽至少一种纤溶蛋白而言，相对较小整体量的尺寸不同的第一缀合粒子和第二缀合粒子可以与相对更大整体量的尺寸相似的第一缀合粒子和第二缀合粒子一样有效，这可具有经济影响。
一种使用单组缀合粒子计算可吸收多少纤溶酶原的方法如下：
树脂容量计算
-用标准的新鲜冷冻血浆单位开始-
ο每个单位有250mL血浆
ο血浆中的纤溶酶原浓度为160μg/mL
ο因此，一单位FFP中的纤溶酶原总量为40mg
ο纤溶酶原的分子量为92kDa
ο出于计算目的，1道尔顿单位被视为在数值上等同于1g/mol。
ο因此92000Da是92000g/mol或92000μg/μmol或92mg/μmol
ο当以一个FFP单位计算40mg中的摩尔数时-40mg÷92mg/μmol＝0.435μmol
-具有在16-23μmol珠粒/mL沥干的树脂上起作用的25原子接头的琼脂糖凝胶4Fast Flow可减少1.317克纤溶酶原，这是一个血浆单位的33倍高。
参考图15和图16，根据本公开的主题的示例，总体上用元件符号1000表示的用于从哺乳动物体液耗尽至少一种纤溶蛋白的系统设备包括设备100、盐水贮存器1100、供体贮存器1200、接受者血浆贮存器1300和洗涤废物贮存器1400。
盐水贮存器1100和供体贮存器1200经由第一三通阀70与流体入口端口330选择性地且非同时地流体连通。
接受者血浆贮存器1300和洗涤废物贮存器1400经由第二三通阀90与流体出口端口340选择性地且非同时地流体连通。
导管82、84分别将盐水贮存器1100和供体贮存器1200连接至第一三通阀70的相应端口72、74，并且另一导管76将第一三通阀70的第三端口76连接至设备100的入口端口330。
导管62、64分别将接受者血浆贮存器1300和洗涤废物贮存器1400连接至第二三通阀90的相应端口92、94，并且另一导管66将第二三通阀90的第三端口96连接至设备100的出口端口340。
在至少该示例中，设备100如在本文的示例中所公开，或者是这些示例的替代变型。在任何情况下，所述控制容积V容纳上述多组粒子，所述多组粒子至少包括所述第一组第一粒子和所述第二组第二粒子。
盐水贮存器1100可包括容纳适当量的盐水的任何适合贮存器，这种量通常是控制体积V的大小的几倍。在该示例中，盐水贮存器1100为注射器形式，但是在该示例的替代变型中，盐水贮存器1100可采取其他形式，例如可经按压以使盐水溶液经由导管82离开袋子的非刚性袋子。
供体贮存器1200可包括容纳要由设备100处理的哺乳动物体液的袋子或其他贮存器。例如，供体贮存器1200可容纳人血浆和/或人全血和/或其他哺乳动物血浆和/或其他哺乳动物全血。可选地，供体贮存器1200可替代地包括活体供体，例如人，所述人具有以允许血液经由导液管(连接到导管84或所述导管的一部分)直接地或经由在输送到设备100之前将血浆从全血中分离出的合适血液产品分离设备间接地流到设备100的方式插入到其血管中的血液导液管。
接受者血浆贮存器1300可包括用于接纳在由设备100处理后的经处理的哺乳动物体液的袋子或其他贮存器。例如，血浆贮存器1300可容纳已经完全或部分耗尽了至少一种纤溶蛋白的人血浆和/或人全血和/或其他哺乳动物血浆和/或其他哺乳动物全血。替代地，接受者血浆贮存器1300可替代地包括活体患者，例如人，所述人具有以允许经处理的哺乳动物体液从设备100经由导液管(连接到导管62或导管62的一部分)流动的方式插入到其血管中的血液导液管。
洗涤废物贮存器1400可包括能够容纳从盐水贮存器1100穿过设备之后的盐水溶液的袋子或其他贮存器。
参考图17，应注意的是，如本文所公开的设备100可与盐水贮存器1100、接受者血浆贮存器1300和洗涤废物贮存器1400一起提供作为套件800。套件800还可包括第一三通阀70，以及经由端口72连接到盐水贮存器1100和第一三通阀70的导管82，以及连接到第一三通阀70和设备100的入口端口330的导管86。套件800还可包括第二三通阀90；以及导管62、64，所述导管分别连接到接受者血浆贮存器1300和洗涤废物贮存器1400，并且经由相应的端口92、94连接到第二三通阀90；以及导管66，所述导管连接到第二三通阀90的第三端口96和设备100的出口端口340。套件800还可包括经由端口74连接至第一三通阀70的导管84，其中导管84的另一端部可连接至供体贮存器1200。
例如，系统1000可以如下使用。
将套件800从其无菌包装中拆出，并且可以检查各种部件以确保所有部件的完整性。
参考图15，通过以下方式设定洗涤配置：确保第一三通阀70被设定为在阻塞端口74的同时在端口72与76之间提供流体连通，并且第二三通阀90被设定为在阻塞端口92的同时在端口94与96之间提供流体连通。然后，通过以下方式来对设备100进行灌注(用盐水洗涤)：使盐水经由第一三通阀70从盐水贮存器1100流经设备100并经由第二三通阀90流入洗涤废物贮存器1400中。
供体贮存器1200可连接到套件800以提供系统1000。在供体贮存器为容纳要由设备100处理的哺乳动物体液的袋子或其他贮存器形式的示例中，供体贮存器1200可熔合至导管84。然后，供体贮存器1200可例如悬挂在IV极上，或者可连接至蠕动泵，以使哺乳动物体液能够被设备100处理，从而选择性地流动至所述设备，如将在下面变得更加清楚的。
在供体贮存器1200是活体供体例如人的示例中，将血液导液管插入到活体供体的血管中，并且该导液管连接到导管84或成为导管84的一部分。
参考图16，并且在完成洗涤配置并且用盐水灌注设备100(使用图15的配置)之后，设定处理配置。通过以下方式设定处理配置：确保第一三通阀70被设定为在阻塞端口72的同时在端口74与76之间提供流体连通，并且第二三通阀90被设定为在阻塞端口94的同时在端口92与96之间提供流体连通。然后对未经处理的哺乳动物体液进行处理，特别是通过使未经处理的哺乳动物体液从供体贮存器1200流出，经由第一三通阀70穿过设备100，并经由第二三通阀90流入接受者血浆贮存器1300而从哺乳动物体液中去除至少一种纤溶蛋白。
参考图18，根据本公开的主题，用于从哺乳动物体液中耗尽至少一种纤溶蛋白的系统的另一个示例，总体上用元件符号2000表示，包括套组2500，所述套组包括多个设备100。在图18的所示示例中，套组2500包括四个设备100，并且在该示例的替代变型中，套组2500加以必要的修改可替代地包括两个、三个或多于四个设备100。
系统2500还包括盐水贮存器1100、供体贮存器1200、接受者血浆贮存器1300和洗涤废物贮存器1400，以及第一三通阀70和第二三通阀90，如本文针对图15和图16所示的系统1000加以必要修改所公开的。在该示例中，套组2500包括多个设备100，所述多个设备以在多个设备100的相应控制体积V之间提供流体连通的方式互连。
在至少该示例中，(套组2500的)每个设备100如本文的示例或这些示例的替代变型中所公开的那样。在任何情况下，套组2500的每个设备100的控制体积V容纳相应的所述多组粒子，所述多组粒子至少包括第一组第一粒子和第二组第二粒子。
在至少该示例中，套组2500的多个设备100串联互连，其中对于每对串连(相邻)互连的设备100，该对中的一个设备100的相应流体入口端口330连接到该对中另一设备100的相应流体出口端口340并与其流体连通。套组2500的最上游设备100(在图18中也称为设备100A)以与在图15和图16中示出的系统1000的设备100类似的方式加以必要修改而经由第一三通阀70连接至盐水贮存器1100和供体贮存器1200。套组2500的最下游设备100(在图18中也称为设备100B)以与在图15和图16中示出的系统1000的设备100类似的方式加以必要修改而经由第二三通阀90连接至接受者血浆贮存器1300和洗涤废物贮存器1400。
在该示例中，盐水贮存器1100具有足够的盐水以洗涤和灌注套组2500中的所有设备100。
需注意的是，如本文所公开的设备100的套组2500，可与盐水贮存器1100、接受者血浆贮存器1300和洗涤废物贮存器1400(并且不包括相应的供体贮存器1200)一起提供作为套件2800。套件2800还可包括第一三通阀70，以及经由端口72连接到盐水贮存器1100和第一三通阀70的导管82，以及连接到第一三通阀70和最上游设备100A的入口端口330的导管86。套件2800还可包括第二三通阀90；以及导管62、64，所述导管分别连接到接受者血浆贮存器1300和洗涤废物贮存器1400，并且经由相应的端口92、94连接到第二三通阀90；以及导管66，所述导管连接到第二三通阀90的第三端口96和最下游设备100B的出口端口340。套件2800还可包括经由端口74连接至第一三通阀70的导管84，其中导管84的另一端部可连接至供体贮存器1200。
系统2000可以与系统1000类似的方式使用，特别地使用相应的洗涤配置之后是相应的处理配置开始，该洗涤配置和该处理配置类似于在本文中针对系统1000所公开的洗涤配置和处理配置加以必要修改。
系统2000的特征是使哺乳动物体液连续地从供体贮存器1200流到套组2500中的每个设备100，从而使得能够提供更高质量的经处理的哺乳动物流体，即其中随着经处理的耗尽哺乳动物体液从套组2500中的一个设备100流到下一个设备100，哺乳动物体液中的至少一种纤溶蛋白的水平被连续地越走越多地耗尽。
另一方面，串联连接的多个设备100可以在系统2000中建立背压，这可导致哺乳动物体液穿过系统2000的流速小于例如系统1000中的流速。
参考图19，根据本公开的主题，用于从哺乳动物体液中耗尽至少一种纤溶蛋白的系统的另一个示例，总体上用元件符号3000表示，包括套组3500，所述套组包括多个设备100。在图19的所示示例中，套组3500包括四个设备100，并且在该示例的替代变型中，套组3500加以必要的修改可替代地包括两个、三个或多于四个设备100。
系统3500还包括盐水贮存器1100、供体贮存器1200、接受者血浆贮存器1300和洗涤废物贮存器1400，以及第一三通阀70和第二三通阀90，如本文针对图15和图16所示的系统1000加以必要修改所公开的。在该示例中，套组3500包括多个设备100，所述多个设备以在多个设备100的相应控制体积V之间提供流体连通的方式互连。
在至少该示例中，(套组3500的)每个设备100如本文的示例或这些示例的替代变型中所公开的那样。在任何情况下，套组3500的每个设备100的控制体积V容纳相应的所述多组粒子，所述多组粒子至少包括第一组第一粒子和第二组第二粒子。
在至少该示例中，套组3500的多个设备100并联互连，并且设备100的相应流体入口端口330经由入口歧管3330彼此互连并且流体连通。此外，设备100的相应流体出口端口340经由出口歧管3340彼此互连和流体连通。套组3500的入口歧管3330以与在图15和图16中示出的系统1000的设备100类似的方式加以必要修改而经由第一三通阀70连接至盐水贮存器1100和供体贮存器1200。套组3500的出口歧管3340以与在图15和图16中示出的系统1000的设备100类似的方式加以必要修改而经由第二三通阀90连接至接受者血浆贮存器1300和洗涤废物贮存器1400。
在该示例中，盐水贮存器1100具有足够的盐水以洗涤和灌注套组3500中的所有设备100。
需注意的是，如本文所公开的设备100的套组3500，可与盐水贮存器1100、接受者血浆贮存器1300和洗涤废物贮存器1400、入口歧管3330和出口歧管3340(并且不包括相应的供体贮存器1200)一起提供作为套件3800。套件3800还可包括第一三通阀70，以及经由端口72连接到盐水贮存器1100和第一三通阀70的导管82，以及连接到第一三通阀70和入口歧管3330的导管86。套件3800还可包括第二三通阀90；以及导管62、64，所述导管分别连接到接受者血浆贮存器1300和洗涤废物贮存器1400，并且经由相应的端口92、94连接到第二三通阀90；以及导管66，所述导管连接到第二三通阀90的第三端口96和出口歧管3340。套件3800还可包括经由端口74连接至第一三通阀70的导管84，其中导管84的另一端部可连接至供体贮存器1200。
系统3000可以与系统1000类似的方式使用，特别地使用相应的洗涤配置之后是相应的处理配置开始，该洗涤配置和该处理配置类似于在本文中针对系统1000所公开的洗涤配置和处理配置加以必要修改。
系统3000的特征在于，相对较大的体积流量和/或体积流率的来自供体贮存器1200的哺乳动物体液可以通过将哺乳动物体液在套组3500中的多个设备100之间分流，以及在各设备100中同时处理哺乳动物体液来进行处理。
另一方面，多个设备可在系统2000中建立背压，这可导致哺乳动物体液穿过系统2000的流速小于例如系统1000中的流速。
在系统3000的替代变型中，套组3500中的多个设备100的流体入口端口330可以直接连接并且与相应的供体血浆贮存器流体连通，和/或流体出口端口340中的每个流体出口端口可直接连接到相应的接受者血浆贮存器并与之选择性地流体连通。
在系统3000的另一种替代变型中，每个设备100可以用一系列串联连接的设备100代替，例如对应于加以必要修改的套组2500。
当激活的因子VII(VIIa)与携带组织因子的细胞结合，从而导致因子IX和X被进一步激活，所述因子IX和X继而切割(激活)因子II(凝血酶原)以形成凝血酶(IIa)时，启动了所建议的基于生理细胞的止血模型。凝血酶激活因子XI继而激活其他因子以生成更多的凝血酶。凝血酶然后进一步切割纤维蛋白原以形成初步的纤维蛋白凝块，然后通过因子XIII的交联作用将所述初步的纤维蛋白凝块稳定化为牢固的止血凝块。
响应于血管损伤，凝血系统如上所述被激活，从而导致交联的纤维蛋白沉积在组织和血管中，从而损害血液的流动。因此，需要另外的系统，该另外的系统可适当地溶解纤维蛋白凝块，从而防止凝块进一步生长超出生理需要，并且在不再需要凝块时启动凝块裂解。该系统由纤溶蛋白组成，所述纤溶蛋白随后被激活，从而通过纤溶酶丝氨酸蛋白酶的作用将纤维蛋白转化为其可溶降解产物。在生理条件下，纤溶由激活物、抑制剂和辅因子的所测得参与度精确地调节。
纤溶系统的主要组分纤溶酶原主要在肝脏中合成。切割(激活)在560-561位的单个Arg-Val肽键处的纤溶酶原，产生了纤溶酶，即有活性的丝氨酸蛋白酶，所述纤溶酶继而溶解纤维蛋白凝块。纤溶酶原的裂解由纤溶酶原激活物介导。
主要的内源性纤溶酶原激活物是组织纤溶酶原激活物(tPA)。在功能上，t-PA本身是纤溶酶原的弱激活物。然而，在纤维蛋白存在下，tPA依赖性纤溶酶原激活的催化效率提高了500倍。超标的纤溶酶活性也会切割凝血因子，从而将防止形成新的凝块。
第二内源性纤溶酶原激活物是单链u-PA或尿激酶原。u-PA对纤维蛋白的亲和力比tPA低得多。尽管在存在或不存在纤维蛋白的情况下，uPA都是有效的纤溶酶原激活物，但是纤维蛋白显著地刺激了uPA的纤溶酶原激活活性。u-PA由几种细胞表达，所述几种细胞包括活化的内皮细胞、巨噬细胞、肾上皮细胞和一些肿瘤细胞。
纤溶系统通过纤溶蛋白的活化剂(如上所详述)和抑制剂的作用而变得相当平衡。纤溶酶的主要抑制剂是α2抗纤溶酶—一种主要在肝脏中合成并且在血浆中以相对较高的浓度(2μM)循环的单链糖蛋白。释放至流动血液或凝块附近的纤溶酶在与α2抗纤溶酶形成不可逆的1:1化学计量络合物时就立即被中和。
在纤溶酶原激活物抑制剂中，纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)是最普遍存在的。它由内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、肝细胞、脂肪细胞和血小板释放。PAI-1是tPA和u-PA两者的最重要且快速作用的生理抑制剂。
纤溶酶原激活物抑制剂2(PAI 2)是由人胎盘合成的。主要在怀孕期间在人血浆中发现了显著水平的PAI 2。
最后，凝血酶可激活的纤溶抑制剂(TAFI)是一种对羧基末端精氨酸和赖氨酸残基具有特异性的血浆羧肽酶，该TAFI充当有效的纤溶抑制剂。
在自发性出血发作、创伤以及整个手术工序期间，治疗具有各种凝血异常的患者是至关重要的。在大多数此类情况下，使用血液/血浆来源产品(例如常规血浆或新鲜冷冻血浆-FFP)。这些产品含有凝血因子和纤溶蛋白，因此被认为通过诱导止血凝块的形成来使出血停止并纠正缺失或受损的凝血异常。通常，一般来说，任何凝血因子的缺乏或异常都可能导致出血倾向，这是因为没有足够的能力制造稳定的止血凝块。不受任何理论的束缚，发明人假设纤溶蛋白的存在是止血凝块裂解的原因，可能导致凝块溶解和出血现象恶化。
因此，一旦在用可用的血液/血浆来源产品置换缺失的凝血因子后形成了止血凝块，凝块的溶解(如果需要的话)就由纤溶系统完成。然而，如果不需要溶解凝块，并且需要相当大的相反活性，例如为了在出血的情况下保持止血凝块或为了产生更多的血凝块，则用体液，特别是血液或血浆和任何由凝血因子组成但纤溶因子耗尽的衍生产品进行治疗可能是理想的解决方案。
如本文所述，本公开的主题提供了缀合物、多种缀合物或所述多种缀合物的任何组合物，以及用于从体液，特别是血液、血浆及其产品中耗尽纤溶蛋白的设备、套件和系统，并由此还提供了使用这些产品的方法。
因此，在另一方面中，本公开的主题涉及一种用于从哺乳动物体液或从其任何产品中耗尽至少一种纤溶蛋白的方法。更具体地，该方法包括以下步骤：在第一步骤(i)中，使体液或其任何制备物经受特异于至少一种纤溶蛋白的亲和力耗尽工序。下一步骤(ii)涉及回收在步骤(i)中获得的至少一种纤溶蛋白耗尽的体液。
应当注意的是，如本公开的主题所公开的，亲和力耗尽工序包括使体液与有效量的根据本公开的主题的多种缀合物接触，或者与至少一种包含所述多种缀合物的组合物接触。或者，可通过将体液施加至包含本公开的主题的缀合物、根据本公开的主题的任何多种缀合物或包含所述多种缀合物的任何组合物的设备、套组、套件或系统上，来进行亲和力耗尽工序。
应当注意的是，在一些实施方案中，每种缀合物包含至少一个粒子、至少一个接头和至少一种氨基酸、其衍生物或其类似物。在一些特定实施方案中，多种缀合物包含至少两种不同的缀合物，并且其中所述氨基酸、其衍生物或其类似物是4-(氨甲基)-环-己烷-甲酸(氨甲环酸)、ε-氨基己酸赖氨酸，环己烷甲酸和4-甲基-环己烷甲酸中的至少一者。在一些其他特定实施方案中，所述多种缀合物包括至少两种不同的缀合物，并且其中所述氨基酸、其衍生物或其类似物是4-(氨甲基)-环-己烷-甲酸(氨甲环酸)、ε-氨基己酸和赖氨酸中的至少一者。
应当注意的是，在一些实施方案中，可用于本公开的主题的方法中的缀合粒子可以如先前本文中由本公开的主题所定义的。在又一些其他实施方案中，本公开的主题的方法可使用由如本文之前定义的本公开的主题所提供的任何设备、套组、套件或系统。
在一些实施方案中，本公开的主题的方法可适用于从体液中耗尽纤溶蛋白，所述体液可以是包含至少一种凝血因子的全血、血浆或血液源性产品中的至少一者。
在一些特定实施方案中，这种血液源性产品可以是全血、血浆、新鲜冷冻血浆(FFP)、富含血小板的血浆(PRP)和冷沉淀物中的至少一者。
应当理解的是，在一些实施方案中，本文公开的主题的方法可以离体或体外执行。更具体地，在不再是人体一部分的体液中。
输血仍然是挽救生命的最重要因素。在现代血库疗法中，输注血液组分而不是全血。
血液组分疗法是指将血液分离成各组分，从而仅将特定的所需组分输注到患者体内，从而避免使用不必要的组分。通过使用血液组分，可以用来自一名供体的血液治疗几位患者。
如本文所用的术语“新鲜冷冻血浆”(FFP)涉及主要血液组分，即人血液的在献血后已经冷冻和保存并将用于输血的无细胞液体级分。在献血后，将一个单位的人血液离心，分离出血液的细胞内含物，并将剩余的血浆在收集的八小时内在-18℃(0℉)或更低的温度下冷冻。
FFP包含凝血、纤溶和补体系统的所有组分(因子/蛋白质)。在单一或多种凝血缺陷，以及在创伤或手术中出现的现有或预期出血中使用FFP时存在明确的适应症。
如本文所用的“冷沉淀物”涉及通过在收集的6-8小时内快速冷冻(如对FFP所做的一样)并在4℃快速解冻而从单个单位的新鲜血浆中获得的血浆沉淀蛋白。冷沉淀物富含因子VIII、因子XIII、血管性血友病因子(von Willebrand factor)和纤维蛋白原。因此，该组分适合于治疗或预防与上述凝血蛋白缺乏或受损有关的遗传性或获得性疾患中的出血。
“富血小板血浆”(PRP)血液组分是通过离心或单采(aphaeresis)工序从一个单位的新鲜(献血的)血液制备的。
除了从标准单位的全血制备外，血液组分还可以通过单采工序获得。单采是使用单采装置/机器来完成的，所述单采装置/机器是半自动化的血液分离仪器。在该工序中，如果计划将血浆用于献血，则使供体的抗凝全血穿过装置，在该装置中血液被分离成红细胞、血浆和白细胞/血小板级分，然后将所述血液返回到受试者体内。仅分离的血浆不返回受试者，而是进一步用于献血。
几种半自动血细胞分离仪可用于收集血小板、粒细胞、血干细胞、单核细胞和血浆。所有这些仪器都使用离心分离血液组分。一些单采工序涉及进行两次静脉穿刺，使血液不断从供体流过血细胞分离器；其他方法可通过单次静脉穿刺以及间断性抽血和返血来完成。
在又一些其他特定实施方案中，本公开的主题的方法可用于耗尽纤溶蛋白，所述纤溶蛋白可以是纤溶酶原和组织纤溶酶原激活物(tPA)中的至少一者。
更具体地，如本文所用的纤溶酶原(也称为PLG，酶条目EC:3.4.21.7)是纤溶系统的主要组分，并且主要在肝脏中合成。人体中存在两种主要的纤溶酶原糖型—I型纤溶酶原含有两个糖基化部分(氮连接到N289并且氧连接到T346)，而II型纤溶酶原只含有单个氧连接的糖(氧连接到T346)。II型纤溶酶原优先于I型糖型被募集到细胞表面。相反，I型纤溶酶原似乎更容易被募集到血凝块中。在循环中，纤溶酶原采取封闭的、抗激活的构象。与血凝块或与细胞表面结合后，纤溶酶原采取开放形式，该开放形式可通过多种酶(包括组织纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)、激肽释放酶和因子XII(哈格曼因子(Hageman factor)))转化为活性纤溶酶。更特别地，切割(激活)在560-561位的单个Arg-Val肽键处的纤溶酶原，产生了纤溶酶，即有活性的丝氨酸蛋白酶，所述纤溶酶继而溶解纤维蛋白凝块。
全长纤溶酶原包含七个结构域。除了C末端胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶结构域外，纤溶酶原还包含N末端Pan Apple结构域(PAp)以及五个Kringle结构域(KR1-5)。PanApple结构域包含用于维持纤溶酶原封闭形式的重要决定因素，而kringle结构域负责结合接受者和底物中存在的赖氨酸残基。
在一些实施方案中，本公开的主题所指的纤溶酶原可以是人纤溶酶原。在此类实施方案中，纤溶酶原基因(GenBank：定位于chr6q26的AY192161.1)跨越约52.5kb的DNA并含有19个外显子(OMIM num173350)。应当注意的是，在一些实施方案中，如本文所用的纤溶酶原是指人纤溶酶原，所述人纤溶酶原包含由包含SEQ ID NO.1所示的序列的核酸序列编码的氨基酸序列。在一些其他实施方案中，人纤溶酶原可包含由包含与SEQ ID NO.1所示的序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的序列的核酸序列编码的氨基酸序列。在另外一些实施方案中，此类人纤溶酶原分子可包含如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。在另一些其他实施方案中，此类人纤溶酶原分子可包含与由SEQ ID NO.2所示的序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同源性的氨基酸序列。
如本文所用的“纤溶酶原缺陷体液”或“无纤溶酶原的体液”是指与未经处理的血液或血液产品相比，本公开的主题的产品(根据一些实施方案，是通过用纤溶蛋白结合剂，特别是纤溶酶原结合剂处理体液(诸如血液、血浆或血液产品)而制备的)显示出约100％至50％的纤溶酶原量降低、减少、减弱。更具体地，特别地当与未经处理的血液或血液产品相比时，体液，特别是血液或血液产品中正常存在的纤溶酶原的至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％被从本公开的主题的产品中去除。换句话说，本公开的主题的产品可包含的纤溶酶原的量为其他产品或未经处理的血液或血液产品中的纤溶酶原的量的约0.01％至约50％。具体地，与未经处理的血液或血液产品相比，约0.01％或更低、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％或更低的纤溶酶原的量。
纤溶酶原当被激活以形成有活性的纤溶酶时，显示出蛋白水解活性，特别是将蛋白质切割或分解成更小的多肽或氨基酸有鉴于此，通过本公开的主题的方法处理的体液没有纤溶酶原或纤溶酶蛋白水解活性。在一些具体实施方案中，纤溶酶和纤溶酶原的蛋白水解活性涉及切割纤维蛋白，从而溶解纤维蛋白凝块。应当理解的是，术语“缺乏纤溶酶和纤溶酶原活性”是指与体液(诸如血液、血浆或血液产品，特别是未经处理的血液或血液产品)中活性纤溶酶或纤溶酶原的蛋白水解活性相比，通过本公开的主题的方法处理的体液完全缺乏纤溶酶和纤溶酶原的蛋白水解活性，或至少显示出纤溶酶和纤溶酶原的蛋白水解活性的约1％至99.9％，特别地约1％至约5％、约5％至10％、约10％至15％、约15％至20％、约20％至25％、约25％至30％、约30％至35％、约35％至40％、约40％至45％、约45％至50％、约50％至55％、约55％至60％、约60％至65％、约65％至70％、约75％至80％、约80％至85％、约85％至90％、约90％至95％、约95％至99％、或约99％至99.9％或100％中任一者的“降低”、“减少”、“缓和”、“抑制”或“减弱”。
更进一步地，在一些实施方案中，通过本公开的主题的方法处理的体液不含tPA。已经通过图9清楚地证明了使本公开的主题的方法、缀合物和设备对tPA的耗尽。
应当理解的是，本文中用于组织纤溶酶原激活物(也称为PLAT；酶条目EC3.4.21.68)的术语tPA涉及一种分泌的丝氨酸蛋白酶，所述分泌的丝氨酸蛋白酶将酶原纤溶酶原转化并激活成有效的纤溶酶。tPA在血管内皮细胞中合成为单一多肽链，该单一多肽链通过纤溶酶或胰蛋白酶在位于中央的精氨酸-异亮氨酸键处进行蛋白水解切割，从而产生由N末端衍生的重链和C末端轻链组成的2链二硫键形式。tPA基因(定位到chr.8p11.21的DNA登录号NT_167187.1)包含14个外显子，所述14个外显子编码包含两个环状区域(K1和K2)和与生长因子同源的区域的重链结构域和包含丝氨酸蛋白酶催化位点的轻链结构域。tPA基因的可变剪接导致编码不同同种型的多种转录物变体，所述不同同种型除了纤溶外，还参与多种生物学过程，诸如细胞迁移和组织重塑。tPA活性增大会导致纤溶亢进，纤溶亢进表现为过量出血；tPA活性降低会导致低纤溶，所述低纤溶会导致血栓形成或栓塞。tPA相关的表型包括家族性纤溶亢进(由于tPA释放增加)和家族性血栓形成(由于tPA释放减少(OMIM编号612348))。应当注意的是，在一些实施方案中，如本文所用的tPA是指人tPA，所述人tPA包含由包含SEQ ID NO.3所示的序列的核酸序列编码的氨基酸序列。在一些其他实施方案中，人tPA可包含由包含与SEQ ID NO.3所示的序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的序列的核酸序列编码的氨基酸序列。在又一些其他实施方案中，此类人tPA分子可包含如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。在又一些其他实施方案中，人tPA可包含与如SEQ ID NO.4所示的序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。
如本文所用的“tPA缺乏的体液”或“无tPA的体液”是指与未经处理的血液或血液产品相比，通过本公开的主题的方法处理的体液(根据一些实施方案，通过用本公开的主题的缀合物处理体液(诸如血液、血浆或血液产品)而制备的)显示出通常以约100％至50％存在的tPA量的减少、降低、减弱。更特别地，从体液中去除了tPA的至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，特别是当与未经处理的血液、血浆或血液产品相比时。换句话说，通过本公开的主题的方法处理的体液可包含的tPA量为其他产品或未经处理的血液或血液产品中的tPA量的约0.01％至约50％。具体地，与未经处理的体液(诸如血液、或血液产品)相比，tPA量的约0.01％或更低、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更低，甚至60％或70％。
在又一些其他实施方案中，通过本公开的主题的方法制备的体液，或者特别地血液、血浆或血液源性产品可不含纤溶酶原和tPA，并且因此不含如上所指定的任何纤溶活性。在又一些其他实施方案中，通过本公开的主题的方法制备的体液或产品也可以不含任何其他纤溶剂，例如尿激酶(uPA)。更进一步，应当理解的是，在一些实施方案中，可以将另外的抗纤溶剂添加到通过本公开的主题的方法制备的体液产品中。
在一些可选的实施方案中，该方法还可包括通过确定所述纤溶蛋白耗尽的体液中的凝结时间和总凝块裂解时间中的至少一者来测量在步骤(ii)中回收的所述纤溶蛋白耗尽的体液中的纤溶酶原的量的步骤。
在一些实施方案中，本公开的主题的方法可用于制备至少一种具有降低的纤溶活性的血液和/或血液源性产品。
如本文所用，纤溶活性是指血液和血液源性产品中的一些蛋白水解酶溶解纤维蛋白和血凝块的能力。切割纤维蛋白的主要蛋白水解酶是纤溶酶。纤溶酶是通过用tPA和/或uPA激活纤溶酶原而形成的。当纤溶酶分解纤维蛋白时，形成了纤维蛋白降解产物(FDP)。FDP与凝血酶竞争，并由此通过阻止纤维蛋白原转化为纤维蛋白而减慢了凝块的形成。凝血酶凝结时间(TCT)测试中可以看到这种效应，TCT在具有有效纤溶的人体中是延长的。FDP和特定的FDP(即D-二聚体)可使用抗体-抗原技术进行测量。这比TCT更特异，并且证实已经发生了纤溶。因此，它可用于指示深静脉血栓形成、肺栓塞、DIC，以及对急性心肌梗塞的治疗功效。或者，甚至在使用肝素的患者中，可以通过在全血中进行血栓弹力测定法(TEM)来更快地检测纤溶活性，尤其是纤溶亢进。在该测定中，通过比较在不存在或存在纤溶抑制剂抑肽酶的情况下的TEM轮廓来评定纤溶增加。更进一步，可以通过球蛋白裂解时间(ELT)测定来测量总体纤溶测试。ELT通过使球蛋白级分(主要是重要的纤溶因子纤维蛋白原、PAI-1、tPA、α2-抗纤溶酶和纤溶酶原)从血浆中凝结，然后观察凝块溶解所需的时间来测量纤溶。缩短的裂解时间表明纤溶过度状态和出血风险。
如上所述，通过本公开的主题的方法处理的体液、血液、血浆或血液产品显示出降低或减少的纤溶活性。应当理解的是，如本文所提及的术语“降低”、“减少”、“缓和”、“抑制”或“减弱”涉及与包含tPA和/或纤溶酶原的体液(诸如血液、血浆或血液产品)相比、与未用本公开的主题的缀合物治疗的血液或血液产品相比、与正常血液或血液产品相比或与市售血液产品相比，过程，特别是纤溶活性延迟、抑制、降低或减少了以下中的任一者：约1％至99.9％，特别地约1％至约5％、约5％至10％、约10％至15％、约15％至20％、约20％至25％、约25％至30％、约30％至35％、约35％至40％、约40％至45％、约45％至50％、约50％至55％、约55％至60％、约60％至65％、约65％至70％、约75％至80％、约80％至85％、约85％至90％、约90％至95％、约95％至99％、或约99％至99.9％，或甚至100％。换句话说，这些产品没有显示出纤溶活性，或至多显示出极低的和降低的纤溶活性，特别是与未经处理的血液或血液产品的纤溶活性相比，所述纤溶活性的约0.01％或更少、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更少。在一些实施方案中，通过本公开的主题提供的方法、缀合物、组合物以及设备、套组、套件或系统处理的体液、血液、血浆或血液产品显示出降低的或没有如本文所定义的纤溶活性，可用于由本公开的主题所公开的任何治疗应用，如下文所论述。
在又一些其他特定实施方案中，本公开的主题的方法可用于体内/体外耗尽有需要的受试者的体液和/或有需要的受试者中的至少一种纤溶蛋白。
因此，在其另一方面，本公开的主题提供了一种通过体外工序从有需要的受试者的体液中耗尽至少一种纤溶蛋白的方法。更具体地，所述方法包括以下步骤：
在第一步骤(i)中，将所述受试者的体液转移到体外装置中。在一些实施方案中，由本公开的主题提供的设备、套组、套件或系统可以被视为此类体外装置。
第二步骤(ii)涉及使体液经历特异于至少一种纤溶蛋白的亲和力耗尽工序。应该注意的是，此类耗尽可以在血液被输送到所述装置中和从所述装置中输送出之前、期间或之后执行。以这种方式，获得了受试者的体外体液。该体外体液耗尽了至少一种纤溶蛋白。
下一步骤(iii)涉及将在步骤(ii)中获得的至少一种纤溶蛋白耗尽的体液返回或重新引入受试者体内。
应当注意的，亲和力耗尽工序包括具体地离体使受试者的体液与有效量的多种缀合物或其任何组合物接触。此外，如由本公开的主题所定义的，本公开的主题的缀合物或其任何组合物可包含在所述体外装置内，或者包含在连接到此类体外装置的设备、套组、套件或系统内。如上所述，在一些实施方案中，本文讨论的每种缀合物可以包含至少一个粒子、至少一个接头和至少一种氨基酸、其衍生物或其类似物。在又一些其他实施方案中，多种缀合物包括至少两种不同的缀合物。在一些其他实施方案中，氨基酸、其衍生物或其类似物可以是4-(氨甲基)-环-己烷-甲酸(氨甲环酸)、ε-氨基己酸、赖氨酸、环己烷甲酸和4-甲基-环己烷甲酸中的至少一者。在又一些其他实施方案中，氨基酸、其衍生物或其类似物是4-(氨甲基)-环-己烷-甲酸(氨甲环酸)、ε-氨基己酸和赖氨酸中的至少一者。在又一些实施方案中，氨基酸、其衍生物或其类似物可为氨甲环酸(TXA)。
在一些实施方案中，体外装置是心肺旁路机(CPB)，并且其中体外装置是血浆置换机。
术语“体外”是指在体外执行的医疗工序。例如，此类体外工序可涉及循环工序，即从患者的循环中抽取血液以在所述血液返回循环之前对所述血液进行处理的工序。所有将血液运送到体外的装置都称为体外回路。此类循环工序包括但不限于在心脏直视手术期间的单采、自体输血、血液透析、血液过滤、血浆置换、体外二氧化碳去除、体外心肺复苏、体外膜氧合(ECMO)和心肺转流。
心肺转流(CPB)是一种在手术期间暂时接管心脏和肺的功能、保持患者身体的血液循环和含氧量的技术。CPB泵本身往往被称为心肺机或“泵”。心肺转流泵由灌注师操作。CPB是一种形式的体外循环。体外膜氧合通常用于长期治疗。
单采机器是这样的设备，所述设备接收从患者或供体体内取出的血液并将血液分离成其各种组分：血浆、血小板、白细胞和红细胞。
应当注意的是，在一些实施方案中，可用于本公开的主题的方法中的缀合粒子可以如由本公开的主题所定义的。在又一些其他实施方案中，本公开的主题的方法可使用由如本文之前定义的设备、套组、套件或系统。
在一些实施方案中，本公开的主题的方法可适用于从体液中耗尽至少一种纤溶蛋白，所述体液可以是包含至少一种凝血因子的全血、血浆或血液源性产品中的至少一者。
在一些特定实施方案中，这种血液源性产品可以是全血、血浆、新鲜冷冻血浆(FFP)、富含血小板的血浆(PRP)和冷沉淀物中的至少一者。
在又一些其他特定实施方案中，本公开的主题的方法可用于耗尽纤溶蛋白，所述纤溶蛋白可以是纤溶酶原和tPA中的至少一者。在一些特定实施方案中，本公开的主题的方法可用于耗尽tPA。在又一些其他实施方案中，本公开的主题的方法可用于耗尽纤溶酶原。此外，在某些实施方案中，本公开的主题的方法可用于耗尽纤溶酶原和tPA。
在又一些其他实施方案中，该方法还可包括从本公开的主题的缀合物、多种缀合物或其任何组合物，或者特别地TXA缀合粒子中回收纤溶酶原和tPA中的至少一者的步骤。
应当理解的是，通过本公开的主题的方法从体液中去除的耗尽的纤溶蛋白可用于其他目的。在一些特定实施方案中，从本公开的主题的装置或缀合物中回收纤溶酶原和/或tPA可以通过以下方式来执行：在所述装置上施加有效量的缀合物、其组合物，或特别是TXA、其衍生物或其任何类似物，或者与所述纤溶酶原和/或tPA结合的组合物、缀合物或特别是TXA缀合粒子。在又一些其他实施方案中，在需要纤溶的情况下，回收的纤溶酶原可用于治疗所述受试者。
更进一步，应理解的是，本公开还提供了一种体外装置，所述体外装置用于在通过体外工序从有需要的受试者的体液中耗尽至少一种纤溶蛋白的方法中使用。更具体地，该方法包括以下步骤：在第一步骤(i)中，将所述受试者的体液转移到中。在一些实施方案中，由本公开的主题提供的设备、套组、套件或系统可以被视为此类体外装置。第二步骤(ii)涉及使体液经历特异于至少一种纤溶蛋白的亲和力耗尽工序。应该注意的是，此类耗尽可以在血液被输送到所述装置中和从所述装置中输送出之前、期间或之后执行。以这种方式，获得了受试者的体外体液。该体外体液耗尽了至少一种纤溶蛋白。下一步骤(iii)涉及将在步骤(ii)中获得的至少一种纤溶蛋白耗尽的体液返回或重新引入受试者体内。
在另一方面中，本公开的主题提供了一种用于治疗、预防、防治、改善、抑制有需要的受试者的出血、止血病症和与其相关的任何出血或病理疾患的方法。更具体地，所述方法可包括向所述被治疗的受试者施用治疗有效量的至少一种具有降低的纤溶活性的血液和/或血液源性产品的步骤。在一些实施方案中，可通过如本文所述的方法制备所述产品。
在一些实施方案中，本公开的主题的方法可适用于可能是遗传性或获得性出血性病症的止血病症。
止血病症是分类为遗传性或获得性的出血病症。获得性出血病症是由外部(获得性)原因(诸如创伤、手术或纤溶治疗)引起出血的病症，如下文将讨论的。
由一种或多种凝血因子的遗传缺陷引起的出血病症是世界范围内的罕见病症。引起这些缺陷的突变基因的纯合子或复合杂合子表现出出血表现，所述出血表现的严重程度各不相同，并且通常与特定凝血因子活性降低的程度有关。
在其他实施方案中，本公开的主题的方法适用于治疗、预防、改善、抑制或延迟与遗传性止血病症和不确定的出血倾向有关的出血。
如本文所用的“遗传性止血病症”涉及至少一种凝血因子的遗传性缺陷。更具体地，已经鉴定出了编码凝血因子I、II、V、VII、X和XI的基因的许多突变，所述突变导致所述因子中的至少一者的缺乏或其活性受损。这些突变的纯合子自发地或在创伤/手术后表现出出血倾向。各种缺陷的杂合子很少表现出出血倾向。
如本文所用的不确定的出血倾向涉及具有出血倾向的疾患，而该疾患的精确诊断无法建立。
一些因为轻度出血症状而被转诊进行评估的患者具有未确诊的出血倾向，所述未确诊的出血倾向可能直到引发出血的攻击事件(诸如手术或分娩)发生才被识别出。关于出血表现的临床变异性在此类个体中很常见，表明环境因素和其他遗传因素可能改善出血风险。尽管轻度的出血问题直到暴露于重大的止血攻击(诸如手术、拔牙、重大创伤、初潮或分娩)才变得明显，但是尚无法确定这些个体的预测性术后出血风险。性别对出血表现有影响。女性通常会因月经和/或分娩引起的麻烦的出血而被转诊进行评估。另外，拔牙后24小时或更长时间持续存在或成问题的出血增加了出血病症的可能性。未能建立对轻度粘膜皮肤出血患者的诊断是实践中的常见问题。
正常的实验室测试是用于诊断不确定的出血倾向的标志。对于需要进行手术或分娩的患者，无法建立诊断可能是成问题的。
对于患有不确定性出血病症的患者的轻度出血症状，可将使用ε-氨基己酸或氨甲环酸的纤溶抑制剂疗法用于牙科和口腔手术，并可使用其他手术工序来减少出血。然而，在例如在手术或分娩期间发生严重出血的情况下，则需要血液或血液源性组分。
在更特定的实施方案中，遗传性止血病症可以是由至少一种凝血因子缺乏和不确定的出血倾向中的至少一者导致的病症。
在又一些其他实施方案中，至少一种凝血因子的缺乏可以是因子XI、因子X、因子V、因子VII、因子II(凝血酶原)和因子I(纤维蛋白原)中至少一者的缺乏。因此，在一些实施方式中，由本公开的主题描述的方法可适用于伴随由如本文所公开的因子XI、因子X、因子V、因子VII、因子II(凝血酶原)和因子I(纤维蛋白原)中的至少一者的缺乏引起的遗传性止血病症的任何形式的出血。
在又一些其他实施方案中，本公开的主题的方法可适用于治疗以凝血因子I、II、V、VII、X和XI的遗传缺陷为特征的病症，所述病症包括与所述凝血因子相关的任何出血倾向中的至少一种出血倾向或任何出血倾向。
凝血因子I、II、V、VII、X和XI的遗传缺陷是已在大多数群体中有描述的常染色体隐性出血病症。它们的相对频率在群体之间有所不同，部分原因是近交群体中特定突变基因的高频率。几项群体调查表明，这些出血性病症中常见的是因子XI和VII缺乏症，较不常见的病症是因子V和X缺乏症和无纤维蛋白原血症，并且最罕见的病症是因子II(凝血酶原)和因子XIII缺乏症。在为突变基因的纯合子或复合杂合子的受影响患者中，出血表现的严重程度是可变的，并且通常与缺陷的程度有关。一些患者仅具有轻度的擦伤或仅在创伤后才表现出过量出血。其他患者，通常具有低于1％的正常因子VII、XIII或X活性，可表现出类似于严重血友病患者的颅内出血和关节积血。
在一些特定实施方案中，本公开的主题的方法可适用于治疗、预防、降低、减弱或抑制与遗传性因子XI缺乏症、或患有因子IX缺乏症的患者的任何获得性出血或止血疾患相关的出血。
遗传因子XI缺乏症是作为常染色体隐性性状遗传的。该病症在纯合子或复合杂合子中表现为轻度至中度的出血倾向，所述轻度至中度的出血倾向主要与损伤有关。已描述了在大多数群体中都有受影响的受试者，但是在犹太人中，特别是德系犹太人中，这种病症是常见的。
由于功能障碍蛋白质导致的因子XI缺乏症很罕见，并且大多数患者具有降低的因子XI蛋白质水平。在各种起源的非犹太人和犹太人患者中，总共报告了超过150个突变，其中大多数突变是错义突变。
纯合子和复合杂合子的大多数出血表现是损伤有关的。过量出血可能在损伤时发生或在创伤后数小时或数天开始。出血倾向取决于止血攻击和变化的损伤部位而变化。涉及具有高纤溶活性的组织(尿道、扁桃体、鼻子、牙槽)的手术工序常常与严重因子XI缺乏症患者，无论基因型如何的过量出血相关。鉴于因子XI在预防凝块裂解中所表现出的功能，现在可以理解与部位相关的出血倾向。因子XI缺乏症本身与纤溶增加有关，因此，这些患者在富含纤溶的部位进行手术的附加出血风险可能会进一步增加出血倾向。
当前对患有因子XI缺乏症的出血患者的治疗是基于FFP的。患有严重的因子XI缺乏症的患者必须接受手术工序，所述手术工序应进行仔细评估并精心准备手术。在具有高局部纤溶活性的部位进行手术的患者应考虑使用抗纤溶剂。因此，在一些实施方案中，本公开的主题提供的tPA和/或纤溶酶原缺陷型FFP可能与治疗因子XI缺乏症患者特别相关。更具体地，受试者患有任何上述疾患。
在其他实施方案中，本公开的主题的方法可适用于治疗、预防、降低、减弱、抑制与遗传性因子VII缺乏症、或患有因子VII缺乏症的患者的任何获得性出血或止血疾患相关的出血。
因子VII遗传性缺陷是一种已在大多数群体中观察到的罕见常染色体隐性遗传病症。因为因子VII缺乏症是唯一会产生延长的凝结时间测试凝血酶原时间(PT)的凝血病症，因此可以容易地进行推测性诊断。引起因子VII缺乏症的大多数突变是错义突变。
在因子VII缺乏症的纯合子和复合杂合子中出现了出血表现。因子VII活性低于正常水平的1％的患者经常呈现出严重的出血表现，诸如关节积血，从而导致严重的关节炎和危及生命的颅内出血。
因子VII水平略高(因子VII活性为正常水平的5％或更高)的患者具有较轻的疾病，特征在于鼻衄、牙龈出血、月经过多和易瘀伤。当一些手术工序如拔牙、扁桃体切除术和涉及泌尿生殖道的工序在工序之前没有预先疗法时，经常伴有出血。相比之下，诸如剖腹手术、疝修补术、阑尾切除术和子宫切除术等手术工序却很顺利。这种明显的差异可以通过相应受创组织表现出的不同局部纤溶程度来解释。
通过FFP进行置换疗法对出现严重出血(诸如血栓形成或颅内出血)的患者至关重要。当需要手术时，应考虑手术部位，因为拔牙、扁桃体切除术、鼻子手术和泌尿科干预措施可能会因局部纤溶而与出血有关。因此，在一些实施方案中，由本公开的主题提供的tPA和纤溶酶原缺陷型FFP可与治疗因子VII缺乏症患者特别相关，具体地与上述疾患中的任何疾患特别相关。
在又一些其他实施方案中，本公开的主题的方法可适用于治疗、预防、降低、减弱、抑制与遗传性因子X缺乏症、或患有因子X缺乏症的患者的任何获得性出血或止血疾患相关的出血。
遗传性因子X缺乏症，即中度至重度出血倾向，是常染色体隐性遗传病症。当前描述的导致因子X缺乏症的95个突变包括大缺失、小移码缺失、无义突变和错义突变。因子X缺乏症的临床表现与因子X的功能水平有关。患有严重因子X缺乏症并且因子X水平低于正常的1％的个体会自发地出血和在创伤之后出血。出血主要发生在关节和软组织中，然而，女性的粘膜出血(诸如月经过多)可能尤其成问题。更多不寻常的出血是颅内出血、壁内肠道出血(其可产生的症状类似于急腹症的症状)、尿道出血，以及软组织出血伴有出血性假性囊肿或假性肿瘤的发展。在轻度缺乏因子X的个体中，出血不太常见，通常仅发生在创伤后、手术期间或手术后。使用新鲜冷冻血浆来治疗X因子缺乏症患者。因此，在一些实施方案中，由本公开的主题提供的tPA和/或纤溶酶原缺陷型FFP(或任何其他血液产品)可与治疗因子X缺乏症患者特别相关，具体地与患有上述疾患中的任何疾患的患者特别相关。
在又一些其他实施方案中，本公开的主题可适用于治疗、预防、降低、减弱和抑制与遗传性因子V缺乏症、或患有因子V缺乏症的患者的任何获得性出血或止血疾患相关的出血。
遗传性因子V缺乏症是较不常见的遗传性出血病症，并且在纯合子或复合杂合子中表现为中度出血倾向。因子V缺乏症是作为常染色体隐性性状遗传的。杂合子的血浆因子V活性在正常水平的25％与60％之间的范围内，通常是无症状的。因子V蛋白测定表明，大多数纯合子和复合杂合子具有真正的缺陷而不是功能障碍蛋白。已鉴定出超过80种不同的突变，其中四分之一是错义的，因子V水平在低于正常水平的1％至10％的范围内的纯合子或复合杂合子患者表现出终生出血倾向。常见表现包括瘀斑、鼻衄、牙龈出血、轻微裂伤后出血和月经过多。在患有严重的因子V缺乏症的患者的妊娠中有超过50％发生了产后出血。从其他部位出血较不常见。创伤、拔牙和手术会导致过量出血的高风险。在发生严重的自发性出血或执行手术的情况下，则应进行新鲜冷冻血浆置换。在计划血浆置换疗法时，重要的是考虑在局部纤溶活性较高的部位(如泌尿生殖道、口腔和鼻子)进行手术工序，因为在这些部位进行手术会导致过量出血，并且产后出血很常见。因此，在一些实施方案中，由本公开的主题提供的tPA和纤溶酶原缺陷型产品可与治疗因子V缺乏症患者特别相关，具体地与上述疾患中的任何疾患特别相关。
在某些实施方案中，本公开的主题的方法可特别适用于治疗、预防、降低、减弱、抑制与遗传性因子II缺乏症、或患有因子II缺乏症的患者的任何获得性出血或止血疾患相关的出血。
遗传因子II(凝血酶原)缺乏症是最罕见的凝血因子缺乏症之一。它以两种形式出现：I型，真正的缺陷(低凝血酶原血症)；以及II型，其中产生了功能障碍的凝血酶原(异常凝血酶原血症)。这些常染色体隐性遗传病症在遗传上是异质的，并且特征是轻度至中度的出血倾向。
凝血酶原的异常是以常染色体隐性方式遗传的。在患有I型缺陷的个体中，杂合子表现出的凝血酶原水平为正常水平的约50％，而纯合子表现出的水平通常低于正常水平的10％。已经鉴定出了超过五十种引起凝血酶原缺乏症的突变，其中大多数是错义突变。
遗传的I型和II型缺陷的特征是轻度至中度的粘膜皮肤和软组织出血，所述轻度至中度的粘膜皮肤和软组织出血通常与功能性凝血酶原缺乏症的程度有关。凝血酶原水平为正常水平的约1％时，出血可自发地发生或在创伤之后发生。手术出血可能很严重。可能会发生月经过多、鼻衄、牙龈出血、易瘀伤和皮下血肿。
对遗传性凝血酶原缺乏症患者的替代治疗由FFP施用组成。因此，在一些实施方案中，由本公开的主题提供的tPA和纤溶酶原缺陷型FFP可与治疗因子II缺乏症患者特别相关，具体地与上述疾患中的任何疾患特别相关。
在又一些其他实施方案中，本公开的主题可适用于治疗、预防、降低、减弱、抑制与遗传性纤维蛋白原缺乏症、或患有纤维蛋白原缺乏症的患者的任何获得性出血或止血疾患相关的出血。
如本文所用的“纤维蛋白原(因子I)缺乏症”涉及遗传性纤维蛋白原异常，包括无纤维蛋白原血症(完全不存在纤维蛋白原)、纤维蛋白原异常血症和低纤维蛋白原血症。纤维蛋白原的遗传性病症很少见，并且可划分为I型和II型病症。I型病症(无纤维蛋白原血症和低纤维蛋白原血症)会影响循环中纤维蛋白原的量。II型病症(纤维蛋白原异常血症和低纤维蛋白原血症)影响循环纤维蛋白原的质量。无纤维蛋白原血症是纤维蛋白原缺乏的最严重形式，其特征是常染色体隐性遗传和血浆中完全不存在纤维蛋白原。
纤维蛋白原异常血症被定义为存在正常水平的功能异常的血浆纤维蛋白原。低纤维蛋白原血症被定义为低水平的功能障碍蛋白。这些是由三种纤维蛋白原编码基因的许多不同突变引起的异质性病症。纤维蛋白原异常血症和低纤维蛋白原血症是常染色体显性遗传病症。大多数受影响的患者对于在三个纤维蛋白原基因中的一个纤维蛋白原基因的编码区中错义突变是杂合的。因为分泌的纤维蛋白原六聚体含有三个纤维蛋白原链中每个纤维蛋白原链的两个拷贝，并且所得的纤维蛋白网络含有分子的多个拷贝，所以一个突变体等位基因的杂合性足以损害纤维蛋白凝块的结构和功能。
通常在新生儿期会出现因无纤维蛋白原血症引起的出血，其中85％的病例出现脐带出血，但发病年龄较晚并不罕见。出血可能发生在皮肤、胃肠道、泌尿生殖道或中枢神经系统中，其中颅内出血是死亡的主要原因。在无纤维蛋白原血症患者中，存在令人不解的脾脏自发性破裂易感性。月经期女性可能会经历月经过多。此外，早期流产在无纤维蛋白原血症女性中很常见。这些患者也可能有产前和产后出血。还观察到了黄体破裂后的腹腔积血。
用含有纤维蛋白原的商品进行置换疗法是治疗遗传性纤维蛋白原缺乏症患者的唯一选择。因此，在一些实施方案中，本公开的主题的方法可与治疗纤维蛋白原缺乏症患者特别相关，具体地与上述疾患中的任何疾患特别相关。特别地，在一些实施方案中，其中通过本公开的主题的缀合物和方法制备的纤溶蛋白耗尽的体液补充有纤维蛋白原。
与用于治疗遗传性凝血因子缺乏症的血液源性产品的商业制备物不同，通过本公开的主题的缀合物、组合物和方法制备的纤溶蛋白耗尽的体液具有显著的优势，因为除了提供缺失的因子(促凝血剂质量)之外，从产品中去除t-PA和纤溶酶原使所述产品具有抗纤溶质量，这对于防止出血情况下的进一步凝块溶解是必不可少的。
在一些实施方案中，本公开的主题的方法可适用于治疗获得性止血病症。获得性止血疾病可以是以下各项中的至少一项：手术引起的出血、创伤引起的出血、急性胃肠道出血、与烧伤相关的出血、出血性中风、与肺气肿和慢性阻塞性肺疾病(COPD)相关的肺损伤、与分娩相关的出血、弥散性血管内凝血(DIC)和纤溶或溶栓治疗引起的出血。
在一些特定实施方案中，本公开的主题的方法可适用于治疗、预防、减少、减轻和抑制与手术工序，特别是小或大手术工序相关的出血。
手术工序是对止血系统的巨大攻击，特别是当在富含纤溶蛋白的地方(例如，组织、器官)执行手术时。即使没有或有轻度至中度出血性病症的患者，手术后也可能过量流血。除了手术创伤的程度外，还必须考虑手术部位的纤溶活性大小。
应该理解的是，在手术工序是选择性的、预期的或非紧急的情况下(例如，剖宫产手术或任何其他有足够时间进行术前准备的大手术)，本公开的主题的产品可用于术前治疗以利于预防或减少手术治疗期间的过量出血。因此，在一些实施方案中，本公开的主题可提供特别适用于患有遗传性病症的患者、患有纤溶亢进的患者和/或预期要手术的患者的预防方法。
在一些另外的特定实施方案中，本公开的主题的方法适合于治疗创伤引起的出血(创伤性出血)。
创伤性出血可能由任何类型的损伤引起，例如由于工作和交通事故、战斗或摔倒而引起的任何损伤。存在不同类型的可导致出血的创伤性伤口。通常，创伤会导致对血管的损害，继而导致血液向外流到体外或向内流入身体器官(诸如脑、肺、肝、肾、脾)或流入体腔(诸如胸腔和腹腔)中。
除了采取使出血停止的物理措施外，通常还施用血液和血液源性组分以引发血液凝结，这将最终导致出血的停止。
本公开的主题的tPA和/或纤溶酶原缺陷的血液和血液源性产品显示出优于市售血液源性产品的优势，因为它们提供了附加的抗纤溶特性，这将防止已形成的凝块的溶解，已形成的凝块对于快速停止血可为必不可少的。
在一些特定实施方案中，通过本公开的主题的缀合物和方法制备的纤溶蛋白耗尽的体液可适用于治疗急性或慢性胃肠道出血。
如本文所用，“胃肠道(GI)出血”，也称为胃肠道出血，涉及胃肠道中从口腔到直肠的所有形式的出血。“急性胃肠道出血”是指在短时间内出现大量失血，从而导致急性失血和失血性休克。症状可包括呕吐(咯血)出红血或黑血(由于经消化的血液导致的，也称为“咖啡渣”)、血便或黑便(经消化的血液称为黑便)。相比之下，慢性胃肠道出血是长时间内的少量血液出血。在这种情况下，症状是缺铁性贫血。
胃肠道出血通常分为两种主要类型：上胃肠道出血和下胃肠道出血。上胃肠道出血的原因包括：消化性溃疡疾病、食道静脉曲张，这些疾病在一些实施方案中可能是由于肝硬化和癌症等而发生的。下胃肠道出血的原因包括：痔疮、癌症和炎症性肠病等。上胃肠道和下胃肠道的内窥镜检查可定位出血区域。在不清楚的情况下，医学成像可为有用的。
急性上胃肠道出血比下胃肠道出血更为常见。每年在每100,000名成年人中有50至150人发生上胃肠道出血。每年在每100,000名成年人中有20至30人发生下胃肠道出血。者导致在美国每年有约300,000人入院。胃肠道出血的死亡风险介于5％与30％之间。出血风险在男性中更常见，并且随着年龄的增长而增加。
上胃肠道出血的最常见来源是消化性溃疡。食道炎症和糜烂性疾病是下一个最常见的原因。在肝硬化患者中，50-60％的出血是由于食管静脉曲张。患有消化性溃疡的患者中有约一半患有幽门螺杆菌感染。其他原因包括胃溃疡或十二指肠溃疡、食管黏膜撕裂症(Mallory-Weiss tears)、癌症和血管发育不良。发现许多药物导致上胃肠道出血：NSAID、COX-2抑制剂、SSRI、皮质类固醇和抗凝剂。
下胃肠道出血通常来自结肠、直肠或肛门。下胃肠道出血的常见原因包括痔疮、癌症、血管发育不良、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病和主动脉肠瘘。
急性胃肠道出血的治疗的最初重点是复苏，首先要进行气道处理和使用静脉输液和输血进行液体复苏。
结肠镜检查对下胃肠道出血的诊断和治疗很有用。可以采用许多技术，包括：剪裁、烧灼和硬化疗法。手术虽然很少用于治疗上胃肠道出血，但仍然经常用于通过切除肠道的引起问题的部分来管理下胃肠道出血。血管造影栓塞可用于上胃肠道出血和下胃肠道出血。
更进一步，使用本公开的主题的缀合物和装置，通过本公开的主题的方法制备的纤溶酶原和/或tPA耗尽的血液产品可用于治疗出血性中风。
如本文所用的“出血性中风”涉及直接发生到脑实质中的出血。通常的机制被认为是被慢性高血压损害的小脑内动脉渗漏。颅内出血患者比缺血性中风患者更容易出现头痛、精神状态改变、癫痫发作、恶心和呕吐，和/或明显的高血压。即使这样，这些发现也都不能可靠地区分出血性中风和缺血性中风。特定症状可源于局灶性神经功能缺损。缺陷的类型取决于所涉及的脑区域。如果牵涉到占主导地位的(通常是左)脑半球，则可能导致由以下组成的症状：右偏瘫、右半感觉丧失、左视线偏爱、右视野切开(right visual fieldcut)和失语。如果牵涉到不占主导地位的(通常是右)脑半球，则可能导致由以下组成的症状：左偏瘫、左半感觉丧失、右视线偏爱和左视野切开left visual field cut)。
脑成像是评估可疑出血性中风的关键步骤，必须在紧急情况下获得。脑成像有助于诊断出血，并且其可识别并发症，诸如脑室内出血、脑水肿或脑积水。无对比计算机断层扫描(NCCT)扫描或磁共振成像(MRI)都是选择方式。
如果指示使用血液制品治疗出血性中风，则使用从血库获得的血液、FFP和血小板。考虑到通过本公开的主题的缀合物和方法制备的纤溶蛋白耗尽的体液的血栓形成和抗纤溶质量，看起来它们比常规血液产品更适合于出血性中风患者的止血。
在一些特定实施方案中，本公开的主题的方法可适合于治疗与肺气肿和COPD相关的肺损伤。在更具体的实施方案中，本公开的主题的方法可包括以下步骤：向治疗的受试者施用治疗有效量的通过本公开的主题的缀合物和方法制备的纤溶蛋白耗尽的体液，这是由于所述体液富含α-1抗胰蛋白酶，使得所述体液更适合用于治疗患有肺气肿和COPD的受试者。在这些疾病中，白细胞蛋白酶破坏了肺的弹性，从而导致肺更饱满，并进而导致肺气肿和慢性阻塞性肺疾病(COPD)的发展。因此，通过本公开的主题的缀合物和方法制备的纤溶蛋白耗尽的体液中的α-1抗胰蛋白酶可抑制白细胞蛋白酶的活性，并且通过这种方式恢复了肺组织的弹性。
肺气肿是一种形式的慢性(长期)肺部疾病。肺气肿患者由于呼出空气受限而难以呼吸。肺气肿有多种原因，但是吸烟是目前为止最常见的原因。
肺气肿是慢性阻塞性肺疾病(COPD)的主要类型之一。之所以称为“阻塞性”，是因为患有肺气肿的人呼气好像有什么东西在阻塞空气流通一样。另一种形式的COPD是慢性支气管炎，慢性支气管炎也可能是吸烟引起的。
当肺部中肺泡的脆弱内层受损而无法修复时，就会导致肺气肿。最常见的是，香烟烟雾中的毒素会造成损害。肺气肿的肺部变化随着肺泡之间的脆弱组织被破坏以及肺中的气袋形成而在多年内缓慢演进。空气变得被困在受损肺组织的这些空间中。肺部缓慢扩张，并且呼吸需要更多的努力。
这种肺气肿问题被称为气流受限。在进行肺功能测试期间，患有肺气肿的人排空肺部所需的时间要比没有肺气肿的人更长。
除吸烟外，肺气肿的另一个主要已知原因是α-1抗胰蛋白酶缺乏症。然而，与吸烟相比，这是次要的原因。α-1抗胰蛋白酶是人血液中循环的天然蛋白质。它的主要功能是防止白细胞损害正常组织。因此，用由本公开的主题的缀合物和方法制备的富含α-1抗胰蛋白酶的纤溶蛋白耗尽的体液治疗患有肺气肿的受试者可抑制蛋白酶的活性，从而恢复肺组织的弹性。
慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种类型阻塞性肺疾病，其特征在于长期的不良气流。主要症状包括呼吸短促和咳嗽以及产生痰液。COPD通常会随着时间推移而恶化。最终步行上楼或搬运东西将很困难。慢性支气管炎和肺气肿是用于不同类型COPD的较老术语。术语“慢性支气管炎”仍用于定义两年中每年存在至少三个月的排痰性咳嗽。
COPD是一种类型的阻塞性肺部疾病，其中存在慢性不完全可逆的不良气流(气流受限)和无法完全呼气(空气滞留)。不良气流是肺组织破裂(称为肺气肿)和小气道疾病(称为阻塞性细支气管炎)的结果。这两个因素的相对贡献因人而异。小气道的严重破坏会导致形成称为肺大疱的大气袋，该肺大疱取代了肺组织。这种形式的疾病称为大疱性肺气肿。
吸烟是COPD的最常见原因，还有许多其他因素，诸如作用较小的空气污染和遗传因素。在发展中国家，空气污染的常见来源之一是通风不畅的取暖和烹调火灾。长期暴露于这些刺激物会引起肺部炎症反应，从而导致小气道变窄和肺组织破裂。该诊断基于通过肺功能测试测得的不良气流。与哮喘不同，使用支气管扩张剂对气流减少并没有太大改善。
COPD最常见症状是痰液产生、呼吸短促和排痰性咳嗽。这些症状会持续很长时间段，并且通常会随着时间的推移而恶化。尚不清楚是否存在不同类型的COPD。尽管先前将肺气肿分为肺气肿和慢性支气管炎，但肺气肿仅是对肺部变化的描述，而不是疾病本身，并且慢性支气管炎只是对COPD可能会或可能不会出现的症状的描述。
晚期COPD会导致肺动脉高压，这会使心脏的右心室劳损，并导致右心力衰竭。这种情况被称为肺心病，并导致腿肿胀和颈部静脉鼓出的症状。COPD比任何其他肺部疾病都更容易引起肺心病。自从使用补充氧气以来，肺心病已经不那么普遍了。
因此，由本公开的主题的缀合物和方法制备的纤溶蛋白耗尽的体液作为COPD的补充治疗可为有益的，因为其富含α-1抗纤溶酶可抑制白细胞的蛋白酶，从而修复受损肺组织的弹性质量。
更进一步，使用本公开的主题的缀合物和装置，通过本公开的主题的方法制备的纤溶酶原和/或tPA耗尽的血液产品可用于治疗烧伤和任何与之相关的出血。如本文所用的术语“烧伤”是指对组织的损伤，涉及对皮肤以及可能在皮肤下面的组织的损伤。接触热、火焰、化学物质、电或辐射可能导致烧伤。
烧伤主要是由事故导致的，并且根据原因可分为热烧伤、电灼伤、化学烧伤、辐射烧伤。根据烧伤的宽度和深度，与引起烧伤的物体温度的接触时间以及皮肤状况，将烧伤的严重程度分为一级、二级、三级和四级烧伤。在二级或更高级的烧伤中，可能会留下疤痕，并且需要在医院中进行治疗。
一级烧伤会导致皮肤发红和瘙痒疼痛。它们会损坏表皮，即皮肤表层的最外层，并伴随疼痛和发红而肿胀。几天后症状消失，但可能会留下表皮剥脱和色素沉着。恢复后，瘢痕(疤痕)不再保留。晒伤是一级烧伤的最常见示例。
二级烧伤会影响表皮和真皮，并在事故发生后24小时内引起发红、疼痛、肿胀和水泡。二级烧伤可影响汗腺或毛孔。发生严重烧伤感和疼痛。水泡破裂会留下被侵蚀的区域，并大量释放分泌物。当烧伤面积约为人体表面积的15％或更多时，应给予特别注意。二级烧伤可在几周内治愈，但在许多情况下，会留下色素沉着或色素减退斑。当发生继发感染时，部分症状会变得更加严重，并且需要更长的时间才能治愈。
三级烧伤会影响表皮、真皮甚至皮下脂肪，并且皮肤的颜色变深或变浅，并且皮肤表面下方的血管凝结。烧伤区域可能会变得麻木，但患者会感到极度疼痛，并且皮肤组织和结构会死亡，需要大量时间进行治疗，并汇留下疤痕。在事故发生后2周内，疮痂剥离并露出溃烂的表面。会分泌出大量体液，可能会发生出血，但三级烧伤会在新组织逐渐形成时愈合，从而导致表皮再生，留下疤痕。当深层皮肤坏死发展时或当发生继发感染时，愈合被延迟并产生不平坦的瘢痕表面，从而导致瘢痕疙瘩形成、变形或移动病症。当烧伤面积约为人体表面积的10％或更多时，需要特别注意。
四级烧伤涉及烧伤区域的碳化和变黑的组织，并延伸穿过皮肤层以损伤脂肪层、韧带、筋膜、肌肉以及甚至骨骼组织。四级烧伤主要包括高压电灼伤，并且在一些情况下，发生病毒感染时，深层的2-3级真皮烧伤可能发展为四级烧伤。当烧伤面积在20％或更高的范围内时，全身可能会发生反应；低血压、休克、急性肾功能不全可能是由于体液流失过多而发生，并且伤口感染或肺炎、败血症和多器官功能障碍综合症可能稍后发生。
在高于44℃(111℉)的温度下，蛋白质开始失去其三维形状并开始分解。这导致细胞和组织损伤。烧伤的许多直接健康影响是继发于皮肤正常功能的破坏。它们包括破坏皮肤的感觉、防止水分因蒸发而流失的能力以及控制体温的能力。细胞膜的破坏会导致细胞向细胞外空间失去钾，并吸收水和钠。
在大面积烧伤(占全身表面积的超过30％)中，会有明显的炎症反应。这导致从毛细血管渗漏的体液增加，并随后引起组织水肿。这会导致总体血容量减少，而剩余的血液则会遭受明显的血浆损失，从而使血液更浓。流向诸如肾脏和胃肠道等器官的血流不畅可能导致肾功能衰竭和胃溃疡。
在又一些其他实施方案中，手术引起的出血可以是小手术或大手术引起的出血。大手术被定义为任何牵涉麻醉或呼吸辅助的手术工序。在大手术期间发生出血的情况下，治疗包括用商业FP、FFP或冷沉淀物置换缺失或无功能的凝血因子。
与如上文中所详述涉及牵涉麻醉或呼吸辅助的任何手术工序的大手术不同，小手术是涉及用仪器切口、对活体执行损伤修复或停止疾病的医疗工序。由于小手术包括切口或切割，这是用锋利的边缘穿透或打开人体任何部分的行为，在有出血倾向的受试者中，这种工序可引起大量出血。
应当注意的是，在一些实施方案中，本公开的主题的方法可以适用于小手术，所述小手术可以包括任何牙科治疗或工序。术语“牙科治疗”是指任何旨在预防和/或治疗颌骨(下颌骨)、口腔、颌面部以及人体的邻近和相关结构的软组织和硬组织的疾病、病症和疾患的治疗。这种治疗显然涉及牙科、正畸学、牙周病学、口腔医学和口腔外科，但也可能涉及牙科和医学实践的其他分支，所述分支可能涉及口腔的总体健康。
更进一步，大手术可为心脏直视手术或肝移植手术。
大手术被定义为任何涉及麻醉或呼吸辅助的手术工序。在大手术期间发生出血的情况下，治疗包括用商业FP、FFP或冷沉淀物置换缺失或无功能的凝血因子。然而，这可能还不够，因为上述产品中tPA和纤溶酶原的存在可在手术损伤部位介导纤溶活性，从而促进所形成的用于停止或防止出血的凝块的溶解。因此，施用本公开的主题的显示出显著降低的纤溶活性的t-PA和纤溶酶原缺乏的产品，是臂商业产品更好和更有效的治疗选择，因为除了通过本公开的主题的产品补充凝血因子之外，它们的抗纤溶活性(如实施例所示)还可减少或防止由商业产品中存在的纤溶蛋白诱导的凝块裂解引起的出血。
在特定实施方案中，本公开的主题的方法适用于心脏直视手术。可以预料一些手术工序可导致严重的出血，例如心脏直视手术。在这些手术中，使用体外循环(心肺转流-CPB)。
心血管(心脏直视)手术是由心脏外科医生在心脏或大血管上执行的手术。通常，它用于治疗缺血性心脏病的并发症(例如，冠状动脉旁路移植术)、纠正先天性心脏病或治疗各种原因引起的瓣膜性心脏病，所述各种原因包括心内膜炎、风湿性心脏病和动脉粥样硬化。它还包括心脏移植。
在心脏直视手术期间，心脏暂时停止跳动。接受心脏直视手术的患者将接受心肺转流，这意味着一台为他们输送血液和氧气的机器。一台机器永远不会像正常的心脏和肺那样运作，因此，与许多手术工序类似，使该机器上的时间保持最少。这种人工方法提供了一种旁路来暂时克服患者对心脏和肺部功能的需求。
在这些手术中发生的出血现象是由于手术期间使用的抗凝血剂引起的，所述抗凝血剂有意引起凝结缺乏。另外，由于血液穿过体外循环而引起的血小板功能障碍也导致出血倾向。
应该认识到，本公开的主题的方法可特别适用于通过CPB进行心脏直视手术的受试者。本公开的主题的产品、组合物和方法可以向这些患者带来如下的双重有益效果：
1.在进行心脏直视手术期间，血液将流经添加到心肺机(CPB机)的管道，同时该管道上涂有氨甲环酸以耗尽来自血液的t-PA和/或纤溶酶原(如实验工序中所详述)。泵会将血流从CPB机引导到患者。当流过该管道时，耗尽了t-PA和纤溶酶原的血液将返回患者的循环。
通过这种方式，返回的血液的纤溶活性差并且富含抗纤溶活性，从而提供了防止出血倾向的保护。
2.如果由于上述原因发生出血，则可以用通过本公开的主题的缀合物和方法制备的纤溶蛋白耗尽的体液治疗患者以使出血停止，这由于其抗纤溶特性而有望更有效地止血。
在进一步的实施方案中，本公开的主题的方法适合于实施与肝移植手术相关的出血的治疗。
肝脏在止血和血栓形成中起着核心作用。肝实质细胞是大多数凝血因子、凝血的生理抑制剂和纤溶系统必不可少的组成组分的合成部位。肝脏还通过清除来自循环中的激活的凝血因子和酶抑制剂络合物来调节止血和纤溶。因此，当患有肝病的患者发生肝功能障碍时，随之而来的是复杂的止血失调，这可能导致出血。
在肝移植的第一阶段期间，去除患病的肝脏(无肝阶段)，可能会发生明显的止血变化。由于激活的凝血因子并未从循环中去除，因此它们的消耗会与血小板的消耗和继发性纤溶亢进一起发展。此外，由于tPA清除有缺陷而导致发生了原发性纤溶亢进。肝移植期间最严重的止血变化发生在供体肝脏再灌注后。血小板被困在移植物中，引起血小板减少症的加剧，并通过诱导内皮细胞凋亡而对移植物造成损害。从再灌注的移植物中释放组织因子和tPA进一步引起了纤溶。因此，在无肝和再灌注阶段，纤溶亢进被认为对受损的止血有明显的贡献。此外，移植物释放出能抑制凝血的类肝素物质。此外，在此阶段期间，其他因素(诸如体温过低、代谢性酸中毒和血液稀释)也会不利地影响止血。肝移植是漫长的工序，需要广泛的手术伤口表面，包括潜在的侧支静脉交易。改进的手术技术和麻醉护理已大大减少了肝移植期间的失血量。当发生不受控的出血时，可输注浓集红细胞、血小板和新鲜冷冻的血浆。通常使用合成的抗纤溶剂，例如氨甲环酸(赖氨酸类似物)和抑肽酶(丝氨酸蛋白酶抑制剂)。
因此，应当理解的是，本公开的主题的产品、本公开的主题所描述的缀合物、组合物和方法由于它们的抗纤溶质量而特别适用于停止与由肝移植手术诱导的纤溶亢进状态相关的出血。
应当理解的是，本公开的主题的方法可适用于涉及任何器官或组织移植(例如，肝、肾、肺、心脏、胰腺、皮肤、血管等)的任何手术。
在一些其他实施方案中，本公开的主题的方法可适用于获得性止血病症，所述获得性止血病症可能是由纤溶或溶栓治疗引起的出血。
纤溶/溶栓治疗大部分在急性心肌梗死(急性冠状动脉血栓形成)患者或急性中风(急性脑动脉血栓形成)患者中施用。纤溶/溶栓治疗的目标是通过加速血栓的纤溶蛋白水解来实现阻塞血管中血流的快速恢复。纤溶疗法通常会导致纤溶状态，因为纤溶酶原激活不限于血栓。这些效应是复杂的，并且包括纤维蛋白原水平的降低、纤维蛋白原降解产物的增加以及凝血因子的减少。纤溶疗法的并发症是出血。纤溶治疗的出血并发症比抗凝血剂治疗更为频繁，并且需要快速诊断和管理。有两个问题导致过量出血。首先，纤溶效应不限于血栓形成部位，而是通常为全身性的。因此，为防止因治疗所需的导管或在脑、胃肠道或其他部位的病理病变内引起的血管损伤部位处出血所需的任何止血塞也易溶解。最严重的并发症是颅内出血，颅内出血在约1％的患者中发生并且与高死亡率和幸存者的严重残疾相关。最常见的出血并发症与侵入性血管工序(诸如放置动脉和静脉导管)有关。这些部位的一些出血是经常发生的，并且如果可以使用局部压力或其他简单措施进行管理，则不应成为中断治疗的理由。通过限制静脉和动脉穿刺以及及早采取局部措施，可以使问题最小化。先前存在的病变(诸如胃肠道溃疡或泌尿生殖系统病变)也可导致大出血。
纤溶/溶栓后的出血并发症的治疗包括针对局部部位的措施，以及对全身性低凝血状态的纠正，包括用于纠正由全身性纤溶症引起的止血缺陷的置换疗法。经常需要纤维蛋白原置换，并且可以通过施用冷沉淀物来实现，而新鲜冷冻血浆可用于置换其他止血蛋白。
应该注意的是，纤溶/血栓溶解疗法，包括使用抗凝血剂或抗凝剂。如本文所用，术语“抗凝血剂”旨在表示干扰血液凝结的任何试剂。一些抗凝血剂，例如香豆素衍生物双羟基香豆素(Dicumarol)和华法林(Coumadin)会抑制凝血酶原、凝块形成物质和其他凝血因子的合成。抗凝血剂可包括但不限于充当β2肾上腺素受体拮抗剂、神经肽V2拮抗剂、前列环素类似物、血栓烷合酶抑制剂、钙激动剂、香豆素衍生物、弹性蛋白酶抑制剂、非甾体抗炎药凝血酶抑制剂、脂氧合酶抑制剂、因子Vila抑制剂、因子Xa抑制剂、磷酸二酯酶III抑制剂、肝素和纤维蛋白原糖蛋白Ilb/IIIa拮抗剂的化合物。
香豆素是维生素K拮抗剂。该类别的主要成员是华法林(Coumadin)。这些抗凝血剂用于治疗患有深静脉血栓形成(DVT)、肺栓塞(PE)的患者并预防具有房颤(AF)和机械性人工瓣膜的患者中的栓子。其他示例是醋硝香豆素、苯丙香豆素、阿托曼霉素和苯茚二酮。
肝素是一种通常由猪肠制成的生物物质。它通过激活抗凝血酶III来起作用，该酶可阻止凝血酶凝结血液。低分子量肝素是一种加工程度更高的产品，其是有用的，因为其不需要监测APTT凝血参数并且具有较少的副作用，如例如为依诺肝素(克赛(Clexane))。
磺达肝癸钠(Fondaparinux)是由肝素中的五种糖(五糖)与抗凝血酶结合而成的合成糖，并且是因子Xa的抑制剂。它是比低分子量肝素更小的分子。另一个示例是艾达肝素钠(Idraparinux sodium)，其化学结构和作用方法与磺达肝癸钠相似。
诸如利伐沙班(rivaroxaban)、阿哌沙班(apixaban)和依度沙班(edoxaban)等药物通过直接抑制因子Xa起作用(与肝素和磺达肝癸钠不同，肝素和磺达肝癸钠通过抗凝血酶激活起作用)。
其他示例包括但不限于来自Portola Pharmaceuticals的贝曲沙班(betrixaban)、来自Astellas的darexaban(YM150)，以及最近来自Takeda的来曲沙班(letaxaban)(TAK-442)和来自Pfizer的伊利巴西班(eribaxaban)(PD0348292)。
另一种类型的抗凝剂是直接凝血酶抑制剂。目前此类别的成员包括但不限于二价药物水蛭素、来匹卢定(lepirudin)和比伐卢定(bivalirudin)；以及单价药物阿加曲班(argatroban)和达比加群(dabigatran)。
抗凝血酶蛋白本身用作蛋白质治疗性抗凝血剂，可以从人血浆中纯化或重组生产(例如，Atryn，其在经基因修饰的山羊的奶中生产)。
如上所述，抗凝血剂施用，例如肝素，是标准的抗血栓治疗，适用于急性静脉血栓形成，用于预防术后(尤其是骨科)和不能活动的患者的血栓形成，以及用于冲洗静脉管线以保持通畅。然而，由于其效力，肝素和LMWH具有缺点。由于简单的运动应力和伴随的与物理物体或手术部位的接触而导致的不可控出血是主要的并发症。此外，约5％(范围至多30％)用肝素治疗的患者和约2％接受未分级肝素(UFH)治疗的患者发展出了免疫介导的血小板减少症(HIT)，所述HIT可能因出血(血小板计数减少的结果)或因血管内血小板聚集导致的动脉和静脉血栓形成而复杂化。本公开的主题的产品和方法可防止这些抗凝剂的此类非所需的效应。
更具体地，弥散性血管内凝血(DIC)是一种病理过程，其特征在于凝结级联的广泛活化，所述广泛活化会导致整个身体的小血管中形成血凝块。这导致受损的组织血流，并且可最终导致多器官损伤。此外，由于凝血过程会消耗凝血因子和血小板，因此正常凝血会受到干扰，并且各个部位都会发生严重的出血。
在又一些实施方案中，本公开的主题提供了适用于治疗、预防、预防改善、抑制与分娩或怀孕有关的任何出血，例如产后出血(PPH)的方法。产后出血(PPH)通常被定义为分娩后的前24小时内损失了超过500ml或1,000ml的血液。体征和症状最初可包括：心跳加快、站立时感到头晕和呼吸速率加快。该疾患可在分娩后至多六周内发生。最常见的原因是分娩后子宫收缩不良，事实上并非所有胎盘均已分娩出、子宫撕裂或血液凝结不良。
产后出血的原因是子宫收缩乏力、创伤、胎盘滞留和凝血病，通常称为“四个T”：
子宫收缩乏力(Tone)：子宫收缩乏力是子宫无法收缩并可能导致持续出血。胎盘组织保留和感染可导致子宫收缩乏力。子宫收缩乏力是产后出血的最常见原因。
创伤：即使分娩受到适当监测也可能发生的对包括子宫、子宫颈、阴道和会阴在内的产道的损伤。由于怀孕期间所有这些器官变得更血管化，因此出血是严重的。
组织：来自胎盘或胎儿的组织的保留可导致出血。
凝血酶：当存在凝结障碍，诸如被称为凝血病的疾病时，就会出现出血病症。
应当理解的是，在一些实施方案中，本公开的主题的不含tPA和/或纤溶酶原的产品和使用所述产品的任何方法可适用于如上所述的PPH的治疗和预防。
在又一些其他实施方案中，本公开的主题的方法也可适用于治疗GPS。古德帕斯丘综合征(Goodpasture syndrome；GPS)是一种罕见的自身免疫性疾病，其中抗体攻击肺和肾的基底膜，从而导致肺出血和肾衰竭。使用本公开的主题的缀合物和方法，从经常用于治疗所述患者的体液如血液产品中耗尽纤溶蛋白如tPA和/或纤溶酶原可改善治疗。
在又一些其他实施方案中，本公开的主题的方法可适用于治疗由血管破裂引起的出血。
在一些特定实施方案中，关节内注射血浆或富含血小板的血浆用于治疗患有膝骨关节炎(OA)的患者。已经证明，向膝盖注射PRP导致了显著的临床改善(Meheux CJ等人)。另一方面，认为可降解多种细胞外基质组分(诸如胶原蛋白和聚集蛋白聚糖核心蛋白)的尿激酶型纤溶酶原激活物(PA)的表达在OA的发展中特别重要(Pap G等人)。Expression ofstromelysin and urokinase type plasminogen activator protein in resectionspecimens and biopsies at different stages of osteoarthritis of the knee(PapG等人)。因此，注射通过本公开的主题的缀合物和方法制备的纤溶蛋白耗尽的体液将防止有害效应并改善结局。
更进一步，可预期手术治疗会导致遗传性止血病症患者严重出血。这些患者可能在手术期间或之后过量出血。应当理解的是，对于患有遗传性止血病症的患者，除了手术创伤的程度之外，还必须考虑手术部位的纤溶活性大小。因此，在具有遗传溶血性病症的患者中，在富含纤溶活性的部位，诸如口腔、鼻咽腔以及泌尿生殖系统，特别是前列腺床进行的手术工序可能会导致过量出血。因此，在一些实施方案中，本公开的主题的方法也可特别适用于此类出血。
如上所述，本公开的主题的方法涉及施用或重新引入具有降低的或没有纤溶活性的体液或其产品，所述体液或其产品是使用本公开的主题的缀合物或本公开的主题所公开的任何组合物、设备、套组、套件或系统由本文之前讨论的方法产生的。
在一些特定实施方案中，可以使用体外装置执行施用。在又一些其他实施方案中，可以使用如本文所讨论的任何设备、套组、套件或系统将无纤溶活性的产品施用于受试者。
应当理解的是，在一些实施方案中，如上所述具有降低的纤溶活性的产品可以由从同种异体受试者获得的体液制备。在又一些其他实施方案中，尤其是在选择性手术(例如，计划的手术)的情况下，可以用自体来源的体液产品治疗受试者。
如本文所用的“自体”献血是这样的概念，在所述概念中，如果可以预期需要血液并制定了献血计划，则输血人员可以献血供自己使用。最常见的此情况在选择性手术时发生。可以通过术前献血获得自体血液供进行输血。如本文所用，术语“同种异体血液”涉及从相同物种的无关供体收集的血液。更具体地，在一些实施方案中，当从至少一个人受试者或更多受试者获得本公开的主题的血液或血液产品时，同种异体来源是指所得产品可用于其他人类个体。
如上所述，本公开的主题提供了用于治疗出血、止血病症以及与之相关的任何疾患的方法。如本文所用，与受试者的健康有关的“疾病”、“病症”、“疾患”等可互换地使用，并且具有赋予此类术语中的每一或所有术语的含义。
应当理解的是，当在本文中提及病理学时，可互换使用的术语“相关的”和“有关的”是指具有以下中的至少一者的疾病、病症、疾患或任何病理学：共享因果关系，以高于巧合的频率共存，或者其中至少一种疾病、病症、疾患或病理学导致第二种疾病、病症、疾患或病理学。
如上所述，本公开的主题提供了用于治疗如上所指定的病症的方法。如本文所用的术语“治疗”是指施用治疗量的本公开的主题的组合物，该组合物可有效缓解与疾病有关的不希望的症状，以在此类症状出现之前防止此类症状出现，以减慢疾病的进展，以减缓症状的恶化，以增加缓解期的发作，减缓在疾病的进行性慢性阶段引起的不可逆的损害，以延缓所述进展阶段的发作，以减轻严重性或治愈疾病，以提高生存率或更快恢复，或以防止疾病发生或上述两者或更多者的组合。可以在最初止血疾患发展时进行治疗，或可以连续施用，例如通过每天、每隔天1天至7天、每隔7天至15天、每隔15天至30天、每个月至两个月、或者两个月至六个月施用多于一次或甚至更多，以达到上述治疗效果。
术语“预防”是指预防或降低生物或医学事件发生的风险，具体地说，是指研究者、兽医、医生或其他临床医生寻求在组织、系统、动物或人类中预防的与出血相关的病症发生或再发生的风险，并且术语“预防有效量”是指将实现该目标的药物组合物的量。因此，在特定的实施方案中，本公开的主题的方法在预防方面特别有效，即预防与出血病症相关的疾患。因此，施用所述组合物的受试者不太可能经历与所述出血病症相关的症状，所述出血病症也不太可能在过去已经经历过这些出血病症的受试者中再次发生。
本文所用的术语“改善”涉及通过根据本公开的主题的组合物和方法带来的症状的减轻和受试者疾患的改善，其中所述改善可表现为抑制与本文所述出血病症相关的病理过程、显著降低其大小或改善患病受试者的生理状态的形式。
术语“抑制”和该术语的所有变型旨在包括对病理症状或病理过程进展的进展和恶化的限制或禁止，所述病理过程症状或过程与之相关。
术语“消除”涉及任选地根据下面描述的本公开的主题的方法基本上消除或去除病理症状和可能的病因。
术语“延迟”，“延迟发作”、“延缓”及其所有变型旨在涵盖与蛋白质错误折叠或蛋白质聚集有关的病症的进度和/或恶化的减慢，特别地出血性病症及其症状减慢了它们的进展、进一步恶化或发展，从而比没有根据本公开的主题的治疗更迟出现。
如上所述，治疗或预防包括预防或推迟疾病的发展、预防或推迟症状的发展和/或减少将要或预期会发展的此类症状的严重程度。这些还包括改善现有症状、预防附加症状以及改善或预防症状的潜在代谢原因。应当理解的是，如本文所提及的术语“抑制”、“缓和”、“降低”或“减弱”涉及过程，特别是出血病症延迟、抑制或降低了以下中的任一者：约1％至99.9％，特别地约1％至约5％、约5％至10％、约10％至15％、约15％至20％、约20％至25％、约25％至30％、约30％至35％、约35％至40％、约40％至45％、约45％至50％、约50％至55％、约55％至60％、约60％至65％、约65％至70％、约75％至80％、约80％至85％、约85％至90％、约90％至95％、约95％至99％、或约99％至99.9％。
按照每日、每周或每月安排的单次或多次施用可根据由治疗医师选择的剂量水平和模式进行。更具体的实施方案涉及通常每周使用2-3次剂量。
本文公开的主题涉及有需要的受试者或患者的治疗。“患者”或“有需要的受试者”是指可被上述病原体感染的任何生物体，以及需要本文所述的预防和防治产品、套件和方法的任何生物体，包括人类、家养和非家养哺乳动物，诸如犬科动物和猫科动物、牛、猿猴、马和鼠科动物、啮齿动物、家禽、水产养殖、鱼类和外来观赏鱼。应当理解的是，被治疗的受试者也可以是任何爬行动物或动物园动物。
“哺乳动物受试者”是指需要所提议疗法的任何哺乳动物，包括人、马、犬和猫受试者，最特别是人。应当注意的是，具体地，在非人受试者的情况下，可以通过经由注射(静脉内(IV)、动脉内(IA)、肌内(IM)或皮下注射)。角质(SC))、饮用水、饲料、喷雾剂、口服灌胃并直接进入有需要的受试者的消化道进行施用来执行本公开的主题的方法。
应当理解，本公开的主题的其他方面提供了任何显示出降低的纤溶活性并且已经通过本公开的主题的任何方法制备的体液产品。因此，本公开的主题在其一些实施方案中包括缺少或具有减少量的至少一种纤溶蛋白，特别是tPA和/或纤溶酶原中的至少一者的任何哺乳动物体液产品。在一些实施方案中，通过本公开的主题的方法产生的产品缺乏tPA。在一些其他实施方案中，通过本公开的主题的方法产生的产品缺乏tPA和纤溶酶原。如上所述，通过本公开的主题的方法生产的此类产品可以是经受本文所述的任何工序、缀合物、组合物设备和系统的任何体液，特别是哺乳动物血液、血浆或任何血液产品。
在又一方面中，本公开的主题提供了治疗有效量的至少一种血液和/或血液源性产品，所述产品具有降低的纤溶活性，以用于在治疗、预防、防治、改善、抑制有需要的受试者的出血、止血病症和与其相关的任何出血或病理疾患的方法中使用。应当理解的是，此类体液产品是通过本公开的主题的方法制备的。在又一些其他实施方案中，此类体液产品可以通过如本文所定义的本公开的主题的缀合物、其任何组合物或包含本公开的主题的所述多种缀合物的任何设备、套组、套件或系统中的任一者来制备。
在又一些其他实施方案中，由本公开的主题使用的血液和/或血液源性产品可特别适用于治疗任何止血病症，特别是遗传性或获得性出血病症，如上文公开的由本公开的主题所定义的。
应该理解的是，本公开的主题所描述的任何缀合物、其任何组合物以及本公开的主题所描述的任何设备、套组、套件或系统也可结合本公开的主题的其他方面适用于此方面。更进一步，必须意识到，本公开的主题还包括本文公开的任何血液和/或血液源性产品，以用于本文描述的任何治疗方法或任何其他方法，用于本文之前公开的任何疾患或病症。
除非另有说明，否则本文中使用的所有科学和技术术语具有本领域中通常使用的含义。本文提供的定义是为了促进对本文中经常使用的某些术语的理解，并不意味着限制本公开的范围。
如本文所定义和使用的所有定义，应理解为相对于字典定义、通过引用并入的文档中的定义，和/或所定义的术语的普通含义处于支配地位。
如本文所用，术语“约”表示可偏离所提及的值至多1％、更特别地5％、更特别地10％、更特别地15％，并且在一些情况下，比所提及的值高或低至多20％，偏差范围包括整数值，并且如果适用的话还包括非整数值，从而构成连续的范围。如本文所用，术语“约”是指±10％。
除非明确相反地指出，否则本文中在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一个”和“一种”应理解为表示“至少一个(种)”。必须指出的是，除非上下文另有明确规定，否则如说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一”、“一种/个”和“该”包括复数指示物。
说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解为是指如此结合的要素中的“一个或两个”，即在一些情况下结合存在而在其他情况下分离存在的要素。用“和/或”列出的多个要素应以相同的方式来解释，即，如此结合的要素中的“一个或多个”要素。除了由“和/或”条款具体标识的要素之外，可以可选地存在其他要素，无论这些要素与那些具体标识的要素相关还是无关。因此，作为非限制性示例，当与诸如“包括”的开放式语言结合使用时，在一个实施方案中，对“A和/或B”的引用可以指仅A(可选地包括除B之外的要素)；在另一个实施方案中，指仅B(可选地包括除A之外的要素)；在又一个实施方案中，指A和B两者(可选地包括其他要素)；等等。
如在说明书和权利要求书中所使用的，“或”应该理解为具有与上面定义的“和/或”相同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或”或“和/或”应被解释为包含性的，即包括至少一个但也包括多于一个的数量或列表的要素，以及可选地，附加的未列出的项目。只有明确表示相反的术语，例如“仅一个”或“恰好一个”，或者当在权利要求书中结合“由……组成”使用时将指的是包括多个或一系列要素中的恰好一个要素。一般而言，本文中使用的术语“或”仅应在排他性术语(例如“基本上由……组成”中的“任一者”、“一个”“仅一个”或“恰好一个”)之前时解释为表示排他性替代(即，“一个或另一个，但不能同时包含两个”)，当在权利要求书中使用时应具有在专利法领域中使用的其普通含义。
如本文在说明书和权利要求书中所使用的，在提及一个或多个要素的列表时，短语“至少一个”应理解为是指从该要素列表中的任何一个或多个要素中选择的至少一个要素，但不一定包括要素列表中具体列出的每个要素中的至少一个，并且不排除要素列表中要素的任何组合。该定义还允许可选地存在除了在短语“至少一个”所指的要素列表中具体标识的要素之外的要素，无论其与那些具体标识的要素相关还是无关。因此，作为非限制性示例，“A和B中的至少一个”、或等效地“A或B中的至少一个”、或等效地“A和/或B中的至少一个”在一个实施方案中可以指至少一个，任选地包括多于一个A而不存在B(并且任选地包括除B以外的要素)；在另一个实施方案中，是指至少一个，任选地包括多于一个B而不存在A(并且任选地包括除A以外的要素)；在又一个实施方案中，至少一个，可选地包括多于一个A和至少一个，可选地包括多于一个B(以及可选地包括其他要素)；等等。
还应当理解，除非明确指出相反的情况，否则在本文要求保护的包括多于一个步骤或动作的任何方法中，该方法的步骤或动作的顺序不一定限于叙述该方法的步骤或动作的顺序。
在整个说明书和随后的实施例和权利要求书中，除非上下文另有要求，否则所有过渡短语如“包括”、“包含”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“保持”、“由……构成”等应理解为开放式的，即意味着包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册中所述，仅过渡短语“由……组成”和“基本上由……组成”应分别是封闭的或半封闭的过渡短语。更具体地，术语“包括”、“包含”、“具有”以及它们的同源词意味着“包括但不限于”。术语“由……组成”是指“包括但限于”。术语“基本上由......组成”是指组合物、方法或结构可以包括附加成分、步骤和/或部分，但是仅当该等附加成分、步骤和/或部分不会实质上改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖特征时。
应当注意的，本公开的主题的各种实施方案可以以范围格式呈现。应当理解的是，以范围格式描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对本公开的主题的范围的僵化限制。因此，应该将范围的描述视为已明确公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对从1至6的范围的描述应被认为已经具体公开了子范围如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单独数目，例如1、2、3、4、5和6。无论范围有多广，这都适用。每当在本文中指定数值范围时，都意味着包括在指定范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语“第一指定数目和第二指定数目之间的范围内”和“在从第一指定数目至第二指定数目的范围内”在本文中可互换使用，并且意在包括该第一和第二指定数目以及它们之间的所有分数和整数数字。
如本文所用，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和工序，包括但不限于化学、药理、生物学、生化和医学领域的从业人员已知的方式、手段、技术和工序，或易由化学、药理、生物学、生化和医学领域的从业人员从已知的方式、手段、技术和工序发展的那些方式、手段、技术和工序。
应当理解的是，为了清楚起见在单独实施方案的上下文中描述的本公开的主题的某些特征也可在单个实施方案中呈组合提供。相反地，本公开的主题的各种特征为了简洁起见而在单个实施方案的上下文中描述，但也可以单独地或以任何合适的子组合提供或者以在本公开的主题的任何其他描述的实施方案中适当的方式提供。在各个实施方案的上下文中描述的某些特征不应被认为是那些实施方案的必要特征，除非在没有那些要素的情况下该实施方案无效。
如上所述和如以下权利要求部分中所要求保护的本公开的主题的各个实施方案和方面在以下实施例中得到了实验支持。
如所公开并描述的，要理解的是，本公开的主题不限于本文公开的特定示例、方法步骤和组合物，因为此类方法步骤和组合物可以有所变化。还应当理解的是，本文所使用的术语只是用于描述特定实施方案的目的，而非旨在为限制性的，因为本公开的主题的范围将仅受所附权利要求书及其等同物限制。
以下实施例代表发明人在实行本公开的主题的各方面时所采用的技术。应当理解的是，尽管这些技术是用于实践本公开的主题的优选实施方案的示例，但是根据本公开，本领域技术人员将认识到，在不脱离本文公开的主题的精神和预期范围的情况下可以做出许多修改。
实施例
实验工序
试剂：
琼脂糖凝胶4B200(Sigma Aldrich)
人血浆-健康供体的血浆是从MDA血库(MDA Blood)获得的
和/或人冷冻沉淀物-冷冻沉淀物是从海德深血库(Hadassah Blood Bank)获得的
方法
珠粒回收(方法编号1)
1.将珠粒在室温下用100mM赖氨酸PH＝9.0和1M NaCl以300xg洗涤3次，持续2分钟。
2.将珠粒在室温(RT)下用3M NaCl以300xg洗涤3次持续2分钟。
3.将珠粒在室温下用H2O以300xg洗涤3次持续2分钟。
4.将珠粒在室温下用0.5M NaOH以300xg洗涤3次持续2分钟，在第三次洗涤中将珠粒用NaOH孵育30分钟。
5.将珠粒在室温下用H2O以300xg洗涤3次持续2分钟。
6.将珠粒在室温下用0.5M柠檬酸钠以300xg洗涤3次持续2分钟。
7.将珠粒在室温下用以下物质以300xg洗涤3次持续2分钟：a-10mM柠檬酸钠PH＝6.8；b-120mM NaCl；c-120mM甘氨酸；8.将珠粒在室温下用H2O以300xg洗涤3次持续2分钟。
9.将珠粒用20％乙醇+1M NaCl*洗涤3次。在第三次洗涤后，添加20％乙醇+1MNaCl以获得70％的料浆，通过轻轻倒置而重悬，并储存在4℃下。
使用蠕动泵回收珠粒(方法编号2)
1-将过滤器连接至蠕动泵。
2-将150ml的以下每种溶液流过过滤器15分钟：
a-100mM赖氨酸PH＝9.0和1M NaCl。
b-3M NaCl
c-H2O
d-0.5M NaOH(将过滤器与NaOH一起孵育30分钟)。
e-H2O。
f-0.5M柠檬酸钠。
g-10mM柠檬酸钠PH＝6.8。
120mM NaCl。
120mM甘氨酸。
h-H2O。
i-20％乙醇+1M NaCl。
除NaOH外，所有缓冲剂均用高压灭菌器灭菌
PLG检测
使用以下试剂盒执行实施例7中的PLG检测：ab196262PLG人单步ELISA试剂盒。
表1：平板准备(血浆稀释度1:105)：
试剂准备：
所有试剂均在使用前达到室温。
准备要使用的试剂(对36孔来说)：
1X洗涤缓冲液PT(36mL)：3.6mL的10X洗涤缓冲液PT+32.4mL去离子水。
抗体混合物(1.8mL)：180μL的10X捕获抗体+180μL的10X检测器抗体+1440μL的抗体稀释液CPI。
样品准备：
将血浆以105X连续稀释成样本稀释液NS：
1:100血浆＝10μL血浆+990μl的样本稀释液NS
1:105血浆＝1μL血浆+999μl的样本稀释液NS
标准品准备：
1-标准品储备溶液(120ng/mL)：通过用移液管添加200μL水来重构PLG蛋白标准样本。在室温下保持10分钟并轻轻混合。
2-标记八个1.5mL试管作为标准品1-8。
向试管1中添加225μL的样本稀释液NS。
向试管2-8中添加150μL的样本稀释液NS。
将75μL的标准储备液添加到试管1中。
将150μL的标准品添加到下一试管(试管2至7)中
标准品编号8不含蛋白质并且是空白对照。
测定工序：
将多余的微孔板条从平板框架上取下，将所述多余的微孔板条返回到装有干燥剂包装的箔袋中，重新密封并返回4℃储存。
1-将50μL的所有样本或标准品添加到适当的孔中。
2-将50μL的抗体混合物添加到每个孔中。
3-将平板密封并在设定为400rpm的平板摇床上在室温下孵育1小时。
4-将每个孔用3×350μL的1X洗涤缓冲液PT洗涤(通过从孔中吸出或倾析进行洗涤，然后将350μL的1X洗涤缓冲液PT分配到每个孔中)
5-将100μL的TMB底物添加到每个孔中，并
在设定为400rpm的平板摇床上在黑暗中孵育10分钟。
6-将100μL停止液添加每个孔中。将平板在平板摇床上振荡1分钟以进行混合。
7-读取450nm下的OD吸光度。
血栓弹力描记术(TEG)
TEG仪器TEG 5000机器(60)(Haemonetics，Braintree，MA)(有效期至2019年10月31日)
一次性杯和销[HAE-07-052]
用于TEG的试剂：
1. 1mg/ml的WT-tPA(50mg的Acytilyse)[50mg的Acytilyse，BoehringerIngelheim；1小瓶2,333mg粉末含有50mg的活性阿替普酶(Alteplase，WT-tPA)]。
2. 0.2M氯化钙[Haemonetics，产品目录号7003，批次号：150597BA]
3.新鲜冷冻的人柠檬酸化血浆。
4.FVII Valin(1mg/ml储备液)DPD-V304-037Bulk B。
5.I级对照物[Haemonetics，产品目录号8001，批次号：HMO3199，到期日：2018年10月]
6.II级对照物[Haemonetics，产品目录号8002，批次号：HMO3178，到期日：2018年10月]
7.PBSx10，Biological Industries批次号：1626505
8.TEG止血系统稀释水批次号：0110-1404
根据“通过血栓弹力描记术(TEG)监测凝块裂解”方案执行测定。在使用TEG之前，使用I级和II级对照进行校准，然后在两个通道中测试每个对照(如方案中所述)。将WT-tPA试剂在PBSx1中以1:90稀释：5μl的Wt-tPA(16.66μM)+595μl的PBS*1＝工作浓度0.185μM(样本中的最终浓度为1.85nM)。
外部出血模型(小鼠剪尾)
动物和条件：
物种/品种：小鼠，c57black
性别/数目/年龄：雄性，24只，8周。
来源：以色列的Harlan Laboratories。
体重：研究开始时体重为20-25g。该组的最小和最大重量在组平均体重的±10％的范围内。
驯化周期：7天。
识别：永久标记(直至24小时实验结束)和笼牌。
根据美国国立卫生研究院(National Institute of Health，NIH)和实验动物管理评估和认可委员会(Association for Assessment and Accreditation of LaboratoryAnimal Care，AAALAC)进行动物处理。将动物饲养在聚砜(PSU)笼子中(4-6只小鼠/笼子)中，所述笼子具有不锈钢顶部格栅，所述不锈钢顶部格栅具有用于在透明聚碳酸酯瓶中的颗粒食物和饮用水的设施；垫料：使用经过蒸汽消毒的干净稻谷壳。每周至少两次更换垫料和笼子。
饮食：使动物摄取商用啮齿动物饮食。动物自由饮用从城市供应中获得的高压灭菌饮用水。
污染物：食物和水供应中的预期污染物对该研究的结局均无潜在影响。
环境条件：将动物在标准实验室条件下使用充足的新鲜空气供应笼饲。将动物保持在气候受控的环境中。温度范围介于20-24℃之间，并且相对湿度(RH)介于30-70％之间，使用12小时光照和12小时黑暗周期。
兽医护理：在动物到达时检查动物以使所述动物适合研究。由于这是24小时实验，因此研究开始后无需进行兽医随访。
伦理委员会：这项研究是在获得“以色列动物实验委员会(The Israel Board forAnimal Experiments)”批准后根据“以色列动物福利法(The Israel Animal WelfareAct)”执行的。
职责：
1.设施管理人员监督动物健康和饲养的各个方面，并得到所有动物项目人员的协助。
2.研究负责人确保对所有研究和技术人员进行了充分培训。工作人员在执行所需工序方面经验丰富。
建立测试模型
将动物根据它们的体重用氯胺酮和甲苯噻嗪(分别为100mg/kg和10mg/kg)的混合物麻醉。通过静脉内注射以下物质对动物进行不同的处理：200μL的盐水、200μL的血浆和200μL的纤溶酶原耗尽的血浆。在此之后，将动物以俯卧位放置。将尾巴的远端7mm段用解剖刀切断。将切下的尾巴立即浸入以水浴预热至37℃的装有等渗盐水的50mL Falcon试管中。尾巴的位置是竖直的，尾巴尖端位于身体水平线下方约2cm处。即使出血停止，也监测每只动物60分钟以检测是否有任何再次出血。使用停表确定出血时间。如果出血开始/结束周期发生，则记录60分钟时段内的出血时间总和。如当地动物伦理委员会所要求，将实验在60分钟结束时终止以避免实验期间的致死现象。再次记录包括尾尖在内的体重，并根据体重减轻来估计实验时期期间的失血体积。在试管离心后估计沉淀的血液。在实验结束时，通过麻醉过量处死动物。
选定的啮齿动物物种是常用实验室品种c57black健康年轻成年动物。该小鼠模型是提供有关纤溶酶原耗尽的血浆治疗大量出血的功效的早期信息的初始步骤。
共利用了3组24只小鼠。每组包括8只动物。对照组仅接受盐水，第二组接受未经处理的血浆，第三组接受纤溶酶原耗尽的血浆(PDP)。将动物随机分为几组。来自各组的一只动物接受血浆或对照处理，所述血浆或对照处理是作为200μL单次剂量静脉内施加的。动物总数基于先前的研究，表明这是每组产生有关动物失血量的重要信息的最小动物数。通过静脉内注射施用治疗。
使用ClearPlasma获得纤溶酶原耗尽的冷沉淀物：
1-ClearPlasma组装：
·用树脂填充过滤器。
·锁定填充入口
·将流量调节器设定为关。
·将夹钳附接到延长管(带有流量调节器)。
·关闭夹钳
·将延长管连接到过滤器
·将夹钳连接到收集袋
·关闭夹钳。
·将收集袋与过滤器附接。
1用18ml树脂填充ClearPlasma：TXA缀合的TXA和/或环己烷甲酸(90-100μm超流树脂-缀合物1。
2用60ml水洗涤树脂。
3用60ml生理盐水洗涤树脂。
4将冷沉淀物袋连接至ClearPlasma
5在22分钟内使16ml冷沉淀物流过过滤器。
6将上清液转移到新试管中—冷沉淀物耗尽了纤溶酶原。
2-PLG检测。
·E-80PMG-人纤溶酶原ELISA试剂盒，批次编号10-(ICL,Inc.)
·使用说明来自试剂盒包装插页。(1)
·表2：平板制备：
1 2 3 4
A BLK BLK
B 6.25ng/ml 6.25ng/ml
C 12.5ng/ml 12.5ng/ml
D 25ng/ml 25ng/ml
E 50ng/m 50ng/m
F 100ng/ml 100ng/ml
G 200ng/m 200ng/ml 未处理 未处理
H 未处理 未处理 PDP过滤器 PDP过滤器
样品稀释：
制备样本的1/5,000稀释度的连续稀释液：
1:100冷沉淀物(1:100＝5μL冷沉淀物(1:100+495μl的1X稀释剂)。
1:5000冷沉淀物(1:50＝10μL的稀释冷沉淀物(1:100)+490μl的1X稀释剂)。
在每个阶段进行彻底混合。
测定工序：
1在使用之前将所有试剂平衡至室温。
2将100μL样本(一式两份)移液到预先指定的孔中。
3将微量滴定板在室温下孵育60分钟。在孵育过程中使平板保持被包被且水平。
4孵育后，吸出孔中的内容物。
5用洗涤缓冲液完全填充孔，倒转平板，然后倒出/振荡出废液容器中的内容物。在此之后，将孔在吸水纸上剧烈敲击，以去除残留的缓冲液。重复3次，共洗涤四次。
6移取100μL的适当稀释的酶抗体缀合物至每个孔中。在室温下孵育60分钟。在孵育过程中使平板保持在黑暗中被包被且水平。
7如步骤5/6中所述洗涤并吸干孔。
8将100μL的TMB底物溶液移液到每个孔中。
9在室温下于黑暗中孵育精确的10分钟。
10十分钟后，向每个孔中添加100μL的停止溶液。
11确定每个孔中内容物的吸光度(450nm)。
实施例1
合成树脂
实施例1.1-合成缀合物1
树脂生产和过滤器包装-扩大规模
根据NHS激活的琼脂糖凝胶Fast Flow(GE Healthcare产品目录号17-0906-02)产品说明执行该过程。
该过程开始于从制造商那里接收一批新的纯净未经处理珠粒以及适当的文件记 载。
用于此方案的树脂体积为8×50mL管中的112mL沥干的树脂(8×14mL)(最初为70％树脂浆料；每管14mL沥干的树脂)。该方案产生一批三个完整的ClearPlasma过滤器。制备、偶合和偶合后的洗涤尽可能干净地进行。在清洁的环境中进行内毒素洗涤和包装阶段。
所使用的实验室器具
0.2μm过滤器(例如Steritop)、3x1L瓶(1mM HCl；0.1M Tris-HCl，pH 8.5；0.1M醋酸盐缓冲液，0.5M NaCl，pH 4.5)、2x0.5 L瓶(耦合缓冲液；4M尿素)、4x1 L瓶(70％EtOH、50mM Tris-HCl pH 7.5、50mM Tris-HCl、无热原水中的0.1NaCl，pH 7.5、20％EtOH)、有机废物容器、高压灭菌刮刀、烧杯、量筒、干净的塑料移液管、管辊/旋转器、50mL导管尖端注射器、无菌ClearPlasma过滤器外壳。
所使用的试剂
碳酸氢钠(NaHCO3)、碳酸钠(Na2CO3)、氯化钠、氨甲环酸、37％HCl、NaOH、Tris-HCl、乙酸、乙酸钠、乙醇、尿素、Ddw(双蒸水)、无热原水。
溶液
所有最终缓冲液和溶液均在使用前滤过0.2μm过滤器。
偶联缓冲液-100mL的0.2M的NaHCO3、0.5M NaCl，pH 8.3。称量1.68g量的碳酸氢钠并溶于70mL ddw中。用(1M NaOH或1M HCl)将pH调节至8.3。称量2.92g量的氯化钠并溶于碳酸氢钠溶液中。用DDW将体积调节至100mL。
配体溶液–85mL的25mM(1当量)或50mM(2当量)或125mM(5当量)或250mM(10当量)的氨甲环酸在偶联缓冲液中的溶液，将pH调节至6-9。将所需量的氨甲环酸溶解在85mL的0.2M NaHCO3、0.5M NaCl，pH 8.3中。将pH调节至所需水平。将溶液滤过0.2μ的过滤器
树脂初洗—1.5L的1mM HCl。向50mL试管中添加44mL DDW。添加1mL盐酸(约37％，12M)，制得0.25M HCl。向2L瓶中添加1400mL的DDW。添加6mL的0.25M HCl。将体积调节至1500mL。将溶液滤过0.2μ的过滤器。
树脂封堵–250mL的0.3M Tris-HCl，pH 8.5。将11.82g量的Tris-HCl溶解在200mL的DDW中。用1M NaOH或1M HCl将pH调节至8.5。用ddw将体积调节至250mL。将溶液滤过0.2μ的过滤器。
碱性洗涤-1.5L的0.1M Tris-HCl,pH 8.5。将23.64g量的Tris-HCl溶解在1300mL的DDW中。用1M NaOH或1M HCl将pH调节至8.5。用ddw将体积调节至1500mL。将溶液滤过0.2μ的过滤器。
树脂酸性洗涤–1.5L的0.1M醋酸盐缓冲液，0.5M NaCl，pH 4.5。将12.3g量的醋酸钠溶解在1300mL的DDW中。用1M NaOH或0.1M乙酸(1.15mL冰醋酸在ddw中的溶液，总共200mL)将pH调节至4.5。将43.83g量的氯化钠溶解。将体积调节至1500mL。将溶液滤过0.2μ的过滤器。
内毒素洗涤(EW)1-600mL的70％乙醇。将420mL的高级乙醇与180mL的DDW混合在一起。
EW2-600mL 50mM Tris-HCl pH 7.5。将3.63g量的Tris-HCl溶解在500mL的DDW中。将pH用1M HCl调节至7.5。用DDW将体积调节至600mL。
EW3-300mL 4M尿素在无热原水中的溶液。将72g量的尿素溶解在200mL的用于冲洗的DDW中。以用于冲洗的水将体积调节至300mL。
EW4-600mL的50mM Tris-HCl，0.1NaCl，pH 7.5在无热原水中的溶液。将3.63g量的Tris-HCl溶解在500mL的用于冲洗的DDW中。将pH用1M HCl调节至7.5。将3.51g量的氯化钠溶于缓冲液中。以用于冲洗的水将体积调节至600mL。
无内毒素储备液(EFS)-550mL的20％EtOH在无热原水中的溶液。将110mL的高级乙醇与440mL的用于冲洗的水混合在一起。
1M HCl-pH调节。用DDW将4.17mL的37％盐酸稀释至50mL。
1M NaOH-pH调节。将2g NaOH在50mL DDW中稀释。
为了调节无内毒素溶液的pH，使用了以用于冲洗的水制备的溶液。
制备
-将树脂重新悬浮(NHS激活的琼脂糖珠粒，在100％异丙醇中的70％浆液)，然后将8×14mL转移到8×50mL PP管中。
-将试管以400g的转速离心3分钟。
-吸出保存溶剂。
-将试管用1mM HCl填充至45mL，然后将树脂重悬浮。
-将试管以400g的转速离心3分钟并吸出。
-再重复洗涤四次(总共洗涤五次)。
耦合
-将7mL树脂添加到每个试管中。
-将pH调节至7.5-8(如果需要的话)。
-将试管轻轻并连续旋转2-4小时(室温)/过夜(4℃)。
-将树脂旋转脱水，吸出并在旋转下用25mL(每管)0.1M Tris-HCl，pH 8.5封闭2-4小时。
洗涤
将树脂旋转脱水并吸出。
添加30mL的0.1M Tris-HCl pH 8-9，并重悬、旋转和吸出。
添加30mL的0.1M乙酸盐缓冲液、0.5M NaCl，pH 4-5以重悬、旋转脱水并吸出。
重复这些洗涤(tris至乙酸盐)5次。
当以下过程时：
ο在另一时间继续进行-在30mL 20％EtOH中执行洗涤步骤(添加、旋转、吸出)两次，作为50％浆液储存在20％EtOH中。
ο继续直接进行内毒素洗涤-添加30mL的70％EtOH(EW1)。
内毒素洗涤
如果树脂存储在20％EtOH中，则将其旋转脱水，吸出并添加30mL的70％EtOH(EW1)。
将树脂在70％EtOH中孵育30分钟(滚动)。
洗涤树脂并添加30mL 50mM Tris-HCl pH 7.5(EW2)。
洗涤树脂并添加30mL的50mM Tris-HCl pH 7.5，将树脂温育30分钟(滚动)。
洗涤树脂并添加15mL的4M尿素(EW3)。
洗涤树脂并添加15mL的4M尿素，将树脂温育30分钟(滚动)。
洗涤树脂并添加30mL的50mM Tris-HCl、0.1M NaCl，pH 7.5(EW4)。
洗涤树脂并添加30mL的50mM Tris-HCl、0.1M NaCl，pH 7.5，将树脂温育30分钟(滚动)。
洗涤树脂并添加30mL的20％EtOH(EFS)。
重复洗涤。
将树脂作为20％EtOH(EFS)中的70％浆料储存，直到进行装填。
装填
将来自试管的所有树脂合并到一个容器中。
如果珠粒沉淀，则轻轻旋转容器以制成均匀的悬浮液。
-将无菌的50mL导管尖端注射器装满悬浮液。
-向套管轻轻地填充悬浮液。如果需要加满，则使用与上述相同的方法。
-当接近过滤器的注水口时，将出口卢尔锁盖打开，以允许任何多余的储存溶液体积流出过滤器。在树脂室装满后，关闭出口。
将经装填的产品根据产品规格进行储存。
实施例1.2-合成缀合物2
制备缀合物2的反应在图1中示意性地表示。
更具体地，采用以下工序：
1.使用摇床，通过过滤器玻璃漏斗，用丙酮洗涤4.2ml量的琼脂糖凝胶4B200(Sigma Aldrich)。认为琼脂糖凝胶含有1ml的反应性官能团，因此4.2ml含有4.2mmol。
2.将琥珀酸酐(0.42，4mmol)添加至珠粒在CH2Cl 2(3ml)中的浆液中，随后添加吡啶(0.339ml)。将混合物振荡过夜。
3.珠粒是小片，并用丙酮洗涤。
4.将珠粒悬浮在CH2Cl2中，并添加N-羟琥珀酰亚胺NHS(0.483g)，然后添加EDC(0.8g)。将混合物振荡过夜，然后过滤。
5.将产品悬浮于DMF(3ml)中，添加N,N-二异丙基乙胺(0.54g)和4-(氨基甲基)-环己烷甲酸(0.66g)。将混合物振荡过夜。将产物用丙酮洗涤并递送用于进一步测试。
实施例1.3-合成缀合物3(“TXA-乙二醛琼脂糖树脂”)
工序
1.使用玻璃过滤器用蒸馏水洗涤乙二醛琼脂糖珠粒。
2.制备配体溶液并测试活性和/或280nm处的吸光度。
3.将1ml乙二醛琼脂糖珠粒添加到9ml TXA在pH 10.05的缓冲液中的溶液中
4.轻轻搅拌并经常检查pH。取出等分的悬浮液，并在280nm下测定活性或吸光度。
5.继续轻轻搅拌数小时或直到活性测量值保持恒定，这表明完全固定。避免磁力搅拌。注意：较长的固定时间有利于强烈生物分子/珠粒反应和稳定性，但可能会导致不利的失真。
6.当活性/吸光度恒定时，向该悬浮液中添加10mg固体硼氢化钠，并在室温下于开放容器中搅拌30分钟，以使氢逸出。不要在明火附近执行此步骤。如果可能的话，在排气扇附近运行。
7.使用真空过滤器用25mM磷酸盐缓冲液pH 7.0洗涤悬浮液，以消除过量的硼氢化物。随后，用蒸馏水彻底洗涤悬浮液，并过滤至干。
8.配体偶联的乙二醛琼脂糖珠粒应在4-10℃下在含有20％乙醇水溶液的防腐剂中保存。
实施例1.4-合成缀合物4(“TXA-ECH琼脂糖树脂”)
氨甲环酸(TXA)与ECH-琼脂糖珠粒(G-Biosciences，编号786-1223)的缀合
1.准备配体溶液—50mM TXA的ddw溶液，用HCl将pH调节至5.2。
2.在10mL的ddw中洗涤2mL树脂。通过以500g离心3min进行旋转脱水。
3.在160mL的0.5M NaCl中洗涤树脂。
4.将4mL配体溶液添加到沥干的树脂中。
5.添加EDC(偶联剂)以在最终反应中得到100mM。
6.旋转1小时，用HCl将pH调节至5.0。继续旋转过夜。
7.将树脂旋转脱水和倾析。
8.用具有以下交替溶液的三个周期洗涤树脂：
a.0.1M醋酸盐，0.5M NaCl，pH 4.0
b.0.1M Tris-HCl，0.5M NaCl，pH 8.0
9.在ddw中洗涤两次。
10.洗涤一次，然后储存在2-8℃下的20％EtOH中。
实施例1.5-合成缀合物5
反应物-氰硼氢化钠
琼脂糖珠粒-
在第一阶段中，制备席夫碱，然后将所述席夫碱用氰基硼氢化钠(NaCNBH3)或优选硼氢化钠(NaBH4)还原以得到最终材料。席夫碱中的双键的特征是介于1590-1690cm-1之间的IR吸收。醛中的羰基是其起始材料，其特征为红外吸收介于2700-2900cm-1之间。在最终材料中，还需要氨甲环酸。
更具体地，采用以下工序：
1.使用玻璃过滤器用蒸馏水洗涤乙二醛琼脂糖珠粒。
2.制备配体溶液，并测试280nm处的活性和/或吸光度。
3.将1ml量的乙二醛琼脂糖珠粒添加到9ml配体溶液在pH 10.05的缓冲液中的溶液中。如果配体在室温下不稳定，则在冷室中进行以下步骤。
4.执行温和搅拌，经常检查pH。取出等分的悬浮液，并在280nm下执行活性或吸光度的测定。
5.保持轻轻搅拌数小时或直到活性测量值保持恒定，这表明完全固定。避免磁力搅拌。
注意：较长的固定时间有利于强烈生物分子/珠粒反应和稳定性，但可能会导致不利的失真。
6.当活性/吸光度恒定时，向该悬浮液中添加10mg固体硼氢化钠，并在室温下于开放容器中搅拌30分钟，以使氢逸出。该步骤不是在明火附近执行，而是在可能的情况下在抽气扇附近执行。
7.使用真空过滤器用25mM磷酸盐缓冲液pH 7.0洗涤悬浮液，以消除过量的硼氢化物。随后，用蒸馏水彻底洗涤悬浮液，并过滤至干。
8.将配体偶联的乙二醛琼脂糖珠粒在4-10℃下在含有20％乙醇水溶液的防腐剂中保存。
实施例1.6-合成缀合物6(TXA-琼脂糖凝胶树脂)
1.使用摇床，通过过滤器玻璃漏斗，用丙酮洗涤4.2ml量的琼脂糖凝胶珠粒。I
2.将琥珀酸酐(0.42，4mmol)添加至珠粒在CH2Cl2(3ml)中的浆液中，随后添加吡啶(0.339ml)。将混合物振荡过夜。
3.珠粒是小片，并用丙酮洗涤。
4.将珠粒悬浮在CH2Cl2中，并添加N-羟琥珀酰亚胺NHS(0.483g)，然后添加EDC(0.8g)。将混合物振荡过夜，然后过滤。
5.将产品悬浮于DMF(3ml)中，添加N,N-二异丙基乙胺(0.54g)和4-(氨基甲基)-环己烷甲酸(0.66g)。将混合物振荡过夜。
将最终的珠粒用丙酮洗涤两次，再在70％乙醇中洗涤，离心并在20％乙醇中悬浮。
实施例2
评价新合成的TXA缀合ECH-琼脂糖珠粒、Sterogene Superflow珠粒和乙二醛琼脂糖珠粒-缀合物1的活性
材料：
·血浆-健康供体的血浆是从MDA血库(MDA Blood Bank)获得的。所使用的血浆是Rh阴性的，并且对不同的病毒抗原(例如，HBV、HCV、HTLV、HIV)也是阴性的。
·珠粒：
1.根据实施例1(制备缀合物1)中所述的工序合成的TXA缀合的乙二醛琼脂糖珠粒
2.TXA共缀合的ECH-琼脂糖珠粒(新珠粒)，Daren laboratories。
3.Sterogene Superflow琼脂糖凝胶珠粒)。
·仪器：
摇床：KRS-3016(MRC)
ELISA读出器：800TS(BioTek)。
实验是在非无菌环境中进行的。
·溶液准备：
结合缓冲液(30ml)：
柠檬酸钠(10mM)-0.3ml
NaCl(120mM；制备日期：2017年09月25日)-1.2ml
DDW＝28.5ml
纤溶酶原耗尽
1.将珠粒存储在20％乙醇和70％树脂中。将1ml量的珠粒转移到15ml试管中。
2.将试管装满水，并且
3.将试管在室温下以300x g离心2分钟。
4.去除上清液。
5.将这些步骤重复3次
6.将珠粒用以下结合缓冲液悬浮*：
a-10mM的柠檬酸钠PH＝7.16
b-120mM氯化钠
7.如第3节所述执行离心步骤。
8.去除上清液。
9.将这些步骤重复2次
10.将1ml量的74E血浆添加到珠粒中。
11.通过轻轻颠倒将混合物充分混合，并在室温下孵育2小时(如果在平板振荡器中以80rpm振荡的话)。
12.如第3节所述执行离心步骤，并将上清液转移到含有纤溶酶原耗尽的血浆的新试管中。
13.使用ELISA测定测试血浆耗尽。
14.将其余血浆(包含未耗尽的和已耗尽的)在-20℃下孵育。
PLG检测
根据制造商的说明，使用试剂盒Ab108893人纤溶酶原ELISA试剂盒
如下表3中所示制备平板(1:20,000的血浆稀释度)：
表3：制备平板
试剂制备
所有试剂均在使用前平衡至室温(18-25℃)。新鲜试剂紧接在使用前制备。
1- 1X稀释剂M：1.5ml的10X稀释剂M浓缩物用15ml试剂级水按1:10稀释。轻轻地且彻底地进行混合。
2- 1X洗涤缓冲液：2ml的20X洗涤缓冲液浓缩物用38ml的试剂级水按1:20稀释。轻轻地且彻底地进行混合。
3- 1X生物素化纤溶酶原检测器抗体：首先将50X生物素化纤溶酶原抗体小瓶旋转，以收集底部的内容物。向588μl的1X稀释剂M中添加12μl的50X生物素化纤溶酶原抗体储备液。轻轻地且彻底地进行混合。
4- 1X SP缀合物：短暂旋转100X链霉亲和素-过氧化物酶缀合物(SP缀合物)，并将6μl缀合物用594μl的1X稀释剂M按1:100稀释。
标准品制备：
1-将标准品平衡至室温。
2-将七个试管标记为编号2-8
3-向试管编号2-8中添加120μL的1X稀释剂M。
4-制备标准品编号2，将120μL的标准品编号1添加到试管编号2中并轻轻混合。
5-制备标准品编号3，将120μL的标准品编号2添加到试管编号3中并轻轻混合。
6-使用下表作为指导，制备后续的连续稀释液。
7-将1X稀释剂M用作零标准品0ng/mL(试管编号8)。
样本制备
将样本用1X稀释剂M以1:20,000连续稀释：
a-1:100血浆＝5μL的血浆+495μl的1X稀释剂M。
b-1:20,000血浆＝5μL的经稀释血浆+995μl的1X稀释剂M。
采用以下工序：
1-按指导制备所有试剂、工作标准品和样本。在室温(18-25℃)下执行测定。
2-将多余的微孔板条从平板框架上取下，并立即放回内有干燥剂的箔袋中。将小袋安全地重新密封，以最小化对水蒸气的暴露，并存放在真空干燥器中。
3-每孔添加50μL量的纤溶酶原标准品或样本。用密封胶带覆盖孔并孵育一小时。在最后一次添加样本后启动计时器。
4-手动使用200μL的1X洗涤缓冲液执行洗涤步骤五次。每次将平板倒置并将内容物倾析(在吸水纸上轻拍i4次以完全除去液体)
5-向每个孔中添加50μL量的1X生物素化纤溶酶原抗体，并孵育一小时。
6-如上所述洗涤微孔板。
7-向每个孔中添加50μL量的1X SP缀合物，并孵育30分钟。打开酶标仪并预先设定程序。
8-如上所述洗涤微孔板。
9-每孔添加50μL的铬底物，并孵育约12分钟或直至形成最佳蓝色密度(轻轻敲打平板以确保充分混合并用移液器吸头打破孔中的气泡)
10-将50μL量的停止液添加每个孔中。颜色从蓝色变成了黄色。
11-立即在酶标仪上读取450nm的波长下的吸光度。
观察到了以下结果：
·PLG浓度：
标准曲线结果*汇总在表4中并在图3中示出：
表4：在450nm下处标准品的OD
获得了表5所示的公式。相应地，计算了样本的浓度和耗尽百分比，并在表6中列出。
表5：从标准曲线获得的公式
曲线名称 曲线公式 A B C D R2
标准曲线 Y＝(A-D)/(1+(X/C)^B)+D 0.0158 1.17 19.6 3 1
表6.样本中的PLG浓度
似乎未耗尽血浆中PLG的浓度略高于人血浆中纤溶酶原浓度的正常范围(153.1-174.9μg/ml，根据试剂盒说明手册)。在与TXA Superflow回收珠粒一起孵育后，纤溶酶原水平耗尽了大于92％；在与YA2-2珠粒一起孵育后，纤溶酶原水平耗尽了大于90％；并且在与TXA缀合的ECH琼脂糖珠粒一起孵育后，纤溶酶原水平耗尽了38％。尽管一旦回收，TXASuperflow珠粒和Y2-2珠粒(TXA缀合乙二醛琼脂糖珠粒)就表现为高效地从血浆中去纤溶酶原，但是TXA缀合ECH琼脂糖珠粒显示出低效率。
实施例3
评估新型缀合GE珠粒Sterogene Superflow珠粒的活性
材料：
·血浆：健康供体的血浆是从MDA血库(参见附录1)获得的。
·珠粒：
1-缀合物1(“TXA缀合的GE珠粒”)-pH 6.5、7.5、8.5。有关合成方案，请参见实施例1。
2-“Sterogene回收的TXA Superflow珠粒”[缀合物-6]]
·方法编号1：珠粒已经用于猪实验并被回收。仪器：
1-摇床：KRS-3016(MRC)
2-ELISA读出器：800TS(BioTek)。
·实验是在非无菌环境中进行的。
纤溶酶原耗尽。
1.a.Sterogene TXA超流珠粒已经在20％乙醇和70％树脂中。将1ml量的珠粒转移到15ml试管中。
b.在20％的乙醇和70％的树脂中已经有1ml的每次反应的TXA缀合GE珠粒。
2.将试管装满水。
3.在室温下以300x g离心2分钟。
4.去除悬浮液。
5.重复3次
6.将珠粒用以下结合缓冲液悬浮*：
a-10mM柠檬酸钠PH＝7.16
b-120mM氯化钠。
7.如第3节所述进行离心。
8.去除悬浮液。
9.重复2次
10.将1ml的27K血浆添加到珠粒中。
11.通过轻轻颠倒将试管充分混合，并在室温下孵育2小时(以在平板振荡器中振荡-80rpm)。
12.如第3节所述进行离心，并将上清液转移到含有纤溶酶原耗尽的血浆的新试管中。
13.使用ELISA测定测试血浆耗尽。
14.将其余血浆(未耗尽的和已耗尽的)在-20℃下孵育。
PLG检测
根据制造商的说明，使用试剂盒Ab108893人纤溶酶原ELISA试剂盒
如下所示制备平板(1:20,000的血浆稀释度)：
表7：平板制备
试剂制备：
所有试剂均在使用前平衡至室温(18-25℃)。新鲜试剂紧接在使用前制备。
1X稀释剂M：将2ml的10X稀释剂M浓缩物用18ml试剂级水按1:10稀释。轻轻地且彻底地进行混合。
1X洗涤缓冲液：4ml的20X洗涤缓冲液浓缩物用76ml的试剂级水按1:20稀释。轻轻地且彻底地进行混合。
1X生物素化纤溶酶原检测器抗体：将50X生物素化纤溶酶原抗体小瓶旋转，以收集底部的内容物。向882μl的1X稀释剂M.中添加18μl的50X生物素化纤溶酶原抗体储备液。轻轻地且彻底地进行混合。
1X SP缀合物：短暂旋转100X链霉亲和素-过氧化物酶缀合物(SP缀合物)，并将9μl缀合物用891μl的1X稀释剂M按1:100稀释。
如实施例2中详述制备标准品。标准曲线结果汇总在表4中并在图2中示出。获得了表5中示出的公式。
样本制备：
将样本用1X稀释剂M以1:20,000连续稀释：
a-1:100血浆＝5μL的血浆+495μl的1X稀释剂M。
b-1:20,000血浆＝5μL的经稀释血浆+995μl的1X稀释剂M。
测定工序：
12-按指导制备所有试剂、工作标准品和样本。使用前将试剂平衡至室温。在室温(18-25℃)下执行测定。
13-将多余的微孔板条从平板框架上取下，并立即放回内有干燥剂的箔袋中。将小袋安全地重新密封，以最小化对水蒸气的暴露，并存放在真空干燥器中。
14-每孔添加50μL的纤溶酶原标准品或样本。用密封胶带覆盖孔并孵育一小时。在最后一次添加样本后启动计时器。
15-手动使用200μL的1X洗涤缓冲液执行洗涤五次。每次将平板倒置并将内容物倾析(在吸水纸上轻拍4次以完全除去液体)。
16-向每个孔中添加50μL的1X生物素化纤溶酶原抗体，并孵育一小时。
17-如上所述清洗微孔板。
18-向每个孔中添加50μL的1X SP缀合物，并孵育30分钟。打开酶标仪并预先设定程序。
19-如上所述清洗微孔板。
20-每孔添加50μL的铬底物，并孵育约12分钟或直至形成最佳蓝色密度(轻轻敲打平板以确保充分混合并用移液器吸头打破孔中的气泡)。
21-将50μL停止液添加每个孔中。颜色从蓝色变成了黄色。
22-立即在酶标仪上读取450nm的波长下的吸光度。
·PLG浓度：
根据表5中详述的公式计算样本的浓度和耗尽百分比，并在表8中呈现。
表8：样本中的PLG浓度
似乎未耗尽血浆中PLG的浓度略高于人血浆中纤溶酶原浓度的正常范围。与使用方法编号1回收的TXASuperflow磁性珠粒一起进行血浆孵育后，约24％的纤溶酶原被耗尽，并且与使用方法编号2回收的珠粒一起孵育后超过93％的纤溶酶原被耗尽。因此，应再次回收具有24％耗尽的珠粒，并将具有93％耗尽的珠粒再次用于猪实验中。虽然在PH＝6.5或PH＝7.5下合成的TXA缀合的GE珠粒显示出超过60％的PLG耗尽，但是PH＝8.5下合成的那些显示出54％的耗尽。该实验表明，该反应在PH＝6.5下反应更有效。未来的实验将过夜进行或在反应中使用不同的配体浓度进行。
实施例4
使用ClearPlasma进行血浆过滤
·TXA超流，缀合物1
过滤器制备：
1-将25ml树脂装填到过滤器中。
2-使100ml的70％乙醇流过过滤器并孵育30分钟。
3-用70％乙醇洗涤两次。
4-用20％乙醇洗涤三次
5-储存于4℃下。
树脂活化：
将树脂用DDW洗涤3次，用结合缓冲液(10mM柠檬酸钠+120mM氯化钠)洗涤2次。
血浆过滤：
将人血浆袋连接至过滤器，并使整个体积(200ml)流过过滤器流入接收袋中持续1小时。
结果在下表9中呈现。
表9.样品中的耗尽百分比
如表9中所示，血浆过滤导致了对纤溶酶原的有效耗尽。
·ClearPlasmaTM设备TXA缀合物珠粒和/或环己烷甲酸琼脂糖珠粒＝缀合物1。
材料：
-血浆:健康供体的血浆是从Magen David Adom(MDA)血库获得的。
-ClearPlasmaTM设备：药筒装有缀合的环己烷甲酸＝使用3ml Pasteur吸管将缀合物2酸性琼脂糖珠粒偶联；用150ml盐水洗涤树脂，并在2-8℃下储存。
-仪器:ELISA读出器：800TS(BioTek)。
使用卢尔锁将250ml量的血浆连接到设备，并以2滴/秒的速度流过设备持续约30分钟。将经耗尽的血浆收集在无菌盖中。对未经处理的血浆和耗尽的血浆中的样本进行分析，并将剩余样本在-20℃下冷冻。使用E-80PMG-人纤溶酶原ELISA试剂盒，批号9(ICL,Inc.)确定纤溶酶原的浓度。
表10:样本中的耗尽百分比
似乎在用上述ClearPlasmaTM设备过滤后，从血浆中去除了超过96％的PLG。
实施例5
使用ClearPlasma评估Clear Plasma从冷沉淀物耗尽纤溶酶原水平的功效
低温沉淀物是一种重要的血浆衍生物，用于治疗一般的出血，尤其是大量的出血。因此，评估了ClearPlasma设备从冷沉淀物中耗尽纤溶酶原的能力。
材料：
a.ClearPlasma：塑料过滤器(Pentracor Inc.)、TXA缀合物Superflow树脂(Sterogene；批次：1608:88)、带流量调节器的延长线(Qosina；批号：159299)、采血袋(Fresenius；批号：FA17H30126)。
b.设施：
i.摇床：产品目录号KRS-3016；S/N：SH30000003；制造商：MRC。
ii.ELISA读出器：产品目录号800TS；S/N：1709201B；制造商：BioTek
iii.离心机：产品目录号Z383K；S/N：31030005；制造商：HERMLE.a。
c.冷沉淀物：冷沉淀物是从海德深血库获得的(冷沉淀物详细信息在附录.1中)。(Y 2002 18 170007O Rh阳性)
根据实验共促中的描述进行实验。数据显示，冷沉淀物单位(29ml)单次通过ClearPlasma可使冷沉淀物中的纤溶酶原浓度从155.87μg/ml降低到2.7μg/ml，即约98％(参见图3)，而没有任何凝血因子的影响。因此，ClearPlasma设备适用于从冷沉淀物中耗尽纤溶酶原。从冷沉淀物中耗尽纤溶酶原可提供新产品，所述新产品具有增强的治疗出血疾患的能力。
实施例6
体内活性纤溶酶原浓度的评估。
简而言之，新鲜血液取自健康志愿者。将50μl tPA(6μM)或生理盐水(NS)添加到1.8ml新鲜血液中，并使用Hemochron 401装置确定凝结时间。在平行实验中，将50μl的tPA(6μM)或NS添加到1.8ml的无纤溶酶原血浆中。
为了评估本公开的主题的缀合物的效应，评估了两个参数。凝结时间和总凝块裂解时间。
凝结时间
凝结时间与活性纤溶酶原的浓度成反比。
在对照血液中，凝结时间为113±27秒(n＝7)，其中在用tPA处理的血液中凝结时间为255±41秒(n＝8)。在纤溶酶原耗尽的血液中，不存在tPA时的凝结时间为110±16(n＝6)，其中在存在tPA的情况下凝结时间为118±18(n＝7)。
全血块裂解时间。
血凝块的存在是通过简单观察并通过将具有血凝块的试管重新插入机器中来确定的。
在14±5.2分钟后，用tPA处理的对照血中凝块消失(n＝6)。相比之下，在用NS处理的对照血液中，在完全形成凝块后2小时血凝块是完整的。
在有或没有tPA的纤溶酶原耗尽的血液中，在完全形成凝块后2小时凝块是完整的。这些结果清楚地证明了本公开的主题的缀合物的有效性。
实施例7
评定猪肝裂伤模型中血浆置换的功效
这项研究旨在研究ClearPlasmaTM的使用以及与正常血浆相比具有减少的纤溶酶原的血浆的益处。这项研究是在Biotechfarm Ltd.(Israel)执行的。
目的
目的是评定在猪肝裂伤模型中施用PDP对失血量的功效。
研究终点
在4cm肝裂伤之后30分钟测量失血量，并根据以下呈现的分级方案进行评估。
表11：猪肝裂伤模型的出血分级方案
类别 最少出血 中度出血 大量出血
失血量 0-100ml 100-300ml X>300ml
研究持续时间
每头猪八至九小时
研究设计
将十四头母猪分为4组(对照、常规血浆、ClearPlasmaTM和TXA)
将所述组如下处理：
对照组1：
1.诱导全身麻醉。
2.收集血浆达90分钟的持续时间。
3.在血浆收集终止后30分钟诱导肝裂伤。
4.在诱导肝裂伤后30分钟闭合腹壁和皮肤。
对照组2：
1.诱导全身麻醉。
2.在血浆收集终止后30分钟诱导肝裂伤。
3.在诱导肝裂伤后30分钟闭合腹壁和皮肤。
对照组3：
1.诱导全身麻醉。
2.用TXA进行治疗。
3.在血浆收集终止后30分钟诱导肝裂伤。
4.在诱导肝裂伤后30分钟闭合腹壁和皮肤。
测试组：
1.诱导全身麻醉。
2.血浆收集-用ClearPlasmaTM(测试设备组)过滤达90分钟的持续时间。
3.在血浆收集终止后30分钟诱导肝裂伤。
4.在诱导肝裂伤后30分钟闭合腹壁和皮肤
表12：动物分配(猪肝裂伤研究)
常规血浆＝新鲜冷冻血浆(FFP)；PDP(纤溶酶原耗尽的血浆)＝通过ClearPlasmaTM去除了纤溶酶原的FFP；TXA＝氨甲环酸
研究工序
1.在麻醉诱导前施用丁丙诺啡。
2.麻醉-用克他命(Ketamine)、噻拉嗪(Xylazine)和阿托品(Atropine)对动物进行镇静，然后用气管导管插管；用氧气中的异氟烷维持麻醉。
3.将导管放置在可触及的耳静脉中以用于血管通路。
4.将中央静脉套管(CVC)引入每个颈静脉中以用于血浆收集应用。
5.收集血浆持续90分钟的时段。之后，在使用或不使用ClearPlasmaTM的情况下执行血浆输注。
6.在血浆收集后30分钟，如下诱导肝裂伤模型：
-将猪以仰卧位放置。
-执行腹侧区域的修剪和擦洗。
-制造中线切口。
-将右肝叶暴露并从腹内取出以允许足够的工作域，然后用生理盐水冲洗。
-制造撕裂伤的网格图案，所述网格图案为4cm(长度)，相距1cm并且深0.5cm(将肝片称重)。
7.通过确定模型诱导后干海绵和染血海绵重量的差异来测量失血量。将重量差表示为失血量(克)。
8.在适用时，测量止血时间(TTH)。
9.撕裂伤诱导后30分钟，将腹壁和皮肤闭合。
监测生理参数
在血浆收集应用之前(基线)、紧接在采集应用之后，恰好在诱发肝裂伤之前、出血期间和紧接在皮肤闭合之后：
-食道温度、
-平均动脉压、
-心率、
-氧饱和度、
-激活的凝结时间、
-用于CBC的血液样本
-血液学、生物化学和凝血参数，包括凝血酶原时间(PT)和部分促凝血酶原激酶时间(PTT)。
在血浆收集应用之前(基线)、诱导肝裂伤后30分钟(恰好在闭合之前)和研究结束时(封闭后5小时)：
-详细的临床体征：在从麻醉恢复之后。
在血浆置换应用之前：
-体重。
支持性照护
在恢复期间将动物放在温暖皮肤的毯子上。
安乐死
在封闭后5小时将动物安乐死。注：出于人道理由，对在诱导肝撕裂伤后持续出血60分钟(即，就在闭合之前)的两只动物实施安乐死。
临床观察方法
行为属性包括但不限于以下各项：
1.清除血液、尿液和粪便，尿液变色(如果适用的话)，腹泻，没有粪便(便秘)。
2.疾病或受伤、嗜睡、呕吐、唾液分泌过多、姿势异常、疼痛、跛行、不适、不愿意或不能移动的迹象。
3.神经病学严重度评分(NSS)
4.只要有必要，就根据临床观察结果进行其他评定。
设施
Haemonetics注射器、针和玻璃器皿手术设备、血压监测器、氧气监测仪。所有用于冲洗或漂洗设备或肠胃外注射组件的稀释剂和溶液均应以确保它们是无菌的、无热原的、并免受污染的方式进行处理。
结果
在所有实验中，使猪经历使用Haemonetics系统的血浆收集。将全血收集，离心，将红血细胞立即返回到猪体内，收集到至多700ml血浆并使用ClearPlasmaTM过滤(针对测试组)或不过滤(针对对照组)，如图4所描述。使猪处于麻醉下，收集来自静脉的血液并将所述血液引入血浆置换系统。然后将红细胞返回动物体内，并且在测试组动物中，将血浆通过ClearPlasmaTM过滤并返回动物体内。表13详细列出了从每头猪获得的详细结果。
表13：猪肝裂伤实验的详细参数。
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缩写：trea.(处理)、amou.(量)、bleed.(出血)、Bl(血液)、Hi(高)、liv.(肝脏)、gr.(克)、exp.(实验)、We.(体重)、anticoag.(抗凝剂)、sol.(溶液)、form(公式)、coll.(收集)、dura.(持续时间)、si.(大小)。
常规血浆＝新鲜冷冻血浆(FFP)；PDP(纤溶酶原耗尽的血浆)＝通过ClearPlasmaTM去除了纤溶酶原的FFP；TXA＝氨甲环酸
实验1：将来自猪144的血浆使用ClearPlasmaTM过滤，并返回到猪144体内。在模拟过滤后，将来自猪143的血浆输注到猪143体内。然后执行4厘米的肝脏切开，并记录血液量和出血时间。该实验表明，纤溶酶原水平的耗尽减少了出血量。即使对照猪的肝脏切开大小较小，但出血量仍高于接受PDP的猪。此外，临床评估得到改善，并且与接受PDP的猪相比，对照猪的脉搏更高且不稳定。
实验2：与常规血浆和TXA相比，PDP的效应。测试了三只猪，如下：将猪145用常规血浆进行处理，将猪146用纤溶酶原耗尽的血浆进行处理，并将猪147用氨甲环酸(TXA)进行处理。结果表明与常规血浆相比，PDP减少了出血量。此外，TXA与常规血浆相比之间的出血量差异很小。
实验3：与常规血浆和TXA相比，PDP的效应。结果表明与常规血浆相比，PDP减少了出血量。
实验4：与常规血浆和TXA相比，PDP的效应。结果表明与常规血浆相比，PDP减少了出血量。
实验5：在施用了PDP的猪中肝脏切割后的出血减少。如材料和方法部分所述，将猪麻醉并收集血浆。将猪用常规血浆、PDP和16mg/kg的TXA处理，或使猪未经处理。然后如材料和方法部分中所述，使用手术刀制造4cm的肝切口。结果表明与常规血浆相比，PDP减少了出血量。
图5表明了肝裂伤后30分钟期间显现的失血量。如在图5中可以看出的，与接受常规血浆的猪相比，ClearPlasma的使用使出血量减少了高于约50％。
为了验证诸如纤溶酶原和tPA之类的纤溶蛋白活性的降低，执行血栓弹力描记术(TEG)(参见图6A至图6L)。(TEG)是一种测试血液凝固效率的方法。猪编号为：编号169-对照，编号172-血浆置换和纤溶酶原耗尽；编号173-仅血浆置换。如图6J中可以看出的，仅在猪编号172中，在tPA施用后没有纤溶反应。该结果表明纤溶蛋白如纤溶酶原和tPA的显著降低。
总之，在所有实验中，与接受常规血浆输注的猪相比，使用ClearPlasmaTM显著改善了临床结局并减少了猪的失血量。
实施例8
施用纤溶酶原耗尽的血浆对猪肝裂伤模型中用克赛处理的动物的失血量的安全性评定
这项研究是在Biotechfarm Ltd.(Israel)执行的。
目标
施用纤溶酶原耗尽的血浆对猪肝裂伤模型中的失血量的安全性评定为了检查用抗凝剂治疗的动物中纤溶酶原耗尽的影响。为了确保在使用血液稀释剂治疗(克赛)的患者中没有发展出血栓栓塞并发症的风险。
研究终点
在4CM肝裂伤后30分钟测量失血量。
研究设计
这项研究在用克赛处理的动物中比较了具有降低的纤溶蛋白的血浆和正常血浆，以证实用PDP处理不会导致发展成深静脉血栓形成(DVT)。
物种和性别：♀家猪，在研究开始时为40-50kg
组数：4(3个对照组和1个测试设备组)
组大小：对照组的n＝5(♀)；测试设备组的n＝5(♀)
动物总数：20
各组的组成和投配：
对照组1：1.对照未经处理：诱导全身麻醉；2.收集血浆持续90分钟；3.终止血浆收集后30分钟诱导肝裂伤；4.诱导肝裂伤后30分钟闭合腹壁和皮肤。
对照组2：1.4000单位的克赛：手术前10小时向猪注射4000单位的克赛；2.诱导全身麻醉；3.终止血浆收集后30分钟诱导肝裂伤；4.诱导肝裂伤后30分钟闭合腹壁和皮肤。
对照组3：1.新鲜血浆和4000单位的克赛：手术前10小时向猪注射4000单位的克赛；2.诱导全身麻醉；3.用TXA处理；4.终止血浆收集后30分钟诱导肝裂伤；5.诱导肝裂伤后30分钟闭合腹壁和皮肤。
测试组：1.纤溶酶原耗尽的血浆和4000单位的克赛：手术前10小时向猪注射4000单位的克赛；2.诱导全身麻醉；3.血浆收集–用ClearPlasmaTM过滤(测试设备组)持续90分钟；4.终止血浆收集后30分钟诱导肝裂伤；5.诱导肝裂伤后30分钟闭合腹壁和皮肤
研究工序
在用PDP或常规血浆治疗之前10小时，将预装注射器中用于注射的注射器4,000IU(40mg)/0.4ml溶液静脉(IV)注入猪体内。
镇痛：丁丙诺啡；麻醉：用克他命、噻拉嗪和阿托品对动物进行镇静，然后用气管导管插管；并且用氧气中的异氟烷维持麻醉。
在可触及的耳静脉中放置用于血管通路的导管。将中央静脉套管(CVC)引入每个颈静脉中以用于血浆收集应用。
收集血浆持续90分钟的时段。在用或不用ClearPlasmaTM处理后，输注血浆。
在血浆收集应用后30分钟，如下诱导肝脏撕裂伤:
-将猪以仰卧位放置,
-进行腹侧区域的修剪和擦洗,
-制造中线切口,
-将右肝叶暴露并从腹内取出以允许足够的工作域，并用生理盐水冲洗,
-制造撕裂伤的网格图案，所述网格图案为4cm(长度)，相距1cm并且深0.5cm，将肝片称重,
通过确定模型诱导后干海绵和染血海绵重量的差异来测量失血量。将重量差表示为失血量(克)。
在适用时，测量止血时间(TTH)。
在撕裂伤诱导后30分钟，将腹部闭合，然后将皮肤闭合。
监测生理参数:
在血浆收集应用之前：
基线、紧接在采集应用之后、恰好在诱导肝裂伤之前、在出血期间和紧接在皮肤闭合之后。
食道温度、平均动脉压、心率、血氧饱和度、CBC的激活凝结时间血样。
血液学、生物化学和凝血参数，包括凝血酶原时间和部分促凝血酶原激酶时间：血浆收集应用之前＝基线，肝脏诱导后30分钟
撕裂(仅在闭合前)和研究结束时，闭合后5小时。
详细的临床体征：在从麻醉恢复之后。
体重:血浆置换应用之前进行一次。
支持照护：在麻醉诱导前施用丁丙诺啡。在恢复期间将动物放在温暖皮肤的毯子上。
终端研究：在封闭后5小时将动物安乐死。注：出于人道理由，对在诱导肝撕裂伤后持续出血60分钟(即，就在闭合之前)的任何动物实施安乐死
研究时段：每头猪8-9个小时
临床观察方法：行为属性包括但不限于以下各项：1.消除血液、尿液和粪便、尿液变色(如果适用的话)、腹泻、没有粪便(便秘)。2.疾病或受伤、嗜睡、呕吐、唾液分泌过多、姿势异常、疼痛、跛行、不适、不愿意或不能移动的迹象。3.神经病学严重程度评分(NSS)。4.只要有必要，就根据临床观察结果进行其他评定。
装置：Haemonetics注射器、针和玻璃器皿手术设备、血压监测器、氧气监测仪。所有用于冲洗或漂洗设备或肠胃外注射组件的稀释剂和溶液均应以确保它们是无菌的和无热原的方式进行处理。确保所有测试溶液均免受污染。
在所有实验中，使猪经历使用Haemonetics系统的血浆收集。如图5所示，收集全血，离心，立即将红细胞返回猪体内，收集至多700ml血浆，并使用ClearPlasmaTM过滤或不过滤。使猪处于麻醉下，收集来自静脉的血液并将所述血液引入血浆置换系统。此后，将红细胞返回动物体内，并将血浆经ClearPlasmaTM过滤并最终返回动物体内。
结果：
表14：猪编号38和编号171的安全性评定结果
缩写：trea.(处理)、amou.(量)、bleed.(出血)、Bl.(血液)、Hi(高)、Nor.(正常)、eve.(事件)、liv.(肝脏)、gr.(克)、We.(体重)、anticoag.(抗凝血剂)、sol.(溶液)、form(公式)、coll.(收集)、si.(大小)、T(时间)、clin.(临床)。
表15：猪编号202、204、203和208的安全性评定结果
缩写：trea.(处理)、anticoag.(抗凝血剂)、num.(数量)、form.(公式)、coll.(收集的)、T.(时间)、bleed.(出血)、Bl.(血液)、Hi(高)、Nor.(正常)、clin.(临床)、press.(压力)、gr.(克)、sol.(溶液)、si.(大小)、plas.(血浆)、liv.(肝脏)、eve.(事件)、dia.(死亡)、alm.(几乎)。
表16：猪编号223、222、224和220的安全性评定结果
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缩写：trea.(处理)、anticoag.(抗凝血剂)、num.(数量)、form.(公式)、coll.(收集的)、T.(时间)、bleed.(出血)、Bl.(血液)、Hi(高)、Nor.(正常)、clin.(临床)、eve.(事件)、press.(压力)、gr.(克)、plasm(血浆)、plas(纤溶酶原)、dep.(耗尽的)、clex.(克赛)、un-treat(未经处理的)、sol.(溶液)、si.(大小)、plas.(血浆)、liv.(肝脏)、eve.(事件)、dea.(死亡)、alm.(几乎)。
如预期的那样，用克赛处理动物会使外流血液的量从187cc显著增加到274cc。数据还显示，给予动物一个单位的新鲜血浆(FP)将使出血量从274cc增加到596cc。此外，从纤溶酶原中耗尽FP可将出血量从596cc减少到128.7cc。
验尸数据显示，用PDP处理的动物不会发展出血栓形成或血栓栓塞事件。在用PDP处理的动物的肺、心脏或脾脏中未发现凝块。在用PDP处理的动物中不存在D-二聚体，进一步支持了有关不存在血栓栓塞事件的结论。
数据表明，即使在用克赛处理的动物中，纤维蛋白溶酶原耗尽的血浆也是一种有效的抗出血治疗方法。数据还表明，纤溶酶原PDP甚至在用克赛处理的动物中也有效。因此，PDP可能是必须进行紧急手术的使用抗凝血剂处理的患者中的良好解决方案。数据还表明，用PDP处理的患者可以用克赛处理，而没有增加出血的风险；此结论与术后需要用抗凝血剂处理以预防或治疗深静脉血栓形成的患者相关。数据还表明，可以用克赛和PDP对患者进行共处理，从而同时预防出血和血栓形成事件。
实施例9
与FFP相比，纤溶酶原耗尽的血浆(PDP)的体外特性
根据实验工序计算纤溶酶原耗尽的血浆(PDP)和新鲜冷冻血浆(FFP)的凝血参数，并进行比较，如表17中所详述。使体积为215ml的新鲜冷冻血浆(FFP)流经ClearPlasma(在表17中以PDP表示)；与同未处理血浆有关的FFP相反)。似乎PPD中高达80％的PLG被耗尽。
表17：PDP与FFP的凝血参数比较。
参数 单位 FFP PDP P值
纤溶酶原 μg/mL 155.41 33.06 P<0.01
PTT 秒 34.82 32.56 N
纤维蛋白原 mg/dl 360.2 317.8 N/S
所有实验均一式三份进行。使用学生t检验计算统计数据(双尾分布等方差)
此外，针对特定血液组分执行多次测试，以确定经处理和未经处理的血浆的凝血和生化状态(检查营养和蛋白质接触)。测试在Bnay-zion Hematological andbiochemical laboratories执行。结果示出于表18中。FFP和PDP之间似乎没有显著的生化参数差异，因此ClearPlasma不会影响营养和/或蛋白质接触水平。
表18：PDP与FFP的生化参数比较。
参数 单位 FFP PDP P值
葡萄糖 mg/dL 384.00 341.80 N/S
碱性磷酸酯酶 U/L 51.20 46.4 N/S
丙氨酸转氨酶 U/L 10.80 10.40 N/S
淀粉酶 U/L 54.00 48.60 N/S
天冬氨酸转氨酶 U/L 16.60 15.40 N/S
γ-乙酰氨基转移酶 U/L 9.40 9.60 N/S
乳酸脱氢酶 U/L 290.20 254.00 N/S
钠 mmol/L 168.6 162.8 N/S
氯化物 mmol/L 73.06 74.68 N/S
总蛋白 g/dL 6.37 5.89 N/S
球蛋白 g/dL 2.33 2.30 N/S
尿素 mg/del 22.80 19.80 N/S
所有实验均一式三份进行。使用学生t检验计算统计数据(双尾分布等方差)
另外，如实验步骤部分所详述，通过血栓弹力描记术(TEG)在PPD和FFD两者中监测凝块裂解。结果示于图7A-图7F中。看来，PDP消除了人血浆中的纤溶活性。
实施例10
小鼠安全性实验-尾巴出血测定中抗纤溶技术的评估
这项研究是在Biocell Ltd.(Israel)执行的。
目的
该实验的目的是检查在小鼠中静脉注射不含纤溶酶原的血浆的安全性。
研究终点
通过血液标志物(血细胞计数、生物化学)和临床观察(皮肤、皮毛、眼睛/粘液检查、神经系统、身体活动和一般行为)来评估纤溶酶原耗尽的血浆的安全性。在注射前、注射后48小时和注射后7天测量参数。
动物
12只动物
物种/品种：小鼠：C57black
性别/数目/年龄：雄性，10-12周
来源：以色列的Harlan Laboratories
伦理委员会
这项研究是在获得“以色列动物实验委员会(The Israel Board for AnimalExperiments)”批准后根据“以色列动物福利法(The Israel Animal Welfare Act)”执行的。
研究设计
在该实验中，向每只小鼠注射200μl的一种治疗物。
1.将健康的12周大的C57black小鼠用克他命和噻拉嗪(分别为100mg/kg和10mg/kg)的混合物麻醉，并测量它们的体重。
2.将小鼠随机分为三个不同的组(每组四只小鼠)，并注射200μl的以下物质：
1.盐水-组1
2.常规血浆-组2
3.无纤溶酶原的血浆–组3(血浆源自C57black小鼠，并通过ClearPlasmaTM过滤)。
3.在注射后四十八小时，处死每组两只小鼠以评估注射的安全性；将血液收集到EDTA K3试管中以进行血液收集，并送至进行血液测试(在4℃下)。
4.七天后，处死每组两只小鼠以评估注射的安全性；将血液收集到EDTA K3试管中以进行血液收集，并送至进行血液测试(在4℃下)。
5.对小鼠血液进行了以下测试：血细胞计数(CBC)、LDH、AGT、ALT和全生化分析。
生理标记已证明，静脉内注射纤溶酶原耗尽的血浆不会影响小鼠生理。检查所有组的全血细胞计数(CBC)、血液生化、体重、形态学外观和动物行为，发现所有组均正常。因此，根据该实验的结果，看来纤溶酶原耗尽的血浆是对于使用来说安全的。
小鼠出血测试
还在小鼠中进行了纤溶酶原耗尽：对源自C57black小鼠的血浆进行ClearPlasma(对照血浆未处理)。然后通过Eliza[KIT：ab198511-纤溶酶原总量(PLG)小鼠ELISA试剂盒]评价纤溶酶原的水平，显示出97％的纤溶酶原被耗尽(如下表所示)。
表19：
根据实验工序部分中所述的工序执行小鼠尾巴剪断后的出血测试。这项非GLP研究旨在调查ClearPlamaTM设备的使用，以及血浆与正常血浆相比具有减少的纤溶酶原的血浆的益处。这项研究是在Biocell Ltd.(Israel)执行的。
目的
为了测试PDP对小鼠出血率的影响。
研究终点
使用以下标准评级方案对失血量进行评级：
表20：尾巴出血测定模型中的出血分级方案
类别 最少出血 中度出血 大量出血
失血量 0-1ml 1-3ml X>3ml
简而言之，向小鼠注射盐水或未经处理的血浆(FFP)或不含纤溶酶原的血浆(经处理的血浆或PDP)。将动物以俯卧位放置。将尾巴的远端10mm段用解剖刀切断。将尾巴立即浸入装有以水浴预热至37℃的等渗盐水的50mL试管中。尾巴的位置是竖直的，并且尾巴尖端位于身体水平线下方约2cm处。监测每只动物20分钟(即使出血停止也如此，以检测潜在的再次出血事件)。
出血时间
将参与小鼠的尾巴在7mm处剪断，并测量直至出血停止的时间。该测试以3只小鼠一组进行，其中每次重复中有来自每个治疗组的一只小鼠。结果表明，除2号测试外，在所有测试重复中，PDP小鼠均具有最短的出血时间。
出血量
将小鼠的尾巴在7mm处剪断，并测量直至出血停止的时间。该测试以3只小鼠一组进行，其中每次重复中有来自每个治疗组的一只小鼠。收集血液，离心并使用尺子测量大小。结果表明，除2号测试外，在所有测试重复中，PDP小鼠均具有最少的出血量(参见图8)。
出血测试后24小时的血细胞颗粒大小
将来自出血测试的血细胞颗粒离心并吸出上清液。然后使用尺子测量颗粒大小。采用单因素方差分析，之后是事后LSD/SCHELF(p<0.05)来计算统计数据。图9示出了来自每只小鼠的颗粒大小结果。图10汇总了颗粒大小测量的统计分析。看起来PDP使小鼠中的出血减少了>40％。这些结果表明，与对照组相比，PDP(ClearPlasmaTM)缩短了用它处理的小鼠的出血时间和失血量。
实施例11
ClearPlasma降低了猪的纤溶酶原水平和tPA蛋白水平
在麻醉下使用Haemonetics mcs+系统对母猪进行血浆置换。检查以下两组猪：对照组和测试组。在测试组中，用ClearPlasma过滤猪的血浆。两组都进行了类似的工序，即经过滤的血液量：700ml，用抗凝血剂[抗凝血剂柠檬酸葡萄糖溶液配方a]处理，时间：约100分钟，用2500ml量的血液进行：收集了约700ml的血浆。按照这些工序，将血浆返回至动物体内。
分析每组血浆样本的纤溶酶原耗尽(Elisa试剂盒：ab108893人纤溶酶原，如实验步骤部分所详述)和tPA耗尽(野生型-tPA Sandwich ELISA编号Technozym T-PA AG EDTAElisa试剂盒96TC12007)。如图11A至图11B所示，似乎用ClearPlasma过滤的血浆样本中的纤溶酶原和tPA都被耗尽了。
实施例12
血浆pH值和电导率目的
为了比较PDP和供体血浆的pH和电导率。
材料
血浆：来自健康供体的血浆
经最终消毒的ClearPlasmaTM设备
仪器：pH计、电导率仪
将装有人血浆的袋子连接到ClearPlasma设备，并使整个体积(200ml)流过该设备进入接收袋持续1小时。测量PDP和血浆的pH和电导率。如表21所示，用ClearPlasmaTM设备处理血浆后，观察到pH和电导率值的微小变化。
表21：经处理和未经处理的血浆的pH值和电导率比较
实施例13
安全相关分析
·血液相容性
最终灭菌的ClearPlasmaTM设备(包裹在聚碳酸酯外壳中的多糖聚合物粒子)已用以下体外溶血测试进行了测试：总血红蛋白浓度测量(氰化高铁血红蛋白方法)。该测试由Envigo(以色列)执行。这项研究是根据OECD的《良好实验室规范原则》(GLP)(于1997年修订),ENV/MC/CHEM(98)17进行的。
体外溶血试验使用氰化高铁血红蛋白法测量总血液血红蛋白浓度。将来自三只兔子的合并血液与阴性(玻璃小瓶，批次：16491)和阳性(Nitril检查手套，批次：41010104)对照以及测试项目(ClearPlasmaTM)一起孵育。在37±1℃下孵育3小时后，测量血浆中的血红蛋白含量并测定溶血度。
阴性对照(玻璃小瓶，批次：16491)的溶血％是-0.5％,因此被分级为非溶血性。
阳性对照(Nitril检查手套，批次：41010104)的溶血％为91.1％，因此被分级为溶血的。
阴性和阳性对照均符合接受标准，因此确认了测试的有效性。
测试项目ClearPlasmaTM(批号：18-0001)的溶血指数％为-0.3％和-0.1％，被认为是非溶血性的。
在本研究的条件下，并且根据计算得出的血红蛋白含量，测试项目ClearPlasmaTM(批号：18-0001)的A部分和B部分被视为非溶血性的。
·材料介导的致热原性测试
这项研究的目的是提供关于检测纤溶酶原耗尽的血浆的材料介导的热原性的一般信息。
该测试由American Preclinical Services,LLC(MN,USA)进行。
该研究是按照以下进行的：
·美国药典(USP)<151>热原测试监管标准、
·ISO标准10993-11:2017用于医疗设备的生物学评估，部分11：全身性毒性测试。
总共使用了3只动物。在注射前不超过30分钟为每只动物建立基线对照温度。将受检制品(纤溶酶原耗尽的血浆，批号001)加热至37±2℃，并在10分钟内以10ml/kg静脉注射到每只动物的侧耳静脉内。在注射后1至3个小时之间，以每30分钟的间隔记录每只动物的体温。基于这项研究的结果，测试制品没有在兔子中显示出材料介导的致热原性迹象。
·细菌内毒素测试
这项研究的目的是评估在最终的无菌ClearPlasmaTM设备和珠粒上制备的水提取物中细菌内毒素(热原)的浓度。
该测试由Milouda&Migal Laboratories(Israel)进行。
单独对所述设备和珠粒进行测试。
将没有珠粒的设备用每个样本50ml LAL试剂水孵育1小时。在测试前，将LAL试剂水加热至37℃。然后使用动态比浊LAL测试法测试样本提取物中的细菌内毒素。
两个测试样本的结果为0.00860EU/ml和0.01380EU/ml。
然后，按以下方式测试3小瓶在30％乙醇中的珠粒：按1:10用LAL试剂水稀释每个样本，并将其在15-30℃下孵育1小时。将样本以5,000RPM离心10分钟。用动态比浊LAL测试法测试上清液(稀释度1:10)的细菌内毒素。每个测试的结果都是<0.05EU/ml。
[设备+珠粒]的最大汇总结果不大于USP<161>(20EU/设备)规定的极限：
[0.01380EU/ml×50ml]+[<0.05EU/ml×27ml(用于填充到设备中)]＝0.69EU/设备+[<1.35]EU/设备＝<2.04EU/设备
作为发布测试的一部分，将对每个产品批次进行LAL测试。
在随后的方法权利要求中，提供用于指定权利要求步骤的字母数字字符和罗马数字只是为了方便起见，并不意味着执行步骤的任何特定顺序。
最后，应注意所附权利要求书中所使用的词语“包括”应解释为意谓“包括但不限于”。
尽管已经根据本文公开的主题示出并公开了实施例，但是应当理解的是，可以在不脱离本文公开的主题的精神的情况下在所述实施例中进行许多改变。
实施例14
临床研究将评估ClearPlasmaTM在急性上消化道出血患者中的功效和安全性
进行了随机双盲的对照试验以评估通过ClearPlasmaTM设备过滤的PDP在急性上消化道出血患者中的安全性和功效。这是一项非劣性研究。主要结局是安全性：血栓栓塞事件(静脉或动脉)。该研究旨在评估以下参数：
1)血浆输血后的总失血量[时间范围：第一次术后48小时]。通过以下方式评估失血量：输注的RBC的输血单位[时间范围：2周]、输注的血浆单位[时间范围：2周]、血红蛋白与基线相比的下降、输注的血小板单位[时间范围：2周]和在两周随访期间的再次出血发作；
2)住院时长[时间范围：在两周随访期间]；
3)与血浆输注有关的死亡率。
该研究的1/2阶段在多个中心(多中心)进行，总持续时间为12个月(每位患者的研究持续时间为2周)。该研究包括两组：
a)输注250-500ml的PDP，加上常规血浆(如果需要的话)；
b)输注常规血浆。
所述患者群体涉及患有通过黑便/胃灌洗物中存在血液/咯血而被诊断出的急性上胃肠道出血(UGIB)的患者。样本量为30名患者(每组15名)。样本量的计算是基于对相似适应症和临床项目中医学文章的审查，并涉及描述性分析。
通过评定纳入和排除标准来筛选患者的研究资格。筛查工序包括收集人口统计数据、病史、身体检查和生命体征。
为纳入研究，患者应≥18岁，并有由医生诊断的急性上胃肠道出血(<24h)并提供书面知情同意书。知情同意过程符合ISO 14155:2011的建议。
以下参数将患者排除在研究范围之外：妊娠、上个月给予血浆输注、已知的肾衰竭肌酐清除率<30ml/min、前3个月有动脉或静脉血栓形成、先前对血浆的过敏反应、参与另一项临床研究和抗凝治疗(诸如华法林、阿哌沙班，利伐沙班、达比加群、低分子量肝素)。
随访/评定时间表是基线、在输血后8-12小时(包括血液样本)、早晨之后(第2天)、72小时和14天。基线评估包括血压、脉搏、血液测试，所述血液测试包括全CBC、PT、INR、PTT、生化。处理时间表是一次输血，并且随访时间表为输血后12h、24h、72h和2周。
ClearPlasmaTM的施用必须基于ABO血型兼容性。在紧急情况下，ClearPlasmaTM血型AB可被视为通用血浆。解冻后，必须使用带过滤器的输液器，通过静脉输注来施用ClearPlasmaTM。必须在整个输注过程中使用无菌技术。
预期的不良反应是过敏反应和发烧。在发生需要改变处理、撤回同意书或研究者决定的严重不良事件时，则可以撤回患者。
本研究的数据根据美国联邦法规记录在病例报告表(CRF)中，以使临床研究数据能够被系统地捕获、审查、管理、存储、分析和报告。
研究站点受到监视：
a)在研究开始之前(即，研究开始随访)；
b)在已经招募了第一批患者并且已经完成了crf之后的研究初期；
c)在研究过程期间招募了10-15名患者之后；
d)在招募了最后一名患者之后(即，研究终止随访)。
CRF返回值不佳、数据质量不佳或患者退出或偏离的患者数过多可能会触发附加的现场监视随访。
这项研究可能要经过申办者或其指定人员的审核，并由适当的监管机构进行检查。研究者必须同意对与研究相关的记录进行审核或检查，并且必须在考虑到数据保护和医疗机密性的前提下允许直接访问原始文档。
在CRF中捕获研究数据，所述研究数据包括根据最终批准方案的所有变量。根据ICH-GCP(良好临床实践)，ISO 14155:2011，用于人受试者的医疗设备的临床研究-良好的临床实践(Clinical investigation of medical devices for human subjects--GoodClinical Practice)，以及FDA标准，诸如US 21CFR部分11的要求来收集、输入、清除和报告数据。
序列表
<110> 普拉斯富瑞有限公司(Plas-Free Ltd.)
<120> 用于从生物流体中去除纤溶蛋白的体外设备和基质、
其方法和用途
<130> 2625735-JDB
<150> US 62/636,511
<151> 2018-02-28
<160> 4
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
<211> 55266
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> misc_特征
<223> 纤溶酶原AY192161.1
<400> 1
cactagtgat gctggaagtg ctcccaagaa gcagagaaaa gtcatgacat ttgacattac 60
aagaaaaact ggatttgctt gatatgtaac agagactgag gtctgtagct ggggttgctt 120
ccatttcaga cagatgattc atcttgtaaa caggtggtgt aaacttactg tatggaaaaa 180
tacataacag taccacagat gtattttctc cttacgaaca tttccttttc tctagcttac 240
tttattgtaa gaatacagta tatcatacat ataacataca aaatacatgt tattaactgt 300
tgctggtcaa cagcaggctg ttagtagtta agtttttgag agtcagagtt atacctggat 360
tttctactgt gtatggtcag tgtgccaacc cctgaaattg atcaagggtc aactgtaatc 420
ctaaaagaat ctaatacaat attgtaaaca gtaagtggtc aataaataag gaattgaact 480
aataagaata cataaatccc agaatatgtg caacctgatc atagtacaca gagatctctc 540
tatatatctc ttttcttagt tcatgctgtt ctttcaggta gaaagcgcct tattttgaat 600
tagttgtctt tagagcaaaa atccctccaa gagtgctgtg tggtttccta tgcacaacct 660
ggaatagtcc attgcttcat gcctaccctg gacatgaagg gccatgccgc agcggaagtc 720
tctatgcacc cacccccgtc tatacctgag caacacattc ctctttgctg ctctcttaca 780
ggctacagag tgcggtggcg ccagcacaga gctctgctca acgtccctct gtgctttcac 840
gatgctgatg gattatgaag gtagggaaga atgtacagcc aggaggccat taggagggca 900
actaatttat aaaatcacat ttgtagaatt taatgcatcc aacaactacc aggggaaagg 960
tgggcaaaag ctataccaac accacccaag tcaaaaccaa aacaacagga aaagaaaatt 1020
atgtggatgt agaatttctg ataacatcat tcccaaggtg ccttatccaa gaggaactgc 1080
tacaataata ttttaagtgg aaataaatac atgctggaag cattatatat tagtagagta 1140
tttttttttc ccaaagtact ttctcaagca catcaacatg agccccctaa gagacatttc 1200
acattaaaaa taaaatgtct gcccactgct ggtttctcaa tctgcctcca ccttctgtcc 1260
cctttaatga actgggccac gaggtgagtc agagaggata aagggagtgg taagaatttg 1320
aggagagaag agagtgaggc taaaatagga aatcaggaaa agcgattcgg tccccctgtc 1380
cctcacatgg ggccaccctc ttgttgccca gtgtggcttc ttcttgaggg ttctgcatgg 1440
ttcctcaatc ccagggaatt ccgcaggaca ttccacccaa gaccattggg ctcccacctc 1500
tactcttttg ccagttaatg aataggcagg aatttcactg cctggaaaga ggaacaatgc 1560
tttctggtcc ttatttcaca tctaaaatag agaggtcaat tgatttattc ctaaatatct 1620
ttgaacacta aaatagaagt tttacagcat atatactacc tggttgctct agacttaagc 1680
cagggaaaag tacagattca acatttaaaa ttgagataga cgctttccac ttaatgctac 1740
cagtcttgct ttatttcatg agaatgagaa tataataata tggcatacgt tcatttgggg 1800
gaaagattga tgtcttataa cataatttat aattacagaa aacatgtgag ttcactggga 1860
ataaataaat tttgaagata ataagatact ttcacttatg tcgtaatttc tatgtcattt 1920
ggtgtaggat gtagagatat taacgtttac acctaactta agtttgtcat ctaagacctg 1980
aaagggtttt gtctatcagc tgcacccctg ggtagagaca caaccttggg gaaggcctca 2040
gccccatccc tcgtacagca ggaatgagaa cagccctgcc tgttgggaag cttgagggag 2100
gctatggacg tgcagcgctt ggcagagggt ctcgtcatgg aaggttccag caaatgtgag 2160
atacttttat gatttcattt tctccaaaag aaagggaata agagaagagg ggaggaaata 2220
agactaattg cgagagataa agtacaaggg tgagggaagg aataaggaga catgacggca 2280
gcgtggagca gccgaggggg gagattgctt tcaccacttc ccagcatcta ttgcagattc 2340
caccctcaaa catgttgtaa ggactcttta ttcaaggtaa tgtttgaacc ctgctgagcc 2400
agtggcatgg gtctctgaga gaatcattaa cttaatttga ctatctggtt tgtggatgcg 2460
tttactctca tgtaagtcaa caacatcctg ggattgggac ccactttctg ggcactgctg 2520
gccagtccca aaatggaaca taaggaagtg gttcttctac ttcttttatt tctgaaatca 2580
ggtaagacat agttttttta aattataaga attatttttt ctcccacaat gtagtaaaaa 2640
tacatatgcc atggctttat gtgcaattca tttaattttt gattcatgaa acttccagtt 2700
gaaaatcttg tataagattg aggaattctt caagaaataa gtttaagttt cctgtgaaga 2760
ttgtcagggt gctggaatga atgggcagag aaaataatgg gtgatttttc aaatctaaat 2820
gagtgcaccc acataatggc cagtctaatt gaaaaagagc caatgtagct aattatgcaa 2880
aggacggcta agctctttgc ctggttctca gtttgactaa tttatatcat ctctgttacg 2940
gtgtcatgct cccctcactt gcaagttaaa acagtgaaat atctctttga atatattccg 3000
ttctctcacc agttcatggt ggcggcaggg tcggggactc agcatttctc cctttgttat 3060
ggcctgagga aggctttcca tcagtatacg tttgcctctt atccccggaa aaatcacacg 3120
catccatttg ccagatgctg tgtgcagata gtgatcaaca aatactcagt tgcttgggtt 3180
aggtccctac atttttacac atacatacat acctgtgtgt gaatgtgagt gtgagtgtgt 3240
atcctttaca aatactagct tatttagctc gtggtatagg tagggtagca tattcatcct 3300
cattttataa acaaagaaat cagacttagg aatatcatgt tatttgctca gtgaccaaat 3360
tctcagatct gggaaataaa gaaaactgga tttaagccag gtttcccaga aggaatctag 3420
ggctcttctc acttttcagc tttgtttaag cctttgaaag aatattctaa acatgtccta 3480
gtacttcttt ttctttaaaa aaaaaaaagc tttattgaga tataattaac atatagaatt 3540
cacccattta ggcatacaat ccaatggatt tcaagatatt gagagttgtg cagccaccat 3600
cagaataaat tttaaaacta ttcatacccc caaaaacgca ctccactctc cttagctgtt 3660
acccccaatc tgcagcttct ggcaaccact aatctacttt ctgtatttat atctttgcca 3720
ttttgaacat ttcatacaaa cggaatcata cgatttgcta gtagttcttc atgtaaataa 3780
tgtacgcttg aaattcaatc tataaattac cagataaaat tttacaagtt gcactttaga 3840
gtcaaataca tttgaattta gtggaagcca ttcaaggagc tatcaaagaa aatacagagc 3900
aggagaaaat taaagaaatt tttgtaagaa attggtgtat gttggggggt atgaatatta 3960
tatttcaatg catggaaact aggacataga tcactatgaa cttattcagt gggctacacc 4020
caaaggctag atcaaacttc tctgccacag gattaacata tgttttaacc cacctggtgg 4080
gcacattctc tcataagctc ttttggaaag ccaggttttc tgtggatgta tcatctttcc 4140
agtgtgctgc aatgcccggg gagagggaaa agtttctttt acagccatgc ttagtgggaa 4200
gtggagaaac atcttccatt tcacaaatta agtcttttac acatgcaaat atgcatacac 4260
attcacacac cacagtgagg aagaaattct cacaccatta ataaaataca tttgcatcag 4320
tagcaatata catctgcatt ttgcctataa tataaatgta tttttccact aaaagatttg 4380
tttgatgttt ccttgccagc aaataagccc tatcaaatcc tattgccata tgagtcctag 4440
aggtgaataa gagaagaaaa aatgggggaa aattatttca aactgaaaag agaaaagttt 4500
gattctgttt tgggatattt cctagggaca tgagctgggg aggggatctc agcagcgatg 4560
cgctatgaag catagtaaca taacacagag aacttaattg aagggggaaa taaatggaag 4620
ttttcttttt ttgaatatca gttgtagcct gctctgctat acttcaaaaa aactcttcag 4680
aaagtttaac tgaactcact gtaggacaca ctttgtggat ttattgtgtg ttttgaagtc 4740
acactgtgag ctatatagaa ttaaccaaaa cacaactctt cttgaaaatg agagttcaag 4800
ttggcagaaa gtgcggggta aagacatgga tatgggccta aagcatctat ttctttgtga 4860
tcttttgata tatctctcaa gtgcttttta gtggattagc tttagaatgc atcagccaac 4920
tcctgctcaa taatccattt ttccagcccg gaatgtctta aattgaggaa ggacaaagtc 4980
ccagaggtgg ggagcagggg gactttggcc gaggactttg catgaatcga tgagcatgca 5040
tccacctccc tgtcctgccc cttgtgctct gtgtaccctc aggaggtcag gacaggcctt 5100
tctgagaatg aaaatctgtt catttgcttt cctactggat acttgtcatc agcatacaaa 5160
ccaatgcgct ctgcagtgtg tcatctttca gaacctcccc tgaccgcatg ttccctggag 5220
ggctcgctgt cttcagagcc aggcttgtct cctgctgcag cctccactgc tctcctagtc 5280
actctgtaac ccaccccctc tgcctgcggc ccccaccacg cccctcaaag tggtcaaggt 5340
tgtcctgttg tctaattcca tggagcttgc ctgtcttcat tttattagcc tcttttggcc 5400
tctcaccctt gtgcaaatca ctagcattct gtgccaagga cggagctggc atctccaggc 5460
ttggaataga gctaccaaag ctcagccaga tgtctggaag agcctcagga caaggggaca 5520
ccctgtagcc ttgtggtggg agcacagctg aggccccctt ggccaccctc tgccacgacc 5580
aggcagaaag cagctttcgg acagattcgt tgtctcagat ttgatctcaa agaaaaacca 5640
agaccagtat ttgtcccagg tcctgctttt ttacaatttc ctccgaaatc cagatacctg 5700
tcaacacctt ggaaaaactg acttctcccc aattagtagt gttgtgtgac tgtcataagc 5760
ccagtacaaa aatggccttc tttgttgggg agcttcttac cctccagtgt tttgcccaat 5820
ttttgtccaa ggtggcaaca taatttagtt cagttcttgt ttatttccac catcatctat 5880
gcaccaaaat ttatgtttct caaggaggga ccattcagag gatgcttccc accggttcaa 5940
gtgacagtgc cagaaccaaa gcgcatattg taggaaatca aacaatggcc tccaagttcc 6000
atttctaccc agggatgaac aaatcaacat caatcttggt aacacaactg ccactgatgg 6060
tgccttactc ttctctcatg acatggcaca atcaatagca aacataaaat ttgttcttgt 6120
ttaaggattt atatccacta atatggtaac atagtagtgg ttccatagtt ctaacctgtt 6180
tgtcaatcca gttaatcttt tactatcttg caatctgcta atgaaactgt ttttctttgt 6240
tttataattt caacttttag agtcaggggt acatgtgcag gtgtgttaca taactaaatt 6300
gcgtgacact gagctttggg gtacaaatga tcccatcacc caggtagtga gctaaatacc 6360
tactaaatag gtagtttttc agcccttgcc ttgctccctc tctcccttct ctggtagtcc 6420
ccagtgtctt tagttgccat ctttatttat gtccaaatgc ccgactgtgt gttcttaact 6480
aaacattttg attcatagct acccattcta cttccagtaa acagaaagtt ttatttggtt 6540
aatgctaacc aaatagatta aaaggaagtc atgacaatta gacattgaca ttgatttact 6600
gaccatttat tccacttgga tctcccacct ctaggtcaag gagagcctct ggatgactat 6660
gtgaataccc agggggcttc actgttcagt gtcactaaga agcagctggg agcaggaagt 6720
atagaagaat gtgcagcaaa atgtgaggag gacgaagaat tcacctgcag gtatttccat 6780
tgtcgttgca cctacgcagg aatctgtaat tcagatggca agtaatttac tcacaaattt 6840
attaatgatt taagaggaaa gagaaattta tggagccaga gtttggaact atatttgctc 6900
acagtatgtg aagccatact aacagcttct tgttaaggtt tattggagtc tttgttagaa 6960
aaataccctc aaaggaagtt atttgttttt acaccggaca caaacattag cagttattgt 7020
tctgagctcc agttttcaac atcatcatca gtaaatgttt gttgaggatc aggtgaatga 7080
aagtgtccta gatagatctg agcaatgact tatagctaca agatccagtg cctgcccttt 7140
agtatttaag gtgtagtcaa agaaactgga tataatgtta aaaaaaaaaa aaagacagcc 7200
caagtgaggt acaggcataa tcaatgcatg ctctacccag atccagaaga aagaacagtg 7260
cctaaggttg aggcagctag agaaggctca gggaggaggt gggaactgag ctgggtttgg 7320
agttgagaga gctcttgaca agcaccagga aggcagggga agatgcggcc ctgcaccttc 7380
tgagggggac cattaagaga tgaagttgac taaagcagag actttgtgta ggtgacgggc 7440
ttgggaaggt agctatggaa tccagactga gcacccatag caggaccacg ggatggagat 7500
gggaggggtc aggggccagg gtggggtgga atgtggagca gaggttcagg ggaactgatc 7560
agagttggga ggtcatggag acggactatc ttggcgaatg ggttcaaagc aaccagagtt 7620
gcttctttcc aacccaaaaa caaaaattaa gaagatgagt gaagaagaag taaagcagtt 7680
gaaacaggaa gaaagggaaa attatgaggg agggaaggta agggcagata agatttgctg 7740
ccacgttggt gtattttgtt cagtacttca tcgatgccat gcccaaataa ctgaaagagg 7800
cagcaattct gagctctctg gtccctcaag atattcaatg atctttagca tgtctcactt 7860
attaataaac atttgttttc tttaaataaa gaaaaatact tattggattt cctgcttcgt 7920
tctgcagggc attccaatat cacagtaaag agcaacaatg tgtgataatg gctgaaaaca 7980
ggaagtcctc cataatcatt aggatgagag atgtagtttt atttgaaaag aaaggtgagt 8040
acattttctt cctcctcctc ctactgtcct ccccatcctc ccactcttcc tctttctcta 8100
ttctatcttt aatttataag accagaggag gaaggcacta tcgtgttata aaactgaatt 8160
ctgagttagg acaggatttg attactaact aaccatgtca gcttgagtgt attacttcac 8220
ctcttagatt taattttttt tgttcaaaag atgaaaggat tagatttaca aaatcacttc 8280
tacctctatg accctgaaaa taagattttt aaaatattat tttatattta acaaggagat 8340
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caattaaata gttaaaataa aacaacaaaa tcaataaaaa tcaaataaac aatatatatt 13980
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cttatcacaa ccctcatcat caccaccatt ccaccactgc caccaccacc accaccatca 50160
ctatcattaa caatagacat cacataacca gtttgtagct ggaccttgag cccagagccc 50220
actcactgtt tcttcagtcc caccgccaac caccaggatg agtcacaaaa cataactcag 50280
gcctgctcct caattttcta catgtcaata atgacattga agcaatgggt gttctctgct 50340
tctcagaggg aagttgaaat tctcctgctc ttcccttcat gtttccagat gttccctgac 50400
ttggatattc caaacgcaga gtttggaggt gttgaggcca aggggttttt ccaggtcagc 50460
catcatctgc aatcactgag ctgatcctgc tgctggactt tccctgttgc cctctcccca 50520
acgccccatc ggggagggct tcaatcctca ggtcacctgt ggcctttctg ccctcagagg 50580
tgccatctct acatctacca ctggaaggca gcacctactc acagattgca tcaatttccc 50640
agcaactcat ggtgggtttt cccccttatc agcgtgtttg ccttgctcag agagcagatc 50700
ccagagcagt gacacctaac ttaattttca gcaaaacatt ttgagaaggg tgctccctca 50760
cacaactaca cagtccaggt gatgcaccca ctgcccaatg cttggtagtc aagaggagct 50820
tcctccctgc agctctgccc agatagggct gagctgggct ctggagccag gcgctgggat 50880
gagcctcttc catgctgctc atgtaaactc cagattcagt gtcggttttc tgaacccgag 50940
acaatgatct aaatgcagtc gaaggctttg gggaaagaga gagtgcctcg gttcttacct 51000
gtgtcatgct cgcaaagcaa agagttttgc aaaattttaa tgaaacctgg gcttgcaaaa 51060
ttggaaaact agattatttg tgacgacact gagacatccc tgggcatgtc tatctggaaa 51120
aacggcattt tctctggcaa ttttgcagac attctatttc aatttggcaa agaaaataaa 51180
gcagtttttc acaaaggcag aaatacaact agaatgttca ctctccctaa ttgtcaaaga 51240
agtgtaaatt agaaaatgaa tcaggacaat ttcaacctat tagattagct aatattttaa 51300
aaattgaaga ctcatacaag tgaggtgaag tgattgtttt ctagtggcac ggtacactgt 51360
cacacccttt tagaaaataa tttggcaacg ttattgggag acagaaatat gtctatgtaa 51420
tttatgggaa cttagactca gaaaatgtta aggaataaga atgaacttta tgaacaaaga 51480
tgtggaaagc tggaagcaag agtggggcca acacgcatgg ggaggaagca tttgggcagt 51540
gactccacag acccaggctc aggctgaact acacaacctc cttacgcctc agtttcctta 51600
acagtagaac agaaatgata aaagtgcctg tttcacagga ctattgcgag gattaagtga 51660
gatacatcgc attataagct tgtgtctgga aaggttaatt cttggtaaat gatgactatt 51720
cttttttatt gcaataaaat atacaaaaca taaggtttac tattttaacc attttggaag 51780
gtaccactga gtggcattta gtacattcac aatcatgtgc aaccatcatc atatttccag 51840
aacattttcc tcattcccaa aggaaacctc atgttcatta agcagtagct ccccttaaca 51900
tattagttat gaagatcata gcattataca aaactcatga cacaatgatg agtgaaaaaa 51960
tcaagatgtg aaattttgtg ttatgatgta attagtaaaa gaagcatatt aaaacatctg 52020
aaaaaagagt atataaaaat agcaattgca tttttcagac tctacatttt aaacattatt 52080
ctttatagtt ttaaaagcaa aaagtaaaga aacaacaacc aaccccaaac caacacgaca 52140
aagccgagat tgttaattcc agggctcagg aacacagaat catatatgat gtttacactc 52200
tgcagggtca gagactccag cggcattggg agctgcctcg tgttctgcag cctcacagac 52260
aggaggtcca gtgccgctgc tctgttctgg aatatcctcc tgaatgtgtt ttgggtgcag 52320
ttgccatttc tttcatcttt ttaaacacag gtacttttgg agctggcctt ctcaaggaag 52380
cccagctccc tgtgattgag aataaagtgt gcaatcgcta tgagtttctg aatggaagag 52440
tccaatccac cgaactctgt gctgggcatt tggccggagg cactgacagt tgccaggtaa 52500
gcaaagatca agagaccaaa gttagtcttg tgctctcttg tctcagtctc agcccctcag 52560
acttcattcc ccaggtggca aattcaagga ttttcaaccg aagaccccag tctaagtgtt 52620
gtttagaaac ttcctagatc tgtccctgaa tgcgtattca gatcatctaa ggggatgtct 52680
tggggcttga gttccaaatc agtagcaagc gagttttaag tgccataact acctcaggcc 52740
actcaccctc ctggggtgtg ctggtggcca gggactaaag tggtgacttt tccggtaggg 52800
aaggaggtag agggtacagg acagagacca actgcacaca ctttacactg atgcccaggc 52860
tagcccagtc taaaggaaac accaacatag gaagggatgt gtgcaggatt cacaaaagat 52920
cttttctacc ccccggaaaa actaagtggt gtggtttcgc taaacagatt ttgctaagta 52980
cttaagcact gcagatgctt gagtaatatg ctcataagtt cctttctgat ttcaattact 53040
gggaaaatgt atatatggat agtagaagga tggcatccca taataaaagg caggcagcct 53100
aaccctcaca tgcatttttc tctccctctg tatagggtga cagtggaggg cctctggttt 53160
gcttcgagaa ggacaaatac attttacaag gagtcacttc ttggggtctt ggctgtgcac 53220
gccccaataa gcctggtgtc tatgttcgtg tttcaaggtt tgttacttgg attgagggag 53280
tgatgagaaa taattaattg gacgggagac agagtgacgc actgactcac ctagaggctg 53340
ggacgtgggt agggatttag catgctggaa ataactggca gtaatcaaac gaagacactg 53400
tccccagcta ccagctacgc caaacctcgg cattttttgt gttattttct gactgctgga 53460
ttctgtagta aggtgacata gctatgacat ttgttaaaaa taaactctgt acttaacttt 53520
gatttgagta aattttggtt ttggtcttca acattttcat gctctttgtt caccccacca 53580
atttttaaat gggcagatgg ggggatttag ctgcttttga taaggaacag ctgcacaaag 53640
gactgagcag gctgcaaggt cacagagggg agagccaaga agttgtccac gcatttacct 53700
catcagctaa cgagggcttg acatgcattt ttactgtctt tattcctgac actgagatga 53760
atgttttcaa agctgcaaca tgtatgggga gtcatgcgaa ccgattctgt tattgggaat 53820
gaaatctgtc accgactgct tgacttgagc ccaggggaca cagagcagag agctgtatat 53880
gatggagtga accggtccat ggatgtgtaa cacaagacca actgagagtc tgaatgttat 53940
tctggggcac acgtgagtct aggattggtg ccaagagcat gtaaatgaac aacaagcaaa 54000
tattgaaggt ggaccactta tttcccattg ctaattgcct gcccggtttt gaaacagtct 54060
gcagtacaca cggtcacagg agaatgacct gtgggagaga tacatgttta gaaggaagag 54120
aaaggacaaa ggcacacgtt ttaccattta aaatattgtt accaaacaaa aatatccatt 54180
caaaatacaa tttaacaatg caacagtcat cttacagcag agaaatgcag agaaaagcaa 54240
aactgcaagt gactgtgaat aaagggtgaa tgtagtctca aatcctcaaa gagctgtgtt 54300
tatttcattg acaaatagat tatttgtatt caattctgat gtgctttaag gatgaagttt 54360
ctcattttac aattagcaca cacttcgtat atgttgtcac ctgttctcct tacacaaatg 54420
ttgttcccca ttttgaagga ttccctttgg taccagtttt gcctgtccac ataaagtatt 54480
tcatttaaaa agctcagcat aaaatataga ctgcatctga aaagatattg aatataatat 54540
acatagcaga acacacacgt tccacatttc aaaagcctcg ataacaaaaa agaaagatca 54600
aagcccttat tagtcgctgt aaagccattt ataaagctcc tgctgatcct gttaagcatg 54660
gatataattg acctttcttt taaattaaaa tgtaagcttt tccccaagac aactcaaagt 54720
gccaagactg aatgggaact gtccatgttt ctaactcttg gccacgggca ccatcagaac 54780
tgaacttaac aaatatatga aaaatatctc ttcattttta aaatcctaag acccagaaat 54840
cataatccat gggatttgtt tagtaaagaa gaaaatctgt ggctctaggt gtccactaaa 54900
ggagagccaa aaatgtcccg aataatctca ggaccacagc atcattttat gaataacaga 54960
accaagacct cagattgtac aacagattgg ttcttattgc tggaatgggg cataaaccat 55020
gcctggaacc ccagatgcta cagagaaggt agatgggaga gacttctgac ctgttcatgt 55080
tgcaaaggcg tgcggagacc aaggtgagca gaggacacga atgctcacat tctgtggccc 55140
aggaacctgt gattcaatct cctcattaac aggattccca aattttcatc ctccctgcaa 55200
tttttcaaat gctcggttat gggcttagtc ccttgactga tcagatttga tgaacatttc 55260
tgcaca 55266
<210> 2
<211> 810
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_特征
<223> 纤溶酶原AAN85555.1
<400> 2
Met Glu His Lys Glu Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Lys Ser
1 5 10 15
Gly Gln Gly Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser
20 25 30
Leu Phe Ser Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu
35 40 45
Cys Ala Ala Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe
50 55 60
Gln Tyr His Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg
65 70 75 80
Lys Ser Ser Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys
85 90 95
Lys Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg
100 105 110
Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser
115 120 125
Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser
130 135 140
Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln
145 150 155 160
Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys
165 170 175
Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn
180 185 190
Tyr Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala
195 200 205
Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe
210 215 220
Pro Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu
225 230 235 240
Leu Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu
245 250 255
Cys Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr
260 265 270
Tyr Gln Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala
275 280 285
Val Thr Val Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro
290 295 300
His Thr His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp
305 310 315 320
Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His
325 330 335
Thr Thr Asn Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys
340 345 350
Asp Ser Ser Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro
355 360 365
Glu Leu Thr Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser
370 375 380
Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser
385 390 395 400
Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr
405 410 415
Pro Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp
420 425 430
Lys Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr
435 440 445
Cys Asn Leu Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Pro
450 455 460
Pro Pro Val Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp
465 470 475 480
Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr
485 490 495
Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg
500 505 510
His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys
515 520 525
Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr
530 535 540
Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys
545 550 555 560
Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys
565 570 575
Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp
580 585 590
Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly
595 600 605
Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu
610 615 620
Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His
625 630 635 640
Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg
645 650 655
Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser
660 665 670
Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser
675 680 685
Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp
690 695 700
Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln
705 710 715 720
Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn
725 730 735
Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly
740 745 750
Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu
755 760 765
Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys
770 775 780
Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val
785 790 795 800
Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn
805 810
<210> 3
<211> 2954
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> misc_特征
<223> 组织纤溶酶原激活物NM_001319189.1
<400> 3
gaacttcctc cccctgcttt ataaaaacag gcctgcctca gctccctcat ggccctgtcc 60
actgagcatc ctcccgccac acagaaaccc gcccagccgg ggccaccgac cccaccccct 120
gcctggaaac ttaaaggagg ccggagctgt ggggagctca gagctgagat cctacaggag 180
tccagggctg gagagaaaac ctctgcgagg aaagggaagg agcaagccgt gaatttaagg 240
gacgctgtga agcaatcatg gatgcaatga agagagggct ctgctgtgtg ctgctgctgt 300
gtggagcagt cttcgtttcg cccagccagg aaatccatgc ccgattcaga agaggagcca 360
gatcttacca agtgatctgc agagatgaaa aaacgcagat gatataccag caacatcagt 420
catggctgcg ccctgtgctc agaagcaacc gggtggaata ttgctggtgc aacagtggca 480
gggcacagtg ccactcagtg cctgtcaaaa gttgcagcga gccaaggtgt ttcaacgggg 540
gcacctgcca gcaggccctg tacttctcag atttcgtgtg ccagtgcccc gaaggatttg 600
ctgggaagtg ctgtgaaata ggaaacagtg actgctactt tgggaatggg tcagcctacc 660
gtggcacgca cagcctcacc gagtcgggtg cctcctgcct cccgtggaat tccatgatcc 720
tgataggcaa ggtttacaca gcacagaacc ccagtgccca ggcactgggc ctgggcaaac 780
ataattactg ccggaatcct gatggggatg ccaagccctg gtgccacgtg ctgaagaacc 840
gcaggctgac gtgggagtac tgtgatgtgc cctcctgctc cacctgcggc ctgagacagt 900
acagccagcc tcagtttcgc atcaaaggag ggctcttcgc cgacatcgcc tcccacccct 960
ggcaggctgc catctttgcc aagcacagga ggtcgcccgg agagcggttc ctgtgcgggg 1020
gcatactcat cagctcctgc tggattctct ctgccgccca ctgcttccag gagaggtttc 1080
cgccccacca cctgacggtg atcttgggca gaacataccg ggtggtccct ggcgaggagg 1140
agcagaaatt tgaagtcgaa aaatacattg tccataagga attcgatgat gacacttacg 1200
acaatgacat tgcgctgctg cagctgaaat cggattcgtc ccgctgtgcc caggagagca 1260
gcgtggtccg cactgtgtgc cttcccccgg cggacctgca gctgccggac tggacggagt 1320
gtgagctctc cggctacggc aagcatgagg ccttgtctcc tttctattcg gagcggctga 1380
aggaggctca tgtcagactg tacccatcca gccgctgcac atcacaacat ttacttaaca 1440
gaacagtcac cgacaacatg ctgtgtgctg gagacactcg gagcggcggg ccccaggcaa 1500
acttgcacga cgcctgccag ggcgattcgg gaggccccct ggtgtgtctg aacgatggcc 1560
gcatgacttt ggtgggcatc atcagctggg gcctgggctg tggacagaag gatgtcccgg 1620
gtgtgtacac caaggttacc aactacctag actggattcg tgacaacatg cgaccgtgac 1680
caggaacacc cgactcctca aaagcaaatg agatcccgcc tcttcttctt cagaagacac 1740
tgcaaaggcg cagtgcttct ctacagactt ctccagaccc accacaccgc agaagcggga 1800
cgagacccta caggagaggg aagagtgcat tttcccagat acttcccatt ttggaagttt 1860
tcaggacttg gtctgatttc aggatactct gtcagatggg aagacatgaa tgcacactag 1920
cctctccagg aatgcctcct ccctgggcag aaagtggcca tgccaccctg ttttcagcta 1980
aagcccaacc tcctgacctg tcaccgtgag cagctttgga aacaggacca caaaaatgaa 2040
agcatgtctc aatagtaaaa gataacaaga tctttcagga aagacggatt gcattagaaa 2100
tagacagtat atttatagtc acaagagccc agcagggcct caaagttggg gcaggctggc 2160
tggcccgtca tgttcctcaa aagcaccctt gacgtcaagt ctccttcccc tttccccact 2220
ccctggctct cagaaggtat tccttttgtg tacagtgtgt aaagtgtaaa tcctttttct 2280
ttataaactt tagagtagca tgagagaatt gtatcatttg aacaactagg cttcagcata 2340
tttatagcaa tccatgttag tttttacttt ctgttgccac aaccctgttt tatactgtac 2400
ttaataaatt cagatatatt tttcacagtt tttccaaaat cagagtggaa tggttttgtt 2460
atagatgctg tatcccactc tttattcatg ttcacatttt aaaatcattt ggaattctgc 2520
ttcactcgct taacatatac acaacacctg taacatacaa ggcaatgggc taggtgctcc 2580
agaccgggaa aaggagggac aggaatgctt ggtctgatgg gctaatatgg catttagaga 2640
agtaccaagg tacagtggag ccggtcacaa aagggcagac ttgtagtaga attcagttgc 2700
aagagggatt ggggaatctt aaggaaaaaa tagaatctta aggaaaaaat aactgggtga 2760
gacgtggact gtggacaggt gtggaaaagg cactctccat ggaggtatga atatgtagag 2820
ggccaagaga ggggagtaca gggagaaatg agttgagctt gtctgaagtg aacttcagga 2880
agaggaacat aggctggaat ttagattatg ggggctctga acaccaaact gagtttggac 2940
ttaattgact tctg 2954
<210> 4
<211> 473
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> MISC_特征
<223> 组织纤溶酶原激活物NP_001306118.1
<400> 4
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Gln Glu Ile His Ala Arg Phe Arg Arg
20 25 30
Gly Ala Arg Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met
35 40 45
Ile Tyr Gln Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn
50 55 60
Arg Val Glu Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser
65 70 75 80
Val Pro Val Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr
85 90 95
Cys Gln Gln Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu
100 105 110
Gly Phe Ala Gly Lys Cys Cys Glu Ile Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe
115 120 125
Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly
130 135 140
Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr
145 150 155 160
Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn
165 170 175
Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu
180 185 190
Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser
195 200 205
Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly
210 215 220
Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe
225 230 235 240
Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile
245 250 255
Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu
260 265 270
Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg
275 280 285
Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile
290 295 300
Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu
305 310 315 320
Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val
325 330 335
Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp
340 345 350
Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro
355 360 365
Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser
370 375 380
Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn
385 390 395 400
Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu
405 410 415
His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn
420 425 430
Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys
435 440 445
Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu
450 455 460
Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro
465 470

Claims (54)

1.多种缀合物，其中每种缀合物包含：
粒子；
至少一个接头；和
至少一种氨基酸或其类似物，所述至少一种氨基酸或其类似物选自4-(氨基甲基)-环-己烷-甲酸、ε-氨基己酸、赖氨酸、环己烷甲酸和4-甲基-环己烷甲酸；
其中所述多种缀合物包括至少两种不同的缀合物，并且其中所述至少一种接头包含26-(2-羟基-3-甲氧基-丙基氨基)-二十六烷醛，其中所述至少一个接头的一个末端与所述粒子结合，且所述至少一个接头的另一个末端与所述至少一种氨基酸或其类似物结合。
2.根据权利要求1所述的多种缀合物，其中所述至少两种不同的缀合物的所述粒子和/或所述接头是不同的。
3.根据权利要求1所述的多种缀合物，其中所述粒子的平均粒度介于约90μm至约150μm之间。
4.根据权利要求1所述的多种缀合物，其中除包含26-(2-羟基-3-甲氧基-丙基氨基)-二十六烷醛的接头外，所述接头包含具有1个原子至40个原子的线性链。
5.根据权利要求1所述的多种缀合物，其中除包含26-(2-羟基-3-甲氧基-丙基氨基)-二十六烷醛的接头外，所述接头包含至少一个具有孤电子对的原子。
6.根据权利要求1所述的多种缀合物，其中所述粒子是多糖珠粒、玻璃珠粒、棉珠粒、塑料珠粒、尼龙珠粒、乳胶珠粒、磁性珠粒、淀粉珠粒、硅珠粒、砷化镓珠粒、金珠粒或银珠粒中的至少一者。
7.根据权利要求1所述的多种缀合物，其中所述粒子是顺磁性珠粒。
8.根据权利要求1所述的多种缀合物，其中所述粒子是超顺磁性珠粒。
9.根据权利要求1所述的多种缀合物，其中所述粒子是琼脂糖珠粒或琼脂糖凝胶珠粒。
10.根据权利要求6所述的多种缀合物，其中所述塑料珠粒是PTFE珠粒或聚苯乙烯珠粒。
11.根据权利要求1至8中任一项所述的多种缀合物，其为：
其中代表粒子。
12.一种组合物，其包含权利要求1-11中任一项所定义的多种缀合物。
13.一种缀合物，所述缀合物包含粒子、至少一个接头和氨甲环酸，其中所述缀合物是:
其中代表粒子。
14.根据权利要求13所述的缀合物，其中所述粒子是琼脂糖珠粒或琼脂糖凝胶珠粒，并且平均粒度介于约90μm至约150μm之间。
15.一种用于从哺乳动物体液中消耗至少一种纤溶蛋白的设备，所述设备包括：
-壳体，所述壳体具有至少一个流体入口端口和至少一个流体出口端口；
-所述壳体包括至少一个腔室，所述至少一个腔室限定了与所述至少一个流体入口端口和所述至少一个流体出口端口流体连通的控制容积；
-所述控制容积容纳权利要求1至11中任一项所定义的多种缀合物、权利要求12中所定义的组合物和权利要求13-14中任一项所定义的缀合物中的至少一者。
16.一种用于从哺乳动物体液中耗尽至少一种纤溶蛋白的设备，所述设备包括：
-壳体，所述壳体具有至少一个流体入口端口和至少一个流体出口端口；
-所述壳体包括至少一个腔室，所述至少一个腔室限定了与所述至少一个流体入口端口和所述至少一个流体出口端口流体连通的控制容积；
-所述控制容积容纳多组粒子，所述多组粒子至少包括第一组第一粒子和第二组第二粒子；
-其中所述第一粒子在尺寸上不同于所述第二粒子；
-其中所述第一粒子和所述第二粒子中的至少一者是缀合粒子，其中所述缀合粒子由权利要求1至11中任一项所定义的多种缀合物、权利要求12所定义的所述组合物或权利要求13至14中任一项所定义的缀合物定义。
17.根据权利要求16所述的设备，其中所述第一粒子和所述第二粒子是缀合粒子。
18.根据权利要求16或权利要求17所述的设备，其中所述第一粒子和所述第二粒子是4-(氨基甲基)-环-己烷-甲酸缀合粒子。
19.根据权利要求15所述的设备，其中所述壳体包括纵向轴线，并且包括主体部分和一对端盖，所述一对端盖包括具有所述至少一个流体入口端口的入口端盖和具有所述至少一个流体出口端口的出口端盖。
20.根据权利要求19所述的设备，其中所述控制容积是由设定在所述主体部分的相对纵向端的对应屏障构件所限定。
21.根据权利要求20所述的设备，其中所述屏障构件被配置用于防止所述粒子离开所述控制容积。
22.根据权利要求21所述的设备，其中所述屏障构件被配置用于同时允许所述哺乳动物体液穿过所述控制容积流通。
23.根据权利要求21所述的设备，其中所述屏障构件被配置为同时允许所述哺乳动物体液穿过所述控制容积流通，其中在所述设备的使用中，所述哺乳动物体液经由所述入口端盖和所述流体入口端口进入所述控制容积，并且在离开所述控制容积之后，经由所述出口端盖和所述流体出口端口流走。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的设备，其中所述屏障构件各自包括多个开口以允许所述哺乳动物体液穿过所述开口流通，所述开口的大小小于所述粒子的大小。
25.一种用于从哺乳动物体液中耗尽至少一种纤溶蛋白的套组，所述套组包括多个设备，其中每个设备为权利要求15至24中任一项所定义的设备，其中所述多个设备中的所述设备以在所述多个设备的相应所述控制容积之间提供流体连通的方式互连。
26.根据权利要求25所述的套组，其中所述多个设备的至少一部分串联互连，其中对于每对所述串联互连的所述设备，所述对中的一个所述设备的相应所述流体入口端口连接到所述对中的另一个所述设备的相应所述流体出口端口并与其流体连通。
27.根据权利要求25所述的套组，其中所述多个设备的至少一部分并联互连，其中对于所述并联互连的所述设备，相应所述流体入口端口互连并且彼此流体连通，并且其中相应所述流体出口端口彼此互连并且流体连通。
28.根据权利要求25所述的套组，其中所述多个设备的至少一部分并联互连，其中对于所述并联互连的所述设备，相应所述流体入口端口与至少一个供体血浆贮存器连接并流体连通，并且其中相应所述流体出口端口与至少一个接受者血浆贮存器连接并流体连通。
29.一种用于从哺乳动物体液中耗尽至少一种纤溶蛋白的套件，所述套件包括：
-权利要求15至24中任一项所定义的至少一个设备，
-盐水贮存器，所述盐水贮存器与所述至少一个入口端口选择性地流体连通；
-接受者血浆贮存器和洗涤废物贮存器，其中所述接受者血浆贮存器和所述洗涤废物贮存器与所述至少一个流体出口端口选择性地且非同时地流体连通。
30.一种用于从哺乳动物体液中耗尽至少一种纤溶蛋白的系统，所述系统包括：
-权利要求15至24中任一项所定义的至少一个设备，
-盐水贮存器和供体贮存器，其中所述盐水贮存器和所述供体贮存器与所述至少一个流体入口端口选择性地且非同时地流体连通；
接受者血浆贮存器和洗涤废物贮存器，其中所述接受者血浆贮存器和所述洗涤废物贮存器与所述至少一个流体出口端口选择性且非同时流体连通。
31.一种用于从哺乳动物的离体的体液或离体的体液的任何产物中耗尽至少一种纤溶蛋白的方法，所述方法包括以下步骤:
(i)对所述体液进行特异于所述至少一种纤溶蛋白的亲和力耗尽工序；以及
(ii)回收在步骤(i)中获得的所述至少一种纤溶蛋白耗尽的体液；
其中所述亲和力耗尽工序包括使所述体液与有效量的多种缀合物或与包含所述多种缀合物的组合物接触，或将所述体液施加到包含所述多种缀合物或组合物的设备、套组、套件或系统上，其中每种缀合物包含粒子、至少一个接头和至少一种氨基酸或其类似物，其中所述多种缀合物包括至少两种不同的缀合物，其中所述氨基酸或其类似物是4-(氨基甲基)-环-己烷-甲酸、ε-氨基己酸、赖氨酸、环己烷甲酸和4-甲基-环己烷甲酸中的至少一者，并且其中所述至少一种接头包含26-(2-羟基-3-甲氧基-丙基氨基)-二十六烷醛。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述多种缀合物为权利要求1至11中任一项所定义的多种缀合物，所述组合物为权利要求12中所定义的组合物，所述缀合物为权利要求13至14中任一项所定义的缀合物，所述设备为权利要求15-24中任一项所定义的设备，所述套组为权利要求25-28中任一项所定义的套组，所述套件为权利要求29所定义的套件，并且所述系统为权利要求30所定义的系统。
33.根据权利要求31至32中任一项所述的方法，其中所述体液是包含至少一种凝血因子的血液源性产品。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述血液源性产品是全血和血浆中的至少一者。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述血液源性产品是新鲜冷冻血浆(FFP)。
36.根据权利要求33所述的方法，其中所述血液源性产品是富血小板血浆(PRP)。
37.根据权利要求33所述的方法，其中所述血液源性产品是冷沉淀物。
38.根据权利要求31至32中任一项所述的方法，其中所述纤溶蛋白是纤溶酶原和组织纤溶酶原激活物(tPA)中的至少一者。
39.根据权利要求31至32中任一项所述的方法，其中所述方法还包括通过确定所述纤溶蛋白耗尽的体液中的凝结时间和总凝块裂解时间中的至少一者来测量在步骤(ii)中回收的所述纤溶蛋白耗尽的体液中的纤溶酶原的量的步骤。
40.根据权利要求31至32中任一项所述的方法，所述方法用于制备至少一种具有降低的纤溶活性的血液源性产品。
41.根据权利要求31至32中任一项所述的方法，所述方法用于从有需要的受试者的体液中耗尽至少一种纤溶蛋白。
42.一种用于通过体外工序从有需要的受试者的体液中耗尽至少一种纤溶蛋白的装置，所述装置包括:
(i)用于将所述受试者的体液转移到体外装置中的第一模块；
(ii)用于对所述体液进行特异于至少一种纤溶蛋白的亲和力耗尽工序的第二模块，其中所述耗尽是在血液被转移到所述装置中和从所述装置中转移出之前、期间或之后执行的，从而获得了所述受试者的至少一种纤溶蛋白被耗尽的体外体液；以及
(iii)用于将在步骤(ii)中获得的所述体液重新引入或返回所述受试者体内的第三模块；
其中所述亲和力耗尽工序包括使所述体液与有效量的包含在所述体外装置内或包含在连接到所述体外装置的设备、套组、套件或系统内的多种缀合物或其组合物接触，其中每种缀合物包含粒子、至少一个接头和至少一种氨基酸或其类似物，其中所述多种缀合物包括至少两种不同的缀合物，其中所述氨基酸或其类似物是4-(氨基甲基)-环-己烷-甲酸、ε-氨基己酸、赖氨酸、环己烷甲酸和4-甲基-环己烷甲酸中的至少一者，并且其中所述至少一种接头包含26-(2-羟基-3-甲氧基-丙基氨基)-二十六烷醛。
43.根据权利要求42所述的装置，其中所述多种缀合物是权利要求1至11中任一项所定义的多种缀合物，所述组合物是权利要求12中所定义的组合物，所述缀合物是权利要求13至14中任一项所定义的缀合物，所述设备是权利要求15-24中任一项所定义的设备，所述套组是权利要求25-28中任一项所定义的套组，所述套件是权利要求29所定义的套件，并且所述系统是权利要求30所定义的系统。
44.根据权利要求42至43中任一项所述的装置，其中所述体液是全血和血浆中的至少一者。
45.根据权利要求42至43中任一项所述的装置，其中所述至少一种纤溶蛋白是纤溶酶原和组织纤溶酶原激活物中的至少一者。
46.根据权利要求42至43中任一项所述的装置，其中所述装置还包括用于从所述多种缀合物或组合物或缀合物回收纤溶酶原和组织纤溶酶原激活物中的至少一者的第四模块。
47.一种具有降低的纤溶活性的血液源性产品，其中所述产品是通过由权利要求31至41中任一项所限定的方法制备的，所述产品适合用于治疗、预防、防治、改善、抑制有需要的受试者的出血、止血病症和与其相关的任何出血或病理疾患。
48.根据权利要求47所述的产品，其中所述止血病症是遗传性出血病症或获得性出血病症。
49.根据权利要求48所述的产品，其中所述遗传性出血病症是由缺乏至少一种凝血因子和不确定的出血倾向中的至少一者引起的病症。
50.根据权利要求49所述的产品，其中所述缺乏至少一种凝血因子是缺乏凝血酶原的因子XI、因子X、因子V、因子VII、因子II和纤维蛋白原的因子I中的至少一者。
51.根据权利要求48所述的产品，其中所述获得性出血病症是手术引起的出血、创伤引起的出血、急性胃肠出血、与烧伤相关的出血、出血性卒中、由于肺气肿和COPD引起的肺损伤、与分娩相关的出血和由纤溶治疗或溶栓治疗引起的出血中的至少一者。
52.根据权利要求51所述的产品，其中所述手术引起的出血是由小手术或大手术引起的出血。
53.根据权利要求52所述的产品，其中所述大手术是心脏直视手术或肝移植手术中的至少一者。
54.根据权利要求48所述的产品，其中所述获得性出血病症是由纤溶治疗或溶栓治疗引起的出血。
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