KR100602807B1 - 단백질의 분비 생산 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 코리네형 세균에 산업상 유용한 이종 단백질을 효율적으로 분비 생산함으로써 이종 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명에서는 코리네형 세균 유래의 시그날 펩타이드 영역을 암호화하는 서열의 하류에 목적 이종 단백질 유전자 서열을 결합한 발현 작제물을 사용하고, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869와 비교하여 2배 이상의 당해 이종 단백질을 분비하는 능력을 갖는 코리네형 세균 변이주에 이러한 발현형 유전자 작제물이 도입되며, 형질전환 코리네형 세균이 배양되고 균체외로 방출된 이종 단백질이 회수된다.
이종 단백질, 프로트랜스글루타미나제, 코리네형 세균, 시그날 펩타이드, 세포 표층 단백질

Description

단백질의 분비 생산 방법{Method for the secretion and production of protein}
본 발명은 이종 단백질을 코리네형 세균으로 효율적으로 분비 생산하는 방법에 관한 것이다.
이종 단백질의 분비 생산은 지금까지 바실러스(Bacillus)속 세균에 의한 분비 생산의 총설[참고문헌: Microbiol. rev., 57, 109-137(1993)], 메탄올 자화성 효모 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)에 의한 분비 생산의 총설[참고문헌: Biotechnol., 11, 905-910(1993)], 그리고 아스퍼질러스(Aspergillus)속의 곰팡이에 의한 공업적 생산의 보고[참고문헌: Biotechnol., 6, 1419-1422(1988); Biotechnol., 9, 976-981(1991)] 등과 같이 다수 보고되어 있다.
본 발명의 하나의 실시 양태에서 분비 생산되는 트랜스글루타미나제는 단백질의 펩타이드쇄 내에 있는 γ-카복시아미드 그룹의 아실 전이반응을 촉매하는 효소이다. 본 효소를 단백질에 작용시키면 ε-(γ-Glu)-Lys 가교 형성반응, Gln의 탈아미드화에 의한 Glu에서의 치환반응이 일어날 수 있다. 이러한 트랜스글루타미나제는 젤리 등의 겔화 식품, 요구르트, 치즈 또는 겔상 화장품 등의 제조 및 식육의 육질 개선 등에 이용되고 있다[참고문헌: 일본 특허공보 제(평)1-50382호]. 또 한, 열에 안정한 미세캡슐의 제조 물질, 고정화 효소의 담체 등의 제조에 사용되는 등의 산업상 이용성이 높은 효소이다.
트랜스글루타미나제는 지금까지 동물 유래의 것과 미생물 유래의 것(마이크로바이알 트랜스글루타미나제:"MTG"로서 후술됨)이 공지되어 있다. 동물 유래의 트랜스글루타미나제는 칼슘이온 의존성 효소이고, 동물의 장기, 피부, 혈액 등에 분포하고 있다. 예를 들면, 기니아 피그 간장 트랜스글루타미나제[참고문헌: K. Ikura et al. Biochemistry 27, 2898(1988)], 사람 표피 케라틴 세포 트랜스글루타미나제[참고문헌: M.A. Phillips et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9333(1990)], 사람 혈액 응고인자XIII[참고문헌: A. Ichinose et al. Biochemistry 25, 6900(1990)] 등이 있다.
미생물 유래의 트랜스글루타미나제는 스트렙토베르티실리움(Streptoverticillium)속의 균으로부터 칼슘 비의존성인 것이 발견되었다. 예를 들면, 스트렙토베르티실리움 그리세오카르늄(Streptoverticillium griseocarneum) IFO 12776, 스트렙토베르티실리움 시나모늄(Streptoverticillium cinnamoneum sub sp. cinnamoneum)(이후, 에스. 시나모늄으로 약칭하는 경우가 있다) IF0 12852, 스트렙토베르티실리움 모바라엔스(Streptoverticillium mobaraense)(이후, 에스. 모바라엔스로 약칭하는 경우가 있다) IFO 13819 등을 들 수 있다[참고문헌: 일본 공개특허공보 제(소)64-27471호]. 이들 미생물이 생산하는 트랜스글루타미나제의 1차 구조는 펩타이드 맵핑 및 유전자 구조분석의 결과, 동물 유래의 것과는 전혀 상동성을 갖지 않는 것으로 판 명되었다[참고문헌: 유럽 공개특허공보 0 481 504 A1].
미생물 유래의 트랜스글루타미나제(MTG)는 균류 등의 배양물로부터 정제조작을 통하여 제조되므로, 공급량, 효율 등에서 문제가 있다. 또한, 유전공학적 방법에 의한 트랜스글루타미나제의 제조도 시도되고 있다. 트랜스글루타미나제 단백질 및 이의 유전자는 예를 들면, 문헌[참고문헌: Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 82-87(1994), Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 88-92(1994), Biochimie, 80, 313-319(1998)., Eur. J. Biochem., 257, 570-576(1998), W0 96/06931, W0 96/22366] 등에 보고되어 있고, 이들은 예를 들면, 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans), 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 등의 숙주 벡터계에서 발현 생산에 관한 보고가 이루어지고 있다. 이들 정보와 함께 이 콜라이, 효모 등의 미생물에서의 분비 발현[참고문헌: 일본 공개특허공보 제(평) 5-199883호]에 의한 방법 및 이. 콜라이에서 MTG를 불활성 융합 단백질 봉입체로서 발현시킨 다음, 이러한 봉입체를 단백질 변성제로 가용화하며 탈변성제 처리를 통하여 재생시킴으로써 활성 MTG를 생산하는 방법[참고문헌: 일본 공개특허공보 제(평)6-30771호]이 보고되어 있다. 그러나 이. 콜라이 또는 효모 등의 미생물에 의한 이러한 분비 발현에서는 이의 발현량이 대단히 적다는 문제점이 지적된다.
한편, 코리네형 세균을 이용하여 이종 단백질을 효율적으로 분비 생산하기 위한 연구는 지금까지 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)(이후, 씨. 글루타미쿰으로 약칭하는 경우가 있다)에 의한 뉴클레아제 및 리파제의 분비[참고문헌: US 4965197, J. Bacteriol., 174, 1854-1861(1992)] 및 서브틸리신(subtilisin) 등의 프로테아제의 분비[참고문헌: Appl. Environ. Microbiol., 61, 1610-1613(1995)], 코리네형 세균의 세포 표층 단백질의 분비에 관한 연구[참고문헌: 일본 국제공개특허공보 제(평)6-502548호], 이 연구를 이용하는 피브로넥틴 결합 단백질의 분비[참고문헌: Appl. Environ. Microbiol., 63, 4392-4400(1997)], 변이형 분비장치를 이용하여 단백질 분비를 향상시킨 보고[참고문헌: 일본 공개특허공보 제(평)11-169182호] 등이 있지만 극히 한정된 단백질에 관해서 매우 소수의 보고가 있을 뿐이다. 단백질의 축적량에 있어서, 문헌[참고문헌: Appl. Environ. Microbiol., 61, 1610-1613(1995)]에서 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 서브틸리신 유전자(aprE)의 프로모터, 리보솜 결합부위 및 시그날 펩타이드의 서열을 이용하여 디켈로박터 노도서스(Dichelobacter nodosus) 유래의 알칼리성 프로테아제의 유전자를 씨. 글루타미쿰에서 발현시키고 약 2.5mg/ml의 축적을 확인한 예는 있지만, US 4965197, 일본 국제공개특허공보 제6-502548호 또는 일본 공개특허공보 제(평)11-169182호의 기재에서는 구체적인 분비 축적의 값이 기재되어 있지 않으며 또한, 피브로넥틴 결합 단백질의 분비[참고문헌: Appl. Environ. Microbiol., 63, 4392-4400(1997)]에서는 최대 약 2.5μg/ℓ라는 대단히 소량의 분비 축적이 확인되어 있는 것에 불과하다. 이와 같이 이종 단백질을 실용적인 수준에서 효율적으로 배지중에 축적시킨다는 보고는 아직 없다.
또한, 코리네형 세균의 유전자 조작기술은 원형질체에 의한 형질전환법의 확 립[참고문헌: J. Bacteriol., 159, 306-311(1984); J. Bacteriol., 161, 463-467(1985)], 각종 벡터의 개발[참고문헌: Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984); J. Bacteriol., 159, 306-311(1984); J. Gen. Microbiol., 130, 2237-2246(1984); Gene, 47, 301-306(1986); Appl. Microbiol. Biotechnol., 31, 65-69(1989)], 유전자 발현제어법의 개발[참고문헌: Bio/Technology, 6, 428-430(1988)] 및 플라스미드의 개발[참고문헌: Gene, 39, 281-286(1985)] 등의 플라스미드 및 파지를 사용하는 시스템에서 발전하고 있다. 또한 코리네형 세균 유래의 유전자 클로닝[참고문헌: Nucleic Acids Res., 14, 10113-1011(1986); J. Bacteriol., 167, 695-702(1986); Nucleic Acids Res., 15, 10598(1987); Nucleic Acids Res., 15, 3922(1987); Nucleic Acids Res., 16, 9859(1988); Agric. Biol. Chem., 52, 525-531(1988); Mol. Microbiol., 2, 63-72(1988); Mol. Gen. Genet., 218, 330-339(1989); Gene, 77, 237-251(1989)]에 대해서도 보고되어 있다.
또한 코리네형 세균 유래의 전이인자에 대해서도 보고되어 있다[참고문헌: WO 93/18151; EP 0445385; 일본 공개특허공보 제(평)6-46867; Mol. Microbiol., 11, 739-746(1994); Mol. Microbiol., 14, 571-581(1994); Mol. Gen. Genet., 245, 397-405(1994); FEMS Microbiol. Lett., 126, 1-6(1995); 일본 공개특허공보 제(평)7-107976].
전이인자는 염색체상에서 전이할 수 있는 DNA 단편이고, 원핵생물로부터 진핵생물까지 넓은 범위의 생물에 존재하는 것으로 공지되어 있다. 전이인자를 이용하는 트랜스포존이 개발되어 있으며[참고문헌: W0 93/18151; 일본 공개특허공보 제(평)7-107976호; Mol. Gen. Genet., 245, 397-405(1994); 일본 공개특허공보 제(평)9-70291호], 트랜스포존으로 이종 유전자를 발현시킬 수 있게 되었다.
발명의 개시
본 발명의 목적은 코리네형 세균으로 산업상 유용한 이종 단백질, 예를 들어 트랜스글루타미나제를 생산하고, 이를 효율적으로 균체외로 분비(분비 생산)시킴으로써 이종 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 코리네형 세균을 사용하여 이종 단백질을 생산할 때, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869와 비교하여 현저하게 높은 생산 능력을 나타내는 변이주를 발견하고 산업상 유용한 이종 단백질을 효율적으로 분비 생산하는 방법을 발명하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869와 비교하여 2배 이상의 이종 단백질을 분비하는 능력을 갖는 코리네형 세균 변이주에 코리네형 세균 유래의 시그날 펩타이드의 하류에 이종 단백질이 접속된 융합 단백질을 생성시키고 당해 이종 단백질을 균체외로 분비시키는 것을 특징으로 하는, 이종 단백질의 제조방법이다.
보다 구체적으로는, 본 발명은 코리네형 세균 유래의 시그날 펩타이드 영역, 특히 세포 표층 단백질의 시그날 펩타이드 영역을 암호화하는 서열의 하류에 목적 단백질 유전자 서열을 결합한 발현 작제물을 코리네형 세균에 도입하여 수득된 형질전환 코리네형 세균을 배양하고, 생산된 단백질을 균체외로 효율적으로 분비시켜 균체외로 방출된 단백질을 회수함으로써 다량의 목적하는 이종 단백질, 예를 들어 트랜스글루타미나제를 수득하는 방법이다.
또한, 본원에 사용된 바와 같이 단백질 또는 펩타이드가 "분비"된다는 것은 단백질 또는 펩타이드 분자가 세균 균체외(세포외)로 이송된다는 것을 나타내고, 최종적으로 이러한 단백질 또는 펩타이드 분자가 배지중에 완전하게 유리 상태로 존재하는 경우 뿐만 아니라 일부만이 균체외에 존재하는 경우 및 균체 표층에 존재하는 경우도 포함한다.
발명을 실시하기 위한 최선의 양태
본 발명의 방법에 따라 코리네형 세균이 숙주 벡터계로서 사용되고, 코리네형 세균의 세포 표층 단백질의 시그날 펩타이드의 하류에 목적 단백질 유전자를 결합한 발현 작제물이 작제되고, 이 작제물이 코리네형 세균내에 도입되어 발현되어 균체외로 분비된 다량의 목적 단백질이 수득된다. 본 발명의 방법으로 분비 생산된 이종 단백질은 산업상 유용한 효소, 생리활성 단백질 및 펩타이드 등이고, 본 발명의 실시 양태의 하나에서 분비 생산되는 트랜스글루타미나제는 식품가공, 약제 제조 등에 폭넓게 사용되고 있다.
분비형 단백질은 일반적으로 프리펩타이드 또는 프리프로펩타이드로서 해독되고, 이후 성숙형 단백질로 되는 것이 공지되어 있다. 즉, 일반적으로 프리펩타이드 또는 프리프로펩타이드로서 해독된 다음, 시그날 펩타이드("프리 부분")가 절단되어 성숙 펩타이드 또는 프로펩타이드로 변환되며, 프로펩타이드는 프로테아제 에 의해 다시 프로-부분이 절단되어 성숙 펩타이드로 되는 것이 공지되어 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "시그날 서열"은 분비성 단백질 전구체의 N-말단에 존재하고, 또한 천연 성숙 단백질에는 존재하지 않는 서열을 나타내며, "시그날 펩타이드"는 이러한 단백질 전구체로부터 절단된 펩타이드를 나타낸다. 일반적으로 시그날 서열은 균체외로의 분비에 따라 프로테아제(일반적으로 시그날 펩티다제라고 호칭된다)에 의해 절단된다. 이러한 시그날 펩타이드는 생물종을 초월하여 일정한 공통된 서열상의 특징을 갖지만 어떤 생물종으로 분비기능을 나타내는 시그날 펩타이드가 다른 생물종에서도 반드시 분비기능을 발휘한다는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, 시그날 펩타이드 및 프로-부분의 양쪽을 갖는 단백질, 즉 1차 해독 산물을 "프리프로 단백질"이라고 나타낼 수 있고, 또한, 시그날 펩타이드를 갖지 않지만 프로-부분을 갖는 단백질을 "프로 단백질"이라고 나타낼 수 있다. 프로 단백질의 프로-부분은 "프로-구조부" 또는 단순히 "프로-구조"라고 나타낼 수 있고, 본원에 사용된 바와 같이, 단백질의 "프로-구조부/프로-구조"와 단백질의 "프로-부분"은 호환적으로 사용된다. 프리프로 단백질 또는 프리 단백질에서, 당해 시그날 펩타이드는 상이한 단백질 유래일 수 있거나, 목적 단백질에 천연으로 존재하는 시그날 펩타이드일 수 있고, 사용하는 숙주의 분비형 단백질 유래가 바람직하다. 또는 사용하는 숙주의 코돈 사용 빈도에 따라 최적인 코돈을 갖도록 변형할 수 있다.
또한 본 발명의 목적에 사용할 수 있는 시그날 펩타이드는 이로부터 유래하는 천연 성숙 단백질의 N-말단 아미노산 서열을 일부 함유할 수 있다. 시그날 펩 타이드가 상이한 단백질 유래인 경우, 프리프로 단백질을 특히 "이종 융합 프리프로 단백질"이라고 칭할 수 있다. 예를 들면, 단백질이 트랜스글루타미나제인 경우, 각각 "프리프로트랜스글루타미나제", "프로트랜스글루타미나제" 및 "이종 융합 프리프로트랜스글루타미나제"라고 나타낸다. 또한, "프로-부분을 절단한" 단백질은 펩타이드 결합을 절단함으로써 프로-부분을 구성하는 하나 이상의 아미노산을 제거한 단백질을 나타내고, 이의 N-말단 영역이 천연 성숙형 단백질과 완전하게 일치하는 단백질 및 이러한 단백질의 활성을 갖는 한, 천연 단백질과 비교하여 N-말단에 프로-부분 유래의 하나 이상의 여분의 아미노산을 갖는 단백질 및 천연 성숙형 단백질보다 아미노산 서열이 짧은 단백질도 포함된다.
지금까지 코리네형 세균을 사용하여 이종 단백질을 균체외로 분비 생산한 예는 종래의 기술의 항에 기재된 바와 같이 매우 적고, 기술로서도 미완성이다. 또한 코리네형 세균이 스스로 균체외로 프로테아제 등의 단백질을 분비하고 있다는 예는 공지되어 있지 않으며, 내인성 DNase의 분비[US 4965197]와 본 발명에서 사용하는 세포 표층 단백질[일본 국제공개특허공보 제(평)6-502548호]이 세포 표층에서 벗겨져 떨어져서 균체외에서 발견되고 있는 사실이 공지되어 있는 예이다. 단, 코리네형 세균의 분비 관련 시그날 펩타이드는 세포 표층 단백질을 제외하고는 지금까지 공지되어 있지 않다. 지금까지 공지되어 있는 코리네형 세균의 세포 표층 단백질로서는 코리네박테리움 글루타미쿰의 세포 표층 단백질인 PS1 및 PS2의 유전자[일본 국제공개특허공보 제(평)6-502548] 및 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)(이후, 씨. 암모니아게네스라고 약 칭하는 경우가 있다)의 세포 표층 단백질인 SlpA의 유전자[일본 공개특허공보 제(평)10-108675호]가 공지되어 있을 뿐이다. 이들 단백질 중에서 PS1과 SlpA는 약간의 상동성(약 30%)이 확인되지만 그외에는 거의 상동성은 확인되지 않으며 시그날 서열 영역에 관해서도 서로 상동성은 확인되어 있지 않다. 시그날 서열의 예로서 코리네박테리움 글루타미쿰의 PS1과 PS2의 시그날 서열을 서열번호 1 및 2, 코리네박테리움 암모니아게네스의 SlpA의 시그날 서열을 서열번호 3에 기재한다.
따라서, 본 발명자들은 코리네박테리움 글루타미쿰[구명칭: 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum)] ATCC 13869 균주에서 PS2 단백질 유전자를 클로닝하여 이의 서열을 결정하였고, 시그날 서열 영역에는 공지된 씨. 글루타미쿰 유래의 서열[일본 국제 공개특허공보 제(평)6-502548호]과의 차이가 확인되지 않았지만 성숙형 세포 표층 단백질의 N-말단 아미노산의 38 잔기까지 2개의 차이가 확인되었다(공지된 서열에서는 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열에서 40 잔기째의 Asn이 Thr, 55 잔기째의 Glu가 Gly로 되어 있다). 이러한 시그날 서열의 30개의 아미노산 잔기 및 성숙형 세포 표층 단백질의 38개 N-말단 아미노산 잔기를 포함하는 68개 잔기를 암호화하는 염기서열 및 프로모터 영역을 포함하는 이의 5'-상류 영역을 서열번호 4, 아미노산 서열을 서열번호 5에 기재한다.
이어서, 본 발명자는 코리네형 세균에서 다량의 이종 단백질을 균체외로 분비 생산할 수 있는지 여부를 측정하기 위해 세포 표층 단백질의 프로모터 영역 또는 시그날 펩타이드를 포함하는 영역을 사용하여 이종 단백질의 분비를 연구하였다.
방선균 유래의 트랜스글루타미나제 유전자는 GC 함량이 높고, 코리네형 세균도 여기에 근접하며 코돈 이용성도 근사하므로 방선균 유전자 그 자체가 그대로 이용될 수 있는 이점이 있다. 그래서 본 발명자는 방선균 유래의 트랜스글루타미나제 유전자를 그대로 이용할 수 있는지 여부를 검토한 결과, 방선균 유래의 트랜스글루타미나제의 시그날 펩타이드는 코리네형 세균에서는 작용하지 않는 것이 명백하였다. 그러나, 코리네형 세균 유래의 세포 표층 단백질의 시그날 펩타이드와 융합한 방선균 유래의 프로-구조부를 포함하는 성숙 단백질을 암호화하는 트랜스글루타미나제 유전자는 그대로 효과적으로 기능하며 프로-구조부를 갖는 프로 단백질로서 효율적으로 균체외로 분비되는 것이 명백해졌다. 또한, 세포 표층 단백질의 시그날 펩타이드 30개 아미노산 잔기와 성숙 세포 표층 단백질의 N-말단 부분의 38개 아미노산 잔기를 여분으로 포함하는 즉, 성숙 세포 표층 단백질의 N-말단 부분이 융합된 프로-구조부 부착 트랜스글루타미나제 유전자를 사용하면 프로트랜스글루타미나제의 균체외 분비 효율이 보다 증대되는 것으로 나타났다.
본원에 사용된 바와 같이, 코리네형 세균은 호기성의 그램 양성 간균이고, 종래에는 브레비박테리움속으로 분류되었지만 현재 코리네박테리움속에 통합된 세균을 포함하고[참고문헌: Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991)], 코리네박테리움속과 상당히 가까운 브레비박테리움속 세균을 포함한다. 코리네형 세균을 사용하는 것의 잇점은 지금까지 이종 단백질 분비에 적절하다고 공지된 곰팡이, 효모 또는 바실러스속 세균과 비교하여 원래 균체외로 분비되는 단백질이 매우 적으며 이종 단백질을 분비 생산하는 경우에 정제과정이 간략화, 생략화될 수 있고, 당, 암모니아 또는 무기염 등의 단순 배지에서 잘 생육하며 배지 비용이나 배양방법, 배양 생산성에서 우수하다는 것이다.
본 발명에서 숙주균으로서 사용할 수 있는 코리네형 세균으로서는 L-글루탐산 생산균으로 대표되는 브레비박테리움 사카로리티쿰(Brevibacterium saccharolyticum) ATCC 14066, 브레비박테리움 임마리오필룸(Brevibacterium immariophilum) ATCC 14068, 브레비박테리움 락토퍼멘툼(코리네박테리움 글루타미쿰) ATCC 13869, 브레비박테리움 로세움(Brevibacterium roseum) ATCC 13825, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum)(코리네박테리움 글루타미쿰) ATCC 14067, 코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC 13870, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032, 코리네박테리움 릴리움(Corynebacterium lilium)(코리네박테리움 글루타미쿰) ATCC 15990, 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes)(코리네박테리움 암모니아게네스) ATCC 6871 등의 야생주 또는 이의 변이주에서 유도되는 변이주이며 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869와 비교하여 2배 이상의 이종 단백질을 분비하는 능력을 갖는 변이주이다.
본 발명의 변이주로는 예를 들면, 글루탐산 생산성을 상실한 변이주, 라이신 등의 아미노산 생산 변이주 및 이노신 등의 핵산과 같은 다른 물질을 생산하는 변이주도 포함된다. 본 발명의 변이주는 자외선 조사 또는 N-메틸-N'-니트로소구아니딘 등의 화학 변이제로의 처리 후, 단백질의 분비 생산 능력이 높아진 주를 선택함으로써 수득할 수 있다.
특히, 야생주 코리네박테리움 글루타미쿰(씨. 글루타미쿰) ATCC 13869에서 스트렙토마이신(Sm) 내성 변이주로서 분리한 코리네박테리움 글루타미쿰 AJ 12036(FERM BP-734)(1984년 3월26일 원기탁)(현, 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터; 일본국 쓰쿠바시 히가시 1-1-1 츄오 제6, 우편번호 305-8566)은 이의 친주(야생주)와 비교하여 단백질 분비에 관계하는 기능 유전자에 변이가 존재하는 것으로 예측되며 이종 단백질의 분비 생산 능력이 최적 배양조건하에 축적량으로서 약 2 내지 3배로 매우 높고 숙주균으로서 적절하다. 또한, 이러한 균주로부터 세포 표층 단백질을 생산하지 않도록 변형한 균주를 숙주로서 사용하는 경우, 배지중에 분비된 이종 단백질의 정제가 용이해지고 특히 바람직하다. 이러한 변형은 돌연변이 또는 유전자 재조합법에 의해 염색체 위의 세포 표층 단백질 또는 이의 발현 조절영역내에 변이를 도입함으로써 실시할 수 있다.
본 발명에 사용되는 유전자 작제물은 일반적으로 프로모터, 적절한 시그날 펩타이드를 암호화하는 서열 및 목적 단백질을 암호화하는 핵산 단편 및 코리네형 세균중에 목적 단백질 유전자를 발현시키기 위해 필요한 조절 서열(오퍼레이터 또는 터미네이터 등)을 이들이 기능할 수 있도록 적절한 위치에 갖는다. 목적 단백질은 N-말단에 프로-구조부를 가질 수 있다. 이러한 작제물을 위해 사용할 수 있는 벡터는 특별히 제한되지 않으며 코리네형 세균에서 기능할 수 있는 임의의 벡터, 플라스미드와 같이 염색체외에서 자율증식하는 벡터 또는 세균 염색체내에 편입되는 벡터일 수 있다. 코리네형 세균 유래의 플라스미드가 특히 바람직하다. 이들은 예를 들면, pHM1519[참고문헌: Agric, Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)], pAM330[참고문헌: Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)] 및 이들을 변형시킨 약제 내성 유전자를 갖는 플라스미드를 포함한다.
또한, 인공 트랜스포존 등도 사용할 수 있다. 트랜스포존이 사용되는 경우, 상동 재조합 또는 그 자신의 전이 능력에 의해 목적 유전자가 염색체내 도입된다.
본 발명에 사용할 수 있는 프로모터는 특별히 한정되지 않으며 코리네형 세균의 균체내에서 기능할 수 있는 프로모터이면 일반적으로 사용할 수 있고, 이종 유래의, 예를 들어 tac 프로모터 등의 이. 콜라이 유래의 프로모터일 수 있다. 이중에서 tac 프로모터 등의 강력한 프로모터가 보다 바람직하다.
코리네형 세균 유래의 프로모터로는 예를 들면, 세포 표층 단백질의 PS1, PS2 및 SlpA의 유전자의 프로모터, 각종 아미노산 생합성계, 예를 들어 글루탐산 생합성계의 글루탐산 탈수소효소 유전자, 글루타민 합성계의 글루타민 합성효소 유전자, 라이신 생합성계의 아스파르토키나제 유전자, 트레오닌 생합성계의 호모세린 탈수소효소 유전자, 이소루신 및 발린 생합성계의 아세토하이드록실레이트 합성효소 유전자, 루신 생합성계의 2-이소프로필말레이트 합성효소 유전자, 프롤린 및 아르기닌 생합성계의 글루타메이트 키나제 유전자, 히스티딘 생합성계의 포스포리보실-ATP 피로포스포릴라제 유전자, 트립토판, 티로신 및 페닐알라닌 등의 방향족 아미노산 생합성계의 데옥시아라비노헵트론산 포스페이트(DAHP) 합성효소 유전자, 이노시네이트 및 구아닐레이트와 같은 핵산 생합성계에서 포스포리보실 피로포스페이트(PRPP) 아미도트랜스퍼라제 유전자, 이노신산 탈수소 효소 유전자 및 구아닐산 합성효소 유전자의 프로모터를 들 수 있다.
본 발명에서 사용하는 시그날 펩타이드는 숙주인 코리네형 세균의 분비성 단백질의 시그날 펩타이드이고, 바람직하게는 코리네형 세균의 세포 표층 단백질의 시그날 펩타이드이다. 코리네형 세균의 세포 표층 단백질로는 씨. 글루타미쿰 유래의 PS1 및 PS2[일본 국제 공개특허공보 제(평)6-502548호] 및 씨. 암모니아게네스 유래의 SlpA[일본 공개특허공보 제(평)10-108675호]를 들 수 있다. PS1의 시그날 펩타이드의 아미노산 서열을 서열번호 1, PS2의 시그날 펩타이드의 아미노산 서열을 서열번호 2, SlpA의 시그날 펩타이드의 아미노산 서열을 서열번호 3에 기재한다. 또한, 미국 특허 제4965197호에 의하면 코리네형 세균 유래의 DNase에도 시그날 펩타이드가 있다고 보고되었고, 이러한 시그날 펩타이드도 본 발명에서 사용할 수 있다.
시그날 펩타이드에는 이것이 유래하는 분비성 단백질의 N-말단 아미노산 서열의 일부가 부가될 수 있다. 시그날 서열은 해독 산물이 균체외로 분비되는 동안 시그날 펩티다제에 의해 절단된다. 또한, 시그날 펩타이드를 암호화하는 유전자는 천연형 그대로 사용하거나 숙주의 코돈 사용빈도에 따라서 최적 코돈을 갖도록 변형할 수 있다.
이들 시그날 펩타이드를 사용하는 경우, 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자는 시그날 펩타이드를 암호화하는 유전자의 3'-말단 영역에 결합되고, 상기 프로모터에 의해 발현 조절을 받도록 위치시킨다.
본 발명에 따라 분비 생산할 수 있는 유용한 단백질은 본질적으로는 동식물 및 미생물 유래의 분비형 단백질 모두가 포함되지만 이에 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 프로테아제, 엔도펩티다제, 엑소펩티다제, 아미노펩티다제, 카복시펩티다제, 콜라게나제 및 키티나제 등의 단백질을 본 발명에 따라 분비 생산할 수 있다. 본 발명에 따라 분비 생산되는 단백질은 천연 분비형 단백질이 바람직하고, 보다 바람직하게는 프로-구조부가 부가된 단백질이며, 트랜스글루타미나제가 본 발명에 따라 분비 생산되는 유용한 단백질로서 특히 바람직하다. 트랜스글루타미나제 유전자로는 방선균, 예를 들면, 에스. 모바라엔스 IFO 13819, 에스. 시나모늄 IFO 12852, 스트렙토베르티실리움 그리세오카르늄(Streptoverticillium griseocarneum) IFO 12776, 스트렙토마이세스 리디쿠수(Streptomyces lydicus)[W0 9606931] 등 및 오마이세테스(0omycetes)[WO 9622366] 등의 곰팡이 등의 분비형 트랜스글루타미나제 유전자를 본 발명의 목적에 이용할 수 있다. 이들 단백질을 암호화하는 유전자는, 사용하는 숙주에 따라서 및 목적하는 활성을 수득하기 위해 변형할 수 있고, 이들에는 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실, 치환 등이 포함되며 필요에 따라 숙주의 코돈 사용빈도에 따라서 최적 코돈으로 전환할 수 있다.
프리프로펩타이드로서 천연으로 발현되는 단백질을 본 발명에 따라 분비 생산하는 경우, 프로-구조부(프로-부분)를 포함하는 프로 단백질을 암호화하는 유전자 단편 사용이 특히 바람직하지만 필수적인 것은 아니다. 프로 단백질을 암호화하는 유전자를 사용하는 경우, 이러한 유전자의 발현에 의해 수득되는 단백질의 프로-구조부는 적절한 방법, 예를 들어, 프로테아제로 절단할 수 있는 아미노펩티다제, 적절한 위치에서 절단하는 엔도펩티다제 또는 보다 특이적인 프로테아제를 사용할 수 있지만, 그 결과 수득되는 단백질이 천연 단백질과 동등하거나 그 이상의 활성을 갖도록 하는 위치에서 절단하는 프로테아제가 바람직하다. 또는 목적 단백질 또는 목적 단백질의 프로-구조부를 암호화하는 유전자 서열을 변형하여 목적하는 위치에 특이적인 프로테아제의 인식부위를 갖는 단백질을 발현하도록 설계할 수 있다. 이러한 변형 기술, 유전자 클로닝 기술 및 생산된 단백질의 검출 기술을 포함하는 일반적인 분자생물학적 방법은 당해 기술분야 숙련가에게 익히 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌[참고문헌: Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, DNA cloning: A Practical Approach, Volumes I and II(D.N. Glover ed. 1985), F.M. Ausubel et al.(eds), Current Protocols in Molecular biology, John Wiley & Sons, Inc.(1994), PCR Technology: Principles and Application for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press] 등을 참조할 수 있다.
본 발명에 따라 최종적으로 수득되는 단백질의 N-말단 영역은 반드시 천연 단백질과 동일한 것은 아니고, 하나 내지 수개의 아미노산을 여분으로 부가하거나 결실한 것일 수 있다. 프로테아제를 사용하는 경우에는 당해 단백질의 활성이라는 관점에서 일반적으로는 천연 단백질과 거의 동일한 위치에서 절단되는 것이 바람직하고 천연의 것과 동일한 성숙 펩타이드인 것이 보다 바람직하다. 따라서, 일반적으로 천연 발생의 성숙 단백질과 동일한 단백질을 생성시키는 위치에서 프로펩타이드를 절단하는 특이적 프로테아제가 가장 바람직하다. 그러나 특정 목적을 위해서, 천연 단백질과 비교하여 N-말단에서 아미노산 하나 내지 수개 잔기의 긴 또는 짧은 펩타이드가 보다 적절한 활성을 가질 수 있다. 이러한 프로테아제로는 시판중인 디스파제(Dispase)(Boehringer Manheim Co.사) 및 미생물의 배양액, 예를 들면, 방선균의 배양액 등으로부터 수득되는 프로테아제를 포함된다. 이러한 프로테아제는 미정제 상태에서 사용할 수 있고, 필요에 따라 적당한 순도까지 정제한 후 사용할 수 있다.
방선균 유래의 프로트랜스글루타미나제의 프로-구조부를 제거하기 위한 다른 적절한 프로테아제의 예로는 스트렙토마이세스 알보그리세올루스(Streptomyces albogriseolus)(이후, 에스. 알보그리세올루스로 약칭하는 경우가 있다)가 생성하는 세린프로테아제인 SAMP45가 있다. 에스. 모바라엔스의 트랜스글루타미나제에 있어서 유전자 서열 및 암호화되는 전장 아미노산 서열(1 내지 31번: 시그날 서열, 32 내지 76번: 프로-구조부, 77 내지 407번: 성숙 트랜스글루타미나제)을 각각 서열번호 6 및 7에 나타내고, 에스. 모바라엔스의 프로트랜스글루타미나제의 경우, SAMP45가 프로-구조부 중의 72번째의 Ser과 73번째의 Phe 사이를 우선적으로 절단하므로 천연형 성숙 트랜스글루타미나제의 N-말단에 부가된 프로-구조부의 C-말단의 Phe-Arg-Ala-Pro의 4개의 아미노산(서열번호 60) 구조의 단백질이 수득된다. 본 발명자들은 이러한 단백질도 트랜스글루타미나제 활성을 갖는다는 것을 확인하였다. 또한, SAMP45 유전자의 서열은 이미 결정되어 있고, 프로-구조가 부가된 단백질(프로 SAMP45)의 아미노산 서열을 서열번호 8에 기재하였다[참고문헌: J. Bacteriol., 179, 430-438(1997)].
또한, 본 발명자들이 발견한 에스. 모바라엔스 IFO 13819가 생산하는 프롤린 특이적 펩티다제(svPEP)를 SAMP45와 조합하여 사용함으로써 N-말단에 부가된 Phe-Arg-Ala-Pro의 4개의 아미노산도 제거되고 천연형과 동일한 성숙 트랜스글루타미나제를 수득할 수 있다.
이러한 svPEP는 하기 화학식 I의 펩타이드 또는 펩타이드 유사물을 화학식 중 ↓의 장소에서, 즉 N-말단에서 3번째 또는 4번째의 프롤린 잔기의 카복실쪽을 특이적으로 절단하는 효소이다.
Y-Pro-↓-Z
상기식에서,
Y는 2 또는 3개의 아미노산 잔기로 이루어진 올리고펩타이드이고,
Z는 아미노산, 펩타이드, 아미드 또는 에스테르이다.
svPEP 유전자의 염기서열 및 여기에 암호화되는 전장 아미노산 서열을 서열번호 9 및 10에 기재한다. svPEP는 에스. 모바라엔스의 배양액 또는 에스. 모바라엔스 균체의 형태로 프로테아제와 함께 프로트랜스글루타미나제에 작용시킬 경우 프로-구조부를 완전하게 절단할 수 있고, 이 결과 프로-구조부가 완전하게 제거된 성숙 트랜스글루타미나제를 수득할 수 있다. 또는 프리프로 svPEP 유전자 및 프리프로프로테아제 유전자를 도입한 코리네형 세균을 프로트랜스글루타미나제를 균체외로 분비 생산하는 코리네형 세균과 함께 배양함으로써 동일하게 프로-구조부가 완전하게 제거된 성숙 트랜스글루타미나제를 수득할 수 있다. 또한, 프리프로트랜스글루타미나제 유전자를 도입한 코리네형 세균내에 SAMP45 유전자와 svPEP 유전자 의 양쪽을 동일한 방법으로 도입하고, 프로트랜스글루타미나제 및 SAMP45 뿐만 아니라 svPEP를 균체 표층 또는 균체외로 분비 생산시킴으로써 천연과 동일한 구조를 갖는 성숙 트랜스글루타미나제를 효율적으로 생산할 수 있다.
본 발명에 사용할 수 있는 유전자 작제물의 코리네형 세균내로의 도입방법은 특별히 한정되지 않고, 일반적으로 사용되는 방법, 예를 들어 원형질체법[참고문헌: Gene, 39, 281-286(1985)], 전기천공법[참고문헌: Bio/Technology, 7, 1067-1070(1989)] 등을 사용할 수 있다. 수득된 유전자 도입 형질전환체는 통상적으로 사용되는 방법 및 조건에 따라서 배양할 수 있다. 예를 들면, 형질전환체는 탄소원, 질소원, 무기이온을 함유하는 통상적인 배지에서 배양할 수 있다. 보다 높은 증식을 얻기 위해 비타민, 아미노산 등의 유기 미량 영양소를 필요에 따라 첨가할 수 있다.
탄소원으로는 글루코스 및 슈크로스와 같은 탄수화물, 아세트산과 같은 유기산, 알콜류 및 기타를 사용할 수 있다. 질소원으로는 암모니아 가스, 암모니아수, 암모늄염 및 기타를 사용할 수 있다. 무기이온으로는 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 인산 이온, 칼륨 이온, 철 이온 등을 필요에 따라 적절하게 사용한다. 배양은 pH 5.0 내지 8.5, 15℃ 내지 37℃의 적절한 범위에서 호기적 조건하에 실시하고, 1 내지 7일 정도 배양한다. 이러한 조건하에 형질전환체를 배양함으로써 목적 단백질이 균체내에서 다량으로 생산되고 효율적으로 균체외로 분비된다. 트랜스글루타미나제는 미생물의 균체내 다량으로 축적될 경우 일반적으로 치사적인 것으로 공지되어 있지만, 본 발명에 따르면 생산된 트랜스글루타미나제는 균체외로 방출되므로 치사적 영향을 받지 않고 연속적으로 트랜스글루타미나제가 생산된다.
본 발명에 따라 배지중에 분비된 단백질은 당해 기술분야 숙련가에게 익히 공지된 방법에 따라서 배양후의 배지로부터 분리 정제할 수 있다. 예를 들면, 균체를 원심분리 등에 의해 제거한 다음, 염석, 에탄올 침전, 한외 여과, 겔 여과 크로마토그래피, 이온교환 칼럼 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 중고압 액체 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피 등의 공지된 적절한 방법 또는 이들을 조합함으로써 분리 정제할 수 있다. 본 발명에 따라 균체 표층으로 분비된 단백질도 당해 기술분야 숙련가에게 익히 공지된 방법, 예를 들면, 염 농도의 상승, 계면활성제의 사용 등에 의해 가용화한 후 배지중으로 분비된 경우와 동일하게 분리 정제할 수 있다. 또한, 몇몇 경우에는 균체 표층으로 분비된 단백질을 가용화하지 않고 예를 들면, 고정화 효소로서 사용할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 보다 구체적으로 설명되지만 본 발명의 범위를 한정하고자 해석해서는 안된다.
실시예 1: 에스. 모바라엔스 IFO 13819 유래의 프리프로트랜스글루타미나제의 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869에서의 발현
(1) 에스. 모바라엔스 IFO 13819 유래의 트랜스글루타미나제 유전자 취득
에스. 모바라엔스 DSMZ주 유래의 트랜스글루타미나제 유전자의 서열은 이미 결정되어 있다[참고문헌: Eur. J. Biochem., 257, 570-576(1998)]. 이러한 서열을 참고로 서열번호 11과 서열번호 12에 기재된 프라이머를 합성하고 통상적인 방법에 따라서(사이토, 미우라의 방법)[참고문헌: Biochim. Biophys. Acta, 72, 619(1963)]) 조제한 에스. 모바라엔스 IFO 13819의 염색체 DNA로부터 성숙 트랜스글루타미나제 서열을 암호화하는 영역을 PCR법으로 증폭하였다. PCR 반응에 있어서, Pyrobest DNA 폴리머라제(다카라슈조사)를 사용하고 반응조건은 당해 기술분야 숙련가가 추천하는 프로토콜에 따랐다.
(서열번호 11) 5'-GACTCCGACGACAGGGTCACCCCTCCCGCC-3'
(서열번호 12) 5'-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열번호 11 및 12: PCR 프라이머
이어서, 증폭된 약 1.0kb의 DNA 단편을 무작위 프라이머 DNA 표지 키트(Random Primer DNA Labeling Kit) Ver. 2(다카라슈조사)와 [α-32P]dCTP를 사용하여 첨부된 프로토콜에 따라서 반응시켜 DNA 프로브를 작제하였다. 작제된 프로브와 에스. 모바라엔스 IFO 13819의 염색체 DNA를 사용하여 문헌[참고문헌: Molecular Cloning 2nd edition, J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p9.31(1989)]에 기재되어 있는 바와 같은 일반적인 방법에 따라서 서던 블롯 하이브리드화함으로써, 제한효소 SacI로 절출된 약 4kb의 단편에 트랜스글루타미나제 유전자가 존재함을 확인하였다. 따라서, 에스. 모바라엔스 IFO 13819의 염색체 DNA를 SacI로 분해한 약 4kb의 단편을 EASYTRAP Ver.2(다카라슈조사)를 사용하여 아가로스 겔 전기영동에 의해 회수하고 이를 pUC18(다카라슈조사)의 SacI 부위에 삽입한 다음, 에스케리키아 콜라이 JM109(다카라슈조사)의 컴피턴트(competent) 세포에 도입하여 라이브러리를 작제하였다.
상기 작제한 트랜스글루타미나제의 DNA 프로브를 사용하여 문헌[참고문헌: Molecular Cloning 2nd edition, J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p1.90(1989)]에 기재된 콜로니 하이브리드화에 의해 라이브러리의 스크리닝을 실시함으로써 트랜스글루타미나제 유전자 단편이 클로닝된 플라스미드를 포함하는 균주를 수득하고, 이로부터 플라스미드를 회수하여 pUITG라고 명명하였다. pUITG에 클로닝된 단편의 염기서열을 결정하였고, 이로써 에스. 모바라엔스 IFO 13819의 트랜스글루타미나제의 유전자가 에스. 모바라엔스 DSMZ주의 트랜스글루타미나제 유전자와 동일한 염기서열을 갖는 것이 확인되었다.
염기서열의 결정 결과, 이러한 SacI의 약 4kb의 단편은 시그날 서열(프리-부분)이 일부 결실된 불완전한 DNA 단편인 것으로 판명되었다. 따라서, 프로모터 영역과 완전한 시그날 서열 영역의 클로닝을 시도하였다. 클로닝은 TAKARA LA PCR in vitro Cloning Kit(다카라슈조사)와 서열번호 13 및 서열번호 14에 기재된 합성 프라이머를 사용하여 첨부된 프로토콜에 따라서 실시하였다.
(서열번호 13) 5'-GTGACCCTGTCGTCGGAGTC-3'
(서열번호 14) 5'-GGCATCCTGTCGAGCGGCTC-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열번호 13 및 14: 에스. 모바라엔스의 프로모터 영역 및 시그날 서열을 위한 PCR 프라이머
그 결과, SalI의 카세트 프라이머를 사용한 경우 약 800bp의 PCR 증폭 단편이 수득되었고, 이 단편의 염기서열을 결정함으로써 트랜스글루타미나제 유전자의 프로모터 영역 및 시그날 서열 영역을 포함하는 단편인 것이 확인되었다. 따라서, 이러한 약 800bp의 PCR 증폭 단편을 일본 공개특허공보 제(평)9-070291호에 기재된 pVC7의 SmaI 부위에 삽입함으로써 pVITGS5를 수득하였다. 또한 pUITG를 SacI로 분해함으로써 트랜스글루타미나제 유전자를 포함하는 약 4kb의 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 회수하였고, 이 단편을 pVITGS5의 SacI 부위에 삽입하여 전장 트랜스글루타미나제 유전자를 포함하는 플라스미드 pVITGC를 작제하였다. 또한, 염기서열을 염료 터미네이터 사이클 서열분석 키트(Dye Terminator Cycle Sequencing kit)(PE Applied Biosystems사)와 DNA 서열분석기 373A(PE Applied Biosystems사)를 사용하여 결정하였다. 프리프로트랜스글루타미나제 유전자의 서열로 암호화되는 전장 아미노산 서열을 서열번호 6에 기재하였고, N-말단의 31개 아미노산 서열(1 내지 31번째)이 시그날 서열(프리-부분)이고 45개 아미노산(32 내지 76번째)이 프로-구조부이며 331개 아미노산(77 내지 407번째)이 성숙 트랜스글루타미나제인 것으로 간주되었다.
(2) 트랜스글루타미나제 유전자의 프로모터 영역 변환
씨. 글루타미쿰의 세포 표층 단백질인 PS2의 유전자 서열은 이미 결정되어 있다[참고문헌: Mol. Microbiol., 9, 97-109(1993)]. 이러한 서열을 참고로 하여 서열번호 15와 서열번호 16에 기재된 프라이머를 합성하였고, 통상적인 방법에 따 라 제조한 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 염색체 DNA로부터 PS2단백질 유전자의 개시 코돈의 5'-상류 영역의 프로모터를 포함하는 영역을 PCR법으로 증폭시켰다.
(서열번호 15) 5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(서열번호 16) 5'-GAGCTCTCCGGCGTATGCGCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAATA-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열번호 15 및 16: PCR 프라이머
한편, 실시예 1(1)에서 결정한 트랜스글루타미나제의 유전자 서열을 기초로 하여 서열번호 12와 서열번호 17에 기재된 프라이머를 합성하였고, 실시예 1(1)에서 수득한 pUITG로부터 프리프로트랜스글루타미나제의 유전자 영역을 PCR법으로 증폭시켰다.
(서열번호 12) 5'-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3'
(서열번호 17) 5'-ATGCGCATACGCCGGAGAGCTCTCGTCTTC-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열번호 12 및 17: PCR 프라이머
이어서, 증폭시킨 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 PS2 유전자의 프로모터를 포함하는 영역과 예상대로 증폭시킨 프리프로트랜스글루타미나제의 유전자 영역의 PCR 반응액 1㎕를 혼합하여 주형으로 하고, 서열번호 15와 서열번호 12를 사용하여 교차 PCR을 실시하고 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 세포 표층 단백질 유전자의 프로모터를 함유하는 영역에 연결된 프리-프로-구조부 부착 트랜스글루타미나제의 융합 유전자를 증폭시켰다. 아가로스 겔 전기영동에 의해 약 1.8kb의 증폭 단편을 검출하였다. 이 단편을 EASYTRAP Ver.2(다카라슈조사)를 사용하여 아가로스 겔로부터 회수하고, 일본 공개특허공보 제(평)9-070291호에 기재된 pVC7의 SmaI 부위에 삽입함으로써 pVKPTGO를 수득하였다. 상기한 방법에 따라서 삽입 단편의 염기서열의 결정하였고, 예상대로 융합 유전자가 작제되었는지를 확인하였다.
(3) 프리프로트랜스글루타미나제 유전자의 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869에서의 발현
실시예 1(1)에서 작제한 pVITGC(프로모터 및 프리프로트랜스글루타미나제 유전자 모두 에스. 모바라엔스 유래) 또는 실시예 1(2)에서 작제한 pVKPTGO(프로모터는 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 PS2 유전자 유래이고, 프리프로트랜스글루타미나제 유전자는 에스. 모바라엔스 유래)로 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869를 형질전환시키고, 5mg/ℓ의 클로람페니콜을 함유하는 CM2S 한천 배지(증류수 1L당 효모 추출물 10g, 트립톤 10g, 슈크로스 5g, NaCl 5g, 한천 15g)에서 생육한 균주를 선택하였다. 이어서, 선택한 pVITGC 또는 pVKPTG0를 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869를 5mg/ℓ의 클로람페니콜을 함유하는 MM 액체 배지(증류수 1L당 글루코스 30g, 황산마그네슘7수화물 0.4g, 황산암모늄 30g, 인산2수소칼륨 1g, 황산철7수화물 0.01g, 황산망간5수화물 O.01g, 티아민 염산염 200㎍, 비오틴 500㎍, DL-메티오닌 0.15g, 탄산칼슘 50g, pH 7.5로 조절)에서 각각 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 종료후 10㎕의 배양 상등액을 SDS-PAGE에 제공한 후, 문헌[참고문헌: Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 82-87(1994)]에 기재된 항-트랜스글루타미나제 항체를 사용하여 통상적인 방법에 따라[예: J. Sambrook 등(1989)(상기)에 기재된 바와 같은 일반적인 순서] 웨스턴 블롯을 실시하였다.
그 결과, 트랜스글루타미나제의 분비를 검출할 수 없었다. 상기 결과로부터 에스. 모바라엔스의 트랜스글루타미나제의 시그날 서열은 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869에서는 기능하지 않는 것을 확인하였다.
실시예 2: 코리네박테리움 글루타미쿰(씨. 글루타미쿰 ATCC 13869)의 세포 표층 단백질의 시그날 펩타이드 및 에스. 모바라엔스 IFO 13819 유래의 성숙 트랜스글루타미나제를 암호화하는 융합 유전자를 사용하는 성숙 트랜스글루타미나제의 분비 생산
(1) 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 세포 표층 단백질의 시그날 서열을 갖는 트랜스글루타미나제 유전자의 작제
씨. 글루타미쿰의 세포 표층 단백질인 PS2의 유전자 서열은 이미 결정되어 있다[참고문헌: Mol. Microbiol., 9, 97-109(1993)]. 이러한 서열을 참고로 하여 서열번호 15와 서열번호 18에 기재된 프라이머를 합성하고, 실시예 1(2)의 방법에 따라 제조한 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 염색체 DNA로부터 PS2에 상응하는 단백질의 N-말단의 44개 아미노산 잔기(시그날 펩타이드의 30개 아미노산 잔기 및 성숙 세포 표층 단백질의 14개 아미노산 잔기)를 암호화하는 영역과 프로모터 영역을 포함하는 5'-상류 영역을 PCR법으로 증폭시켰다. 또한 서열번호 18에 기재된 프라이머는 트랜스글루타미나제와의 융합 유전자를 작제하기 위해서 성숙 트랜스글루타미나제의 N-말단 영역의 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 함유하고 있다.
(서열번호 15) 5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(서열번호 18) 5'-GGGGTGACCCTGTCGTCGGAGTCGTTGAAGCCGTTGTTGATGTTGAA-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열번호 15 및 18; PCR 프라이머
한편, 실시예 1(1)에서 결정한 트랜스글루타미나제의 유전자 서열을 기초로하여 서열번호 11과 서열번호 12에 기재된 프라이머를 합성하고, 실시예 1(1)에서 수득한 pUITG로부터 성숙 트랜스글루타미나제의 유전자 영역을 PCR법으로 증폭시켰다.
이어서, 증폭시킨 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 PS2에 상응하는 단백질의 N-말단의 44개 아미노산 잔기를 암호화하는 영역과 프로모터 영역을 포함하는 5'-상류 영역의 PCR 반응액 1㎕와 예상대로 증폭시킨 성숙 트랜스글루타미나제의 유전자 영역의 PCR 반응액 1㎕를 혼합하여 주형으로 하여 서열번호 15와 서열번호 12를 사용하여 교차 PCR을 실시하고, 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 세포 표층 단백질 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 5'-상류 영역 및 N-말단의 44개 아미노산 잔기를 암호화하는 영역에 연결된 성숙 트랜스글루타미나제의 융합 유전자를 증폭시켰다.
아가로스 겔 전기영동에 의해 약 1.7kb의 증폭 단편을 검출하였다. 이 단편을 EASYTRAP Ver.2(다카라슈조사)를 사용하여 아가로스 겔로부터 회수하고, 일본 공개특허공보 제(평)9-070291호에 기재된 pVC7의 SmaI 부위에 삽입함으로써 pVKTG3을 수득하였다. 상기 방법에 따라서 삽입 단편의 염기 서열을 결정하였고, 예상대로 융합 유전자가 작제되어 있는 것을 확인하였다.
또한, pVKTG3을 KpnI와 XbaI를 사용하여 분해함으로써 약 1.7kb의 씨. 글루 타미쿰 ATCC 13869의 세포 표층 단백질 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 5'-상류 영역과 N-말단의 44개 아미노산 잔기를 암호화하는 영역에 연결된 성숙 트랜스글루타미나제의 융합 유전자를 절단하여 아가로스 겔 전기영동에 의해 회수하였다. 이 단편을 일본 공개특허공보 제(평)9-322774호에 기재된 pPK4의 KpnI-XbaI 부위에 삽입함으로써 pPKTG3을 작제하였다.
(2) 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 세포 표층 단백질의 시그날 서열을 사용하는 성숙 트랜스글루타미나제의 분비
작제한 플라스미드 pVKTG3 또는 pPKTG3(둘다에서 프로모터, 및 시그날 펩타이드와 N-말단의 14개 아미노산 잔기로 이루어진 유전자는 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869 유래이고 성숙 트랜스글루타미나제 유전자는 에스. 모바라엔스 유래)을 사용하여 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869를 형질전환시키고, 5mg/ℓ의 클로람페니콜 또는 25mg/ℓ의 카나마이신을 함유하는 CM2S 한천 배지에서 생육한 균주를 선택하였다. 이어서, 선택한 pVKTG3 또는 pPKTG3을 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869를 5mg/ℓ의 클로람페니콜 또는 25mg/ℓ의 카나마이신을 함유하는 상기 MM 액체 배지에서 30℃로 48시간 동안 배양하였다. 배양 종료후, 10㎕의 배양 상등액을 SDS-PAGE에 제공한 후, 문헌[참고문헌: Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 82-87(1994)]에 기재된 항-트랜스글루타미나제를 사용하여 통상적인 방법에 따라 웨스턴 블롯을 실시하였다. 그 결과, 두개의 모든 균주에서 배양 상등액에 성숙 트랜스글루타미나제와 거의 동일한 분자량을 갖는 분비된 트랜스글루타미나제를 소량 검출할 수 있었다.
실시예 3: 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 세포 표층 단백질의 시그날 펩타이드에 결합된 에스. 모바라엔스 IFO 13819 유래의 프로트랜스글루타미제 융합 유전자(이종 융합 프리프로트랜스글루타미나제 유전자)를 사용하는 프로트랜스글루타미나제의 분비 생산
(1) 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 세포 표층 단백질의 시그날 서열을 갖는 프로-구조부 부착 트랜스글루타미나제 유전자(이종 융합 프리프로트랜스글루타미나제 유전자)의 작제
씨. 글루타미쿰의 세포 표층 단백질인 PS2의 유전자 서열[참고문헌: Mol. Microbiol., 9, 97-109(1993)]을 참고로 하여 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 및 서열번호 22에 기재된 프라이머를 합성하였다. 실시예 1(2)의 방법에 따라 제조한 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 염색체 DNA로부터 서열번호 15와 서열번호 19 또는 서열번호 15와 서열번호 20 또는 서열번호 15와 서열번호 21 또는 서열번호 15와 서열번호 22의 조합에 의해 PS2에 상응하는 단백질의 N-말단의 각각 30, 31, 44 및 68개 아미노산 잔기를 암호화하는 영역(시그날 펩타이드의 30개 아미노산 잔기 포함)과 프로모터 영역을 포함하는 5'-상류 영역을 PCR법으로 증폭시켰다.
서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 및 서열번호 22에 기재된 프라이머는 프로-구조부 부착 트랜스글루타미나제와의 융합 유전자를 작제하기 위해서 프로트랜스글루타미나제의 N-말단의 아미노산을 암호화하는 서열을 포함하고 있다.
(서열번호 15) 5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(서열번호 19) 5'-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCAGCGAATGCTGGGATAGCAACGCC-3'
(서열번호 20) 5'-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCCTGAGCGAATGCTGGGATAGCTAC-3'
(서열번호 21) 5'-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCGTTGAAGCCGTTGTTGATGTTGAA-3'
(서열번호 22) 5'-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCAGTCAGGTCGCGGAGGGTTTCCTC-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열번호 15, 19 내지 22: PCR 프라이머
한편, 실시예 1(1)에서 결정한 트랜스글루타미나제의 유전자 서열을 기초로 하여 서열번호 23과 서열번호 12에 기재된 프라이머를 합성하고, 실시예 1(1)에서 수득한 pUITG로부터 프로트랜스글루타미나제의 유전자 영역을 PCR법으로 증폭시켰다.
(서열번호 12) 5'-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3'
(서열번호 23) 5'-GACAATGGCGCGGGGGAAGAGACGAAGTCC-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열번호 12 및 23: PCR 프라이머
이어서, 각각 증폭시킨 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 PS2에 상응하는 단백질 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 5'-상류 영역과 N-말단의 30, 31, 44 및 68개 아미노산 잔기를 암호화하는 영역의 PCR 반응액 각각 1㎕와 예상대로 증폭시킨 프로-구조부 부착 트랜스글루타미나제의 유전자 영역의 PCR 반응액 1㎕를 혼합하여 주형으로 하고 서열번호 15와 서열번호 12를 사용하여 교차 PCR을 실시하며 각각 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 PS2에 상응하는 단백질 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 5'-상류 영역 및 N-말단의 30, 31, 44 및 68개 아미노산 잔기를 암호화하는 각각의 영역에 결합된 프로트랜스글루타미나제와의 융합 유전자, 즉 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869 표층 단백질 유전자의 프로모터에 결합된 이종 융합 프리프로트랜스글루타미나제 유전자 단편을 증폭시켰다.
아가로스 겔 전기영동에 의해 각각 약 1.8kb 내지 1.9kb의 증폭 단편을 검출하였다. 이 단편을 EASYTRAP Ver.2(다카라슈조사)를 사용하여 아가로스 겔로부터 회수하고 일본 공개특허공보 제(평)9-070291호에 기재된 pVC7의 SmaI 부위에 삽입함으로써 각각 pVKPTG1, pVKPTG2, pVKPTG3, 및 pVKPTG4를 수득하였다. 상기 방법에 따라서 삽입 단편의 염기서열을 결정하였고, 예상대로 융합 유전자가 작제되어 있는 것을 확인하였다.
또한, pVKPTG1, pVKPTG2, pVKPTG3, 및 pVKPTG4를 KpnI와 XbaI를 사용하여 분해함으로써 약 1.8kb 내지 1.9kb의 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 PS2에 상응하는 단백질 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 5'-상류 영역과 N-말단의 30, 31, 44 및 68개 아미노산 잔기를 암호화하는 각각의 영역에 결합된 프로-구조부 부착 트랜스글루타미나제의 융합 유전자를 절단하여 아가로스 겔 전기영동으로 회수하였다. 이들 단편을 일본 공개특허공보 제(평)9-322774호에 기재된 pPK4의 KpnI-XbaI 부위에 삽입함으로써 pPKPTG1, pPKPTG2, pPKPTG3, 및 pPKPTG4를 작제하였다.
(2) 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 세포 표층 단백질의 시그날 서열을 사용하는 프로트랜스글루타미나제의 분비
작제한 플라스미드 pVKPTG1, pVKPTG2, pVKPTG3, pVKPTG4, pPKPTG1, pPKPTG2, pPKPTG3 또는 pPKPTG4를 사용하여 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869를 형질전환시키고, 5mg/ℓ의 클로람페니콜 또는 25mg/ℓ의 카나마이신을 함유하는 CM2S 한천 배지에서 생육한 균주를 선택하였다. 이어서, 선택한 pVKPTG1, pVKPTG2, pVKPTG3, pVKPTG4, pPKPTG1, pPKPTG2, pPKPTG3 또는 pPKPTG4를 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869를 5mg/ℓ의 클로람페니콜 또는 25mg/ℓ의 카나마이신을 함유하는 MM 액체 배지에서 각각 30℃로 48시간 동안 배양하였다. 배양 종료후 10㎕의 배양 상등액을 SDS-PAGE에 제공하고, 문헌[참고문헌: Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 82-87(1994)]에 기재된 항-트랜스글루타미나제 항체를 사용하여 통상적인 방법에 따라 웨스턴 블롯을 실시하였다. 그 결과, pVC7 또는 pPK4의 어느 쪽의 벡터에서도 거의 동량의 프로-구조부 부착 트랜스글루타미나제의 분비가 확인되었지만, PS2에 상응하는 단백질의 성숙 단백질의 N-말단 아미노산 잔기의 길이에 따라서 분비량에 유의적인 차이가 확인되었다. 대표적인 분비량을 표 1에 기재한다.
씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 세포 표층 단백질의 시그날 서열을 사용하는 프로트랜스글루타미나제의 분비 생산량
플라스미드 프로트랜스글루타미나제(mg/ℓ)
pPKPTG1 78
pPKPTG4 210

실시예 4: 코리네박테리움 암모니아게네스(씨. 암모니아게네스 ATCC 6872)의 세포 표층 단백질의 시그날 서열 및 에스. 모바라엔스 IFO 13819 유래의 프로트랜스글루타미나제를 암호화하는 서열을 갖는 융합 유전자를 사용하는 프로트랜스글루타미나 제의 분비 생산
(1) 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질의 시그날 서열을 갖는 프로-구조부 부착 트랜스글루타미나제 유전자(이종 융합 프리프로트랜스글루타미나제 유전자)의 작제
씨. 암모니아게네스 ATCC 6872의 세포 표층 단백질(SlpA)의 유전자 서열[일본 공개특허공보 제(평)10-108675호]을 참고로 하여 서열번호 24와 서열번호 25에 기재된 프라이머를 합성하고, 통상적인 방법에 따라 제조한 씨. 암모니아게네스의 염색체 DNA로부터 세포 표층 단백질(SlpA) 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 5'-상류 영역과 N-말단의 25개 아미노산 잔기(시그날 펩타이드)를 암호화하는 영역을 PCR법으로 증폭시켰다. 또한, 서열번호 25에 기재된 프라이머는 프로트랜스글루타미나제와의 융합 유전자를 작제하기 위해 프로트랜스글루타미나제의 N-말단의 아미노산을 암호화하는 서열을 포함하고 있다.
(서열번호 24) 5'-GCCCAGAAGCCCAAAATTGAGATTT-3'
(서열번호 25) 5'-CTTCGTCTCTTCCCCCGCGCCATTGTCTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCCAGC-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열번호 24 및 25: PCR 프라이머
이어서, 증폭시킨 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA) 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 5'-상류 영역과 N-말단의 25개 아미노산 잔기를 암호화하는 영역의 PCR 반응액 1㎕와 실시예 3(1)에서 증폭시킨 프로-구조부 부착 트랜스글루타미나제의 유전자 영역의 PCR 반응액 1㎕를 혼합하여 주형으로 하고 서열번호 24와 서열번호 12를 사용하여 교차 PCR을 실시하고 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA) 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 5'-상류 영역과 N-말단의 25개 아미노산 잔기를 암호화하는 영역에 결합된 프로-구조부 부착 트랜스글루타미나제의 융합 유전자(이종 융합 프리프로트랜스글루타미나제 유전자)를 증폭시켰다. 아가로스 겔 전기영동에 의해 약 1.7kb의 증폭 단편을 검출하였다. 이 단편을 EASYTRAP Ver.2(다카라슈조사)를 사용하여 아가로스 겔로부터 회수하고, pVC7의 SmaI 부위에 삽입함으로써 pVSPTG1을 수득하였다.
(2) 프로모터 영역의 변환; 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 세포 표층 단백질 유전자의 프로모터와의 결합
씨. 글루타미쿰의 세포 표층 단백질인 PS2의 유전자 서열[참고문헌: Mol. Microbiol., 9, 97-109(1993)]을 참고로 하여 서열번호 15와 서열번호 26에 기재된 프라이머를 합성하였다. 실시예 1(2)의 방법에 따라 제조한 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 염색체 DNA로부터 PS2에 상응하는 단백질 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 5'-상류 영역을 PCR법으로 증폭시켰다. 또한, 서열번호 26에 기재된 프라이머는 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 시그날 서열을 갖는 프로-구조부 부착 트랜스글루타미나제 유전자와의 융합 유전자(이종 융합 프리프로트랜스글루타미나제 유전자)를 작제하기 위해 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 시그날 서열의 N-말단의 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 포함하고 있다.
(서열번호 15) 5'-AAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(서열번호 26) 5'-CGCAGCCAGCGATTTCATGCGTTTCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAATAGGT-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열번호 15 및 26: PCR 프라이머
한편, 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 시그날 서열을 갖는 프로-구조부 부착 트랜스글루타미나제 유전자와의 융합 유전자 서열을 기초로 하여 서열번호 27과 서열번호 12에 기재된 프라이머를 합성하고 실시예 4(1)에서 수득한 pVSPTG1에서 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 시그날 서열을 갖는 프로-구조부 부착 트랜스글루타미나제의 유전자 영역을 PCR법으로 증폭시켰다.
(서열번호 12) 5'-CGCTCACATCACGGCCAGCCCTGCTTTACC-3'
(서열번호 7) 5'-ATGAAACGCATGAAATCGCTGGCTGCGGCG-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열번호 12 및 27: PCR 프라이머
이어서, 증폭시킨 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 PS2에 상응하는 단백질 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 5'-상류 영역의 PCR 반응액 각각 1㎕와 예상대로 증폭시킨 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 시그날 서열을 갖는 프로-구조부 부착 트랜스글루타미나제의 유전자(이종 융합 프리프로트랜스글루타미나제 유전자) 영역의 PCR 반응액 1㎕를 혼합하여 주형으로 하고 서열번호 15와 서열번호 12를 사용하여 교차 PCR을 실시하고 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 PS2에 상응하는 단백질 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 5'-상류 영역을 갖는 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 N-말단의 25개 아미노산 잔기를 암호화하는 영역에 결합된 프로-구조부 부착 트랜스글루타미나제의 융합 유전자를 증폭시켰다.
아가로스 겔 전기영동에 의해 약 1.8kb의 증폭 단편을 검출하였다. 이 단편을 EASYTRAP Ver.2(다카라슈조사)를 사용하여 아가로스 겔로부터 회수하고, 일본 공개특허공보 제(평)9-070291호에 기재된 pVC7의 SmaI 부위에 삽입함으로써 pVKSPTG1을 수득하였다. 상기 방법에 따라서 삽입 단편의 염기서열을 결정하였고, 예상대로 융합 유전자가 작제되어 있는 것을 확인하였다.
또한, pVKSPTG1을 KpnI 및 XbaI를 사용하여 분해함으로써 약 1.8kb의 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 PS2에 상응하는 단백질 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 5'-상류 영역을 갖는 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 N-말단의 25개 아미노산 잔기(시그날 펩타이드)를 암호화하는 영역에 결합된 프로-구조부 부착 트랜스글루타미나제의 융합 유전자(이종 융합 프리프로트랜스글루타미나제 유전자)를 절단하여 아가로스 겔 전기영동으로 회수하였다. 이 단편을 일본 공개특허공보 제(평)9-322774호에 기재된 pPK4의 KpnI-XbaI 부위에 삽입함으로써 pPKSPTG1을 작제하였다. 플라스미드 pVKSPTG1 및 pPKSPTG1는 모두 프로모터는 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869의 PS2 유전자 유래이고, 시그날 펩타이드는 씨. 암모니아게네스의 SlpA 유래이며, 프로트랜스글루타미나제는 에스. 모바라엔스 유래인 유전자로 구성되어 있다.
(3) 이. 콜라이의 tac 프로모터로의 변환
이. 콜라이의 tac 프로모터가 클로닝되어 있는 플라스미드 pKK223-3(아마샴파마시아사)의 서열을 참고로 하여 서열번호 28과 서열번호 29에 기재된 프라이머 를 합성하였다. pKK223-3의 DNA로부터 tac 프로모터에 상응하는 영역을 PCR법으로 증폭시켰다. 또한, 서열번호 29에 기재된 프라이머는 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 시그날 서열을 갖는 프로-구조부 부착 트랜스글루타미나제 유전자와의 융합 유전자(이종 융합 프리프로트랜스글루타미나제 유전자)를 작제하기 위해 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 시그날 서열의 N-말단 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 포함하고 있다.
(서열번호 28) 5'-GGATCCGGAGCTTATCGACTGCACG-3'
(서열번호 29) 5'-CGCAGCCAGCGATTTCATGCGTTTCATAATTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGT-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열번호 28 및 29: PCR 프라이머
이어서, 증폭시킨 tac 프로모터에 상응하는 영역의 PCR 반응액 1㎕와 실시예 4(2)에서 증폭시킨 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 시그날 서열을 갖는 프로-구조부 부착 트랜스글루타미나제의 유전자 영역의 PCR 반응액 1㎕를 혼합하여 주형으로 하고, 서열번호 28과 서열번호 12를 사용하여 교차 PCR을 실시하고 tac 프로모터를 갖는 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 N-말단의 25개 아미노산 잔기를 암호화하는 영역에 결합된 프로-구조부 부착 트랜스글루타미나제의 융합 유전자(이종 융합 프리프로트랜스글루타미나제 유전자)를 증폭시켰다. 아가로스 겔 전기영동에 의해 약 1.5kb의 증폭 단편을 검출하였다. 이 단편을 EASYTRAP Ver.2(다카라슈조사)를 사용하여 아가로스 겔로부터 회수하고, 일본 공개특허공보 제(평)9-070291호에 기재된 pVC7의 SmaI 부위에 삽입함으로써 pVTSPTG1을 수득하였다. 상기 방법에 따라서 삽입 단편의 염기서열을 결정하였고, 예상대로 융합 유전자가 작제되어 있는 것을 확인하였다.
또한, pVTSPTG1을 KpnI 및 XbaI를 사용하여 분해함으로써 약 1.5kb의 tac 프로모터를 갖는 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 N-말단의 25개 아미노산 잔기를 암호화하는 영역에 결합된 프로-구조부 부착 트랜스글루타미나제의 융합 유전자를 절단하여 아가로스 겔 전기영동으로 회수하였다. 이 단편을 일본 공개특허공보 제(평)9-322774호에 기재된 pPK4의 KpnI-XbaI 부위에 삽입함으로써 pPTSPTG1을 작제하였다. 플라스미드 pVTSPTG1 및 pPTSPTG1 모두 이. 콜라이 유래의 tac 프로모터, 씨. 암모니아게네스의 SlpA 유래의 시그날 펩타이드, 에스. 모바라엔스 유래의 프로트랜스글루타미나제 유전자로 구성되어 있다.
(4) 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질의 시그날 서열을 사용하는 프로트랜스글루타미나제의 분비
작제한 플라스미드 pVKSPTG1, pVTSPTG1, pPKSPTG1, pPTSPTG1을 사용하여 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869를 형질전환시키고, 5mg/ℓ의 클로람페니콜 또는 25mg/ℓ의 카나마이신을 함유하는 CM2S 한천 배지에서 생육한 균주를 선택하였다. 이어서, 선택한 pVKSPTG1 또는 pVTSPTG1, pPKSPTG1, pPTSPTG1을 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869를 5mg/ℓ의 클로람페니콜 또는 25mg/ℓ의 카나마이신을 함유하는 MM 액체 배지에서 각각 30℃로 48시간 동안 배양하였다. 배양 종료후, 10㎕의 배양 상등액을 SDS-PAGE에 제공한 후, 문헌[참고문헌: Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 82-87(1994)]에 기재된 항-트랜스글루타미나제 항체를 사용하여 통상적인 방법에 따라 웨스턴 블롯을 실시하였다. 그 결과, pVC7 또는 pPK4 어느 쪽의 벡터에서도 거의 동량의 프로트랜스글루타미나제의 분비가 확인되었다. 대표적인 분비량을 표 2에 기재하였다.
씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질의 시그날 서열을 사용하는 프로트랜스글루타미나제의 분비 생산량
플라스미드 프로트랜스글루타미나제(mg/ℓ)
pPKSPTG1 102
pPTSPTG1 74

실시예 5: 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질의 시그날 서열 및 스트렙토베르티실리움 시나모늄 IFO 12852 유래의 프로트랜스글루타미나제를 암호화하는 서열을 갖는 융합 유전자를 사용하는 프로트랜스글루타미나제의 분비 생산
(1) 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질의 시그날 서열 및 에스. 시나모늄 IFO 12852 유래의 프로트랜스글루타미나제를 암호화하는 서열을 갖는 융합 유전자의 작제
에스. 시나모늄 IFO 12852의 트랜스글루타미나제 유전자의 서열은 이미 결정되어 있다[참고문헌: 일본 특허원 제(평)11-295649호]. 아미노산 서열의 1번째 내지 32번째가 프리-부분의 서열, 33번째 내지 86번째가 프로-부분의 서열, 87번째 내지 416번째가 성숙 트랜스글루타미나제의 서열이라고 추정된다. 이 염기서열과 암호화된 전체 아미노산 서열을 서열번호 30 및 31에 기재한다. 또한 당해 유전자 를 함유하는 플라스미드 pUJ-MTG로 형질전환된 에스케리키아 콜라이 AJ13669는 1999년 10월 14일자로 FERM P-17602로서 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(현, 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 일본국 쓰쿠바시 히가시 1-1-1 츄오 제6, 우편번호 305-8566)에 기탁되어 있고, 2000년 8월 28일자로 부다페스트 조약에 근거하여 기탁이 이관되어 있으며 수탁번호 FERM BP-7287이 부여되어 있다.
우선 pUJ-MTG에서 제한효소 BamHI로 전장의 프리프로트랜스글루타미나제 유전자를 포함하는 영역 약 3.5Kb를 절단하고, 이를 pUC19의 BamHI 부위에 삽입한 pUCSCTG를 작제하였다.
pUCSCTG를 주형으로 하여 서열번호 32와 서열번호 33에 기재된 프라이머를 합성하고 에스. 시나모늄 IFO 12852 유래의 프로트랜스글루타미나제를 함유하는 유전자 영역을 지금까지와 동일하게 PCR법으로 증폭시켰다.
(서열번호 32) 5'-GGC GAT GGG GAA GAG AAG GGG-3'
(서열번호 33) 5'-GGC GGA TCC TCG CGT CGA GAG GCG TGG ACT GA-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열번호 32 및 33: PCR 프라이머
이어서, 실시예 4(2)에서 작제한 pPKSPTG1을 주형으로 하여 서열번호 34와 서열번호 35의 조합에 의해 씨. 글루타미쿰의 세포 표층 단백질인 PS2 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 5'-상류 영역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 SlpA의 시그날 서열을 포함하는 영역을 PCR법으로 증폭시켰다.
서열번호 35에 기재된 프라이머는 스트렙토베르티실리움 시나모늄 IFO 12852 유래의 프로트랜스글루타미나제와의 융합 유전자를 작제하기 위해 스트렙토베르티실리움 시나모늄 IF0 12852 유래의 프로트랜스글루타미나제의 N-말단 아미노산을 암호화하는 서열을 포함하고 있다.
(서열번호 34) 5'-TAC GAA TTC GAG CTC GGT ACC-3'
(서열번호 35) 5'-CCC CTT CTC TTC CCC ATC GCC TGC CGT TGC CAC AGG TGC GGC C-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열번호 34 및 35: PCR 프라이머
이어서, 증폭시킨 에스. 시나모늄 IFO 12852 유래의 프로트랜스글루타미나제를 포함하는 유전자를 암호화하는 영역의 PCR 반응액 1㎕와 예상대로 증폭시킨 PS2 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 5'-상류 영역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 SlpA의 시그날 서열을 포함하는 영역의 PCR 반응액 1㎕를 혼합하여 주형으로 하고, 서열번호 34와 서열번호 33을 사용하여 교차 PCR을 실시하고 PS2 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 5'-상류 영역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 SlpA의 시그날 서열에 결합된 이종 융합 프리프로트랜스글루타미나제 유전자 단편을 증폭시켰다.
아가로스 겔 전기영동에 의해 약 1.8kb의 증폭 단편을 검출하였다. 이 단편을 EcoRI 및 BamHI로 분해한 다음, 아가로스 겔로부터 회수하고 pUC19의 EcoRI-BamHI 부위에 삽입함으로써 pUKSPTG2'를 수득하였다. 상기 방법에 따라서 삽입 단편의 염기서열을 결정하였고, 예상대로 융합 유전자가 작제되어 있는 것을 확인하였다. 이 pUKSPTG2'를 EcoRI로 분해한 다음, 평활말단(Blunting) 키트(다카라슈조사)로 평활 말단화하고 5'-말단이 인산화된 5'-CTCTAGAG-3'의 서열을 갖는 XbaI 링커(다카라슈조사)를 삽입하고 폐환하여 pUKSPTG2를 작제하였다. pUKSPTG2를 XbaI로 분해함으로써 약 1.8kb의 융합 프리프로트랜스글루타미나제 유전자(프로트랜스글루타미나제 유전자는 에스. 시나모늄 IFO 12852 유래)를 절단하고 아가로스 겔 전기영동으로 회수하였다. 이들 단편을 상기한 pPK4의 XbaI 부위에 삽입함으로써 pPKSPTG2를 작제하였다.
이어서, 프로-구조부의 N-말단 일부가 에스. 모바라엔스의 프로-구조부로 치환된 키메라 프로-구조부를 갖는 프리프로트랜스글루타미나제 유전자를 작제하였다(성숙 트랜스글루타미나제 유전자 및 프로-구조부의 일부는 에스. 시나모늄 IFO 12852 유래).
우선 실시예 4(2)에서 작제된 플라스미드 pPKSPTG1(에스. 모바라엔스 IFO 13819 유래의 프로트랜스글루타미나제 발현용)에서 EcoRI-BamHI의 약 1.8kb의 프리프로트랜스글루타미나제 유전자를 포함하는 단편을 절단하고, pUC19의 EcoRI-BamHI 부위에 삽입하였다(pUKSPTG1). pUKSPTG1을 AatII로 분해하여 약 1.2kb의 단편을 절단하고, pUKSPTG2'도 AatII로 분해하여 약 1.2kb의 단편을 제거한 약 3.3kb의 단편을 제조하였다. 이러한 약 3.3kb의 단편을 pUKSPTG1 유래의 약 1.2kb의 AatII 단편과 연결하고, 통상적인 방법의 유전자 조작법에 근거하여 AatII 단편이 삽입된 클론을 선택하였다. 이중에서 AatII 단편이 삽입된 방향을 결정하기 위해 순차적으로 서열화하여 목적하는 방향(프리프로트랜스글루타미나제가 암호화되어 있다)으 로 삽입된 것을 선택하였다(pUKSPTG3').
또한, pUKSPTG3'에 대해서도 먼저 pUKSPTG2'에서 실시한 것과 동일하게 이의 EcoRI 부위를 평활 말단화하여 XbaI 링커를 삽입하고 pUKSPTG3을 작제하였다. 또한, pUKSPTG3으로부터 XbaI의 약 1.8kb 단편을 절단하고 pPK4의 XbaI 부위에 삽입함으로써 pPKSPTG3을 작제하였다.
(2) 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질의 시그날 서열을 사용하는 스트렙토베르티실리움 시나모늄 IF0 12852 유래의 프로트랜스글루타미나제의 분비
작제한 플라스미드 pPKSPTG2 및 pPKSPTG3을 사용하여 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869를 형질전환시키고, 25mg/ℓ의 카나마이신을 함유하는 CM2S 한천 배지에서 생육한 균주를 선택하였다. 이어서, 선택한 pPKSPTG2 및 pPKSPTG3을 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869를 25mg/ℓ의 카나마이신을 함유하는 MMTG 액체 배지(증류수 1L당 글루코스 60g, 황산마그네슘7수화물 0.4g, 황산암모늄 30g, 인산2수소칼륨 1g, 황산철7수화물 O.01g, 황산망간5수화물 0.01g, 티아민 염산염 450㎍, 비오틴 450㎍, DL-메티오닌 0.15g, 탄산칼슘 50g, pH 7.5로 조절)에서 각각 30℃로 3일 동안 배양하였다. 배양 종료후, 10㎕의 배양 상등액을 SDS-PAGE에 제공한 후, 항-트랜스글루타미나제 항체를 사용하여 통상적인 방법에 따라 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다. 본 항체는 에스. 모바라엔스 유래의 트랜스글루타미나제에 대한 항체이지만, 에스. 시나모늄 유래의 트랜스글루타미나제에 대하여도 반응성을 나타냈다. 그 결과, 프로-구조부 부착 에스. 시나모늄 IFO 12852 유래의 트랜스글루타미나제 분비가 확인되었다(약 30 내지 50mg/ℓ).

실시예 6: 세린 프로테아제(SAMP45) 유전자의 클로닝 및 발현 플라스미드의 작제 평가
(1) 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질의 시그날 서열을 갖는 프로-구조부 부착 세린 프로테아제(SAMP45) 유전자(이종 융합 프리프로세린프로테아제(SAMP45) 유전자)의 작제
에스. 알보그리세오루스가 생성하는 세린 프로테아제인 SAMP45의 유전자 서열은 이미 결정되어 있다[참고문헌: J. Bacteriol., 179, 430-438(1997)]. 이 서열을 참고로 하여 서열번호 36과 서열번호 37에 기재된 프라이머를 합성하고, SAMP45의 N-말단 프로-구조, 성숙 SAMP45, 및 C-말단 프로-구조를 포함하는 유전자 영역을 상기 기재한 동일한 방법에 따라 PCR법으로 증폭시켰다.
(서열번호 36) 5'-AACGGGGAGAACAGCACGGCCGCCGG-3'
(서열번호 37) 5'-GGCGAATTCTCCGGCGGGCCGTCACCGGT-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열번호 36 및 37: PCR 프라이머
이어서, 실시예 4(2)에서 작제한 pPKSPTG1을 주형으로 하여 서열번호 38과 서열번호 39의 조합에 의해 씨. 글루타미쿰의 세포 표층 단백질 PS2 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 5'-상류 영역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 SlpA 유전자의 시그날 서열을 포함하는 영역을 동일하게 PCR법으로 증폭시켰다.
서열번호 39에 기재된 프라이머는 프로-구조부 부착 세린프로테아제와의 융 합 유전자를 작제하기 위해 프로세린프로테아제의 N-말단 아미노산을 암호화하는 서열을 포함하고 있다.
(서열번호 38) 5'-GGCAAGCTTAAATTCCTGTGAATTAGCTGA-3'
(서열번호 39) 5'-CGGCCGTGCTGTTCTCCCCGTTTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCC-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열번호 38 및 39: 융합 프리프로세린프로테아제 유전자 작제용 PCR 프라이머
이어서, 각각 증폭시킨 SAMP45의 N-말단 프로-구조, 성숙 SAMP45, 및 C-말단 프로-구조를 함유하는 유전자를 암호화하는 영역의 PCR 반응액 각각 1㎕와 예상대로 증폭시킨 PS2 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 5'-상류 영역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 SlpA 유전자의 시그날 서열을 포함하는 영역의 PCR 반응액 1㎕를 혼합하여 주형으로 하고, 서열번호 38과 서열번호 37를 사용하여 교차 PCR을 실시하고 PS2 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 5'-상류 영역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 SlpA의 시그날 서열에 결합된 이종 융합 프리프로세린프로테아제 유전자 단편을 증폭시켰다.
아가로스 겔 전기영동에 의해 약 3.9kb의 증폭 단편을 검출하였다. PCR 산물을 HindIII 및 EcoRI로 분해한 다음, 아가로스 겔 전기영동에 제공하여 약 3.9kb의 단편을 아가로스 겔로부터 회수하고, 상기한 pVC7의 HindIII-EcoRI 부위에 삽입함으로써 각각 pVSS1을 수득하였다. 상기 기재된 방법에 따라서 삽입 단편의 염기서열을 결정하였고, 예상대로 융합 유전자가 작제되어 있는 것을 확인하였다.
(2) 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질의 시그날 서열을 사용하는 세린프로테 아제의 분비
작제한 플라스미드 pVSS1을 사용하여 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869를 형질전환시키고, 5mg/ℓ의 클로람페니콜을 함유하는 CM2S 한천 배지에서 생육한 균주를 선택하였다. 이어서, 선택된 pVSS1을 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869를 5mg/ℓ의 클로람페니콜을 함유하는 MMTG 액체 배지에서 30℃로 70시간 동안 배양하였다. 이 배양액 1㎖를 원심분리로 배양 상등액과 균체로 분리하였다. 균체는 0.1M 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에 현탁시켰다. 세린 프로테아제의 활성을 하기와 같이 측정하였다. 0.25mM의 Bz-Phe-Val-Arg-pNA(바켐사)를 함유하는 20mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에 배양 상등액 또는 균체 현탁액 50㎕를 가하고 0.6㎖의 총량으로 30℃에서 20분 동안 반응시킨 다음, 50% 아세트산을 0.4㎖ 가하여 반응을 정지시킨다. 410nm의 흡광도를 측정하여 유리된 pNA(p-니트로아닐리드)의 양을 산출함으로써 활성을 결정하였다. 또한, 효소 1단위는 1분 동안에 1μmol의 pNA를 유리시키는 효소량으로 한다. 그 결과, 배양 상등액에서는 세린 프로테아제의 활성은 검출되지 않았고, 균체 현탁액에서는 활성을 검출할 수 있었다. 검출된 활성치와 문헌[참고문헌: J. Bacteriol., 179, 430-438(1997)]에 따른 비활성치(1.96u/mg)로부터 계산한 결과, 약 9mg/ℓ상당의 세린 프로테아제가 균체 표면에서 분비 발현되는 것이 확인되었다.
실시예 7: 프롤린 특이적 펩티다제(svPEP) 유전자의 클로닝 및 발현 플라스미드 작제 평가
(1) 에스. 모바라엔스 IFO 13819가 생산하는 프롤린 특이적 펩티다제(svPEP)의 정제 및 N-말단 아미노산 서열 분석
ISP2 액체 배지(증류수 1L당 효모 추출물 4g, 말타제 추출물 10g, 글루코스 4g, pH 7.3으로 조절) 800mL를 5L 경사구 플라스크에 가득 채우고, 에스. 모바라엔스 IFO 13819 균주를 플레이트로부터 식균하여 30℃에서 48시간, 120rpm으로 진탕 배양하였다.
배양액을 원심분리하고 배양 상등액을 제거하여 균체를 회수하였다. 25mg/ℓ의 카나마이신을 함유하는 20mM의 트리스-HCl 완충액으로 세정한 다음, 수득된 균체를 25mg/ℓ의 카나마이신을 함유하는 0.1M의 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에 현탁시켰다. 빙상에서 4시간 동안 진탕한 다음, 원심분리에 의해 수득된 상등액을 회수하였다. 니트로셀룰로스 필터(기공 크기 0.22μm, Sartrius Co. Ltd사)를 사용하여 여과 멸균시킨 후, FPLC(Amarsham Pharmacia사)를 사용하여 1.5M의 황산암모늄/50mM의 인산 완충액(pH 7.0)으로 평형화한 부틸-세파로스 4FF(Amarsham Pharmacia사)의 칼럼(1.6Φ×10cm)에 통과시키고 상기 완충액 중에서 황산암모늄 1.5 내지 0M의 직선 농도 구배로 용출하였다. 활성 성분을 함유하는 분획물을 회수한 다음, 동일 조건에서 페닐-세파로스 HP 칼럼(1mL, Amarsham Pharmacia사)에 통과시켜 활성 분획물을 회수하고, 50mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에 대하여 밤새 4℃에서 투석하였다. 이에 따라 부분 정제 효소액을 수득하였다. 부분 정제 효소액을 역상 크로마토그래피에 걸어 다시 순화 정제하였다. 역상 크로마토그래피의 조건은 하기와 같다.
HPLC 장치: 펌프: HITACHI L-6300, 검출기: L-4000H
칼럼: PROTEIN C4 214TP5410(VYDAC사)
용출조건: 24-40% 아세토니트릴 직선 구배/0.1% 트리플루오로아세트산(20분) 실온에서 용출
유속: 1.O㎖/분
검출파장: 280nm
상기 조건하에서 정제한 효소 시료를 막 카트리지(퍼킨엘머사)를 사용하여 폴리비닐리덴-디플루오라이드(PVDF)막에 전사하고, 기체-상 단백질 서열분석기 PPSQ-10(시마쓰세이사쿠쇼제)으로 N-말단 아미노산 서열을 분석하였다. 그 결과, 서열번호 40에 기재된 20개 N-말단 아미노산 잔기의 부분서열을 수득하였다.
(서열번호 40) Gln Ala Asp Ile Lys Asp Arg Ile leu Lys Ile Pro
1 5 10
Gly Met Lys Phe Val Glu Glu Lys
15 20
(2) 에스. 모바라엔스 IFO 13819 유래의 프롤린 특이적 펩티다제(svPEP) 유전자의 수득
결정된 svPEP의 N-말단의 20개 아미노산 서열로부터 추정되는 염기서열 중에서 축퇴가 적은 부위 Lys-Ile-Pro-Gly-Met-Lys-Phe-Val-Glu-Glu-Lys(서열번호 41)를 선택하고, 서열번호 42에 기재된 합성 올리고뉴클레오타이드를 작제하였다. 이러한 합성 올리고뉴클레오타이드를 프로브로서 통상적인 방법에 따라 제조한 에스. 모바라엔스 IFO 13819의 염색체 DNA를 6개의 염기서열을 인식하는 각종 제한효소로 분해하여 서던 블롯 하이브리드화법에 의해 분석하였고, 이로써 SacI 절단에 의해 약 6kb의 단일 밴드가 검출되었다. 따라서, 상기 방법에 따라 제조한 에스. 모바라엔스 IF0 13819의 염색체 DNA를 SacI로 분해하고 약 6kb의 단편을 EASYTRAP Ver.2(다카라슈조사)를 사용하여 아가로스 겔 전기영동으로 회수하였다. 회수 단편을 pUC18의 SacI 부위에 삽입한 다음, 에스케리키아 콜라이 JM109(다카라슈조사)의 컴피턴트 세포에 도입하여 라이브러리를 작제하였다. 작제한 라이브러리를 서열번호 38에 기재된 32P-표지된 합성 올리고뉴클레오타이드를 프로브로서 콜로니 하이브리드화에 의해 라이브러리를 스크리닝하고, svPEP 유전자 단편이 클로닝된 플라스미드를 함유하는 균주를 스크리닝하여 목적하는 유전자를 수득하였다. 이 균주에서 회수한 플라스미드를 pUMP1이라고 명명하였다.
(서열번호 42) 5'-AAGATCCCCGGGATGAAGTTCGTCGAGGAGAAG-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열번호 42: svPEP용 프로브
pUMP1로서 클로닝된 단편의 염기서열을 결정하였다. 이 유전자에 암호화되는 아미노산 서열을 추정하였고, 이로써 상기 정제 효소 단백질에서 결정한 N-말단 부분 아미노산 서열(20개 잔기)를 밝혀내고 서열번호 9에 기재된 바와 같은 svPEP의 시그날 서열 및 프로-구조로 상정되는 영역을 포함하는 전체 아미노산의 1차 서열을 결정하였다. 아미노산 서열 1 내지 25번째가 시그날 서열이고 26 내지 33번 째가 프로-구조부이며 아미노산 서열 34 내지 477번째가 성숙형 svPEP로 추정된다.
pUMP1로 형질전환된 에스케리키아 콜라이 AJ13691을 FERM BP-7160으로서 2000년 5월 15일자로 부다페스트 조약에 근거하여 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(현, 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1-1-1 츄오 제6, 우편번호305-8566)에 기탁하고 있다.
(3) 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질의 시그날 서열을 갖는 프로-구조부 부착 프롤린 특이적 펩티다제(svPEP) 유전자(이종 융합 프리프로프롤린 특이적 펩티다제(svPEP) 유전자)의 작제
실시예 7(2)에서 결정한 svPEP의 서열을 참고로 하여 실시예 7(2)에서 작제한 pUMP1을 주형으로 서열번호 43과 서열번호 44에 기재된 프라이머를 합성하였고, svPEP의 프로-구조, 및 성숙 svPEP를 함유하는 유전자 영역을 지금까지와 동일한 방법으로 PCR법으로 증폭시켰다.
(서열번호 43) 5'-GAGGCGGCGTCGATCACCGCCCC-3'
(서열번호 44) 5'-GCCAAGCTTGAAGCACCGGCGGCGGCACCCGG-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열번호 43 및 44: PCR 프라이머
이어서, 실시예 4(2)에서 작제한 pPKSPTG1을 주형으로 서열번호 38과 서열번호 45의 조합에 의해 씨. 글루타미쿰의 세포 표층 단백질인 PS2 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 5'-상류 영역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 SlpA 유전자의 시그날 서열을 포함하는 영역을 PCR법으로 증폭시켰다.
서열번호 45에 기재된 프라이머는 프로-구조부 부착 svPEP와의 융합 유전자를 작제하기 위해 svPEP의 N-말단의 아미노산을 암호화하는 서열을 포함하고 있다.
(서열번호 38) 5'-GGCAAGCTTAAATTCCTGTGAATTAGCTGA-3'
(서열번호 45) 5'-GGGGCGGTGATCGACGCCGCCTCTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCCA-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열번호 38 및 45: PCR 프라이머
이어서, 각각 증폭시킨 svPEP의 프로-구조, 및 성숙 svPEP를 함유하는 유전자를 암호화하는 영역의 PCR 반응액 각각 1㎕와 예상대로 증폭시킨 PS2 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 5'-상류 영역 및 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 SlpA의 시그날 서열을 포함하는 영역의 PCR 반응액 1㎕를 혼합하여 주형으로 하고 서열번호 38과 서열번호 44를 사용하여 교차 PCR을 실시하고 PS2 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 5'-상류 영역과 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질 SlpA의 시그날 서열에 결합된 이종 융합 프리프로 svPEP 유전자 단편을 증폭시켰다.
(서열번호 38) 5'-GGCAAGCTTAAATTCCTGTGAATTAGCTGA-3'
(서열번호 44) 5'-GCCAAGCTTGAAGCACCGGCGGCGGCACCCGG-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열번호 38 및 44: PCR 프라이머
아가로스 겔 전기영동에 의해 약 2.1kb의 증폭 단편을 검출하였다. PCR 산물을 HindIII으로 분해한 다음, 아가로스 겔 전기영동에 제공하여 약 2.1kb의 단편 을 아가로스 겔로부터 회수하고 실시예 6(1)에 기재된 pVSS1의 HindIII 부위에 삽입함으로써 각각 pVSSSP1을 수득하였다. 통상적인 방법에 따라서 삽입 단편의 염기서열을 결정하였고, 예상대로 융합 유전자가 작제되고 있는 것을 확인하였다.
(4) 씨. 암모니아게네스의 세포 표층 단백질의 시그날 서열을 사용하는 프롤린 특이적 펩티다제의 분비
작제된 플라스미드 pVSSSP1을 사용하여 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869를 형질전환시키고, 5mg/ℓ의 클로람페니콜을 함유하는 상기 CM2S 한천 배지에서 생육시킨 균주를 선택하였다. 이어서, 선택한 pVSSSP1을 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869를 5mg/ℓ의 클로람페니콜을 함유하는 상기 MMTG 액체 배지에서 30℃로 70시간 동안 배양하였다. 이 배양액 1㎖를 원심분리로 배양 상등액과 균체로 분리하였다. 균체를 0.1M 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에 현탁시켰다. svPEP의 활성을 아래와 같이 결정하였다. 0.25mM의 Ala-Ala-Pro-pNA(바켐사)를 함유하는 20mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에 배양 상등액 또는 균체 현탁액 50㎕를 가하고 총 액량 0.6㎖로 30℃에서 20분 동안 반응시킨 다음, 50% 아세트산을 0.4㎖ 가하여 반응을 정지시켰다. 410nm의 흡광도를 측정하여 유리된 pNA의 양을 산출함으로써 활성을 결정하였다. 또한, 효소 1단위는 1분 동안에 1μmol의 pNA를 유리시키는 효소량으로 한다. 그 결과, 배양 상등액에서는 svPEP의 활성은 검출되지 않았고, 균체 현탁액에서는 활성을 검출할 수 있었다. 검출된 활성치와 실시예 7(1)에 따른 비활성치(35.5u/mg)로부터 계산한 결과, 약 50mg/ℓ상당의 svPEP가 균체 표면에서 분비 발현하는 것이 확인되었다.
(5) 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869에서 분비 발현된 세린 프로테아제와 프롤린 특이적 펩티다제에 의한 프로-구조부 부착 트랜스글루타미나제의 프로-구조부의 절단
작제된 플라스미드 pVSSSP1을 사용하여 실시예 4(2)에 기재된 프로-구조부 부착 트랜스글루타미나제의 분비 발현 플라스미드 pPKSPTG1을 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869를 형질전환시키고, 5mg/ℓ의 클로람페니콜과 25mg/ℓ의 카나마이신을 함유하는 상기 CM2S 한천 배지에서 생육한 균주를 선택하였다. 이어서, 선택한 pVSSSP1 및 pPKSPTG1을 갖는 씨. 글루타미쿰 ATCC 13869를 5mg/ℓ의 클로람페니콜과 25mg/ℓ의 카나마이신을 함유하는 MMTG 액체 배지에서 30℃로 70시간 동안 배양하였다. 배양 종료후, 10㎕의 배양 상등액을 SDS-PAGE에 제공한 후, 항-트랜스글루타미나제 항체를 사용하여 통상적인 방법에 따라서 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다. 그 결과, SAMP45 및 svPEP가 정상으로 분비 발현되고, 예상대로 분비되고 있는 프로-구조부 부착 트랜스글루타미나제의 프로-구조부가 절단되고 천연형의 성숙 트랜스글루타미나제와 거의 동일한 분자량을 갖는 트랜스글루타미나제의 분비가 확인되었다.
이러한 배양 상등액에서 하이드록사메이트법으로 트랜스글루타미나제 활성을 확인하였고, 이로써 천연형과 거의 동일한 비활성(약 20U/mg)을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
또한, SDS-PAGE후, 상기 방법에 따라 PVDF막에 세미-드라이 블로팅하였다. 블로팅한 다음, PVDF막을 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue)로 염색하여 탈염시키고, 바람으로 건조시켰다. 성숙 트랜스글루타미나제의 부분을 절취하고 프로테인 서열분석기로 N-말단 아미노산 서열을 분석하였다. 그 결과, 서열번호 6에 기재된 에스. 모바라엔스 유래의 77번째의 Asp에서 시작되는 천연형의 성숙 트랜스글루타미나제와 동일한 N-말단을 갖는 서열을 갖고 있는 것이 확인되었다.
실시예 8: 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872의 세포 표층 단백질의 시그날 서열 및 사람 상피세포 증식인자(hEGF)를 암호화하는 서열을 갖는 융합 유전자를 사용하는 사람 상피세포 증식인자의 분비 생산
(1) 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869의 세포 표층 단백질의 시그날 서열을 갖는 hEGF 유전자의 작제
코리네박테리움 글루타미쿰의 세포 표층 단백질인 PS2의 유전자 서열은 이미 결정되어 있다[참고문헌: Mol. Microbiol., 9, 97-109(1993)]. 이 서열을 참고로 서열번호 46과 서열번호 47에 기재된 프라이머를 합성하고 사이토, 미우라의 방법[참고문헌: Biochem. Biophys. Act., 72, 619(1963)]에 의해 제조된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869의 염색체 DNA로부터 PS2에 상응하는 5'-상류 영역과 N-말단의 44개 아미노산 잔기를 암호화하는 영역을 PCR법으로 증폭시켰다. 서열번호 46에 기재된 프라이머는 5'-말단에서 플라스미드내에 삽입하기 위해 필요한 제한효소 KpnI의 인식서열을 포함하고 있다.
(서열번호 46) 5'-GCTCGGTACCCAAATTCCTGTGAATTAGCTGATTTAG-3'
(서열번호 47) 5'-GTTGAAGCCGTTGTTGATGTTGAA-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열번호 46 및 47: PCR 프라이머
한편, 서열번호 48과 서열번호 49에 기재된 프라이머를 합성하고, hEGF 유전자 서열을 포함하는 플라스미드 pT13S△hIL2-KS-hEGF(H3)[일본 공개특허공보 제(소)64-2583호]로부터 hEGF를 암호화하는 영역을 PCR법으로 증폭시켰다. 또한 당해 유전자를 함유하는 플라스미드 pT13S△hIL2-KS-hEGF(H3)로 형질전환시킨 에스케리키아 콜라이 AJ 12354는 FERM P-9719로서 1987년 11월 20일에 현 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터[일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1-1-1 츄오 제6, 우편번호305-8566]에 원기탁되어 있으며 2002년 3월 18일자로 동센터에서 부다페스트 조약에 근거하는 국제기탁으로 이관되어 수탁번호 FERM BP-7966이 부여되어 있다.
서열번호 48에 기재된 프라이머는 PS2에 상응하는 단백질의 5'-상류 영역 및 N-말단의 44개 아미노산 잔기를 암호화하는 영역의 융합 유전자를 작제하기 위해 PS2의 시그날 서열의 C-말단 아미노산을 암호화하는 유전자 서열을 포함하고 있다.
(서열번호 48) 5'-AACATCAACAACGGCTTCAACAATTCCGATTCTGAGTGCCCT-3'
(서열번호 49) 5'-CGGCCACGATGCGTCCGGCG-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열번호 48 및 49: PCR 프라이머
이어서, 증폭시킨 코리네박테리움 글루타미쿰의 PS2에 상응하는 단백질의 5'-상류 영역 및 N-말단의 44개 아미노산 잔기를 암호화하는 영역의 PCR 반응액 1㎕와 예상대로 증폭시킨 hEGF의 유전자 영역의 PCR 반응액 1㎕를 혼합하여 주형으로 하고 서열번호 46과 서열번호 49를 사용하여 교차 PCR을 실시하고 코리네박테리움 글루타미쿰의 세포 표층 단백질의 5'-상류 영역과 N-말단의 44개 아미노산 잔기를 암호화하는 영역에 결합된 hEGF의 융합 유전자를 증폭시켰다. 아가로스 겔 전기영동으로 약 O.9kb의 증폭 단편을 검출하였다. 이 단편을 EASYTRAP Ver.2(다카라슈조사)를 사용하여 아가로스 겔로부터 회수하였다. 회수한 DNA를 제한효소 KpnI 및 BamHI(다카라슈조사)에 의해 절단하여 DNA 클린-업 시스템(Promega사)에 의해 정제하고, 일본 공개특허공보 제(평)9-322774호에 기재된 플라스미드 pPK4의 KpnI-BamHI 부위에 삽입함으로써 pPKEGF를 수득하였다. 염료 터미네이터 사이클 서열분석 키트(PE 어플라이드바이오시스템즈사)와 DNA 서열분석기 377A(PE 어플라이드바이오시스템즈사)를 사용하여 삽입 단편의 염기서열을 결정하였고, 예상대로 융합 유전자가 작제되어 있는 것을 확인하였다.
(2) 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872의 세포 표층 단백질의 시그날 서열을 갖는 hEGF 유전자의 작제
코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872의 세포 표층 단백질(SlpA)의 서열[일본 공개특허공보 제(평)10-108675호]을 참고로 서열번호 24와 서열번호 50에 기재된 프라이머를 합성하고, 실시예 8(1)에 기재된 방법에 따라 제조한 코리네박테리움 암모니아게네스의 염색체 DNA로부터 세포 표층 단백질(SlpA)의 5'-상류 영역과 N-말단의 25개 아미노산 잔기를 암호화하는 영역을 PCR법으로 증폭시켰다. 또한 서열번호 50에 기재된 프라이머는 hEGF와의 융합 유전자를 작제하기 위해 hEGF의 N-말단 아미노산을 암호화하는 서열을 포함하고 있다.
(서열번호 24) 5'-GCCCAGAAGCCCAAAATTGAGATTT-3'
(서열번호 50) 5'-AGGGCACTCAGAATCGGAATTTGCCGTTGCCACAGGTGCGGCC-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열번호 24 및 50: PCR 프라이머
한편, 서열번호 51과 서열번호 49에 기재된 프라이머를 합성하고 hEGF 유전자 서열을 포함하고 있는 플라스미드 pT13S△hIL2-KS-hEGF(H3)[일본 공개특허공보 제(소)64-2583호]로부터 hEGF를 암호화하는 영역을 PCR법으로 증폭시켰다.
(서열번호 49) 5'-CGGCCACGATGCGTCCGGCG-3'
(서열번호 51) 5'-AATTCCGATTCTGAGTGCCCT-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열번호 49 및 51: PCR 프라이머
이어서, 증폭시킨 코리네박테리움 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 5'-상류 영역 및 N-말단의 25개 아미노산 잔기를 암호화하는 영역의 PCR 반응액 1㎕와 hEGF 유전자 영역의 PCR 반응액 1㎕를 혼합하여 주형으로 하고 서열번호 49와 서열번호 24를 사용하여 교차 PCR을 실시하고 코리네박테리움 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 5'-상류 영역과 N-말단의 25개 아미노산 잔기를 암호화하는 영역에 결합된 hEGF의 융합 유전자를 증폭시켰다.
또한, 서열번호 52와 서열번호 53에 기재된 프라이머를 합성하고, 실시예 8(1)에 의해 작제한 플라스미드 pPKEGF를 주형으로 PS2에 상응하는 단백질의 5'-상류 영역을 PCR법으로 증폭시켰다. 또한 서열번호 53에 기재된 프라이머는 PS2에 상응하는 단백질의 5'-상류 영역의 3'-말단 서열 및 코리네박테리움 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 시그날 서열 N-말단 아미노산을 암호화하는 서열을 포함하고 있다.
(서열번호 52) 5'-GAATTCGAGCTCGGTACCCA-3'
(서열번호 53) 5'-AGCGATTTCATGCGTTTCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAA-3'
<서열목록 프리 텍스트> 서열번호 52 및 53: PCR 프라이머
한편, 먼저 PCR로 증폭시킨 코리네박테리움 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 5'-상류 영역을 포함하는 시그날 서열을 갖는 hEGF 유전자와의 융합 유전자의 서열을 기초로 서열번호 54와 서열번호 49에 기재된 프라이머에 의해 코리네박테리움 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 시그날 서열을 갖는 hEGF의 유전자 영역을 PCR법으로 증폭시켰다. PCR 반응에는 Pyrobest DNA 폴리머라제(다카라슈조사)를 사용하고 있고 반응조건은 이의 프로토콜에 따랐다.
(서열번호 49) 5'-CGGCCACGATGCGTCCGGCG-3'
(서열번호 54) 5'-ATGAAACGCATGAAATCGCTGGC-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열번호 49 및 54: PCR 프라이머
이어서, 증폭시킨 코리네박테리움 글루타미쿰의 PS2에 상응하는 단백질의 5'-상류 영역의 PCR 반응액 1㎕와 예상대로 증폭시킨 코리네박테리움 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 시그날 서열을 갖는 hEGF의 유전자 영역의 PCR 반응액 1㎕를 혼합하여 주형으로 하고 서열번호 52와 서열번호 49를 사용하여 교차 PCR을 실시하고, 코리네박테리움 글루타미쿰의 PS2에 상응하는 단백질의 5'-상류 영역과 코리네박테리움 암모니아게네스의 세포 표층 단백질(SlpA)의 N-말단의 25개 아미노산 잔기를 암호화하는 영역에 결합된 hEGF의 융합 유전자를 증폭시켰다. PCR 반응에는 Pyrobest DNA 폴리머라제(다카라슈조사)를 사용하고 있고, 반응조건은 이의 프로토콜에 따랐다. 아가로스 겔 전기영동으로 약 0.9kb의 증폭 단편을 검출하였다. 이 단편을 EASYTRAP Ver.2(다카라슈조사)를 사용하여 아가로스 겔로부터 회수하고, 제한효소 KpnI 및 BamHI(다카라슈조사)에 의해 절단하여 DNA 클린-업 시스템(Promega사)으로 정제하였다. 이를 일본 공개특허공보 제(평)9-322774호에 기재된 플라스미드 pPK4의 KpnI-BamHI 부위에 삽입함으로써 pPSEGF를 수득하였다. 다이 터미네이터 사이클 시퀀싱 키트(PE 어플라이드바이오시스템즈사)와 DNA 서열분석기 377A(PE 어플라이드바이오시스템즈사)를 사용하여 삽입 단편의 염기서열을 결정하였고, 예상대로 융합 유전자가 작제되어 있는 것을 확인하였다.
(3) hEGF 생산주의 작제
(2)에서 작제한 hEGF 발현 플라스미드 pPSEGF를 사용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869를 전기천공법에 의해 형질전환시키고, 카나마이신 내성주를 수득하였다. 수득된 균주를 25mg/ℓ의 카나마이신을 함유하는 MMTG 액체 배지(증류수 1L당 글루코스 60g, 황산마그네슘7수화물 0.4g, 황산암모늄 30g, 인산2수소칼륨 1g, 황산철7수화물 0.01g, 황산망간5수화물 0.01g, 티아민 염산염 450μg, 비오틴 450μg, DL-메티오닌 0.15g, 탄산칼슘 50g, pH 7.5로 조절)에서 각각 30℃로 3일 동안 진탕 배양하였다. 균체를 원심분리로 제거한 배양 상등액 10㎕를 SDS- PAGE에 제공하였다. 시판중인 hEGF(PEPRO TECHEC LTD사)를 표준으로서 동시에 전기영동하고, 쿠마시 브릴리언트 블루(CBB) 염색을 실시한 결과, 동일 이동도의 위치에 밴드를 검출하였다. 배양 상등액 중에 다른 불순 단백질은 거의 검출되지 않았다.
(4) 플라스미드 pPSEGF를 갖는 hEGF 생산주의 hEGF 생산량의 측정
hEGF 생산주의 배양 상등액을 완충액으로서 O.1% TFA/24% 아세토니트릴, O.1% TFA/44% 아세토니트릴, 1%/분 선형 구배, 1.0ml/분의 유속 및 280nm의 검출을 사용하는 HPLC 칼럼(YMC-AP203Ca300A. C18, 입자직경 5μm, 직경 4.6mm ×길이 250mm)으로 분석하였고, hEGF의 표준을 분석할 경우 피크 면적과의 비교에 의해 정량한 결과, 대략 100mg/ℓ였다.
(5) 플라스미드 pPSEGF를 갖는 hEGF 생산주에 의해 분비된 hEGF의 생물 활성 측정
hEGF 생산주의 배양 상등액중 EGF 활성을 측정하였다. MCF-7 세포[참고문헌: A.V. Kriskman, Journal of Bone and research, 6, 1099-1107, 1991]를 96-웰 플레이트에 1웰당 시초 세포수 1×104개로 뿌리고 EGF 생산주의 배양 상등액의 2배 희석열을 첨가하였다. 72시간 동안 배양한 후의 티미딘의 수득량을 측정하였다. 시판중인 hEGF(프나코시사) 107U/mg와 비교하여 활성치를 산출한 결과, 1.4×109U/ml이었다.
(6) 플라스미드 pPSEGF를 갖는 hEGF 생산주에 의해 분비된 hEGF의 N-말단 아미노산 서열의 분석
hEGF 생산주의 배양 상등액 120㎕를 HPLC 칼럼에 걸어 HPLC에 의한 정량으로 기재된 조건으로 분리하였다. 표준 hEGF의 용출 위치와 일치하는 피크를 분취하였다. 이 샘플을 N-말단 아미노산 분석에 제공하였다. 기체-상 아미노산 서열분석기 PPSQ-10(시마쓰세이사쿠쇼사)를 사용하여 측정하였다. 측정 결과는 N-말단에서 1 잔기째 Asn, 2 잔기째 Ser, 3 잔기째 Asp, 4 잔기째 Ser였다. 이 결과는 서열번호 55에 기재된 hEGF의 아미노산 서열의 N-말단 서열과 일치하였다.
(7) 플라스미드 pPSEGF를 갖는 hEGF 생산주에 의해 분비된 hEGF의 분자량 측정
hEGF 생산주의 배양 상등액 120㎕를 HPLC 칼럼에 걸어 HPLC에 의한 정량으로 실시예 (4)에 기재된 조건으로 분리하였다.
용출된 hEGF의 피크를 분취하였다. 이 샘플을 다시 상기 HPLC에 의해 분취하였고 HPLC에서 1피크인 것을 확인하였다. 이 샘플을 분자량 분석에 제공하였다. MLALDI-TOFMS(매트릭스 지원 레이저 탈이온화-비행시간형 질량분석계) MALDI IV(시마쓰세이사쿠쇼사)를 사용하여 측정하였다. 2회의 측정치의 평균은 6176이고, 이 결과는 hEGF의 분자량, 즉 분자내에 3개의 S-S 결합이 존재한다고 가정하여 계산된 이론치 6217과 오차 범위내였다. 따라서, 상기 기재된 방법으로 작제된 EGF 생산주에 의해 분비된 hEGF는 예상된 아미노산 서열 및 구조를 갖는 것이 확인되었다.
실시예 9: 이종 단백질의 분비 능력이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 AJ12036 및 AJ12036 유래의 세포 표층 단백질(PS2) 유전자 파괴주의 작제와 이들 변이주를 사용하는 이종 단백질의 분비 생산평가
(1) 코리네박테리움 글루타미쿰 AJ12036 유래의 세포 표층 단백질(PS2) 유전자 파괴주의 작제
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869 유래의 스트렙토마이신(Sm) 내성주 AJ 12036는 이미 육종되어 있고, 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 유전자 재조합을 위한 하나의 숙주로서 사용되고 있다(미국 특허 제4,822,738호). 코리네박테리움 글루타미쿰(구명칭: 브레비박테리움 락토퍼멘툼) AJ 12036은 1984년 3월 26일자로 FERM BP-734로서 통상산업성 공업기술원 미생물공업기술연구소(현, 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터-일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1-1-1 츄오 제6,우편번호 305-8566)에 기탁되어 있다.
AJ 12036주는 배지중에 세포 표층 단백질(PS2)을 소량 분비하고 있는 것이 확인되므로, 완전하게 PS2를 생성하지 않도록 유전자 파괴를 실시할 경우 단백질의 분비 효율을 보다 향상시킬 수 있는 것으로 간주되었다. 따라서, 아래와 같이 PS2 유전자 완전 결손주를 상동 재조합법을 사용하여 작제하였다.
사이토, 미우라의 방법[참고문헌: Biochim. Biophys. Acta.,72, 619(1963)]으로 제조한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869의 염색체 DNA로부터 하기 기재된 프라이머를 합성하고 서열번호 56과 57, 서열번호 58과 59의 조합으로 PCR을 실시하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869의 PS2 유전자 서열은 미국 특허 제5,547,864호에 기재되어 있고, 또한 암호화 영역의 일부 및 이의 5'-상류 영역의 유전자 서열은 서열번호 4에 기재되어 있다.
이어서, 증폭된 각각의 단편과 서열번호 56 및 59의 프라이머의 조합으로 교차 PCR을 실시하고 PS2 유전자의 프로모터 영역 및 암호화 영역의 N-말단을 결손시킨 △PS2 단편을 증폭시켰다. 이 단편을 pUC19의 SmaI 부위에 클로닝하여 pU△PS2를 작제하였다. pU△PS2를 KpnI 및 XbaI로 분해하여 PS2 단편을 절단하고, 플라스미드 pHM1519 유래의 온도 감수성 플라스미드 벡터인 pHS4(미국 특허 제5,616,480호)의 KpnI-XbaI 부위에 삽입함으로써 pHS△PS2를 작제하였다. 플라스미드 pHS4로 형질전환시킨 에스케리키아 콜라이 AJ 12570은 FERM BP-3523으로서 1990년 10월 11일자로 공업기술원 생명공학공업기술연구소(현, 독립행정법인, 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 일본 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1-1-1 츄오 제6, 우편번호 305-8566)에 기탁되어 있다.
(서열번호 56) 5'-act ggg agg cta tct cca tt-3'
(서열번호 57) 5'-atc gat ctg atc acg tta ca-3'
(서열번호 58) 5'-tgt aac gtg atc aga tcg att cac tgg tcg aca ccg ttg a-3'
(서열번호 59) 5'-acg gaa gct acc ttc gag gt-3'
<서열목록 프리 텍스트>
서열번호 56 내지 59: PCR 프라이머
이어서, pHS△PS2를 AJ 12036주에 전기천공에 의해 도입하고, 일본 특허등록 2763054에 기재된 상동 재조합법에 의해 PS2 유전자 완전 결손주를 수득하였다. 본 주를 YDK O10주라고 명명한다.
(2) 코리네박테리움 글루타미쿰 AJ 12036 및 AJ 12036 유래의 세포 표층 단백질(PS2) 유전자 파괴주를 사용하는 이종 단백질의 분비 생산 평가
AJ 12036주와 YDK 010주에 프로트랜스글루타미나제 분비 발현 플라스미드인 실시예 4(2)의 pPKSPTG1을 도입하고 형질전환체를 수득하였다. 이들 형질전환체와 pPKSPTG1을 야생주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869에 도입한 것을 대조 균주로서 분비 생산량에 관해서 비교 평가하였다.
동일하게 SAMP45 분비 발현 플라스미드 pVSS1, svPEP 분비 발현 플라스미드 pVSSSP1 및 hEGF 분비 발현 플라스미드 pPSEGF에 대해서도 각각 AJ 12036주와 YDK 010주의 형질전환체를 수득하여 분비 생산량을 평가하였다.
25mg/ℓ의 카나마이신을 함유하는 상기 CM2S 한천 배지에서 30℃로 밤새 생육한 균주를 5%의 CaCO3 및 25μg/㎖의 카나마이신으로 보충된 MMTG 배지[글루코스 60g/ℓ, MgSO4·7H20 1g/ℓ, MnSO4·4H20 1g/ℓ, FeSO4 ·7H20 1g/ℓ, (NH4)2SO4 30g/ℓ, KH2PO4 1.5g/ℓ, VB1·HCl 450μg/ℓ, 비오틴 450μg/ℓ, DL-Met 0.15g/ℓ, pH 7.5] 4㎖로 충전시킨 대형 시험관에 접종하여 30℃에서 3일 동안 배양하였다.
변이주에 의한 프로트랜스글루타미나제의 분비 생산량
생산주 프로트랜스글루타미나제
ATCC13869/pPKSPTG1 235mg/ℓ
AJ12036/pPKSPTG1 680
YDK010/pPKSPTG1 700
변이주에 의한 SAMP45의 분비 생산량
생산주 SAMP45
ATCC13869/pVSS1 9mg/ℓ
AJ12036/pVSS1 20
YDK010/pVSS1 22
변이주에 의한 svPEP의 분비 생산량
생산주 svPEP
ATCC13869/pVSSSP1 50mg/ℓ
AJ12036/pVSSSP1 130
YDK010/pVSSSP1 150
변이주에 의한 hEGF의 분비 생산량
생산주 hEGF
ATCC13869/pPSEGF 100mg/ℓ
AJ12036/pPSEGF 280
YDK010/pPSEGF 290

그 결과, 표 3 내지 6에 기재된 바와 같이 숙주를 야생주에서 스트렙트마이신 내성주 AJ12036으로 변경함으로써 상당한 프로트랜스글루타미나제, SAMP45, svPEP 및 hEGF의 분비 생산량의 개선이 확인되었다. 그러나, AJ12036주로부터 세포 표층 단백질(PS2) 유전자를 완전 결손하는 것에 따른 분비 생산량의 향상 효과는 근소하게 확인되는 것에 불과하였다. PS2의 분비에 따른 프로트랜스글루타미나제 및 hEGF의 분비에 대한 길항에 따른 마이너스 효과는 이 경우에는 현저하게는 확인되지 않았다. 단, PS2 유전자 완전 결손주에서는 PS2의 분비가 전혀 확인되지 않는 점으로부터 배지중의 바람직하지 않은 오염 단백질의 분해에 기여하고 있고, 이것이 프로트랜스글루타미나제 및 hEGF의 정제과정에서의 장점이다.
실시예 10: 프로트랜스글루타미나제 분비에 대한 배양 유효인자
상기 pPKSPTG1로 코리네박테리움 글루타미쿰 YDK O1O주를 형질전환한 재조합체를 사용하여 프로트랜스글루타미나제의 분비 생산을 위한 배양조건을 검토하였다.
25mg/ℓ의 카나마이신을 함유하는 상기 CM2S 한천 배지에서 30℃에서 밤새 생육한 균주를 CM2S 액체 배지 20㎖를 함유하는 500㎖ 용적의 경사구 플라스크에 접종하여 30℃에서 밤새 배양하였다. 이를 종균 배양을 위해 사용하였다.
주된 배양으로서 25mg/ℓ의 카나마이신을 함유하는 MMTG 액체 배지[글루코스 6Og/ℓ, MgS04·7H20 1g/ℓ, MnSO4·4H20 1g/ℓ, FeSO4 ·7H20 1g/ℓ, (NH4)2SO4 30g/ℓ, KH2P04 1.5g/ℓ, VB1·HCl 450μg/ℓ, 비오틴 450μg/ℓ, DL-Met 0.15g/ℓ, pH 7.5]를 기본 배지로 하여 S형 병에서 배양하여 CaCl2의 첨가효과를 검토하였다. 300㎖의 배지를 충전하고 종균량은 5%(15㎖)로 하며 용존 산소농도 3% 이하로 억제하여 30℃에서 3일 동안 배양하였다.
배양 종료후, 10㎕의 배양 상등액을 SDS-PAGE에 제공한 후, 상기 기재된 항-트랜스글루타미나제 항체를 사용하여 통상적인 방법에 따라서 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다. 그 결과, 표 7에 기재된 바와 같이 CaCl2를 첨가한 배양 그룹은 무첨가 그룹과 비교하여 약 1.3배 내지 2배의 분비량을 나타내고, 칼슘의 첨가효과가 확인되었다.
프로트랜스글루타미나제의 분비 생산 배양에서 칼슘 이온의 효과
CaCl2(g/ℓ) 프로트랜스글루타미나제 축적(mg/ℓ) 상대비
0 460 1
0.25 610 1.3
0.5 790 1.7
1.0 810 1.8
2.0 930 2.0

또한, 2.0g/ℓ의 CaCl2를 함유하는 MMTG 배지를 사용하여 통기 및 교반 조건을 검토한 결과, 배지중의 용존 산소농도를 측정 한계인 3% 이하로 억제하는 편이 양호한 결과를 수득하였다(표 8).
프로트랜스글루타미나제의 분비 생산 배양에서 용존 산소농도의 효과
용존산소농도 프로트랜스글루타미나제 축적(mg/ℓ) 상대비
3% 이하 930 1.43
3%로 조절 810 1.25
5%로 조절 650 1
본 발명에 따라 코리네박테리움속 세균에 유용 단백질, 예를 들면, 트랜스글루타미나제 또는 사람 상피세포 성장인자 등의 이종 단백질을 다량으로 생성시키고 또한 효율적으로 균체외로 분비시킬 수 있다. 본 발명에 따라 생산되는 단백질은 배지중에 방출되므로 공지된 적절한 방법에 따라 간단하고 대량으로 배지로부터 직접 회수할 수 있다.
본 발명에 따라 코리네형 세균에 산업상 유용한 이종 단백질, 예를 들면, 트 랜스글루타미나제나 사람 상피세포 성장인자를 생산시키고 이것을 효율적으로 균체외로 방출(분비 생산)시킴으로써 이종 단백질을 제조하는 방법이 제공된다.
<110> Ajinomoto Co., Inc. <120> Method for the secretion and production of protein <130> Y1J0182 <150> JP 2001-98808 <151> 2001-03-30 <160> 60 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 43 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 1 Met Arg Asp Thr Ala Phe Arg Ser Ile Lys Ala Lys Ala Gln Ala Lys 1 5 10 15 Arg Arg Ser Leu Trp Ile Ala Ala Gly Ala Val Pro Thr Ala Ile Ala 20 25 30 Leu Thr Met Ser Leu Ala Pro Met Ala Ser Ala 35 40 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala 1 5 10 15 Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala 20 25 30 <210> 3 <211> 25 <212> PRT <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 3 Met Lys Arg Met Lys Ser Leu Ala Ala Ala Leu Thr Val Ala Gly Ala 1 5 10 15 Met Leu Ala Ala Pro Val Ala Thr Ala 20 25 <210> 4 <211> 782 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (579)..(782) <400> 4 aaattcctgt gaattagctg atttagtact tttcggaggt gtctattctt accaaatcgt 60 caagttgtgg gtagagtcac ctgaatatta attgcaccgc acgggtgata tatgcttatt 120 tgctcaagta gttcgaggtt aagtgtattt taggtgaaca aatttcagct tcgggtagaa 180 gactttcgat gcgcttcaga gcttctattg ggaaatctga caccacttga ttaaatagcc 240 tacccccgaa ttgggggatt ggtcattttt tgctgtgaag gtagttttga tgcatatgac 300 ctgcgtttat aaagaaatgt aaacgtgatc agatcgatat aaaagaaaca gtttgtactc 360 aggtttgaag cattttctcc gattcgcctg gcaaaaatct caattgtcgc ttacagtttt 420 tctcaacgac aggctgctaa gctgctagtt cggtggccta gtgagtggcg tttacttgga 480 taaaagtaat cccatgtcgt gatcagccat tttgggttgt ttccatagca atccaaaggt 540 ttcgtctttc gatacctatt caaggagcct tcgcctct atg ttt aac aac cgt atc 596 Met Phe Asn Asn Arg Ile 1 5 cgc act gca gct ctc gct ggt gca atc gca atc tcc acc gca gct tcc 644 Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala Ile Ser Thr Ala Ala Ser 10 15 20 ggc gta gct atc cca gca ttc gct cag gag acc aac cca acc ttc aac 692 Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Gln Glu Thr Asn Pro Thr Phe Asn 25 30 35 atc aac aac ggc ttc aac gat gct gat gga tcc acc atc cag cca gtt 740 Ile Asn Asn Gly Phe Asn Asp Ala Asp Gly Ser Thr Ile Gln Pro Val 40 45 50 gag cca gtt aac cac acc gag gaa acc ctc cgc gac ctg act 782 Glu Pro Val Asn His Thr Glu Glu Thr Leu Arg Asp Leu Thr 55 60 65 <210> 5 <211> 68 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 5 Met Phe Asn Asn Arg Ile Arg Thr Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Ala 1 5 10 15 Ile Ser Thr Ala Ala Ser Gly Val Ala Ile Pro Ala Phe Ala Gln Glu 20 25 30 Thr Asn Pro Thr Phe Asn Ile Asn Asn Gly Phe Asn Asp Ala Asp Gly 35 40 45 Ser Thr Ile Gln Pro Val Glu Pro Val Asn His Thr Glu Glu Thr Leu 50 55 60 Arg Asp Leu Thr 65 <210> 6 <211> 1809 <212> DNA <213> Streptoverticillium mobaraense <220> <221> CDS <222> (578)..(1798) <400> 6 gtcgacgcgg gccgggaggg ggtgcggcgg cgcccttcgg ctgtgtggac gaagcgtcgg 60 gtcggagggg cggccggata tcgtccttgg ggcggggtgg ccggaattgc cgccatggtg 120 ttgccgggga atcgacccga agacatgatc acttctcgta tccacccgat cacgtatccg 180 ggagtcgaga agtgttacgc cgtgcccctg tccgcgtcct cacccctgtc gccgtgacag 240 cgacccgcgt tcttccactc gcacggacgg ccccacagga cctttcggcc cgggctcgcc 300 ccgccgcctc ggtgacggcc tccgaataac gcggccgccg gggcctcggc cggttgaccg 360 atccgggtca cgcgccccgc cgggcgggcg gccacgtccg gtctcgcccc gcccgacatc 420 ggctgcgact gccttcgctc gcacttcttc ccgcctcccg gccgcgtttt tccgccgccg 480 aaggtgcggc gacgcgtacc gaatccccct tcatcgcgac gtgcttccgc acggccgcgt 540 tcaacgatgt tccacgacaa aggagttgca ggtttcc atg cgc ata cgc cgg aga 595 Met Arg Ile Arg Arg Arg 1 5 gct ctc gtc ttc gcc act atg agt gcg gtg tta tgc acc gcc gga ttc 643 Ala Leu Val Phe Ala Thr Met Ser Ala Val Leu Cys Thr Ala Gly Phe 10 15 20 atg ccg tcg gcc ggc gag gcc gcc gcc gac aat ggc gcg ggg gaa gag 691 Met Pro Ser Ala Gly Glu Ala Ala Ala Asp Asn Gly Ala Gly Glu Glu 25 30 35 acg aag tcc tac gcc gaa acc tac cgc ctc acg gcg gat gac gtc gcg 739 Thr Lys Ser Tyr Ala Glu Thr Tyr Arg Leu Thr Ala Asp Asp Val Ala 40 45 50 aac atc aac gcg ctc aac gaa agc gct ccg gcc gct tcg agc gcc ggc 787 Asn Ile Asn Ala Leu Asn Glu Ser Ala Pro Ala Ala Ser Ser Ala Gly 55 60 65 70 ccg tcg 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180 gag ttc gag ggc cgc gtc gcg aag gag agc ttc gac gag gag aag ggc 1171 Glu Phe Glu Gly Arg Val Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly 185 190 195 ttc cag cgg gcg cgt gag gtg gcg tcc gtc atg aac agg gcc ctg gag 1219 Phe Gln Arg Ala Arg Glu Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu 200 205 210 aac gcc cac gac gag agc gct tac ctc gac aac ctc aag aag gaa ctg 1267 Asn Ala His Asp Glu Ser Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu 215 220 225 230 gcg aac ggc aac gac gcc ctg cgc aac gag gac gcc cgt tcc ccg ttc 1315 Ala Asn Gly Asn Asp Ala Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe 235 240 245 tac tcg gcg ctg cgg aac acg ccg tcc ttc aag gag cgg aac gga ggc 1363 Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly 250 255 260 aat cac gac ccg tcc agg atg aag gcc gtc atc tac tcg aag cac ttc 1411 Asn His Asp Pro Ser Arg Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe 265 270 275 tgg agc ggc cag gac cgg tcg agt tcg gcc gac aag agg aag tac ggc 1459 Trp Ser Gly Gln Asp Arg Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly 280 285 290 gac ccg gac gcc ttc cgc ccc gcc ccg ggc acc ggc ctg gtc gac atg 1507 Asp Pro Asp Ala Phe Arg Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met 295 300 305 310 tcg agg gac agg aac att ccg cgc agc ccc acc agc ccc ggt gag gga 1555 Ser Arg Asp Arg Asn Ile Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly 315 320 325 ttc gtc aat ttc gac tac ggc tgg ttc ggc gcc cag acg gaa gcg gac 1603 Phe Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp 330 335 340 gcc gac aag acc gtc tgg acc cac gga aat cac tat cac gcg ccc aat 1651 Ala Asp Lys Thr Val Trp Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn 345 350 355 ggc agc ctg ggt gcc atg cat gtc tac gag agc aag ttc cgc aac tgg 1699 Gly Ser Leu Gly Ala Met His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp 360 365 370 tcc gag ggt tac tcg gac ttc gac cgc gga gcc tat gtg atc acc ttc 1747 Ser Glu Gly Tyr Ser Asp Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe 375 380 385 390 atc ccc aag agc tgg aac acc gcc ccc gac aag gta aag cag ggc tgg 1795 Ile Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp 395 400 405 ccg tgatgtgagc g 1809 Pro <210> 7 <211> 407 <212> PRT <213> Streptoverticillium mobaraense <400> 7 Met Arg Ile Arg Arg Arg Ala Leu Val Phe Ala Thr Met Ser Ala Val 1 5 10 15 Leu Cys Thr Ala Gly Phe Met Pro Ser Ala Gly Glu Ala Ala Ala Asp 20 25 30 Asn Gly Ala Gly Glu Glu Thr Lys Ser Tyr Ala Glu Thr Tyr Arg Leu 35 40 45 Thr Ala Asp Asp Val Ala Asn Ile Asn Ala Leu Asn Glu Ser Ala Pro 50 55 60 Ala Ala Ser Ser Ala Gly Pro Ser Phe Arg Ala Pro Asp Ser Asp Asp 65 70 75 80 Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro Asp Pro Tyr 85 90 95 Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg 100 105 110 Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg Lys Gln Gln Met 115 120 125 Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr 130 135 140 Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala Ser 145 150 155 160 Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn Gly Arg Pro Arg 165 170 175 Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu 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<210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer for the promoter region and signal sequence region of S.mobaraense <400> 14 ggcatcctgt cgagcggctc 20 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 15 aaattcctgt gaattagctg atttag 26 <210> 16 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 16 gagctctccg gcgtatgcgc atagaggcga aggctccttg aata 44 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 17 atgcgcatac gccggagagc tctcgtcttc 30 <210> 18 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 18 ggggtgaccc tgtcgtcgga gtcgttgaag ccgttgttga tgttgaa 47 <210> 19 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 19 cttcgtctct tcccccgcgc cattgtcagc gaatgctggg atagcaacgc c 51 <210> 20 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 20 cttcgtctct tcccccgcgc cattgtcctg agcgaatgct gggatagcta c 51 <210> 21 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 21 cttcgtctct tcccccgcgc cattgtcgtt gaagccgttg ttgatgttga a 51 <210> 22 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 22 cttcgtctct tcccccgcgc cattgtcagt caggtcgcgg agggtttcct c 51 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 23 gacaatggcg cgggggaaga gacgaagtcc 30 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 24 gcccagaagc ccaaaattga gattt 25 <210> 25 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 25 cttcgtctct tcccccgcgc cattgtctgc cgttgccaca ggtgcggcca gc 52 <210> 26 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 26 cgcagccagc gatttcatgc gtttcataga ggcgaaggct ccttgaatag gt 52 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 27 atgaaacgca tgaaatcgct ggctgcggcg 30 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 28 ggatccggag cttatcgact gcacg 25 <210> 29 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 29 cgcagccagc gatttcatgc gtttcataat tctgtttcct gtgtgaaatt gt 52 <210> 30 <211> 1461 <212> DNA <213> Streptoverticillium cinnamoneum <220> <221> CDS <222> (151)..(1398) <400> 30 cggcggcagc cctccttgcc gccggcgcag cgacgcagga cggcgcggcc aaggccctga 60 gcggcagctc gtcgcaaacc cctccatcgc gtcgtgctct cacatgccct cgtttcacga 120 ggcttcacca caagggagtt attgatttcc atg cac aaa cgt cgg aga ctt ctc 174 Met His Lys Arg Arg Arg Leu Leu 1 5 gcc ttc gcc act gtg ggt gcg gtc ata tgc acc gca gga ttc aca cct 222 Ala Phe Ala Thr Val Gly Ala Val Ile Cys Thr Ala Gly Phe Thr Pro 10 15 20 tcg gtc agc cag gcc gcc agc agt ggc gat ggg gaa gag aag ggg tcc 270 Ser Val Ser Gln Ala Ala Ser Ser Gly Asp Gly Glu Glu Lys Gly Ser 25 30 35 40 tac gcc gaa acg cac ggc ctg acg gcg gat gac gtc gag agc atc aac 318 Tyr Ala Glu Thr His Gly Leu Thr Ala Asp Asp Val Glu Ser Ile Asn 45 50 55 gca ctg aac gaa aga gct ctg act ctg ggc caa cct ggc aag cct ccg 366 Ala Leu Asn Glu Arg Ala Leu Thr Leu Gly Gln Pro Gly Lys Pro Pro 60 65 70 aag gaa tta cct ccg agc gcc agc gcg ccc tcc cgg gcc ccc tcc gat 414 Lys Glu Leu Pro Pro Ser Ala Ser Ala Pro Ser Arg Ala Pro Ser Asp 75 80 85 gac cgg gaa act cct ccc gcc gag ccg ctc gac agg atg cct gag gcg 462 Asp Arg Glu Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro Glu Ala 90 95 100 tac cgg gcc tac gga ggc agg gcc act acg gtc gtc aac aac tac ata 510 Tyr Arg Ala Tyr Gly Gly Arg Ala Thr Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile 105 110 115 120 cgc aag tgg cag cag gtc tac agt cac cgc gac gga aag aaa cag caa 558 Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Lys Lys Gln Gln 125 130 135 atg acc gaa gag cag cga gaa aag ctg tcc tac ggt tgc gtt ggc gtc 606 Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Lys Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val 140 145 150 acc tgg gtc aac tcg ggc ccc tac ccg acg aac aga ttg gcg ttc gcg 654 Thr Trp Val Asn Ser Gly Pro Tyr Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala 155 160 165 tcc ttc gac gag aac aag tac aag aac gac ctg aag aac acc agc ccc 702 Ser Phe Asp Glu Asn Lys Tyr Lys Asn Asp Leu Lys Asn Thr Ser Pro 170 175 180 cga ccc gat gaa acg cgg gcg gag ttc gag ggt cgc atc gcc aag ggc 750 Arg Pro Asp Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Ile Ala Lys Gly 185 190 195 200 agt ttc gac gag ggg aag ggt ttc aag cgg gcg cgt gat gtg gcg tcc 798 Ser Phe Asp Glu Gly Lys Gly Phe Lys Arg Ala Arg Asp Val Ala Ser 205 210 215 gtc atg aac aag gcc ctg gaa aat gcc cac gac gag ggg act tac atc 846 Val Met Asn Lys Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Gly Thr Tyr Ile 220 225 230 aac aac ctc aag acg gag ctc acg aac aac aat gac gct ctg ctc cgc 894 Asn Asn Leu Lys Thr Glu Leu Thr Asn Asn Asn Asp Ala Leu Leu Arg 235 240 245 gag gac agc cgc tcg aac ttc tac tcg gcg ctg agg aac aca ccg tcc 942 Glu Asp Ser Arg Ser Asn Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser 250 255 260 ttc aag gaa agg gac ggc ggc aac tac gac ccg tcc aag atg aag gcg 990 Phe Lys Glu Arg Asp Gly Gly Asn Tyr Asp Pro Ser Lys Met Lys Ala 265 270 275 280 gtg atc tac tcg aag cac ttc tgg agc ggg cag gac cag cgg ggc tcc 1038 Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Gln Arg Gly Ser 285 290 295 tcc gac aag agg aag tac ggc gac ccg gaa gcc ttc cgc ccc gac cag 1086 Ser Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Glu Ala Phe Arg Pro Asp Gln 300 305 310 ggt acc ggc ctg gtc gac atg tcg aag gac aga agc att ccg cgc agt 1134 Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Lys Asp Arg Ser Ile Pro Arg Ser 315 320 325 ccg gcc aag ccc ggc gaa ggt tgg gtc aat ttc gac tac ggt tgg ttc 1182 Pro Ala Lys Pro Gly Glu Gly Trp Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe 330 335 340 ggg gct caa aca gaa gcg gat gcc gac aaa acc aca tgg acc cac ggc 1230 Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Thr Trp Thr His Gly 345 350 355 360 gac cac tac cac gcg ccc aat agc gac ctg ggc ccc atg cac gta cac 1278 Asp His Tyr His Ala Pro Asn Ser Asp Leu Gly Pro Met His Val His 365 370 375 gag agc aag ttc cgg aag tgg tct gcc ggg tac gcg gac ttc gac cgc 1326 Glu Ser Lys Phe Arg Lys Trp Ser Ala Gly Tyr Ala Asp Phe Asp Arg 380 385 390 gga gcc tac gtg atc acg ttc ata ccc aag agc tgg aac acc gcc ccc 1374 Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro 395 400 405 gcc aag gtg gag caa ggc tgg ccg tgacaggctg gtactacgac ctctgctgat 1428 Ala Lys Val Glu Gln Gly Trp Pro 410 415 ttctgcccgg tcagtccacg cctctcgacg cga 1461 <210> 31 <211> 416 <212> PRT <213> Streptoverticillium cinnamoneum <400> 31 Met His Lys Arg Arg Arg Leu Leu Ala Phe Ala Thr Val Gly Ala Val 1 5 10 15 Ile Cys Thr Ala Gly Phe Thr Pro Ser Val Ser Gln Ala Ala Ser Ser 20 25 30 Gly Asp Gly Glu Glu Lys Gly Ser Tyr Ala Glu Thr His Gly Leu Thr 35 40 45 Ala Asp Asp Val Glu Ser Ile Asn Ala Leu Asn Glu Arg Ala Leu Thr 50 55 60 Leu Gly Gln Pro Gly Lys Pro Pro Lys Glu Leu Pro Pro Ser Ala Ser 65 70 75 80 Ala Pro Ser Arg Ala Pro Ser Asp Asp Arg Glu Thr Pro Pro Ala Glu 85 90 95 Pro Leu Asp Arg Met Pro Glu Ala Tyr Arg Ala Tyr Gly Gly Arg Ala 100 105 110 Thr Thr Val Val Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser 115 120 125 His Arg Asp Gly Lys Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Lys 130 135 140 Leu Ser Tyr Gly Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Pro Tyr 145 150 155 160 Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asn Lys Tyr Lys 165 170 175 Asn Asp Leu Lys Asn Thr Ser Pro Arg Pro Asp Glu Thr Arg Ala Glu 180 185 190 Phe Glu Gly Arg Ile Ala Lys Gly Ser Phe Asp Glu Gly Lys Gly Phe 195 200 205 Lys Arg Ala Arg Asp Val Ala Ser Val Met Asn Lys Ala Leu Glu Asn 210 215 220 Ala His Asp Glu Gly Thr Tyr Ile Asn Asn Leu Lys Thr Glu Leu Thr 225 230 235 240 Asn Asn Asn Asp Ala Leu Leu Arg Glu Asp Ser Arg Ser Asn Phe Tyr 245 250 255 Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asp Gly Gly Asn 260 265 270 Tyr Asp Pro Ser Lys Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp 275 280 285 Ser Gly Gln Asp Gln Arg Gly Ser Ser Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp 290 295 300 Pro Glu Ala Phe Arg Pro Asp Gln Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser 305 310 315 320 Lys Asp Arg Ser Ile Pro Arg Ser Pro Ala Lys Pro Gly Glu Gly Trp 325 330 335 Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala 340 345 350 Asp Lys Thr Thr Trp Thr His Gly Asp His Tyr His Ala Pro Asn Ser 355 360 365 Asp Leu Gly Pro Met His Val His Glu Ser Lys Phe Arg Lys Trp Ser 370 375 380 Ala Gly Tyr Ala Asp Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile 385 390 395 400 Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Ala Lys Val Glu Gln Gly Trp Pro 405 410 415 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 32 ggcgatgggg aagagaaggg g 21 <210> 33 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 33 ggcggatcct cgcgtcgaga ggcgtggact ga 32 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 34 tacgaattcg agctcggtac c 21 <210> 35 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 35 ccccttctct tccccatcgc ctgccgttgc cacaggtgcg gcc 43 <210> 36 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 36 aacggggaga acagcacggc cgccgg 26 <210> 37 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 37 ggcgaattct ccggcgggcc gtcaccggt 29 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer for fused prepro-serineprotease construction <400> 38 ggcaagctta aattcctgtg aattagctga 30 <210> 39 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer for fused prepro-serineprotease gene construction <400> 39 cggccgtgct gttctccccg tttgccgttg ccacaggtgc ggcc 44 <210> 40 <211> 20 <212> PRT <213> Streptoverticillium mobaraence <400> 40 Gln Ala Asp Ile Lys Asp Arg Ile Leu Lys Ile Pro Gly Met Lys Phe 1 5 10 15 Val Glu Glu Lys 20 <210> 41 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:probe for svPEP <400> 41 Lys Ile Pro Gly Met Lys Phe Val Glu Glu Lys 1 5 10 <210> 42 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:probe for svPEP <400> 42 aagatccccg ggatgaagtt cgtcgaggag aag 33 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 43 gaggcggcgt cgatcaccgc ccc 23 <210> 44 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 44 gccaagcttg aagcaccggc ggcggcaccc gg 32 <210> 45 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 45 ggggcggtga tcgacgccgc ctctgccgtt gccacaggtg cggcca 46 <210> 46 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 46 gctcggtacc caaattcctg tgaattagct gatttag 37 <210> 47 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 47 gttgaagccg ttgttgatgt tgaa 24 <210> 48 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 48 aacatcaaca acggcttcaa caattccgat tctgagtgcc ct 42 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 49 cggccacgat gcgtccggcg 20 <210> 50 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 50 agggcactca gaatcggaat ttgccgttgc cacaggtgcg gcc 43 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 51 aattccgatt ctgagtgccc t 21 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 52 gaattcgagc tcggtaccca 20 <210> 53 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 53 agcgatttca tgcgtttcat agaggcgaag gctccttgaa 40 <210> 54 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 54 atgaaacgca tgaaatcgct ggc 23 <210> 55 <211> 53 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His 1 5 10 15 Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn 20 25 30 Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys 35 40 45 Trp Trp Glu Leu Arg 50 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 56 actgggaggc tatctccatt 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 57 atcgatctga tcacgttaca 20 <210> 58 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 58 tgtaacgtga tcagatcgat tcactggtcg acaccgttga 40 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer <400> 59 acggaagcta ccttcgaggt 20 <210> 60 <211> 4 <212> PRT <213> Streptoverticillium mobaraense <400> 60 Phe Arg Ala Pro 1

Claims (12)

  1. 코리네형 세균중에서 기능하는 프로모터 서열의 하류에 코리네형 세균 유래의 시그날 펩타이드 영역을 암호화하는 핵산 서열이 결합되고, 시그날 펩타이드 영역을 암호화하는 핵산 서열의 하류에 이종 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 결합된 발현 유전자 작제물을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) AJ 12036(FERM BP-734) 또는 이의 세포 표층 단백질을 생산하지 않는 코리네형 세균 변이주를 배양하여 당해 코리네형 세균이 이종 단백질을 생성하도록 하고, 생성된 이종 단백질을 회수하는 것을 특징으로 하는 이종 단백질의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 시그날 펩타이드가 코리네형 세균 유래의 세포 표층 단백질의 시그날 펩타이드인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 시그날 펩타이드가 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 세포 표층 단백질의 시그날 펩타이드인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 시그날 펩타이드가 서열번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 시그날 펩타이드가 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) 유래의 세포 표층 단백질의 시그날 펩타이드인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 시그날 펩타이드가 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 갖는 방법.
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서, 코리네형 세균의 배양이 칼슘이온 2.25mM 내지 18mM을 함유하는 배지에서 실시되는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 코리네형 세균의 배양이 용존 산소농도를 0초과 내지 3%로 조절하면서 실시되는 방법.
  12. 삭제
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