KR100312443B1 - 아드레노메둘린 - Google Patents

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KR100312443B1
KR100312443B1 KR1019940008834A KR19940008834A KR100312443B1 KR 100312443 B1 KR100312443 B1 KR 100312443B1 KR 1019940008834 A KR1019940008834 A KR 1019940008834A KR 19940008834 A KR19940008834 A KR 19940008834A KR 100312443 B1 KR100312443 B1 KR 100312443B1
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tyr
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기따무라가즈오
겐지 간가와
마쯔오히사유끼
이또다네나오
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시오노 요시히코
시오노기세이야쿠가부시키가이샤
겐지 간가와
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Abstract

본 발명은 혈압강하 효과를 갖는 신규한 펩티드인 아드레노메둘린; 카테콜아민 분비 억제 효과를 갖는, 프로아드레노메둘린의 N-말단의 아미노산 서열에 상응하는 프로아드레노메둘린 N-말단 20 펩티드(proAM-N20); Na 채널 억제 효과를 갖는 프로아드레노메둘린 N-말단 10-20 펩티드(proAM-N(10-20)) 및 이들 펩티드를 암호화하는 유전자를 제공한다. 또한 본 발명에 의하면 아드레노메둘린 또는 proAM-N20을 미지량으로 함유하는 시료중에서 이들 펩티드를 아드레노메둘린, proAM-N20 또는 그의 단편에 대한 항체를 사용하여 정량할 수 있다.
본 발명의 아드레노메둘린 및 그의 전구체 단백질은 혈압강하 효과와 혈관 확장효과를 지니므로, 고혈압 및 심부전증과 같은 질병의 치료에 유용하다.

Description

아드레노메둘린
본 발명은 혈압강하 효과를 갖는 신규한 펩티드인 아드레노메둘린과 카테콜아민 분비억제 효과를 갖는 프로아드레노메둘린 N-말단 20펩티드(이하, "proAM-N20"이라 함) 및 Na 채널 억제 효과를 갖는 프로아드레노메둘린 N-말단 10-20펩티드(이하, "proAM-N(10-20)"이라 함)(이들 양 프로아드레노메둘린 N-말단펩티드는 아드레노메둘린의 프로단백질의 일부분이다)에 관한 것이다. 더욱 상술하면, 본 발명은 인간 페노크로모사이토마(phenochromocytoma)(이하, "인간 PC"라 함)로부터 정제할 수 있는 아드레노메둘린; 아드레노메둘린, proAM-N20 및 proAM-N(10-20)의 구조유전자; 구조유전자에 의해 암호화된 아드레노메둘린 및 이의 프로단백질; 구조 유전자를 갖는 발현 벡터; 발현 벡터를 갖는 형질전환체; 이 형질전환체를 사용하는 아드레노메둘린, proAM-N20 및 proAM-N(10-20)의 제조방법; 아드레노메둘린 또는 proAM-N20에 대한 항체; 이 항체를 사용하여 시료중 아드레노메둘린 또는 proAM-N20을 정량하기 위한 어세이; 그리고 항체의 제조와 어세이에 유용한 펩티드에 관한 것이다.
포유동물의 순환계는 여러 신경 및 호르몬의 인자를 포함하는 예민한 메카니즘에 의해 조절된다. 뇌의 나트륨이뇨성 폴리펩티드(BNP), 심방의 나트륨이뇨성 폴리펩티드(ANP) 및 엔도텔린과 같은 혈관확장 펩티드는 심장혈관 계에 있어서의 중요한 조절인자로서 공지되어 있다. BNP와 ANP는 혈압조절시 그리고 전해질 대사조절시 침전되는 것으로 추정된다.
순환계의 복잡한 계를 규명하기 위해서는, 여전히 미확인된 혈관활성 펩티드를 밝혀내는 것이 중요하다. 특히, 고혈압 과분문(hypercardia) 및 심기능부전증의 진단 및 치료에 유용한 혈압강하 펩티드가 요구된다.
본 발명의 펩티드는 SEQ ID No.1에 있어서의 13위치의 Ser으로부터 52위치의 Tyr까지의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 혈압강하 효과를 지닌다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, 본 펩티드는 SEQ ID No.1에 있어서의 1위치의 Tyr로부터 52위치의 Tyr까지의 아미노산 서열을 포함하여 이루어진다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, 본 펩티드는 SEQ ID No.1에 있어서의 -73위치의 Ala로부터 52위치의 Tyr까지의 아미노산 서열을 포함하여 이루어진다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, 본 펩티드는 SEQ ID No.1에 있어서의 13위치의 Ser로부터 52위치의 Tyr까지의 아미노산 서열로 구성된다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, 본 펩티드는 SEQ ID No.1에 있어서의 1위치의 Tyr로부터 52위치의 Tyr까지의 아미노산 서열로 구성된다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, 본 펩티드는 SEQ ID No.1에 있어서의 -73위치의 Ala로부터 52위치의 Tyr까지의 아미노산 서열로 구성된다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, 본 펩티드의 카르복실 말단은 아미드화된다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, 본 펩티드의 카르복실 말단에 Gly가 부착된다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, 본 펩티드는 SEQ ID No.1에 있어서의 -94위치의 Met로부터 91위치의 Leu까지의 아미노산 서열을 포함하여 이루어진다. 이 아미노산 서열에 있어서, -94위치의 Met로부터 -74위치의 Thr까지의 서열은 시그널 펩티드인 것으로 보인다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, SEQ ID No.1에 있어서의 16위치의 Cys와 21위치의 Cys는 디술피드 결합에 의해 연결된다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, SEQ ID No.1에 있어서의 16위치의 Cys와 21위치의 Cys간에 연결된 디술피드 결합은 -CH2-CH2- 결합으로 대체된다.
이와 달리, 본 발명의 펩티드는 SEQ ID No.1에 있어서의 3위치의 Gln으로부터 12위치의 Arg까지의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, SEQ ID No.1에 있어서의 1위치의 Tyr로부터 52위치의 Tyr까지의 아미노산 서열을 인식하는 항체를 생산한다. 상기한 펩티드의 예로는 SEQ ID No.1에 있어서의 3위치의 Gln으로부터 12위치의 Arg 까지의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드와 1위치의 Tyr로부터 12위치의 Arg까지의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드가 포함된다. 그러한 펩티드는 성숙 아드레노메둘린의 N-말단 서열에 상응하고, 항체의 제조와 이러한 항체를 사용하는 어세이에 유용하다.
이와 달리, 본 발명의 펩티드는 SEQ ID No.1에 있어서의 47위치의 I1e으로부터 52위치의 Tyr까지의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, SEQ ID No.1에 있어서의 13위치의 Ser로부터 52위치의 Tyr까지의 아미노산 서열을 인식하는 항체를 생산한다. 상기한 펩티드의 예로는 SEQ ID No.1에 있어서의 47위치의 I1e으로부터 52위치의 Tyr 까지의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드와, SEQ ID No.1에 있어서의 45위치의 Ser로부터 52위치의 Tyr까지의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드 및 SEQ ID No.1에 있어서의 40위치의 Asn으로부터 52위치의 Tyr까지의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드가 포함된다. 그러한 펩티드는 성숙 아드레노메둘린의 C-말단 서열에 상응하고, 항체의 제조와 이러한 항체를 사용하는 어세이에 유용하다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, 성숙 아드레노메둘린의 C-말단 서열에 상응하는 펩티드의 카르복실 말단은 아미드화된다.
또한 본 발명의 다른 펩티드(proAM-N(10-20))는 SEQ ID No.1의 -64위치의 Arg으로부터 -54위치의 Arg까지의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지며, Na 채널 억제 효과를 지닌다. 상기한 펩티드의 예로는 SEQ ID No.1에 있어서의 -73위치의 Ala로부터 -54위치의 Arg까지의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지며, 카테콜아민 분비 억제 효과도 지니는 펩티드(proAM-N20)를 포함한다. 그러한 펩티드는 프로아드레노메둘린의 N-말단 서열에 상응한다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, 프로아드레노메둘린의 N-말단 펩티드의 카르복실 말단은 아미드화된다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, 프로아드레노메둘린의 N-말단 펩티드의 카르복실말단에 Gly가 부착된다.
이와 달리, 본 발명의 펩티드는 SEQ ID No.1에 있어서의 -61위치의 Trp으로부터 -54위치의 Arg까지의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, SEQ ID No.1에 있어서의 -73위치의 Ala로부터 -54위치의 Arg까지의 아미노산 서열을 인식하는 항체를 생산한다. 상기한 펩티드의 예로는 SEQ ID No.1에 있어서의 -61위치의 Trp으로부터 -54위치의 Arg 까지의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드와 SEQ ID No.1에 있어서의 -65위치의 Phe로부터 -54위치의 Arg까지의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드가 포함된다. 그러한 펩티드는 proAM-N20의 C-말단 서열에 상응하고, 항체의 제조와 이러한 항체를 사용하는 어세이에 유용하다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, proAM-N20의 C-말단 서열에 상응하는 펩티드의 카르복실 말단은 아미드화된다.
이와 달리, 본 발명의 펩티드를 형성하는 아미노산 서열중 하나 이상은 표지될 수 있다.
이와 달리, 본 발명의 펩티드는 상기한 펩티드중 어느 하나의 펩티드에 부착된 방사성 동위원소로 표지된 Tyr을 더욱 포함한다.
본 발명의 DNA 서열은 상기한 펩티드중 어느 것이나 암호화한다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, DNA 서열은 SEQ ID No.1에 있어서의 483위치의 A로부터 602 위치의 C까지의 염기 서열을 포함하여 이루어진다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, DNA 서열은 SEQ ID No.1에 있어서의 483위치의 A로부터 605위치의 C까지의 염기서열을 포함하여 이루어진다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, DNA 서열은 SEQ ID No.1에 있어서의 447위치의 T로부터 602위치의 C까지의 염기서열을 포함하여 이루어진다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, DNA 서열은 SEQ ID No.1에 있어서의 447위치의 T로부터 605 위치의 C까지의 염기 서열을 포함하여 이루어진다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, DNA 서열은 SEQ ID No.1에 있어서의 228위치의 G로부터 602위치의 C까지의 염기서열을 포함하여 이루어진다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, DNA 서열은 SEQ ID No.1에 있어서의 228위치의 G로부터 605위치의 C까지의 염기서열을 포함하여 이루어진다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, DNA 서열은 SEQ ID No.1에 있어서의 165위치의 A로부터 719 위치의 T까지의 염기 서열을 포함하여 이루어진다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, DNA 서열은 SEQ ID No.1에 있어서의 255위치의 C로부터 287위치의 T까지의 염기서열을 포함하여 이루어진다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, DNA 서열은 SEQ ID No.1에 있어서의 255위치의 C로부터 290위치의 G까지의 염기서열을 포함하여 이루어진다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, DNA 서열은 SEQ ID No.1에 있어서의 228위치의 G로부터 287 위치의 T까지의 염기 서열을 포함하여 이루어진다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, DNA 서열은 SEQ ID No.1에 있어서의 228위치의 G로부터 290위치의 G까지의 염기서열을 포함하여 이루어진다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, DNA 서열은 SEQ ID No.1에 있어서의 264위치의 T로부터 287위치의 T까지의 염기서열을 포함하여 이루어진다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, DNA 서열은 SEQ ID No.1에 있어서의 252 위치의 T로부터 287위치의 T까지의 염기서열을 포함하여 이루어진다.
본 발명의 발현 벡터는 상기한 DNA 서열중 어느 하나의 서열을 함유한다.
본 발명의 형질전환체는 상기 발현 벡터를 숙주로 도입하여 얻는다.
본 발명의 펩티드의 제조방법은 형질전환체를 배지중에서 배양시키는 단계와 생성된 펩티드를 배지로부터 수집하는 단계를 포함하여 이루어진다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, 제조방법은 수집된 펩티드의 카르복실 말단을 아미드화하는 단계를 더욱 포함한다.
본 발명의 항체는 상기한 펩티드중 어느것이나 인식한다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, 항체는 SEQ ID No.1에 있어서의 1위치의 Tyr로부터 12위치의 Arg까지의 아미노산 서열 또는 이 아미노산 서열중에 포함되는 부위를 인식한다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, 항체는 SEQ ID No.1에 있어서의 3 위치의 Gln 으로부터 12위치의 Arg까지의 아미노산 서열 또는 이 아미노산 서열중에 포함되는 부위를 인식한다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, 항체는 SEQ ID No.1에 있어서의 47 위치의 Ile로부터 52위치의 Tyr까지의 아미노산 서열 또는 이 아미노산 서열에 포함되는 부위를 인식한다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, 항체는 SEQ ID No.1에 있어서의 45 위치의 Ser로부터 52위치의 Tyr까지의 아미노산 서열 또는 이 아미노산 서열중에 포함되는 부위를 인식한다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, 항체는 SEQ ID No.1에 있어서의 40 위치의 Asn 으로부터 52위치의 Tyr까지의 아미노산 서열 또는 이 아미노산 서열중에 포함되는 부위를 인식한다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, 항체는 SEQ ID No.1에 있어서의 -61위치의 Trp로부터 -54위치의 Arg까지의 아미노산 서열 또는 이 아미노산 서열에 포함되는 부위를 인식한다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, 항체는 SEQ ID No.1에 있어서의 -65위치의 Phe로부터 -54위치의 Arg까지의 아미노산 서열 또는 이 아미노산 서열중에 포함되는 부위를 인식한다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, 항체는 카르복실 말단의 카르복실기가 아미드화된 아미노산 서열 또는 이 아미노산 서열중에 포함되는 부위를 인식한다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체이다.
본 발명에 따른 펩티드의 면역학적 어세이는 상기한 항체중 어느 하나의 항체와 상기한 펩티드중 어느 하나의 펩티드를 함유하는 시료를 항원-항체 착체를 형성하는 조건하에 배양하는 단계와, 이 항원-항체 착체를 정량하는 단계를 포함하여 이루어진다.
본 발명의 혈압강하제, 혈관이완제 또는 심기능부전증에 대한 약물은 유효성분으로서 상기한 펩티드를 포함한다.
본 발명의 펩티드의 면역학적 어세이용 킷트는 상기한 항체 모두가 포함된다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, 킷트는 상기한 펩티드 모두가 포함된다.
따라서, 본 발명은 (1) 혈압강하 효과를 갖는 신규한 펩티드 아드레노메둘린과 아드레노메둘린을 포함하는 혈압강하제 또는 혈관이완제를 제공하는 것과; (2) 카테콜아민 분비 억제 효과를 갖는 신규한 펩티드인 proAM-N20과 proAM-N20을 포함하는 카테콜아민 억제제를 제공하는 것과; (3) Na 채널 억제효과를 갖는 proAM-N (10-20) 및 proAM-N(10-20)을 포함하는 Na 채널 억제제를 제공하는 것과; (4) 심기능부전증, 심장 경색증 및 고혈압과 같은 순환계 질병의 치료에 유용한 혈압 강하제, 카테콜아민 억제제 및 Na 채널 억제제를 제공하는 것과; (5) 아드레노메둘린 및 그의 전구체를 암호화하는 DNA 서열을 제공하는 것과; (6) 이 DNA 서열을 갖는 발현 벡터를 제공하는 것과; (7) 이 발현 벡터를 갖는 형질전환체를 제공하는 것과; (8) 필요시, 저렴한 비용으로 아드레노메둘린을 대량 생산할 수 있는 형질전환체를 사용하여 아드레노메둘린을 제조하는 방법을 제공하는 것과; (9) 아드레노메둘린 또는 proAM-N20에 대한 항체를 제공하는 것과; (10) 이 항체를 사용하여 시료중에 고혈압과 같은 순환계 질병의 진단, 예방 및 치료에 사용할 수 있는, 아드레노메둘린을 정량적으로 어세이 하는 방법을 제공하는 것과; (11) 상기한 항체의 제조 및 어세이에 유용한 펩티드를 제공하는 것과; 그리고 (12) 종양 표지물로 사용할 수 있는 아드레노메둘린 또는 proAM-N20에 대한 정량적 어세이를 제공하는 잇점을 갖는다.
이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 사람은 본 발명의 이들 잇점과 기타의 잇점들에 대해 첨부된 도면을 참고하여 상기 상세한 설명을 파악함으로써 명백히 알수 있을 것이다.
본 발명자들은 혈압강하 펩티드를 얻기 위해 광범위한 연구를 한 결과, 인간 PC로부터 신규한 혈압강하 펩티드를 분리해내고, 이 펩티드의 1차구조와 면역학적 특성을 규명하게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.
I. 정의:
본 발명을 설명하기 위해 본원에서 사용된 용어들을 다음과 같이 정의하였다:
"아드레노메둘린"은 신규한 혈압강하 펩티드이다. 특히, 본 발명에 의해 제공된 인간-유도 아드레노메둘린은 첨부된 서열 리스트의 SEQ ID No.1에 있어서의 1위치의 Tyr로부터 52위치의 Tyr까지의 아미노산 서열을 포함한다. 돼지-유도 아드레노메둘린은 첨부된 서열 리스트의 SEQ ID No.2에 있어서의 1위치의 Tyr로부터 52위치의 Tyr까지의 아미노산 서열을 포함한다. 그러나, 본 발명의 아드레노메둘린은 이들 서열에 한정되지는 않으며, 이의 활성에 역효과를 주지 않는 보존적 변형 또는 결손을 함유하는 모든 아미노산 서열이 포함된다. 아드레노메둘린의 C-말단은 아미드화할 수 있다.
SEQ ID No.1에 있어서의 -94위치의 Met로부터 91위치의 Leu까지의 아미노산 서열을 포함하여 이루어진 펩티드는 프레프로아드레노메둘린인 것으로 추정된다. 프레프로아드레노메둘린의 시그날 펩티드의 처리에 의해 얻어지고, SEQ ID No.1에 있어서의 -73위치의 Ala로부터 91위치의 Leu까지의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 펩티드는 프로아드레노메둘린인 것으로 추정된다.
"프로아드레노메둘린 N-말단 20펩티드(proAM-N20)"는 카테콜아민 분비 억제 효과를 갖는 신규한 펩티드이다. 특히, 본 발명에 의해 제공되는 인간-유도 proAM-N20은 SEQ ID No.1에 있어서의 -73위치의 Ala로부터 -54위치의 Arg까지의 아미노산 서열로 구성된다. "프로아드레노메둘린 N-말단 10-20펩티드(proAM-N(10-20)"은 Na채널 억제 효과를 갖는 신규한 펩티드이다. 특히, 본 발명에 의해 제공되는 인간-유도 proAM-N(10-20)은 SEQ ID No.1에 있어서의 -64위치의 Arg로부터 -54위치의 Arg까지의 아미노산 서열로 구성된다. 본 발명의 proAM-N20 및 proAM-N(10-20)은이들 서열에 한정되지는 않으며, 이의 활성에 역효과를 주지 않는 보존적 변형 또는 결손을 함유하는 모든 아미노산 서열이 포함된다. proAM-N20 및 proAM-N(10-20)의 C-말단은 아미드화할 수 있다.
"C-말단의 아미드화"는 펩티드의 C-말단 아미노산중 COOH기를 CONH2로 변화시키는, 펩티드의 변형중 1종이다. 유기체중에서 작용하는 생물학적으로 활성을 갖는 펩티드 중 몇가지를 먼저 고분자량 전구체 단백질로서 생합성한다. 이어서, 이 전구체 단백질을 C-말단의 아미드화와 같은 변형에 의해 성숙시킨다. 이 아미드화는, 전구체 단백질상에서 작용하는 C-말단 아미드화 효소에 의해 수행된다. 전구체 단백질은 아미드화하려는 잔기의 C-말단측상에 있으며, 종종 C-말단측상에 Lys-Arg 및 Arg-Arg와 같은 염기성 아미노산 서열쌍이 이어지는 Gly 잔기가 항상 포함된다[참조:Hizuno, Seikaguku, Vol. 61, No.12, pp.1435-1461(1989)].
본 명세서에서 C-말단에 COOH기를 갖는 통상의 펩티드와 C-말단 아미드화된 펩티드를 각기 펩티드[X-Y] 및 펩티드 [X-Y]NH2(여기서 X 및 Y는 첨부된 서열 리스트에 있어서의 펩티드의 처음과 마지막에 존재하는 아미노산 위치를 나타낸다)로 표시된다.
펩티드중 특이 에피토프가 항체에 의해 인식되는 경우에 항체에 결합하게 됨으로써 펩티드는 항체와 "면역학적 반응성"을 갖는다. 펩티드가 항체와 면역학적 반응성을 갖는지의 여부를 측정하는 여러가지 방법이 이 기술 분야에서 공지되어 있다. 효소-결합 면역흡착 어세이(ELISA) 및 방사면역어세이(RIA)가 특히 바람직하다.
II. 본 발명에서 사용되는 방법.
본 발명에서, 달리 언급한 것을 제외하고는, 이 기술분야에서 모두 공지되어 있는, 단백질의 분리 및 분석방법, 재조합 DNA 기술과 기타 면역학적 방법을 사용한다.
본 발명에서 사용할 수 있는 전형적 방법은 다음과 같다:
(1) 아드레노메둘린의 정제 및 구조적 분석:
본 발명의 아드레노메둘린의 유도는 특히 제한되지 않으며, 인간 PC 또는 돼지 아드레날 메둘라로부터 유도할 수 있다.
인간 PC로부터 얻어진 조 추출물을 다양한 형태의 크로마토그래피로 정제하여 아드레노메둘린을 얻는다. 목적하는 아드레노메둘린을 함유하는 분획물은 혈소판 cAMP의 활성 상승을 검색하여 얻을 수 있다.
혈소판 cAMP의 활성 상승을 검색하는 어세이는 인간 PC로부터, 혈관 활성 장내 폴리펩티드(VIP) 및 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP)와 같은 생물학적 활성을 갖는 펩티드를 분리하는데 사용되어 왔다[참조: kitamura et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 185, 134-141 (1992)]. 이들 펩티드는 효능성 혈압긴장저하 효과를 갖고 있는 것으로 공지되어 있으며, 혈소판 막상의 특이 수용체에 결합하여 세포내 cAMP 함량을 증가시키는 것으로 보인다. 이 어세이는 생물학적 활성을 갖는 펩티드를 연구하는데 양호한 수단이 될수 있다. 따라서, 본 발명자들은 이 어세이가 신뢰할 수 있는 방법인 것으로 판단되어, 인간 PC 조직으로부터 얻은 추출물중에서 혈관활성을 갖는 펩티드를 검출하는데 이 어세이를 채택하였다.
상기한 바와 같이 정제한 아드레노메둘린의 구조분석은 예를 들면, 가스 상 시퀀서(sequencer)등을 사용하여 실시한다.
(2) 아드레노메둘린의 혈압강하 효과의 확인:
상기한 바와 같이 제조한 아드레노메둘린의 혈압강하 효과는 예를 들면, 쥐 뇌의 나트륨이뇨성 폴리펩티드에 대해 보고된 방법과 동일한 방법으로 확인할 수 있다[참조: kita et al., Eur. J. Pharmacol., 202, 73-79(1991)]. 상술하면, 쥐와 같은 실험 동물을 마취시킨다음, 적절한 방법으로 아드레노메둘린을 투여한다. 그후, 상기 동물의 혈압을 혈압 변환기에 접속된 우측 경동맥 카테터를 통해 연속적으로 검색한다. 아드레노메둘린의 투여 전 및 후의 혈압을 비교하여 아드레노메둘린의 혈압강하효과를 확인한다.
(3) 아드레노메둘린 cDNA의 클로닝 및 시퀀싱:
본 발명의 아드레노메둘린을 암호화하는 DNA를 함유한 DNA 단편을 클로닝 및 시퀀싱하는 방법을 하기에 기술한다. 본 발명의 아드레노메들린을 암호화하는 cDNA를 시퀀싱하는 방법의 예를 들면 다음과 같다: cDNA 라이브러리(하기에 상세히 기술한다)를 인간 PC의 총 RNA로부터 제조한다음, 프로브를 사용하여 이 라이브러리를 스크리닝하여 양성 클론을 얻는다. 이 양성 클론을 DNA 시퀀싱 방법으로 서열화한다.
(A) DNA 프로브의 제조:
아드레노메둘린을 암호화하는 cDNA는 예를 들면, 상기한 바와 같은 인간 PC로부터 제조할 수 있다.
인간 PC로부터 유도된 cDNA 라이브러리로부터 아드레노메둘린 cDNA를 클로닝하기 위한 프로브는 다음과 같이 제조한다:
프로브는 상기한 (1)에 기술한 바와 같이 제조한 아드레노메둘린의 아미노 말단에 위치한 펩티드 서열에 따라 직접적으로 또는 간접적으로 제조한다.
간접적 제조방법에서는, 폴리머라제 쇄 반응(PCR)에 대한 DNA 프라이머를 예를 들면, 아미노 말단의 아미노산 서열에 기초하여 합성한다. DNA 프라이머는 하기 와 같이 제조한 PCR용 템플레이트를 증폭하는데 사용하여 스크린용 프로브를 얻을 수 있다. PCR용과 같은 템플레이트를 제조하기 위해서는, 아드레노메둘린이 풍부하게 존재하는 것으로 생각되는, 인간 PC로부터 얻어지는 cDNA를 사용할 수 있다. 그러한 cDNA는 다음과 같이 제조할 수 있다: 구아니딘 티오시안에이트법에 의해 인간 PC로부터 RNA를 추출한다[참고: Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem., 162, 156-159(1987)]. 추출된 RNA를 프라이머와 어닐링한 후, 역 전사효소를 사용하여 프라이머로부터 DNA를 합성하여 목적하는 cDNA를 얻는다.
이와 달리, 그러한 프로브는 다른 비인간 동물로부터 유도된 아드레노메둘린을 암호화하는 DNA로부터 제조할 수 있다. 본 발명자들에 의해 판명된 돼지-유도 프로브를 사용하여 인간-유도된 아드레노메둘린을 암호화하는 DNA를 스크리닝 하는 방법을 하기 실시예에 상세히 기술한다.
상기에서 얻은 프로브를 후속 스크리닝에 사용하기 위해 표지한다.
(B) 라이브러리의 스크리닝:
cDNA 라이브러리는 인간 PC 조직으로부터 이 기술분야에서 공지된 방법으로 제조한다. cDNA 라이브러리의 제조방법은, 예를 들면, 문헌[Hyunh, V. T. et al., DNA Cloning Techniques-A Practical Approach(IRL Press, Oxford. 1984) and Okayama and Berg. Mol. Cell Biol.(1983) 3:280-289]에 개시되어 있다.
상기 (A)항에 기술된 바와 같이 제조된 프로브를 사용하고 적절한 조건하에 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여 목적하는 아드레노메둘린을 암호화하는 cDNA를 함유하는 양성 클론을 얻는다.
(C) cDAN의 시퀀싱:
목적하는 재조합 플라스미드, 즉 상기 (B)항에서 얻은, 양성 클론의 삽입물을 다음과 같이 서열화할 수 있다. 삽입물은 그 안에 존재하는 제한 효소 인식부위에서 절단한다. 절단된 각 DNA 단편은 적절한 서열 벡터, 예를 들면 블루 스크립트(Blue Script)로 서브클론한다. 그후, 클론된 단편의 염기 서열을, 예를 들면 염료프라이머 순환 시퀀싱법 또는 디데옥시 사이클 시퀀싱법으로 자동화된 DNA 시퀀서를 사용하여 측정한다. 이와 같이 하여 전체 단편의 염기서열을 측정한다.
(4) 아드레노메둘린, 그의 전구체 단백질, proAM-N20, 항체를 제조하기 위한 그의 단편 및 proAM-N(10-20)의 제조:
아드레노메둘린, 그의 전구체 단백질, proAM-N20, 항체를 제조하기 위한 그의 단편 및 proAM-N(10-20)은 재조합기술을 포함하는 각종 방법과 화학적 합성법으로 제조할 수 있다. 이 재조합기술에서, 아드레노메둘린, 그의 전구체 단백질,proAM-N20, 그의 단편 및 proAM-N(10-20)을 암호화하는 DNA서열은 다양한 재조합 시스템을 사용하여 발현시킨다. 발현벡터를 제조하고 이 기술분야에서 공지된 방법으로 적절한 DNA 서열을 갖는 형질 전환체를 제조한다. 발현은 원핵생물계(procaryote)와 진핵류(eucaryote)중에서 수행할 수 있다.
원핵생물계 숙주의 예를 들면, E. coli, 바실러스 및 기타 박테리아가 포함된다. 상기한 원핵생물계가 숙주인 경우에는, 복제부위와, 숙주와 상용성인 조절서열을 갖는 플라스미드 벡터를 사용한다. 예를 들면, E.coli는 전형적으로 E. coli로부터 유도된 플라스미드인, pBR322의 유도체로 형질전환된다. 여기에서의 조절서열은 전사, 필요시 오퍼레이터와 리보솜 결합부위의 개시를 위한 프로모터를 포함한다. 그러한 조절 서열은 일반적으로 사용되는 프로모터, 즉 β-락탐아제 및 락토스 프로모터[참조: Chang et al., Nature, (1977) 198, 1056], 트립토판 프로모터 [Goeddel et al., Nucleic Acids Res., (1980)8, 4057], 그리고 λ파지 및 N-유전자 리보솜 결합부위로부터 유도되는 PL프로모터[Shimatake, Nature, (1981) 292, 128]가 포함된다.
유카리오트 숙주의 예로는 이스트가 포함된다. 그러한 유카리오트가 숙주로 사용되는 경우에는, 복제부위와, 숙주와 상용성인 조절서열을 갖는 플라스미드 벡터가 사용된다. 예를 들면, 이스트는 pYEUra3(Clontech)으로 형질전환된다. 이스트 숙주에 유용한 다른 프로모터는 예를 들면, 글리콜분해효소를 합성하는 프로모터, 즉 3-포스포글리세레이트 키나제를 합성하는 프로모터가 포함된다[Hitzeman etal., J. Biol. Chem. (1980) 255, 2073]. 또한 엔올라제 유전자로부터 유도되는 프로모터 또는 YEp13으로부터 얻은 Leu2 유전자로부터 유도되는 프로모터를 사용할 수 있다.
적절한 포유동물 프로모터의 예로는 메탈로티온인, SV40으로부터 유도되는 조기 또는 후기 프로모터 및 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스II, 소의 파필로마 바이러스 및 아비안 사르코마 바이러스로부터 유도되는 것과 같은 기타 바이러스 프로모터가 포함된다.
형질전환체는 발현 벡터를 적절한 숙주세포로 도입하여 얻을 수 있다. 아드레노메둘린, 그의 전구체 단백질, proAM-N20, 그의 단편 및 proAM-N(10-20)과 같은 목적하는 펩티드는 형질전환체를 적절한 조건하에 배양시켜 얻을 수 있다.
C-말단 아미드화된 펩티드는 다음중에서 하나의 방법으로 제조한다. 즉 숙주내에서의 발현에 의해 얻어진 펩티드중 C-말단의 카르복실기를 화학적으로 아미드화하거나; 또는 목적하는 펩티드중 C-말단에 Gly가 부착되도록 펩티드를 제조한다음, 아미드화를 위해 상기한 C-말단 아미드화 효소와 반응시킨다.
아드레노메둘린과 같은, 상기한 펩티드는 이 기술분야에서 공지된 방법으로 화학적으로 합성할 수 있다. 예를 들면, 펩티드는 펩티드 신시사이저를 사용하여 고상법으로 합성할 수 있다. C-말단 아미드화된 펩티드는 다음과 같이 펩티드 신시사이저를 사용하여 합성할 수 있다. 먼저, C-말단 아미노산에 상응하는 아미노산을 벤즈히드릴 아민 수지에 결합시킨다. 그후, 결합된 아미노산의 N-말단에 DCC/HOBt를 사용하는 표준 축합조건하에 결합시킴으로써 축합반응을 수행한다. 이 축합반응을 반복하여 목적하는 아미노산 서열을 얻는다. 얻어진 펩티드 수지로부터 일반적 절단법(트리플루오로메탄술폰산 법)으로 목적하는 펩티드를 절단해 낸다.
예컨대, 펩티드를 공기로 또는 다른 적절한 산화제로 산화시켜 디술피드 결합을 연결시킬 수 있다. 디술피드 결합은 공지방법으로 -CH2-CH2- 결합으로 치환할 수 있다[0. Keller et al., Helv. Chim. Acta(1974) 57:1253]. 일반적으로, 디술피드 결합을 -CH2-CH2- 결합으로 치환함으로써 디술피드 결합이 절단되는 것을 피할 수 있으며, 이로써 안정한 단백질을 얻을 수 있다.
(5) 아드레노메둘린, 그의 전구체 단백질, proAM-N20, 항체의 제조를 위한 그의 단편 및 proAM-N(10-20)의 표지화:
아드레노메둘린, 그의 전구체 단백질, proAM-N20, 항체를 제조하기 위한 그의 단편 및 proAM-N(10-20)은 방사성 동위원소, 효소, 형광물질 등으로 표지할 수 있다. 이들 표지화는 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 사람에게 공지된 방법으로 실시할 수 있다.
표지화에 사용되는 방사성 동위원소의 예로는14C,3H,32P,125I 및131I가 포함되며, 이들중125I가 바람직하다. 이들 방사성 동위원소는 펩티드에 클로라민 T법, 퍼옥시다제법, 요도겐법, 볼톤-헌터(Bolton-Hunter)법 등으로 표지할 수 있다.
표지화에 사용되는 효소의 예로는 호스래디시 퍼옥시다제, 소의 점막 알칼리 포스파타제 및 E. coli β-갈락토시다제가 포함된다.
표지화에 사용되는 형광물질의 예로는 플루오레스카민, 플루오레스세인, 플루오레스세인이소티오시안에이트 및 테트라메틸로다민 이소티오시안에이트가 포함된다.
표지된 펩티드는 추적자로서, 또는 하기한 면역학적 어세이에 유용하다.
(6) 아드레노메둘린, 그의 단편 및 proAM-N20의 면역학적 어세이:
본 발명에서의 면역학적 어세이는 시료중 항원을 정량하는데 사용할 수 있다. 면역학적 어세이의 예로는 방사성 동위원소, 효소, 또는 형광물질로 표지한 항원 및 비표지 항원을 항체와 경쟁적으로 반응시키는 방법이 포함된다. 두 항체를 사용하는 면역어 세이와 샌드위치 기술을 사용할 수도 있다. 두 항체를 사용하는 면역 어세이에서는, 항원을 마이크로플레이트 또는 플라스틱 컵과 같은 고상에서 부동화하고, 묽은 항혈청 또는 정제된 항체로 배양한다음 다시, 방사성 동위원소, 효소 또는 형광물질로 표지한 항면역글로블린으로 배양시켜 표지된 결합 물질을 얻는다. 샌드위치 기술에서는, 항체를 고상에서 부동화하고 항원으로 배양시킨 다음, 방사성 동위원소, 효소 또는 형광물질로 표지한 항체로 배양하여 표지된 결합물질을 얻는다. 표지화에 사용되는 방사성 동위원소의 예를 들면32P,3H,14C,125I 및131I가 포함되며, 이들중125I가 바람직하다. 표지화에 사용되는 효소는 바람직하게는 호스래디시 퍼옥시다제, 소의 점막 알칼리 포스파타제 및 E. coli β-갈락토시다제이다. 이들 중, 호스래디시 퍼옥시다제가 바람직하게 사용된다. 표지화에 사용되는 형광물질의 예로는 플루오레스세인이소티오시안에이트 및 테트라메틸로다민 이소티오시안에이트가 포함된다. 그러나, 방사성 동위원소, 효소 및 형광물질은 여기에 기술된 것들에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 아드레노메둘린, proAM-N20 또는 그의 단편과 같은 펩티드가 면역원으로 사용된다. 그러한 면역원으로는 아미노산 서열, 예컨데 SEQ ID No.1에 있어서의 3위치의 Gln으로부터 12위치의 Arg까지, 1위치의 Tyr로부터 12위치의 Arg까지, 47위치의 Ile로부터 52위치의 Tyr까지, 45위치의 Ser로부터 52위치의 Tyr까지, 또는 40위치의 Asn으로부터 52위치의 Tyr까지의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드; 상기한 아미노산 서열을 포함하고, 아드레노메둘린을 인식하는 항체를 생산할 수 있는 펩티드; SEQ ID No.1에 있어서의 -61위치의 Trp로부터 -54위치의 Arg까지, 또는 -65위치의 Phe로부터 -54위치의 Arg까지의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드; 이들 아미노산 서열을 포함하고 proAM-N20을 인식하는 항체를 생산할 수 있는 펩티드; 소의 티로글로불린 등과 결합된 이들 펩티드가 포함된다. 그러한 면역원을 사용하여, 마우스, 쥐, 토끼, 새 및 염소와 같은 동물을 면역화하여 동물의 혈청으로부터 유도된 항체를 제조한다. 이와 달리, 동물의 비장으로부터 얻은 세포를 미에로마 세포 같은 세포와 융합시켜 히브리도마를 생성시키고, 이로부터 모노클로날 항체를 제조한다.
다음으로, 기지농도의, 비표지 항원과 혈청으로부터 유도된 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 면역화에서 사용된 것과 같은 종류의 항원을 함유하는 표지된 펩티드 소정량에 가하여 항원-항체 경쟁반응을 일으킨다. 항체에 결합된 표지된 항원을 적절한 방법으로 항체에 결합되지 않은 표지된 항원으로부터 분리한 다음, 항체에 결합된 표지된 항원의 방사성 또는 효소활성을 측정한다. 이 조작을 비표지된 항원의 농도를 달리하여 반복한다. 비표지된 항원의 농도가 증가함에 따라 항체에 결합된 표지된 항원의 양은 감소한다. 이들 간의 관계를 그래프로 플롯트하여 표준곡선을 만든다.
그후, 기지농도의 비표지된 항원 대신에 미지 농도의 항원을 함유하는 시료를 상기한 반응계에 가한다. 경쟁반응을 유도한 후, 항체에 결합된 항원의 효소활성 또는 형광강도를 측정한다. 측정 결과를 표준곡선에 적용하여 시료중 항원의 농도를 측정한다.
샌드위치 기술을 사용한 경우에는, 아드레노메둘린의 서로 다른 에피토프에 대한 2종류의 항체를 먼저 제조한다. 하나의 항체는 방사성 동위원소, 효소 또는 형광물질로 표지하고, 다른 항체는 고상 항체로서 고상에 결합되게 하거나 또는 고상에 특이적으로 결합할 수 있도록 만든다. 이들 항체들은 다양한 농도의 항원과 반응시켜 다수의 항원 착체를 형성시킨다. 항원-항체 착체가 고상에 결합되기 때문에, 착체로부터 고상을 분리하여, 고상 내에서의 방사성, 효소 활성 또는 형광강도를 측정할 수 있다. 방사성, 효소 활성 또는 형광강도 및 항원의 농도와의 관계를 플롯트하여 표준곡선을 만든다.
미지 농도의 항원을 함유하는 시료를 반응계에 가하는 경우에는 반응 후 측정된 방사성 또는 효소 활성을 표준곡선에 적용함으로써 항원의 농도를 측정할 수 있다.
본 발명에서 어세이에 사용된 항체는 Fab 및 Fab'와 같은 일반적 면역 어세이에서 사용되는 항체 단편이 될 수 있다.
(7) proAM-N20이 카테콜아민 분비에 미치는 효과 확인:
본 발명의 proAM-N20이 카테콜아민 분비에 미치는 효과는 다음과 같이 확인할 수 있다. proAM-N20을 배양된 소의 아드레날 메둘라 세포에 가하여 배양시킨다. 얻어진 생성물을 HPLC하여 그안에서 분비된 카테콜아민의 양을 측정한다. proAM-N20을 함유하지 않은 대조물에 대해 동일 조작을 반복한다. 이로부터 얻어진 결과들을 비교하여 proAM-N20의 효과를 확인할 수 있다.
(8) proAM-N(10-20)이 Na 채널에 미치는 효과의 확인:
본 발명의 proAM-N(10-20)이 Na 채널에 미치는 효과는 다음과 같이 확인할 수 있다. 배양된 소의 아드레날 메둘라 세포를 proAM-N(10-20)으로 처리한 후, 세포를 카르바콜로 자극시키고 HPLC로22Na의 세포로의 유입을 측정한다. proAM-N(10-20)으로 처리하지 않은 세포에 대해 동일 조작을 반복한다. 이로부터 얻은 결과들을 대조하여 proAM-N(10-20)의 효과를 확인한다.
(9) 아드레노메둘린, 그의 전구체 단백질, proAM-N20 및 proAM-N(10-20)의 용도 및 투여방법:
본 발명의 아드레노메둘린 및 그의 전구체 단백질은 혈압강하 효과와 혈관이완 효과를 갖기 때문에, 고혈압 및 심부전증과 같은 질병 치료에 유용하다.
본 발명의 proAM-N20은 카테콜아민 분비 억제효과가 있으므로, 고혈압등을 치료하기 위한 카테콜아민 억제제로서 유용하다.
본 발명의 proAM-N(10-20)은 Na 채널 억제 효과가 있으므로 고혈압등을 치료하기 위한 Na 채널 억제제로서 유용하다.
본 발명의 아드레노메둘린, 그의 전구체 단백질, proAM-N20 및 proAM-N(10-20)은 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, Ed.Alfonso R., Mack Publishing, Easton, PA)에 기술된 통상의 펩티드 제제의 경우에 사용되는 것과 동일한 방법으로 투여할 수 있다. 이들 펩티드는 바람직하게는 주사에 의해, 더욱 바람직하게는 정맥내 주사에 의해 투여할 수 있으며, 아드레노메둘린의 용량수준은 환자 몸무게 kg당 약 0.1nmol 내지 3.0nmol이다.
본 발명의 아드레노메둘린, 그의 전구체 단백질, proAM-N20 및 proAM-N(10-20)은 심부전증등, 특히, 심근경색의 급성기 증상을 경감시키기 위해, 심장에 가해지는 부하를 완화시키기 위한 정맥내 주사 또는 드롭용 약물로서 사용할 수 있다.
Gly가 아드레노메둘린, 그의 전구체 단백질, proAM-N20 및 proAM-N(10-20)의 C-말단에 부착된 펩티드는, 상기한 바와 같이 유기체내의 C-말단 아미드화 효소가 Gly에 미치는 작용에 기인하여 이들 펩티드의 C-말단의 카르복실기가 유기체내에서 아미드화되기 때문에, 직접 투여할 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명의 이해를 더욱 용이하게 하기 위하여, 제공되는 것일 뿐, 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
(인간 PC로부터 아드레노메둘린의 정제)
노르에피네프린 우성 PC 환자에게서 외과적 수술에 의해 떼어낸 인간 PC조직으로부터 아드레노메둘린을 문헌[Kitamura et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 185, 134-141(1992)]에 기재된 방법으로 정제하였다.
상기한 정제를 다음과 같은 방법으로 구체적으로 실시하였다. 떼어낸 인간 pc조직은, 즉시 가늘게 절단한 다음, 4배용량의 1M의 아세트산 중에서 10분간 비등시킴으로써 내인성 프로테아제를 비활성화하였다. 이어서, 생성물을 냉각시키고, 4℃에서 폴리트론(polytron) 믹서로 균질화하였다. 균질화된 현탁액을 20,000×g의 원심분리속도로 30분간 원심분리시켜 상등액을 얻었다. 이 상등액을 66%의 농도에서 아세톤-침강을 실시한 다음, 침강된 물질을 제거하고, 남은 상등액을 회전증발기를 사용하여 농축시켰다. 농축된 생성물을 물로 2배용량이 되도록 희석시키고, C-18 실리카겔 칼럼 (270㎖, chemco LS-SORB ODS)상에 유입하였다. 칼럼상에 흡수된 물질을 0.1%의 트리플루오로아세트산(TFA)를 함유한 60%의 CH3CN로 용출시켰다. 용출액을 증발시키고, 이어서 1M의 아세트산으로 평형화된 SP-세파덱스(sephadex) C-25칼럼(H+-형(form), 2×15cm, 파마시아제)상에 유입하였다. 1M의 아세트산, 2M의 피리딘, 2M의 피리딘-아세트산(pH 5.0)으로 연속 용출시켜 얻은 세개의 용출획분을 SP-I, SP-II, SP-III라고 지정하였다.
혈소판 cAMP의 상승 활성이 90% 이상인 SP-III 획분을 세파덱스 G-50 칼럼상에서 겔여과로 분리하였다. 활성 어세이는 기따무라씨등의 상기 문헌에 기재된 방법으로 확인하였다. 구체적으로 설명하면, 135mM의 NaCl, 2mM의 EDTA, 5mM의 글루코오스, 10mM의 테오필린, 15mM의 HEPES(pH 7.5)로 이루어진 현탁액 매체중에 용해시킨 시료 254㎕를 37℃에서 10분간 배양시킨 다음, 이 배양액중에 세척된 쥐 혈소판(4.0×105) 25㎕를 가하여 반응을 개시하였다. 이어서, 반응 혼합물을 30분간 배양시킨 배양물에 150mM의 HCl을 추가로 가한 다음, 배양혼합물을 3분간 가열시키고 반응을 정지시켰다. 생성된 시료를 스피드백(Speedvac)농축기에서 농축시키고, 50mM의 아세트산 나트륨 완충액(pH 6.2) 100㎕중에서 용해시켰다. 수득된 용액중에 존재하는 환상 AMP는 cAMP RIA에 의해 분석할 수 있도록 숙신일화시켰다.
분자량이 4,000∼6,000이고 혈소판 cAMP의 상승활성을 갖는 획분을 TSK CM-2SW 칼럼(8.0×300mm, 일본국 도소사제)상에서 CM이온 교환 HPLC로 추가로 분리하였다. 아드레노메둘린은 페닐 칼럼(4.6×250mm, 바이닥(Vydac)사제) 및 마이크로본다스피어( μBondasphere)C-18 칼럼(4.6×150mm, 300A, 워터스(waters)사제)상에서 역상 HPLC에 의해 최종적으로 정제하였다.
(아드레노메둘린의 구조분석)
정제된 아드레노메둘린 200피코몰(pmol)을 문헌(Kangawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 118, 131-139 (1984))에 기재된 방법으로 환원 및 S-카르복시메틸화(RCM)시켰다. 수득된 RCM-아드레노메둘린을 역상 HPLC로 정제하였다. 이 정제된 RCM-아드레노메둘린의 절반(100피코몰)을 가스상 시퀀서(모델, 470A/120A, Applied Biosystems)에 적용하였다.
상기 정제된 RCM-아드레노메둘린의 남은 절반을 0.01%의 트리톤-X 100을 함유하는 50mM의 트리스-HCl(pH 8.0) 50㎕중에서 알기닐 엔도펩티다제(일본국 교또소재, 다까라 슈조사제) 400ng으로 37℃에서 3시간 소화시켜 펩티드 단편 RE1 내지 SE6를 제조하였다. 이들 펩티드 단편 RE1 내지 RE6는 상품명이 Chemco sorb 3 ODS H인 반미량 칼럼(2.1×75mm, 일본국 오오사까시 소재, 켐코사제 )상에서 역상 HPLC로 각기 분리하고, 수득된 각 단편은 가스상 시퀀서(모델 470A/120A, Applied Biosystems)로 서열화하여 제1도에 나타낸 바와 같이 아드레노메둘린의 전체 아미노산 서열을 결정하였다. 이 아드레노메둘린은 52개의 아미노산으로 구성되며, 분자내에 디술피드결합을 갖고 있다. 천연 아드레노메둘린[45-52](예를 들어, 단편 RE6)가 합성 아드레노메둘린[45-52]NH2와 동일한 위치에서 역상 HPLC에 의해 용출되기 때문에 C-말단의 Tyr가 아미드화된 것임을 알 수 있다. 이러한 방식으로, 측정된 천연 아드레노메둘린 서열에 상응하도록 천연 아드레노메둘린과 제조된 합성 아드레노메둘린간의 크로마토그래피적 대조를 행함으로써 전체 아드레노메둘린 구조가 입증되었다.
컴퓨터로 검색한 결과(PRF-SEQDB, 일본국 오오사까시 소재, Protein Research Foundation), 동일한 펩티드 서열이 전혀 발견되지 않았다. 따라서, 이 아드레노메둘린은 생물학적 활성을 갖는 신규한 펩티드임이 확인되었다. 분자내에 디술피드 결합을 갖는 6개의 잔여 고리구조와(C-말단 아미드화 구조가 이들 모두에 공통적이긴 하지만, 인간 CGRP(Morris et al., Nature, 308, 746-748(1984)),CGRPII(Steenbergh et al., FEBS Lett., 183, 403-407(1985)) 및 아밀린(Cooper et al., Proc. Natl. Acad, Sci. U.S.A., 84, 8628-8632(1987))에 대한 아드레노메둘린의 결합 서열 동종성은 제2도에 나타낸 바와 같이, 대략 20% 정도로 낮다. 아드레노메둘린에 존재하는 14개의 잔여 아미노 말단 연장은 CGRP 및 아밀린에는 없다.
실시예 2
(아드레노메둘린의 혈압 강하 효과)
아드레노메둘린의 혈압강하 효과는 쥐 뇌의 나트륨이뇨성 폴리펩티드(Kita et al, Eur. J. pharmacol., 202, 73-79(1991))에 관해 기술된 방법으로 시험하였다. 수컷 위스터 쥐(2주간 자란 쥐, 300g)를 나트륨 펜토바르비탈(50mg/kg)로 복강내 주사하여 마취시켰다. 이어서, 스테담(statham) 압력 변환기(모델 P231D, 구울드사제)에 접속시킨 우측 카로이드 동맥 카테터(PE-50)을 통해 각 쥐의 혈압을 연속적으로 측정하였다. 유지액과 펩티드를 관리하기 위해서 우측 경정맥에 PE-10 카테터를 삽입하였다. 60분 이상 평형화한 후, 각 쥐에 CGRP나 아드레노메둘린을 정맥내 주사하였다. 제3A도 내지 제3D에 CGRP 또는 아드레노메둘린 주사시 측정된 쥐 혈압의 편차를 나타내었다. 제3A도, 제3B도, 제3C도는 아드레노메둘린을 각각 0.3nmol/kg, 1.0nmol/kg, 3.0nmol/kg로 주사시킴으로써 야기된 편차를 나타내고, 제3D도는 CGRP을 3.0nmol/kg로 주사시킴으로써 야기된 편차를 나타낸다. 주사한 아드레노메둘린은 SEQ ID No.1에 있어서의 1에서 52까지의 아미노산으로 구성되고, 이의 C-말단이 아미드화된 펩티드이었다.
아드레노메둘린의 1회 정맥내 주사에 의해 투여량 의존방식으로 빠르고, 강하며, 지속적인 혈압강하 효과가 야기되었다. 아드레노메둘린 3.0nmol/kg을 정맥내로 주사한 경우에는 평균혈압에서의 최대 감소량이 53 ±5.0mmHg(예를 들어, 평균 ± S.E.M., n=4)이었다. 유효한 혈압강하 효과는 30-60분간 지속되었다. 제3C도 및 제3D도로부터 분명하게 알수 있는 바와 같이, 아드레노메둘린의 혈압강하 활성은 가장 강력한 혈압강하제중의 하나로서 알려진 CGRP의 혈압강하 활성과 견줄만 하였다. 따라서, 아드레노메둘린은 효과가 오랫동안 지속되는 혈압강하 효과가 있음이 확인되었다.
이어서, SEQ ID No.1에 있어서의 13에서 52까지의 아미노산으로 구성되고, 아미드화된 C-말단을 갖는 아드레노메둘린을 쥐에 투여하여 쥐의 혈압편차를 검사하였다.
펩티드 [13-52]NH2는 펩티드 신시사이저(Applied Biosystems, 430A)를 사용하여 다음과 같은 방법으로 합성하였다. 우선, 52위치의 Tyr과 같은 C-말단 아미노산에 상응하는 아미노산을 벤즈히드릴 아민수지에 결합시킨 다음, 이 화합물을 DCC/HOBt을 사용한 표준축합반응 조건하에 결합아미노산(예를 들어, Tyr)의 N-말단에 결합되도록 축합반응을 실시하였다. 목적하는 아미노산 서열을 얻기 위해서 상기한 축합반응을 반복하였다. 목적하는 펩티드를 수득된 펩티드 수지로부터 일반적 인 절단 방법(트리플루오로메탄술폰산 방법)으로 절단하고, 공기 또는 적절한 산화제, 예를 들어, 페리시안화 칼륨 및 요오드로 산화시켜 펩티드내에 디술피드 결합을 형성하고, 필요시 역상 HPLC로 정제하였다.
수득된 펩티드 [13-52]NH2를 상기한 바와 같은 방법으로 투여한 경우에는, 상당한 혈압강하 효과가 나타났다.
(아드레노메둘린을 투여한 후, 심박도수의 체크)
각각 체중 300 내지 390g인 수컷 위스터 쥐를 챨스 리버 주식회사(Charles Reiver Inc)로부터 구입하였다. 구입한 각각의 쥐를 나트륨 펜토바르비탈(500mg/kg)로 복강내 주사하여 마취시켰다. 이어서, 호흡을 도와주기 위해 기관내에 폴리에틸렌 카테터(PE-250)를 삽입하였다. 스테담 압력 변환기(모델 P231D, Gould사제)와 폴리그라프(Polygraph, 모델 141-6 산-이(San-Ei)사제)에 접속시킨 퍼모랄(fermoral) 동맥 카테터(PE-50)를 통해 평균 혈압(MBP)과 심박도수(HR)을 측정하였다. 우측 경정맥을 통해 우심방에 PE-10 카테터를 삽입하였다. 이어서, 우측 경동맥을 통해 상행 대동맥에 써모센서를 넣었다. 상기한 조간하에서, 열희석법(모델 600, Cardiotherm)으로 심박출량을 측정하는데, 측정시 쥐의 동맥온도를 36-37℃로 유지하기 위하여 쥐를 히트 테이블에 놓았다.
외과적 처치후, 각각의 쥐는 45분간 평형화하도록 유지한 다음, 염수(n=8) 또는 동일한 양의 등장성 염수(n=8)에 용해시킨 인간 아드레노메둘린(1.0nmol/kg)용액을 각각의 쥐에 정맥내경로로 주사하였다. 미리 실시하는 예비시험에서, 상기한 양의 아드레노메둘린을 투여하여 야기되는 혈관 확장인자 응답은 대략 최대 효능의 절반 정도였다. 투여 15분전, 투여후 2분, 5분, 10분, 30분째에 각각 심박출량을 측정하였다.
심장 지수(CI), 박출량 지수(SVI) 및 전체 말초저항지수(TPRI)를 다 음식을 사용하여 산정하였다:
CI(체중 100g당 1분당 ㎖)
= 심박출량/체중 100g
SVI(체중 100g당 1박동당 ㎕) = CI/HR
TPRI(μ·체중 100g) = MBP/CI
상기에서 사용된 인간 아드레노메둘린과 펩티드는 고상법으로 합성하고, 이의 동종성은 역상 HPLC로 확인하였다.
본 발명에서는 염수에 용해시킨 인간 아드레노메둘린(흑구로 표시함) 및 염수단독(백구로 표시함)을 각각의 쥐에 투여 할 경우에 MBP, HR, CI, SVI 및 TPRI의 시간경과에 따른 변화를 제4도에 나타내었다. 각 수치는 평균 ±S.E.M.로 나타낸 것이다.
본 발명의 제4도에 나타낸 바와 같이, MBP는 인간 아드레노메둘린 투여후 2분, 5분 10분에서 현저하게 감소하고, 30분이 경과한 후에야 초기수준으로 회복되었다. TPRI는 MBP의 감소와 함께 투여한지 2분, 5분, 10분후 현저하게 감소되었다. 반면에, CI와 SVI는 증가되었다. HR은 투여한 지 2분후에 약간 감소되지만 현저하게 변화되지는 않았다. 염수를 쥐에 투여한 경우의 CI, SVI, TPRI, MBP 및 HR은 변화가 없었다.
실시예 3
(아드레노메둘린과 이의 단편을 이용한 RIA)
(A) 아드레노메둘린의 N-말단 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 단편에 대해 항체를 이용하는 RIA:
펩티드 [1-12]와 펩티드[3-12]를 펩티드 신시사이저(Applied Biosystems, 430A)를 사용하여 고상법으로 합성하고, 역상 HPLC로 정제하였다.
상기에서 합성된 펩티드[1-12] 10mg과 소의 티로글로불린 20mg을 글루타르알데히드(Miyata et al., Biochem, Biophys. Res. Commun., 120, 1030-1036(1984))와 0.1M의 인산나트륨 완충액(pH 7.4) 2㎖중에서 접합하였다. 수득된 반응 혼합물을 50mM의 인산나트륨 완충액(pH 7.4)/0.08M NaCl을 사용하여 투석시키고, 이어서 미야따 씨등의 상기 문헌에 기재된 면역방법에 상기 생성물을 사용하였다. 뉴질랜드산 흰토끼에 상기한 면역방법을 실시하였다. 면역된 동물에서 수득된 항혈청을 다음 RIA에 사용하였다.
펩티드 [1-12]와 펩티드[3-12]에 대한 RIA는 β-네오-엔돌핀(Kimura et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 109, 966-974(1982))에 대해 개시된 방법으로 실시하였다.
구체적으로, 기지농도의 펩티드[1-12] 또는 펩티드[3-12] 100㎕, 상기에서 수득한 항혈청을 1:6,000배로 희석시킨 항혈청 50㎕, 락토퍼옥시다제 방법(Kitamura et al., Biochem, Biophys. Res. Commun., 161, 348-352(1989))으로 제조된125I-표지 리간드(18,000cpm) 50㎕를 혼합하여 RIA 반응 혼합물을 얻었다. 이어서, 이 혼합물을 24시간동안 배양시킨 다음, 항혈청에 결합되지 않은 표지 리간드(이하, "미결합 리간드"라 칭함)로부터 항혈청에 결합된 표지 리간드(이하, "결합 리간드"라 칭함)를 폴리에틸렌 글리콜 방법으로 분리하였다. 수득된 펠렛의 방사능을 감마 계수기(ARC-600, 알로카사제)로 계수하고, 어세이를 4℃에서 중복하여 실시하였다. 각각의 펩티드를 여러 농도에 대해서 상기한 절차를 반복하여 표준 곡선을 얻었다. 펩티드[1-12]와 펩티드[3-12]의 표준곡선은 서로 일치하였다. 펩티드[1-12] 또는 펩티드[3-12]에 의해 결합된 방사성 요오드화 리간드의 하프 최대 억제를 10펨토몰/튜브에서 측정하였다.
이어서, 미지농도의 아드레노메둘린을 함유하는 시료액을 트립신(Worthington) 1㎕과 함께 사용하여 소의 혈청 알부민(BSA) 20㎕을 함유하는 0.1M의 NH4HCO3100㎕중에서 트립신 처리하였다. 이어서, 생성된 시료액 100㎕, 항혈청을 1:6,000배로 희석시킨 항혈청 50㎕, 락토퍼옥시다제방법(Kitamura et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 161, 348-352(1989))으로 제조된125I-표지 리간드(18,000cpm) 50㎕로 이루어진 반응혼합물을 24시간동안 배양시킨 다음, 미결합 리간드로부터 결합 리간드를 폴리에틸렌 글리콜 방법으로 분리하였다. 수득된 펠렛의 방사능을 감마 계수기(ARC-600, 알로카사제)로 계수하고, 어세이를 4℃에서 중복하여 실시하였다.
상술한 RIA를 통하여, 항 혈청이 트립신으로 소화되어 제조된 아드레노메둘린 단편인 펩티드를 인식하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 펩티드[1-12]와 펩티드[3-12]는 아드레노메둘린에 대한 항체 제조에 유용한 것으로 밝혀졌다.
(B) 아드레노메둘린의 C-말단 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 단편에 대한 항체를 이용한 RIA:
펩티드 [1-52]NH2, [13-52]NH2, [40-52]NH2, [45-52]NH2, [45-52], [47-52]NH2, [47-52], [1-12[를 펩티드 신시사이저(Applied Biosystems, 430A)을 사용하여 고상법으로 합성하고, 역상 HPLC로 정제하였다. 상기한 펩티드중 C-말단 아미드화 펩티드는 펩티드 신시사이저를 사용하여 다음과 같은 방법으로 합성하였다. 우선, 52번째에 위치한 Tyr과 같은 C-말단 아미노산에 상응하는 아미노산을 벤즈히드릴 아민 수지에 결합시킨 다음, 이 화합물을 DCC/HOBt을 사용한 표준 축합반응 조건하에 결합 아미노산(예를 들어, Tyr)의 N-말단에 결합되도록 축합반응을 실시하였다. 목적하는 아미노산 서열을 얻기 위해서 상기한 축합반응을 반복하였다. 목적하는 펩티드를 수득된 펩티드 수지로부터 일반적인 절단방법(트리플루오로메탄술폰산 방법)으로 각각 절단하였다.
상기한 바와 같은 방법으로 디술피드 결합을 형성시켰다.
상기에서 합성된 펩티드[40-52]NH29.3mg과 소의 티로글로불린 10.3mg의 혼합물을 염수 0.5㎖에 용해시키고, 생성된 용액을 실온에서 교반하면서 2시간마다 수용성 카르보디이미드를 50mg씩 5회 첨가하였다. 생성된 혼합물을 4℃에서 하룻밤 동안 계속 교반한 다음, 이 혼합물을 염수 500㎖를 사용하여 5회 투석시키고, 인산나트륨 완충액 500㎖를 사용하여 2회 투석시켰다. 수득된 투석물을 인산나트륨 완충액을 가하여 최종 용량을 11㎖로 조절하여 항원 공역용액을 얻었다.
상기에서 수득한 항원공역용액(1.5-3㎖)를 등용량의 완전 프로인트보조액으로 에멀젼화 하였다. 이어서, 에멀젼화 용액으로 뉴질랜드산 흰토끼에 면역을 실시하였다. 면역된 동물에서 수득된 항혈청을 다음의 RIA에 사용하였다.
펩티드 [1-52]NH2, [40-52]NH2, [45-52]NH2, [45-52], [47-52]NH2, [47-52], [1-12], CGRP, CGRP-II 및 아밀린에 대한 RIA는 β-네오-엔돌핀(Kitamura et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 109, 966-974(1982))에 대해 개시된 방법으로 실시하였다.
구체적으로, 기지농도의 펩티드중의 어느 하나의 펩티드 100㎕, 상술한 방법으로 수득한 항혈청을 1:180,000배로 희석시킨 항혈청 50㎕ 볼톤-헌터 방법 (A. E. Bolton and W. M. Hunter, Biochemical J. (1973) 133, 529-539)으로 제조된125I-표지 리간드 (18,000cpm) 50㎕로 이루어진 반응 혼합물을 24시간 동안 배양시킨 다음, 미결합리간드로부터 결합리간드를 폴리에틸렌 글리콜 방법으로 분리하였다. 수득된 펠렛의 방사능을 감마계수기(ARC-600, 알로카사제)로 계수하고, 어세이를 4℃에서 중복하여 실시하였다.
수득된 결과를 사용하여 표준 곡선을 얻었다. 펩티드 [1-52]NH2에 의해 펩티드[13-52]NH2, [40-52]NH2, [45-52]NH2및 [47-52]NH2에 결합된 방사성 요오드화 리간드의 하프 최대억제를 11펨토몰/튜브에서 측정하였다.
상술한 RIA 결과로부터 알수 있는 것은, 항 혈청이 항원인 펩티드 [40-52]NH2에 대해서는 반응성을 나타내고, 펩티드[1-52]NH2, [45-52]NH2, [1-52]NH2에 대해서는 교차반응성을 나타내고, 펩티드[45-52], [47-52] 및 [1-12], CGRP, CGRP-II 및 아밀린에 대해서는 교차반응성을 전혀 나타내지 않았다.
(각 조직에서의 아드레노메둘린의 분포)
인간 PC, 아드레날 메둘라, 허파, 신장, 대뇌피질, 장 및 심실로부터 각 조직 1.0g을 취하고, 5배 용량의 물중에서 10분간 비등시켜, 내인성 프로테아제를 비활성화시켰다. 이어서, 냉각시킨 후, 각 조직에 빙초산을 가하여 생성혼합물을 1M이 되게 준비하였다. 이 혼합물을 4℃에서 폴리트론믹서로 균질화한 다음, 균질화된 혼합물을 24,000×g의 원심분리속도로 30분간 원심분리시키고, 수득된 추출물의 상등액을 1M의 아세트산으로 미리 평형화시킨 셉-팍(Sep-Pak) C-18 카트리지 칼럼 (워터스사제)상에 유입하였다. 칼럼상에 흡수된 물질을 0.1% TFA를 함유한 60%의 아세토니트릴 3㎖로 용출시켰다. 생성액중의 아드레노메둘린은 문헌(Ichiki et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 187, 1587-1593(1992))에 기재된 조건하에서 TSK ODS 120A 칼럼 (4.6×150mm, 일본국 도소사제)상에서 역상 HPLC로 분석하였다.
상술한 각 인간조직중의 아드레노메둘린 존재를 역상 HPLC로 펩티드를 확인하는 RIA로 조사하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
표 1
표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 인간 PC에는 습윤 조직 1mg당 1,900 ± 450 펨토몰의 양인 풍부한 아드레노메둘린이 함유되어 있음을 알 수 있다. 정상 아드레날 메둘라에는 습윤조직 1mg당 150±24 펨토몰의 양인 다량의 아드레노메둘린이 존재하였다. 허파 또는 신장의 아드레노 메둘린 농도는 정상 아드레날 메둘라의 1% 미만이었다. 하지만, 허파 및 신장중의 아드레노메둘린 총량은 아드레날 메둘라중의 아드레노메둘린양 보다 더 많았다. 신경펩티드로 작용하는 CGRP가 뇌 및 말초신경에 존재하지만, 뇌에서는 아드레노메둘린이 검출되지 않았다. 또한, 미리 실시한 예비 시험에서, 건강한 인간 혈장에는 상당한 농도(19±5.4 펨토몰/㎖, n=4)로 아드레노메둘린이 존재함을 알 수 있었다. 따라서, 말초조직, 아드레날 메둘라, 허파 및 신장에서 생성된 아드레노메둘린은 혈압조절에 참여하는 순환호르몬으로 작용한다. 또한, 인간 PC중의 아드레노메둘린의 생산성 향상은 기립성 저혈압과 같은 PC환자에서의 여러 징후와 적절하게 일치하는 것으로 여겨진다.
실시예 4
(돼지의 아드레날 메둘라로부터 아드레노메둘린의 정제와 구조분석)
(A) 돼지의 아드레날 메둘라로부터 아드레노메둘린의 정제;
돼지의 아드레날 메둘라로부터 아드레노 메둘린을 실시예 1의 인간 아드레노메둘린에 사용된 정제방법으로 정제하였다.
구체적으로, 돼지의 아드레날 메둘라를 가늘게 절단하고, 10배 용량의 1M의 아세트산중에서 10분간 비등시켜 내인성 프로테아제를 비활성화하였다. 생성혼합물을 냉각시키고, 4℃에서 폴리트론 믹서로 균질화하였다. 균질화된 현탁액을 22,000×g의 원심분리 속도로 30분간 원심분리하였다. 수득된 추출물의 상등액을 셉-팍 C-18 카트리지 칼럼(20㎖, 워터스사제)상에 유입하였다. 칼럼상에 흡수된 물질을 0.1% TFA를 함유한 60%의 CH3CN로 용출시키고, 수득된 용출물을 증발시켰다. 얻어진 용액은 불순한 펩티드 추출물로써 실시예 3에서와 같은 연속 RIA에 사용하였다. 실시예 3에서 기술한 바와 같이, 이 RIA를 인간 아드레노메둘린으로부터 유도된 펩티드[1-12]를 이용한 RIA 시스템으로써 설정하였다.
불순한 펩티드 추출물을 겔 여과 크로마토그래피(세파덱스 G-50, Fine, 3×150cm)로 분리하였다. 하나의 주요 면역반응성(ir)-아드레노메둘린은 분자량 5000∼6000범위내에서 발견되었다. 상기 획분중의 펩티드를 추가로 TSK CM-2SW 칼럼(8.0×300mm, 일본국 도소사제)상에서 CM 이온교환 HPLC로 분리하였다. 하나의 주요 면역 반응성 아드레노메둘린은 인간 아드레노메둘린과 동일한 위치에서 발견되었다. 이 획분을 페닐칼럼(4.6×250mm, 비닥사제)상에서 역상 HPLC로 최종 정제하였다. 210nm에서의 흡광도의 용출 프로파일 및 면역반응성-아드레노메둘린은 인간 아드레노메둘린의 것과 정확하게 일치하였다.
(B) 돼지의 아드레노메둘린의 구조분석:
(A)항에서 수득한 돼지의 아드레노메둘린 100피코몰(pmol)을 문헌(Kangawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 118, 131-139 (1984))에 기재된 방법으로 환원 및 S-카르복시메틸화(RCM)시켰다. 수득된 RCM-아드레노메둘린을 역상 HPLC로 정제하였다. 이 정제된 RCM-아드레노메둘린을 기체상 시퀀서(모델, 470A/120A, Applied Biosystems)에 적용하여, 아미노산 서열을 37번째 잔기까지 결정하였다. 별도로, 돼지의 아드레노메둘린 100피코몰을 0.01%의 트리톤을 함유하는 0.1M의 NH4HCO3중에서 트립신 또는 키모트립신 500ng으로 37℃에서 소화시켜 두개의 펩티드 단편을 제조하였다. 이들 펩티드 단편을 상품명이 Chemcosorb 3 ODS H인 반미량 칼럼(2.1×75mm, 일본국 오오사까시 소재, 켐코사제)상에서 역상 HPLC로 각기 분리하고, 수득된 각 단편은 가스상 시퀀서(모델 470A/120A, Applied Biosystems)로 서열화하여 돼지의 아드레노메둘린의 전체 아미노산 서열을 결정하였다. 돼지의 아드레노메둘린은 52개의 아미노산으로 구성되며, 분자내에 디술피드 결합을 갖고 있다. C-말단의 Tyr가 아미드화되었다.
돼지의 아드레노메둘린의 아미노산 결합서열은 인간 아드레노메둘린의 40번째에 위치한 아스파라긴을 돼지의 아드레노메둘린의 글리신으로 대체하는 것을 제외하고는 인간 아드레노메둘린과 일치하였다.
(돼지의 아드레노메둘린 cDNA의 클로닝)
(A) 프라이머의 합성:
상술한 방법으로 수득한 돼지의 아드레노메둘린의 아미노산 결합서열에 기초하여 DNA 올리고머를 합성하였다. 프라이머로서 올리고머를 사용하여 폴리머라제 연쇄반응(PCR)(Saiki, R.K. et. al., Science, 239, 487-494(1988))에 의해 하기의 cDNA 라이브러리의 스크리닝을 위한 프로브를 제조하였다.
PCR에 사용되는 DNA 올리고머를 지정하고, 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 결정된 아미노산 서열에서 어떤 영역을 암호화할 수 있는 전체 DNA 서열을 포함하는 혼합 DNA 올리고머는 아미노산 잔기에 각각 상응하는 각종 코돈을 사용하여 지정할 수 있다. 실제로, 포유동물에 우선적으로 사용되는 코돈은 결정된 각각의 아미노산 3-8 및 35-41에 기초하여 DNA 올리고머 I 및 II (SEQ ID No.3 및 4에 각각 나타냄), 및 DNA 올리 고머 III(SEQ ID No.5에 나타냄)를 합성하는데 주로 사용된다. DNA 올리고머 III는 유전자 암호화 아드레노메둘린의 보충사슬의 염기서열에 기초한 것이다. DNA 올리고머는 사슬이 짧기 때문에 핵산 신시사이저(파마시아 LKB 유전자 어셈블러 플러스, DNA 신시사이저)를 사용하여 화학적으로 합성하였다.
(B) PCR용 템플레이트 시료의 제조:
각 인간 조직에서 인간 아드레노메둘린 존재에 대한 시험결과로부터 아드레날 메둘라에 풍분한 아드레노메둘린이 존재함을 알게 되었기 때문에, 아드레날 메둘라를 유전자 클로닝용 재료로서 적합한 것으로 간주하였다.
RNA는 돼지의 아드레날 메둘라로부터 구아니딘 티오시안에이트 방법(chomczynski, P. et al., Anal. Biochem., 162, 156-159(1987))으로 추출하였다. 폴리 (A)+RNA를 올리고(dT)-셀룰로오스 칼럼(파마시아)상에서 분리하였다. 돼지의 아드레날 메둘라 폴리 (A)+RNA 5㎕으로부터 구블러와 호프만 방법으로 이중가닥 cDNA를 제조하였다. 이어서, 이중가닥 cDNA를 EcoRI 수용체에 결찰시키고, 세파크릴 S-300 칼럼상에서 사이즈-획분화하여 목적하는 아드레노메둘린이 함유되는 것으로 여겨지는 획분을 얻었다. 수득된 획분은 시험관내에 충전시켜 cDNA 라이브러리를 제조하기 위하여 람다(λ)gt10 아암스(Bethesda Research Laboratory)에 넣었다.
(C) PCR에 의한 돼지의 아드레노메둘린 cDNA의 증폭 및 분리:
DNA 올리고머 I 및 III의 조합물 또는 DNA 올리고머 II 및 III의 조합물을 사용하여 (A)항에 기재한 바와 같이 수득하고, (B)항에서 수득한 cDNA 라이브러리로부터 아드레노메둘린 cDNA 단편을 증폭하였다. PCR에서, 미합중국 퍼킨 엘머 세투스(Perkin Elmer Cetus)로부터 구입한 Ampli Taq DNA 폴리머라제를 효소로서 사용하고, 사용된 반응액의 조성은 그들의 지시에 따랐다. 증폭장치로서 열 시클러(Perkin Elmer Cetus)를 사용하고, 증폭은 94℃에서 1분 및 37℃에서 1분을 15회 반복하는 주기, 및 94℃에서 50초, 48℃에서 50초 및 72℃에서 1분을 15회 반복하는 다른 주기로 이루어진다.
증폭된 cDNA 단편을 랜덤 프라임 방법으로 표지하고, 돼지의 아드레날 메둘라 cDNA 라이브러리를 인시튜(in situ) 플라크 혼성화 방법으로 프로브에 사용하였다.
(D) 돼지의 아드레노메둘린 cDNA의 시퀀싱:
플라크 혼성화에 의해 수득된 양성 클론을 플라크 정제하고, cDNA를 취하여 재조합 블루스크립트(BlueScript)플라스미드를 얻었다. 삽입된 가장 긴 cDNA를 포함한 클론을 서열화에 사용하였다. SmaI, NaeI 및 RsaI과 같은 적당한 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켜 삽입 cDNA로부터 생성된 제한 단편을 블루스크립트 플라스미드로 재서브클론 하고, 자동 DNA 시퀀서(373A, Applied Biosystems)을 사용하여 염료프라이머 사이클 서열화 방법으로 서열화하였다.
따라서, 수득된 돼지의 아드레노메둘린 cDNA의 전체서열을 이의 아미노산 서열과 함께 SEQ ID No.2에 나타내었다.
실시예 5
(인간 아르레노메둘린 cDNA의 클로닝)
실시예 4의 (C)항에서 수득된 돼지의 아드레노메둘린 cDNA 단편을 사용하여 실시예 4와 동일한 방법으로 인간 아드레노메둘린 cDNA를 클로닝하였다.
(A) cDNA 라이브러리의 제조:
RNA는 인간 PC로부터 구아니딘 티오시안에이트 방법(chomczynski, P. et al., Anal. Biochem., 162, 156-159(1987))으로 추출하였다. 폴리(A)+RNA를 올리고(dT)-셀룰로오스 칼럼(파마시아사제)상에서 분리하였다. 이어서, 폴리 (A)+RNA로부터 구블러와 호프만 방법으로 이중가닥 cDNA를 제조하였다. 이중가닥cDNA를 EcoRI 수용체에 결찰시키고, 세파크릴 S-300 칼럼(파마시아사제)상에서 사이즈-획분화하여 목적하는 아르레노메둘린이 함유되는 것으로 여겨지는 획분을 얻었다. 수득된 획분은 시험관내에 충전시켜 cDNA 라이브러리를 제조하기 위하여 람다(λ)gt 10 아암스(Bethesda Research Laboratory)에 넣었다.
(B) 인간 아르레노메둘린 cDNA의 서열화:
인간 아드레노메둘린 cDNA를 다음과 같은 방법으로 서열화 하였다.
상기에서 수득된 cDNA 라이브러리는 실시예 4의 (C)항에서 수득한 돼지의 아드레노메둘린 cDNA 단편을 프로브로서 사용하여 혼성화에 의해 스크리닝하였다.
플라크 혼성화에 의해 수득된 양성 클론을 정제하고, cDNA를 취하여 재조합 블루스크립트 플라스미드를 얻었다. 삽입된 가장 긴 cDNA를 포함한 클론을 서열화에 사용하였다. SmaI, NaeI, RsaI 및 SacI와 같은 적당한 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켜 삽입 cDNA로부터 생성된 제한 단편을 블루스크립트 플라스미드로 재서브클론 하고, 자동 DNA 시퀀서(373A, Applied Biosystems)을 사용하여 염료 프라이머 사이클 서열화 방법 또는 디데옥시 사이클 시퀀싱 방법으로 서열화하였다.
따라서, 수득된 cDNA 서열을 이의 아미노산 서열과 함께 SEQ ID No.1에 나타내었다.
실시예 6
(proAM-N20의 구조분석)
proAM-N20은 실시예 5에서 측정된 SEQ ID No.1중 프로아드레노메둘린의 N-말단 아미노산 서열에 상응하는 부분이다. 더욱 상세하게 설명하면, proAM-N20은 SEQID No.1의 아미노산 (-73) 내지 (-54)에 상응하는 펩티드[(-73)-(-54)]이다. 컴퓨터로 검색한 결과 (PRF-SEQDB, 일본국 오오사까시 소재, protein Research Foundation), 동일한 펩티드 서열이 전혀 발견되지 않았다. 따라서, proAM-N20은 생물학적 활성을 갖는 신규한 펩티드임이 확인되었다.
(카테콜아민 분비에 대한 proAM-N20의 효과)
proAM-N20은 펩티드 신시사이저(431A, Applied Biosystems)를 사용하여 고상법으로 합성하고, 역상 HPLC로 정제하였다.
(A) 배양된 소의 아드레날 메둘라 세포(4일간 배양된 것, 4×106세포/디쉬)를 KRP 완충액으로 세척하고, proAM-N20(10-6M)을 함유하는 KRP 완충액 1㎖중에서 37℃에서 10분간 배양시켰다. 대조용시료는 동일 조건하에서 KRP 완충액 1㎖에서만 배양시켰다. 수득된 상등액중의 카테콜아민의 양을 HPLC로 측정하였다.
분비된 카테콜 아민량은 proAM-N20을 사용할 경우에는 1.64㎍/4×106세포(n=2), 대조용 시료에서는 2.56㎍/4×106세포이었다. 상기한 방법에서는, 카테콜아민의 분비가 proAM-N20에 의해 억제되었다.
(B) 소의 아드레날 메둘라 세포는 proAM-N20(10-6M)을 함유하는 KRP 완충액 1㎖중에서 상기와 동일한 방법으로 37℃에서 5 내지 10분간 예비 배양시켰다. 이어서, 여기에 자극시키기 위해 카르바콜(10-4M)을 가하고, 37℃에서 10분간 배양시켰다. 대조용 시료는 proAM-N20으로 예비 배양시키지 않고, 카르바콜로 자극만을 주었다. 수득된 상등액중에서 분비된 카테콜아민의 양을 HPLC로 측정하였다.
분비된 카테콜아민의 양은 대조용시료에서는 14.36㎍/1×106세포(n=2)이지만, proAM-N20을 사용하여 5분간 배양시킬 경우에는 11.31㎍/4×106세포이고, proAM-N20을 사용하여 10분간 배양시킬 경우에는 9.19㎕/4×106세포이었다. 상기한 방법에서, 카르바콜에 의해 자극된 카테콜아민 분비는 proAM-N20으로 전처리하면 억제되었다.
실시예 7
(proAM-N20 및 이의 단편을 이용한 RIA 방법)
펩티드[(-73)-(-54)]NH2, N-말단에 Tyr을 갖는 펩티드[(-73)-(-54)]NH2인 펩티드 N-Tyr-[(73)-(-54)]NH2, 펩티드[(-65)-(-54)]NH2, 펩티드[(-61)-(-54)]NH2및 펩티드[(-58)-(-54)]NH2는 페녹시수지를 이용한 펩티드 신시사이저(Applied Biosystems, 431A)를 사용하여 고상법으로 합성하고, 역상 HPLC로 정제하였다.
펩티드[(-73)-(-54)]NH210㎎와 소의 티로글로불린 20㎎을 카르보디이미드 방법(Goodfriend et al., Science, 144, 1344-1346(1964))으로 접합시켰다. 수득된 반응 혼합물을 염수 1ℓ로 4회 투석시키고, 50mM의 인산 나트륨 완충액(pH 7.4)/0.08M NaCl로 2회 투석시켰다. 투석물을 등용량의 완전 프로인트 보조액으로 에멀젼화하고, 생성물을 이용하여 뉴질랜드산 수컷 흰토끼에 면역을 실시하였다. 면역된 동물에서 수득된 항혈청을 다음의 RIA에 사용하였다.
펩티드 N-Tyr-[(-73)-(-54)]NH2를 락토퍼옥시다제 방법(Kitamura et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 161, 348-352(1989))으로 표지하였다.125I-표지된 펩티드를 TSK ODS 120A 칼럼(Tosoh)을 사용하여 역상 HPLC로 정제하여 트레이서로 사용하였다.
구체적으로, 기지농도 또는 미지농도의 펩티드[(-73)-(-54)NH2100㎕, 상술한 방법으로 수득한 항혈청을 1:66,500배로 희석시킨 항혈청 200㎕를 혼합하여 RIA 반응 혼합물을 얻고, 이 혼합물을 12시간동안 배양시킨 다음,125I-표지 리간드 (18,000cpm) 100㎕를 혼합물에 가하고, 생성된 반응 혼합물을 24시간 동안 배양시킨 다음, 이 혼합물에 항-토끼 IgG 염소혈청 100㎕를 가하였다. 생성 혼합물을 24시간동안 추가로 배양시키고, 2,000×g의 원심분리속도로 30분간 원심분리하였다. 수득된 펠렛의 방사능을 감마 계수기(ARC-600, 알로카사제)로 계수하고, 어세이를 4℃에서 중복하여 실시하였다. 얻어진 수치를 사용하여 표준 곡선을 얻었다. 펩티드 [(-73)-(-54]NH2에 의해 결합된 방사성 요오드화 리간드의 하프 최대억제를 10펨토몰/튜브에서 측정하였다.
상술한 RIA 결과로부터 알수 있는 것은, 항혈청이 항원인 펩티드[(-73)-(-54)]NH2에 대해서는 반응성을 나타내고, 펩티드[(-65)-(-54)]NH2및 [(-61)-(-54)]NH2에 대해서는 교차 반응성을 나타내고, 펩티드[(-58)-(-54)]NH2에 대해서는전혀 교차반응성을 나타내지 않는다는 것이었다. 따라서, 펩티드[(-73)-(-54)]NH2, 펩티드[(-65)-(-54)]NH2및 [(-61)-(-54)]NH2는 proAM-N20에 대한 항체의 제조에 유용함을 알게 되었다.
(각 조직에서의 proAM-N20의 분포)
인간 PC, 아드레날 메둘라, 심장(우심방, 좌심방, 우심실, 좌심실)허파, 신장, 췌장, 장, 간, 비장 및 대뇌피질로부터 각 조직 1.0g을 취하고, 5배용량의 물중에서 10분간 비등시켜, 내인성 프로테아제를 비활성화시켰다. 이어서, 냉각시킨 후, 각 조직에 빙초산을 가하여 생성혼합물을 1M이 되게 준비하였다. 이 혼합물을 4℃에서 폴리트론믹서로 균질화한 다음, 균질화된 혼합물을 24,000×g의 원심분리속도로 30분간 원심분리시키고, 수득된 추출물의 상등액을 1M의 아세트산으로 미리 평형화시킨 셉-팍(Sep-Pak) C-18 카트리지 칼럼 (워터스사제)상에 유입하였다. 칼럼상에 흡수된 물질을 0.1% TFA를 함유한 50%의 아세토니트릴 4㎖로 용출시켰다. 생성액중의 면역 반응성인 proAM-N20은 세파덱스 G-50 칼럼(파마시아제)상에서의 겔 여과, TSK ODS 120A 칼럼 (4.6×150mm, 일본국 도소사제)상에서의 역상 HPLC또는 TSK CM-2SW 칼럼상에서 이온교환 HPLC로 분석하였다.
상술한 각 인간조직중의 proAM-N20의 존재를 역상 HPLC로 펩티드를 확인하는RIA에 의해 검사하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
모든 수치는 평균 ± 3 내지 4개의 시료에 대한 표준편차이다.
표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 인간 아드레날 메둘라에는 습윤조직 1mg당 13.8±7.93 펨토몰의 양인 풍부한 proAM-N20이 함유되어 있음을 알 수 있다. 심방에도 풍부한 proAM-N20이 함유되어 있음을 알 수 있다. 심실, 허파, 신장, 췌장, 장, 간, 비장 및 대뇌피질에는 소량의 proAM-N20이 검출되었다. 우심방 습윤조직 1mg중의 proAM-N20의 양은 좌심방의 것보다 약 5배가 더 많았다. 하지만, 심실중에 있는 proAM-N20의 총량은 심방중에 있는 양 보다 더 적었다. proAM-N20의 분포는 아드레노메둘린의 분포와 매우 유사하다.
proAM-N20은 아드레노메둘린과 함께 아드레노메둘린 전구물질중에 함유되어 있다. proAM-N20은 아드레노메둘린, CGRP, BNP, 심실에 위치한 ANP에서와 같이 순환계 조절에 관련될 가능성이 있다.
인간 아드레날 메둘라의 proAM-N20의 농도는 습윤조직 1mg당 12.3±9.82 펨토몰이었다. 하지만 proAM-N20을 생성하는 종양세포의 생성정도에 의존하는 것으로 여겨져 각 시료에 대한 수치 편차는 크다.
실시예 8
(Na 채널상의 ProAM-N(10-20)의 효과)
proAM-N(10-20)은 실시예 5에서 측정된 SEQ ID No.1에서 프로아드레노메둘린의 아미노산 N-말단 서열에 상응하는 부분이다. 구체적으로, proAM- N(10-20)은 SEQ ID No.1의 아미노산 (-64) 내지 (-54)에 상응하는 펩티드 [(-64)-(-54)]이다. proAM-N(10-20)은 펩티드 신시사이저(431A, Applied Biosystems)를 사용하여 고상법으로 합성하고, 역상 HPLC로 정제하였다.
배양된 소의 아드레날 메둘라 세포(4일간 배양된 것, 4×106세포/디쉬)를 KRP 완충액으로 세척하고, proAM-N(10-20)(10-6M)을 함유하는 KRP 완충액 1㎖ 또는 proAM-N20(10-6M)을 함유하는 KRP 완충액 1㎖중에서 37℃에서 5 내지 10분간 예비 배양시켰다. 이어서, 여기에 자극을 주기 위해 카르바콜(300μM)을 가하고, 37℃에서 2분간 배양시켰다. 세포내로 유동된22Na의 양을 각 시료에 대해 측정하였다. 대조용 시료는 예비배양시키지 않고, 카르바콜로 자극만을 주었다.
22Na의 양은 proAM-N(10-20)을 사용할 경우에는 29.1nmol/디쉬(n=2)이고, proAM-N20을 사용할 경우에는 70.5nmol/디쉬(n=2)인 반면에, 대조용 시료에서는 99.8nmol/디쉬(n=2)이었다. 상기한 방법에서는, 세포내의22Na의 유동은 proAM-N(10-20)에 의해 70% 억제되고, proAM-N20에 의해서는 30% 억제된다.
이상 기술한 바와 같이, 본 발명은 이 기술분야에 통상의 기술을 가진자라면 본 발명의 범위와 정신을 벗어나지 않고 다양한 다른 변형을 할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 따라서, 여기에 첨부된 특허 청구의 범위는 본 발명에 기술된 내용에 한정시켜서는 안되며, 보다 광범위하게 해석되어야 한다.
제1도는 본 발명의 인간 PC로부터 유도된 아드레노메둘린의 아미노산 서열을 나타내며, 여기서 단편 RE1 내지 RE6는 알기닐엔도펩티다제로 절단하여 얻은 단편을 나타내는 도면이고,
제2도는 본 발명의 인간 PC로부터 유도된 아드레노메둘린, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP), CGRPII 및 아밀린에 있어서의 아미노산 서열들간의 비교서열을 나타낸 도면이고,
제3A도 내지 3D도는 본 발명의 아드레노메둘린 또는 CGRP를 마취된 쥐에 일회 정맥내 투여함으로써 유발되는 혈압의 변화를 나타낸 도면이고,
제4도는 본 발명의 아드레노메둘린을 마취된 쥐에 일회 정맥내 투여함으로써 유발되는 다양한 혈액동력학 파라메터의 변화를 나타낸 도면이다.

Claims (57)

  1. SEQ ID No.1에 있어서의 13위치의 Ser로부터 52위치의 Tyr까지의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 혈압강하 효과를 갖는 펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기한 SEQ ID No.1에 있어서의 1위치의 Tyr로부터 52위치의 Tyr까지의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기한 SEQ ID No.1에 있어서의 -73위치의 Ala로부터 52위치의 Tyr까지의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 펩티드.
  4. 제1항에 있어서, 상기한 SEQ ID No.1에 있어서의 13위치의 Ser로부터 52위치의 Tyr까지의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드.
  5. 제2항에 있어서, 상기한 SEQ ID No.1에 있어서의 1위치의 Tyr로부터 52위치의 Tyr까지의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드.
  6. 제3항에 있어서, 상기한 SEQ ID No.1에 있어서의 -73위치의 Ala로부터 52위치의 Tyr까지의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항중의 어느 한 항에 있어서, 상기한 펩티드의 카르복시 말단이 아미드화 되는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  8. 제1항 내지 제6항중의 어느 한 항에 있어서, 상기한 펩티드의 카르복시 말단에 Gly가 부착되는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  9. 제1항에 있어서, 상기한 SEQ ID No.1에 있어서의 -94위치의 Met로부터 91위치의 Leu까지의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 펩티드.
  10. 제1항 내지 제6항 및 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기한 SEQ ID No.1에 있어서의 16위치의 Cys와 21위치의 Cys가 디술피드 결합에 의해 연결되는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  11. 제10항에 있어서, 상기한 디술피드 결합은 -CH2-CH2- 결합으로 대체되는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  12. SEQ ID No.1에 있어서의 3위치의 Gln으로부터 12위치의 Arg까지의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 제2항의 아미노산 서열을 인식하는 항체를 생산하는 펩티드.
  13. 제12항에 있어서, 상기한 SEQ ID No.1에 있어서의 1위치의 Tyr로부터 12위치의 Arg 까지의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 펩티드.
  14. SEQ ID No.1에 있어서의 47위치의 Ile으로부터 52위치의 Tyr까지의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 제1항 또는 제2항의 아미노산 서열을 인식하 항체를 생산하는 펩티드.
  15. 제14항에 있어서, 상기한 SEQ ID No.1에 있어서의 45위치의 Ser로부터 52위치의 Tyr까지의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 펩티드.
  16. 제14항에 있어서, 상기한 SEQ ID No.1에 있어서의 40위치의 Asn으로부터 52위치의 Tyr까지의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 펩티드.
  17. 제14항에 있어서, 상기한 펩티드의 카르복시 말단이 아미드화되는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  18. SEQ ID No.1에 있어서의 -64위치의 Arg으로부터 -54위치의 Arg까지의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지며, Na 채널 억제 효과를 갖는 펩티드.
  19. SEQ ID No.1에 있어서의 -73위치의 Ala로부터 -54위치의 Arg까지의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지며, 카테콜아민 분비 억제 효과를 갖는 펩티드.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기한 펩티드의 카르복실 말단이 아미드화되는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  21. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기한 펩티드의 카르복실말단에 Gly가 부착되는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  22. SEQ ID No.1에 있어서의 -61위치의 Trp으로부터 -54위치의 Arg까지의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 제19항의 아미노산 서열을 인식하는 항체를 생산하는 펩티드.
  23. 제22항에 있어서, 상기한 SEQ ID No.1에 있어서의 -65위치의 Phe로부터 -54위치의 Arg까지의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 펩티드.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기한 펩티드의 카르복실 말단이 아미드화되는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  25. 제1항 내지 제6항, 9항, 12항, 13항, 18항, 19항, 22항 및 23항중의 어느 한항에 있어서, 상기한 펩티드를 형성하는 아미노산 서열중 하나 이상이 표지되는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  26. 제1항 내지 제6항, 9항, 12항, 13항, 18항, 19항, 22항 및 23항중의 어느 한 항에 있어서, 상기한 펩티드가 방사성 동위원소로 표지되어, 펩티드에 부착되는 Tyr을 더욱 포함하여 이루어지는 펩티드.
  27. 제1항 내지 제6항, 9항, 12항, 13항, 18항, 19항, 22항 및 23항중의 어느 한 항의 펩티드를 암호화하는 DNA 서열.
  28. 제27항에 있어서, SEQ ID No.1에 있어서의 483위치의 A로부터 602 위치의 C까지의 염기 서열을 포함하여 이루어지는 DNA 서열.
  29. 제27항에 있어서, SEQ ID No.1에 있어서의 483위치의 A로부터 605위치의 C까지의 염기서열을 포함하여 이루어지는 DNA 서열.
  30. 제27항에 있어서, SEQ ID No.1에 있어서의 447위치의 T로부터 602위치의 C까지의 염기서열을 포함하여 이루어지는 DNA 서열.
  31. 제27항에 있어서, SEQ ID No.1에 있어서의 447위치의 T로부터 605 위치의 C까지의 염기 서열을 포함하여 이루어지는 DNA 서열.
  32. 제27항에 있어서, SEQ ID No.1에 있어서의 228위치의 G로부터 602위치의 C까지의 염기서열을 포함하여 이루어지는 DNA 서열.
  33. 제27항에 있어서, SEQ ID No.1에 있어서의 228위치의 G로부터 605위치의 C까지의 염기서열을 포함하여 이루어지는 DNA 서열.
  34. 제27항에 있어서, SEQ ID No.1에 있어서의 165위치의 A로부터 719 위치의 T까지의 염기 서열을 포함하여 이루어지는 DNA 서열.
  35. 제27항에 있어서, SEQ ID No.1에 있어서의 255위치의 C로부터 287위치의 T까지의 염기서열을 포함하여 이루어지는 DNA 서열.
  36. 제27항에 있어서, SEQ ID No.1에 있어서의 255위치의 C로부터 290위치의 G까지의 염기서열을 포함하여 이루어지는 DNA 서열.
  37. 제27항에 있어서, SEQ ID No.1에 있어서의 228위치의 G로부터 287 위치의 T까지의 염기 서열을 포함하여 이루어지는 DNA 서열.
  38. 제27항에 있어서, SEQ ID No.1에 있어서의 228위치의 G로부터 290위치의 G까지의 염기서열을 포함하여 이루어지는 DNA 서열.
  39. 제27항에 있어서, SEQ ID No.1에 있어서의 264위치의 T로부터 287위치의 T까지의 염기서열을 포함하여 이루어지는 DNA 서열.
  40. 제27항에 있어서, SEQ ID No.1에 있어서의 252 위치의 T로부터 287위치의 T까지의 염기서열을 포함하여 이루어지는 DNA 서열.
  41. 제27항의 DNA 서열을 갖는 발현 벡터.
  42. 제41항의 발현 벡터를 숙주로 도입하여 얻어지는 형질 전환체.
  43. 제42항의 형질전환체를 배지중에서 배양시키는 단계와 생성된 펩티드를 배지로부터 수집하는 단계를 포함하여 이루어지는 제1항 내지 제6항, 9항, 12항 및 13항중의 어느 한 항의 펩티드의 제조방법.
  44. 제43항에 있어서, 수집된 펩티드의 카르복실 말단이 아미드화되는 단계를 더욱 포함하여 이루어지는 제조방법.
  45. 제1항 내지 제6항, 9항, 12항, 13항, 18항, 19항, 22항 및 23항중의 어느 한 항의 펩티드를 인식하는 항체.
  46. 제45항에 있어서, SEQ ID No.1에 있어서의 1위치의 Tyr로부터 12위치의 Arg까지의 아미노산 서열에 포함되는 부위를 인식하는 항체.
  47. 제45항에 있어서, SEQ ID No.1에 있어서의 3위치의 Gln 으로부터 12위치의 Arg까지의 아미노산 서열에 포함되는 부위를 인식하는 항체.
  48. 제45항에 있어서, SEQ ID No.1에 있어서의 47위치의 Ile로부터 52위치의 Tyr까지의 아미노산 서열에 포함되는 부위를 인식하는 항체.
  49. 제45항에 있어서, SEQ ID No.1에 있어서의 45위치의 Ser로부터 52위치의 Tyr까지의 아미노산 서열에 포함되는 부위를 인식하는 항체.
  50. 제45항에 있어서, SEQ ID No.1에 있어서의 40위치의 Asn 으로부터 52위치의 Tyr까지의 아미노산 서열에 포함되는 부위를 인식하는 항체.
  51. 제45항에 있어서, SEQ ID No.1에 있어서의 -61위치의 Trp로부터 -54위치의 Arg까지의 아미노산 서열에 포함되는 부위를 인식하는 항체.
  52. 제45항에 있어서, SEQ ID No.1에 있어서의 -65위치의 Phe로부터 -54위치의 Arg까지의 아미노산 서열에 포함되는 부위를 인식하는 항체.
  53. 제48항 내지 52항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기한 아미노산 서열의 카르복실 말단의 카르복실기가 아미드화되는 것을 특징으로 하는 항체.
  54. 제45항의 항체와 제1항 내지 제6항, 9항, 12항, 13항, 18항, 19항, 22항 및 23항중의 어느 한 항의 펩티드를 함유하는 시료를 항원-항체 착체를 형성하는 조건하에 배양하는 단계와, 이 항원-항체 착체를 정량하는 단계를 포함하여 이루어지는 펩티드의 면역학적 어세이.
  55. 제1항 내지 제6항, 9항, 18항 및 19항중의 어느 한항의 펩티드를 유효성분으로 함유하는 혈압긴장저하제, 혈관이완제 또는 심기능부전증 약물.
  56. 제45항의 항체를 포함하는, 제1항 내지 제6항, 9항, 12항, 13항, 18항, 19항, 22항 및 23항중의 어느 한 항의 펩티드의 면역학적 어세이용 킷트.
  57. 제56항에 있어서, 상기한 제1항 내지 제6항, 9항, 12항, 13항, 18항, 19항, 22항 및 23항중의 어느 한항의 펩티드를 더욱 포함하는 킷트.
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