JPWO2018151072A1 - アミノクマリン化合物およびアミノクマリン化合物内包樹脂粒子 - Google Patents
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Abstract
Description
前記アミノクマリン化合物は、前記式(1)中のQがイオウ原子であるアミノクマリン化合物、酸素原子であるアミノクマリン化合物、またはN−R1であるアミノクマリン化合物である。
本発明のアミノクマリン化合物内包樹脂粒子は、前記アミノクマリン化合物と該アミノクマリン化合物を内包する樹脂粒子とを有する。本発明のアミノクマリン化合物内包樹脂粒子は、免疫染色等に好適に使用することができる。
20mLバイアル管瓶に下記式(3)で表わされる化合物 (3)600mgを入れ、発煙硫酸6mLを加えて、25℃にて4時間撹拌し、反応を行った。反応の進行はTLCにて確認した。具体的には、反応液の一部をNaOH水溶液にて中和した後、反応液にエタノールを加え、CHCl3 を2、MeOHを3の割合で混合した溶液を用いてTLCを行った。原料のRf値0.88に対し、目的物のRf値0.73であり、このTLCのデータより、反応の収束および目的物の生成を確認した。
スルホン化前の1H−NMR(400MHz, CDCl3)(化合物(3)): δ= 1.31(s, 6H), 1.59(s, 6H), 1.77(t, 2H), 1.83(t, 2H), 3.29(t, 2H), 3.38(t, 2H), 7.30(s, 1H), 7.36(t, 1H), 7.47(t, 1H), 7.94(d, 1H), 8.00(d, 1H), 8.83(s, 1H)
スルホン化後の1H−NMR(400MHz, CD3OD)(アミノクマリン化合物I): δ= 1.37(s, 6H), 1.59(s, 6H), 1.83(s broad, 2H), 1.89(s broad, 2H), 3.52(s broad, 2H), 3.61(s broad, 2H), 7.46(s, 1H), 7.95(d, 1H), 8.11(d, 1H), 8.53(s, 1H), 8.69(s, 1H)
式(3)で表わされる化合物の代わりに下記式(4)で表わされる化合物(4)を用いたこと以外は実施例1と同様の方法により、下記式(II)で表わされるアミノクマリン化合物IIを得た。アミノクマリン化合物IIの収率は82%であった。
スルホン化前の1H−NMR(400MHz, CDCl3)(化合物(4)): δ= 1.99(m, 4H), 2.79(t, 2H), 2.94(t, 2H), 3.33(s broad, 4H), 7.05(s, 1H), 7.34(t, 1H), 7.46(t, 1H), 7.92(d, 1H), 8.00(d, 1H), 8.80(s, 1H)
スルホン化後の1H−NMR(400MHz, CD3OD)(アミノクマリン化合物II): δ= 1.95(m, 4H), 2.78(t, 2H), 2.84(t, 2H), 3.36(m, 4H), 7.20(s, 1H), 7.89(d, 1H), 7.94(d, 1H), 8.38(s, 1H), 8.80(s, 1H)
式(3)で表わされる化合物の代わりに下記式(5)で表わされる化合物(5)を用いたこと以外は実施例1と同様の方法により、下記式(III)で表わされるアミノクマリン化合物IIIを得た。アミノクマリン化合物IIIの収率は80%であった。
式(3)で表わされる化合物の代わりに下記式(6)で表わされる化合物(6)を用いたこと以外は実施例1と同様の方法により、下記式(IV)で表わされるアミノクマリン化合物IVを得た。アミノクマリン化合物IVの収率は75%であった。
スルホン化前の1H−NMR(400MHz, CDCl3)(化合物(6)): δ= 1.98(m, 4H), 2.78(t, 2H), 2.93(t, 2H), 3.33(m, 4H), 6.98(s, 1H), 7.30(d, 1H), 7.31(d, 1H), 7.57(t, 1H), 7.78(t, 1H), 8.50(s, 1H)
スルホン化後の1H−NMR(400MHz, CD3OD)(アミノクマリン化合物IV): δ= 1.97(s broad, 4H), 2.80(m, 2H), 2.87(m, 2H), 3.39(m, 4H), 7.19(s, 1H), 7.72(d, 1H), 7.87(d, 1H), 8.05(s, 1H), 8.65(s, 1H)
式(3)で表わされる化合物の代わりに下記式(7)で表わされる化合物(7)を用いたこと以外は実施例1と同様の方法により、下記式(V)で表わされるアミノクマリン化合物Vを得た。アミノクマリン化合物Vの収率は70%であった。
スルホン化前の1H−NMR(400MHz, CDCl3)(化合物(7)): δ= 1.98(m, 4H), 2.78(t, 2H), 2.93(t, 2H), 3.33(m, 4H), 6.98(s, 1H), 7.30(d, 1H), 7.31(d, 1H), 7.57(t, 1H), 7.78(t, 1H), 8.50(s, 1H)
スルホン化後の1H−NMR(400MHz, CD3SOCD3)(アミノクマリン化合物V): δ= 1.97(s broad, 4H), 2.80(m, 2H), 2.87(m, 2H), 3.39(m, 4H), 7.19(s, 1H), 7.72(d, 1H), 7.87(d, 1H), 8.05(s, 1H), 8.65(s, 1H)
式(3)で表わされる化合物の代わりに下記式(8)で表わされる化合物(8)を用いたこと以外は実施例1と同様の方法により、下記式(VI)で表わされるアミノクマリン化合物VIを得た。アミノクマリン化合物VIの収率は75%であった。
式(3)で表わされる化合物の代わりに上記式(i)で表わされるアミノクマリン化合物(i)を用いたこと以外は実施例1と同様の方法により、下記式(ii)で表わされるアミノクマリン化合物iiを得た。
スルホン化前の1H−NMR(400MHz, CDCl3)(アミノクマリン化合物(i)): δ= 1.25(t, 6H), 3.46(q, 4H), 6.56(s, 1H), 6.67(d, 1H), 7.36(t,1H), 7.48(m, 2H), 7.99(d, 1H), 8.01(d, 1H), 8.90(s, 1H)
スルホン化後の1H−NMR(400MHz, CD3SOCD3)(アミノクマリン化合物ii): δ= 1.67(t, 6H), 3.51(m, 4H), 6.68(s, 1H), 6.86(d, 1H), 7.41(d, 1H), 7.78(d, 1H), 7.91(d, 1H), 8.30(s, 1H), 9.03(s, 1H)
アミノクマリン化合物I 14.4mgを水22mLに加えて溶解させた。この溶液に乳化重合用乳化剤のエマルジョン(登録商標)430(ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王社製)の5%水溶液を2mL加えた。
(FACS評価)
アミノクマリン化合物内包樹脂粒子Iの末端にNHS−PEG(polyethylene glycol)−マレイミド試薬を用いてマレイミドを導入し、これにチオール化した抗HER2抗体を結合させた。
(FISH評価)
〔BACプローブの調製〕
CellBiochemBiophys.2006;45(1)59の記載の方法に従って、以下のように核酸分子を調製した。GSP社から購入したHER2−DNAクローン(約150kbp)1μg(5μL)に対して、ニックトランスレーション用のキット(製品名「GSP−ニックトランスレーションキット」K−015、GSP社製)のプロトコールに従い、以下のようにニックトランスレーション法により、HER2のDNAクローン(核酸分子)のdTTPをDNP標識dUTPで置換した。
まず、下記の試薬を遠心チューブ内で混合した。
・10×NickBuffer(Tris−HCl[pH7.2]、MgSO4、DTT)・・・2.5μL
・BSA(Nuclease−free BSA)・・・1.5μL
・dNTP mix(dATP、dCTP、dCTP)・・・5μL
・dTTP・・・0.5μL、
・DNP−11−dUTP(製品番号NEL551001EA、PerkinElmer社製、250nmol/25μL)・・・0.15μL
・純水(Nuclease free water)・・・3μL
・上記HER2−DNAクローン約150kbp 1μgの水溶液・・・5μL
・DNA PоlymeraseI(Tris−HCl[pH7.5]、EDTA、DTT、glycerоl)・・・1μL
・DNaseI・・・5μL
次に、15℃で4時間反応させ、70℃で10分間加熱して反応を停止させた。反応後の遠心チューブに25μLの蒸留水を添加した。ビオチン標識済みのBACプローブの反応溶液を核酸精製用マイクロスピンカラム(GEヘルスケア社製「MicroSpin S−200HR Column」、製品番号「#27−5120−01」)により精製した。
アミノクマリン化合物内包樹脂粒子Iの表面アミノ基にNHS−PEG(polyethylene glycol)−マレイミド試薬を反応してマレイミドを導入し、これに抗DNP抗体を結合させた。
上述のように得られたDNAプローブをハイブリダイゼーション緩衝液(25%脱イオン化したホルムアミド、2×SSC、200ng/μLサケ精子DNA、5×デンハルト溶液、50mMのリン酸ナトリウム、pH7.0、1mMEDTA)に終濃度1〜5ng/μLとなるように希釈した。必要に応じて、S300サイズのスピンカラム(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)により遊離のリガンドを除去した。直ぐに使用しない場合、DNAプローブを−20℃で冷凍保存した。
FISHによりHER2遺伝子のコピー数を測定した。FISHは以下に示すように、脱パラフィン処理、検体スライドの前処理、酵素処理、検体の固定処理、プローブの準備、検体スライドのDNAの変性処理、ハイブリダイゼーション処理、スライドグラスの洗浄処理、およびDAPI染色処理をこの順で行うことで実施した。
HER2陽性染色対照標本の検体スライド(パソロジー研究所社製「HER2−FISHコントロールスライド Code PS−09006」)を、以下の(1)〜(4)の順で処理することで脱パラフィン処理を行った。(1)ヘモディー(Hemo−De)に常温で10分間浸漬する。(2)検体スライドを新しいHemo−Deに常温10分間浸漬する。同じ操作を3回繰り返す。(3)検体スライドを100%エタノールで常温で5分間浸漬し、2回洗浄し、脱水処理を行う。(4)検体スライドを風乾または45〜50℃のスライドウォーマー上で乾燥させる。
DNAプローブの到達性を向上させるために、上記検体スライドに対し以下の(1)〜(6)の順で前処理を行い、細胞膜及び核膜の蛋白質の除去を行った。(1)検体スライドを0.2mоl/L HClで室温、20分間処理する。(2)検体スライドを精製水に3分間浸漬する。(3)検体スライドを洗浄緩衝液(2xSSC:standard sailine citrate)に3分間浸漬する。(4)検体スライドを80℃の前処理溶液(1N NaSCN)に30分間浸漬する。(5)検体スライドを精製水に1分間浸漬する。(6)検体スライドを洗浄緩衝液(2xSSC)に5分間浸漬し、この浸漬操作を2回繰り返す。
前処理を行った検体スライドに対して、以下の(1)〜(4)の処理をこの順で行うことで酵素処理を行った。(1)前処理した検体スライドを取り出し、ペーパータオルにスライドグラスの下端をつけて余分な洗浄緩衝液を取り除く。(2)検体スライドを37℃に加温したプロテアーゼ溶液に10〜60分間浸漬する。この浸漬処理は、細胞膜及び核膜のタンパク質、特にコラーゲンの分解をするために、25mg プロテアーゼ(2500−3000Units/mg)[ペプシン]/1M NaCl[pH2.0]50mLで37℃、60分間)で処理することが望ましい。(3)検体スライドを洗浄緩衝液に5分間浸漬する。この操作を2回繰り返す。(4)検体スライドを風乾または45〜50℃のスライドウォーマー上で2〜5分間乾燥させる。
検体の固定処理として、前処理を行った検体スライドに対して以下の(1)〜(3)の処理を行った。(1)検体スライドを10%中性緩衝ホルマリン(和光純薬社製「4%パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液」、製品番号163−20145)に常温で10分間浸漬する。(2)検体スライドを洗浄緩衝液に5分間浸漬する。これと同じ操作を2回繰り返す。(3)検体スライドを風乾または45〜50℃のスライドウォーマー上で2〜5分間乾燥させる。
冷凍保存しておいたDNAプローブ試薬の溶液を室温に戻し、正確な容量を採液可能なピペッティング操作ができる程度まで溶液の粘度を十分にさげて、ボルテックスミキサー等で溶液を混和した。
検体スライド上のDNAの変性処理として、検体の固定処理を行った検体スライドに対して以下の(1)〜(8)の処理を行った。(1)検体スライドの作成前に水で湿らせたペーパータオルを底に敷いた湿潤箱(気密性の容器であり、その側面をペーパータオルでテーピングしたもの)を37℃インキュベータ内に載置して予備加熱する。(2)変性溶液(70% ホルムアミド/SSC[150mM NaCl、15mMクエン酸ナトリウム])のpHが常温でpH7.0〜8.0であることを確かめる。変性溶液をコプリンジャーに入れ、溶液が72℃±1℃になるまで温浴槽で加温する(72±1℃の温浴槽に少なくとも30分間置く)。(3)ハイブリダイゼーション領域がどの部分か分かるように、検体スライドの裏側に領域を囲むようにダイアモンドペン等でマークする。(4)検体スライドを72±1℃の変性溶液の入ったコプリンジャー中に浸漬し、検体スライドのDNAを変性する。(5)ピンセットを使って、検体スライドを変性溶液から取り出し、すぐに常温の70%エタノール中に入れる。ホルムアミドを除くためにスライドを振盪する。検体スライドを1分間浸漬する。(6)検体スライドを70%エタノールから取り出し、85%エタノール中に入れ、ホルムアミドを除くためにスライドを振盪する。検体を1分間浸漬する。100%エタノールで同じ操作を2回繰り返す。(7)ペーパータオルに検体スライドグラスの下端をつけてエタノールを取り除き、ペーパータオルでスライドグラスの裏側を拭く。(8)検体スライドをドライヤーで風乾または45〜50℃のスライドウォーマーで2〜5分間乾燥させる。
上記変性処理を行った検体スライドに対して以下の(1)〜(3)の処理をこの順で行うことで、検体スライドに対して上述したように調製したDNAプローブ10μL(10〜50ng)を用いてハイブリダイゼーション処理を行った。(1)検体スライドのハイブリダイゼーション領域に調製した上記DNAプローブを10μL添加し、すぐに、22mm×22mmのカバーグラスをプローブの上に被せ均一にプローブを広げる。ハイブリダイゼーション領域に気泡が入らないようにする。(2)ペーパーボンドでカバーグラスをシールする。(3)前もって加温した湿潤箱に検体スライドを入れて蓋をして37℃のインキュベータで14〜18時間ハイブリダイゼーションを行う。
上記ハイブリダイゼーション処理を行った検体スライドに対して以下の(1)〜(6)の処理をこの順で行うことで、検体スライドの洗浄処理を行った。(1)ポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液(2×SSC/0.3%NP−40)をコプリンジャーに入れる。ポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液が72℃±1℃になるまで温浴槽で予備加熱をする(72℃±1℃の温浴槽に少なくとも30分間置く)。(2)ポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液を入れたコプリンジャーをもうひとつ用意し、常温に維持する。(3)ピンセットでペーパーボンドのシールを取り除く。(4)検体スライドをポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液の中に入れる。カバーグラスは自然に溶液中で剥がれるのを待つ。(5)溶液から検体スライドを取り出し、余分な溶液を取り去り、72±1℃に加温したポストハイブリダイゼーション洗浄緩衝液に2分間浸す。ここで、73℃を超える温度や処理時間として2分を超えないようにするのが望ましい。(6)コプリンジャーから検体スライドを取り出し、遮光下(締め切った引出や締め切ったキャビネットの棚等)で風乾する。
DAPI染色は以下のように行った。まず、10μLのDAPI対比染色液を検体スライドのハイブリダイゼーション領域に添加した。次に、ハイブリダイゼーション処理した後、細胞数をカウントするためにDAPI染色(2μg/mLPBS)を25℃、10分間行うことで細胞核を染色し、カバーガラスを被せて、シグナルの計測まで検体スライドを遮光して保存した。DAPI (4',6−Diamidino−2−Phenylindole, Dihydrochloride) はMolecular Probes社(D1306)を使用した。
<蛍光顕微鏡観察>
蛍光顕微鏡観察では、HER2遺伝子染色済み組織切片を、蛍光顕微鏡Zeiss imager(Camera:MRmモノクロ・冷却機能付、対眼レンズx10、対物レンズ×60油浸、Zeiss製フィルターセットHE46(励起フィルター500nm±12.5nm、ビームスプリッター515nm、蛍光フィルター535nm±15nm))にセットし、ハイブリダイズしたDNAプローブのアミノクマリン化合物内包樹脂粒子の蛍光発光を、蛍光画像(蛍光静止画像)として取得した。
[実施例8〜12]
実施例8〜12においては、アミノクマリン化合物Iの代わりにアミノクマリン化合物II〜VIをそれぞれ用いたこと以外は実施例7と同様の方法で、アミノクマリン化合物内包樹脂粒子II〜VIを作製した。
[比較例5〜8]
比較例5〜8においては、アミノクマリン化合物Iの代わりにアミノクマリン化合物i〜ivをそれぞれ用いたこと以外は実施例7と同様の方法で、アミノクマリン化合物内包樹脂粒子i〜ivを作製した。
アミノクマリン化合物I 3.4mgに塩化チオニル0.1mLを加え、65℃4時間、加熱混合した後、真空乾燥を行なって余剰の塩化チオニルを除去した。得られたアミノクマリン化合物と塩化チオニルの反応物と3−アミノプロピルトリメトキシシラン(3−aminopropyltrimetoxysilane、信越シリコーン社製、KBM903)3μLを1.2mLのN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)の中で混合し、オルガノアルコキシシラン化合物を得た。
[実施例14]
超純水0.85mL、アンモニア水0.85mLとしたこと以外は実施例13と同様の方法で、アミノクマリン化合物内包粒子VIIIを得た。得られた粒子の1000個についてSEM観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は80nmであった。
[実施例15]
超純水1.10mL、アンモニア水1.10mLとしたこと以外は実施例13と同様の方法で、アミノクマリン化合物内包粒子IXを得た。得られた粒子の1000個についてSEM観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は150nmであった。
[実施例16]
超純水1.15mL、アンモニア水1.15mLとしたこと以外は実施例13と同様の方法で、アミノクマリン化合物内包粒子Xを得た。得られた粒子の1000個についてSEM観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は195nmであった。
[実施例17]
超純水1.20mL、アンモニア水1.20mLとしたこと以外は実施例13と同様の方法で、アミノクマリン化合物内包粒子XIを得た。得られた粒子の1000個についてSEM観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は220nmであった。
[比較例9]
アミノクマリン化合物Iの代わりに緑色色素であるPyrromethene556を用いたこと以外は実施例15と同様の方法で、色素内包粒子vを得た。得られた粒子の1000個についてSEM観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は150nmであった。
[比較例10]
アミノクマリン化合物Iの代わりに緑色色素であるPyrromethene556を用いたこと以外は実施例7と同様の方法で、色素内包粒子viを得た。得られた粒子の1000個についてSEM観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は150nmであった。
[比較例11]
アミノクマリン化合物Iの代わりに赤色色素であるスルホローダミン101を用いたこと以外は実施例7と同様の方法で、色素内包粒子viiを得た。得られた粒子の1000個についてSEM観察を行い、平均粒径を測定したところ、平均粒径は150nmであった。
[実施例7A]
実施例7で作製したアミノクマリン化合物内包粒子Iを用いて、下記の方法により免疫染色を行った。
(色素内包粒子のストレプトアビジン修飾)
アミノクマリン化合物内包粒子Iを、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)を2mM含有するPBS(リン酸緩衝液生理的食塩水)を用いて3nMに調整し、この溶液に最終濃度10mMとなるようにSM(PEG)12(サーモサイエンティフィック社製、succinimidyl−[(N−maleimidopropionamid)−dodecanethyleneglycol]ester)を混合し、5℃で1時間反応させた。
(ビオチン修飾された2次抗体の作製)
50mMTris−HCl溶液(pH7.5)に抗ウサギIgG抗体50μgを溶解した。該溶液に、最終濃度3mMとなるようにDTT(dithiothretol)溶液を混合した。その後、該溶液を37℃で30分間反応させた。その後、脱塩カラムを用いてDTTで還元化した2次抗体を精製した。精製した抗体全量のうち200μLを50mMTris−HCl溶液(pH7.5)に溶解して抗体溶液を得た。その一方で、スペーサーの長さが30オングストロームであるリンカー試薬「(+)−Biotin−PEG6‐NH‐Mal」(PurePEG社製,製品番号2461006-250)を、DMSOを用いて0.4mMとなるように調整した。この溶液8.5μLを前記抗体溶液に添加し、混和して37℃で30分間反応させた。
(染色)
(1)標本処理工程
(1−1)脱パラフィン処理工程
染色用の組織切片として、HER2(3+)とHER2(−)の組織アレイスライド(コスモバイオ社製「CB−A712のシリーズ」)を用いた。この組織アレイスライドを脱パラフィン処理した。
脱パラフィン処理した組織アレイスライドを水に置換する洗浄を行った。洗浄した組織アレイスライドを10mMクエン酸緩衝液中(pH6.0)中で121℃、15分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。賦活化処理後の組織アレイスライドをPBSにより洗浄し、洗浄した組織アレイスライドに対してBSAを1%含有するPBSを用いて1時間ブロッキング処理を行った。
(2−1)1次反応
BSAを1%含有するPBSを用いて、ベンタナ社製「抗HER2ウサギモノクロナール抗体(4B5)」を0.05nMに調整し、該1次抗体の溶液を上述のブロッキング処理した組織アレイスライドに対して4℃で1晩反応させた。
1次反応を行った組織アレイスライドをPBSで洗浄した後、1%BSA含有のPBSで6μg/mLに希釈した上記ビオチン化2次抗体と室温30分間反応させた。
2次反応を行った組織アレイスライドに対して、1%BSA含有のPBSで0.02nMに希釈したストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子Iを、中性のpH環境(pH6.9〜7.4)室温の条件下で3時間反応させた。該反応後の組織アレイスライドをPBSで洗浄した。
免疫染色後、ヘマトキシリン・エオシン染色(HE染色)を行った。免疫染色した切片をマイヤーヘマトキシリン液で5分間染色してヘマトキシリン染色を行った。その後、該組織切片を45℃の流水で3分間洗浄した。次に、1%エオシン液で5分間染色してエオシン染色を行った。
免疫染色工程および形態観察染色工程を終えた組織切片に対して、純エタノールに5分間浸漬する操作を4回行い、洗浄・脱水を行った。続いて、キシレンに5分間浸漬する操作を4回行い、透徹を行った。最後に、封入剤(メルク社製「エンテランニュー」)を用いて、組織切片を封入して観察用のサンプルの組織アレイスライドとした。
固定化処理工程を終えた組織切片に対して所定の励起光を照射して、蛍光を発光させた。その状態の組織切片を蛍光顕微鏡(オリンパス社製「BX−53」)、顕微鏡用デジタルカメラ(オリンパス社製「DP73」)により観察および撮像を行った。上記励起光は、光学フィルターに通すことで575〜600nmに設定した。また、観察する蛍光の波長(nm)の範囲についても、光学フィルターを通すことで612〜692nmに設定した。顕微鏡観察、画像取得時の励起波長の条件は、580nmの励起では視野中心部付近の照射エネルギーが900W/cm2となるようにした。画像取得時の露光時間は、画像の輝度が飽和しないように任意に設定(例えば4000μ秒に設定)して撮像した。HER2(3+)の組織の輝点数は、400倍で撮像した画像をもとにImageJ FindMaxims法により計測した1000細胞の平均値とした。
[実施例14A〜17A]
実施例14A〜17Aでは、それぞれ、実施例14〜17で作製したアミノクマリン化合物内包粒子VIII〜XIを用いて、下記の方法により免疫染色を行った。
(色素内包粒子のストレプトアビジン修飾)
アミノクマリン化合物内包粒子Iの代わりにアミノクマリン化合物内包粒子VIII〜XIをそれぞれ使用したこと以外は実施例7Aと同様の方法でストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子VIII〜XIをそれぞれ得た。
(ビオチン修飾された2次抗体の作製)
実施例7Aと同様の方法でビオチン化2次抗体の溶液を得た。
(染色)
ストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子Iの代わりにストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子VIII〜XIをそれぞれ使用したこと以外は実施例7Aと同様の方法で、S/Nを算出した。S/Nを表4に示す。
[実施例8A]
実施例8Aでは、実施例8で作製したアミノクマリン化合物内包粒子IIを用いて、下記の方法により免疫染色を行った。
(色素内包粒子のストレプトアビジン修飾)
アミノクマリン化合物内包粒子Iの代わりにアミノクマリン化合物内包粒子IIを使用したこと以外は実施例7Aと同様の方法でストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子IIを得た。
(ビオチン修飾された2次抗体の作製)
実施例7Aと同様の方法でビオチン化2次抗体の溶液を得た。
(染色)
(1)標本処理工程
(1−1)脱パラフィン処理工程
染色用の組織切片としてPDL1の組織アレイスライドを用いた。この組織アレイスライドを脱パラフィン処理した。
脱パラフィン処理した組織アレイスライドを水に置換する洗浄を行った。洗浄した組織アレイスライドを10mMクエン酸緩衝液中(pH6.0)中で121℃、15分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。賦活化処理後の組織アレイスライドをPBSにより洗浄し、洗浄した組織アレイスライドに対してBSAを1%含有するPBSを用いて1時間ブロッキング処理を行った。
(2−1)1次反応
BSAを1%含有するPBSを用いて、Cell Signaling Technology社製「抗PD-L1ウサギモノクロナール抗体(E1L3N)」を0.05nMに調整し、該1次抗体の溶液を上述のブロッキング処理した組織アレイスライドに対して4℃で1晩反応させた。
1次反応を行った組織アレイスライドをPBSで洗浄した後、1%BSA含有のPBSで6μg/mLに希釈した上記ビオチン化2次抗体と室温30分間反応させた。
2次反応を行った組織アレイスライドに対して、1%BSA含有のPBSで0.02nMに希釈したストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子IIを、中性のpH環境(pH6.9〜7.4)室温の条件下で3時間反応させた。該反応後の組織アレイスライドをPBSで洗浄した。
免疫染色後、ヘマトキシリン・エオシン染色(HE染色)を行った。免疫染色した切片をマイヤーヘマトキシリン液で5分間染色してヘマトキシリン染色を行った。その後、該組織切片を45℃の流水で3分間洗浄した。次に、1%エオシン液で5分間染色してエオシン染色を行った。
免疫染色工程および形態観察染色工程を終えた組織切片に対して、純エタノールに5分間浸漬する操作を4回行い、洗浄・脱水を行った。続いて、キシレンに5分間浸漬する操作を4回行い、透徹を行った。最後に、封入剤(メルク社製「エンテランニュー」)を用いて、組織切片を封入して観察用のサンプルの組織アレイスライドとした。
実施例7Aと同様の方法で、S/Nを算出した。S/Nを表4に示す。
[比較例9A−1]
(色素内包粒子のストレプトアビジン修飾)
アミノクマリン化合物内包粒子Iの代わりに色素内包粒子vを使用したこと以外は実施例7Aと同様の方法でストレプトアビジン結合色素内包粒子vを得た。
(ビオチン修飾された2次抗体の作製)
実施例7Aと同様の方法でビオチン化2次抗体の溶液を得た。
(染色)
ストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子Iの代わりにストレプトアビジン結合色素内包粒子vを使用したこと以外は実施例7Aと同様の方法で、S/Nを算出した。S/Nを表4に示す。
[比較例9A−2]
(色素内包粒子のストレプトアビジン修飾)
アミノクマリン化合物内包粒子Iの代わりに色素内包粒子vを使用したこと以外は実施例1と同様の方法でストレプトアビジン結合色素内包粒子vを得た。
(ビオチン修飾された2次抗体の作製)
実施例1と同様の方法でビオチン化2次抗体の溶液を得た。
(染色)
ストレプトアビジン結合アミノクマリン化合物内包粒子IIの代わりにストレプトアビジン結合色素内包粒子vを使用したこと以外は実施例8Aと同様の方法で、S/Nを算出した。S/Nを表4に示す。
[実施例7B]
実施例7で作製したアミノクマリン化合物内包粒子Iを用いて、下記の方法により緑色および赤色の多重免疫染色を行った。
(色素内包粒子の修飾)
アミノクマリン化合物内包樹脂粒子Iの末端にNHS−PEG(polyethylene glycol)−マレイミド試薬を用いてマレイミドを導入し、これにチオール化した抗HER2抗体を結合させ、抗HER2抗体結合アミノクマリン化合物内包樹脂粒子を作製した。
(組織標本の免疫染色)
下記工程(1)〜(13)によりヒト乳房組織標本の免疫染色(IHC法)を行った。
(顕微鏡観察)
蛍光顕微鏡としてCarl Zeiss社製蛍光顕微鏡を、フィルターセットとしてSemrock製フィルターセットを使用した。フィルターセットは免疫染色剤(緑色用および赤色用)に対応する下記2種類を使用した。
[実施例8B]
実施例8Bにおいては、アミノクマリン化合物内包樹脂粒子VIIの代わりにアミノクマリン化合物内包粒子IIを使用したこと以外は実施例7Bと同様の方法により多重免疫染色を行った。結果を表6に示す。
[比較例10B]
アミノクマリン化合物内包樹脂粒子VIIの代わりに色素内包粒子viを使用したこと以外は実施例7Bと同様の方法により多重免疫染色を行った。結果を表6に示す。
Claims (7)
- 前記式(1)中のQがイオウ原子である請求項1に記載のアミノクマリン化合物。
- 前記式(1)中のQが酸素原子である請求項1に記載のアミノクマリン化合物。
- 前記式(1)中のQがN−R1である請求項1に記載のアミノクマリン化合物。
- 請求項1に記載のアミノクマリン化合物と該アミノクマリン化合物を内包する樹脂粒子とを有するアミノクマリン化合物内包樹脂粒子。
- 前記樹脂粒子がアミノ樹脂粒子である請求項5に記載のアミノクマリン化合物内包樹脂粒子。
- 励起スペクトル極大波長が475〜510nmであり、蛍光スペクトル極大波長が510〜540nmである請求項5または6に記載のアミノクマリン化合物内包樹脂粒子。
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