JPWO2016158809A1 - デリバリー機能と遺伝子発現制御能を有する一本鎖核酸分子 - Google Patents
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Abstract
Description
前記領域(X)が、前記領域(Xc)と相補的であり、
前記領域(X)および前記領域(Xc)の少なくとも一方が、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む、標的遺伝子の発現抑制用一本鎖核酸分子であって、該標的遺伝子の発現抑制用一本鎖核酸分子の5’末端、3’末端、および前記リンカー領域(Lx)からなる群から選択される少なくとも1つに、デリバリー機能を有する生体関連物質が結合していることを特徴とする、標的遺伝子の発現抑制用一本鎖核酸分子である。
本発明の一本鎖核酸分子は、前述のように、デリバリー機能を有する標的遺伝子の発現抑制用一本鎖核酸分子であって、領域(X)、リンカー領域(Lx)および領域(Xc)からなり、
前記領域(X)が、前記領域(Xc)と相補的であり、前記領域(X)および前記領域(Xc)の少なくとも一方が、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む、標的遺伝子の発現抑制用一本鎖核酸分子であって、
該標的遺伝子の発現抑制用一本鎖核酸分子の5’末端、3’末端、および前記リンカー領域(Lx)からなる群から選択される少なくとも1つに、デリバリー機能を有する生体関連物質が結合していることを特徴とする。
前記単糖は、立体異性体、配座異性体等の異性体であってもよく、また、アミノ基、アルコール、チオール等による置換を受けていてもよい。上記記載は、前記二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖についても同様に適用できる。
X>Xc ・・・(1)
X−Xc=1〜10、好ましくは1、2または3、
より好ましくは1または2 ・・・(3)
X=Xc ・・・(2)
(1)非修飾ヌクレオチド残基
(2)修飾ヌクレオチド残基
(3)非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
(1)非修飾ヌクレオチド残基
(2)修飾ヌクレオチド残基
(3)非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
(4)非ヌクレオチド残基
(5)非ヌクレオチド残基および非修飾ヌクレオチド残基
(6)非ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
(7)非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
X1およびX2は、それぞれ独立して、H2、O、SまたはNHであり;
Y1およびY2は、それぞれ独立して、単結合、CH2、NH、OまたはSであり;
L1は、n個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、もしくはSRaで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L1は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y1が、NH、OまたはSの場合、Y1に結合するL1の原子は炭素であり、OR1に結合するL1の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
L2は、m個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SHもしくはSRcで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L2は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y2が、NH、OまたはSの場合、Y2に結合するL2の原子は炭素であり、OR2に結合するL2の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
Ra、Rb、RcおよびRdは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり;
mは、0〜30の範囲の整数であり;
nは、0〜30の範囲の整数であり;
前記領域(Xc)および前記領域(X)は、それぞれ、−OR1−または−OR2−を介して、前記リンカー領域(Lx)に結合し、
ここで、R1およびR2は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、R1およびR2は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造(I)であり、
Aは、任意の原子団であり、ただし、下記式(Ia)は、前記アミノ酸であり、かつ、下記式(Ia)は、ペプチド以外のアミノ酸である。
条件(1)
前記領域(Xc)は、−OR2−を介して、前記領域(X)は、−OR1−を介して、前記式(I)の構造と結合する。
条件(2)
前記領域(Xc)は、−OR1−を介して、前記領域(X)は、−OR2−を介して、前記式(I)の構造と結合する。
前記ヌクレオチド残基は、例えば、構成要素として、糖、塩基およびリン酸を含む。前記ヌクレオチド残基としては、前述のように、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記リボヌクレオチド残基は、例えば、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)およびU(ウラシル)を有し、前記デオキシリボース残基は、例えば、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)およびチミン(T)を有する。
前記非ヌクレオチド残基は、特に制限されない。本発明のssNc分子は、例えば、前記非ヌクレオチド残基として、アミノ酸残基またはペプチド残基を含む非ヌクレオチド構造を有してもよい。前記アミノ酸残基またはペプチド残基を構成するアミノ酸としては、例えば、塩基性アミノ酸、酸性アミノ酸等があげられる。前記塩基性アミノ酸としては、例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン等があげられる。前記酸性アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸等があげられる。前記非ヌクレオチド残基は、例えば、前記リンカー領域(Lx)に有することが好ましい。
本発明の発現抑制用組成物は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であり、前記本発明のssNc分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明のssNc分子を含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の発現抑制用組成物は、例えば、発現抑制用試薬ということもできる。
本発明の発現抑制方法は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明のssNc分子を使用することを特徴とする。本発明の発現抑制方法は、前記本発明のssNc分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
本発明の疾患の治療方法は、前述のように、前記本発明のssNc分子を、患者に投与する工程を含み、前記ssNc分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする。本発明の治療方法は、前記本発明のssNc分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
本発明の使用は、前記標的遺伝子の発現抑制のための、前記本発明のssNc分子の使用である。また、本発明の使用は、RNA干渉の誘導のための、前記本発明のssNc分子の使用である。
(1)一本鎖核酸分子の合成
以下に示す一本鎖核酸分子を、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機(商品名ABI Expedite(登録商標) 8909 Nucleic Acid Synthesis System、アプライドバイオシステムス)により合成した。前記合成には、RNAアミダイトとして、EMMアミダイト(国際公開第2013/027843号)を用いた(以下、同様)。前記アミダイトの脱保護は、定法に従った。合成した一本鎖核酸分子は、HPLCにより精製した。精製後の一本鎖核酸分子は、それぞれ凍結乾燥した。下記一本鎖核酸分子中、KH−0001、NH−0005、PH−0009の下線部は、ヒトTGF−β1遺伝子の発現抑制配列であり、KH−0010の下線部は、ルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制配列である。
KH−0001(配列番号29)
5’-GCAGAGUACACACAGCAUAUACC-Lx-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUU-3’
NH−0005(配列番号30)
5’-GCAGAGUACACACAGCAUAUACCCCACACCGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUU-3’
PH−0009(配列番号29)
5’-GCAGAGUACACACAGCAUAUACC-Lx-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUU-3’
KH−0010(配列番号31)
5’-CUUACGCUGAGUACUUCGAUUCC-Lx-GGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUU-3’
KH−0030(配列番号29)
5’-GCAGAGUACACACAGCAUAUACC-Lx-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUU-3’
PH−0000(配列番号32)
5’-UACUAUUCGACACGCGAAGUUCC-Lx-GGAACUUCGCGUGUCGAAUAGUAUU-3’
以下に本発明の脂質コンジュゲート一本鎖核酸分子であるKH−0001−C18の構造を示す。
KH−0001−C18は、前記KH−0001のリンカー領域(Lx)に、後述する方法にて一本鎖脂質であるステアリン酸(C18)を結合させた一本鎖核酸分子である。
500μmol/LのKH−0001 200μL、50mmol/LのC18−NHS/DMF溶液 80μL、イソプロパノール 320μL、pH9.2の炭酸緩衝液 400μL(最終濃度100mmol/L)を混合し、40℃にて3時間撹拌した。反応液をHPLCにて精製 (カラム:Develosil C8−UG−5,5μm,10×50mm;流速:4.7mL/min;検出:UV260nm;カラムオーブン:35℃;Buffer A:50mmol/L TEAA,5%CH3CN;Buffer B:CH3CN) し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水(大塚製薬)に溶解させた。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度98.45%のKH−0001−C18を6.5mg得た。質量分析:15989.34(計算値:15989.06)。精製後のHPLCチャートを図2に示す。
KH−0001−DOPEは、前記KH−0001のリンカー領域(Lx)に、後述する方法にて二本鎖脂質であるDOPEを結合させた一本鎖核酸分子である。
KH−0001(1115μM)100μL、10mM DOPE−NHS/エタノール溶液 400μL、エタノール 200μL、1%トリエチルアミン水溶液 100μL、注射用蒸留水 200μLを混合し、40℃にて3時間撹拌した。反応液をHPLCにて精製 (カラム:Develosil C8−UG−5,5μm,10×50mm;流速:4.7mL/min;検出:UV260nm;カラムオーブン:35℃;Buffer A:50mM TEAA,5%CH3CN;Buffer B:CH3CN) し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度98.64%のKH−0001−DOPEを3.0mg得た。質量分析:16562.52(計算値:16562.71)。精製後のHPLCチャートを図3に示す。
KH−0001−Cholは、前記KH−0001のリンカー領域(Lx)に、後述する方法にてエチレングリコールリンカーを介してコレステロールを結合させた一本鎖核酸分子である。
500μmol/LのKH−0001 200μL、50mmol/L のCholesteryl−EG−NHS Ester/DMF溶液 80μL、イソプロパノール 320μL、pH9.2の炭酸緩衝液 400μL(最終濃度100mmol/L)を混合し、50℃にて終夜撹拌した。反応液をHPLCにて精製 (カラム:Develosil C8−UG−5,5μm,10×50mm;流速:4.7mL/min;検出:UV260nm;カラムオーブン:35℃;Buffer A:50mmol/L TEAA,5%CH3CN;Buffer B:CH3CN) し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水(大塚製薬)に溶解させた。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度95.47%のKH−0001−Cholを0.9mg得た。質量分析:16382.13(計算値:16382.55)。
以下に本発明の糖質コンジュゲート一本鎖核酸分子であるKH−0001−Lacの構造を示す。
KH−0001−Lacは、前記KH−0001のリンカー領域(Lx)に、後述する方法にて二糖であるラクトースを結合させた一本鎖核酸分子である。
1mmol/LのKH−0001 100μL、2mol/Lのラクトース 50μL、メタノール 600μL、pH3.8の酢酸緩衝液 200μL(最終濃度200mmol/L)、10mol/LのNaBH3CN/メタノール溶液 50μLを混合し、60℃にて20時間撹拌した。反応液をSephadex G−25(PD−10;GEヘルスケア)を用いて精製し、質量分析より目的物の生成を確認した。質量分析:16048.38(計算値:16048.89)。精製後のHPLCチャートを図4に示す。
KH−0001−GalNAcは、前記KH−0001のリンカー領域(Lx)に、後述する方法にて単糖であるN−アセチルガラクトサミンを結合させた一本鎖核酸分子である。
1mmol/LのKH−0001 100μL、2mol/LのN−アセチルガラクトサミン 50μL、メタノール 600μL、pH3.8の酢酸緩衝液 200μL(最終濃度200mmol/L)、10mol/LのNaBH3CN/メタノール溶液 50μLを混合し、60℃にて終夜撹拌した。反応液をSephadex G−25(PD−10;GEヘルスケア)を用いて精製し、質量分析より目的物の生成を確認した。質量分析:15927.54(計算値:15927.81)。
KH−0001−GlcNAcは、前記KH−0001のリンカー領域(Lx)に、後述する方法にて単糖であるN−アセチルグルコサミンを結合させた一本鎖核酸分子である。
1mmol/LのKH−0001 100μL、2mol/LのN−アセチルグルコサミン 50μL、メタノール 600μL、pH3.8の酢酸緩衝液 200μL(最終濃度200mmol/L)、10mol/LのNaBH3CN/メタノール溶液 50μLを混合し、60℃にて終夜撹拌した。反応液をSephadex G−25(PD−10;GEヘルスケア)を用いて精製し、質量分析より目的物の生成を確認した。質量分析:15927.85(計算値:15927.81)。
以下に本発明のペプチドコンジュゲート一本鎖核酸分子であるKH−0010−GE11の構造を示す。
KH−0010−GE11は、前記KH−0010のリンカー領域(Lx)に、後述する方法にてGMBSリンカーを介して前記配列番号12で示すペプチドであるGE11を結合させた一本鎖核酸分子である。
500μmol/LのKH−0010 200μL、4mmol/LのGMBS/DMF溶液 500μL、pH7.0のリン酸緩衝液(最終濃度120mmol/L)を混合し、室温にて3時間撹拌した。反応液をSephadex G−25(PD−10;GEヘルスケア)を用いて精製し、100mmol/Lのリン酸緩衝液(pH7.0)中にて1mgのGE11ペプチドを添加し、室温にて1時間撹拌した。反応液をHPLCにて精製 (カラム:Develosil C8−UG−5,5μm,10×50mm;流速:4.7mL/min;検出:UV260nm;カラムオーブン:35℃;Buffer A:50mmol/L TEAA,5%CH3CN;Buffer B:CH3CN)し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水(大塚製薬)に溶解させた。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度95.97%のKH−0010−GE11を0.7mg得た。精製後のHPLCチャートを図5に示す。
KH−0010−GE11(7)は、前記KH−0010のリンカー領域(Lx)に、後述する方法にてGMBSリンカーを介して前記配列番号13で示すペプチドであるGE11(7)を結合させた一本鎖核酸分子である。
500μmol/LのKH−0010 200μL、4mmol/LのGMBS/DMF溶液 500μL、pH7.0のリン酸緩衝液(最終濃度120mmol/L)を混合し、室温にて3時間撹拌した。反応液をSephadex G−25(PD−10;GEヘルスケア)を用いて精製し、100mmol/Lのリン酸緩衝液(pH7.0)中にて1mgのGE11(7)ペプチドを添加し、室温にて1時間撹拌した。反応液をHPLCにて精製 (カラム:Develosil C8−UG−5,5μm,10×50mm;流速:4.7mL/min;検出:UV260nm;カラムオーブン:35℃;Buffer A:50mmol/L TEAA,5%CH3CN;Buffer B:CH3CN) し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水(大塚製薬)に溶解させた。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度95.12%のKH−0010−GE11(7)を0.3mg得た。質量分析:16877.66 (計算値:16877.74)。精製後のHPLCチャートを図6に示す。
KH−0010−GE11(5)は、前記KH−0010のリンカー領域(Lx)に、後述する方法にてGMBSリンカーを介して前記配列番号14で示すペプチドであるGE11(5)を結合させた一本鎖核酸分子である。
500μmol/LのKH−0010 200μL、4mmol/LのGMBS/DMF溶液 500μL、pH7.0のリン酸緩衝液(最終濃度120mmol/L)を混合し、室温にて3時間撹拌した。反応液をSephadex G−25(PD−10;GEヘルスケア)を用いて精製し、100mmol/Lのリン酸緩衝液(pH7.0)中にて1mgのGE11(5)ペプチドを添加し、室温にて1時間撹拌した。反応液をHPLCにて精製 (カラム:Develosil C8−UG−5,5μm,10×50mm;流速:4.7mL/min;検出:UV260nm;カラムオーブン:35℃;Buffer A:50mmol/L TEAA,5%CH3CN;Buffer B:CH3CN) し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水(大塚製薬)に溶解させた。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度92.12%のKH−0010−GE11(5)を0.6mg得た。質量分析:16657.41(計算値:16657.54)。精製後のHPLCチャートを図7に示す。
KH−0001−GE11は、前記KH−0001のリンカー領域(Lx)に、後述する方法にてGMBSリンカーを介して前記配列番号12で示すペプチドであるGE11を結合させた一本鎖核酸分子である。
500μmol/LのKH−0001 800μL、4mmol/LのGMBS/DMF溶液 2000μL、1mol/Lのリン酸緩衝液 (pH7.0) 480μL、注射用蒸留水720μLを混合し、室温にて3時間撹拌した。反応液をSephadex G−25(PD−10;GEヘルスケア)を用いて精製し、その1/3量を次反応に用いた。100mmol/Lのリン酸緩衝液(pH7.0)中にて1mgのGE11ペプチドを添加し、室温にて1時間撹拌した。反応液をHPLCにて精製 (カラム:Develosil C8−UG−5,5μm,10×50mm;流速:4.7mL/min;検出:UV260nm;カラムオーブン:35℃;Buffer A:50mmol/L TEAA,5%CH3CN;Buffer B:CH3CN) し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水(大塚製薬)に溶解させた。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度96.85%のKH−0001−GE11を1.1mg得た。質量分析:17530.41(計算値:17530.61)。精製後のHPLCチャートを図8に示す。
KH−0001−GE11(7)は、前記KH−0001のリンカー領域(Lx)に、後述する方法にてGMBSリンカーを介して前記配列番号13で示すペプチドであるGE11(7)を結合させた一本鎖核酸分子である。
500μmol/LのKH−0001 800μL、4mmol/LのGMBS/DMF溶液 2000μL、1mol/Lのリン酸緩衝液 (pH7.0) 480μL、注射用蒸留水720μLを混合し、室温にて3時間撹拌した。反応液をSephadex G−25(PD−10;GEヘルスケア)を用いて精製し、その1/3量を次反応に用いた。100mmol/Lのリン酸緩衝液(pH7.0)中にて1mgのGE11(7)ペプチドを添加し、室温にて1時間撹拌した。反応液をHPLCにて精製 (カラム:Develosil C8−UG−5,5μm,10×50mm;流速:4.7mL/min;検出:UV260nm;カラムオーブン:35℃;Buffer A:50mmol/L TEAA,5%CH3CN;Buffer B:CH3CN) し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水(大塚製薬)に溶解させた。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度96.40%のKH−0001−GE11(7)を1.1mg得た。質量分析:16877.65(計算値:16877.74)。精製後のHPLCチャートを図9に示す。
KH−0001−GE11(5)は、前記KH−0001のリンカー領域(Lx)に、後述する方法にてGMBSリンカーを介して前記配列番号14で示すペプチドであるGE11(5)を結合させた一本鎖核酸分子である。
500μmol/LのKH−0001 800μL、4mmol/LのGMBS/DMF溶液 2000μL、1mol/Lのリン酸緩衝液 (pH7.0) 480μL、注射用蒸留水720μLを混合し、室温にて3時間撹拌した。反応液をSephadex G−25(PD−10;GEヘルスケア)を用いて精製し、その1/3量を次反応に用いた。100mmol/Lのリン酸緩衝液(pH7.0)中にて1mgのGE11(5)ペプチドを添加し、室温にて1時間撹拌した。反応液をHPLCにて精製 (カラム:Develosil C8−UG−5,5μm,10×50mm;流速:4.7mL/min;検出:UV260nm;カラムオーブン:35℃;Buffer A:50mmol/L TEAA,5%CH3CN;Buffer B:CH3CN) し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水(大塚製薬)に溶解させた。UV260nmにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度98.09%のKH−0001−GE11(5)を1.1mg得た。質量分析:16657.49(計算値:16657.54)。精製後のHPLCチャートを図10に示す。
TGF−β1遺伝子を標的とする発現抑制配列を有する、前記実施例A1にて合成した脂質コンジュゲート一本鎖核酸分子KH−0001−C18、比較例として、コンジュゲートを持たない一本鎖核酸分子であるPH−0009について、TGF−β1遺伝子発現抑制効果を検討した。
TGF−β1遺伝子用PCRプライマーセット
(配列番号33) 5’-TTGTGCGGCAGTGGTTGAGCCG-3’
(配列番号34) 5’-GAAGCAGGAAAGGCCGGTTCATGC-3’
β−アクチン遺伝子用プライマーセット
(配列番号35) 5’-GCCACGGCTGCTTCCAGCTCCTC-3’
(配列番号36) 5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGTCAC-3’
TGF−β1遺伝子を標的とする発現抑制配列を有する、前記実施例A1にて合成した以下の脂質コンジュゲート一本鎖核酸分子、糖質コンジュゲート一本鎖核酸分子およびペプチドコンジュゲート一本鎖核酸分子について、TGF−β1遺伝子発現抑制効果を検討した。脂質コンジュゲート一本鎖核酸分子としては、KH−0001−C18、KH−0001−DOPE、KH−0001−CholおよびKH−0030、糖質コンジュゲート一本鎖核酸分子としては、KH−0001−Lac、KH−0001−GalNAcおよびKH−0001−GlcNAcならびにペプチドコンジュゲート一本鎖核酸分子としては、KH−0001−GE11、KH−0001−GE11(7)およびKH−0001−GE11(5)を使用した。ネガティブコントロールとしてPH−0000、比較例としてコンジュゲートを持たない一本鎖核酸分子であるKH−0001およびPH−0009を使用した。
前記実施例A1にて合成した、脂質コンジュゲート一本鎖核酸分子KH−0001−C18、比較例として、コンジュゲートを持たない一本鎖核酸分子であるPH−0009、およびリンカー領域Lxがヌクレオチド残基のみからなる一本鎖核酸分子であるNH−0005について、ダイサータンパク質に対する反応性を検討した。
前記実施例A1にて合成した、脂質コンジュゲート一本鎖核酸分子KH−0001−C18、比較例として、コンジュゲートを持たない一本鎖核酸分子であるPH−0009、およびリンカー領域Lxがヌクレオチド残基のみから成る一本鎖核酸分子であるNH−0005について、ヒト血清中での安定性を検討した。
下記スキーム6に従い、リジン(Lys)アミダイトであるDMTr-Lysアミダイト(7)を合成した。なお、下記スキーム6中、「Tfa」は、トリフルオロアセチル基を表す。
6-ヒドロキシヘキサン酸(6g, 15.1mmol)のピリジン溶液(124mL)に4,4’-ジメトキシトリチルクロリド(20g, 1.3eq.)およびジメチルアミノピリジン(0.5g, 0.1eq.)を加え、室温にて20時間撹拌した。反応終了後メタノール(10mL)を加えて10分間撹拌し、溶媒留去した。反応液を酢酸エチルで希釈し、TEAA緩衝液(pH 8-9)で3回洗浄、飽和食塩水で1回洗浄後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、減圧下溶媒留去した。このようにして、薄黄色油状物質である化合物2を31g(ピリジン含有)得た。
化合物3(2.7g, 7.9mmol)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(1.9g, 1.2eq.)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物(2.6g, 2.4eq.)のアセトニトリル溶液(45mL)に、4-アミノ-1-ブタノール(0.86g, 1.2eq.)のアセトニトリル溶液(5mL)を加えて室温で16時間撹拌した。反応終了後沈殿物を濾取し、濾液をエバポレーターにて溶媒留去した。得られた残渣にジクロロメタンを加え、酢酸緩衝液(pH 4)で3回、飽和重曹水で3回洗浄後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、減圧下溶媒留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒:ジクロロメタン/メタノール=10/1)により精製し、白色固体である化合物4を2.8g(収率85%)得た。以下に、化合物4の機器分析値を示す。
1H-NMR(400MHz, CDCl3) δ: 7.07(br, 1H), 6.72(t, J=5.6Hz, 1H), 4.03(m, 1H), 3.66(d, J=4.9Hz, 2H), 3.37(dd, J=12.9, 6.3Hz, 2H), 3.29(dd, J=12.4, 6.3Hz, 2H), 1.83(s, 2H), 1.66-1.60(m, 6H), 1.44(s, 9H), 1.41-1.37(m, 2H)
化合物4(2.5g, 6.1mmol)を塩酸/テトラヒドロフラン溶液(4M, 45mL)中で室温にて2時間撹拌した。反応終了後、減圧下溶媒留去した。得られた残渣をエタノールに溶かし、トルエンを加えて共沸した。溶媒留去後、白色固体である化合物5を1.9g得た。以下に、化合物5の機器分析値を示す。
1H-NMR(400MHz, CD3OD) δ: 3.85-3.81(m, 1H), 3.59-3.56(m, 2H), 3.32-3.20(m, 2H), 1.94-1.80(m, 2H), 1.66-1.58(m, 6H), 1.46-1.40(m, 2H)
化合物2(ピリジン含有, 24g, 35.5mmol)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(8.8g, 1.2eq.)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物(7.2g, 1.5eq.)の溶液(150mL)にトリエチルアミン(4.5mL, 0.9eq.)を加え、さらに化合物5(10g, 0.9eq.)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(30mL)を加えて室温で20時間撹拌した。反応終了後沈殿物を濾取し、濾液をエバポレーターにて溶媒留去した。得られた残渣にジクロロメタンを加え、飽和重曹水で3回洗浄後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、減圧下溶媒留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒:ジクロロメタン/メタノール=20/1+0.05%ピリジン)により精製し、薄黄色固体である化合物6を16g(収率70%)得た。以下に、化合物6の機器分析値を示す。
1H-NMR(400MHz, CDCl3) δ: 7.43-7.40(m, 2H), 7.32-7.26(m, 6H), 7.21-7.17(m, 1H), 6.81(d, J=8.8Hz, 4H), 4.39-4.37(m, 1H), 3.78(s, 6H), 3.64-3.61(m, 2H), 3.33-3.22(m, 4H), 3.03(t, J=6.6Hz, 2H), 2.19(t, J=7.6Hz, 2H), 1.79-1.54(m, 12H), 1.40-1.34(m, 4H)
アセトニトリルにて共沸乾燥した出発物質(1.26g, 1.73mmol)の無水アセトニトリル溶液(3.5mL)に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(394mg, 1.3eq.)、2-シアノエトキシ-N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(700mg, 1.3eq.)を加え、室温にて2.5時間撹拌した。ジクロロメタンを加えて飽和重曹水および飽和食塩水で洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製(アミノシリカ、展開溶媒:n-ヘキサン/酢酸エチル=2/3)し、白色固体である化合物7を1.3g(収率78%)得た。以下に、化合物7の機器分析値を示す。
1H-NMR(400MHz, CDCl3) δ: 7.43-7.41(m, 2H), 7.32-7.17(m, 7H), 6.81(dt, J=9.3, 2.9Hz, 4H), 4.42-4.37(m, 1H), 3.78(s, 6H), 3.88-3.54(m, 6H), 3.32-3.20(m, 4H), 3.03(t, J=6.3Hz, 2H), 2.19(t, J=7.6Hz, 2H), 1.83-1.53(m, 12H), 1.42-1.31(m, 4H), 1.28-1.24(m, 2H), 1.18-1.16(m, 12H)
31P-NMR(162MHz, CDCl3) δ: 146.9
下記スキーム7に従い、グリシン(Gly)アミダイトであるDMTr-Glyアミダイト(化合物12)を合成した。
Fmoc−グリシン(4.00g, 13.45mmol)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(3.33g, 16.15mmol)及び1−ヒドロキシベンゾトリアゾール1水和物(4.94g, 32.29mmol)の無水N,N−ジメチルホルムアミド溶液(100mL)に4−アミノブタノール(1.44g, 16.15mmol)の無水N,N−ジメチルホルムアミド溶液(30mL)を加え、アルゴン雰囲気下、室温で終夜撹拌した。生成した沈殿をろ別し、ろ液を減圧下で濃縮した。得られた残渣にジクロロメタン(200mL)を加え、飽和重曹水で3回洗浄した。更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ(展開溶媒:ジクロロメタン−メタノール(95:5)に付し、N-(4-ヒドロキシブチル)-Nα-Fmoc-グリシンアミド(8)(4.30g, 87%)を得た。以下に、N-(4-ヒドロキシブチル)-Nα-Fmoc-グリシンアミド(8)の機器分析値を示す。
1H−NMR(400MHz, CDCl3):δ=7.78−7.76(2H,d,J=7.3Hz),7.65−7.63(2H,d,J=7.3Hz),7.42−7.41(2H,t,J=7.6Hz),7.34−7.30(2H,td,J=7.6,1.1Hz),4.42−4.40(2H,d,J=7.3Hz),4.25−4.22(1H,t,J=6.8Hz),3.83(2H,s),3.60−3.55(2H,m),3.30−3.25(2H,m),1.61−1.55(4H,m).
化合物8(4.20g, 11.40mmol)に対し無水ピリジンを用いて3回共沸乾燥した。その共沸残渣に4,4’−ジメトキシトリチルクロリド(5.80g, 17.10mmol)及び無水ピリジン(80mL)を加え、室温下で終夜撹拌した。得られた反応混合物にメタノール(20mL)を加え室温で30分撹拌した後、減圧下で溶媒を留去した。その後、ジクロロメタン(200mL)を加え、飽和重曹水で3回洗浄し、更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。未精製のN-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-Nα-Fmoc-グリシンアミド(9)(11.40g)を得た。
未精製の化合物9(11.40g, 16.99mmol)にN,N−ジメチルホルムアミド(45mL)及びピペリジン(11.7mL)を室温で加え、室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下で溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ(展開溶媒:ジクロロメタン−メタノール(9:1)+0.05%ピリジン)に付し、グリシン−4,4’−ジメトキシトリチルオキシブタンアミド(3)(4.90g, 96%、 2steps)を得た。以下に、N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-グリシンアミド(10)の機器分析値を示す。
1H−NMR(400MHz,CDCl3):δ=7.44−7.42(2H,m),7.33−7.26(6H,m),7.21−7.20(1H,m),6.83−6.80(4H,m),3.79(6H,s), 3.49(2H,s),3.30−3.28(2H,t,J=6.3Hz),3.09−3.06(2H,t,J=5.9Hz),1.61−1.55(4H,m).
化合物10(4.80g, 10.70mmol)を無水ピリジンで3回共沸乾燥後、アルゴン雰囲気下で6−ヒドロキシヘキサン酸(1.70g, 12.84mmol)、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(2.46g, 12.84mmol)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール1水和物(3.93g, 25.69mmol)、及び無水ジクロロメタン(60mL)を室温で加え、10分間撹拌した。このようにして得た混合物にトリエチルアミン(3.90g, 38.53mmol)を加え、アルゴン雰囲気下、室温で終夜撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン(200mL)を加え飽和重曹水で3回、更に飽和食塩水で1回洗浄した。有機層を分取し硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ(展開溶媒:ジクロロメタン−メタノール(95:5)+0.05%ピリジン)に付し、N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-Nα-(6-ヒドロキシヘキサノイル)-グリシンアミド(11)(4.80g, 80%)を得た。以下に、N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-Nα-(6-ヒドロキシヘキサノイル)-グリシンアミド(11)の機器分析値を示す。
1H−NMR(400MHz,CDCl3):δ=7.43−7.40(2H,m),7.33−7.26(6H,m),7.22−7.20(1H,m),6.83−6.80(4H,m),3.85(2H,s),3.78(6H,s),3.63−3.60(2H,t,J=6.3Hz),3.26−3.23(2H,t,J=6.1Hz),3.07−3.05(2H,t,J=5.6Hz),2.26−2.22(2H,t,J=7.3Hz),1.68−1.52(8H,m),1.41−1.36(2H,m).
化合物11(4.70g, 8.35mmol)を無水ピリジンで3回共沸乾燥した。つぎに、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(1.72g, 10.02mmol)を加え、減圧下で脱気してアルゴンガスを充填し、無水アセトニトリル(5mL)を加えた。さらに、2−シアノエトキシ−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト(3.02g, 10.02mmol)の無水アセトニトリルジクロロメタン混合溶液(1:1)(4mL)を加え、混合物をアルゴン雰囲気下、室温で4時間撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン(150mL)を加え、飽和重曹水で2回、更に飽和食塩水で1回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。アミノシリカを用いたカラムクロマトグラフ(展開溶媒:n−ヘキサン−アセトン(3:2)+0.1%トリエチルアミン)に残渣を付し、ヒドロキシヘキサン酸アミドグリシン−4,4’−ジメトキシトリチルオキシブタンアミドホスホロアミダイト(12)(4.50g, 71%, HPLC98.2%)を得た。以下に、N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-Nα-(6-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスフィチル)-ヒドロキシヘキサノイル)-グリシンアミド(12)の機器分析値を示す。
1H−NMR(400MHz,CDCl3):δ=7.43−7.40(2H,m),7.33−7.26(6H,m),7.22−7.20(1H,m),6.83−6.80(4H,m),3.85−3.81(4H,s),3.78(6H,s),3.63−3.61(2H,t,J=6.3Hz),3.26−3.23(2H,t,J=6.1Hz),3.05−2.97(4H,m),2.64−2.62(2H,t,J=6.4Hz),2.25−2.23(2H,t,J=7.3Hz),1.68−1.52(8H,m),1.40−1.38(2H,m),1.13−1.20(12H,m).
31P−NMR(162MHz,CDCl3): δ=146.57.
下記スキーム8に従い、プロリン骨格を含むアミダイトである化合物17を製造した。
化合物13(Fmoc−L−プロリン)を出発原料とした。前記化合物13(10.00g、29.64mmol)、4−アミノ−1−ブタノール(3.18g、35.56mmol)および1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(10.90g、70.72mmol)を混合し、前記混合物に対し、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に、無水アセトニトリル(140mL)を室温で加え、さらに、ジシクロヘキシルカルボジイミド(7.34g、35.56mmol)の無水アセトニトリル溶液(70mL)を添加した後、アルゴン雰囲気下、室温で15時間撹拌した。反応終了後、生成した沈殿をろ別し、回収したろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣にジクロロメタン(200mL)を加え、飽和重曹水(200mL)で洗浄した。そして、有機層を回収し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去し、その残渣にジエチルエーテル(200mL)を加え、粉末化した。生じた粉末を濾取することにより、無色粉末状の化合物14(10.34g、収率84%)を得た。以下に、前記化合物14の機器分析値を示す。
1H−NMR(CDCl3): δ7.76−7.83(m,2H,Ar−H)、7.50−7.63(m,2H,Ar−H)、7.38−7.43 (m,2H,Ar−H)、7.28−7.33(m,2H,Ar−H),4.40−4.46(m,1H,CH),4.15−4.31(m,2H,CH2),3.67−3.73(m,2H,CH2)、3.35−3.52(m,2H,CH2)、3.18−3.30(m,2H,CH2)、2.20−2.50(m,4H)、1.81−2.03(m,3H)、1.47−1.54(m,2H);
Ms(FAB+): m/z409(M+H+).
N-(4-ヒドロキシブチル)-Nα-Fmoc-L-プロリンアミド(化合物14)(7.80g、19.09mmol)を無水ピリジン(5mL)と混合し、室温で2回共沸乾燥した。得られた残留物に、4,4’−ジメトキシトリチルクロリド(8.20g、24.20mmol)、DMAP(23mg、0.19mmol)および無水ピリジン(39mL)を加えた。この混合物を、室温で1時間撹拌した後、メタノール(7.8mL)を加え、室温で30分撹拌した。この混合物を、ジクロロメタン(100mL)で希釈し、飽和重曹水(150mL)で洗浄後、有機層を分離した。前記有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた未精製の残渣に、無水ジメチルホルムアミド(39mL)およびピペリジン(18.7mL、189mmol)を加え、室温で1時間撹拌した。反応終了後、前記混合液について、減圧下、室温で、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(商品名Wakogel C−300、展開溶媒 CH2Cl2:CH3OH=9:1、0.05%ピリジン含有)に供し、淡黄色油状の化合物15(9.11g、収率98%)を得た。以下に、前記化合物15の機器分析値を示す。
1H−NMR (CDCl3): δ7.39−7.43(m,2H,Ar−H)、7.30(d,J=8.8Hz,4H,Ar−H)、7,21(tt,1H,4.9,1.3Hz,Ar−H)、6.81(d,J=8.8Hz,4H,Ar−H)、3.78(s,6H,OCH3)、3.71(dd,H,J=6.3Hz,5.4Hz,CH)、3.21(2H,12.9,6.3Hz,2H,CH2)、3.05(t,J=6.3Hz,2H,CH2)、2.85−2.91(m,2H,CH2)、2.08−2.17(m,1H,CH)、1.85−2.00(m,3H)、1.55−1.65(m,5H);
Ms(FAB+); m/z 489(M+H+)、303(DMTr+).
得られた前記N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-L-プロリンアミド(化合物15)(6.01g、12.28mmol)、EDC(2.83g、14.74mmol)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(3.98g、29.47mmol)およびトリエチルアミン(4.47g、44.21mmol)の無水ジクロロメタン溶液(120mL)を混合した。この混合液に、さらに、アルゴン雰囲気下、室温で、6−ヒドロキシヘキサン酸(1.95g、14.47mmol)を加え、その後、アルゴン雰囲気下、室温で、1時間撹拌した。前記混合液をジクロロメタン(600mL)で希釈し、飽和食塩水(800mL)で3回洗浄した。有機層を回収し、前記有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。これにより、淡黄色泡状の前記化合物16(6.29g、収率85%)を得た。以下に、前記化合物16の機器分析値を示す。
1H−NMR (CDCl3): δ7.41−7.43(m,2H,Ar−H)、7.27−7.31(m,4H,Ar−H)、7.19−7.26(m,2H,Ar−H)、7.17−7.21(m,1H,Ar−H)、6.79−6.82(m,4H,Ar−H)、4.51−4.53(m,1H,CH)、3.79(s,6H,OCH3)、3.61(t,2H,J=6.4Hz,CH2)、3.50−3.55(m,1H,CH)、3.36−3.43(m,1H,CH),3.15−3.24(m,2H,CH2),3.04(t,J=6.3Hz,2H,CH2)、2.38−2.45(m,1H,CH)、2.31(t,6.8Hz,2H,CH2)、2.05−2.20(m,1H,CH)、1.92−2.00(m,1H,CH)、1.75−1.83(m,1H,CH)、1.48−1.71(m,8H)、1.35−1.44(m,2H,CH2);
Ms(FAB+): m/z 602(M+)、303(DMTr+).
得られた前記N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-Nα-(6-ヒドロキシヘキサノイル)-L-プロリンアミド(化合物16)(8.55g、14.18mmol)を無水アセトニトリルと混合し、室温で3回共沸乾燥した。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(2.91g、17.02mmol)を加え、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に対し、無水アセトニトリル(10mL)を加え、さらに、2−シアノエトキシ−N,N,N’,N’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト(5.13g、17.02mmol)の無水アセトニトリル溶液(7mL)を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で2時間撹拌した。そして、前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水(200mL)で3回洗浄した後、飽和食塩水(200mL)で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られた前記ろ液について、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー(展開溶媒 ヘキサン:酢酸エチル=1:3、0.05%ピリジン含有)に供し、無色シロップ状の化合物17(10.25g、純度92%、収率83%)を得た。以下に、前記化合物17の機器分析値を示す。
1H−NMR(CDCl3): δ7.40−7.42(m,2H,Ar−H)、7.29−7.31(m,4H,Ar−H)、7.25−7.27(m,2H, Ar−H)、7.17−7.21(m,1H,Ar−H)、6.80−6.82(m,4H,Ar−H)、4.51−4.53(m,1H,CH)、3.75−3.93(m,4H)、3.79(s,6H,OCH3)、3.45−3.60(m,4H)、3.35−3.45(m,1H,CH)、3.20−3.29(m,1H)、3.04(t,J=6.4Hz,2H,CH2)、2.62(t,J=5.8Hz,2H,CH2)、2.40−2.44(m,1H,CH)、2.31(t,7.8Hz,2H,CH2)、2.03−2.19(m,1H,CH)、1.92−2.02(m,1H,CH)、1.70−1.83(m,1H,CH)、1.51−1.71(m,8H)、1.35−1.44(m,2H,CH2)、1.18(d,J=6.8Hz,6H,CH3)、1.16(d,J=6.8Hz,6H,CH3);
31P−NMR(CDCl3): δ147.17;
Ms(FAB+): m/z 802(M+)、303(DMTr+),201(C8H19N2OP+).
下記スキームに従い、リジン−コレステロールアミダイトである化合物11を製造した。
コレステロール(化合物1)(8.0 g, 20 mmol)のピリジン溶液(200 mL)にN,N-カルボニルジイミダゾール(6.6 g, 2.0 eq.)を加え、室温にて4時間撹拌した。エバポレーターにて溶媒留去、ジクロロメタンを加えて溶液を希釈した。この溶液を5%リン酸二水素ナトリウム水溶液で洗浄し、その後飽和食塩水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒留去した。減圧乾燥し、白色固体物質を9.8 g(収率 98 %)得た。以下に、化合物(2)の機器分析値を示す。
共沸乾燥した6-ヒドロキシヘキサン酸(化合物3)(3.0 g, 23 mmol)と4-ジメチルアミノピリジン(DMAP) (0.28 g, 0.1 eq.)のピリジン溶液 (75 mL) に4,4-ジメトキシトリチルクロリド(DMTrCl) (7.8 g, 1.0 eq.) を加えて室温にて5時間撹拌した。TLCにて原料の消失を確認後、メタノールを加えて30分撹拌した。エバポレーターにて溶媒留去、ジクロロメタンを加えて溶液を希釈した。この溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄、飽和食塩水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒留去した。ヘキサンを用いてトリチレーションを行った。減圧乾燥し、油状物質を7.8 g得た。
N-α-(t-ブトキシカルボニル)-N-ε-トリフルオロアセチル-L-リジン(化合物5)(8.0 g, 24 mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(160 mL)に4-アミノ-1-ブタノール (2.4 g, 1.2 eq.)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物(HOBt) (8.6 g, 2.4 eq.)を加え、0℃で撹拌した。1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC) (5.4 g, 1.2 eq.)を加え30分撹拌した。その後室温で一晩撹拌した。反応溶液をエバポレーターにて溶媒留去した。得られた残渣にジクロロメタンを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、飽和食塩水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥、減圧下溶媒留去した。ヘキサンで洗浄後、沈殿物をろ別して減圧乾燥させた。固体物質を7.0 g(収率 73 %)得た。以下に、化合物(6)の機器分析値を示す。
化合物6(3.0 g, 7.2 mmol)のメタノール溶液(30 mL)に、アンモニア水 (26.5 mL, 50eq.) を加えて室温で1日撹拌した。さらにアンモニア水 (26.5 mL, 50eq.) を加えて40℃で7時間撹拌した。反応終了後、減圧下溶媒留去した。減圧乾燥して油状物質を2.3 g得た。以下に、化合物(7)の機器分析値を示す。
化合物7(2.3 g, 7.3 mmol)のピリジン溶液(100 mL)に、化合物2 (14 g, 4.0 eq.)と4-ジメチルアミノピリジン(DMAP)(0.27 g, 0.3 eq.)を加えて、40℃で5日間撹拌した。エバポレーターにて溶媒留去、ジクロロメタンを加えて溶液を希釈した。この溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄、飽和食塩水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ(展開溶媒 ジクロロメタン:メタノール=20:1)に付し、固体物質を3.5 g(収率 67 %)得た。以下に、化合物(8)の機器分析値を示す。
ESI-MS: m/z 730.59 [M+H]+, 752.57 [M+Na]+, 1460.19 [2M+H]+, 1482.16 [2M+Na]+
化合物8(3.4 g, 4.7 mmol)を2M-塩酸/メタノール溶液(150 mL)に加え、室温で3時間撹拌した。反応終了後、減圧下溶媒留去した。ヘキサンを用いてトリチレーションを行った。減圧乾燥し、固体物質を2.7 g(収率 93 %)得た。以下に、化合物(9)の機器分析値を示す。
化合物9(2.5 g, 4.0 mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(90 mL)に化合物4 (2.6 g, 1.5 eq.)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物(HOBt) (1.8 g, 3.0 eq.)、トリエチルアミン(1.2 g, 3.0 eq.)を加え、0℃で撹拌した。1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC) (1.1 g, 1.5 eq.)を加え30分撹拌した。その後室温で一晩撹拌した。反応溶液をエバポレーターにて溶媒留去した。得られた残渣にジクロロメタンを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、飽和食塩水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥、減圧下溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ(展開溶媒 酢酸エチル+0.05% ピリジン→酢酸エチル:メタノール(30:1)+0.05% ピリジン)に付し、固体物質を2.0 g(収率 50 %)得た。以下に、化合物(10)の機器分析値を示す。
ESI-MS:m/z 1068.72 [M+Na]+, 1084.71 [M+K]+
共沸乾燥した化合物10 (2.3 g, 2.2 mmol) のジクロロメタン溶液 (8 mL) に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(DIPAT) (0.45 g, 1.2 eq.)を加えた。2-シアノエトキシ-N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト (0.80 g, 1.2 eq.) のジクロロメタン溶液 (2 mL)を加え、40℃にて3時間撹拌した。ジクロロメタンにて希釈し飽和重曹水および飽和食塩水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒留去した。アミノシリカを用いたカラムクロマトグラフ(展開溶媒 n-ヘキサン:酢酸エチル(1:2)+0.1 %トリエチルアミン)に残渣を付し、固体物質を2.2 g(収率81%)得た。以下に、化合物(11)の機器分析値を示す。
31P-NMR (202 MHz, CDCl3) : δ=148.074, 147.913
ESI-MS:m/z 1268.85 [M+Na]+, 1284.82 [M+K]+
下記スキーム9に従い、ミリスチン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル(C14-NHS)、パルミチン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル(C16-NHS)またはステアリン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル(C18-NHS)を、それぞれ合成した。また、下記スキーム10に従い、オレイン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル(C18:1-NHS)を合成した。
ミリスチン酸(1.5g, 6.6mmol)をジクロロメタン(30mL)に溶解させ撹拌した。この溶液にN-ヒドロキシコハク酸イミド(0.91g, 1.2eq.)と1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)(1.5g, 1.2eq.)を加え、一晩撹拌した。水で2回洗浄後、飽和食塩水で1回洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥して、減圧下溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン=1/3)により精製し、目的物を1.4g(収率67%)得た。以下に、得られたミリスチン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル(C14-NHS)のNMR測定結果を示す。
1H−NMR(CDCl3) δ: 2.83(4H, s), 2.60(2H, t, J=7.6Hz), 1.74(2H, q, J=7.6Hz), 1.44(2H, q, J=6.9Hz), 1.48−1.22(18H, m), 0.88(3H, t, J=6.8Hz).
パルミチン酸(6.0g, 23mmol)をジクロロメタン(110mL)に溶解させ撹拌した。この溶液にN-ヒドロキシコハク酸イミド(3.2g, 1.2eq.)と1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)(5.4g, 1.2eq.)を加え、一晩撹拌した。水で2回洗浄後、飽和食塩水で1回洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥して、減圧下溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン=1/2)により精製し、目的物を7.8g(収率94%)得た。以下に、得られたパルミチン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル(C16-NHS)のNMR測定結果を示す。
1H−NMR(CDCl3) δ: 2.84(4H, s), 2.60(2H, t, J=7.6Hz), 1.74(2H, q, J=7.6Hz), 1.38(2H, q, J=6.9Hz), 1.43−1.20(m, 22H), 0.88(3H, t, J=6.8Hz).
ステアリン酸(3.0g, 11mmol)をジクロロメタン(100mL)に溶解させ撹拌した。この溶液にN-ヒドロキシコハク酸イミド(1.5g, 1.2eq.)と1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)(2.4g, 1.2eq.)を加え、2日間撹拌した。水で2回洗浄後、飽和食塩水で1回洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥して、減圧下溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン=1/3)により精製し、目的物を2.8g(収率70%)得た。以下に、得られたステアリン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル(C18-NHS)のNMR測定結果を示す。
1H−NMR(CDCl3) δ: 2.84(4H, m), 2.60(2H, t, J=7.6Hz), 1.74(2H, q, J=7.6Hz), 1.38(2H, q, J=6.9Hz), 1.43−1.20(m, 26H), 0.88(3H, t, J=6.8Hz).
オレイン酸(4.0g, 14mmol)をジクロロメタン(70mL)に溶解させ撹拌した。この溶液にN-ヒドロキシコハク酸イミド(2.0g, 1.2eq.)と1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)(3.3g, 1.2eq.)を加え、一晩撹拌した。水で2回洗浄後、飽和食塩水で1回洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥して、減圧下溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン=1/3)により精製し、目的物を5.2g(収率97%)得た。以下に、得られたオレイン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル(C18:1-NHS)のNMR測定結果を示す。
1H−NMR(CDCl3) δ: 5.35(2H, m), 2.83(4H, s), 2.60(2H, t, J=7.6Hz), 2.01(4H, m), 1.75(2H, q, J=7.6Hz), 1.41−1.27(20H, m), 0.88(3H, t, J=6.8Hz).
本出願は、日本でされた特願2015−065570(出願日:2015年3月27日)を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
Claims (41)
- 領域(X)、リンカー領域(Lx)および領域(Xc)からなり、
前記領域(X)が、前記領域(Xc)と相補的であり、
前記領域(X)および前記領域(Xc)の少なくとも一方が、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む、標的遺伝子の発現抑制用一本鎖核酸分子であって、
該標的遺伝子の発現抑制用一本鎖核酸分子の5’末端、3’末端、および前記リンカー領域(Lx)からなる群から選択される少なくとも1つに、デリバリー機能を有する生体関連物質が結合していることを特徴とする、標的遺伝子の発現抑制用一本鎖核酸分子。 - 前記生体関連物質が、脂質、ペプチド、糖質からなる群から選択される少なくとも一つである請求項1記載の一本鎖核酸分子。
- 前記生体関連物質が、脂質である、請求項1記載の一本鎖核酸分子。
- 前記脂質が、単純脂質、複合脂質、誘導脂質、一本鎖脂質、二本鎖脂質、糖脂質、脂溶性ビタミン、ステロイドである、請求項3記載の一本鎖核酸分子。
- 前記脂質が、パルミチン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、DOPEおよびコレステロールからなる群から選択される少なくとも一つである請求項3記載の一本鎖核酸分子。
- 前記生体関連物質が、ペプチドである、請求項1記載の一本鎖核酸分子。
- 前記ペプチドが、抗体に由来するペプチド、膜透過性ペプチド、特定の受容体に作用するペプチドおよび特定のタンパク質に相互作用するペプチドからなる群から選択される少なくとも1つである、請求項6記載の一本鎖核酸分子。
- 前記ペプチドが、配列番号1〜28のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する、請求項6または7記載の一本鎖核酸分子。
- 前記生体関連物質が、糖質である、請求項1記載の一本鎖核酸分子。
- 前記糖質が、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖からなる群から選択される少なくとも1つである、請求項9記載の一本鎖核酸分子。
- 前記リンカー領域(Lx)が、下記式(I)を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
前記式(I)中、
X1およびX2は、それぞれ独立して、H2、O、SまたはNHであり;
Y1およびY2は、それぞれ独立して、単結合、CH2、NH、OまたはSであり;
L1は、n個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、もしくはSRaで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L1は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y1が、NH、OまたはSの場合、Y1に結合するL1の原子は炭素であり、OR1に結合するL1の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
L2は、m個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SHもしくはSRcで置換されても置換されていなくてもよく、または、
L2は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Y2が、NH、OまたはSの場合、Y2に結合するL2の原子は炭素であり、OR2に結合するL2の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず;
Ra、Rb、RcおよびRdは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり;
mは、0〜30の範囲の整数であり;
nは、0〜30の範囲の整数であり;
前記領域(Xc)および前記領域(X)は、それぞれ、−OR1−または−OR2−を介して、前記リンカー領域(Lx)に結合し、
ここで、R1およびR2は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、R1およびR2は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造(I)であり、
Aは、任意の原子団であり、ただし、下記式(Ia)は、前記アミノ酸であり、かつ、下記式(Ia)は、ペプチド以外のアミノ酸である。
- 前記式(I)中、
Aが、鎖式原子団、脂環式原子団、および芳香族性原子団からなる群から選択される少なくとも一つを含み、前記各原子団は、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い、請求項11記載の一本鎖核酸分子。 - 前記アミノ酸が、天然アミノ酸または人工アミノ酸である請求項12に記載の一本鎖核酸分子。
- 前記アミノ酸が、グリシン、α−アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、ヒドロキシリジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、チロシン、バリン、トリプトファン、β−アラニン、1−アミノ−2−カルボキシシクロペンタン、またはアミノ安息香酸であり、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い、請求項12に記載の一本鎖核酸分子。
- 前記式(I)の構造が、下記式(I−1)〜(I−4)のいずれかひとつであり、下記式においてnおよびmは前述と同じである、請求項11から14のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
- 前記式(I−1)が、下記式(I−1a)または下記式(I−1b)であり、前記式(I−4)が、下記式(I−4a)である、請求項15記載の一本鎖核酸分子。
- 前記リンカー領域(Lx)が、下記式を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
- 前記領域(X)の塩基数(X)および前記領域(Xc)の塩基数(Xc)が、下記式(1)または式(2)の条件を満たす、請求項1から17のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
X>Xc ・・・(1)
X=Xc ・・・(2) - 前記領域(X)の塩基数(X)および前記領域(Xc)の塩基数(Xc)が、下記式(3)の条件を満たす、請求項18記載の一本鎖核酸分子。
X−Xc=1、2または3 ・・・(3) - 前記領域(Xc)の塩基数(Xc)が、19塩基〜30塩基である、請求項18または19に記載の一本鎖核酸分子。
- RNA分子である、請求項18から20のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
- 前記一本鎖核酸分子において、塩基数の合計が、38塩基以上である、請求項18から21のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
- 少なくとも1つの修飾された残基を含む、請求項1から22のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
- 安定同位体を含む、請求項1から23のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
- 前記リンカー領域(Lx)が、
ヌクレオチド残基および非ヌクレオチド残基の少なくとも一つから構成される、請求項1から24のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。 - 前記ヌクレオチド残基が、非修飾ヌクレオチド残基および/または修飾ヌクレオチド残基である、請求項25記載の一本鎖核酸分子。
- 前記リンカー領域(Lx)が、下記(1)〜(7)のいずれかの残基で構成される、請求項25または26記載の一本鎖核酸分子。
(1)非修飾ヌクレオチド残基
(2)修飾ヌクレオチド残基
(3)非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
(4)非ヌクレオチド残基
(5)非ヌクレオチド残基および非修飾ヌクレオチド残基
(6)非ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
(7)非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基 - 前記発現抑制配列が、成熟miRNA配列である、請求項1から27のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
- 前記一本鎖核酸分子が、配列番号29または31である、請求項1から27のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
- 標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、
請求項1から29のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を含むことを特徴とする、発現抑制用組成物。 - 請求項1から29のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を含むことを特徴とする、薬学的組成物。
- 炎症治療用である、請求項31記載の薬学的組成物。
- 標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
請求項1から29のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を使用することを特徴とする発現抑制方法。 - 前記一本鎖核酸分子を、細胞、組織または器官に投与する工程を含む、請求項33記載の発現抑制方法。
- 前記一本鎖核酸分子を、in vivoまたはin vitroで投与する、請求項34記載の発現抑制方法。
- 前記遺伝子の発現抑制が、RNA干渉による発現抑制である、請求項33から35のいずれか一項に記載の発現抑制方法。
- 標的遺伝子の発現を抑制するRNA干渉を誘導する方法であって、
請求項1から29のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を使用することを特徴とする発現誘導方法。 - 疾患の治療方法であって、
請求項1から29のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を、患者に投与する工程を含み、
前記一本鎖核酸分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする治療方法。 - 標的遺伝子の発現抑制のための、請求項1から29のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子の使用。
- RNA干渉の誘導のための、請求項1から29のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子の使用。
- 疾患の治療に使用するための核酸分子であって、
前記核酸分子は、請求項1から29のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子であり、
前記一本鎖核酸分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする核酸分子。
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