JPWO2014157485A1

JPWO2014157485A1 - 抗老化作用を有するペプチドおよびその利用

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Publication number: JPWO2014157485A1
Application number: JP2015508680A
Authority: JP
Inventors: 啓徳中神; 森下　竜一; 竜一森下; 英樹冨岡; 昭子天満
Original assignee: Osaka University NUC
Current assignee: Osaka University NUC
Priority date: 2013-03-29
Filing date: 2014-03-27
Publication date: 2017-02-16
Anticipated expiration: 2034-03-27
Also published as: WO2014157485A1; JP6319911B2; US20160101032A1; US20180110713A1; HK1222399A1; EP3000824A4; US10463592B2; EP3000824A1; US9872825B2; EP3000824B1

Abstract

本発明は、抗老化作用を有する短鎖ペプチドを見出し、当該ペプチドを有効成分として含有する新規な抗老化剤を提供することを課題とする。線維芽細胞増殖促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用およびコラーゲンゲル収縮作用からなる群から選択される１種以上の作用を有し、ＥＬＫＬＩＦＬＨＲＬＫＲＬＲＫＲＬＫＲＫ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列、またはその部分配列からなるペプチドもしくはその誘導体またはその塩は、抗老化剤の有効成分として有用であることを見出した。

Description

本発明は、抗老化作用を有するペプチドおよびその利用に関するものであり、詳細には線維芽細胞増殖促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用またはコラーゲンゲル収縮作用を有するペプチドを含有する抗老化剤およびその利用に関するものである。

皮膚を構成する真皮は主に線維芽細胞およびマトリックス成分からなっている。線維芽細胞はコラーゲンなどのタンパク質およびヒアルロン酸などのグリコサミノグリカンを産生して、結合組織を形成し、皮膚に重要な役割を果たしている。そのため加齢等により線維芽細胞の機能が低下すると、コラーゲンやヒアルロン酸などが減少、変性し、さらに紫外線等により酸化ストレスを受けることで肌が荒れるなどのダメージを受けて、皮膚が老化し、シワ、しみ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下などが起こることになる。

このような皮膚の老化を防止することを目的として、従来、コラーゲンやヒアルロン酸の機能に着目して、ニワトリのトサカなどに含まれるヒアルロン酸が抗老化剤に配合されている。しかし、ヒアルロン酸は高分子であるため、それを配合した化粧料を皮膚に直接塗布しても吸収されにくいという問題がある。また、皮膚にコラーゲンを注入する方法が採用されているが、注入されたコラーゲンは皮膚から速やかに消失してしまう。また、本人の幹細胞から得た線維芽細胞を皮膚に移植する治療も試みられているが、移植された線維芽細胞は定着し難い。

そこで、近年、真皮中の線維芽細胞の増殖を促進することで、細胞自らのコラーゲンやヒアルロン酸産生を促進することができる天然成分の探索が盛んに行われている。このような天然成分としては、クロレラ水抽出物、アロエベラ抽出物、ウチワサボテン抽出物、キョウニン抽出物、パッションフラワー抽出物などの植物成分が多く報告されている。

一方、２０個以下のアミノ酸残基からなるペプチドは、ペプチドのデザインが簡単で高効率な合成法や検定法が確立されているため、安いコストで量産が可能といった利点を有している。医薬品成分として利用する場合、抗原性の観点から副作用が起こりにくい。医薬部外品または化粧品等の一成分としての実用化が極めて近い。また、天然型のアミノ酸を用いていることから安全性の面でも刺激性や感作性はなく、代謝が容易であり、開発を進める上で障害となるものはない。
それゆえ、線維芽細胞増殖作用等の種々の生理活性機能を有するペプチドの発見、開発が期待されている。

従来から、皮膚に対してペプチド類を使用して、皮膚の状態を向上させる試みがなされている。例えば、特許文献１には、成分（Ａ）アミノ酸が３個から８個で構成される合成ペプチドまたはその誘導体と、成分（Ｂ）分子量が５００から５０００の範囲にある加水分解コラーゲンまたはその誘導体とを含有する抗老化用皮膚外用剤および抗老化用化粧料が開示されている。しかし、特許文献１にはペプチド単独を有効成分として含有する抗老化用皮膚外用剤および抗老化用化粧料は開示されていない。

特開２０１１−４２６１３号公報

本発明は、抗老化作用を有する短鎖ペプチドを見出し、当該ペプチドを有効成分として含有する新規な抗老化剤を提供することを課題とする。

本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
〔１〕線維芽細胞増殖促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用およびコラーゲンゲル収縮作用からなる群から選択される１種以上の作用を有し、ＥＬＫＬＩＦＬＨＲＬＫＲＬＲＫＲＬＫＲＫ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列、またはその部分配列からなるペプチドもしくはその誘導体またはその塩。
〔２〕ＫＬＩＦＬＨＲＬＫＲＬＲＫＲＬＫ（配列番号２０）で示されるアミノ酸配列、またはその部分配列からなる前記〔１〕に記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩。
〔３〕部分配列が、ＫＬＩＦＬ（配列番号４）、ＩＦＬＨＲ（配列番号６）、ＬＨＲＬＫ（配列番号８）、ＨＲＬＫＲ（配列番号９）、ＲＬＫＲＬ（配列番号１０）、ＬＫＲＬＲ（配列番号１１）およびＬＲＫＲＬ（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする前記〔１〕または〔２〕に記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩。
〔４〕部分配列が、ＬＫＲ（配列番号１９）を含むことを特徴とする前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩。
〔５〕部分配列が、ＨＲＬＫＲ（配列番号９）、ＲＬＫＲＬ（配列番号１０）またはＬＫＲＬＲ（配列番号１１）である前記〔４〕に記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩。
〔６〕Ｃ末端がアミド化されている前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩。
〔７〕Ｎ末端がアセチル化されている前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩。
〔８〕前記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩を有効成分として含有する抗老化剤。
〔９〕前記〔８〕に記載の抗老化剤を含む化粧品。
〔１０〕前記〔８〕に記載の抗老化剤を含む医薬部外品。
〔１１〕前記〔８〕に記載の抗老化剤を含む医薬品。
〔１２〕前記〔８〕に記載の抗老化剤を含む飲食品。
〔１３〕前記〔８〕に記載の抗老化剤を含むサプリメント。

本発明により、抗老化作用を有する短鎖ペプチド、および当該ペプチドを有効成分として含有する新規な抗老化剤を提供することができる。本発明の抗老化剤は、線維芽細胞増殖作用、ヒアルロン酸合成促進作用およびコラーゲンゲル収縮作用を有するので、化粧品、医薬部外品、医薬品、飲食品、サプリメントの成分として有用である。さらに、有効成分であるアミノ酸残基数が２０以下の短鎖ペプチドは、高効率な合成法や検定法が確立されているため、安いコストで量産が可能という利点を有している。医薬品成分として利用する場合、抗原性の観点から副作用が起こりにくいという利点も有している。

コラーゲンゲル収縮作用を検討した結果を示す図である。ｈ−ＣＬＡＴ法による感作試験においてＣＤ８６発現量を測定した結果を示す図である。ｈ−ＣＬＡＴ法による感作試験においてＣＤ５４発現量を測定した結果を示す図である。配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるペプチド（ＯＳＫ−９）

本発明者らは、以前に血管新生作用と抗菌作用を併せ持つペプチドとして、３０アミノ酸残基からなるＡＧ３０（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，２００８；１３：５３５−４６）を見出し、これに変更を加えて血管新生作用および抗菌作用の改良を行ってきた（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌ１６，Ｎｏ７，２０１２，ｐｐ．１６２９−１６３９、ＷＯ２０１０／０６１９１５、ＷＯ２０１０／１０１２３７、ＷＯ２０１０／１３７５９４、特開２０１２−１４５８３）。本発明者らは、ＡＧ３０をさらに変更することにより抗老化作用を有する２０アミノ酸残基からなるペプチドを見出し、さらにそのフラグメントが抗老化作用を有することを見出し、本発明を完成させた。

〔ペプチド〕
本発明は、線維芽細胞増殖促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用およびコラーゲンゲル収縮作用からなる群から選択される１種以上の作用を有するペプチドもしくはその誘導体またはその塩（以下、これらを単に「本発明のペプチド」ともいう。）を提供する。本発明のペプチドは、ＥＬＫＬＩＦＬＨＲＬＫＲＬＲＫＲＬＫＲＫ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列からなるペプチド、または、配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分配列からなり、線維芽細胞増殖促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用およびコラーゲンゲル収縮作用からなる群から選択される１種以上の作用を有するペプチドであればよい。

配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分配列は、３アミノ酸以上の部分配列であることが好ましく、４アミノ酸以上の部分配列であることがより好ましく、５アミノ酸以上の部分配列であることがさらに好ましい。具体的には、配列番号１で表されるアミノ酸配列の中から任意に選ばれる３〜１９個の連続するアミノ酸からなる部分配列であることが好ましく、より好ましくは４〜１６個の連続するアミノ酸からなる部分配列であり、さらに好ましくは４〜１０個の連続するアミノ酸からなる部分配列であり、特に好ましくは５個の連続するアミノ酸からなる部分配列である。

配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分配列は、ＫＬＩＦＬＨＲＬＫＲＬＲＫＲＬＫ（配列番号２０）で示されるアミノ酸配列からなるペプチド、または、配列番号２０で示されるアミノ酸配列の部分配列からなり、線維芽細胞増殖促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用およびコラーゲンゲル収縮作用からなる群から選択される１種以上の作用を有するペプチドであることが好ましい。

配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分配列、または、配列番号２０で示されるアミノ酸配列の部分配列は、ＫＬＩＦＬ（配列番号４）、ＩＦＬＨＲ（配列番号６）、ＬＨＲＬＫ（配列番号８）、ＨＲＬＫＲ（配列番号９）、ＲＬＫＲＬ（配列番号１０）、ＬＫＲＬＲ（配列番号１１）およびＬＲＫＲＬ（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことが好ましい。また、配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分配列、または、配列番号２０で示されるアミノ酸配列の部分配列は、ＬＫＲ（配列番号１９）を含むことが好ましい。配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分配列、または、配列番号２０で示されるアミノ酸配列の部分配列としてよりこの好ましくは、ＬＫＲ（配列番号１９）、ＲＬＫＲ（配列番号１８）、ＬＫＲＬ（配列番号２１）、ＨＲＬＫＲ（配列番号９）、ＲＬＫＲＬ（配列番号１０）またはＬＫＲＬＲ（配列番号１１）を含む部分配列である。

本発明のペプチドは、ＨＲＬＫＲ（配列番号９）、ＲＬＫＲＬ（配列番号１０）またはＬＫＲＬＲ（配列番号１１）で示されるアミノ酸配列からなる、５残基のペプチドであることが特に好ましい。

本発明のペプチド誘導体は、特定のアミノ酸配列で示されるペプチドのＣ末端が、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ⁻）、アミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。エステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ_１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ_６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ_１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ_１−２アルキル基などのＣ_７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが挙げられる。アミド体としては、アミド、Ｃ_１−６アルキル基の１つまたは２つで置換されたアミド、フェニル基で置換されたＣ_１−６のアルキル基の１つまたは２つで置換されたアミド、アミド基の窒素原子を含んで５から７員環のアザシクロアルカンを形成するアミド等が挙げられる。本発明のペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基またはカルボキシレートを有している場合、それらの基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のペプチド誘導体に含まれる。本発明のペプチド誘導体は、Ｃ末端がアミド化されていることが好ましい。

本発明のペプチド誘導体には、Ｎ末端のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ_２−６アルカノイル基などのＣ_１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ_２−６アルカノイル基などのＣ_１−６アシル基など）で保護されているものも含まれる。本発明のペプチド誘導体は、Ｎ末端がアセチル化されていることが好ましい。さらに好ましくは、Ｎ末端がアセチル化され、かつＣ末端がアミド化されているペプチド誘導体である。

本発明のペプチド誘導体を構成するアミノ酸は、側鎖が任意の置換基で修飾されていてもよい。置換基は特に限定されないが、例えば、フッ素原子、塩素原子、シアノ基、水酸基、ニトロ基、アルキル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アミノ基、リン酸基などが挙げられる。また、側鎖の置換基は、保護基で保護されていてもよい。さらに、糖鎖が結合した糖ペプチドも本発明のペプチドの誘導体に含まれる。

本発明のペプチドまたはその誘導体は塩を形成していてもよく、その塩としては、生理学的に許容される塩が好ましい。生理学的に許容される塩としては、例えば、塩酸、硫酸、燐酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、シュウ酸、リンゴ酸、クエン酸、オレイン酸、パルミチン酸、硝酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などの酸との塩；ナトリウム、カリウム、カルシウムなどのアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の、またはアルミニウムの水酸化物または炭酸塩との塩；トリエチルアミン、ベンジルアミン、ジエタノールアミン、ｔ−ブチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、アルギニンなどとの塩などが挙げられる。中でも、塩酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩がより好ましい。

本発明のペプチドまたはその誘導体は、元のペプチドの特性が保持される限り、非天然アミノ酸を含んでもよい。また、本発明のペプチドまたはその誘導体は、元のペプチドの特性が保持される限り、ペプチドに他の物質を連結してもよい。ペプチドに連結可能な他の物質としては、例えば、他のペプチド、脂質、糖または糖鎖、アセチル基、天然または合成のポリマー等が挙げられる。また、本発明のペプチドは、元のペプチドの特性が保持される限り、ペプチドに、糖鎖付加、側鎖酸化、リン酸化等の修飾を行ってもよい。

本発明のペプチドその誘導体またはその塩は、公知の一般的なペプチド合成のプロトコールに従って、固相合成法（Ｆｍｏｃ法、Ｂｏｃ法）または液相合成法により製造することができる。また、本発明のペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを導入した形質転換体を用いて製造することができる。また、本発明のペプチドを一部に含むペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを導入した形質転換体を用いてペプチドを取得し、これを適当なプロテアーゼやペプチダーゼで切断することによって製造することができる。また、ｉｎｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いる方法により製造することができる。

本発明のペプチドは、線維芽細胞増殖作用、ヒアルロン酸産生促進作用およびコラーゲンゲル収縮作用からなる群から選択される１種以上の作用を有するペプチドである。線維芽細胞はコラーゲンなどのタンパク質およびヒアルロン酸などのグリコサミノグリカンを産生して、結合組織を形成し、皮膚に重要な役割を果たしている。そのため加齢等により線維芽細胞の機能が低下すると、コラーゲンやヒアルロン酸などが減少、変性し、さらに紫外線等により酸化ストレスを受けることで肌が荒れるなどのダメージを受けて、皮膚が老化し、シワ、たるみ、しみ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下などが起こることになる。したがって、線維芽細胞増殖作用、またはヒアルロン酸産生促進作用を有するペプチドは皮膚のシワやたるみを抑制することができ、抗老化に有用である。また、コラーゲンゲル収縮作用を有するペプチドは皮膚の弾力性の低下を抑制することができ、抗老化に有用である。

本発明に用いるペプチドの線維芽細胞増殖作用を確認する方法としては、例えば実施例２に記載の方法等が挙げられる。本発明に用いるペプチドのヒアルロン酸産生促進作用を確認する方法としては、例えば実施例４に記載の方法等が挙げられる。本発明に用いるペプチドのコラーゲンゲル収縮作用を確認する方法としては、例えば実施例６に記載の方法等が挙げられる。

線維芽細胞増殖作用を有するペプチドとしては、配列番号１、３、４、６、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６および１７のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドが好ましく、Ｎ末端がアセチル化され、かつＣ末端がアミド化されているペプチド誘導体がより好ましい。

ヒアルロン酸産生促進作用を有するペプチドとしては、配列番号１、２、４、６、８、９、１０、１１、１４、１５、１６、１８および１９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドが好ましく、Ｎ末端がアセチル化され、かつＣ末端がアミド化されているペプチド誘導体がより好ましい。

コラーゲンゲル収縮作用を有するペプチドとしては、配列番号１〜１９のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドが好ましく、Ｎ末端がアセチル化され、かつＣ末端がアミド化されているペプチド誘導体がより好ましい。

〔抗老化剤およびその利用〕
本発明は、上記本発明のペプチドを有効成分として含有する抗老化剤を提供する。本発明の抗老化剤は、線維芽細胞増殖促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用およびコラーゲンゲル収縮作用からなる群から選択される１種以上の作用を有することにより、優れた抗老化作用を発現することができる。それゆえ、本発明の抗老化剤は、線維芽細胞増殖促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤またはコラーゲンゲル収縮剤と換言することができる。本発明の抗老化剤は、化粧品、医薬部外品、医薬品、飲食品、サプリメント等の形態で実施することができる。

本発明は、上記発明の抗老化剤を含有する化粧品を提供する。本発明の化粧品は、例えば、保湿用化粧品、美白用化粧品、抗しわ用化粧品などとして好適に実施することができる。

本発明は、上記発明の抗老化剤を含有する医薬部外品を提供する。本発明の医薬部外品としては、例えば、保湿剤、美白剤、抗しわ剤、皮膚外用剤などとして好適に実施することができる。

本発明の抗老化剤を含む化粧品または医薬部外品の形態は特に限定されず、例えば、化粧水、乳液、美容液、パック、メイクアップベースローション、メイクアップベースクリーム、ファンデーション（乳液状、クリーム状、または軟膏型）、アイカラー、チークカラー、リップカラー、ハンドクリーム、レッグクリーム、ボディローション、シャンプー、コンディショナー、トリートメント、ヘアケア剤、スタイリング剤、入浴剤、ボディソープ、石鹸等の形態とすることができる。

本発明の抗老化剤を含む化粧品または医薬部外品は、本発明の抗老化剤以外に化粧品または医薬部外品として一般に使用されている成分、例えば、油分、湿潤剤、保湿剤、乳化剤、紫外線吸収剤、界面活性剤、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、増粘剤、充填剤、金属イオン封鎖剤、日焼け止め剤、消泡剤、柔軟剤、着色剤、防腐剤、推進剤、酸性化または塩基性化剤、シリコーン、ビタミン、染料、顔料、ナノ顔料、香料、アルコール等の有機溶媒、水等を目的に応じて適宜配合することができる。

本発明は、上記発明の抗老化剤を含有する医薬品を提供する。本発明の医薬品は、線維芽細胞の増殖能低下、ヒアルロン酸産能の低下に起因する疾患の予防または治療用医薬品として好適に実施することができる。また、線維芽細胞増殖促進および／またはヒアルロン酸産生促進により改善される皮膚（特に真皮）の損傷等の治療用医薬品として好適に実施することができる。

本発明の医薬品は、上記本発明のペプチドもしくはその誘導体またはその塩を有効成分とし、薬学的に許容される担体または添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口剤；注射剤、輸液、坐剤、軟膏、パッチ剤、液剤等の非経口剤とすることができる。担体または添加剤の配合割合については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。

錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は通常の製剤業務（例えば有効成分を注射用水、天然植物油等の溶媒に溶解または懸濁させる等）に従って調製することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０^ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。

このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
投与量は、投与対象、対象疾患、投与ルートなどにより異なるが、例えば、経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき有効成分を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。例えば、注射剤の形態で非経口的に投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき有効成分を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈内投与する。１日当たりの総投与量は、単一投与量であっても分割投与量であってもよい。

本発明は、上記発明の抗老化剤を含有する飲食品を提供する。本発明の飲食品は、線維芽細胞増殖促進用、ヒアルロン酸産生促進用、コラーゲンゲル収縮用の飲食品として好適に実施することができる。飲食品には、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、病者用食品が含まれる。飲食品の形態は特に限定されない。例えば茶飲料、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料、そば、うどん、中華麺、即席麺等の麺類、飴、キャンディー、ガム、チョコレート、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子、パン等の菓子およびパン類、かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品、加工乳、発酵乳等の乳製品、サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂および油脂加工食品、ソース、たれ等の調味料、カレー、シチュー、丼、お粥、雑炊等のレトルトパウチ食品、アイスクリーム、シャーベット、かき氷等の冷菓などを挙げることができる。

本発明は、本発明のペプチド等を含有するサプリメントを提供する。本発明のサプリメントは、骨形成促進用サプリメントとして、また、軟骨障害または関節疾患の予防・改善用サプリメントとして好適である。サプリメントは、例えば錠剤、顆粒剤、散剤、ドリンク剤等の形態で提供することができる。

本発明の抗老化剤を有するサプリメントを製造する際には、例えば、デキストリン、デンプン等の糖類；ゼラチン、大豆タンパク、トウモロコシタンパク等のタンパク質；アラニン、グルタミン、イソロイシン等のアミノ酸類；セルロース、アラビアゴム等の多糖類；大豆油、中鎖脂肪酸トリグリセリド等の油脂類等の任意の助剤を添加して任意の剤形に製剤化することができる。

本発明には、さらに以下の発明が含まれる。
（ａ）抗老化剤を製造するための上記本発明のペプチドもしくはその誘導体またはその塩の使用。
（ｂ）線維芽細胞の増殖を促進させるため、ヒアルロン酸の産生を促進させるため、またはコラーゲンゲルを収縮させるための上記本発明のペプチドもしくはその誘導体またはその塩。
（ｃ）哺乳動物に対して上記本発明のペプチドもしくはその誘導体またはその塩の有効量を投与することを特徴とする非治療的な抗老化方法。
（ｄ）哺乳動物に対して上記本発明のペプチドもしくはその誘導体またはその塩の有効量を投与することを特徴とする抗老化方法。
（ｅ）哺乳動物に対して上記本発明のペプチドもしくはその誘導体またはその塩の有効量を投与することを特徴とする皮膚の損傷を治療する方法。

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

〔実施例１：ペプチドの合成〕
文献ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｐｉｅｒｃｅ（１９８４）、Ｆｍｏｃｓｏｌｉｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ（２０００）および第５版実験化学講座１６有機化合物の合成ＩＶ等に記載の方法に従い、全自動固相合成機を用いて、保護ペプチド樹脂をＦｍｏｃ法で合成した。得られた保護ペプチド樹脂にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）とスカベンジャー（チオアニオール、エタンジチオール、フェノール、トリイソプロピルシラン、水などの混合物）を加えて、樹脂から切り出すとともに脱保護して、粗ペプチドを得た。この粗ペプチドを、逆相ＨＰＬＣカラム（ＯＤＳ）を用いて、０．１％ＴＦＡ−Ｈ２０／ＣＨ３ＣＮの系でグラジエント溶出し、精製を行った。目的物を含む分画を集め凍結乾燥して、目的のペプチドを得た。合成したペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸シーケンサーＧ１０００Ａ（ＨｅｌｅｔｔＰａｃｋａｒｄ）、ＰＰＳＱ−２３Ａ（島津製作所）またはＰｒｏｃｉｓｃＬＣ（ＡＢＩ社）を用いて確認した。合成したペプチドの配列を以下に示した。表１において（＊）を付したペプチドについては、Ｎ末端をアセチル化およびＣ末端をアミド化した。

合成したＯＳＫ−９（表１参照）について、ＡｘｉｍａＣＦＲ（島津製作所）を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により分子量を測定した。得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳスペクトルを図４に示した。

〔実施例２：線維芽細胞増殖作用の検討（１）〕
ペプチドの線維芽細胞の増殖に対する影響を検討した。
（１）実験方法
同仁化学のＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ（ＷＳＴ-１）を用いてペプチドの線維芽細胞増殖活性を測定した。コントロールとして、ペプチド無添加の群を用いた。正常ヒト線維芽細胞（新生児由来）（クラボウ、以下、ＮＨＤＦという。）を９６ウェルプレートに播種した（０．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／１００μＬ）。培地は、Ｍｅｄｉｕｍ１０６（１％ＦＢＳ含有、増殖添加剤不含）を用いた。細胞を播種してから約３時間後、培地を用いて調製したペプチド溶液を、１００μＬ添加し、ペプチドの最終濃度が、０．３、１、３、１０または３０μＭとなるようにした。コントロールのウェルには培地のみを１００μＬ添加し、細胞を含まないブランクのウェルには培地のみを２００μＬ添加した。ＣＯ_２インキュベータ内で２日間培養した。２日間培養後、ＷＳＴ−１試薬を各ウェルに２０μＬ添加し、ＣＯ_２インキュベータ内で約２〜４時間静置した。マイクロプレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ１４２０ＡＲＶＯｓｘ（プログラム：ＷＳＴ−１））にて波長４５０ｎｍ、６２０ｎｍの吸光度を測定し、各測定値のＯ．Ｄ．４５０−Ｏ．Ｄ．６２０を求めた。測定ウェルのＯ．Ｄ．４５０−Ｏ．Ｄ．６２０の値からブランクのウェルのＯ．Ｄ．４５０−Ｏ．Ｄ．６２０の平均値を引いたものをＮｅｔＯ．Ｄ．４５０とした。線維芽細胞増殖作用は、コントロールに対する各添加群のＮｅｔＯ．Ｄ．４５０の割合（％）を線維芽細胞増殖率として評価した。

（２）結果
ＯＳＫ−１〜ＯＳＫ−１７の各濃度（０．３、１、３、１０または３０μＭ）における線維芽細胞増殖率のうち最大値の結果を表２に示した。ＯＳＫ−１、ＯＳＫ−３、ＯＳＫ−４、ＯＳＫ−６、ＯＳＫ−９、ＯＳＫ−１０、ＯＳＫ−１１、ＯＳＫ−１２、ＯＳＫ−１４、ＯＳＫ−１５、ＯＳＫ−１６およびＯＳＫ−１７は、０．３〜３０μＭにおいて、線維芽細胞増殖作用を有することが確認された。

〔実施例３：線維芽細胞増殖作用の検討（２）〕
次に、実施例２での線維芽細細胞増殖活性の高かったＯＳＫ−１、ＯＳＫ−９、ＯＳＫ−１０およびＯＳＫ−１１について、さらに線維芽細胞活性を評価した。
（１）実験方法
各ペプチドの濃度が３、１０、３０、１００または３００μＭである以外は実施例２と同様の方法で行った。

（２）結果
ＯＳＫ−１、ＯＳＫ−９、ＯＳＫ−１０およびＯＳＫ−１１の各濃度（３、１０、３０、１００または３００μＭ）における線維芽細胞増殖率のうち最大値の結果を表３に示した。いずれのペプチドも、３０〜３００μＭにおいて、線維芽細胞増殖作用を有することが確認された。

〔実施例４：ヒアルロン酸産生促進作用の検討（１）〕
ペプチド添加による線維芽細胞のヒアルロン酸産生量への影響を検討した。
（１）実験方法
ＥＬＩＳＡ法により線維芽細胞のヒアルロン酸産生量を測定した。コントロールとして、ペプチド無添加の群を用いた。ＮＨＤＦ（ＮＢ）を２４ウェルプレートに播種し、一晩培養した（２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／５００μＬ）。培地はＭｅｄｉｕｍ１０６（１％ＦＢＳ含有、増殖添加剤不含）を用いた。播種の２０時間後、培地を用いて調製したペプチド溶液を各ウェルに５００μＬずつ添加した。ペプチドの最終濃度が、３、１０、３０、１００または３００μＭになるようにした。コントロールのウェルには培地のみを５００μＬ添加した。３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で５日間培養した。培養後、培養上清を１．５ｍＬチューブに移し、１５０００ｒｐｍ、４℃、５分間遠心し、上清を新しいチューブに回収した。培養上清中のヒアルロン酸量はＱｎＥＨｙａｌｕｒｏｎｉｃＡｃｉｄ（ＨＡ）ＥＬＩＳＡＡｓｓａｙ（ＢｉｏｔｅｃｈＴｒａｄｉｎｇＰａｒｔｎｅｒｓ社）を用いて測定した。方法はキットのプロトコールに従って行った。ヒアルロン酸産生促進作用は、コントロールに対する各添加群のＥＬＩＳＡ吸光度の割合（％）をヒアルロン酸産生率として評価した。

（２）結果
ＯＳＫ−２〜ＯＳＫ−１７の各濃度（３、１０、３０、１００または３００μＭ）におけるヒアルロン酸産生率のうち最大値の結果を表４に示した。ＯＳＫ−２、ＯＳＫ−４、ＯＳＫ−６、ＯＳＫ−８、ＯＳＫ−９、ＯＳＫ−１０、ＯＳＫ−１１、ＯＳＫ−１４、ＯＳＫ−１５およびＯＳＫ−１６は、線維芽細胞のヒアルロン酸産生量を増大させることが確認された。

〔実施例５：ヒアルロン酸産生促進作用の検討（２）〕
（１）実験方法
ヒアルロン酸産生率を、ＥＬＩＳＡの検量線から定量したヒアルロン酸量のコントロールに対する各添加群の割合（％）から算出した以外は、実施例４と同様に行った。

（２）結果
ＯＳＫ−１、ＯＳＫ−９〜ＯＳＫ−１１、ＯＳＫ−１８〜ＯＳＫ−２２およびＯＳＫ−２３の各濃度（３、１０、３０、１００または３００μＭ）におけるヒアルロン酸産生率のうち最大値の結果を表５に示した。ＯＳＫ−１、ＯＳＫ−９、ＯＳＫ−１０、ＯＳＫ−１１、ＯＳＫ−１８、ＯＳＫ−１９、ＯＳＫ−２１、ＯＳＫ−２２およびＯＳＫ−２３は、線維芽細胞のヒアルロン酸産生量を増大させることが確認された。

〔実施例６：コラーゲンゲル収縮作用の検討〕
（１）プレートのコーティング
３０％アルブミン溶液（ＳＩＧＭＡ）をＤＰＢＳで希釈して２％アルブミン溶液を調製した。２４ウェルプレートの各ウェルに１ｍＬ分注し、室温または３７℃で数時間静置した。使用直前に２％アルブミン溶液を吸引除去し、ＤＰＢＳでウェルを２回洗浄した。洗浄後ＤＰＢＳを０．５ｍＬ／ウェルで加えておき、コラーゲン液を添加する直前に吸引除去した。
（２）線維芽細胞懸濁液の調製
継代培養したＮＨＤＦをトリプシン／ＥＤＴＡ処理によりプレートから剥がし、１２００ｒｐｍ、室温、３分間遠心し回収した。回収したＮＨＤＦをＤＭＥＭ（２％ＦＢＳ含有、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁し、２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調製した。使用まで氷上に置いた。
（３）コラーゲンゲルの調製
表６の組成になるようにコラーゲン溶液を調製した。必要なウェル数より余分に調製し、氷上ですばやく行った。調製したコラーゲン溶液と（２）で調製した線維芽細胞懸濁液が４：１の割合になるように混合した。ピペットを用いて静かにピペッティングして混合した。混合した液を、３７℃にセットしたウォーターバス中で気泡が入らないように注意しながら穏やかに混ぜて温めた。（１）でアルブミンをコーティングしておいた２４ウェルプレートのＤＰＢＳを除き、各ウェルにコラーゲン溶液と線維芽細胞懸濁液の混合液を５００μＬずつ静かに加えた。３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で約１時間静置し、コラーゲンを重合させた。
（４）ペプチド添加
重合したコラーゲンゲルの入ったウェルに、培地を用いて調製したペプチド溶液を５００μLずつ添加し、ペプチドの最終濃度が３、１０、３０、１００、３００μＭになるようにした。コントロールとして、ペプチド無添加の群を用いた。プレートを静かに揺らし、コラーゲンゲルを浮遊させた。
（５）コラーゲンゲルの測定
デジタルカメラ（ＣＯＯＬＰＩＸ４５００、Ｎｉｋｏｎ）でゲルの写真を撮影し、画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＪ１．４３Ｓ）を用いてゲル面積を算出した。コントロールのゲル面積を１００％としたときの各添加群のゲル面積（％）を算出した。

（６）結果
ＯＳＫ−１〜ＯＳＫ−２２の各濃度（３、１０、３０、１００または３００μＭ）における収縮率のうち最大値の結果を図１に示した。ＯＳＫ−１〜ＯＳＫ−２２は、コラーゲンゲル収縮作用を有することが確認された。

〔実施例７：感作性試験〕
ＯＳＫ−６およびＯＳＫ−９の感作性試験を、ｈ−ＣＬＡＴ法により行った。対照として、ＬＬ−３７、ＭａｇａｉｎｉｎおよびＰｅｐｔｉｄｅ−１を用いた。ＬＬ−３７は、哺乳類の抗菌ペプチドであるカテリシジンファミリーに属するペプチドで、高い抗菌活性を有している。好中球やマスト細胞、上皮細胞などから産生され、局所感染や全身感染に対する防御機構として重要な役割を果たしている。３７個のアミノ酸（LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES：配列番号２２）から構成される。Ｍａｇａｉｎｉｎは、カエルの皮膚から単離された抗菌ペプチドで、２３個のアミノ酸（GIGKFLHSAKKFGKAFVGEIMNS：配列番号２３）から構成される。Ｐｅｐｔｉｄｅ−１は１９個のアミノ酸からなる機能未知のペプチドである。

（１）実験方法
ヒト単球系株化細胞ＴＨＰ−１細胞（ＪＣＲＢ登録番号：ＪＣＲＢ０１１２）は、１０％ＦＢＳおよび０．０５ｍＭメルカプトエタノール含有ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて７５ｃｍ^２フラスコに２．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で５０ｍＬ添加し、４８時間前培養した。前培養したＴＨＰ−１細胞を遠心回収し、１０％ＦＢＳおよび０．０５ｍＭメルカプトエタノール含有ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて２．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞分散液を調製し、２４ウェルプレートの各ウェルに５００μＬを播種した。細胞分散液を播種した各ウェルに、同培地を用いて調製したペプチドを５００μＬ添加した。２４時間培養後、細胞を遠心回収し、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）による洗浄を２回繰り返した。その後、６００μＬの０．０１％ヒトγグロブリン溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｇ２３８８）含有ＦＡＣＳバッファーに分散して４℃で１０分間インキュベートし、Ｆｃレセプターのブロッキングを行った。その後、細胞分散液を、抗体反応用に１８０μＬずつ３分割して１．５ｍＬチューブに分注した後、遠心回収したペレットに対し、ＣＤ８６抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｃａｔ＃５５５６５７）、ＣＤ５４抗体（Ｄａｋｏ；Ｃａｔ＃Ｆ７１４３）およびｉｓｏｔｙｐｅｃｏｎｔｒｏｌ（ＭｏｕｓｅＩｇＧ）抗体（Ｄａｋｏ；Ｃａｔ＃Ｘ０９２７）の各ＦＩＴＣ標識抗体液をＦＡＣＳバッファーで適正濃度に調整した液５０μＬを添加し、４℃で３０分間インキュベートした。３０分間インキュベーション後、細胞を遠心回収し、ＦＡＣＳバッファーによる洗浄を２回繰り返した。遠心回収した細胞を０．６２５μｇ／ｍＬＰｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ含有ＦＡＣＳバッファー２００μＬに分散し、フローサイトメトリーにて生細胞１×１０^４ｃｅｌｌｓを測定し、細胞表面抗原の発現量を測定した。前方散乱および側方散乱によるゲーティングは行わず、測定した平均蛍光強度（ＭＦＩ）から、下に示す式で相対蛍光強度（ＲＦＩ）を算出した。

試料未処理コントロール細胞（溶媒処理細胞）の生存率が９０％以上を示すとき試験成立とし、試験実施時の各試料濃度における細胞生存率が５０％より低い場合は、その濃度におけるＣＤ８６またはＣＤ５４の値は判定から除外とした。生存率、ＣＤ８６およびＣＤ５４のＲＦＩ値の結果から感作性を判定した。試料処理による各抗原の発現に関するＲＦＩは以下の値を超えた場合、陽性と判定した。
ＣＤ８６のＲＦＩ＞１５０
ＣＤ５４のＲＦＩ＞２００

（２）結果
ＣＤ８６の結果を図２に、ＣＤ５４の結果を図３にそれぞれ示した。ＯＳＫ−６およびＯＳＫ−９はいずれも５個のアミノ酸からなるペプチドであり、高濃度添加しても感作性は陰性であり、安全性が高いことが示された。Ｐｅｐｔｉｄｅ−１は、低濃度でも強い感作性を示した。ＬＬ−３７およびＭａｇａｉｎｉｎはＰｅｐｔｉｄｅ−１より長いペプチドであるが、ＣＤ５４に関しては感作性が陰性であり（図３）、ＣＤ８６に関しては、低濃度では陰性であったが、高濃度になると感作性が陽性になった（図２）。したがって、ペプチドの感作性は、単純にアミノ酸数によって感作性が上がるわけではなく、配列によって感作性が大きく異なることが示された。

なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

本発明の抗老化剤は、線維芽細胞増殖作用、ヒアルロン酸産生促進作用またはコラーゲンゲル収縮作用により、皮膚のシワ、たるみまたは皮膚の弾力性の低下を抑制することで、抗老化を目的とする化粧品、医薬部外品、医薬品、飲食品またはサプリメントの成分として好適に使用できる。

Claims

線維芽細胞増殖促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用およびコラーゲンゲル収縮作用からなる群から選択される１種以上の作用を有し、
ＥＬＫＬＩＦＬＨＲＬＫＲＬＲＫＲＬＫＲＫ（配列番号１）で示されるアミノ酸配列、またはその部分配列からなるペプチドもしくはその誘導体またはその塩。
ＫＬＩＦＬＨＲＬＫＲＬＲＫＲＬＫ（配列番号２０）で示されるアミノ酸配列、またはその部分配列からなる請求項１に記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩。
部分配列が、ＫＬＩＦＬ（配列番号４）、ＩＦＬＨＲ（配列番号６）、ＬＨＲＬＫ（配列番号８）、ＨＲＬＫＲ（配列番号９）、ＲＬＫＲＬ（配列番号１０）、ＬＫＲＬＲ（配列番号１１）およびＬＲＫＲＬ（配列番号１４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１または２に記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩。
部分配列が、ＬＫＲ（配列番号１９）を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩。
部分配列が、ＨＲＬＫＲ（配列番号９）、ＲＬＫＲＬ（配列番号１０）またはＬＫＲＬＲ（配列番号１１）である請求項４に記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩。
Ｃ末端がアミド化されている請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩。
Ｎ末端がアセチル化されている請求項１〜６のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩。
請求項１〜７のいずれかに記載のペプチドもしくはその誘導体またはその塩を有効成分として含有する抗老化剤。
請求項８に記載の抗老化剤を含む化粧品。
請求項８に記載の抗老化剤を含む医薬部外品。
請求項８に記載の抗老化剤を含む医薬品。
請求項８に記載の抗老化剤を含む飲食品。
請求項８に記載の抗老化剤を含むサプリメント。