JP2004352685A - ピラゾール化合物含有コラーゲン蓄積促進及び／又は減少抑制のための組成物 - Google Patents
ピラゾール化合物含有コラーゲン蓄積促進及び／又は減少抑制のための組成物 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】組織中のコラーゲン量の減少を伴う疾患又は組織容態を改善させるような薬剤の開発・提供が切望されており、コラーゲン蓄積促進及び／又は減少抑制のための組成物等を提供すること。
【解決手段】式（Ｉ）
（式中、Ｘは水素原子又はハロゲン原子を示す。）
で示されるピラゾール化合物を含有する、コラーゲン蓄積促進及び／又は減少抑制のための組成物等が提供可能となった。
【選択図】 なし
【解決手段】式（Ｉ）
（式中、Ｘは水素原子又はハロゲン原子を示す。）
で示されるピラゾール化合物を含有する、コラーゲン蓄積促進及び／又は減少抑制のための組成物等が提供可能となった。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ピラゾール化合物を含有する、コラーゲン蓄積促進及び／又は減少抑制のための組成物等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
体の中で最も大量に存在するタンパク質であるコラーゲン、特にその中で存在量の最も多いＩ型コラーゲンの主たる役割は、線維性成分としての力学的支持性である。各種臓器の構成細胞の１つである線維芽細胞は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン等の線維状タンパク質やヒアルロン酸等のグリコサミノグルカン等を産生し、これら細胞外マトリックスが３次元的な構造を形成することにより、組織が保持、維持されている。そのため、コラーゲンの質的量的な変化は力学的支持体としてのコラーゲン線維の機能的変化をもたらし、例えば、Ｉ型コラーゲンが有機成分の中心を占める骨基質ではコラーゲン量の減少に伴い、その脆弱化が起こると考えられている。また、加齢や紫外線等によって皮膚に生じるしわ等の組織容態や、異常創傷治癒、歯周病、骨粗しょう症、慢性関節リウマチ等の疾患においては、コラーゲン合成の低下とコラーゲン分解の促進とがそれら疾患又は組織容態の遷延に影響している（例えば、非特許文献１乃至５参照）。
実際、レチノイン酸、ビタミンＣ類、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、安息香酸化合物等の公知のコラーゲン合成促進剤を外用剤として用いることにより、しわ等の組織容態が改善されることがすでに報告されている（例えば、非特許文献６及び非特許文献７、並びに特許文献１参照）。また、骨粗しょう症等の疾患を改善させるエストロゲンは、骨芽細胞のコラーゲン合成を促進し、しかもマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）−１（以下、ＭＭＰ−１と記載することもある。）の産生を抑制することがすでに報告されている（例えば、非特許文献８及び非特許文献９参照）。
【０００３】
組織中のコラーゲン量は、合成と分解とのバランスにより既定されるが、それらは種々の細胞増殖因子、サイトカイン、低分子化合物等によって調節されている。例えば、サイトカインの１種であるＴＧＦ−βはよく知られたコラーゲン等の細胞外マトッリクスの発現促進因子であるが、一方では、コラーゲンの分解を触媒する各種マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）の発現抑制因子でもある。具体的には、例えば、ＴＧＦ−βはヒト肺線維芽細胞のＩ、ＩＩＩ、Ｖ型コラーゲンの産生や、ヒト胎児線維芽細胞のフィブロネクチンの産生を高める一方、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の産生を抑制する（例えば、非特許文献１０及び非特許文献１１参照）。
また動物個体レベルにおける研究において、ＴＧＦ−βトランスジェニックマウスでは創傷治癒の促進が起こり、さらに、ＴＧＦ−β遺伝子をリウマチモデル動物に導入したところ、当該疾患が改善したことが報告されている（例えば、非特許文献１２参照）。
以上のことから、コラーゲン合成の促進とコラーゲン分解の抑制により、コラーゲン蓄積促進及び／又は減少抑制の効果を有する低分子化合物は、しわ、異常創傷治癒、歯周病、骨粗しょう症、慢性関節リウマチ等の組織中のコラーゲン量の減少を伴う疾患又は組織容態を改善させ、その結果、当該化合物を有効成分として含有する医薬品、医薬部外品、化粧品、食品等の開発につながる。
【非特許文献１】
Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９４，９９，（１９９９）
【非特許文献２】
Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９３，６３９，（１９７５）
【非特許文献３】
Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ Ｒｅｓ．，３７，１，（２００２）
【非特許文献４】
Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７８，１９１，（１９９９）
【非特許文献５】
Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，４４，２５０３，（２００１）
【非特許文献６】
Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９６，９７５，（１９９１）
【非特許文献７】
Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ．，８，１８，（１９８４）
【非特許文献８】
Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８６，２５１，（２００２）
【非特許文献９】
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ，１５，２９１，（２００１）
【非特許文献１０】
Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６３，１７１，（１９９０）
【非特許文献１１】
Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９４，３６５，（１９９０）
【非特許文献１２】
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４，５５３，（１９９７）
【特許文献１】
公開特許公報、特開平８−２０８４６３
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況下において、組織中のコラーゲン量の減少を伴う疾患又は組織容態を改善させるような薬剤の開発・提供が切望されている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる状況の下、鋭意検討した結果、下記の式（Ｉ）で示される尿素化合物が、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を促進し、ＭＭＰ−１遺伝子の転写を抑制する能力を有することを見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．式（Ｉ）
（式中、Ｘは水素原子又はハロゲン原子を示す。）
で示されるピラゾール化合物（以下、本化合物と記すこともある。）を含有する、コラーゲン蓄積促進及び／又は減少抑制のための組成物（以下、本発明組成物と記すこともある。）；
２．Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を促進し、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）遺伝子の転写を抑制するための、式（Ｉ）
（式中、Ｘは水素原子又はハロゲン原子を示す。）
で示されるピラゾール化合物の使用；
３．組織中のコラーゲン量の減少を伴う疾患又は組織容態と診断されうる哺乳動物に対して、有効量の式（Ｉ）
（式中、Ｘは水素原子又はハロゲン原子を示す。）
で示されるピラゾールを投与する工程を有することを特徴とする組織中のコラーゲン量の蓄積促進及び／又は減少抑制方法（以下、本発明方法と記すこともある。）；
等を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、詳細に本発明を説明する。
本発明組成物に含有される本化合物において、ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子があげられる。
本化合物のうち、下記の式（ａ）で示される化合物は、ＡｓｉｎＥｘ社（モスクワ（ロシア））カタログ等に記載されており、また下記の式（ｂ）で示される化合物は、例えば、Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．，（１９８９），２６，７６９等に記載されており、いずれも公知である。しかしながら、当該文献には組織内におけるＩ型コラーゲン遺伝子の転写促進、ＭＭＰ−１遺伝子の転写の効果、ひいてはコラーゲン蓄積量の促進効果についての記載は何ら存在していない。
【０００７】
本化合物は、下記の式（ＩＩ）（式中、Ｘは水素原子又はハロゲン原子を示す。）で示されるヒドラジン化合物と、２，４−ペンタンジオンとを縮合することにより製造することができる。
上記の縮合方法としては、例えば、Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．，（１９８９），２６，７６９等に記載された方法をあげることができる。
表１に、化合物番号（１）〜（４）で表される本化合物を例示する。
【０００８】
本化合物
【０００９】
【表１】
【００１０】
本発明組成物は、例えば、本化合物を１種又は２種以上と、薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／又は、医薬品添加剤、食品添加剤若しくは化粧品添加剤等とが混合されてなる組成物等である。本化合物自体又は本発明組成物は、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を促進し、ＭＭＰ−１遺伝子の転写を抑制する能力を有する。当該能力は、Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現量を増加させ、ＭＭＰ−１遺伝子の発現量を減少させて、組織中のコラーゲンの蓄積促進及び／又は減少抑制の効果を導くことにより、組織中のコラーゲン量の減少を伴う疾患又は組織容態を改善するために重要であり、当該目的のための医薬品、医薬部外品、化粧品、食品等としての利用が考えられる。
本発明組成物又は本化合物の適用可能な疾患又は組織容態としては、種々の原因により組織中のコラーゲン量が減少し、その結果、臓器・組織の機能低下をもたらす疾患又は組織容態を改善するために用いることができる。例えば、加齢や紫外線等によって皮膚に生じるしわや、異常創傷治癒、歯周病、骨粗しょう症、慢性関節リウマチ等の疾患をあげることができる。
用いられる薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／又は、医薬品添加剤、食品添加剤若しくは化粧品添加剤等は、前記組成物の具体的用途に応じて適宜選択することができる。また、当該組成物の形態も、具体的用途に応じて、例えば、種々の固体、液体等の形態とすることができる。
例えば、本発明組成物又は本化合物を医薬品として用いる場合には、具体的な形態として、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、シロップ剤、カプセル剤、懸濁化剤、エマルジョン剤、エキス剤及び丸剤等の経口剤、注射剤、外用液剤、軟膏剤等の経皮吸収剤（皮膚外用剤）、坐剤及び局所等の非経口剤等をあげることができる。
経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸等の担体や賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、安定化剤、保湿剤、防腐剤、酸化防止剤等の医薬品添加剤を用いて、通常の方法に従って製造することができる。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明組成物又は本化合物の種類、投与形態等によって異なるが、通常は経口の場合にはヒト成人で１日あたり有効成分量として約１ｍｇ〜約２ｇ、好ましくは有効成分量として約５ｍｇ〜約１ｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
非経口剤のうち、注射剤は、生理食塩水、滅菌水リンゲル液等の水溶性溶剤、植物油、脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖、塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、乳化剤等の医薬品添加剤を用いて、通常の方法に従って製造することができる。外用液剤、ゲル状軟膏等の経皮吸収剤、直腸内投与のための坐剤等も通常の方法に従って製造することができる。このような非経口剤を投与するには、注射（皮下、静脈内等）、経皮投与、直腸投与すればよい。局所剤は、例えば、本化合物をエチレンビニル酢酸ポリマー等の徐放性ポリマーのペレットに取り込ませて製造することができる。このペレットを治療すべき組織中に外科的に移植すればよい。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明組成物又は本化合物の種類、投与形態等によって異なるが、通常は注射の場合にはヒト成人で有効成分量として約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
本発明組成物又は本化合物を化粧品として用いる場合には、具体的な形態としては、例えば、クリーム、ローション剤等をあげることができる。ローション剤は、例えば、懸濁剤、乳化剤、保存剤等の化粧品添加剤を用いて、通常の方法に従って製造することができる。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明組成物又は本化合物の種類、投与形態等によって異なるが、通常ヒト成人で有効成分量として約０．０１ｍｇ〜約５０ｍｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
本発明組成物又は本化合物を食品として用いる場合には、具体的な形態としては、例えば、粉末、錠剤、飲料、摂取可能なゲル若しくはシロップとの混合液状物、例えば、調味料、和菓子、洋菓子、氷菓、飲料、スプレッド、ペースト、漬物、ビン缶詰、畜肉加工品、魚肉・水産加工品、乳・卵加工品、野菜加工品、果実加工品、穀類加工品等の一般的な飲食物や嗜好物等をあげることができる。また、家畜、家禽、蜜蜂、蚕、魚等の飼育動物のための飼料や餌料への食品添加物等もあげられる。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明組成物又は本化合物の種類、投与形態等によって異なるが、通常ヒト成人で有効成分量として約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
【００１１】
【実施例】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に具体的に説明する。
【００１２】
実施例１（Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現量及びＭＭＰ−１遺伝子の発現量を指標とした、被験化合物が有するコラーゲンの蓄積促進及び／又は減少抑制の効果測定）
正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号ＣＣ−２５０９）を１２ウエルプレートに１ウエルあたり５ｘ１０４個播き、３７℃、５％ ＣＯ２雰囲気下で一晩培養した。培養された細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ−ＭＥＭ（日水製薬、カタログ番号０５９１９）培地で洗浄した後、非働化牛胎児血清（以下、ＦＢＳと記す。ＴｈｅｒｍｏＴｒａｃｅ社、カタログ番号１５−０１０−０５００Ｖ）を０．１（ｖ／ｖ）％含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ−ＭＥＭ培地（以下、Ｄ−ＭＥＭ（０．１％）と記す。）０．５ｍｌ添加した。その後、化合物番号（４）で示される本化合物を０．５ｍＭとなるようジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯと記す。）にそれぞれ溶解させてなる溶液を添加（最終濃度１μＭ）した。また、対照としてＤＭＳＯを１μｌ、陽性対照として２．５μｇ／ｍｌのＴＧＦ−βを１μｌ添加（最終濃度５ｎｇ／ｍｌ）した。３７℃、５％ ＣＯ２雰囲気下で３日間培養した後、培養上清と細胞とを分離した。
分離された細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号７４１０６）を用い、全ＲＮＡ（約３０μｌ）を抽出した。抽出された全ＲＮＡ ５μｌ（５０ｎｇ）に、２０μＭ オリゴｄＴ １μｌ及びＲＮａｓｅフリー蒸留水 ４μｌを加えて６５℃、５分間インキュベートした直後に氷冷した。当該溶液１０μｌに、５ｘバッファー ４μｌ、ＭｇＣｌ２ ２．４μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、ＲＮａｓｉｎ １μｌ、ＩｍｐｒｏｍＩＩ １μｌ、ＲＮａｓｅフリー蒸留水 ０．６μｌ（以上全てＰｒｏｍｅｇａ社）を加えて２５℃で５分間、４２℃で１時間、７０℃で１５分間の条件で逆転写反応した。
逆転写反応溶液 ５μｌに、配列番号１、２で示される各１０ｐｍｏｌ／μｌプライマー ２μｌ、配列番号３で示されるＩ型コラーゲン検出用プローブ（ＦＡＭ−ｃｔａｃｔｇｇｃｇａ ａａｃｃｔｇｔａｔｃ ｃｇｇｇｃ−ＴＡＭＲＡ）（アプライドバイオシステム社） １．２５μｌ、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステム社） １２．５μｌ、滅菌水 ２．２５μｌをＯｐｔｉｃａｌ ９６−Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ（アプライドバイオシステム社、カタログ番号Ｎ８０１−０５６０）のウエル中で混合した。同様に、配列番号４、５で示されるプライマー及び配列番号６で示されるＭＭＰ−１検出用プローブ（ＦＡＭ−ｃｔｃｇｃｔｇｇｇａ ｇｃａａａｃａｃａｔ ｃｔｇａｃｃｔ−ＴＡＭＲＡ）（アプライドバイオシステム社）又はＧＡＰＤＨ検出用プローブ（アプライドバイオシステム社、カタログ番号４３１０８８４Ｅ）を各々別々のウエル中で混合した。スタンダードとしては逆転写反応溶液５μｌの代わりに、予め調製した正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞ｃＤＮＡ ５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６２５ｎｇ／μｌ 各５μｌを用いた。その後、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ５７００（アプライドバイオシステム社）を用いて５０℃で５分間の１サイクル、９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の４０サイクルの条件でＰＣＲ反応した。定量はスタンダード直線を作成した後、各サンプルのＩ型コラーゲン量、ＭＭＰ−１量及びＧＡＰＤＨ量を算出し、次式に従ってＩ型コラーゲン遺伝子の発現量（即ち、転写量）及びＭＭＰ−１遺伝子の発現量（即ち、転写量）を算出した。
Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現量（補正値）＝測定されたＩ型コラーゲン遺伝子の発現量／ＧＡＰＤＨ量
ＭＭＰ−１遺伝子の発現量（補正値）＝測定されたＭＭＰ−１遺伝子の発現量／ＧＡＰＤＨ量
被験化合物が化合物番号（４）で示される本化合物である場合における、Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現量及びＭＭＰ−１遺伝子の発現量は表２のとおりであり、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を促進し、ＭＭＰ−１遺伝子の転写を抑制する能力が確認された。
【００１３】
【表２】
＊コントロールでの値を１００とした場合の相対値で示す。
【００１４】
実施例２（非分解Ｉ型コラーゲンのタンパク量を指標とした、被験化合物が有するコラーゲンの蓄積促進及び／又は減少抑制の効果測定）
実施例１載の培養上清 ５０μｌに、２５ｍＭ 酢酸ｐ−アミノフェニル水銀（アマシャムファルマシア社、カタログ番号ＲＰＮ２６２９）１μｌを添加し、３７℃、１時間インキュベートした。得られた反応液 １０μｌを１０％ ポリアクリルピラゾールゲル電気泳動した後、ＰＶＤＦ膜に転写（２５０ｍＡ、９０分間）した。タンパク質転写されたＰＶＤＦ膜を５％スキムミルク溶液中で振とうさせながら３０分間インキュベートした後、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液（以下、ＰＢＳ−Ｔと記す。）で洗浄し、１０００倍希釈したウサギ抗Ｉ型コラーゲン抗体（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社、カタログ番号２３７０６）を加えて室温、１時間インキュベートした。次に、ＰＢＳ−Ｔで３回、各１０分間振とうさせながら洗浄した後、１０００倍希釈したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体−ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社、カタログ番号ｓｃ−２００４）を加えて室温、１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャムファルマシア社、カタログ番号ＲＰＮ２１０６）を加え、ルミノ・イメージアナライザーＬＡＳ−１０００ｐｌｕｓ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社）を用いて約２００ｋＤａ及び１５０ｋＤａ部分の発光を検出し、Ｉｍａｇｅ Ｇａｕｇｅ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社）を用いて定量した。得られた値を非分解Ｉ型コラーゲンのタンパク量とした。
化合物番号（４）で示される本化合物の非分解Ｉ型コラーゲンのタンパク量は、表３のとおりであり、コラーゲンの蓄積能力が確認された。
【００１５】
【表３】
＊コントロールでの値を１００とした場合の相対値で示す。
【００１６】
【発明の効果】
本発明により、式（Ｉ）で示されるピラゾール化合物を含有する、コラーゲン蓄積促進及び／又は減少抑制のための組成物等が提供可能となる。
【００１７】
［配列表フリーテキスト］
配列番号１
Ｉ型コラーゲン遺伝子を検出するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２
Ｉ型コラーゲン遺伝子を検出するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３
Ｉ型コラーゲン遺伝子を検出するために設計されたオリゴヌクレオチドプローブ
配列番号４
ＭＭＰ−１遺伝子を検出するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー配列番号５
ＭＭＰ−１遺伝子を検出するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー配列番号６
ＭＭＰ−１遺伝子を検出するために設計されたオリゴヌクレオチドプローブ
【００１８】
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ピラゾール化合物を含有する、コラーゲン蓄積促進及び／又は減少抑制のための組成物等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
体の中で最も大量に存在するタンパク質であるコラーゲン、特にその中で存在量の最も多いＩ型コラーゲンの主たる役割は、線維性成分としての力学的支持性である。各種臓器の構成細胞の１つである線維芽細胞は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン等の線維状タンパク質やヒアルロン酸等のグリコサミノグルカン等を産生し、これら細胞外マトリックスが３次元的な構造を形成することにより、組織が保持、維持されている。そのため、コラーゲンの質的量的な変化は力学的支持体としてのコラーゲン線維の機能的変化をもたらし、例えば、Ｉ型コラーゲンが有機成分の中心を占める骨基質ではコラーゲン量の減少に伴い、その脆弱化が起こると考えられている。また、加齢や紫外線等によって皮膚に生じるしわ等の組織容態や、異常創傷治癒、歯周病、骨粗しょう症、慢性関節リウマチ等の疾患においては、コラーゲン合成の低下とコラーゲン分解の促進とがそれら疾患又は組織容態の遷延に影響している（例えば、非特許文献１乃至５参照）。
実際、レチノイン酸、ビタミンＣ類、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、安息香酸化合物等の公知のコラーゲン合成促進剤を外用剤として用いることにより、しわ等の組織容態が改善されることがすでに報告されている（例えば、非特許文献６及び非特許文献７、並びに特許文献１参照）。また、骨粗しょう症等の疾患を改善させるエストロゲンは、骨芽細胞のコラーゲン合成を促進し、しかもマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）−１（以下、ＭＭＰ−１と記載することもある。）の産生を抑制することがすでに報告されている（例えば、非特許文献８及び非特許文献９参照）。
【０００３】
組織中のコラーゲン量は、合成と分解とのバランスにより既定されるが、それらは種々の細胞増殖因子、サイトカイン、低分子化合物等によって調節されている。例えば、サイトカインの１種であるＴＧＦ−βはよく知られたコラーゲン等の細胞外マトッリクスの発現促進因子であるが、一方では、コラーゲンの分解を触媒する各種マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）の発現抑制因子でもある。具体的には、例えば、ＴＧＦ−βはヒト肺線維芽細胞のＩ、ＩＩＩ、Ｖ型コラーゲンの産生や、ヒト胎児線維芽細胞のフィブロネクチンの産生を高める一方、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の産生を抑制する（例えば、非特許文献１０及び非特許文献１１参照）。
また動物個体レベルにおける研究において、ＴＧＦ−βトランスジェニックマウスでは創傷治癒の促進が起こり、さらに、ＴＧＦ−β遺伝子をリウマチモデル動物に導入したところ、当該疾患が改善したことが報告されている（例えば、非特許文献１２参照）。
以上のことから、コラーゲン合成の促進とコラーゲン分解の抑制により、コラーゲン蓄積促進及び／又は減少抑制の効果を有する低分子化合物は、しわ、異常創傷治癒、歯周病、骨粗しょう症、慢性関節リウマチ等の組織中のコラーゲン量の減少を伴う疾患又は組織容態を改善させ、その結果、当該化合物を有効成分として含有する医薬品、医薬部外品、化粧品、食品等の開発につながる。
【非特許文献１】
Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９４，９９，（１９９９）
【非特許文献２】
Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９３，６３９，（１９７５）
【非特許文献３】
Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ Ｒｅｓ．，３７，１，（２００２）
【非特許文献４】
Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７８，１９１，（１９９９）
【非特許文献５】
Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，４４，２５０３，（２００１）
【非特許文献６】
Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９６，９７５，（１９９１）
【非特許文献７】
Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ．，８，１８，（１９８４）
【非特許文献８】
Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８６，２５１，（２００２）
【非特許文献９】
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ，１５，２９１，（２００１）
【非特許文献１０】
Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６３，１７１，（１９９０）
【非特許文献１１】
Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９４，３６５，（１９９０）
【非特許文献１２】
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４，５５３，（１９９７）
【特許文献１】
公開特許公報、特開平８−２０８４６３
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況下において、組織中のコラーゲン量の減少を伴う疾患又は組織容態を改善させるような薬剤の開発・提供が切望されている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる状況の下、鋭意検討した結果、下記の式（Ｉ）で示される尿素化合物が、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を促進し、ＭＭＰ−１遺伝子の転写を抑制する能力を有することを見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．式（Ｉ）
で示されるピラゾール化合物（以下、本化合物と記すこともある。）を含有する、コラーゲン蓄積促進及び／又は減少抑制のための組成物（以下、本発明組成物と記すこともある。）；
２．Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を促進し、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）遺伝子の転写を抑制するための、式（Ｉ）
で示されるピラゾール化合物の使用；
３．組織中のコラーゲン量の減少を伴う疾患又は組織容態と診断されうる哺乳動物に対して、有効量の式（Ｉ）
で示されるピラゾールを投与する工程を有することを特徴とする組織中のコラーゲン量の蓄積促進及び／又は減少抑制方法（以下、本発明方法と記すこともある。）；
等を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、詳細に本発明を説明する。
本発明組成物に含有される本化合物において、ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子があげられる。
本化合物のうち、下記の式（ａ）で示される化合物は、ＡｓｉｎＥｘ社（モスクワ（ロシア））カタログ等に記載されており、また下記の式（ｂ）で示される化合物は、例えば、Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．，（１９８９），２６，７６９等に記載されており、いずれも公知である。しかしながら、当該文献には組織内におけるＩ型コラーゲン遺伝子の転写促進、ＭＭＰ−１遺伝子の転写の効果、ひいてはコラーゲン蓄積量の促進効果についての記載は何ら存在していない。
本化合物は、下記の式（ＩＩ）（式中、Ｘは水素原子又はハロゲン原子を示す。）で示されるヒドラジン化合物と、２，４−ペンタンジオンとを縮合することにより製造することができる。
表１に、化合物番号（１）〜（４）で表される本化合物を例示する。
【０００８】
本化合物
【表１】
本発明組成物は、例えば、本化合物を１種又は２種以上と、薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／又は、医薬品添加剤、食品添加剤若しくは化粧品添加剤等とが混合されてなる組成物等である。本化合物自体又は本発明組成物は、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を促進し、ＭＭＰ−１遺伝子の転写を抑制する能力を有する。当該能力は、Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現量を増加させ、ＭＭＰ−１遺伝子の発現量を減少させて、組織中のコラーゲンの蓄積促進及び／又は減少抑制の効果を導くことにより、組織中のコラーゲン量の減少を伴う疾患又は組織容態を改善するために重要であり、当該目的のための医薬品、医薬部外品、化粧品、食品等としての利用が考えられる。
本発明組成物又は本化合物の適用可能な疾患又は組織容態としては、種々の原因により組織中のコラーゲン量が減少し、その結果、臓器・組織の機能低下をもたらす疾患又は組織容態を改善するために用いることができる。例えば、加齢や紫外線等によって皮膚に生じるしわや、異常創傷治癒、歯周病、骨粗しょう症、慢性関節リウマチ等の疾患をあげることができる。
用いられる薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／又は、医薬品添加剤、食品添加剤若しくは化粧品添加剤等は、前記組成物の具体的用途に応じて適宜選択することができる。また、当該組成物の形態も、具体的用途に応じて、例えば、種々の固体、液体等の形態とすることができる。
例えば、本発明組成物又は本化合物を医薬品として用いる場合には、具体的な形態として、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、シロップ剤、カプセル剤、懸濁化剤、エマルジョン剤、エキス剤及び丸剤等の経口剤、注射剤、外用液剤、軟膏剤等の経皮吸収剤（皮膚外用剤）、坐剤及び局所等の非経口剤等をあげることができる。
経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸等の担体や賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、安定化剤、保湿剤、防腐剤、酸化防止剤等の医薬品添加剤を用いて、通常の方法に従って製造することができる。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明組成物又は本化合物の種類、投与形態等によって異なるが、通常は経口の場合にはヒト成人で１日あたり有効成分量として約１ｍｇ〜約２ｇ、好ましくは有効成分量として約５ｍｇ〜約１ｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
非経口剤のうち、注射剤は、生理食塩水、滅菌水リンゲル液等の水溶性溶剤、植物油、脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖、塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、乳化剤等の医薬品添加剤を用いて、通常の方法に従って製造することができる。外用液剤、ゲル状軟膏等の経皮吸収剤、直腸内投与のための坐剤等も通常の方法に従って製造することができる。このような非経口剤を投与するには、注射（皮下、静脈内等）、経皮投与、直腸投与すればよい。局所剤は、例えば、本化合物をエチレンビニル酢酸ポリマー等の徐放性ポリマーのペレットに取り込ませて製造することができる。このペレットを治療すべき組織中に外科的に移植すればよい。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明組成物又は本化合物の種類、投与形態等によって異なるが、通常は注射の場合にはヒト成人で有効成分量として約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
本発明組成物又は本化合物を化粧品として用いる場合には、具体的な形態としては、例えば、クリーム、ローション剤等をあげることができる。ローション剤は、例えば、懸濁剤、乳化剤、保存剤等の化粧品添加剤を用いて、通常の方法に従って製造することができる。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明組成物又は本化合物の種類、投与形態等によって異なるが、通常ヒト成人で有効成分量として約０．０１ｍｇ〜約５０ｍｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
本発明組成物又は本化合物を食品として用いる場合には、具体的な形態としては、例えば、粉末、錠剤、飲料、摂取可能なゲル若しくはシロップとの混合液状物、例えば、調味料、和菓子、洋菓子、氷菓、飲料、スプレッド、ペースト、漬物、ビン缶詰、畜肉加工品、魚肉・水産加工品、乳・卵加工品、野菜加工品、果実加工品、穀類加工品等の一般的な飲食物や嗜好物等をあげることができる。また、家畜、家禽、蜜蜂、蚕、魚等の飼育動物のための飼料や餌料への食品添加物等もあげられる。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明組成物又は本化合物の種類、投与形態等によって異なるが、通常ヒト成人で有効成分量として約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。
【００１１】
【実施例】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に具体的に説明する。
【００１２】
実施例１（Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現量及びＭＭＰ−１遺伝子の発現量を指標とした、被験化合物が有するコラーゲンの蓄積促進及び／又は減少抑制の効果測定）
正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号ＣＣ−２５０９）を１２ウエルプレートに１ウエルあたり５ｘ１０４個播き、３７℃、５％ ＣＯ２雰囲気下で一晩培養した。培養された細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ−ＭＥＭ（日水製薬、カタログ番号０５９１９）培地で洗浄した後、非働化牛胎児血清（以下、ＦＢＳと記す。ＴｈｅｒｍｏＴｒａｃｅ社、カタログ番号１５−０１０−０５００Ｖ）を０．１（ｖ／ｖ）％含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ−ＭＥＭ培地（以下、Ｄ−ＭＥＭ（０．１％）と記す。）０．５ｍｌ添加した。その後、化合物番号（４）で示される本化合物を０．５ｍＭとなるようジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯと記す。）にそれぞれ溶解させてなる溶液を添加（最終濃度１μＭ）した。また、対照としてＤＭＳＯを１μｌ、陽性対照として２．５μｇ／ｍｌのＴＧＦ−βを１μｌ添加（最終濃度５ｎｇ／ｍｌ）した。３７℃、５％ ＣＯ２雰囲気下で３日間培養した後、培養上清と細胞とを分離した。
分離された細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号７４１０６）を用い、全ＲＮＡ（約３０μｌ）を抽出した。抽出された全ＲＮＡ ５μｌ（５０ｎｇ）に、２０μＭ オリゴｄＴ １μｌ及びＲＮａｓｅフリー蒸留水 ４μｌを加えて６５℃、５分間インキュベートした直後に氷冷した。当該溶液１０μｌに、５ｘバッファー ４μｌ、ＭｇＣｌ２ ２．４μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、ＲＮａｓｉｎ １μｌ、ＩｍｐｒｏｍＩＩ １μｌ、ＲＮａｓｅフリー蒸留水 ０．６μｌ（以上全てＰｒｏｍｅｇａ社）を加えて２５℃で５分間、４２℃で１時間、７０℃で１５分間の条件で逆転写反応した。
逆転写反応溶液 ５μｌに、配列番号１、２で示される各１０ｐｍｏｌ／μｌプライマー ２μｌ、配列番号３で示されるＩ型コラーゲン検出用プローブ（ＦＡＭ−ｃｔａｃｔｇｇｃｇａ ａａｃｃｔｇｔａｔｃ ｃｇｇｇｃ−ＴＡＭＲＡ）（アプライドバイオシステム社） １．２５μｌ、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステム社） １２．５μｌ、滅菌水 ２．２５μｌをＯｐｔｉｃａｌ ９６−Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ（アプライドバイオシステム社、カタログ番号Ｎ８０１−０５６０）のウエル中で混合した。同様に、配列番号４、５で示されるプライマー及び配列番号６で示されるＭＭＰ−１検出用プローブ（ＦＡＭ−ｃｔｃｇｃｔｇｇｇａ ｇｃａａａｃａｃａｔ ｃｔｇａｃｃｔ−ＴＡＭＲＡ）（アプライドバイオシステム社）又はＧＡＰＤＨ検出用プローブ（アプライドバイオシステム社、カタログ番号４３１０８８４Ｅ）を各々別々のウエル中で混合した。スタンダードとしては逆転写反応溶液５μｌの代わりに、予め調製した正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞ｃＤＮＡ ５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６２５ｎｇ／μｌ 各５μｌを用いた。その後、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ５７００（アプライドバイオシステム社）を用いて５０℃で５分間の１サイクル、９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の４０サイクルの条件でＰＣＲ反応した。定量はスタンダード直線を作成した後、各サンプルのＩ型コラーゲン量、ＭＭＰ−１量及びＧＡＰＤＨ量を算出し、次式に従ってＩ型コラーゲン遺伝子の発現量（即ち、転写量）及びＭＭＰ−１遺伝子の発現量（即ち、転写量）を算出した。
Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現量（補正値）＝測定されたＩ型コラーゲン遺伝子の発現量／ＧＡＰＤＨ量
ＭＭＰ−１遺伝子の発現量（補正値）＝測定されたＭＭＰ−１遺伝子の発現量／ＧＡＰＤＨ量
被験化合物が化合物番号（４）で示される本化合物である場合における、Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現量及びＭＭＰ−１遺伝子の発現量は表２のとおりであり、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を促進し、ＭＭＰ−１遺伝子の転写を抑制する能力が確認された。
【００１３】
【表２】
【００１４】
実施例２（非分解Ｉ型コラーゲンのタンパク量を指標とした、被験化合物が有するコラーゲンの蓄積促進及び／又は減少抑制の効果測定）
実施例１載の培養上清 ５０μｌに、２５ｍＭ 酢酸ｐ−アミノフェニル水銀（アマシャムファルマシア社、カタログ番号ＲＰＮ２６２９）１μｌを添加し、３７℃、１時間インキュベートした。得られた反応液 １０μｌを１０％ ポリアクリルピラゾールゲル電気泳動した後、ＰＶＤＦ膜に転写（２５０ｍＡ、９０分間）した。タンパク質転写されたＰＶＤＦ膜を５％スキムミルク溶液中で振とうさせながら３０分間インキュベートした後、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液（以下、ＰＢＳ−Ｔと記す。）で洗浄し、１０００倍希釈したウサギ抗Ｉ型コラーゲン抗体（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社、カタログ番号２３７０６）を加えて室温、１時間インキュベートした。次に、ＰＢＳ−Ｔで３回、各１０分間振とうさせながら洗浄した後、１０００倍希釈したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体−ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社、カタログ番号ｓｃ−２００４）を加えて室温、１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャムファルマシア社、カタログ番号ＲＰＮ２１０６）を加え、ルミノ・イメージアナライザーＬＡＳ−１０００ｐｌｕｓ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社）を用いて約２００ｋＤａ及び１５０ｋＤａ部分の発光を検出し、Ｉｍａｇｅ Ｇａｕｇｅ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社）を用いて定量した。得られた値を非分解Ｉ型コラーゲンのタンパク量とした。
化合物番号（４）で示される本化合物の非分解Ｉ型コラーゲンのタンパク量は、表３のとおりであり、コラーゲンの蓄積能力が確認された。
【００１５】
【表３】
【００１６】
【発明の効果】
本発明により、式（Ｉ）で示されるピラゾール化合物を含有する、コラーゲン蓄積促進及び／又は減少抑制のための組成物等が提供可能となる。
【００１７】
［配列表フリーテキスト］
配列番号１
Ｉ型コラーゲン遺伝子を検出するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２
Ｉ型コラーゲン遺伝子を検出するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３
Ｉ型コラーゲン遺伝子を検出するために設計されたオリゴヌクレオチドプローブ
配列番号４
ＭＭＰ−１遺伝子を検出するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー配列番号５
ＭＭＰ−１遺伝子を検出するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー配列番号６
ＭＭＰ−１遺伝子を検出するために設計されたオリゴヌクレオチドプローブ
【００１８】
【配列表】
Claims (3)
- 式（Ｉ）
（式中、Ｘは水素原子又はハロゲン原子を示す。）
で示されるピラゾール化合物を含有する、コラーゲン蓄積促進及び／又は減少抑制のための組成物。 - Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を促進し、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）遺伝子の転写を抑制するための、式（Ｉ）
（式中、Ｘは水素原子又はハロゲン原子を示す。）
で示されるピラゾール化合物の使用。 - 組織中のコラーゲン量の減少を伴う疾患又は組織容態と診断されうる哺乳動物に対して、有効量の式（Ｉ）
（式中、Ｘは水素原子又はハロゲン原子を示す。）
で示されるピラゾールを投与する工程を有することを特徴とする組織中のコラーゲン量の蓄積促進及び／又は減少抑制方法。
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