JP4353046B2 - トリアジノインドールアミン化合物 - Google Patents

Description

本発明は、トリアジノインドールアミン化合物並びに該化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、コラーゲン蓄積促進及び／又は減少抑制のための組成物等に関する。

体の中で最も大量に存在するタンパク質であるコラーゲン、特にその中で存在量の最も多いＩ型コラーゲンの主たる役割は、線維性成分としての力学的支持性である。各種臓器の構成細胞の１つである線維芽細胞は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン等の線維状タンパク質やヒアルロン酸等のグリコサミノグルカン等を産生し、これら細胞外マトリックスが３次元的な構造を形成することにより、組織が保持、維持されている。そのため、コラーゲンの質的量的な変化は力学的支持体としてのコラーゲン線維の機能的変化をもたらし、例えば、Ｉ型コラーゲンが有機成分の中心を占める骨基質ではコラーゲン量の減少に伴い、その脆弱化が起こると考えられている。また、加齢や紫外線等によって皮膚に生じるしわ等の組織容態や、異常創傷治癒、歯周病、骨粗しょう症、慢性関節リウマチ等の疾患においては、コラーゲン合成の低下とコラーゲン分解の促進とがそれら疾患又は組織容態の遷延に影響している（例えば、非特許文献１乃至５参照。）。

実際、レチノイン酸、ビタミンＣ類、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３、安息香酸化合物等の公知の非分解型コラーゲン合成促進剤を外用剤として用いることにより、しわ等の組織容態が改善されることがすでに報告されている（例えば、非特許文献６及び非特許文献７、並びに特許文献１参照。）。かかるしわ等の組織容態が改善のための外用剤として現在、商業的に実用化されている非分解型コラーゲン合成促進剤としては例えばレチノイン酸が挙げられる。また、骨粗しょう症等の疾患を改善させるエストロゲンは、骨芽細胞のコラーゲン合成を促進し、しかもマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）−１（以下、ＭＭＰ−１と記載することもある。）の産生を抑制することがすでに報告されている（例えば、非特許文献８及び非特許文献９参照。）。

組織中のコラーゲン量は、合成と分解とのバランスにより規定されるが、それらは種々の細胞増殖因子、サイトカイン、低分子化合物等によって調節されている。例えば、サイトカインの１種であるＴＧＦ−βはよく知られたコラーゲン等の細胞外マトリックスの発現促進因子であるが、一方では、コラーゲンの分解を触媒する各種マトリックスメタロプロテアーゼ（以下、ＭＭＰｓと記載することもある。）の発現抑制因子でもある。具体的には、例えば、ＴＧＦ−βはヒト肺線維芽細胞のＩ、III、Ｖ型コラーゲンの産生や、ヒト胎児線維芽細胞のフィブロネクチンの産生を高める一方、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の産生を抑制する（例えば、非特許文献１０及び非特許文献１１参照。）。

また動物個体レベルにおける研究において、ＴＧＦ−βトランスジェニックマウスでは創傷治癒の促進が起こり、さらに、ＴＧＦ−β遺伝子をリウマチモデル動物に導入したところ、当該疾患が改善したことが報告されている（例えば、非特許文献１２参照。）。

以上のことから、コラーゲン合成の促進とコラーゲン分解の抑制により、コラーゲン蓄積促進及び／又は減少抑制の効果を有する低分子化合物は、非分解型コラーゲン合成促進剤として有用である可能性があり、しわ、異常創傷治癒、歯周病、骨粗しょう症、慢性関節リウマチ等の組織中のコラーゲン量の減少を伴う疾患又は組織容態を改善させることが期待できることから、当該化合物を有効成分として含有する医薬品、医薬部外品、化粧品、食品等の開発につながると考えられる。

一方、コラーゲンやラミニンなどで構成される細胞外マトリックスは、細胞を取りまくことによって細胞同士を接着させて、細胞間シグナル伝達や組織形成に大きく寄与している。癌は原発巣で増殖を開始し、その一部は周囲の細胞との接着を切断して腫瘍組織から離脱し、さらに血管壁を破り血流に乗って遠隔部位に転移する。そこで再び細胞外マトリックスを分解して組織中に浸潤する。この一連の過程を経て癌の転移がはじめて達成される。この癌転移の一連のステップに、ＭＭＰｓが重要な役割を果たしていることが強く示唆されている。つまり、癌細胞のＭＭＰｓの活性を阻害、または、その発現を抑制することができるならば、癌の転移および増殖を抑制できると考えられる。実際、ＭＭＰｓ阻害剤であるＢａｔｉｍａｓｔａｔやＭａｒｉｍａｓｔａｔは、ヌードマウス腹腔内におけるヒト卵巣癌細胞の増殖を抑制し、明確な延命効果を示している。さらに、進行癌患者を対象にした第ＩＩ相試験が行われ、患者の延命率は有意に向上したとの報告がある（例えば、非特許文献１３参照。）。したがって、コラーゲン減少抑制の効果を有する低分子化合物は、癌転移を抑制させることが期待できることから、当該化合物を有効成分として含有する抗癌剤の開発につながると考えられる。

Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９４，９９，（１９９９） Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９３，６３９，（１９７５） Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ Ｒｅｓ．，３７，１，（２００２） Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７８，１９１，（１９９９） Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，４４，２５０３，（２００１） Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９６，９７５，（１９９１） Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ．，８，１８，（１９８４） Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８６，２５１，（２００２） Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ，１５，２９１，（２００１） Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６３，１７１，（１９９０） Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９４，３６５，（１９９０） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４，５５３，（１９９７） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２，２０８７，（１９９３） 特開平８−２０８４６３号公報

このような状況下において、組織中のコラーゲン量の減少を伴う疾患又は組織容態を改善させるような薬剤の開発・提供が切望されている。

本発明者らは、かかる状況の下、鋭意検討した結果、下記の式（Ｉ）で示されるトリアジノインドールアミン化合物が、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を促進し、及び／又はＭＭＰ−１遺伝子の転写を抑制する能力を有することを見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．式（I）

（式中、Ｘは水素原子、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、ハロアルキル基、ハロアルコキシ基、ニトロ基またはアミノ基を表わし、Ｙは水素原子、アルキル基またはアラルキル基を表わし、Ｚは置換されてもよい炭素数１または２のアルキレン鎖を表わし、Ｒは置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいヘテロアリール基を表わす。）
で示されるトリアジノインドールアミン化合物（以下、本発明化合物（I）と記すこともある。）並びに本発明化合物（I）又はその薬学的に許容される塩を含有することを特徴とするコラーゲン蓄積促進及び／又は減少抑制のための組成物（以下、本発明組成物と記すこともある。）；
２．Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を促進し、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）遺伝子の転写を抑制するための、本発明化合物（I）又はその薬学的に許容される塩の使用；
３．組織中のコラーゲン量の減少を伴う疾患又は組織容態と診断されうる哺乳動物に対して、有効量の本発明化合物（I）又はその薬学的に許容される塩を投与する工程を有することを特徴とする組織中のコラーゲン量の蓄積促進及び／又は減少抑制方法（以下、本発明方法と記すこともある。）；
等を提供するものである。

本発明により、式（I）で示されるトリアジノインドールアミン化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する、コラーゲン蓄積促進及び／又は減少抑制のための組成物等が提供可能となる。

本発明化合物（I）は、下記の式（II）で示されるアミン化合物と式（III）で示されるトリアジノインドールチオン化合物、式（IV）で示されるメチルスルフィニルトリアジノインドール化合物または式（V）で示されるメチルスルホニルトリアジノインドール化合物とを縮合することにより製造することができる。

（式中、Ｘ、Ｙ、ＺおよびＲは前記と同じ意味を表わす。）

上記の縮合方法としては、例えばＪ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．，（１９８８）２５，４７５およびＡｒｃｈ.Ｐｈａｒｍ.（１９８７），３２０，１１９６等に記載された方法に準じて行うことができる。

反応に用いられる試剤の量は、式（III）で示されるトリアジノインドールチオン化合物、式（IV）で示されるメチルスルフィニルトリアジノインドール化合物または式（V）で示されるメチルスルホニルトリアジノインドール化合物１モルに対して、式（II）で示されるアミン化合物が通常１〜１００モル程度の割合である。反応温度は、通常０〜２５０℃程度の範囲であり、反応時間は通常０．１〜２４時間程度の範囲である。

反応終了後は、例えば下記の後処理操作を行うことにより、本発明化合物（I）を単離することができる。
（i）反応混合物に水、必要に応じて有機溶媒を加え、析出した本発明化合物（I）をろ取する。
（ii）反応混合物に水を加え、必要に応じて希塩酸等の酸で中和した後、有機溶媒で抽出し、有機層を乾燥、濃縮する。
単離された本発明化合物（I）は再結晶、クロマトグラフィー等によりさらに精製することもできる。

上記式（III）で示されるトリアジノインドールチオン化合物は、例えばＪ.Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ.，（１９７２），１５（３），２７７に記載された方法等に準じて得ることができる。また、上記式（IV）で示されるメチルスルフィニルトリアジノインドール化合物および式（V）で示されるメチルスルホニルトリアジノインドール化合物は、例えばヨウ化メチル等を用いて上記式（III）で示されるトリアジノインドールチオン化合物をメチル化した後、例えば３−クロロ過安息香酸等の酸化剤と反応させることにより得ることができる。

かくして得られる本発明化合物（I）において、Ｒで表わされるアリール基としては、例えばフェニル基、ナフチル基等の炭素数６〜１０のアリール基が挙げられ、ヘテロアリール基としては、ピリジル基、フリル基、チエニル基、ピロリル基、ピラゾリル基、イミダゾリル基、オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、トリアゾリル基、ピリミジニル基、ピラジニル基、ピリダジニル基、インドリル基等の炭素数２〜１０のヘテロアリール基が挙げられる。

かかるアリール基およびヘテロアリール基上に置換していてもよい置換基としては、例えばアルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、ハロアルキル基、ハロアルコキシ基、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、水酸基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アミノカルボニル基、アルキルアミノカルボニル基であり、好ましくはアルコキシ基、ハロゲン原子、ハロアルキル基、ハロアルコキシ基、アミノ基、シアノ基、水酸基が挙げられ、より好ましくは、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基が挙げられる。

アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基等の炭素数１〜６の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基が挙げられる。アルコキシ基としては、上記アルキル基と酸素原子とから構成されるものを示し、例えばメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ｎ−ブチルオキシ基、ｓｅｃ−ブチルオキシ基、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。

ハロアルキル基としては、上記アルキル基とハロゲン原子とから構成されるものを示し、例えばフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基等が挙げられる。ハロアルコキシ基としては、上記アルコキシ基とハロゲン原子とから構成されるものを示し、例えばクロロメトキシ基、フルオロメトキシ基、トリフルオロメトキシ基、クロロエトキシ基等が挙げられる。

アルコキシカルボニル基としては、上記アルコキシ基とカルボニル基とから構成されるものを示し、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ−プロピルオキシカルボニル基、イソプロピルオキシカルボニル基、ｎ−ブチルオキシカルボニル基、ｓｅｃ−ブチルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基、ｎ−ペンチルオキシカルボニル基、ｎ−ヘキシルオキシカルボニル基等が挙げられる。アルキルアミノカルボニル基は、上記アルキル基とアミノカルボニル基とから構成されるものを示し、例えばメチルアミノカルボニル基、エチルアミノカルボニル基、ｎ−プロピルアミノカルボニル基、イソプロピルアミノカルボニル基、ジメチルアミノカルボニル基、ジエチルアミノカルボニル基等が挙げられる。

かかるＲで表わされる置換されていてもよいアリール基または置換されていてもよいヘテロアリール基としては、無置換またはアルコキシ基、ハロゲン原子もしくはアミノ基で置換されたフェニル基あるいはピリジル基が好ましく用いられる。

Ｘで表わされるアルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、ハロアルキル基、ハロアルコキシ基としては、アリール基およびヘテロアリール基上に置換していてもよい置換基としてそれぞれ前記したものと同様のものが例示される。

かかるＸで表わされる置換基のうち、水素原子、アルキル基、アルコキシ基またはハロゲン原子が好ましく、さらに好ましくはこれらの置換基がトリアジノインドール環の８位に結合したものが挙げられる。

Ｙで表わされるアルキル基としては、前記したものと同様の炭素数１〜６の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基が挙げられる。アラルキル基としては、上記アルキル基とフェニル基とから構成されるものを示し、例えばベンジル基、フェネチル基等が挙げられるが、かかるＹとしては水素原子が好ましく用いられる。

Ｚで表わされる炭素数１または２のアルキレン基としては、メチレン基、エチレン基が挙げられ、かかるアルキレン基上に置換していてもよい置換基としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基等の炭素数１〜３のアルキル基などが挙げられる。

かかる本発明化合物（I）の態様としては、例えば以下の化合物が挙げられる。

式（I）において、Ｒが置換されていてもよいフェニル基であるトリアジノインドールアミン化合物；
式（I）において、Ｒが置換フェニル基であるトリアジノインドールアミン化合物；
式（I）において、Ｒがアルコキシ置換されたフェニル基であるトリアジノインドールアミン化合物；
式（I）において、Ｒがメトキシフェニル基であるトリアジノインドールアミン化合物；
式（I）において、Ｒがハロゲン置換されたフェニル基であるトリアジノインドールアミン化合物；
式（I）において、Ｒがクロロフェニル基であるトリアジノインドールアミン化合物；
式（I）において、Ｒがアミノフェニル基であるトリアジノインドールアミン化合物；
式（I）において、Ｒが無置換フェニル基であるトリアジノインドールアミン化合物；
式（I）において、Ｘが水素原子であるトリアジノインドールアミン化合物；
式（I）において、Ｘがハロゲン原子であるトリアジノインドールアミン化合物；
式（I）において、Ｘがアルコキシ基であるトリアジノインドールアミン化合物；
式（I）において、Ｘがアルキル基であるトリアジノインドールアミン化合物；
式（I）において、Ｙが水素原子であるトリアジノインドールアミン化合物；
式（I）において、Ｙがアルキル基であるトリアジノインドールアミン化合物；
式（I）において、Ｙがメチル基であるトリアジノインドールアミン化合物；
式（I）において、Ｚが炭素数１〜３のアルキル基で置換されていてもよいエチレン鎖であるトリアジノインドールアミン化合物；
式（I）において、Ｚが無置換エチレン基であるトリアジノインドールアミン化合物；
式（I）において、Ｚがメチル基で置換されたエチレン基であるトリアジノインドールアミン化合物；
式（I）において、Ｚが炭素数１〜３のアルキル基で置換されていてもよいメチレン基であるトリアジノインドールアミン化合物；
式（I）において、Ｚが無置換メチレン基であるトリアジノインドールアミン化合物；
式（I）において、Ｒが置換されていてもよいフェニル基であり、ＸおよびＹが水素原子であるトリアジノインドールアミン化合物；
式（I）において、Ｒがアルコキシ置換されたフェニル基であり、ＸおよびＹが水素原子であるトリアジノインドール化合物；
式（I）において、Ｒがハロゲン置換されたフェニル基であり、ＸおよびＹが水素原子であるトリアジノインドール化合物；
式（I）において、Ｒがアミノフェニル基であり、ＸおよびＹが水素原子であるトリアジノインドール化合物；
式（I）において、Ｒが無置換フェニル基であり、ＸおよびＹが水素原子であるトリアジノインドールアミン化合物；
式（I）において、Ｒが置換されていてもよいフェニル基であり、Ｘがアルキル基であり、Ｙが水素原子であるトリアジノインドールアミン化合物；
式（I）において、Ｒが無置換フェニル基であり、Ｘがアルキル基であり、Ｙが水素原子であるトリアジノインドールアミン化合物；
式（I）において、Ｒが置換されていてもよいフェニル基であり、Ｘがアルコキシ基であり、Ｙが水素原子であるトリアジノインドールアミン化合物；
式（I）において、Ｒがアルコキシ置換されたフェニル基であり、Ｘがアルコキシ基であり、Ｙが水素原子であるトリアジノインドール化合物；
式（I）において、Ｒが無置換フェニル基であり、Ｘがアルコキシ基であり、Ｙが水素原子であるトリアジノインドールアミン化合物；
式（I）において、Ｒが置換されていてもよいフェニル基であり、Ｘがハロゲン原子であり、Ｙが水素原子であるトリアジノインドールアミン化合物；
式（I）において、Ｒがアルコキシ置換されたフェニル基であり、Ｘがハロゲン原子であり、Ｙが水素原子であるトリアジノインドール化合物；
式（I）において、Ｒが無置換フェニル基であり、Ｘがハロゲン原子であり、Ｙが水素原子であるトリアジノインドールアミン化合物；
式（I）において、Ｒがピリジル基であり、ＸおよびＹが水素原子であるトリアジノインドールアミン化合物；
式（I）において、Ｒがピリジル基であり、Ｘがアルコキシ基であり、Ｙが水素原子であるトリアジノインドールアミン化合物；
式（I）において、Ｒがピリジル基であり、Ｘがハロゲン原子であり、Ｙが水素原子であるトリアジノインドールアミン化合物；

また、これらの化合物は、薬学的に許容される塩、例えば塩酸塩、硫酸塩等の無機酸との塩や、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、乳酸塩、酒石酸塩等の有機酸との塩にしてもよく、そのような塩への変換は、慣用手段で行うことができる。

次に本発明化合物（I）の具体例を以下の表に示す。

表１〜１５においてＰｈはフェニル基を表わす。

本発明組成物は、例えば、本発明化合物（I）を１種又は２種以上又はその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／又は、医薬品添加剤、食品添加剤若しくは化粧品添加剤等とが混合されてなる組成物等である。本発明化合物（I）又はその薬学的に許容される塩、或いは本発明組成物は、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を促進し、及び／又はＭＭＰ−１遺伝子の転写を抑制する能力を有する。当該能力は、Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現量を増加させ、及び／又はＭＭＰ−１遺伝子の発現量を減少させて、組織中のコラーゲンの蓄積促進及び／又は減少抑制の効果を導くことにより、組織中のコラーゲン量の減少を伴う疾患又は組織容態を改善するために重要であり、当該目的のための医薬品、医薬部外品、化粧品、食品等としての利用が考えられる。

本発明組成物、或いは本発明化合物（I）又はその薬学的に許容される塩の適用可能な疾患又は組織容態としては、種々の原因により組織中のコラーゲン量が減少し、その結果、臓器・組織の機能低下をもたらす疾患又は組織容態を改善するために用いることができる。例えば、加齢や紫外線等によって皮膚に生じるしわや、異常創傷治癒、歯周病、骨粗しょう症、慢性関節リウマチ、癌等の疾患をあげることができる。

用いられる薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／又は、医薬品添加剤、食品添加剤若しくは化粧品添加剤等は、前記組成物の具体的用途に応じて適宜選択することができる。また、当該組成物の形態も、具体的用途に応じて、例えば、種々の固体、液体等の形態とすることができる。

例えば、本発明組成物、或いは本発明化合物（I）又はその薬学的に許容される塩を医薬品として用いる場合には、具体的な形態として、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、シロップ剤、カプセル剤、懸濁化剤、エマルジョン剤、エキス剤及び丸剤等の経口剤、注射剤、外用液剤、軟膏剤等の経皮吸収剤（皮膚外用剤）、坐剤及び局所等への非経口剤等をあげることができる。

経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸等の担体や賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、安定化剤、保湿剤、防腐剤、酸化防止剤等の医薬品添加剤を用いて、通常の方法に従って製造することができる。

投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明組成物又は本発明化合物（I）の種類、投与形態等によって異なるが、通常は経口の場合にはヒト成人で１日あたり有効成分量として約１ｍｇ〜約２ｇ、好ましくは有効成分量として約５ｍｇ〜約１ｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。

非経口剤のうち、注射剤は、生理食塩水、滅菌水リンゲル液等の水溶性溶剤、植物油、脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖、塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、乳化剤等の医薬品添加剤を用いて、通常の方法に従って製造することができる。外用液剤、ゲル状軟膏等の経皮吸収剤、直腸内投与のための坐剤等も通常の方法に従って製造することができる。このような非経口剤を投与するには、注射（皮下、静脈内等）、経皮投与、直腸投与すればよい。局所剤は、例えば、本発明化合物（I）をエチレンビニル酢酸ポリマー等の徐放性ポリマーのペレットに取り込ませて製造することができる。このペレットを治療すべき組織中に外科的に移植すればよい。

投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明組成物又は本発明化合物（I）の種類、投与形態等によって異なるが、通常は注射の場合にはヒト成人で有効成分量として約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。

本発明組成物又は本発明化合物（I）を化粧品として用いる場合には、具体的な形態としては、例えば、クリーム、ローション剤等をあげることができる。ローション剤は、例えば、懸濁剤、乳化剤、保存剤等の化粧品添加剤を用いて、通常の方法に従って製造することができる。

投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明組成物又は本発明化合物（I）の種類、投与形態等によって異なるが、通常ヒト成人で有効成分量として約０．０１ｍｇ〜約５０ｍｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。

本発明組成物、或いは本発明化合物（I）又はその薬学的に許容される塩を食品として用いる場合には、具体的な形態としては、例えば、粉末、錠剤、飲料、摂取可能なゲル若しくはシロップとの混合液状物、例えば、調味料、和菓子、洋菓子、氷菓、飲料、スプレッド、ペースト、漬物、ビン缶詰、畜肉加工品、魚肉・水産加工品、乳・卵加工品、野菜加工品、果実加工品、穀類加工品等の一般的な飲食物や嗜好物等として用いられる可能性がある。また、家畜、家禽、蜜蜂、蚕、魚等の飼育動物のための飼料や餌料への食品添加物等として用いられる可能性もある。

投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明組成物、或いは本発明化合物（I）又はその薬学的に許容される塩の種類、投与形態等によって異なるが、通常ヒト成人で有効成分量として約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇを投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回または数回に分けて投与することができる。

以下、本発明を製造例、製剤例及び試験例等によりさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの例のみに限定されるものではない。
まず、本発明化合物（I）の製造中間体の製造について参考製造例を示す。

参考製造例 １
１Ｈ−インドール−２，３−ジオン４．４１ｇ、チオセミカルバジド３．０１ｇ、炭酸カリウム６．２２ｇ、水１５０ｍｌの混合物を３．５時間加熱還流した。反応液を室温まで冷却後、酢酸９０ｍｌを滴下した。析出した結晶を吸引ろ過し、水で洗浄後、減圧下乾燥して、２，５−ジヒドロ−３Ｈ−１，２，４−トリアジノ[５，６−ｂ]インドール−３−チオン４．８４ｇを得た。
収率：８０％
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯｄ_６，ＴＭＳ）δ（ｐｐｍ）：
１４．４５（１Ｈ，ｂｒｓ）、１２．６８（１Ｈ，ｂｒｓ）、
８．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）、７．６４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）、
７．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ）、７．３５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）

参考製造例 ２
２，５−ジヒドロ−３Ｈ−１，２，４−トリアジノ[５，６−ｂ]インドール−３−チオン０．５０ｇを１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液３ｍｌに溶解し、ヨウ化メチル０．３９ｇを室温にて滴下した。室温にて１時間撹拌後、析出した結晶をろ過、水で洗浄し、減圧下乾燥して、３−（メチルチオ）−２Ｈ−１，２，４−トリアジノ[５，６−ｂ]インドール ０．３５ｇを得た。
収率：６５％
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯｄ_６，ＴＭＳ）δ（ｐｐｍ）：
１１．９６（１Ｈ，ｂｒｓ）、８．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ）、
７．６９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．０Ｈｚ）、７．５８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ）、
７．４３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．０Ｈｚ）、２．６６（３Ｈ，ｓ）

参考製造例 ３
３−（メチルチオ）−２Ｈ−１，２，４−トリアジノ[５，６−ｂ]インドール１．３６ｇをクロロホルム１５ｍｌに懸濁させ氷水冷下、３−クロロ過安息香酸１．７ｇを添加し、３時間撹拌した。反応懸濁液に１０％亜硫酸水素ナトリウム水溶液３０ｍｌを加えて１５分間撹拌した。反応液をろ過し、水で洗浄後、減圧下乾燥して、３−（メチルスルフィニル）−２Ｈ−１，２，４−トリアジノ[５，６−ｂ]インドール１．２９ｇを得た。
収率：８８％
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯｄ_６，ＴＭＳ）δ（ｐｐｍ）：
１３．１１（１Ｈ，ｂｒｓ）、８．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６）、
７．８３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）、７．７１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ）、
７．５３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）、３．０１（３Ｈ，ｓ）

参考製造例 ４
３−（メチルスルフィニル）−２Ｈ−１，２，４−トリアジノ[５，６−ｂ]インドール０．３０ｇをクロロホルム５ｍｌに懸濁させ、室温にて、３−クロロ過安息香酸０．２７ｇを添加した。室温で３時間撹拌後、１０％亜硫酸水素ナトリウム水溶液５ｍｌを加えて１５分間撹拌した。クロロホルム層を分液後、水層を５％塩酸水でｐＨ２〜３に調整し、析出した結晶をろ取、水で洗浄した。得られた結晶を、加熱減圧下、乾燥および、３−クロロ安息香酸を昇華させて除き、３−（メチルスルホニル）−２Ｈ−１，２，４−トリアジノ[５，６−ｂ]インドール０．２７ｇを得た。
収率：８４％
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯｄ_６，ＴＭＳ）δ（ｐｐｍ）：
１３．４３（１Ｈ，ｂｒｓ）、８．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）、
７．８６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ）、７．７４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）、
７．５６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）、３．５５（３Ｈ，ｓ）

次に、本発明化合物（I）の製造例を示す

製造例 １
２，５−ジヒドロ−３Ｈ−１，２，４−トリアジノ［５，６−ｂ］インドール−３−チオン１１０ｍｇと２−フェニルエチルアミン３ｍｌとを混合し、１７０℃で８時間加熱した。反応物を室温まで冷却後、氷水へ注加、攪拌した。析出した結晶をろ取し、水、ついでｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルで洗浄後、減圧下乾燥して、Ｎ−(２−フェニルエチル)−５Ｈ−１，２，４−トリアジノ[５，６−ｂ]インドールー３−アミン（本発明化合物１）９０ｍｇを得た。
収率：５８％
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯｄ_６，ＴＭＳ）δ（ｐｐｍ）：
１１．８９（１Ｈ，ｂｒｓ）、８．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）、
７．６５（１Ｈ，ｂｒｓ）、７．５０〜７．１９（８Ｈ，ｍ）、３．６１（２Ｈ）、
２．９３（２Ｈ，ｔ，７．６Ｈｚ）

製造例 ２
３−（メチルスルフィニル）−２Ｈ−１，２，４−トリアジノ[５，６−ｂ]インドール１００ｍｇとα−メチル−３，４−ジメトキシフェネチルアミン３ｍｌとを混合し、１７０℃で５．５時間加熱した。反応物を室温まで冷却後、水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーに付し、Ｎ−[１−メチル−２−（３，４−ジメトキシフェニル）エチル]−５Ｈ−１，２，４−トリアジノ[５，６−ｂ]インドールー３−アミン（本発明化合物１０１）８９ｍｇを得た。
収率：５７％
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯｄ_６，ＴＭＳ）δ（ｐｐｍ）：
１１．８４（１Ｈ，ｂｒｓ）、８．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）、
７．５０〜７．３８（２Ｈ，ｍ）、７．４７（１Ｈ，ｂｒｓ）、
７．２７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）、６．８７〜６．７７（３Ｈ，ｍ）、
４．２６（１Ｈ）、３．７２（３Ｈ，ｓ）、３．６８（３Ｈ，ｓ）、
２．９５〜２．６４（２Ｈ，ｍ）、１．１９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）

製造例 ３
３−（メチルスルホニル）−２Ｈ−１，２，４−トリアジノ[５，６−ｂ]インドール１００ｍｇとＮ−メチル−フェネチルアミン２ｍｌとを混合し、１４０℃で２時間加熱した。反応液を室温まで冷却後、水を加え、結晶をろ過した。水、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルで洗浄後、減圧下乾燥して、Ｎ−メチル−(２−フェニルエチル)−５Ｈ−１，２，４−トリアジノ[５，６−ｂ]インドール−３−アミン（本発明化合物２２）７４ｍｇを得た。
収率：６１％
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯｄ_６，ＴＭＳ）δ（ｐｐｍ）：
１１．９０（１Ｈ，ｂｒｓ）、８．１０（１Ｈ，ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）、
７．５２〜７．１８（８Ｈ，ｍ）、３．９６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）、
３．１８（３Ｈ，ｓ）、２．９５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）

次に、これらの方法に準じて製造した式（I）の化合物の物性を表１６〜２３に示す。

次に、本発明化合物（I）がＩ型コラーゲン遺伝子の転写を促進し、及び／又はＭＭＰ−１遺伝子の転写を抑制する能力を有することを試験例で示す。

試験例１（レポーター遺伝子の発現量を指標とした本発明化合物（Ｉ）が有するＩ型コラーゲン遺伝子の転写調節能力の測定）
１）ヒトＩ型コラーゲン遺伝子のプロモーターとルシフェラーゼレポーター遺伝子を有するプラスミドの調製）
正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、カタログ番号ＣＣ−２５０９）１ｘ１０^８細胞を３７℃、５％ ＣＯ₂雰囲気下で一晩培養した。培養された細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ ３ｍｌを加えセルスクレイパー（Ｎａｌｇｅｎ、カタログ番号１７９６９３）を用いて細胞を器壁から剥がした。剥がした細胞を遠心分離（１，５００ｒｐｍ、４℃、１５分間）により集め、これをＰＢＳ ２０ｍｌに懸濁して再度遠心分離した。得られた沈殿に、ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カタログ番号２００６００）のＳｏｌｕｔｉｏｎ２を１１ｍｌ、ｐｒｏｎａｓｅを４．８μｌそれぞれ加えて６０℃にて１時間振とうした後、得られた混合液を氷中に１０分間放置した。次に、当該混合液に上記キットのＳｏｌｕｔｉｏｎ ３を４ｍｌ加えて混合した後、これを氷中に５分間放置した。遠心分離（３，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）し、上清を回収した。回収された上清に、当該上清１ｍｌ当たり２μｌのＲＮａｓｅを加え、３７℃で１５分間放置した。この混合液に、２倍容量のエタノールを加えて混合し、出現した白い糸状の物質（ゲノムＤＮＡ）を回収した。回収されたゲノムＤＮＡを７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。風乾されたゲノムＤＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）（以下、ＴＥと記す。）５００μｌに溶解した。
得られたゲノムＤＮＡ溶解液（ゲノムＤＮＡ １μｇ相当量）と、配列番号１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（各１０ｐｍｏｌ／μｌ）を各１μｌ、蒸留水 ２９μｌ、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造社、カタログ番号ＲＲ００２Ａ）に添付されたｂｕｆｆｅｒ ５μｌ、Ｍｇ^２＋溶液 ５μｌ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ５μｌ及びＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造社、カタログ番号ＲＲ００２Ａ）０．５μｌを混合した。得られた混合液を９４℃、５分間保温した後、９４℃、１分間次いで６０℃、１分間さらに７２℃、１分間の保温を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。当該混合液を１％アガロースゲル電気泳動に供し、約３．５ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡ溶液に等容量のフェノールを加えて激しく混和した後に、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）した。次に、ＤＮＡ溶液中に溶解しているフェノールを除去するために、回収された上清に等容量のクロロホルムを加えて激しく混和し、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）した（以下、当該操作をフェノール・クロロホルム処理と記す。）。回収された上清をエタノール沈殿することにより、ＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡを超純水に溶解し、この溶解液にＮｈｅＩ ２．５μｌ及びＨｉｎｄIII ２．５μｌを加え、３７℃で３時間保温した。次いで、当該溶解液を１％アガロースゲル電気泳動に供し、約３．５ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをエタノール沈殿することにより再びＤＮＡ（以下、コラーゲンプロモーターＤＮＡと記す。）を回収した。
一方、ホタルルシフェラーゼをコードする塩基配列を有するベクターｐＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ社、カタログ番号Ｅ１７５１）をＮｈｅＩ及びＨｉｎｄIIIで消化した後、上記と同様にアガロースゲル電気泳動に供し、約５ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをエタノール沈殿することにより再びＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡに蒸留水４４μｌ、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造、カタログ番号２１２０Ａ）に添付されたＢｕｆｆｅｒ５μｌ及びＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社、カタログ番号２１２０Ａ）１μｌを加えて、この混合液を６５℃で３０分間保温した。次に、当該混合液をフェノール・クロロホルム処理した後、エタノール沈澱することによりＤＮＡ（以下、ＬｕｃベクターＤＮＡと記す。）を回収した。次いで、上記コラーゲンプロモーターＤＮＡ約２０ｎｇとＬｕｃベクターＤＮＡ 約２０ｎｇとを混合した後、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ２酵素溶液を同量添加して１６℃で一昼夜保温した。当該混合液に大腸菌５Ｈｄα（ＴＯＹＯＢＯ社、カタログ番号ＤＮＡ−９０３）を加えて氷中に３０分間放置し、次いで４２℃、４５秒間保温した後、得られた大腸菌を５０μｇ／ｍｌ アンピシリンナトリウム（ナカライテスク社、カタログ番号０２７−３９）を含むＬＢプレートに播種し、３７℃、一昼夜放置した。出現したシングルコロニーを５０μｇ／ｍｌ アンピシリンを含むＬＢ培地２ｍｌで３７℃、１２時間培養した。得られた培養液からＡＵＴＯＭＡＴＩＣ ＤＮＡ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ ＰＩ−５０（ＫＵＲＡＢＯ社）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。調製されたプラスミドＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシークエンサーで分析した。その結果、当該プラスミド（以下、ＣＯＬ−Ｌｕｃと記す。）は、ヒトＩ型コラーゲンα２鎖遺伝子の転写調節領域の−３５００〜＋５７（転写開始点を＋１とする。）の塩基配列の下流に、ホタルルシフェラーゼをコードする塩基配列が接続されてなる塩基配列を保有していることが確認された。

２）レポーター遺伝子の発現量の測定
正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞 １ｘ１０⁶細胞を１００ｍｍディッシュに播種し、非働化牛胎児血清（以下、ＦＢＳと記す。Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号２１１４０−０７９）を１０（ｖ／ｖ）％含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ−ＭＥＭ（日水製薬社、カタログ番号０５９１９）培地（以下、当該培地をＤ−ＭＥＭ（＋）と記す。）中で３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下において一晩培養した。次いで培地を、ＦＢＳを含まないＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ−ＭＥＭ培地（以下、当該培地をＤ−ＭＥＭ（−）と記す。）に置換した。
Ｄ−ＭＥＭ（−）３００μｌに、ＣＯＬ−Ｌｕｃ ５μｇ及びｐＣＭＶ−β−ｇａｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号１０５８６−０１４）５μｇを加え、得られた混合液を室温で５分間放置した（溶液１）。また、Ｄ−ＭＥＭ（−）３００μｌにＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号１８２９２−０１１）２０μｌを加え、得られた混合液を室温で４５分間放置した（溶液２）。次に、溶液１と溶液２とを混合し、これを室温で１０分間放置した後、当該混合液にＤ−ＭＥＭ（−）５．４ｍｌを加えて混合した。当該混合液を前記正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞に添加した後、当該細胞を３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で培養した。６時間後、ディッシュから培養上清を除き、細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、０．２５％トリプシンを含むＰＢＳ １ｍｌを添加して細胞を剥がした。当該細胞にＤ−ＭＥＭ（＋）を加えてよく混合した後、当該細胞懸濁液を１２ウエルプレートに１ｍｌずつ分注し、これを３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で終夜培養した。翌日、各ウエルをＤ−ＭＥＭ（−）で２回洗浄した後、０．１％ ＦＢＳを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ−ＭＥＭ培地（以下、当該培地をＤ−ＭＥＭ（０．１％）と記す。）１ｍｌに培地交換した。
このようにして培養された細胞に、本発明化合物（I）をそれぞれ１００μMとなるように、Ｄ−ＭＥＭ（０．１％）で希釈した１０％ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯと記す。）で溶解し、細胞に１０μｌ添加した（最終濃度は１μM）。コントロールとしては、１０％ＤＭＳＯを１０μｌ添加した。また、陽性対照として、ＴＧＦ−β（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ社）を最終濃度５ｎｇ／ｍｌになるよう添加した。当該細胞を３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下でさらに４０時間培養した。培養された細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、これに細胞溶解剤（東洋インキ社、カタログ番号ＰＤ１０）２００μｌを加え細胞を剥がした。得られた細胞懸濁液を回収した後、この細胞懸濁液を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）することにより、上清を回収した。回収された上清各５０μｌを９６ウエルプレートに移した後、ＭＩＣＲＯＬＵＭＡＴ ＬＢ９６Ｐ（ＥＧ＆Ｇ ＢＥＲＴＨＯＬＤ社製）を用いて、Ｌｕｃアッセイ溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ（ｐＨ７．８）、２．６７ｍＭ ＭｇＳＯ_４、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、３３．３ｍＭ ＤＴＴ、２７０μＭ Ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ、５３０μＭＡＴＰ、４７０μＭ Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）５０μｌを当該プレートに自動分注した後、各ウエル内の発光量を測定した（Ｄｅｌａｙ：１．６秒、Ｍｅａｓ．Ｉｎｔｅｒｖａｌ：２０秒）。
一方、回収された上清または細胞溶解剤５０μｌを、予め９６ウエルプレートに分注されたβ−ｇａｌ基質溶液（５．８ｍＭ ｏ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、４５ｍＭ ２−メルカプトエタノール）５０μｌに加えて３７℃、２時間インキュベートした後に、マイクロプレートリーダーを用いて各ウエル内の４２０ｎｍの吸光度を測定した。得られた値を基にし、次式に従って転写活性を算出した。
転写活性＝［発光量（上清添加区）−発光量（細胞溶解剤添加区）］／［４２０ｎｍ吸光度（上清添加区）−４２０ｎｍ吸光度（細胞溶解剤添加区）］

算出された転写活性を基にしてコントロールに対する本発明化合物（I）のＩ型コラーゲン遺伝子の転写促進能力を以下３段階に定義し、結果を表２４に示す。
コントロールの発現量を１００、陽性対照の発現量を１０００とした場合のＩ型コラーゲン遺伝子の発現量（補正ベースの相対値）が
＋＋＋：１５０以上を示した化合物
＋＋ ：１２０以上１５０未満の化合物
＋ ：１００以上１２０未満の化合物

本発明化合物（I）のＩ型コラーゲン遺伝子のレポーター活性は表２４のとおりであり、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を促進する能力が確認された。

試験例２（Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現量及びＭＭＰ−１遺伝子の発現量を指標とした、本発明化合物（I）が有するコラーゲンの蓄積促進及び／又は減少抑制の効果測定）
正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞を１２ウエルプレートに１ウエルあたり５ｘ１０^４個播き、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で一晩培養した。細胞をＤ−ＭＥＭ（−）で洗浄し、Ｄ−ＭＥＭ（０．１％）１ｍｌに培地交換して本発明化合物（Ｉ）を最終濃度１μＭとなるように添加した。コントロールとしては、１０％ＤＭＳＯを１０μｌ添加した。また、陽性対照として、ＴＧＦ−βを最終濃度５ｎｇ／ｍｌになるよう添加した。
３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で２日間培養した後、細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号７４１０６）を用い、全ＲＮＡ（約３０μｌ）を抽出した。抽出された全ＲＮＡ ５μｌ（５０ｎｇ）に、２０μＭオリゴｄＴ １μｌ及びＲＮａｓｅフリー蒸留水４μｌを加えて６５℃、５分間インキュベートした直後に氷冷した。当該溶液１０μｌに、５ｘバッファー４μｌ、ＭｇＣｌ_２ ２．４μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ、ＲＮａｓｉｎ １μｌ、ＩｍｐｒｏｍII １μｌ、ＲＮａｓｅフリー蒸留水０．６μｌ（以上全てＰｒｏｍｅｇａ社）を加えて２５℃で５分間、４２℃で１時間、７０℃で１５分間の条件で逆転写反応した。逆転写反応溶液５μｌに、配列番号３、４で示される各１０ｐｍｏｌ／μｌプライマー１．５μｌ、配列番号５で示されるＩ型コラーゲン検出用プローブ（FAM-ctactggcga aacctgtatc cgggc-TAMRA）（アプライドバイオシステム社）１．２５μｌ、ＧＡＰＤＨ検出用プローブ（アプライドバイオシステム社、カタログ番号４３１０８８４Ｅ）１．２５μｌ、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステム社） １２．５μｌ及び滅菌水 ２μｌをＯｐｔｉｃａｌ ９６−Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ（アプライドバイオシステム社、カタログ番号Ｎ８０１−０５６０）のウエル中で混合した。上記と同様に、配列番号６、７で示されるプライマー及び配列番号８で示されるＭＭＰ−１検出用プローブ（FAM-ctactggcga aacctgtatc cgggc-TAMRA）（アプライドバイオシステム社）を添加した反応液を別々のウエル中で混合した。スタンダードとしては逆転写反応溶液５μｌの代わりに、予め調製した正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞ｃＤＮＡ ５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６２５ｎｇ／μｌ 各５μｌを用いた。その後、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ７９００（アプライドバイオシステム社）を用いて５０℃で５分間の１サイクル、９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の４０サイクルの条件でＰＣＲ反応した。定量はスタンダード直線を作成した後、各サンプルのＩ型コラーゲン量、ＭＭＰ−１量及びＧＡＰＤＨ量を算出し、次式に従ってＩ型コラーゲン遺伝子の発現量（即ち、転写量）及びＭＭＰ−１遺伝子の発現量（即ち、転写量）を算出した。
Ｉ型コラーゲン遺伝子の発現量（補正値）＝測定されたＩ型コラーゲン遺伝子の発現量／ＧＡＰＤＨ量
ＭＭＰ−１遺伝子の発現量（補正値）＝測定されたＭＭＰ−１遺伝子の発現量／ＧＡＰＤＨ量

算出されたI型コラーゲン遺伝子の発現量およびＭＭＰ−１遺伝子の発現量を基に、各々の発現量を以下３段階に定義し、結果を表２５に示す。
コントロールの発現量をいずれも１００とした場合、
I型コラーゲン遺伝子の発現量が、
＋＋＋：１４０以上を示した化合物
＋＋ ：１２０以上１４０未満の化合物
＋ ：１００以上１２０未満の化合物
− ：１００未満の化合物
ＭＭＰ−１遺伝子の発現量が
＋＋＋：５０以下の化合物
＋＋ ：８０以下５０を越える化合物
＋ ：１００以下８０を越える化合物
― ：１００を超える化合物

本発明化合物（I）のＩ型コラーゲン遺伝子及びＭＭＰ−１遺伝子の発現量は表２５のとおりであり、Ｉ型コラーゲン遺伝子の転写を促進し、及び／又はＭＭＰ−１遺伝子の転写を抑制する能力が確認された。

試験例３（非分解Ｉ型コラーゲンのタンパク量を指標とした、本発明化合物（I）が有するコラーゲンの蓄積促進及び／又は減少抑制の効果測定）
試験例２記載の培養上清５０μｌに、２５ｍＭ酢酸ｐ−アミノフェニル水銀（アマシャムファルマシア社、カタログ番号ＲＰＮ２６２９）１μｌを添加し、３７℃、１時間インキュベートした。得られた反応液１０μｌを１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ＰＶＤＦ膜に転写（２５０ｍＡ、９０分間）した。タンパク質が転写されたＰＶＤＦ膜を５％スキムミルク溶液中で振とうさせながら３０分間インキュベートした後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液（以下、ＰＢＳ−Ｔと記す。）で洗浄し、１０００倍希釈したウサギ抗Ｉ型コラーゲン抗体（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社、カタログ番号２３７０６）を加えて室温、１時間インキュベートした。次に、ＰＢＳ−Ｔで３回、各１０分間振とうさせながら洗浄した後、１０００倍希釈したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体−ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社、カタログ番号ｓｃ−２００４）を加えて室温、１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャムファルマシア社、カタログ番号ＲＰＮ２１０６）を加え、ルミノ・イメージアナライザーＬＡＳ−１０００ｐｌｕｓ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社）を用いて約２００ｋＤａ及び１５０ｋＤａ部分の発光を検出し、Ｉｍａｇｅ Ｇａｕｇｅ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社）を用いて定量した。得られた値を非分解Ｉ型コラーゲンのタンパク量とした。
次に、当該ＰＶＤＦ膜をＰＢＳ−Ｔで洗浄した後に、２ＭグリシンーＨＣｌ溶液（ｐＨ２．８）で室温、１時間インキュベートして抗体を剥がした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、再度５％スキムミルク溶液でブロッキングした後に、１０００倍希釈したウサギ抗牛血清アルブミン抗体−ＨＲＰ（Ｃａｐｅｌ社、カタログ番号５５２８５）を加えて室温、１時間インキュベートした。その後に、上記と同様にしてＩｍａｇｅ Ｇａｕｇｅを用いて牛血清アルブミンのバンドに相当する約６０ｋＤａ部分の発光を定量した。次式に従って非分解型Ｉ型コラーゲンタンパク量を算出した。
非分解型Ｉ型コラーゲンタンパク量（補正値）＝測定された非分解Ｉ型コラーゲンタンパク量／牛血清アルブミンタンパク量

算出されたタンパク量を基にしてコントロールに対する本発明化合物(I)の非分解型Ｉ型コラーゲンタンパク量を以下３段階に定義し、結果を表２６に示す。
コントロールのタンパク量を１００とした場合の非分解型Ｉ型コラーゲンタンパク量（補正値）が
＋＋＋：２００以上を示した化合物
＋＋ ：１５０以上２００未満を示した化合物
＋ ：１００以上１５０未満を示した化合物
− ：１００未満の化合物

本発明化合物（I）の非分解Ｉ型コラーゲンのタンパク量は表２６のとおりであり、コラーゲンの蓄積促進能力が確認された。

試験例４（レポーター遺伝子の発現量を指標とした、本発明化合物（I）が有する細胞内シグナル伝達経路の活性化能力の測定）
１）Ｓｍａｄ３のＤＮＡ結合配列とルシフェラーゼレポーター遺伝子を有するプラスミドの調製）
配列番号９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号１０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（各１０ｐｍｏｌ／μｌ）を各２０μｌずつ混合し、ヒートブロック中で１００℃、５分間保温した後に、そのまま室温まで冷却した（以下、Ｓｍａｄ３の結合配列（ＳＢＥ）を含むＤＮＡと記す。）。
一方、ホタルルシフェラーゼをコードする塩基配列を有するｐＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ社、カタログ番号Ｅ１７５１）にＴＡＴＡ配列を付加したベクターを、ＮｈｅＩ及びＸｈｏIで消化した後、アガロースゲル電気泳動に供し、約５ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをエタノール沈殿することにより再びＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡに蒸留水４４μｌ、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造、カタログ番号２１２０Ａ）に添付されたＢｕｆｆｅｒ５μｌ及びＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社、カタログ番号２１２０Ａ）１μｌを加えて、この混合液を６５℃で３０分間保温した。次に、当該混合液をフェノール・クロロホルム処理した後、エタノール沈澱することによりＤＮＡ（以下、ＬｕｃベクターＤＮＡと記す。）を回収した。次いで、上記ＳＢＥを含むＤＮＡ５μｌとＬｕｃベクターＤＮＡ約２０ｎｇとを混合した後、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ２酵素溶液を同量添加して１６℃で一昼夜保温した。当該混合液に大腸菌５Ｈｄα（ＴＯＹＯＢＯ社、カタログ番号ＤＮＡ−９０３）を加えて氷中に３０分間放置し、次いで４２℃、４５秒間保温した後、得られた大腸菌を５０μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウム（ナカライテスク社、カタログ番号０２７−３９）を含むＬＢプレートに播種し、３７℃、一昼夜放置した。出現したシングルコロニーを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地２ｍｌで３７℃、１２時間培養した。得られた培養液からＡＵＴＯＭＡＴＩＣ ＤＮＡ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ ＰＩ−５０（ＫＵＲＡＢＯ社）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。調製されたプラスミドＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシークエンサーで分析した。その結果、当該プラスミド（以下、ＳＢＥ−ＴＡＴＡ−Ｌｕｃと記す。）は、Ｓｍａｄ３の結合配列の下流に、ＴＡＴＡ配列とホタルルシフェラーゼをコードする塩基配列が接続されてなる塩基配列を保有していることが確認された。

２）レポーター遺伝子の発現量の測定
正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞 ５ｘ１０^５細胞を６０ｍｍディッシュに播種し、Ｄ−ＭＥＭ（＋）中で３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下において一晩培養した。次いで培地を、Ｄ−ＭＥＭ（−）２ｍｌに置換した。
Ｄ−ＭＥＭ（−）１００μｌに、ＳＢＥ−ＴＡＴＡ−Ｌｕｃ２μｇ及びｐＣＭＶ−β−ｇａｌ２μｇを加え、得られた混合液を室温で５分間放置した（溶液１）。また、Ｄ−ＭＥＭ（−）１００μｌにＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎｅ８μｌを加え、得られた混合液を室温で４５分間放置した（溶液２）。次に、溶液１と溶液２とを混合し、これを室温で１０分間放置した後、当該混合液を前記正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞に添加した後、当該細胞を３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で培養した。６時間後、ディッシュから培養上清を除き、細胞をＤ−ＭＥＭ（−）で２回洗浄した後、Ｄ−ＭＥＭ（０．１％）４ｍｌを加えて１時間培養した。
このようにして培養された細胞に、化合物２５１のＤＭＳＯ溶液を４μｌ添加した。コントロールとしては、ＤＭＳＯを４μｌ、Ｄ−ＭＥＭ（０．１％）を４μｌ添加した。当該細胞を３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下でさらに４０時間培養した後に、ＰＢＳで２回洗浄し、これに細胞溶解剤１５０μｌを加え細胞を剥がした。得られた細胞懸濁液を回収した後、この細胞懸濁液を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）することにより、上清を回収した。回収された上清各１５μｌを９６ウエルプレートに移した後、ＭＩＣＲＯＬＵＭＡＴ ＬＢ９６Ｐ（ＥＧ＆Ｇ ＢＥＲＴＨＯＬＤ社製）を用いて、Ｌｕｃアッセイ溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ（ｐＨ７．８）、２．６７ｍＭ ＭｇＳＯ_４、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、３３．３ｍＭ ＤＴＴ、２７０μＭ Ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ、５３０μＭＡＴＰ、４７０μＭ Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）５０μｌを当該プレートに自動分注した後、各ウエル内の発光量を測定した（Ｄｅｌａｙ：１．６秒、Ｍｅａｓ．Ｉｎｔｅｒｖａｌ：２０秒）。
一方、回収された上清または細胞溶解剤５０μｌを、予め９６ウエルプレートに分注されたβ−ｇａｌ基質溶液（５．８ｍＭ ｏ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、４５ｍＭ ２−メルカプトエタノール）５０μｌに加えて３７℃、２時間インキュベートした後に、マイクロプレートリーダーを用いて各ウエル内の４２０ｎｍの吸光度を測定した。得られた値を基にし、次式に従って転写活性を算出した。
転写活性＝［発光量（上清添加区）−発光量（細胞溶解剤添加区）］／［４２０ｎｍ吸光度（上清添加区）−４２０ｎｍ吸光度（細胞溶解剤添加区）］

算出された転写活性を基にしてコントロールを１００％として、表２７に示す。

化合物２５１のＳＢＥレポーター活性は表２７のとおりであり、単独でＳｍａｄ３を介して転写を促進する能力が確認された。

試験例５（核内のＳｍａｄ３量を指標とした、本発明化合物（I）が有する細胞内シグナル伝達経路の活性化能力の測定）
正常ヒト胎児皮膚線維芽細胞 ２ｘ１０^４細胞を８ウエルカルチャースライド（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カタログ番号ＲＥＦ３５４１０８）に播種し、Ｄ−ＭＥＭ（＋）中で３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下において一晩培養した。次いで培地を、Ｄ−ＭＥＭ（０．１％） ０．４ｍｌに置換して１時間培養した。その後に、化合物２５１を含むＤ−ＭＥＭ（０．１％）と置換して２時間培養した。コントロールとしては、ＤＭＳＯを ０．１％含むＤ−ＭＥＭ（０．１％）を加えた。また、陽性対照として、ＴＧＦ−β溶液（５ｎｇ／ｍｌ）を加えた。陽性対照としては、次に、冷ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、冷メタノール ０．４ｍｌを加えて−３０℃、２０分間固定した後に、冷ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、冷ＰＢＳ（−）で２５倍希釈したウサギ抗Ｓｍａｄ３抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社、カタログ番号ｓｃ−８３３２）を０．４ｍｌ加え、４℃、１時間放置した。次に、冷ＰＢＳ（−）で３回洗浄した後に、冷ＰＢＳ（−）で５０倍希釈したヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社、カタログ番号ｓｃ−２０１２）を０．４ｍｌ加え、遮光して４℃、１時間放置した。その後に、冷ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、蛍光顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ社製、ＩＸ７０）観察をおこなった。

１００個の細胞を観察し、核内のみに蛍光が認められた細胞の割合を表２８に示す。

化合物２５１のＳｍａｄ３の核内移行促進活性は表２８のとおりであり、Ｓｍａｄ３の核内移行を用量依存的に促進する能力が確認された。

コラーゲン蓄積促進及び／又は減少抑制の効果を有する本発明化合物（I）又はその医薬的に許容される塩は、しわ、異常創傷治癒、歯周病、骨粗しょう症、慢性関節リウマチ等の組織中のコラーゲン量の減少を伴う疾患又は組織容態を改善させることが期待できることから、これを有効成分として含有する医薬品、医薬部外品、化粧品、食品等の開発につながる可能性がある。また、本発明化合物（I）又はその医薬的に許容される塩のうち、コラーゲン減少抑制の効果を有するものは、癌転移を抑制させることが期待できることから、これを有効成分として含有する抗癌剤の開発につながる可能性もある。

配列番号１
コラーゲンプロモーターＤＮＡを増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２
コラーゲンプロモーターＤＮＡを増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３
Ｉ型コラーゲン ＤＮＡを検出するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４
Ｉ型コラーゲン ＤＮＡを検出するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５
Ｉ型コラーゲン ＤＮＡを検出するために設計されたオリゴヌクレオチドプローブ
配列番号６
ＭＭＰ−１ ＤＮＡを検出するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７
ＭＭＰ−１ ＤＮＡを検出するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８
ＭＭＰ−１ ＤＮＡを検出するために設計されたオリゴヌクレオチドプローブ
配列番号９
Ｓｍａｄ３のＤＮＡ結合配列を含むレポータープラスミドを作製するために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１０
Ｓｍａｄ３のＤＮＡ結合配列を含むレポータープラスミドを作製するために設計されたオリゴヌクレオチド

Claims (5)

1. 式（I）
   

   

   （式中、Ｘは水素原子、アルキル基、アルコキシ基またはハロゲン原子を表わし、Ｙは水素原子、アルキル基またはアラルキル基を表わし、Ｚは炭素数１〜３のアルキル基で置換されていてもよい炭素数１または２のアルキレン鎖を表わし、Ｒはピリジル基、または、アルコキシ基、ハロゲン原子もしくはアミノ基で置換されたフェニル基を表わす。）
   で示されるトリアジノインドールアミン化合物。
2. 式（I）において、Ｒはアルコキシ基で置換されたフェニル基であり、Ｘは水素原子、アルコキシ基またはハロゲン原子である請求項１に記載のトリアジノインドールアミン化合物。
3. 式（I）において、Ｒはハロゲン原子で置換されたフェニル基であり、Ｘは水素原子である請求項１に記載のトリアジノインドールアミン化合物。
4. 式（I）において、Ｒはアミノ基で置換されたフェニル基であり、Ｘは水素原子である請求項１に記載のトリアジノインドールアミン化合物。
5. 式（I）において、Ｒはピリジル基であり、Ｘは水素原子、アルコキシ基またはハロゲン原子である請求項１に記載のトリアジノインドールアミン化合物。