WO2007145253A1

WO2007145253A1 - ＮＦ－κＢ活性化阻害剤

Info

Publication number: WO2007145253A1
Application number: PCT/JP2007/061917
Authority: WO
Inventors: Hideki Ushio; Reiko Nagasaka; Kazuyuki Ohhara; Hiroshi Ozaki; Masatoshi Hori
Original assignee: Tokyo University Of Marine Science And Technology; The University Of Tokyo
Priority date: 2006-06-14
Filing date: 2007-06-13
Publication date: 2007-12-21
Also published as: US20090326259A1; JP2007332070A

Abstract

炎症や２型糖尿病などのNF―κB活性化に関係する疾患の予防および治療に使用することができる安全性の高いＮＦ－κＢ活性化阻害剤を安価に提供する。下記化１の化学構造式（該式中、Ｒ１はヒドロキシ基を示し、Ｒ２はヒドロキシ基、メトキシ基あるいはアルコキシ基を示し、Ｒ３はトリテルペンからなるエステルおよびその塩類を表す。）で表される化合物またはその塩類を有効成分とするＮＦ－κＢ活性化阻害剤。代表的な化合物としてはヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステルを挙げることができる。【化１】

Description

明細書

NF_ /c B活性化阻害剤

技術分野

[0001] 本発明は、炎症、 2型糖尿病などの疾患の予防や治療に使用することができる NF

- κ B活性ィ匕阻害剤に関するものである。

背景技術

[0002] 遺伝子の発現は、転写調節因子という DNA結合タンパク質が DNAの特異的配列

(応答配列）に結合することによって制御されている。転写調節因子として知られる Nu clear Factor kappa B (NF— κ B)は、免疫グロブリン kappa鎖遺伝子のェンハンサーに結合する B細胞に特異的な因子として同定された。その後、各種炎症に関連するサイト力インや受容体のプロモーター領域に結合することでこれらの遺伝子の発現を制御し、免疫応答や炎症などをコントロールする重要な転写調節因子として重要な働きをしていることが明らかになつてきた。 NF - κ Bは、このように、免疫応答や炎症などの病態形成に重要な働きを持ち、 NF - κ B活性化を阻害する化合物はこれらの病態の改善および治癒に有用である。

[0003] このため、 NF- κ Bの活性ィ匕を阻害する薬物の探索が進められ、非ステロイド系抗炎症剤であるアスピリンやサリチル酸ナトリウムが比較的高濃度域で NF— κ Bの活性化を阻害する作用を有すること、プリン系化合物であるキサンチン誘導体が NF κ B活性ィ匕阻害を起こすこと、ステロイド系化合物であるデキサメタゾンが NF— κ B活性ィ匕阻害を起こすこと、ゥコンの成分であるクルクミンが NF— κ Β活性ィ匕阻害を示すこと、プロポリスの成分である桂皮酸フエネチルエステルが NF— κ Β活性化阻害を示すことなどが報告されて、る。

[0004] また、活性化された NF— κ Βは脂肪細胞の分化誘導を制御し、脂質代謝全体を制御する核受容体型転写調節因子パーォキシゾーム増殖剤活性化受容体 (PPAR γ )の活性を阻害することが明らかにされている。

[0005] ところで、本発明に係る NF— κ Β活性ィ匕阻害剤は、下記化 1に示すような化学構造式の化合物からなり、この化合物はフエ二ル基を有するプロピオン酸誘導体にトリテルペンアルコールがエステル結合をした基本構造をして、る

[0006] [化 1]

[0007] 以下、この化合物について化学構造の観点力も従来技術について述べる。化 1において、 R力 Sヒドロキシ基、 R力 Sメトキシ基、 Rがトリテルペンである化合物は、総称と

1 2 3

して γ—オリザノールと呼ばれ、特許 3493459号において皮脂分泌作用等を有するとされているが、その作用機序についてはまったく触れられておらず、本発明で主張する NF— κ Β活性ィ匕阻害作用についてはなんら記載されていない。

[0008] Akihisaらは後述する非特許文献 1で、 y オリザノールの成分がホルボールエステルを用いて起こさせたマウス耳の炎症に対して抗炎症作用を示すことを報告している力 NF- κ B活性ィ匕阻害作用についてはなんら記載されていない。

[0009] また、 R力ヒドロキシ基、 R力メトキシ基、 Rが水素である遊離フェルラ酸の誘導体

1 2 3

につ、ては、後述する非特許文献 2にお、て抗酸ィ匕性物質として記載されて、るが、 NF— κ Β活性ィ匕阻害作用についてはまったく触れられていない。

[0010] また、本発明の化合物は広く食用植物界に分布する化合物であり、これまでの長い食経験でその安全性が確認されているものである力これまで NF— κ Β活性ィ匕阻害作用につヽては述べられたことがな、。

特許文献 1：特許第 3493459号公報

特許文献 2：特表 2005 - 501043号公報

非特許文献 1 : Akihisa, T" Yamaura, K., Ukiya, M., Kimura, Y" Shimizu, N" Arai, K. Triterpene alcohol and sterol ferulates from rice bran and their anti-inflammatory effects. J. Agric. Food Chem., 48, 2313—2319 (2000)

非特許文献 2 : Rice- Evans, C.A. , Miller, N.J, Paganga, G. Structure- anitioxidant act ivity relationships of flavonoids and phenolic acids. Free Radical Biology & Medicine, 20, 933-956 (1996).

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0011] 本発明の課題は、炎症、 2型糖尿病などの疾患の予防や治療に使用することができる安全性の高い NF— κ B活性ィ匕阻害剤を提供する点にある。

課題を解決するための手段

[0012] 本発明に係る NF— κ B活性ィ匕阻害剤は、下記の化 1で表される化合物またはその塩類を有効成分とするものである。

[0013] [化 1]

[0014] ここで、化 1の化学構造式中、 Rはヒドロキシ基を示し、 Rはヒドロキシ基、メトキシ

1 2

基あるいはアルコキシ基を示し、 Rはステロールなどのトリテルペン骨格を示す。

3

[0015] ィ匕 1の代表的な化合物としてはヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステルを挙げることができ、好ましい例としては、シクロアルテュルフェルレート、 βシトステリルフエノレレート、スティグマステリルフェルレート、 24—メチレンシクロアノレテ-ノレフェルレートもしくはカンペステリルフェルレートまたはそれらの塩類を挙げることができる。塩類とは、医薬として許容される塩類であればよぐたとえばアンモニゥム塩などを挙げることができる。

[0016] なお、本発明に係る NF— κ Β活性ィ匕阻害剤の投与は、例えば、非経口又は経口等の公知の用法で行うことができる。投与形態としては、非経口剤として用いる場合、その形態は限定されず、例えば、静脈内注射剤 (点滴を含む)、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、皮下注射剤、点鼻薬、坐剤、軟膏、クリーム及び塗布液等のいずれであってもよい。さらに、経口剤として用いる場合、その形態は限定されず、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれであってもよいし、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。

[0017] これら各種用法に用いる製剤 (経口剤や非経口剤等)は、薬剤製造上一般に用いられる賦形材、充填材、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等を適宜選択して使用し、常法により調製することができる。また、用途として、化粧料、食料、飲料、家畜飼料、ペットフードへの応用が考えられる。

発明の効果

[0018] 本発明に係る化合物は、 NF - κ Bの活性化を阻害する作用を有し、 NF- κ Β活性ィ匕が関与する幅広、炎症性疾患 (潰瘍性大腸炎とクローン病を含む腸炎等)や、アディポネクチンが関与する疾患 (例えばインスリン耐性を伴う 2型糖尿病）などの予防及び治療に使用することができるという効果がある。

図面の簡単な説明

[0019] [図 1]ヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステル類の分離例を示すダラフである。

[図 2]RAW264.7マクロファージにおける NF— κ Β活性に対するシクロアルテュルフエルレートの作用を示すグラフである。

[図 3]RAW264.7マクロファージにおける iNOSmRNA発現に対するシクロアルテュルフェルレート（CAF)の影響を示すグラフである。

[図 4]RAW264.7マクロファージにおける IL— 1 β mRN Α発現に対するシクロアルテ -ルフェルレート（CAF)の影響を示すグラフである。

[図 5]DSS腸炎における DAIスコア一に対する γ —オリザノールの影響を示すグラフである。

[図 6]DSS腸炎における ΜΡΟ活性に対する γ —オリザノールの影響を示すグラフである。

[図 7]ΗΕ染色したマウスの結腸の顕微鏡写真である。

[図 8]NF- κ B活性ィ匕阻害がマウス脂肪細胞アディポネクチン分泌に及ぼす影響を示すグラフである。発明を実施するための最良の形態

[0020] NF - κ Bの活性ィ匕を阻害することによって炎症、 2型糖尿病などの疾患を予防したり治療するとヽぅ目的を、長ヽ食経験でその安全性が確認されてヽる穀物 (米糠）に含まれて、る成分を用いることによって実現した。

[0021] 以下、本発明の実施例を示すが、これらの例は本発明をよりよく理解するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。

実施例 1

[0022] [ヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステルの抽出例] クロ口ホルムメタノール混液を用いて米糠より全脂質を抽出した。得られた抽出液の溶媒を、ァセトニトリル (国産化学)、酢酸 (国産化学)、蒸留水 (国産化学 )94 : 2 : 6(v/v)混合溶液に置換し、 0. 50 μ mミクロフィルター (PTFE、 ADVANTEC TOYO)でろ過した。

[0023] 移動相をァセトニトリル (国産化学)、酢酸 (国産化学)、蒸留水 (国産化学) 94： 2： 6(v/ V)混合溶液とし、固定相を逆相 HPLCカラムである Mightysil RP-18 GP250-4.6 3 m( 関東ィ匕学)、流速を lmlZminとした高速液体クロマトグラフィーシステムで分離し、 R F-10A (島津製作所)にて励起波長 330nm、蛍光波長 390nmの蛍光強度で検出したところ、図 1に示す通りの結果が得られた。

[0024] 図 1に示す結果から、ヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステルの一種であるシクロアルテュルフェルレート、 24—メチレンシクロアルテュルフェルレート、カンペステリルフェルレート、 β—シトステリルフェルレートが米糠中力も抽出できたことがわかる。

実施例 2

[0025] [ヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステルの合成] 前述した非特許文献 1の方法に従、、ヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステルの合成を行った。まず、 5gの transフェルラ酸および 5gの無水プロピオン酸 (Aldrich)を 15mlのピリジン (Aldrich)に溶解させ、窒素雰囲気下で 48時間撹拌した。得られた 1 . 2gの 4-プロピオ-ルフェルラ酸および 400mgのコレステロール (SIGMA)を 100ml のジクロロメタンに溶解し、 900mgの 2- chloro- 1 ,3- dimethylimidazolinium (DMC; Aid rich)を加えた。 [0026] 次いで、十分に冷却しながら 200mgのピリジンをゆっくりと加え、 4時間室温で撹拌した。その後、 1000mlの蒸留水を加え、ジクロロメタン層を 1000mlの希塩酸次いで飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。下層を採取して、無水硫酸ナトリウムで脱水後、エバポレーターにて溶媒を除去した。得られた乾固物をクロ口ホルムに溶解させた後、 Slica60プレートに着点し、クロ口ホルムを展開溶媒とする薄層クロマトグラフィ一にて分離した。

[0027] 365nmの紫外光で蛍光を発するとともに 50%硫酸検出で赤色を呈するスポットを搔き取り、シリカをクロ口ホルム:メタノール（1 : 1, vZv)溶媒で溶出した。得られたコレステロール 4-プロピオ-ルフェルラ酸エステルに 0.1Mの水酸化カリウムメタノール溶液を加え、 50°Cで 20分間加水分解を行い、コレステロールフェルラ酸エステルを得た。

[0028] また、コレステロールに変えて他のトリテルペンアルコールを用いることにより、その他のヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステルを得た。

実施例 3

[0029] [RAW264.7マウスマクロファージ細胞株における LPS刺激による NF— κ Β活性の測定] マウスマクロファージ RAW264.7細胞を 10%牛胎児血清を含む DMEMで維持し、 1 M cycloartenyl ferulate (CAFを含む DMEMにて 22時間処理した。次いで、 1 μ g/mlリポポリサッカライド（LPS)で 2時間刺激した。

[0030] RAW 264.7細胞の核タンパク質を、 Transfactor Extraction kit (BD Biosciences, US A)を用いて抽出し、 lOOmM HEPES (pH 7.6), 5mM EDTA, 50mM Ammonium Sulf ate, 5mM DTT, 150mM KCl, 1% (v/v) Tween 20, 0.0001% poly (dト dC) (Amersham Biosciences, USA)からなる反応溶液中で下記に示す NF— κ Bのピオチン化応答コンセンサス配列と 60分間結合させた。

[0031] NF— κ Βのコンセンサス配列： 5し AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC- 3'

[0032] これらの実験群以外に、対照として 90倍の非標識コンセンサス配列と反応させたコ一ルド群と、 anti- ρ50ポリクローナル抗体（Abeam, USA)および anti- p65ポリクローナル抗体 (Santa Cruz Biotechnology, INC., USA)を用いたスーパーシフト群を設けた。

[0033] 結合反応物を 1. 0 % Tris/borate/EDTA緩衝液を含む 6. 0%ポリアクリルアミドゲノレにて電気泳動し、続いてナイロンメンブレン (Presoak Pall Biodyne B, Whatman, US A)に転写した。転写後のメンブレンを 85°Cで 30分間加熱して DNAを架橋して Strept avidin標識ペルォキシダーゼ（SIGMA, USA)と 15分間反応させた。

[0034] そして、ペルォキシダーゼ活性を Immobilon Western Chemiluminescent HRP subst rate (Millipore, USA)を用いて検出し、発光強度を Image J (National Institutes of Hea lth, USA)を用いて数値ィ匕したところ、図 2に示す通りとなった。

[0035] また、この実施例にぉ、て、ヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステルのひとつであるシクロアルテュルフェルレート (1 μ M: CAF)と、生体内でのその代謝産物と考えられるフェルラ酸 (1 M : FA)の存在下で NF— κ B活性を調べたところ、図 2に示す通りとなった。

[0036] 図 2に示す結果から、 RAW264.7細胞は無刺激時においても比較的高い NF— κ Β 活性が得られ、 LPS刺激により NF— κ B活性は増加傾向を示すことがわかる。また、フェルラ酸はこの NF— κ B活性をほとんど抑制しないが、ヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステルの一つであるシクロアルテュルフェルレートは NF— κ B活性を顕著に抑制することがわかる。

実施例 4

[0037] [RAW264.7マウスマクロファージ細胞株における LPS刺激による iNOSと IL- 1 β mR NA発現量の半定量的 RT-PCR解析] 各刺激を行った RAW246.7細胞から全 RNAを Sepazol-RNA (Nacalai tesque Inc., Japan)にて抽出し、 260nmの吸収強度から RNA 量を定量した。得られた全 RNAから、 M- MLV Reverse transcriptase (Promega. USA ), Oligo (dT)12-18 primerおよび RNase inWbitorを含む反応液を用いて cDNAを得た。得られた cDNAにっき、下に示す特異的なプライマーおよび Taq DNA polymera se (TaKaRa, Japan)を用いて標的 DNAを増幅した。

[0038] なお、 PCRにはホットスタート法を用い、 PCR System (Bio-Rad, Japan)を使用して 9 4°C, 5min反応させたのち、 94°C, lmin, 55°C, 1. 5min, 72°C, lminを 35サイクル繰り返した後、 72°C, 5min反応させた。 iNOSと IL-1 βおよび jS -actinプライマ一はそれぞれ 479, 387, 374および 349bpのフラグメントを増幅した。得られたフラグメントを 2%ァガロースゲル電気泳動で分離し、臭化工チジゥムで染色して、その染色強度を ImageJ (National Institutes of Health, USA)にて数値化したところ、図 3及び図 4に示す通りとなった。

[0039] iNOS: forward primer, 5 ' - GCCTCGCTCTGGAAAGA- 3 '；

reverse primer 5，— TCCATGCAGACAACCTT— 3，；

IL-1 β： forward primer, 5，— TGCAGAGTTCCCCAACTGGTACATC— 3 ' reverse primer 5，— GTGCTGCCTAATGTCCCCTTGAATC— 3 '

j8 -actin: forward primer, 5，— TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC— 3 ' reverse primer 5，— TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG— 3 '

[0040] また、ヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステルのひとつであるシクロアルテュルフェルレート (1 と 10 M : CAF)の効果について検討したところ、図 3 及び図 4に示す通りとなった。

[0041] 図 3及び図 4に示す結果から、 RAW264.7細胞は無刺激時においても比較的高い i NOSと IL-1 βの mRNA発現が認められる。これは、無刺激時での高い NF— κ Β活性に合致した結果と考えられる。また、 RAW264.7細胞は LPS刺激により、 iNOSと IL- 1 βの mRNA発現量がさらに増加することがわかる。これに対し、ヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステルのひとつであるシクロアルテュルフェルレート (1 μ Μと 10 M : CAF)は iNOSと IL-1 βの mRNA発現を顕著に抑制することがわかる。実施例 5

[0042] [炎症性腸疾患モデル] デキストラン硫酸 (DSS： MW36000- 50000, MP Biomedic als)を 3%、 1 %、 0. 5%溶液になるように蒸留水に溶解し、 C57BL/6Jマウス（ォス、 8週齢）に自由飲水させ、 3%DSS投与群は投与開始 7日目で、 1%ならびに 0. 5%DSS投与群は 14日目に安楽死させ、結腸病変部を摘出した。

[0043] また、実施例 1で示したヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステルの混合物である γ—オリザノールはカルボキシメチルセルロース 0. 5%と 0. 01% Tween 20を含む生理食塩水に γ —オリザノールを懸濁液として調整し、 50mg/kg/dayを DS S自由飲水開始前 2日力経口投与を開始した。

[0044] Control群：溶媒のみ 6匹

3%DSS群：溶媒のみ経口投与 + 3%DSS自由飲水 5匹 3%DSS+ y オリザノール群： γ オリザノール経口投与 + 3% DSS自由飲水 5 匹

1%DSS群：溶媒のみ経口投与 + 1%DSS自由飲水 6匹

l%DSS+ y オリザノール群： γ オリザノール経口投与 + 1%DSS自由飲水 6匹 0. 5%DSS群：溶媒のみ経口投与 + 0. 5%DSS自由飲水 6匹

0. 5%DSS+ γ オリザノール群： γ オリザノール経口投与 + 0. 5%DSS自由飲水 6匹

[0045] 1) Disease Activity Index (DAI)：自由飲水開始後、毎日午前中に体重測定、便硬度の触診、血便の有無 (潜血判定キット使用）について解析し、下記の規定に基づき Disease Activity Index (DAI)を算出した。

(A)体重減少：なし（0) , 1-5% (1), 5-10% (2), 10-15% (3),〉15% (4)

(B)便の形状:通常（0),軟便 (2),下痢便 (4)

(C)潜血キット判定:なし (0)、わずかな緑色 (1)、 3秒以内に緑色 (2)、反応後すぐに鮮緑色 (3)、反応後すぐに暗青色 (4)

{(A) + (B)+(C)}/3 = DAI

[0046] 2) HE染色： 3%DSS投与群にぉ、て、 DSS投与 7日目の結腸病変部 (横行結腸〜上行結腸)を摘出し、中性ホルマリンにて固定して、 HE染色による病理切片を作製した。

[0047] 3)ミエ口ペルォキシダーゼ活性（MPO活性)：結腸病変部 (横行結腸〜上行結腸 )を摘出し、腸内容物を除去した後、腸管病変部における総タンパク量当たりの MP O酵素活性を測定し、好中球浸潤の指標とした。

[0048] 1) DAIスコア一：体重は 1%DSSならびに 0. 5%DSS投与群いずれにおいても対照群と比べて有意な差は認められな力つた。また、 γ—オリザノール投与群においてもそれぞれの対照群と差は認められなかった。

[0049] DAIスコア一評価法において、 0. 5%DSS投与群は対照群と比べて差はなぐ DAI スコア一は 0であった。一方、 1%DSS投与群は、図 5に示す通り、 DSS投与開始後 1 0日目力便の軟ィ匕と軽度の潜血便が認められ、 DSS投与後 14日目の DAIスコア一は 0. 72±0. 13と有意に上昇していた。 γ—オリザノール投与群では DAIスコア一は全ての個体で 0となり、有意な病態改善効果が認められた。

[0050] 2) MPO活性： MPO活性は図 6に示す通りであり、 0. 5%DSS投与群ならびに 1% DSS投与群の結腸病変部にぉ、て、好中球浸潤の指標となるミエ口ペルォキシダーゼ活性は DSSの濃度に依存して増加することがわかる。また、 γ —オリザノール投与群では 0. 5%DSS投与の場合はほぼ完全に ΜΡΟ活性を静止レベルまで低下させた 1S 1%DSS投与群においては抑制傾向を示すものの、有意な差は認められないことがわカゝる。

[0051] 3) HE染色： HE染色は図 7に示す通りであり、 3%DSS投与 1週間目の結腸病変部は、同図 (b)に示す通り、粘膜上皮が脱落し、粘膜下織への炎症性細胞の浸潤と肥厚ならびに筋層部の肥厚が認められる。一方、 γ —オリザノール投与群では、同図（ c)に示す通り、粘膜下織への炎症性細胞の浸潤は認められるが、明らかに粘膜下織と筋層の肥厚は軽減し、粘膜上皮の脱落も DSS投与群に比べて軽度であることがわかる。なお、同図（a)は controlである。

実施例 6

[0052] マウス 3T3- L1前駆脂肪細胞（IFO50416, HSRRB)を購入し、 24ゥエルプレートを用 V、て、 10%FBS (SIGMA)を含むタルべッコ変法イーグル増殖培地（DMEM) (日水製薬)で培養した。 48hごとに培地を交換して細胞を増殖させ、 25cm²フラスコ、 75cm² フラスコへ細胞を継代した。増やした細胞を回収して BICELL (日本冷凍）にて 1分約 1°Cで— 85°Cまで冷却し、—85°Cで保存した。

[0053] [脂肪細胞への分化] マウス 3T3-L1前駆脂肪細胞を 75cm²フラスコからトリプシン- EDTA (免疫生物研究所）を用いて 50mlプラスチックチューブに回収した。 lOOOrp m、 5分間遠心し、上清を除いた。新しい培地を加え、細胞を懸濁させた。細胞液を 6 ゥエルプレートへ分注し、コンフルェントに達するまで培養した。細胞がコンフルェントに達した後、 5 μ g/mlインスリン（和光純薬工業）、 0.5mmol/l 3- isobuty卜 1- methy卜 xa nthine (IBMX) (SIGMA)、および 1 μ mol/1デキサメタゾン（和光純薬工業）を加えた分化誘導培地に交換した。 48時間ごとに新しい分ィ匕誘導培地に交換し、 7日間培養した。その後、増殖培地に交換し、さらに 2日間培養した。

[0054] [脂肪細胞アディポネクチンへの影響] 1 M γ —オリザノール、 1 ^ Μ βシトステロール、 1 M trans-フェルラ酸、 1 Mコレステロールあるいは 1 μ Μトログリタゾンを含む試験培地をそれぞれ 100 1ずつ加えた。ポジティブコントロールとしてトロダリタゾンを、ネガティブコントロールとして DMSOのみを含む培地を用いた。 22時間処理して培地を除いた後、 1 μ g/ml LPS, 50ng/ml recombinant TNF- a、 100 U/ml rec ombinant IFN- γを加えた培地で 2時間培養し、 NF— κ Βを活性化させた。 2時間後 NF - κ Β活性ィ匕培地を除いて、試験培地による処理開始力も通算して 24時間後それぞれの培地を回収した。回収した培地を SDS-PAGE sample bufferと混合し、 3分間ボイノレした。 SDS- PAGEおよびウェスタンブロッテイングを行った。

[0055] なお、検出にはピオチンとアビジンの結合能を利用した ABC法を用いた。すなわち、一次抗体には Biotinylated Anti-mouse Adiponectin polyclonal antibody (R&D byst ems, Inc)を反応させた。続いて horseradish peroxidase標識ビォチンとアビジンの複合体を含む ABC溶液（和光純薬工業）を反応させた。次いで Chemiluminescent HRP Substrate (MILLIPORE)を用いて化学発光法、もしくは Sigma FAST DAB tabletを用いて検出した。検出されたバンドをフラットベッドデジタルスキャナで取り込み、 Image- Jを用いて画像解析を行ってアディポネクチンレベルを測定したところ、図 8に示す通りとなった。

[0056] 図 8に示す結果から、 LPS等の刺激による NF— κ Β活性化状態のマウス脂肪細胞にお、て中程度の濃度のヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステル ( TTAHCE)はアディポネクチンの分泌を有意に促進することが明わかる。すなわち、ヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステルは NF— κ Β活性化を阻害し、抗 2型糖尿病因子アディポネクチン分泌促進を引き起こすことがわ力る。

Claims

請求の範囲下記化 1の化学構造式 (該式中、 Rはヒドロキシ基を示し、 Rはヒドロキシ基、メトキ 1 2 シ基あるいはアルコキシ基を示し、 Rはトリテルペンを示す。）で表される化合物また 3 はその塩類を有効成分とする NF— κ Β活性ィ匕阻害剤。

[化 1]

[2] ヒドロキシ桂皮酸誘導体トリテルペンアルコールエステルまたはそれらの塩類を有効成分とする請求項 1に記載の NF— κ Β活性化阻害剤。

[3] シクロアルテニルフェルレートまたはそれらの塩類を有効成分とする請求項 1又は 2 に記載の NF— κ Β活性化阻害剤。

[4] βシトステリルフェルレートまたはそれらの塩類を有効成分とする請求項 1又は 2に記載の NF— κ Β活性化阻害剤。

[5] スティグマステリルフェルレートまたはそれらの塩類を有効成分とする請求項 1又は

2に記載の NF— κ Β活性化阻害剤。

[6] 24—メチレンシクロアルテュルフェルレートまたはそれらの塩類を有効成分とする請求項 1又は 2に記載の NF— κ Β活性化阻害剤。

[7] カンペステリルフェルレートまたはそれらの塩類を有効成分とする請求項 1又は 2に記載の NF— κ Β活性化阻害剤。