JPWO2014103799A1

JPWO2014103799A1 - クモ糸タンパク質フィルム及びその製造方法

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Publication number: JPWO2014103799A1
Application number: JP2014524974A
Authority: JP
Inventors: 香里関山; 瑞季石川; 真也村田
Original assignee: Spiber Inc
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Priority date: 2012-12-26
Filing date: 2013-12-17
Publication date: 2017-01-12
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Abstract

クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドを含むフィルムであって、２４０〜２６０℃に分解温度があり、光波長２００〜３００ｎｍの紫外光は吸収し、光波長４００〜７８０ｎｍでは８５％以上の光透過率を有し、可視光領域では無色透明である。本発明の製造方法は、クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドをジメチルスルホキシド溶媒に溶解させ、ドープ溶液とし、前記ドープ溶液を基材表面にキャスト成形する。これにより、フィルム化しやすく、延伸性も良好なクモ糸タンパク質フィルム及びその製造方法を提供する。

Description

本発明は、延伸が可能なクモ糸タンパク質フィルム及びその製造方法に関する。

クモ糸はスパイダーシルクとも言われ、天然クモ糸を出発物質とし、バイオ合成技術を用いて産生されることは知られている。このクモ糸タンパク質を使用したフィルムは下記特許文献１〜３などにおいて提案されている。これらの提案は、クモ糸タンパク質をヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）溶媒に溶解してフィルム化することが開示されている。

特表２００８−５０７２６０号公報特表２００８−５０６４０９号公報特表２００７−５１５３９１号公報

しかし、従来法で提案されているヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）溶媒を用いるとキャスト成形時に使用する基板がフィルム又は樹脂の場合、基板を溶解してしまう場合があるという大きな問題があった。加えて、ＨＦＩＰの沸点は５９℃であり、貯蔵安定性が低く、フィルムを作るためのキャスト成形時に溶媒が蒸発してしまい、フィルム形成しにくいという問題があった。このため、クモ糸タンパク質フィルム自体の特性も明らかではなかった。

本発明は前記従来の問題を解決するため、フィルム又は樹脂からなる基板を溶解させることなしに容易にキャスト成形が可能で、フィルム化しやすいクモ糸タンパク質フィルム及びその製造方法を提供すること、及びクモ糸タンパク質フィルム自体の特性を明らかにすることを目的とする。

本発明のクモ糸タンパク質フィルムは、クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドを含むフィルムであって、２４０〜２６０℃に分解温度があり、光波長２００〜３００ｎｍの紫外光は吸収し、光波長４００〜７８０ｎｍでは８５％以上の光透過率を有し、可視光領域では無色透明であることを特徴とする。

本発明のクモ糸タンパク質フィルムの製造方法は、クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドを含むフィルムの製造方法であって、クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドをジメチルスルホキシド溶媒に溶解させ、ドープ溶液とし、前記ドープ溶液を基材表面にキャスト成形することを特徴とする。

本発明のフィルムは２４０〜２６０℃に分解温度があり耐熱性が高い。光波長２００〜３００ｎｍの紫外光は吸収し、光波長４００〜７８０ｎｍでは８５％以上の光透過率があり、人体にとって有害な紫外光（ＵＶ）は吸収し、光波長４００〜７８０ｎｍの光透過性は良好である。このフィルムは可視光領域では無色透明である。以上の特性は光学フィルムなどに有用である。また本発明は、溶媒としてジメチルスルホキシド（以下ＤＭＳＯとも言う）を使用することによって、フィルム又は樹脂からなる基板を溶解させることなしに容易にキャスト成形が可能で、貯蔵安定性が良く、フィルム化しやすいクモ糸タンパク質フィルム及びその製造方法を提供できる。ＤＭＳＯは融点１８．４℃、沸点１８９℃であり、貯蔵安定性は高く、キャスト成形時の蒸発は少なく、安全性も高く、均一膜厚で透明性の高いフィルムを得ることができる。

また、そのようなＤＭＳＯの溶媒としての使用によって、クモ糸タンパク質フィルムの延伸性が高められるだけでなく、キャスト成形の際の基板にポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルムなどの樹脂基板を使用することが可能となる。

図１は本発明の一実施例のフィルムの引っ張り試験測定グラフである。図２は本発明の一実施例の未延伸フィルムの光透過性測定グラフである。図３は本発明の一実施例の延伸フィルムの光透過性測定グラフである。図４は本発明の一実施例のフィルムの熱重量測定グラフである。図５は本発明の一実施例のフィルムの熱重量測定グラフである。

本発明のフィルムは、２４０〜２６０℃に分解温度があり、耐熱性が高い。耐熱性は示差熱熱重量同時測定装置（ＴＧ−ＤＴＡ）による重量減少により測定できる。また透過度測定により、光波長２００〜３００ｎｍの紫外光は吸収し、光波長４００〜７８０ｎｍでは８５％以上の光透過率を有する。人体にとって有害な紫外光（ＵＶ）は吸収し、光波長４００〜７８０ｎｍの光透過性は良好である。光波長４００〜７８０ｎｍの好ましい光透過率は９０％以上である。このフィルムは、可視光領域では無色透明である。この性質は光導波路、透明導電膜を含む光学フィルムなどに有用である。

このクモ糸タンパク質フィルムは、延伸することが可能である。延伸フィルムは熱固定されていることが好ましい。これにより常温（０〜３０℃）において、寸法安定性があるフィルムとなる。延伸後の熱固定は５０〜２００℃が好ましく、さらに好ましくは８０〜２００℃である。熱固定の時間は５〜６００秒が好ましく、さらに好ましくは２０〜３００秒である。

前記クモ糸タンパク質フィルムの光波長５９０ｎｍにおける屈折率は、１．１〜１．６の範囲であるのが好ましい。さらに好ましくは１．２〜１．６である。この屈折率であれば、光導波路、透明導電膜を含む光学フィルムなどに有用である。前記クモ糸タンパク質未延伸フィルムのヘイズ値は０．５〜３．０％が好ましく、さらに好ましくは１．０〜２．０％である。前記の範囲であれば透明性が良好である。

前記クモ糸タンパク質フィルムは水分吸収性があり、示差熱熱重量同時測定装置（ＴＧ−ＤＴＡ）において６７〜９４℃付近で４〜８重量％分の質量低下があるのが好ましい。これは未延伸又は延伸フィルムの平衡水分率を示している。また、示差熱熱重量同時測定装置（ＴＧ−ＤＴＡ）において未延伸フィルムは１７５℃付近に質量低下が認められ、残存溶媒のＤＭＳＯであると思われる。ＤＭＳＯ溶媒を使用した未延伸フィルムは延伸しやすいことから、残存ＤＭＳＯは延伸の際の可塑剤になると思われる。

前記クモ糸タンパク質フィルムの未延伸フィルムは、最大点応力が６〜２０ＭＰａであり、さらに好ましくは７〜１８ＭＰａである。未延伸フィルムの破断点変位（ひずみ）は２０〜１５０％であり、さらに好ましくは２３〜９５％である。また、延伸後熱固定されたフィルムは、最大点応力が４０ＭＰａ以上であることが好ましい。好ましくは４０〜１００ＭＰａであり、さらに好ましくは４５〜７５ＭＰａである。破断点変位（ひずみ）は１０〜５０％が好ましく、さらに好ましくは１５〜４０％である。前記の最大点応力及び破断点変位（ひずみ）であれば、機械特性として実用的である。

本発明方法は、クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドをジメチルスルホキシド溶媒に溶解させ、ドープ溶液とし、前記ドープ溶液を基材表面にキャスト成形し、乾燥及び／又は脱溶媒する。前記ドープ溶液の粘度は１５〜８０ｃＰ（センチポアズ）であるのが製膜性から好ましい。

前記キャスト成形の際に使用する基材は、ポリエチレンテレフタレートフィルム：ＰＥＴ又はＰＥＴ表面にシリコーン化合物を固定化させた剥離フィルムが好ましい。これらの基板はＤＭＳＯ溶媒に対して安定であり、ドープ溶液を安定してキャスト成形でき、成形後の膜の分離も容易にできる利点がある。ガラス基板や金属基板でもキャスト製膜ではないわけではないが、これらの基板はドープ溶液との親和性が高すぎてフィルムが剥離しにくい問題がある。一方、ポリテトラフルオロエチレン等のフッ素樹脂基板、及びポリプロピレン（ＰＰ）フィルム基板はドープ溶液をはじいてしまい、液離れが起こり、キャスト製膜しにくい。

前記乾燥及び／又は脱溶媒は、真空乾燥、熱風乾燥、風乾、及び液中浸漬から選ばれる少なくとも一つの手段で行うのが好ましい。液中浸漬は、水中、メタノール、エタノール、２−プロパノールなどの炭素数１〜５の低級アルコールなどのアルコール液でもよいし、水とアルコール混合液などにキャストフィルムを浸漬して脱溶媒させてもよい。脱溶媒液（凝固液）の温度は０〜９０℃が好ましい。溶媒はできるだけ脱離したほうが好ましい。液中延伸の場合、脱溶媒は延伸と同時に行うこともできる。なお、脱溶媒は延伸後に行っても良い。

乾燥及び／又は脱溶媒後の未延伸フィルムは、水中で１軸延伸又は２軸延伸することができる。２軸延伸は逐次延伸でも同時２軸延伸でもよい。２段以上の多段延伸をしても良い。好ましい延伸倍率は縦、横ともに１．０１〜６倍、さらに好ましくは１．０５〜４倍である。この範囲であると応力−歪のバランスがとりやすい。未延伸又は延伸フィルムの厚さは１〜１０００μｍが好ましい。水中延伸の条件は２０〜９０℃の水温が好ましい。前記延伸後のフィルムは５０〜２００℃の乾熱で５〜６００秒間熱固定するのが好ましい。この熱固定により常温における寸法安定性が得られる。なお、１軸延伸したフィルムは１軸配向フィルムとなり、２軸延伸したフィルムは２軸配向フィルムとなる。

本発明は、天然クモ糸タンパク質（ｓｐｉｄｅｒｓｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎｓ）由来のポリペプチドのドープ液として、極性溶媒であるＤＭＳＯを使用する。ＤＭＳＯは融点１８．４℃、沸点１８９℃であり、従来法で使用されているヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）の沸点５９℃、ヘキサフルロアセトン（ＨＦＡｃ）の沸点−２６．５℃に比べると、沸点ははるかに高い。また、ＤＭＳＯは、一般産業分野においてもアクリル繊維の重合、紡糸液として使用され、ポリイミドの重合溶媒としても使用されていることから、コストも安く安全性も確認されている物質である。

本発明のタンパク質は、クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドである。クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドとは、天然型クモ糸タンパク質に由来又は類似するものであればよく、特に限定されない。前記クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドは、強靭性に優れるという観点からクモの大瓶状線で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドであることが好ましい。前記大吐糸管しおり糸タンパク質としては、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する大瓶状線スピドロインＭａＳｐ１やＭａＳｐ２、二ワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）に由来するＡＤＦ３やＡＤＦ４などが挙げられる。

上記組換えクモ糸タンパク質は、クモの小瓶状線で産生される小吐糸管しおり糸に由来する組換えクモ糸タンパク質であってもよい。上記小吐糸管しおり糸タンパク質としては、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する小瓶状線スピドロインＭｉＳｐ１やＭｉＳｐ２が挙げられる。

その他にも、上記組換えクモ糸タンパク質は、クモの鞭毛状線（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍｇｌａｎｄ）で産生される横糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質であってもよい。上記横糸タンパク質としては、例えばアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する鞭毛状絹タンパク質（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍｓｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ）などが挙げられる。

前記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドとしては、式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上、好ましくは４以上、より好ましくは６以上含むポリペプチドが挙げられる。なお、前記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する組ポリペプチドにおいて、式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位は、同一であってもよく、異なっていてもよい。

前記式（１）において、ＲＥＰ１はポリアラニンを意味している。前記ＲＥＰ１において、連続して並んでいるアラニンは、２残基以上であることが好ましく、より好ましくは３残基以上であり、さらに好ましくは４残基以上であり、特に好ましくは５残基以上である。また、前記ＲＥＰ１において、連続して並んでいるアラニンは、２０残基以下であることが好ましく、より好ましくは１６残基以下であり、さらに好ましくは１２残基以下であり、特に好ましくは１０残基以下である。前記式（１）において、ＲＥＰ２は１０〜２００残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、前記アミノ酸配列中に含まれるグリシン、セリン、グルタミン、プロリン及びアラニンの合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上である。

大吐糸管しおり糸において、前記ＲＥＰ１は繊維内で結晶βシートを形成する結晶領域に該当し、前記ＲＥＰ２は繊維内でより柔軟性があり大部分が規則正しい構造を欠いている無定型領域に該当する。そして、前記［ＲＥＰ１−ＲＥＰ２］は、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域（反復配列）に該当し、しおり糸タンパク質の特徴的配列である。

前記式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、例えば、配列番号１、配列番号２及び配列番号３のいずれかに示されているアミノ酸配列を有するＡＤＦ３由来の組換えクモ糸タンパク質が挙げられる。配列番号１に示されるアミノ酸配列は、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号４）を付加したＡＤＦ３のアミノ酸配列において、第１〜１３番目の反復領域をおよそ２倍になるように増やすとともに、翻訳が第１１５４番目アミノ酸残基で終止するように変異させたものである。配列番号２に示されているアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したＡＤＦ３の部分的なアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１０、ＧＩ：１２６３２８７）のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号４）を付加したアミノ酸配列である。配列番号３に示されるアミノ酸配列は、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号４）を付加したＡＤＦ３のアミノ酸配列において、第１〜１３番目の反復領域をおよそ２倍になるように増やしたものである。また、前記式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、配列番号１、配列番号２及び配列番号３のいずれかに示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域を有するポリペプチドを用いてもよい。

本発明において、「１若しくは複数個」とは、例えば、１〜４０個、１〜３５個、１〜３０個、１〜２５個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、又は１若しくは数個を意味する。また、本発明において、「１若しくは数個」は、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、又は１個を意味する。

上記小吐糸管しおり糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質としては、式２：ＲＥＰ３（２）で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。上記式２において、ＲＥＰ３は（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｚ）ｍ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）ｌ（Ａ）ｒから構成されるアミノ酸配列を意味し、Ｚは任意の一つのアミノ酸を意味するが、特にＡｌａ、Ｔｙｒ及びＧｌｎからなる群から選ばれる一つのアミノ酸であることが好ましい。またｍは１〜４であることが好ましく、ｌは０〜４であることが好ましく、ｒは１〜６であることが好ましい。

クモ糸において、小吐糸管しおり糸はクモの巣の中心から螺旋状に巻かれ、巣の補強材として使われたり、捉えた獲物を包む糸として利用されたりする。大吐糸管しおり糸と比べると引っ張り強度は劣るが伸縮性は高いことが知られている。これは小吐糸管しおり糸において、多くの結晶領域がグリシンとアラニンが交互に連なる領域から形成されているため、アラニンのみで結晶領域が形成されている大吐糸管しおり糸よりも結晶領域の水素結合が弱くなり易いためと考えられている。

上記横糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質としては、式３：ＲＥＰ４（３）で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。前記式３において、ＲＥＰ４は（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘ）ｎから構成されるアミノ酸配列を意味し、Ｘは任意の一つのアミノ酸を意味するが、特にＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ及びＶａｌからなる群から選ばれる一つのアミノ酸であることが好ましい。またｎは少なくとも４以上の数字を表し、好ましくは１０以上、より好ましくは２０以上である。

クモ糸において、横糸は結晶領域を持たず、無定形領域からなる繰り返し領域を持つことが大きな特徴である。大吐糸管しおり糸などにおいては結晶領域と無定形領域からなる繰り返し領域を持つため、高い応力と伸縮性を併せ持つと推測される。一方、横糸については、大吐糸管しおり糸に比べると応力は劣るが、高い伸縮性を持つ。これは横糸の大部分が無定形領域によって構成されているためだと考えられている。

前記ポリペプチドは、ポリペプチドをコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換した宿主を用いて製造することができる。遺伝子の製造方法は特に制限されず、天然型クモ糸タンパク質をコードする遺伝子をクモ由来の細胞からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅してクローニングするか、若しくは化学的に合成する。遺伝子の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手した天然型クモ糸タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔｐｌｕｓ１０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結して合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、前記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を合成してもよい。前記発現ベクターとしては、ＤＮＡ配列からタンパク質を発現し得るプラスミド、ファージ、ウイルスなどを用いることができる。前記プラスミド型発現ベクターとしては、宿主細胞内で目的の遺伝子が発現し、かつ自身が増幅することのできるものであればよく、特に限定されない。例えば宿主として大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）を用いる場合は、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクター、ｐＣｏｌｄプラスミドベクターなどを用いることができる。中でも、タンパク質の生産性の観点から、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクターを用いることが好ましい。前記宿主としては、例えば動物細胞、植物細胞、微生物などを用いることができる。

本発明のドープ液を１００質量％としたとき、媒質（天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチド）の濃度は３〜５０質量％が好ましく、さらに好ましくは３．５〜３５質量％であり、とくに４．２〜１５．８質量％が好ましい。

ゴミと泡を取り除き、ドープ溶液の粘度は１５〜８０ｃＰ（センチポアズ）が好ましく、さらに好ましいドープ溶液粘度は２０〜７０ｃＰである。この粘度のドープ溶液を使用してフィルムキャスト成形する。すなわち、好ましくは離形層が形成されているＰＥＴフィルム基板上に前記ドープ溶液を流延し、アプリケーター、ナイフコーター、バーコーターなどの膜厚制御手段を使用して一定の厚さの濡れ膜を作成し、乾式の場合は溶媒を乾燥させ、真空乾燥、熱風乾燥、風乾などにより乾燥及び／又は脱溶媒する。湿式の場合はキャストフィルムを脱溶媒槽（又は凝固槽とも言う。）に浸漬して溶媒を脱離する。その後、前記のとおり延伸しても良い。

本発明においてはカラーフィルムを作成することもできる。まず染料などの着色剤をＤＭＳＯに溶解又は分散させておき、ＤＭＳＯ着色液とする。着色剤はＤＭＳＯに溶解又は分散しやすい。この着色液をドープ溶液に加えるか又はドープ溶液に着色液を加えて混合し、前記と同様にフィルムキャスト成形する。その後、乾燥及び／又は脱溶媒して未延伸着色フィルムにするか、又は延伸してもよい。カラーフィルムは反射板、マーカー、紫外線防止膜、スリット糸などに応用できる。

以下実施例を用いて、本発明をさらに具体的に説明する。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。

＜各測定方法＞
（１）光透過度
島津製作所社製、紫外線可視近赤外分光光度計を用いた。
（２）熱分析
セイコーインスツルメント社製、示差熱熱重量同時測定装置（ＴＧ−ＤＴＡ）装置を用いた。
（３）屈折率
ＪＩＳＫ７１４２に従い、アタゴ社製アッベ屈折計２Ｔを使用し、測定温度２３℃、光源Ｎａランプ（Ｄ線／５８９ｎｍ）、測定数３、接触液：ジョードメタンを使用した。
（４）粘度
ＫＥＭ社製、ＥＭＳ装置を使用した。
（５）引っ張り試験
島津製作所社製、引っ張り試験装置を用いた。
（６）フィルムの厚み測定
新潟精機社製、デジタル外側マイクロメータを使用した。
（７）溶媒残量測定
内部標準として１，２−ジクロロエタン−ギ酸溶液、濃度３，１００ｐｐｍ（０．００３１０ｍｇ／ｍｌ）を準備した。タンパク質溶液（１０ｍｌのギ酸に０．１ｇのタンパク質フィルムを溶解したもの）５００μｌと内部標準溶液５００μｌを混合した。さらに、Ｈ−ＮＭＲ測定のためアセトニトリル重溶媒を同量程度加え約２倍に希釈し、Ｈ−ＮＭＲ測定を行った（ＮＭＲの機種：ＪＥＯＬ社製ＪＮＭ−ＥＣＸ１００）。内部標準試料１，２−ジクロロエタンのＨ−ＮＭＲ積分強度とＤＭＳＯのＨ−ＮＭＲ積分強度を比較した。検量線の作成は３ｐｐｍ〜３０００ｐｐｍのＤＭＳＯ−ギ酸溶液を作成し、上記プロトコルにしたがって、検量線を作成した。検量線との比較から、タンパク質溶液中のＤＭＳＯ濃度を求めた。ＤＭＳＯ濃度測定は、ＪＥＯＬ社製、核磁気共鳴装置（ＮＭＲ）を用いた。

（実施例１〜４、比較例１）
１．クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドの準備
＜遺伝子合成＞
（１）ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子の合成
ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つであるＡＤＦ３（ＧＩ：１２６３２８７）の部分的なアミノ酸配列をＮＣＢＩのウェブデータベースより取得し、同配列のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号４）を付加したアミノ酸配列（配列番号２）をコードする遺伝子を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に合成受託した。その結果、配列番号５で示す塩基配列からなるＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＵＣ５７ベクター（遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅＩサイト、及び５’末端直下流にＸｂａＩサイト有り）を取得した。その後、同遺伝子をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターに組み換えた。

（２）ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅの遺伝子の合成
ＡＤＦ３Ｋａｉを鋳型にＴ７プロモータープライマー（配列番号８）とＲｅｐＸｂａＩプライマー（配列番号９）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子配列における５’側半分の配列（以下、配列Ａと記す。）を増幅し、同断片をＭｉｇｈｔｙＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を使用して、予めＮｄｅＩ及びＸｂａＩで制限酵素処理をしておいたｐＵＣ１１８ベクターに組み換えた。同様に、ＡＤＦ３Ｋａｉを鋳型にＸｂａＩＲｅｐプライマー（配列番号１０）とＴ７ターミネータープライマー（配列番号１１）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子配列における３’側半分の配列（以下、配列Ｂと記す。）を増幅し、同断片をＭｉｇｈｔｙＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を使用して、予めＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩで制限酵素処理をしておいたｐＵＣ１１８ベクターに組み換えた。配列Ａの導入されたｐＵＣ１１８ベクターをＮｄｅＩ、ＸｂａＩで、配列Ｂの導入されたｐＵＣ１１８ベクターをＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩでそれぞれ制限酵素処理し、ゲルの切り出しによって配列Ａ及び配列Ｂの目的ＤＮＡ断片を精製した。ＤＮＡ断片Ａ、Ｂ及び予めＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理をしておいたｐＥＴ２２ｂ（＋）をライゲーション反応させ、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。Ｔ７プロモータープライマー及びＴ７ターミネータープライマーを用いたコロニーＰＣＲにより、目的ＤＮＡ断片の挿入を確認した後、目的サイズ（３．６ｋｂｐ）のバンドが得られたコロニーからプラスミドを抽出し、３１３０ｘｌＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたシーケンス反応により全塩基配列を確認した。その結果、配列番号６に示すＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅの遺伝子の構築が確認された。なお、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅのアミノ酸配列は配列番号３で示すとおりである。

（３）ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１の遺伝子の合成
前記で得られたＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを鋳型に、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＢａｓａｌＫｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いた部位特異的変異導入により、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅのアミノ酸配列（配列番号３）における第１１５５番目のアミノ酸残基グリシン（Ｇｌｙ）に対応するコドンＧＧＣを終止コドンＴＡＡに変異させ、配列番号７に示すＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１の遺伝子をｐＥＴ２２ｂ（＋）上に構築した。変異の導入の正確性については、３１３０ｘｌＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたシーケンス反応により確認した。なお、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１のアミノ酸配列は配列番号１で示すとおりである。

＜タンパク質の発現＞
前記で得られたＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１の遺伝子配列を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターを、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）に形質転換した。得られたシングルコロニーを、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養後、同培養液１．４ｍｌを、アンピシリンを含む１４０ｍＬのＬＢ培地に添加し、３７℃、２００ｒｐｍの条件下で、培養液のＯＤ₆₀₀が３．５になるまで培養した。次に、ＯＤ₆₀₀が３．５の培養液を、アンピシリンを含む７Ｌの２×ＹＴ培地に５０％グルコース１４０ｍＬと共に加え、ＯＤ₆₀₀が４．０になるまでさらに培養した。その後、得られたＯＤ₆₀₀が４．０の培養液に、終濃度が０．５ｍＭになるようにイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加してタンパク質発現を誘導した。ＩＰＴＧ添加後２時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の菌体から調製したタンパク質溶液をポリアクリルアミドゲルに泳動させたところ、ＩＰＴＧ添加に依存して目的サイズ（約１０１．１ｋＤａ）のバンドが観察され、目的とするタンパク質が発現していることを確認した。

＜精製＞
（１）遠沈管（１０００ｍｌ）にＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１のタンパク質を発現している大腸菌の菌体約５０ｇと、緩衝液ＡＩ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）３００ｍｌを添加し、ミキサー（ＩＫＡ社製「Ｔ１８ベーシックウルトラタラックス」、レベル２）で菌体を分散させた後、遠心分離機（クボタ社製の「Ｍｏｄｅｌ７０００」）で遠心分離（１１，０００ｇ、１０分、室温）し、上清を捨てた。
（２）遠心分離で得られた沈殿物（菌体）に緩衝液ＡＩを３００ｍｌと、０．１ＭのＰＭＳＦ（イソプロパノールで溶解）を３ｍｌ添加し、前記ＩＫＡ社製のミキサー（レベル２）で３分間分散させた。その後、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡＮｉｒｏＳａｏｖｉ社製の「ＰａｎｄａＰｌｕｓ２０００」）を用いて菌体を繰り返し３回破砕した。
（３）破砕された菌体に、３ｗ／ｖ％のＳＤＳを含む緩衝液Ｂ（５０ｍＭＴｒｉｓーＨＣＬ、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０）３００ｍＬを加え、前記ＩＫＡ社製のミキサー（レベル２）で良く分散させた後、シェイカー（タイテック社製、２００ｒｐｍ、３７℃）で６０分間攪拌した。その後、前記クボタ社製の遠心分離機で遠心分離（１１，０００ｇ、３０分、室温）し、上清を捨て、ＳＤＳ洗浄顆粒（沈殿物）を得た。
（４）ＳＤＳ洗浄顆粒を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう１Ｍの塩化リチウムを含むＤＭＳＯ溶液で懸濁し、８０℃で１時間熱処理した。その後、前記クボタ社製の遠心分離機で遠心分離（１１，０００ｇ、３０分、室温）し、上清を回収した。
（５）回収した上清に対して３倍量のエタノールを準備し、エタノールに回収した上清を加え、室温で１時間静置した。その後、前記クボタ社製の遠心分離機で遠心分離（１１，０００ｇ、３０分、室温）し、凝集タンパク質を回収した。次に純水を用いて凝集タンパク質を洗浄し、遠心分離により凝集タンパク質を回収するという工程を３回繰り返した後、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収した。得られた凍結乾燥粉末における目的タンパク質ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１（約５６．１ｋＤａ）の精製度は、粉末のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＣＢＢ染色）の結果をＴｏｔａｌｌａｂ（ｎｏｎｌｉｎｅａｒｄｙｎａｍｉｃｓｌｔｄ．製）を用いて画像解析することにより確認した。その結果、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１の精製度は約８５％であった。

２．ドープ液の調整
クモ糸タンパク質の濃度５．９８質量％の割合でＤＭＳＯ溶媒に溶かし、ドープ液とした。ドープ液はシェイカーを使用して３時間溶解した後、ゴミと泡を取り除いた。ドープ液の溶液粘度は２３．５ｃＰ（センチポアズ）であった。

３．フィルムキャスト成形
実施例１は、厚さ７５μｍのポリエチレンテレフタレートフィルム（ＰＥＴ）表面にシリコーン化合物を固定化させた離形フィルム（三井化学東セロ株式会社製、商品番号“ＳＰ−ＰＥＴ−０１−７５−ＢＵ”）を基板として使用し、この基板の表面にＭＴＩＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製、マイクロメーター付き、フィルムアプリケータ１５０ｍｍを使用して前記ドープ液をキャスト成形し、濡れ膜を作成した。他の実施例及び比較例は、表１に示された基板を用い、実施例１と同様な操作を行って、濡れ膜を作成した。

４．乾燥
６０℃で１６時間静置させた後、６０℃の真空乾燥機内でさらに１６時間静置し、乾燥した。その後、クモ糸タンパク質未延伸フィルムを基板から剥離した。空気中で剥離できない場合は水中に浸漬して剥離した。

以上のようにして未延伸フィルムを得た結果を表１にまとめて示す。表１の評価は次のとおりである。
＜キャスト性＞
Ａ：基板へのキャスト性は良好で均一膜厚にキャストできる
Ｂ：基板へのキャスト性はやや問題で厚さむらができる
Ｃ：基板からはじかれてしまいキャスト性は不良

＜フィルムの剥離性＞
Ａ：空気中での剥離が良好にできる
Ｂ：空気中での剥離は困難であるが水中では剥離できる
Ｃ：水中でも剥離しない

以上のとおり、本発明の実施例１及び実施例２は、基板がＰＥＴフィルム又はＰＥＴフィルムにシリコーン離形薄膜を形成したフィルムを使用したため、良好な未延伸フィルムが得られた。実施例３は剥離性に、実施例４はキャスト性及び剥離性にやや問題があったがフィルムを作成することはできた。これに対して比較例１は、フィルムは作成できたが剥離性が悪かった。

（実施例５〜８）
実施例１で得られた未延伸フィルムを用いて水中で一軸延伸した。各条件と結果を表２に示す。

表２から５〜７９℃の範囲であれば、水中で延伸できた。２５〜４８℃では２倍以上の延伸倍率が可能であった。

（実施例９）
実施例１で得られた未延伸フィルムを用いて、水中で一軸延伸したフィルムは室温２５℃で収縮してしまうことが分かった。そこで収縮を止めるため熱固定した。各条件と結果を表３に示す。

表３から、延伸後に熱固定すると収縮を止めることが確認できた。

（実施例１０〜１１）
実施例１と同様に未延伸フィルムを作成した。フィルム厚みは２３．４μｍであった（実施例１０）。この未延伸フィルムを５０℃の水中で１．５倍に一軸延伸した。フィルム厚みは１９．８μｍであった（実施例１１）。得られた各フィルムの引っ張り試験結果は次の表４に示すとおりであった。引っ張り試験の環境は２５℃、湿度６０％ＲＨであった。表４における実施例１１の一軸延伸フィルムは延伸方向の値である。このデータは図１にまとめて示す。

実施例１及び実施例１０で得られた未延伸フィルムの屈折率ｎ_Dはいずれも１．５５６であった。また、光透過性測定グラフを図２〜３に示す。図２は実施例１０のフィルム、図３は実施例１１のフィルムの光透過性測定グラフである。光波長２００〜３００ｎｍの紫外光は吸収し、光波長４００〜７８０ｎｍでは８５％以上の光透過率を示している。

次に、実施例１０のフィルムの熱分析測定グラフを図４に示し、実施例１１のフィルムの熱分析測定グラフを図５に示す。いずれも６７〜９４℃付近で４〜８質量％分の質量低下があり、吸収した平衡水分と思われる。また、２４０〜２６０℃付近に分解温度があることが分かった。さらに実施例１０の未延伸フィルムでは１７５℃付近でも質量低下が認められた。残存溶媒のＤＭＳＯであると思われる。

（実施例１２）
実施例１で得られた未延伸フィルム（縦５０ｍｍ、横５０ｍｍ、厚さ３２μｍ）を湿度７８〜８０ＲＨ％，温度２４℃環境下でＸ軸に１．２６倍、Ｙ軸に１．２６倍で同時２軸延伸した。引張りスピードは３０ｍｍ／ｍｉｎであった。延伸装置は井元製作所製，フィルム二軸延伸装置を使用した。同時２軸延伸は可能であった。

（比較例２）
溶媒としてヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）を用い、クモ糸タンパク質は実施例１と同一物を使用した。クモ糸タンパク質の濃度５．９８質量％の割合でＨＦＩＰ溶媒に溶かし、ドープ液とした。キャスト基板は実施例１及び２の基板と同一物を使用した以外は実施例１と同様に実験した。しかし、ＨＦＩＰはＰＥＴ基板を、膨潤させ、溶かしてしまい、基板として使用できなかった。

そこでガラス基板を使用してキャストした。しかし、剥がれにくく、水中で苦労して徐々に剥がし未延伸フィルムを得た。この未延伸フィルムの縦２０ｍｍ、横４０ｍｍのサンプルを手動一軸延伸機（井元製作所製）にセットし（つかみ具間距離２０ｍｍ）、５０℃の温水中で引っ張ったところ、フィルムが一部溶解してしまい、フィルムが切断したため、延伸することができなかった。

（実施例１３）
本実施例は溶媒のＤＭＳＯを除去する方法について実験した。実施例１で得られた未延伸フィルム（厚み５５．２μｍ）を使用して表５に示す溶媒除去をした。ＤＭＳＯ残量定量はＮＭＲを用いて行った。以上の結果を表５に示す。

表５に示す通り、６０℃の真空乾燥ではＤＭＳＯは除去しにくいことがわかった。これに対してメタノール、メタノール／水、温水５０℃ではＤＭＳＯは効率よく除去できた。ＤＭＳＯが検出されない程度であれば、人体適合フィルムとしても使用できる。また、温水中で延伸するだけでＤＭＳＯは約１／１０に減った。

（実施例１４）
本実施例はカラーフィルムを作成する実験をした。まず、ＤＭＳＯに表６に示す各染料を０．５ｗ／ｖ％で添加し、振とうしながら６０℃で２時間溶解させた後、さらに４０℃で１６時間溶解させた。クモ糸タンパク質の濃度が５．９８質量％となる様にこの着色溶液を加え、実施例１と同様にフィルムを作成した。結果を表６に示す。

（実施例１５）
実施例１と同様に未延伸フィルムを作成した。厚みは６９．０μｍのフィルムと１０．１μｍのフィルムであった。スガ試験機株式会社製ヘーズメーター（型式ＨＺ−２Ｐ）に縦３０ｍｍ、横３０ｍｍの未延伸フィルムをセットし、Ｃ光源を用いてヘイズ値を測定した。ヘイズ値は次の式より求めた。
ヘイズ率［％］＝（Ｔｄ拡散透過率／Ｔｔ全光線透過率）×１００
測定結果は以下の通りであった。
（１）厚み６９．０μｍ：Ｔｄ：１．３９，Ｔｔ：９１．６５，Ｈａｚｅ：１．５１（％）
（２）厚み１０．１μｍ：Ｔｄ：０．９３，Ｔｔ：９２．５，Ｈａｚｅ：１（％）
以上から前記未延伸フィルムの透明性は高いことが確認できた。

本発明のフィルムは光透過性が良く、屈折率も比較的高いことから、光導波路、透明導電膜を含む光学フィルムなどに有用である。またカラーフィルムとしても有用である。

配列番号１〜４アミノ酸配列
配列番号５〜７塩基配列
配列番号８〜１１プライマーシーケンス

本発明のクモ糸タンパク質フィルムは、クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドを含み、ジメチルスルホキシド溶媒をドープ溶液として作成した脱溶媒前のフィルムであって、２４０〜２６０℃に分解温度があり、光波長２００〜３００ｎｍの紫外光は吸収し、光波長４００〜７８０ｎｍでは８５％以上の光透過率を有し、可視光領域では無色透明であり、前記フィルムはジメチルスルホキシドを含み、前記フィルムは未延伸、１軸延伸又は２軸延伸フィルムであることを特徴とする。

Claims

クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドを含むフィルムであって、
２４０〜２６０℃に分解温度があり、
光波長２００〜３００ｎｍの紫外光は吸収し、光波長４００〜７８０ｎｍでは８５％以上の光透過率を有し、
可視光領域では無色透明であることを特徴とするクモ糸タンパク質フィルム。
前記クモ糸タンパク質フィルムは未延伸であり、脱溶媒前の未延伸フィルム中にはジメチルスルホキシドが存在している請求項１に記載のクモ糸タンパク質フィルム。
前記クモ糸タンパク質フィルムは１軸延伸又は２軸延伸フィルムである請求項１又は２に記載のクモ糸タンパク質フィルム。
前記クモ糸タンパク質フィルムの光波長５９０ｎｍにおける屈折率は、１．２〜１．６の範囲である請求項１〜３のいずれか１項に記載のクモ糸タンパク質フィルム。
前記クモ糸タンパク質フィルムは水分吸収性があり、示差熱熱重量同時測定装置（ＴＧ−ＤＴＡ）において６７〜９４℃付近で質量低下がある請求項１〜４のいずれか１項に記載のクモ糸タンパク質フィルム。
前記未延伸フィルムは、最大点応力が６〜２０ＭＰａであり、破断点変位（ひずみ）が２０〜１５０％である請求項１〜５のいずれか１項に記載のクモ糸タンパク質フィルム。
前記クモ糸タンパク質フィルムには、ジメチルスルホキシドに溶解又は分散が可能な着色料が添加され着色されている請求項１〜６のいずれか１項に記載のクモ糸タンパク質フィルム。
前記クモ糸タンパク質フィルムの延伸フィルムは、最大点応力が４０ＭＰａ以上であり、破断点変位（ひずみ）が１０〜５０％である請求項２〜７のいずれか１項に記載のクモ糸タンパク質フィルム。
クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドを含むフィルムの製造方法であって、
クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドをジメチルスルホキシド溶媒に溶解させ、ドープ溶液とし、
前記ドープ溶液を基材表面にキャスト成形することを特徴とするクモ糸タンパク質フィルムの製造方法。
前記ドープ溶液の粘度は１５〜８０ｃＰである請求項９に記載のクモ糸タンパク質フィルムの製造方法。
前記キャスト成形の際に使用する基材は、ポリエチレンテレフタレートフィルム（ＰＥＴ）又はＰＥＴ表面にシリコーン化合物を固定化させた離形フィルムである請求項９又は１０に記載のクモ糸タンパク質フィルムの製造方法。
前記フィルムを真空乾燥、熱風乾燥、風乾、及び液中浸漬から選ばれる少なくとも一つの手段で乾燥及び／又は脱溶媒する請求項９〜１１のいずれか１項に記載のクモ糸タンパク質フィルムの製造方法。
前記乾燥及び／又は脱溶媒後のフィルムを水中で一軸延伸又は２軸延伸するか、又は延伸時に同時に脱溶媒する請求項９〜１２のいずれか１項に記載のクモ糸タンパク質フィルムの製造方法。
前記延伸後のフィルムを５０〜２００℃の乾熱で熱固定する請求項１３に記載のクモ糸タンパク質フィルムの製造方法。
着色剤をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解又は分散させてＤＭＳＯ着色液とし、前記着色液をドープ溶液に加えるか又はドープ溶液に前記着色液を加えて混合し、フィルムキャスト用ドープ液とする請求項９〜１４のいずれか１項に記載のクモ糸タンパク質フィルムの製造方法。