JPWO2014017615A1 - Rna合成用モノマー、その製造方法、およびrnaの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
R1は、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジメチルイソプロピルシリル基、ジエチルイソプロピルシリル基、ジメチルテキシルシリル基、t−ブチルジメチルシリル基、t−ブチルジフェニルシリル基、トリベンジルシリル基、トリ−p−キシリルシリル基、トリフェニルシリル基、ジフェニルメチルシリル基およびt−ブチルメトキシフェニルシリル基から選択されるシリル系保護基;トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基、p−メトキシフェニルジフェニルメチル基、ジ(p−メトキシフェニル)フェニルメチル基、トリ(p−メトキシフェニル)メチル基、4−(4’−ブロモフェナシルオキシ)フェニルジフェニルメチル基、4,4’,4”−トリス(4,5−ジクロロフタルイミドフェニル)メチル基、4,4’,4”−トリス(レブリノイルオキシフェニル)メチル基、4,4’,4”−トリス(ベンゾイルオキシフェニル)メチル基、3−(イミダゾイル−1−イルメチル)ビス(4’,4”−ジメトキシフェニル)メチル基および1,1−ビス(4−メトキシフェニル)−1’−ピレニルメチル基から選択されるトリチル系保護基;または、t−ブトキシカルボニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびベンジルオキシカルボニル基から選択されるカーバメート系保護基を示し;
R2は、C1-24アルキル基、C2-24アルケニル基またはC1-24ハロゲン化アルキル基を示す]
当該RNA合成用モノマー(I)は、非常に効率的に製造できるものであるので、RNA合成のモノマーとして用いれば、RNA合成の全体的な製造効率を顕著に高めることができる。
例えば、塩基部分がアデニンであるRNA合成用モノマー(I’)は、2−5Aの原料化合物として有用である。詳しくは、3〜6個のアデノシンが2’,5’リン酸結合しているオリゴマーは2−5Aと呼ばれており、補酵素としてRNase Lを活性化し、病原ウィルスのmRNAを分解する。このRNase Lは、インターフェロンが細胞膜受容体に結合することにより誘導される。即ち、当該RNA合成用モノマー(I’)は、インターフェロンによる治療システムの一端を担う2−5Aの原料化合物として有用である。
当該RNA合成用モノマーとして、下記式(I)の3’−H−ホスホン酸エステル、下記式(I’)の2’−H−ホスホン酸エステルまたはその塩を製造するためのものであり;
リパーゼの存在下、H−ホスホン酸エステル化された5’保護リボヌクレオシド(II)と、下記式(III)の化合物:
R2C(=O)OR3 ・・・ (III)
[式中、R2は前記と同義を示し;R3は、−H、C1-6アルキル基、C2-6アルケニル基、−C(=O)R2または−N=C(C1-6アルキル)2を示す]
とを反応させることにより、2’位水酸基または3’位水酸基を選択的にエステル化する工程を含むことを特徴とする。
本発明に係るRNA合成用モノマーの製造方法では、さらに、5’保護リボヌクレオシド(IV)に三ハロゲン化リンを作用させ、2’位水酸基または3’位水酸基をH−ホスホン酸エステル化することによりH−ホスホン酸エステル化された5’保護リボヌクレオシド(II)を得る工程を含むことが好ましい。
本発明方法では、リパーゼを用いて2’位水酸基または3’位水酸基を選択的にエステル化することができるので、その前工程において、2’位水酸基または3’位水酸基を選択的に保護する必要が無い。また、上記反応により得られるH−ホスホン酸エステル化された5’保護リボヌクレオシドにおいて、H−ホスホン酸基は2’位と3’位との間で転位するため、何れかの位置異性体がリパーゼ反応で消費されると平衡が傾き、リパーゼの基質化合物ではない位置異性体が基質化合物に変化するため、ホスホン酸エステル化を効率的に進めることができる。
5’位水酸基の反応性は、塩基部分中のアミノ基や2’位水酸基、3’位水酸基とも区別できるので、5’位水酸基のみを選択的に保護することは比較的容易である。また、本発明方法では、塩基部分中のアミノ基を保護する必要が無い。
下記式(I)または(I’)で表されることを特徴とするRNA合成用モノマーまたはその塩と
下記式(VI)で表される固定化RNAとを縮合する工程
R2は上記と同義を示し;
Xは可溶性高分子を示し;
nは整数を示す;
但し、n=0の場合、リン酸ジエステル基は水酸基であるものとする;
また、各リボース単位において、2’位および3’位の置換基は互いに入れ替わっていてもよいものとする];
亜リン酸ジエステル基を酸化する工程;および
R1を除去する工程を含むことを特徴とする。
R2とXは上記と同義を示し;
R4は、上記R1と同義を示すか或いは水素原子を示し;
mは1以上の整数を示し;
但し、各リボース単位において、2’位および3’位の置換基は互いに入れ替わっていてもよいものとする]
本発明において、「C1-24アルキル基」とは、炭素数1〜24の直鎖状または分枝鎖状の飽和炭化水素基を意味する。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、s−ブチル基、t−ブチル基、ペンチル基、s−ペンチル基、イソペンチル基、メチルブチル基、ネオペンチル基、エチルプロピル基、ヘキシル基、s−ヘキシル基、イソヘキシル基、メチルペンチル基、ジメチルブチル基、エチルブチル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デカニル基、ドデカニル基、テトラデカニル基、ヘキサデカニル基、オクタデカニル基、イコサニル基、ドコサニル基、テトラコサニル基を挙げることができる。立体障害の小ささや置換基(−C(=O)R2)の導入のし易さや除去のし易さの観点からは、R2としてはC1-6アルキル基が好ましく、C1-4アルキル基がより好ましく、C1-2アルキル基がさらに好ましく、メチル基が最も好ましい。また、炭素数が多いとモノマーの脂溶性が高まり、特に長鎖RNAの合成の際に有機溶媒に対する溶解性が向上し、反応効率の低下を回避することが可能になり得る。かかる観点からは、R2としてはC10-24アルキル基が好ましく、C12-20アルキル基がより好ましく、C14-18アルキル基がさらに好ましい。また、本発明に係るRNA合成用モノマーを重合してRNAを製造する場合には、溶解度を向上させるために、5〜10塩基ごとにR2として比較的長鎖の上記アルキル基を導入することが好ましい。
本発明方法の中間化合物である5’保護リボヌクレオシド(IV)は、出発原料化合物であるリボヌクレオシド(V)の5’位水酸基を選択的に保護することにより得られる。
上記反応では、リボヌクレオシドを溶媒に溶解し、保護試薬を直接または溶媒に溶解した上で加え、反応させればよい。
次に、5’保護リボヌクレオシド(IV)の溶液に三ハロゲン化リンを加え、2’位水酸基または3’位水酸基をH−ホスホン酸エステル化することにより、本発明方法に特徴的なリパーゼ反応の基質化合物であり、H−ホスホン酸エステル化された5’保護リボヌクレオシド(II)を得る。なお、当該反応では、下記式のとおり、5’保護リボヌクレオシド(IV)がいったんホスフィチル化された後、水の存在下で加水分解されて2’ホスホン酸エステルまたは3’ホスホン酸エステルとなり、また、水溶液中では、ホスフィチル体を介して2’ホスホン酸エステルと3’ホスホン酸エステルが平衡状態にあると考えられる。
次に、リパーゼの存在下、H−ホスホン酸エステル化された5’保護リボヌクレオシド(II)と、下記式(III)の化合物:
R2C(=O)OR3 ・・・ (III)
[式中、R2およびR3は前記と同義を示す]
とを反応させることにより、H−ホスホン酸エステル化された5’保護リボヌクレオシド(II)の2’位水酸基または3’位水酸基を選択的にエステル化し、3’ホスホン酸エステル(I)または2’ホスホン酸エステル(I’)を得る。
先ず、本発明に係るRNA合成用モノマー(I)と固定化RNA(VI)とを縮合する。
上記縮合工程で得られた固定化RNA(VII)では、RNA合成用モノマー(I)と固定化RNA(VI)とが亜リン酸ジエステル基で結合されている。そこで、当該亜リン酸ジエステル基を酸化する必要がある。
次に、R1を除去し、5’位を脱保護する。下記反応式でも、上記反応式でも、各リボース単位の2’位と3’位の置換基は、互いに入れ替わっていてもよい。但し好適には、可溶性高分子が置換している末端リボース以外の各リボース単位の2’位と3’位の置換基は、何れも共通することが好ましい。
上記工程(4)〜(6)を繰返し、所望の塩基配列を有するRNA鎖が得られた後は、可溶性高分子が結合した末端リボースの2’位と3’位を脱保護することによりRNAとする。
(1−1) 5’−O−TBDMS−リボヌクレオシドの合成
4種のリボヌクレオシド(100mmol)の無水ピリジン溶液(200mL)に対して、塩化t−ブチルジメチルシリル(14.3g,95mmol)の無水ピリジン溶液(100mL)を、カニュラーを用いて0℃でゆっくりと加えた。得られた反応混合液の温度を室温まで昇温したのち、4時間撹拌した。エバポレータを用いて反応混合液を濃縮した後、濃縮物を塩化メチレン(200mL)に溶解または懸濁した。得られた溶液または懸濁液を、撹拌した蒸留水(500mL)に滴下した。有機相を分離した後、硫酸ナトリウムで乾燥し、さらにエバポレータを用いて濃縮することにより粗生成物を得た。粗生成物は蒸留水−メタノールで再結晶することにより精製した。得られた結晶をアセトニトリルあるいはアセトンで洗浄することにより、目的の5’−O−TBDMS体を得た(収率:83〜88%)。
アデノシン(100mmol)の無水ピリジン溶液(400mL)に対して、塩化t−ブチルジメチルシリル(14.3g,95mmol)の無水ピリジン溶液(100mL)を、カニュラーを用いて0℃でゆっくりと加えた。得られた反応混合液の温度を室温まで昇温したのち、4時間撹拌した。エバポレータを用いて反応混合液を濃縮した後、濃縮物を塩化メチレン(200mL)に溶解した。得られた溶液を、撹拌した蒸留水(500mL)に滴下した。有機相を分離した後、エバポレータを用いて濃縮することにより粗生成物を得た。粗生成物はアセトニトリルで再結晶することにより精製した。得られた結晶をアセトニトリルで洗浄することにより、目的の5’−O−TBDMS体を得た(収率:85%)。
シチジン(100mmol)の無水ピリジン溶液(400mL)に対して、塩化t−ブチルジメチルシリル(14.3g,95mmol)の無水ピリジン溶液(100mL)を、カニュラーを用いて0℃でゆっくりと加えた。得られた反応混合液の温度を室温まで昇温したのち、4時間撹拌した。エバポレータを用いて反応混合液を濃縮した後、濃縮物を塩化メチレン(200mL)に溶解または懸濁した。得られた溶液または懸濁液を、撹拌した蒸留水(500mL)に滴下した。有機相を分離した後、酢酸エチルを加えて粗生成物を結晶として得た。さらに酢酸エチル−塩化メチレンで再結晶することにより目的の5’−O−TBDMS体を得た(収率:88%)。
ウリジン(100mmol)の無水ピリジン溶液(200mL)に対して、塩化t−ブチルジメチルシリル(14.3g,95mmol)の無水ピリジン溶液(100mL)を、カニュラーを用いて0℃でゆっくりと加えた。得られた反応混合液の温度を室温まで昇温したのち、4時間撹拌した。エバポレータを用いて反応混合液を濃縮した後、濃縮物を塩化メチレン(200mL)に溶解した。得られた溶液を、撹拌した蒸留水(500mL)に滴下した。有機相を分離した後、エバポレータを用いて濃縮することにより粗生成物を得た。粗生成物を中圧クロマト装置(山善社製,製品名「YFLC AI−580」)とHigh−Flash 40μmsize4Lカラムを用いて、塩化メチレン−メタノールを溶出溶媒として精製し、目的の5’−O−TBDMS体を得た(収率:83%)。
グアノシン(100mmol)の塩化メチレン(200mL)懸濁液に対してジメチルホルムアミドジメチルアセタール(500mmol)を加え、室温で8時間撹拌した。反応液をろ過し、得られた固体を乾燥した後、無水ピリジン溶液(200mL)に溶解した。この溶液に塩化t−ブチルジメチルシリル(14.3g,95mmol)の無水ピリジン溶液(100mL)を、カニュラーを用いて0℃でゆっくりと加えた。得られた反応混合液の温度を室温まで昇温したのち、4時間撹拌した。エバポレータを用いて反応混合液を濃縮した後、濃縮物を塩化メチレン(200mL)に溶解した。得られた溶液を撹拌した蒸留水(500mL)に滴下し、有機相を分離した後、エバポレータを用いて濃縮することにより粗生成物を得た。粗生成物をアセトニトリルで再結晶することにより、目的の5’−O−TBDMS体を得た(収率:83〜88%)。
上記で得られた4種の5’−O−TBDMS−リボヌクレオシド(80mmol)、1,2,4−トリアゾール(16.6g,240mmol)、ジイソプロピルエチルアミン(35.6mL,240mmol)の無水ピリジン溶液(160mL)に対して、蒸留した三塩化リン(7.0mL,80mmol)を、カニュラーを用いて−78℃でゆっくりと滴下し、30分撹拌した。反応液を、0℃に冷却した5%炭酸水素ナトリウム水溶液(200mL)に滴下し、10分撹拌した。反応液を、排除限界分子量100の透析膜(Cellulose Ester(CE) Dialysis Membranes,Spectrum製)に封入し、メタノールに対して15時間透析し、反応試薬由来の不純物と溶媒を交換した。得られた溶液を濃縮し、粗生成物を得た。得られた粗生成物を下記条件のクロマトグラフィに付し、目的化合物であるホスホン酸エステル混合物を得た(収率:65〜77%)。
カラム担体: ODSシリカ担体(60μm)
装置: 中圧逆相クロマトグラフ装置(昭光サイエンティフィック社製,Purif−compact)
溶離液: 0〜50%アセトニトリル水溶液
(2−2) 5’−O−TBDMS アデノシン 2’−または3’−H−ホスホン酸エステル混合物の合成
イミダゾール(49g,720mmol)の塩化メチレン(200mL)溶液に対して、蒸留した三塩化リン(10mL,120mmol)を−50℃下でゆっくりと滴下した。当該溶液に5’−O−TBDMSアデノシン(22.9mmol,60mmol)の無水ピリジン溶液(200mL)を、カニュラーを用いてゆっくりと滴下し、30分以上かけて0℃まで昇温し、そのまま30分撹拌した。反応液に28%アンモニア水(100mL)を加え、室温で一晩撹拌した。得られた溶液を濃縮して粗生成物を得たのち、中圧クロマト装置(山善社製,製品名「YFLC AI−580」)とHigh−Flash 40μmsize4Lカラムを用いて、塩化メチレン−メタノールを溶出溶媒として精製し、目的化合物であるホスホン酸エステル混合物を得た(収率:77%)。
イミダゾール(25g,360mmol)の塩化メチレン(100mL)溶液に対して、蒸留した三塩化リン(5.0mL,60mmol)を−50℃下でゆっくりと滴下した。当該溶液に5’−O−TBDMSシチジン(10.8g,60mmol)の無水ピリジン溶液(100mL)を、カニュラーを用いてゆっくりと滴下し、30分以上かけて0℃まで昇温し、そのまま30分撹拌した。反応液に28%アンモニア水(100mL)を加え、室温で一晩撹拌した。得られた溶液を濃縮して粗生成物を得たのち、粗生成物を中圧クロマト装置(山善社製,製品名「YFLC AI−580」)とHigh−Flash 40μmsize4Lカラムを用いて、塩化メチレン−メタノールを溶出溶媒として精製し、目的化合物であるホスホン酸エステル混合物を得た(収率:75%)。
イミダゾール(25g,360mmol)の塩化メチレン(100mL)溶液に対して、蒸留した三塩化リン(5.0mL,60mmol)を−50℃下でゆっくりと滴下した。当該溶液に5’−O−TBDMSウリジン(10.8g,30mmol)の無水ピリジン溶液(100mL)を、カニュラーを用いてゆっくりと滴下し、30分以上かけて0℃まで昇温し、そのまま30分撹拌した。反応液に28%アンモニア水(100mL)を加え、室温で一晩撹拌した。得られた溶液を濃縮して粗生成物を得たのち、粗生成物を中圧クロマト装置(山善社製,製品名「YFLC AI−580」)とHigh−Flash 40μmsize4Lカラムを用いて、塩化メチレン−メタノールを溶出溶媒として精製し、目的化合物であるホスホン酸エステル混合物を得た(収率:75%)。
イミダゾール(25g,360mmol)の塩化メチレン(100mL)溶液に対して、蒸留した三塩化リン(5.0mL,60mmol)を−50℃下でゆっくりと滴下した。当該溶液に5’−O−TBDMSグアノシン(13.6g,30mmol)の無水ピリジン溶液(100mL)を、カニュラーを用いてゆっくりと滴下し、30分以上かけて0℃まで昇温し、そのまま30分撹拌した。反応液に28%アンモニア水(100mL)を加え、室温で一晩撹拌した。得られた溶液を濃縮して粗生成物を得た後、中圧クロマト装置(昭光サイエンティフィック社製,製品名「PrifCompact」)とPrifPack ODS 30μmsize200カラムを用いて、塩化メチレン−メタノールを溶出溶媒として精製し、目的化合物であるホスホン酸エステル混合物を得た(収率:75%)。
上記(2)で得られた4種の5’−O−TBDMS−リボヌクレオシド H−ホスホン酸エステル混合物(50mmol)の無水DMF溶液(250mL)に対して、酢酸ビニル(23.4mL,250mmol)とCandida Cyclindracea(Candida rugosa)由来のリパーゼ(1.0g)を加え、55℃で24時間振とうした。リパーゼを濾別し、濾液をエバポレータで濃縮することにより粗生成物を得た。得られた粗生成物を、溶離液を5〜25%アセトニトリル水溶液に変更した以外は上記(2)と同様の条件のクロマトグラフィに付し、目的化合物である3’−H−ホスホン酸エステルを得た(収率:55〜81%)。
上記(2)で得られた5’−O−TBDMSアデノシン H−ホスホン酸エステル混合物(17g,25mmol)のt−ブタノール溶液(125mL)に対して、無水酢酸(7.1mL,75mmol)とブタ膵臓由来のリパーゼ(1.0g)を加え、37℃で8時間振とうした。リパーゼを濾別し、濾液をエバポレータで濃縮することにより粗生成物を得た。粗生成物は昭光サイエンティフィック社製中圧クロマト装置PrifCompact上で、PrifPack ODS30μm size200カラムを用いて、脱気した水−メタノールを溶出溶媒として精製し、目的化合物である3’−H−ホスホン酸エステルを得た(13.2g,収率:76%)。
1H NMR(500 MHz,CD3OD):δ8.74(1H,s),8.51(1H,s), 8.11-8.17(2H,br S),6.93(1H,d,J = 588 Hz),6.58-6.71(1H,m),6.17-6.24(1H,m),5.09-5.47(1H,m),4.42-4.55(5H,m),3.49-3.66(2H,m),2.36(3H,s),0.82(9H,s),0.02(3H,s),-0.06(3H,s)
31P NMR(202.5 MHz,CD3OD):δ2.0
ESI-TOF MS:calcd for C18H29N5O7PSi,[M-H]-m/z:486.16,Found m/z:486.36
得られた目的化合物を、逆相カラムを用いた下記条件のHPLCで分析した。得られたHPLCチャートを図1に示す。
ポンプ:日本分光社製「PU−980」
サンプリングユニット:日本分光社製「AS−2057plus」
UV−VIS検出器:日本分光社製「UV−970」
カラムオーブン:日本分光社製「860−CO」
カラム:ナカライテスク社製「5C18 COSMOSIL−AR−II 4.6×250mm」
溶出液:0.1M TEAA buffer(pH7.0)/CH3CN aq (CH3CN aqの割合を、30分間かけて2%から60%とした)
溶出速度:0.5mL/min
分析温度:40℃
検出波長:260nm
図1のとおり、酵素を用いたアセチル化により、高い立体選択性をもって2’位をアセチル化できることが実証された。
上記(2)で得られた5’−O−TBDMSシチジン H−ホスホン酸エステル混合物(6.6g,10mmol)のt−ブタノール溶液(25mL)に対して、無水酢酸(2.8mL,30mmol)とブタ膵臓(0.4g)を加え、37℃で24時間振とうした。リパーゼを濾別し、濾液をエバポレータで濃縮することにより粗生成物を得た。昭光サイエンティフィック社製中圧クロマト装置PrifCompact上で、PrifPack ODS30μm size200カラムを用いて、脱気した水−メタノールを溶出溶媒として精製し、目的化合物である3’−H−ホスホン酸エステルを得た(5.54g,収率:80%)。
1H NMR(500 MHz,CD3OD):7.95-8.20(2H,br S),δ7.73(1H,d,J = 17.3),6.63(1H,d,J = 593 Hz),6.32-6.65(1H,m),6.05-6.37(1H,m),5.94(1H,d,J = 17.3),5.09-5.40(2H,m),4.18-4.63(5H,m),3.63-3.72(2H,m),2.45(3H,s),0.81(9H,s),0.04(3H,s),-0.02(3H,s)
31P NMR(202.5 MHz,CD3OD):δ2.2
ESI-TOF MS:calcd for C17H29N3O8PSi,[M-H]-m/z:462.15,Found m/z:462.23
(3−4) 2’−O−アセチル−5’−O−TBDMS−ウリジン 3’−H−ホスホン酸エステルモノマーの合成
上記(2)で得られた5’−O−TBDMSウリジン H−ホスホン酸エステル混合物(6.6g,10mmol)のt−ブタノール溶液(25mL)に対して、無水酢酸(2.8mL,30mmol)とブタ膵臓由来のリパーゼ(0.4g)を加え、37℃で24時間振とうした。リパーゼを濾別し、濾液をエバポレータで濃縮することにより粗生成物を得た。昭光サイエンティフィック社製中圧クロマト装置PrifCompact上で、PrifPack ODS30μm size200カラムを用いて、脱気した水−メタノールを溶出溶媒として精製し、目的化合物である3’−H−ホスホン酸エステルヌクレオシドモノマーを得た(5.61g,収率:81%)。
1H NMR(500 MHz,CD3OD):δ7.88(1H,d,J = 17.2),6.63(1H,d,J = 579 Hz),6.21-6.59(1H,m),5.58-6.07(1H,m),5.79(1H,d,J = 17.3),4.99-5.28(2H,m),4.10-4.73(5H,m),3.73-3.88(2H,m),2.27(3H,s),0.82(9H,s),0.01(3H,s),-0.06(3H,s)
31P NMR(202.5 MHz,CD3OD):δ2.1
ESI-TOF MS:calcd for C17H28N2O9PSi,[M-H]-m/z:463.13,Found m/z:463.51
得られた目的化合物を、上記実施例1(3−2)と同様の条件のHPLCで分析した。得られたHPLCチャートを図2に示す。図2のとおり、酵素を用いたアセチル化により、ウリジンでも、高い立体選択性をもって2’位をアセチル化できることが実証された。
上記(2)で得られた5’−O−TBDMSグアノシン H−ホスホン酸エステル混合物(7.03g,10mmol)のt−ブタノール溶液(25mL)に対して、無水酢酸(2.8mL,30mmol)とブタ膵臓由来のリパーゼ(0.4g)を加え、37℃で24時間振とうした。リパーゼを濾別し、濾液をエバポレータで濃縮することにより粗生成物を得た。昭光サイエンティフィック社製中圧クロマト装置PrifCompact上で、PrifPack ODS30μm size200カラムを用いて、脱気した水−メタノールを溶出溶媒として精製し、目的化合物である3’−H−ホスホン酸エステルヌクレオシドモノマーを得た(4.8g,収率:55%)。
1H NMR(500 MHz,DMSO-D6):δ10.46-10.64(1H,br s),8.07(1H,s),7.23-7.56(2H,br S),6.54(1H,d,J = 592 Hz),5.28-6.59(3H,m),4.45-4.98(5H,m),3.63-3.79(2H,m),2.34(3H,s),0.77(9H,s),-0.03(3H,s),-0.12(3H,s)
31P NMR(202.5 MHz,DMSO-D6):δ1.7
ESI-TOF MS:calcd for C18H29N5O7PSi,[M-H]-m/z:502.51,Found m/z:502.77
(1) 3’−O−アセチル−5’−O−TBDMS−リボヌクレオシド 2’−H−ホスホン酸エステルの合成
上記実施例1(2)で得た4種の5’−O−TBDMS−リボヌクレオシド H−ホスホン酸エステル混合物(50mmol)の無水ピリジン溶液(250mL)に対して、酢酸ビニル(23.4mL,250mmol)とブタ膵臓由来リパーゼ(2.0g)を加え、55℃で24時間振とうした。リパーゼを濾別し、濾液をエバポレータで濃縮することにより粗生成物を得た。得られた粗生成物を上記実施例1(3)と同様の条件のクロマトグラフィに付し、目的化合物である2’−H−ホスホン酸エステルモノマーを得た(収率:52〜80%)。
上記実施例1(2)で得た5’−O−TBDMSアデノシン H−ホスホン酸エステル混合物(6.7g,10mmol)の無水DMF溶液(25mL)に対して、無水酢酸(2.8mL,30mmol)とLipasePS AmanoSD(0.4g)を加え、37℃で8時間振とうした。リパーゼを濾別し、濾液をエバポレータで濃縮することにより粗生成物を得た。粗生成物は昭光サイエンティフィック社製中圧クロマト装置PrifCompact上で、PrifPack ODS30μm size200カラムを用いて、脱気した水−メタノールを溶出溶媒として精製し、目的化合物である2’−H−ホスホン酸エステルモノマーを得た(5.35g,収率:80%)。
H NMR(500 MHz,CD3OD):δ8.72(1H,s),8.48(1H,s),8.03-12(2H,br S),6.58(1H,d,J = 573 Hz),6.62-6.73(1H,m),5.57-6.19(2H,m),4.68-5.01(4H,m),3.49-3.66(2H,m),2.41(3H,s),0.81(9H,s),0.03(3H,s),-0.05(3H,s)
31P NMR(202.5 MHz,CD3OD):δ2.4
ESI-TOF MS:calcd for C18H29N5O7PSi,[M-H]-m/z:486.16,Found m/z:486.41
得られた目的化合物を、上記実施例1(3−2)と同様の条件のHPLCで分析した。得られたHPLCチャートを図2に示す。図2のとおり、酵素を用いたアセチル化により、高い立体選択性をもって3’位もアセチル化できることが実証された。
(1) 5’−O−TBDMS−ウリジン 2’−アセチル−3’−酒石酸エステルおよび3’−アセチル2’−酒石酸エステル混合物の合成
5’−O−TBDMSウリジン(1.08g,3.0mmol)の無水ピリジン溶液(10mL)に対して、無水酒石酸(300mg,3.0mmol)を0℃下で加え、そのまま1時間撹拌した。反応液に無水酢酸(570μL,6.0mmol)を加え、0℃で30分撹拌した。反応液にメタノールを加え、得られた溶液を濃縮して粗生成物を得た後、中圧クロマト装置(昭光サイエンティフィック社製,PrifCompact)と分離精製用カラム(昭光サイエンティフィック社製,PurifPack ODS30μm size60)を用いて、脱気した水−メタノールを溶出溶媒として精製し、目的化合物である5’−O−TBDMS−ウリジン アセチル−酒石酸エステル混合物を得た(1.2g,収率:73%)。
上記(1)で得られた5’−O−TBDMS−ウリジン アセチル−酒石酸エステル混合物(1.1g,2.0mmol)およびモノメトキシポリエチレングリコール(平均分子量5000,5.0g,1.0mmol)の無水アセトニトリル溶液(10mL)に対して、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(810mg,6.0mmol)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(0.93mL,6.0mmol)を加え、室温で一晩撹拌した。反応液にTBAFのTHF溶液(1.0M,4.0mL,4.0mmol)を加え、室温で撹拌した後、CellfineGH−25(50mL,溶離液:メタノール)を用いて精製し、ウリジン担持ポリエチレングリコールを得た(1.0g,収率:95%)。
上記(2)で得られたウリジン担持ポリエチレングリコール(1.0g,1.9mmol)と、上記実施例1(3−2)で得られた2’−O−アセチル−5’−O−TBDMS−アデノシン 3’−H−ホスホン酸エステルモノマー(2.0mmol)のアセトニトリル(4.0mL)溶液に、塩化ピバリル酸(490μL,4.0mmol)およびトリエチルアミン(560μL,4.0mmol)を加えた。モノマーの消費をYMC PakDiol60(溶離液:0.1M,NaCl)で追跡しながら1時間撹拌した。
上記反応溶液に、20mMヨウ素水/ピリジン/THF溶液(1.0mL,20mmol)を添加して30分撹拌した。
さらに、上記反応液にTBAFのTHF溶液(1.0M,4.0mL,4.0mmol)を加えて1時間撹拌した。次いで、CellfineGH−25(50mL)で精製した。
上記担持2量体RNAをメタノール(125mL)に溶解し、Thermomyces lanuginosus由来のリパーゼ(5.0mL)を加え、室温で48時間振とうした。リパーゼを濾別し、反応液を凍結乾燥した後、昭光サイエンティフィック社製中圧クロマト装置PrifCompact上で、YMC ODSpack 25μm 200カラムを用いて、オートクレーブおよび脱気した水−メタノールを溶出溶媒として精製し、目的のRNA2量体(1.5g)を得た。得られたRNA2量体がテトラブチルアンモニウム塩であるとして計算した通算収率は95%であった。得られたRNA2量体の分析結果を以下に示す。
ESI-TOF MS:calcd for C19H23N7O12P,[M-H]- m/z:572.11,Found m/z:572.23
また、上記実施例1(3−2)と同様の条件で、得られた溶液をHPLCで分析した。得られたHPLCチャートを図3に示す。図3のとおり、本発明方法により得られたRNA2量体の純度は高いものであった。
上記実施例3と同様の条件で、さらに上記(3)〜(5)のプロセスを繰り返し、可溶化高分子に担持された5’−rGCA UUU UUA UUU UUU UUU UUU−3’の配列のRNA21量体の保護体がポリエチレングリコールに固定化された化合物を合成した。
得られたHPLCチャートを図4に示す。
Claims (9)
- 下記式(I)で表されることを特徴とするRNA合成用モノマーまたはその塩。
[式中、
R1は、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジメチルイソプロピルシリル基、ジエチルイソプロピルシリル基、ジメチルテキシルシリル基、t−ブチルジメチルシリル基、t−ブチルジフェニルシリル基、トリベンジルシリル基、トリ−p−キシリルシリル基、トリフェニルシリル基、ジフェニルメチルシリル基およびt−ブチルメトキシフェニルシリル基から選択されるシリル系保護基;トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基、p−メトキシフェニルジフェニルメチル基、ジ(p−メトキシフェニル)フェニルメチル基、トリ(p−メトキシフェニル)メチル基、4−(4’−ブロモフェナシルオキシ)フェニルジフェニルメチル基、4,4’,4”−トリス(4,5−ジクロロフタルイミドフェニル)メチル基、4,4’,4”−トリス(レブリノイルオキシフェニル)メチル基、4,4’,4”−トリス(ベンゾイルオキシフェニル)メチル基、3−(イミダゾイル−1−イルメチル)ビス(4’,4”−ジメトキシフェニル)メチル基および1,1−ビス(4−メトキシフェニル)−1’−ピレニルメチル基から選択されるトリチル系保護基;または、t−ブトキシカルボニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびベンジルオキシカルボニル基から選択されるカーバメート系保護基を示し;
R2は、C1-24アルキル基、C2-24アルケニル基またはC1-24ハロゲン化アルキル基を示す] - 下記式(I’)で表されることを特徴とするRNA合成用モノマーまたはその塩。
[式中、
R1は、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジメチルイソプロピルシリル基、ジエチルイソプロピルシリル基、ジメチルテキシルシリル基、t−ブチルジメチルシリル基、t−ブチルジフェニルシリル基、トリベンジルシリル基、トリ−p−キシリルシリル基、トリフェニルシリル基、ジフェニルメチルシリル基およびt−ブチルメトキシフェニルシリル基から選択されるシリル系保護基;トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基、p−メトキシフェニルジフェニルメチル基、ジ(p−メトキシフェニル)フェニルメチル基、トリ(p−メトキシフェニル)メチル基、4−(4’−ブロモフェナシルオキシ)フェニルジフェニルメチル基、4,4’,4”−トリス(4,5−ジクロロフタルイミドフェニル)メチル基、4,4’,4”−トリス(レブリノイルオキシフェニル)メチル基、4,4’,4”−トリス(ベンゾイルオキシフェニル)メチル基、3−(イミダゾイル−1−イルメチル)ビス(4’,4”−ジメトキシフェニル)メチル基および1,1−ビス(4−メトキシフェニル)−1’−ピレニルメチル基から選択されるトリチル系保護基;または、t−ブトキシカルボニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびベンジルオキシカルボニル基から選択されるカーバメート系保護基を示し;
R2は、C1-24アルキル基、C2-24アルケニル基またはC1-24ハロゲン化アルキル基を示す] - RNA合成用モノマーを製造するための方法であって、
当該RNA合成用モノマーは、下記式(I)の3’−H−ホスホン酸エステル、下記式(I’)の2’−H−ホスホン酸エステルまたはその塩であり;
[式中、
R1は、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジメチルイソプロピルシリル基、ジエチルイソプロピルシリル基、ジメチルテキシルシリル基、t−ブチルジメチルシリル基、t−ブチルジフェニルシリル基、トリベンジルシリル基、トリ−p−キシリルシリル基、トリフェニルシリル基、ジフェニルメチルシリル基およびt−ブチルメトキシフェニルシリル基から選択されるシリル系保護基;トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基、p−メトキシフェニルジフェニルメチル基、ジ(p−メトキシフェニル)フェニルメチル基、トリ(p−メトキシフェニル)メチル基、4−(4’−ブロモフェナシルオキシ)フェニルジフェニルメチル基、4,4’,4”−トリス(4,5−ジクロロフタルイミドフェニル)メチル基、4,4’,4”−トリス(レブリノイルオキシフェニル)メチル基、4,4’,4”−トリス(ベンゾイルオキシフェニル)メチル基、3−(イミダゾイル−1−イルメチル)ビス(4’,4”−ジメトキシフェニル)メチル基および1,1−ビス(4−メトキシフェニル)−1’−ピレニルメチル基から選択されるトリチル系保護基;または、t−ブトキシカルボニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびベンジルオキシカルボニル基から選択されるカーバメート系保護基を示し;
R2は、C1-24アルキル基、C2-24アルケニル基またはC1-24ハロゲン化アルキル基を示す]
リパーゼの存在下、H−ホスホン酸エステル化された5’保護リボヌクレオシド(II)と、下記式(III)の化合物:
R2C(=O)OR3 ・・・ (III)
[式中、R2は前記と同義を示し;R3は、−H、C1-6アルキル基、C2-6アルケニル基、−C(=O)R2または−N=C(C1-6アルキル)2を示す]
とを反応させることにより、2’位水酸基または3’位水酸基を選択的にエステル化する工程を含むことを特徴とする製造方法。
- さらに、5’保護リボヌクレオシド(IV)に三ハロゲン化リンを作用させ、2’位水酸基または3’位水酸基をH−ホスホン酸エステル化することによりH−ホスホン酸エステル化された5’保護リボヌクレオシド(II)を得る工程を含む請求項3に記載の製造方法。
- さらに、リボヌクレオシド(V)の5’位水酸基を選択的に保護することにより5’保護リボヌクレオシド(IV)を得る工程を含む請求項4に記載の製造方法。
[式中、R1は上記と同義を示す] - RNAを製造するための方法であって、
下記式(I)または(I’)で表されることを特徴とするRNA合成用モノマーまたはその塩と
[式中、
R1は、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジメチルイソプロピルシリル基、ジエチルイソプロピルシリル基、ジメチルテキシルシリル基、t−ブチルジメチルシリル基、t−ブチルジフェニルシリル基、トリベンジルシリル基、トリ−p−キシリルシリル基、トリフェニルシリル基、ジフェニルメチルシリル基およびt−ブチルメトキシフェニルシリル基から選択されるシリル系保護基;トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基、p−メトキシフェニルジフェニルメチル基、ジ(p−メトキシフェニル)フェニルメチル基、トリ(p−メトキシフェニル)メチル基、4−(4’−ブロモフェナシルオキシ)フェニルジフェニルメチル基、4,4’,4”−トリス(4,5−ジクロロフタルイミドフェニル)メチル基、4,4’,4”−トリス(レブリノイルオキシフェニル)メチル基、4,4’,4”−トリス(ベンゾイルオキシフェニル)メチル基、3−(イミダゾイル−1−イルメチル)ビス(4’,4”−ジメトキシフェニル)メチル基および1,1−ビス(4−メトキシフェニル)−1’−ピレニルメチル基から選択されるトリチル系保護基;または、t−ブトキシカルボニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびベンジルオキシカルボニル基から選択されるカーバメート系保護基を示し;
R2は、C1-24アルキル基、C2-24アルケニル基またはC1-24ハロゲン化アルキル基を示す]
下記式(VI)で表される固定化RNAとを縮合する工程
[式中、
R2は上記と同義を示し;
Xは可溶性高分子を示し;
nは整数を示す;
但し、n=0の場合、リン酸ジエステル基は水酸基であるものとする;
また、各リボース単位において、2’位および3’位の置換基は互いに入れ替わっていてもよいものとする];
亜リン酸ジエステル基を酸化する工程;および
R1を除去する工程を含むことを特徴とする方法。 - さらに、リパーゼまたはエステラーゼにより2’位のR2−(C=O)−基と3’位のX−(C=O)−基を除去する工程を含む請求項6に記載の方法。
- 2’位のR2−(C=O)−基と3’位のX−(C=O)−基を除去する工程をC1-4アルコールを含む溶媒中で行う請求項7に記載の方法。
- 下記式(XI)で表されることを特徴とするRNAオリゴマーまたはその塩。
[式中、
R2は、C1-24アルキル基、C2-24アルケニル基またはC1-24ハロゲン化アルキル基を示し;
R4は、水素原子;トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジメチルイソプロピルシリル基、ジエチルイソプロピルシリル基、ジメチルテキシルシリル基、t−ブチルジメチルシリル基、t−ブチルジフェニルシリル基、トリベンジルシリル基、トリ−p−キシリルシリル基、トリフェニルシリル基、ジフェニルメチルシリル基およびt−ブチルメトキシフェニルシリル基から選択されるシリル系保護基;トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基、p−メトキシフェニルジフェニルメチル基、ジ(p−メトキシフェニル)フェニルメチル基、トリ(p−メトキシフェニル)メチル基、4−(4’−ブロモフェナシルオキシ)フェニルジフェニルメチル基、4,4’,4”−トリス(4,5−ジクロロフタルイミドフェニル)メチル基、4,4’,4”−トリス(レブリノイルオキシフェニル)メチル基、4,4’,4”−トリス(ベンゾイルオキシフェニル)メチル基、3−(イミダゾイル−1−イルメチル)ビス(4’,4”−ジメトキシフェニル)メチル基および1,1−ビス(4−メトキシフェニル)−1’−ピレニルメチル基から選択されるトリチル系保護基;または、t−ブトキシカルボニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびベンジルオキシカルボニル基から選択されるカーバメート系保護基を示し;
Xは可溶性高分子を示し;
mは1以上の整数を示す;
但し、各リボース単位において、2’位および3’位の置換基は互いに入れ替わっていてもよいものとする]
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