JP5757641B2 - Ｒｎａ合成用モノマー、その製造方法、およびｒｎａの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、ＲＮＡ合成用モノマー、当該ＲＮＡ合成用モノマーを製造するための方法、および、当該ＲＮＡ合成用モノマーを用いたＲＮＡの製造方法に関するものである。

ＲＮＡは、遺伝子の発現において重要な役割を担う他、触媒として機能することも知られている。さらに、ｍＲＮＡの一部に相補的なＲＮＡを結合させるとｍＲＮＡが分解されるＲＮＡ干渉という現象が見出されて以来、所望の塩基配列を有するＲＮＡの需要が一層高まっている。

ＲＮＡは、複数のリボヌクレオシドが５’位と３’位でホスホジエステル結合している構造を有する。よって、ＲＮＡを化学的に合成するに当たっては、２つのリボヌクレオシドを、リン酸を介して５’位と３’位とで選択的に結合することが非常に重要となる。

一般的に、ＲＮＡは、塩基部分のアミノ基と２’位の水酸基が保護され且つ３’位で固相担体へ結合しているリボヌクレオシドに、塩基部分のアミノ基と、２’位および５’位の水酸基が保護されたリボヌクレオチドを結合させた後に脱保護する方法で製造される。かかる化学的製造方法では、各水酸基が選択的に保護されたモノマーをいかに効率的に得るかがポイントとなる。以下に、ＲＮＡ合成用モノマーの代表的な製造方法を示す。

上記のとおり、ＲＮＡ合成用モノマーを製造するには、最短でも７段階もの工程が必要となる。詳しくは、塩基部分のアミノ基は塩基性が高く選択的に保護し易いが、特に２’位と３’位の水酸基の反応性には差がない。よって、３’位と５’位の水酸基を環状保護基で同時に保護した後、２’位水酸基を保護しておき、３’位と５’位の環状保護基を選択的に脱保護する必要があるため、工程数が多くならざるを得ない。

ＲＮＡ合成の研究は、最後に脱保護すべきものであることから、主に２’位水酸基の保護基に関して行われている。例えば特許文献１には、２’位水酸基が１，３−ジオキソラン−２−イル誘導体基などにより保護されたリボヌクレオシド化合物が開示されている。当該置換基は、安価な試薬により導入可能であり、また、リン酸ジエステル基の転位に対して不活性な酸性条件下で除去可能であるとされている。また、特許文献２には、ＲＮＡの３’−５’結合を維持しつつ塩基により除去され得る、２’位水酸基の保護基として、アセトキシメチル基などが記載されている。

また、非特許文献１には、２’位水酸基または３’位水酸基を制御することなくＨ−ホスホン酸エステル化した後、２’位を選択的にＴＢＤＭＳ（ｔ−ブチルジメチルシリル基）で保護することにより、３’位水酸基がＨ−ホスホン酸エステル化されたＲＮＡ合成用モノマーを得る方法が記載されている。

特開２００６−７７０１３号公報 特開２０１１−５２１９３０号公報

Xiaohu Zhangら，Tetrahedron Letters，vol．38，no．41，pp．7135-7138（1997）

上述したように、ＲＮＡ合成用モノマーの製造方法は一応は確立しており、ＲＮＡ合成に関する研究は主に置換基の検討について為されている。しかし、従来のＲＮＡ合成用モノマーの製造方法は、少量が得られればよい時代に開発されたものであり、工程数が多く、大量合成に適するものではない。例えば、１００ｇのｓｉＲＮＡが数十億円で取引きされている例がある。

また、非特許文献１に記載の技術のように、ＲＮＡ合成用モノマーの製造工程を減らすことも検討されている。しかし、非特許文献１に記載の方法では、塩基部分の種類によっては２’位と３’位における選択性は落ちる。

さらに、上述したようにＲＮＡの製造方法としては、各工程における精製が容易であるといった理由から固相合成法が一般的である。しかし、固相合成法ではＲＮＡ合成用モノマーが大過剰量用いられ、少量合成では５〜１５倍モル、大量合成でも２〜５倍モル程度用いられる。また、ステップ毎に必要な大量の反応剤や洗浄に要する溶媒のコストがかかったり、大量の廃棄物が生じるという問題もある。一方、液相合成法はその高いコストパフォーマンスやエネルギーパフォーマンスから大量合成に適しており、また、塩基部分を保護する必要性が低いという利点があり、ＲＮＡ合成用モノマーが大量に入手できるのであれば、液相合成法の適用も検討すべきである。しかし、一般的には、固相合成法よりもその使用量は低いといえるとはいえ、液相合成法でも過剰量のＲＮＡ合成用モノマーが用いられる。

そこで本発明は、効率的に製造され得るものであり、結果としてＲＮＡの製造コストを顕著に低減することができるＲＮＡ合成用モノマーと、少ない工程数で効率的にＲＮＡ合成用モノマーを製造する方法を提供することを目的とする。また、本発明では、ＲＮＡ合成用モノマーをほぼ化学量論量で用いる場合であってもＲＮＡを効率的に合成できる方法を提供することも目的とする。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、２’位または３’位がアルカノイル基などで保護されたＲＮＡ合成用モノマーは、ほぼ化学量論量でもＲＮＡを効率的に合成できることを見出して、本発明を完成した。

本発明に係る第１のＲＮＡ合成用モノマーは、下記式（Ｉ）で表される化合物またはその塩であることを特徴とする。

［式中、
Ｒ¹は、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジメチルイソプロピルシリル基、ジエチルイソプロピルシリル基、ジメチルテキシルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリベンジルシリル基、トリ−ｐ−キシリルシリル基、トリフェニルシリル基、ジフェニルメチルシリル基およびｔ−ブチルメトキシフェニルシリル基から選択されるシリル系保護基；トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基、ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル基、ジ（ｐ−メトキシフェニル）フェニルメチル基、トリ（ｐ−メトキシフェニル）メチル基、４−（４’−ブロモフェナシルオキシ）フェニルジフェニルメチル基、４，４’，４”−トリス（４，５−ジクロロフタルイミドフェニル）メチル基、４，４’，４”−トリス（レブリノイルオキシフェニル）メチル基、４，４’，４”−トリス（ベンゾイルオキシフェニル）メチル基、３−（イミダゾイル−１−イルメチル）ビス（４’，４”−ジメトキシフェニル）メチル基および１，１−ビス（４−メトキシフェニル）−１’−ピレニルメチル基から選択されるトリチル系保護基；または、ｔ−ブトキシカルボニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびベンジルオキシカルボニル基から選択されるカーバメート系保護基を示し；
Ｒ²は、Ｃ_1-24アルキル基、Ｃ_2-24アルケニル基またはＣ_1-24ハロゲン化アルキル基を示す］
当該ＲＮＡ合成用モノマー（Ｉ）は、非常に効率的に製造できるものであるので、ＲＮＡ合成のモノマーとして用いれば、ＲＮＡ合成の全体的な製造効率を顕著に高めることができる。

本発明に係る第２のＲＮＡ合成用モノマーは、下記式（Ｉ’）で表される化合物またはその塩であることを特徴とする。

［式中、Ｒ¹とＲ²は上記と同義を示す］
例えば、塩基部分がアデニンであるＲＮＡ合成用モノマー（Ｉ’）は、２−５Ａの原料化合物として有用である。詳しくは、３〜６個のアデノシンが２’，５’リン酸結合しているオリゴマーは２−５Ａと呼ばれており、補酵素としてＲＮａｓｅ Ｌを活性化し、病原ウィルスのｍＲＮＡを分解する。このＲＮａｓｅ Ｌは、インターフェロンが細胞膜受容体に結合することにより誘導される。即ち、当該ＲＮＡ合成用モノマー（Ｉ’）は、インターフェロンによる治療システムの一端を担う２−５Ａの原料化合物として有用である。

また、本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、５’位が保護されたリボヌクレオシドをリパーゼで処理すると、２’位または３’位の水酸基が高い選択率でエステル化されるばかりでなく、塩基部分のアミノ基を保護する必要がないことから、わずかな工程数でＲＮＡ合成用モノマーが製造できることを見出して、本発明を完成した。

本発明に係るＲＮＡ合成用モノマーの製造方法は、
当該ＲＮＡ合成用モノマーとして、下記式（Ｉ）の３’−Ｈ−ホスホン酸エステル、下記式（Ｉ’）の２’−Ｈ−ホスホン酸エステルまたはその塩を製造するためのものであり；

［式中、Ｒ¹とＲ²は上記と同義を示す］
リパーゼの存在下、Ｈ−ホスホン酸エステル化された５’保護リボヌクレオシド（ＩＩ）と、下記式（ＩＩＩ）の化合物：
Ｒ²Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ³ ・・・ （ＩＩＩ）
［式中、Ｒ²は前記と同義を示し；Ｒ³は、−Ｈ、Ｃ_1-6アルキル基、Ｃ_2-6アルケニル基、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ²または−Ｎ＝Ｃ（Ｃ_1-6アルキル）₂を示す］
とを反応させることにより、２’位水酸基または３’位水酸基を選択的にエステル化する工程を含むことを特徴とする。

［式中、Ｒ¹とＲ²は上記と同義を示す］
本発明に係るＲＮＡ合成用モノマーの製造方法では、さらに、５’保護リボヌクレオシド（ＩＶ）に三ハロゲン化リンを作用させ、２’位水酸基または３’位水酸基をＨ−ホスホン酸エステル化することによりＨ−ホスホン酸エステル化された５’保護リボヌクレオシド（ＩＩ）を得る工程を含むことが好ましい。

［式中、Ｒ¹は上記と同義を示す］
本発明方法では、リパーゼを用いて２’位水酸基または３’位水酸基を選択的にエステル化することができるので、その前工程において、２’位水酸基または３’位水酸基を選択的に保護する必要が無い。また、上記反応により得られるＨ−ホスホン酸エステル化された５’保護リボヌクレオシドにおいて、Ｈ−ホスホン酸基は２’位と３’位との間で転位するため、何れかの位置異性体がリパーゼ反応で消費されると平衡が傾き、リパーゼの基質化合物ではない位置異性体が基質化合物に変化するため、ホスホン酸エステル化を効率的に進めることができる。

本発明に係るＲＮＡ合成用モノマーの製造方法では、さらに、リボヌクレオシド（Ｖ）の５’位水酸基を選択的に保護することにより５’保護リボヌクレオシド（ＩＶ）を得る工程を含むことが好ましい。

［式中、Ｒ¹は上記と同義を示す］
５’位水酸基の反応性は、塩基部分中のアミノ基や２’位水酸基、３’位水酸基とも区別できるので、５’位水酸基のみを選択的に保護することは比較的容易である。また、本発明方法では、塩基部分中のアミノ基を保護する必要が無い。

本発明に係るＲＮＡの製造方法は、
下記式（Ｉ）または（Ｉ’）で表されることを特徴とするＲＮＡ合成用モノマーまたはその塩と

［式中、Ｒ¹とＲ²は上記と同義を示す］
下記式（ＶＩ）で表される固定化ＲＮＡとを縮合する工程

［式中、
Ｒ²は上記と同義を示し；
Ｘは可溶性高分子を示し；
ｎは整数を示す；
但し、ｎ＝０の場合、リン酸ジエステル基は水酸基であるものとする；
また、各リボース単位において、２’位および３’位の置換基は互いに入れ替わっていてもよいものとする］；
亜リン酸ジエステル基を酸化する工程；および
Ｒ¹を除去する工程を含むことを特徴とする。

本発明に係るＲＮＡの製造方法では、さらに、リパーゼまたはエステラーゼにより２’位のＲ²−（Ｃ＝Ｏ）−基と３’位のＸ−（Ｃ＝Ｏ）−基を除去する工程を含むことが好ましい。リパーゼまたはエステラーゼを用いれば、Ｒ²−（Ｃ＝Ｏ）−基のみならず、水溶性担体も穏和な条件で良好に除去することが可能になる。

本発明に係るＲＮＡの製造方法では、２’位のＲ²−（Ｃ＝Ｏ）−基と３’位のＸ−（Ｃ＝Ｏ）−基を除去する工程をＣ_1-4アルコールを含む溶媒中で行うことが好ましい。ＲＮＡの切断などの副反応は水の存在により引き起こされるが、リパーゼとエステラーゼは溶媒中にＣ_1-4アルコールが含まれていても脱保護反応を触媒することができ、また、Ｃ_1-4アルコールの存在により、上記副反応を抑制することが可能である。

本発明に係るＲＮＡオリゴマーまたはその塩は、下記式（ＸＩ）で表されることを特徴とする。

［式中、
Ｒ²とＸは上記と同義を示し；
Ｒ⁴は、上記Ｒ¹と同義を示すか或いは水素原子を示し；
ｍは１以上の整数を示し；
但し、各リボース単位において、２’位および３’位の置換基は互いに入れ替わっていてもよいものとする］
本発明において、「Ｃ_1-24アルキル基」とは、炭素数１〜２４の直鎖状または分枝鎖状の飽和炭化水素基を意味する。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ｓ−ペンチル基、イソペンチル基、メチルブチル基、ネオペンチル基、エチルプロピル基、ヘキシル基、ｓ−ヘキシル基、イソヘキシル基、メチルペンチル基、ジメチルブチル基、エチルブチル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デカニル基、ドデカニル基、テトラデカニル基、ヘキサデカニル基、オクタデカニル基、イコサニル基、ドコサニル基、テトラコサニル基を挙げることができる。立体障害の小ささや置換基（−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ²）の導入のし易さや除去のし易さの観点からは、Ｒ²としてはＣ_1-6アルキル基が好ましく、Ｃ_1-4アルキル基がより好ましく、Ｃ_1-2アルキル基がさらに好ましく、メチル基が最も好ましい。また、炭素数が多いとモノマーの脂溶性が高まり、特に長鎖ＲＮＡの合成の際に有機溶媒に対する溶解性が向上し、反応効率の低下を回避することが可能になり得る。かかる観点からは、Ｒ²としてはＣ_10-24アルキル基が好ましく、Ｃ_12-20アルキル基がより好ましく、Ｃ_14-18アルキル基がさらに好ましい。また、本発明に係るＲＮＡ合成用モノマーを重合してＲＮＡを製造する場合には、溶解度を向上させるために、５〜１０塩基ごとにＲ²として比較的長鎖の上記アルキル基を導入することが好ましい。

「Ｃ_1-6アルキル基」とは、炭素数１〜６の直鎖状または分枝鎖状の飽和炭化水素基を意味し、Ｃ_1-24アルキル基の上記具体例のうち炭素数が１〜６のものを挙げることができる。

「Ｃ_2-24アルケニル基」とは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する炭素数２〜２４の直鎖状または分枝鎖状の不飽和炭化水素基を意味する。例えば、エテニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、１−ブテニル基、１，３−ブタジエニル基、１−ペンテニル基、２−ペンテニル基、１−ヘキセニル基、２−エチル−２−ブテニル基、２−オクテニル基、（４−エテニル）−５−ヘキセニル基、２−デセニル基、ドデセニル基、テトラデセニル基、ヘキサデセニル基、オクタデセニル基、イコセニル基、ドコセニル基を挙げることができる。アルキル基の場合と同様に、置換基（−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ²）の導入のし易さや除去のし易さの観点からは、Ｒ²としてはＣ_2-6アルケニル基が好ましく、Ｃ_2-4アルケニル基がより好ましく、２−プロペニル基がさらに好ましい。また、炭素数が多いとモノマーの脂溶性が高まり、ＲＮＡ合成の際に有機溶媒を用いることができるようになり得る。かかる観点からは、Ｒ²としてはＣ_10-24アルケニル基が好ましく、Ｃ_12-20アルケニル基がより好ましく、Ｃ_14-18アルケニル基がさらに好ましい。

「Ｃ_2-6アルケニル基」とは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する炭素数２〜６の直鎖状または分枝鎖状の不飽和炭化水素基を意味し、Ｃ_2-24アルケニル基の上記具体例のうち炭素数が２〜６のものを挙げることができる。

「Ｃ_1-24ハロゲン化アルキル基」とは、１以上のハロゲン原子基に置換されたＣ_1-24アルキル基を意味する。ハロゲン原子基としては、フッ素原子基、塩素原子基、臭素原子基、ヨウ素原子基のいずれかをいう。ハロゲン原子基の置換基数の上限は、置換可能である限り特に制限されないが、好適には５、より好適には４、さらに好適には３、さらに好適には２、特に好適には１である。Ｃ_1-24ハロゲン化アルキル基としては、例えば、トリフルオロメチル基、１，１，１−トリフルオロエチル基、１，１，１−トリクロロエチル基、ペンタフルオロエチル基を挙げることができる。

「Ｃ_1-4アルコール」としては、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｓ−ブタノールおよびｔ−ブタノールを挙げることができ、Ｃ_1-2アルコールがより好ましい。

本発明に係るＲＮＡ合成用モノマーは、２’位または３’位がアルカノイル基などにより保護されているという構造的な特徴を有する。その理由は必ずしも明らかではないが、本発明に係るＲＮＡ合成用モノマーを重合する場合には、従来、ＲＮＡ合成用モノマーを過剰量用いなければならなかったのに対して、ほぼ化学量論量でも反応が進行する。よって、本発明に係るＲＮＡ合成用モノマーと当該ＲＮＡ合成用モノマーを用いたＲＮＡの製造方法は、ＲＮＡの製造コストを顕著に低減できるものとして産業上非常に有用である。

また。本発明に係るＲＮＡ合成用モノマーの製造方法によれば、先ず、原料化合物であるリボヌクレオシドの塩基部分のアミノ基を保護する必要がない。よって、従来方法に比して、当該アミノ基を選択的に保護するための複数工程を実施しなくてもよい。

また、本発明に係るＲＮＡ合成用モノマーの製造方法によれば、リパーゼによりヌクレオシドの２’位水酸基または３’位水酸基が選択的にエステル化される。この際、基質化合物である５’保護ヌクレオチドのホスホン酸基は、溶液中、２’位と３’位で転位し、これら位置異性体はおおよそ１：１で存在する。よって、リパーゼにより２’ホスホン酸エステル体または３’ホスホン酸エステル体が基質化合物として消費されると、平衡が傾いて他方の位置異性体が基質化合物に変化するので、従来方法と異なり、２’位水酸基を選択的に保護して３’位水酸基を選択的にリン酸エステル化するといった必要が無い。

従って、本発明に係るＲＮＡ合成用モノマーの製造方法は、従来方法に比して工程数が大幅に少なく、ＲＮＡ合成用モノマーを安価で効率的に製造できるので、ＲＮＡ合成用モノマーの製造コスト、ひいてはＲＮＡの製造コストを顕著に低減できるものとして、産業上極めて有用である。

図１は、５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳアデノシン Ｈ−ホスホン酸エステル混合物の２’位をブタ膵臓由来のリパーゼでアセチル化した反応液のＨＰＬＣチャートである。 図２は、５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳウリジン Ｈ−ホスホン酸エステル混合物の２’位をブタ膵臓由来のリパーゼでアセチル化した反応液のＨＰＬＣチャートである。 図３は、本発明方法により得られたＲＮＡ２量体のＨＰＬＣチャートである。 図４は、本発明方法により得られたＲＮＡ２１量体のＨＰＬＣチャートである。

以下、先ず、本発明に係るＲＮＡ合成用モノマーの製造方法を実施の順番に従って説明する。

（１） ５’位水酸基の保護工程
本発明方法の中間化合物である５’保護リボヌクレオシド（ＩＶ）は、出発原料化合物であるリボヌクレオシド（Ｖ）の５’位水酸基を選択的に保護することにより得られる。

［式中、Ｒ¹は上記と同義を示す］
上記反応では、リボヌクレオシドを溶媒に溶解し、保護試薬を直接または溶媒に溶解した上で加え、反応させればよい。

リボヌクレオシド中の塩基（式中では「Ｂ」）としては、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、ヒポキサンチン、キサンチンを挙げることができ、これら塩基を含むリボヌクレオシドは、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、イノシン、キサントシンとして、それぞれ容易に入手可能である。その他、Ｂは人工的に合成された塩基基であってもよい。なお、本発明における「Ｂ」中の−ＮＨ₂または＝ＮＨは保護されていても保護されていなくてもよく、本発明に係るＲＮＡ合成用モノマーの製造方法では塩基基を保護しなくても反応を進めることができるため、好適には保護しない。

保護試薬は、保護基Ｒ¹に対応するハロゲン化物、より具体的には塩化物または臭化物を用いればよい。かかる保護試薬は、市販されているか、市販の前駆体化合物から容易に調製することができる。

保護試薬の使用量は、適宜調整すればよいが、例えば、リボヌクレオシドに対して０．９倍モル以上、１．１倍モル以下程度とすることができる。

上記反応で用いる溶媒は、リボヌクレオシドや保護試薬を適度に溶解できるものであり且つ反応の進行を妨げないものであれば特に制限されない。例えば、ピリジン、メチルピリジン、ジメチルピリジンなどのピリジン系溶媒；アセトニトリルなどのニトリル系溶媒；ジメチルホルムアミドやジメチルアセトアミドなどのアミド系溶媒；ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド系溶媒；ジメチルカーボネートなどの炭酸エステル系溶媒などを挙げることができる。また、後述するリパーゼ反応の基質化合物（ＩＩＩ）を本工程の溶媒として用いることもできる。溶媒は、使用直前に脱水するなど、水を含まないものや水含量が極力抑えられているものを使うことが好ましい。

さらに、塩基を用いてもよい。塩基としては、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、イミダゾール、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）などの有機塩基を用いることができる。

リボヌクレオシド溶液の濃度は、適宜調整すればよいが、例えば、１０ｍｇ／ｍＬ以上、５００ｍｇ／ｍＬ以下程度とすることができる。また、保護試薬を溶媒に溶解して添加する場合、保護試薬の濃度も適宜調整すればよく、例えば、１０ｍｇ／ｍＬ以上、５００ｍｇ／ｍＬ以下程度とすることができる。リボヌクレオシド溶液の溶媒と保護試薬溶液の溶媒は、同一であっても異なっていてもよい。

反応温度は適宜調整すればよく、例えば、リボヌクレオシド溶液を−１００℃以上、１０℃以下に冷却した上で、保護試薬またはその溶液をゆっくり加えた後、反応混合液の温度を２０℃以上、５０℃以下程度に高めればよい。反応時間も適宜調整すればよく、例えば、薄層クロマトグラフィで原料化合物の消費を確認できるまでとしたり、予備実験により決定すればよい。具体的には、保護試薬またはその溶液の添加完了から１時間以上、１０時間以下程度とすることができる。

反応終了後は、通常の後処理を行えばよい。例えば、反応混合液を濃縮し、濃縮物を塩化メチレンや酢酸エチルなど水に対する溶解性の低い溶媒に溶解した後、水で洗浄する。有機相を乾燥、濃縮した後、さらに再結晶などにより５’保護リボヌクレオシド（ＩＶ）を精製すればよい。

（２） ホスホン酸エステル化工程
次に、５’保護リボヌクレオシド（ＩＶ）の溶液に三ハロゲン化リンを加え、２’位水酸基または３’位水酸基をＨ−ホスホン酸エステル化することにより、本発明方法に特徴的なリパーゼ反応の基質化合物であり、Ｈ−ホスホン酸エステル化された５’保護リボヌクレオシド（ＩＩ）を得る。なお、当該反応では、下記式のとおり、５’保護リボヌクレオシド（ＩＶ）がいったんホスフィチル化された後、水の存在下で加水分解されて２’ホスホン酸エステルまたは３’ホスホン酸エステルとなり、また、水溶液中では、ホスフィチル体を介して２’ホスホン酸エステルと３’ホスホン酸エステルが平衡状態にあると考えられる。

なお、亜リン酸基やリン酸基などを有する化合物が溶解している場合には、Ｐ−ＯＨは電離してＰ−Ｏ^-の状態にあると考えられるが、本発明では、便宜上、Ｐ−ＯＨと記載し、Ｐ−Ｏ^-の状態にある場合も本発明範囲に含まれるものとする。

三ハロゲン化リンとしては、三塩化リン、三臭化リンおよび三ヨウ化リンを挙げることができ、三塩化リンが最も安価で入手容易である。

上記反応で用いる溶媒は、適宜選択すればよいが、例えば、上記工程（１）で用いたものを同様のものを用いることができる。

上記反応においては、反応をより一層進行せしめるために塩基を用いてもよい。かかる塩基は特に制限されず適宜選択すればよいが、例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ジフェニルアミン、トリフェニルアミン、ベンズイミダゾール、１，２，３−ベンゾトリアゾール、キノリン、イソキノリン、インドール、ピリミジン、ピリジン、イミダゾール、ピラゾール、１，２，３−トリアゾール、１，２，４−トリアゾール、１，２，３−オキサジアゾール、ピラジン、ピリダジン、ピペリジン、２−ピラゾリン、ピラゾリジン、３−ピロリン、ピロリジン、ピロール、モルフォリン、キノキサリン、４，４−トリメチレンジピリジン、ピペラジン、４，４’−トリメチレンジピペリジン、１−(３−アミノプロピル)−イミダゾール、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）などを用いることができる。これら塩基は、１種のみ用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。

塩基の使用量は適宜調整すればよいが、例えば、５’保護リボヌクレオシド（ＩＶ）に対して過剰量、具体的には、２倍モル以上、１０倍モル以下程度とすることができる。

５’保護リボヌクレオシド（ＩＶ）溶液の濃度は、適宜調整すればよいが、例えば、１０ｍｇ／ｍＬ以上、５００ｍｇ／ｍＬ以下程度とすることができる。また、当該溶液に塩基を加える場合の総塩基の濃度も適宜調整すればよいが、例えば、１０ｍｇ／ｍＬ以上、５００ｍｇ／ｍＬ以下程度とすることができる。

三ハロゲン化リンは、そのまま加えてもよいし、溶媒に溶解した上で加えてもよい。三ハロゲン化リン溶液とする場合の濃度は、適宜調整すればよいが、例えば、１００ｍｇ／ｍＬ以上、１０００ｍｇ／ｍＬ以下程度とすることができる。５’保護リボヌクレオシド（ＩＶ）の溶媒と三ハロゲン化リンの溶液の溶媒は、同一であっても異なっていてもよい。

反応温度は適宜調整すればよく、例えば、５’保護リボヌクレオシド（ＩＶ）溶液を−１００℃以上、−１０℃以下に冷却した上で、三ハロゲン化リンまたはその溶液をゆっくり加える。反応時間も適宜調整すればよく、例えば、薄層クロマトグラフィで原料化合物の消費を確認できるまでとしたり、予備実験により決定すればよい。具体的には、三ハロゲン化リンまたはその溶液の添加完了から１分間以上、５時間以下程度とすることができる。

さらに、得られたホスフィチル体を加水分解する。例えば、反応混合液を１０℃以下に冷却した後、塩基性水溶液を添加すればよい。当該塩基性水溶液中の塩基としては、例えば、炭酸水素ナトリウムや炭酸水素カリウムなどのアルカリ金属炭酸水素塩；炭酸ナトリウムや炭酸カリウムなどのアルカリ金属炭酸塩；炭酸カルシウムや炭酸マグネシウムなどのアルカリ土類金属炭酸塩；水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属水酸化物を挙げることができる。当該塩基性水溶液の濃度は適宜調整すればよく、例えば、０．１質量％以上、１０質量％以下程度とすることができる。また、当該塩基性水溶液の使用量も適宜調整すればよく、例えば、反応混合液の０．５倍容量以上、２倍容量以下程度とすることができる。

反応終了後は、通常の後処理を行えばよい。例えば、塩基などを除去するために透析を行った後、クロマトグラフィなどによりＨ−ホスホン酸エステル（ＩＩ）を精製すればよい。

（３） ２’水酸基または３’水酸基の保護工程（リパーゼ反応工程）
次に、リパーゼの存在下、Ｈ−ホスホン酸エステル化された５’保護リボヌクレオシド（ＩＩ）と、下記式（ＩＩＩ）の化合物：
Ｒ²Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ³ ・・・ （ＩＩＩ）
［式中、Ｒ²およびＲ³は前記と同義を示す］
とを反応させることにより、Ｈ−ホスホン酸エステル化された５’保護リボヌクレオシド（ＩＩ）の２’位水酸基または３’位水酸基を選択的にエステル化し、３’ホスホン酸エステル（Ｉ）または２’ホスホン酸エステル（Ｉ’）を得る。

使用する基質化合物（ＩＩＩ）のうち、Ｒ³が−Ｈであるカルボン酸は比較的シンプルな構造を有しており、例えば市販化合物として入手可能である。また、Ｒ³がＣ_1-6アルキル基、Ｃ_2-6アルケニル基、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ₂または−Ｎ＝Ｃ（Ｃ_1-6アルキル）₂であるエステル化合物または酸無水物も、比較的シンプルな構造を有しており、市販化合物として入手可能であるか、或いは、当業者であれば市販化合物から容易に合成可能である。

３’ホスホン酸エステル（Ｉ）または２’ホスホン酸エステル（Ｉ’）の何れが主生成物として得られるかは、主に使用するリパーゼによる。例えば、目的化合物が３’ホスホン酸エステル（Ｉ）である場合、２’位水酸基を選択的にエステル化できるリパーゼとして、Ｃａｎｄｉｄａ Ｃｙｃｌｉｎｄｒａｃｅａ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）由来、ブタ膵臓由来、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ由来、Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ由来、Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ由来のものを用いればよい。また、目的化合物が２’ホスホン酸エステル（Ｉ’）である場合、３’位水酸基を選択的にエステル化できるリパーゼとして、例えば、Ｌｉｐａｓｅ ＰＳ Ａｍａｎｏ ＳＤを用いることができる。但し、溶媒や化合物（ＩＩＩ）との組合せなどで選択性が変わることがあるので、使用する酵素は、実際には予備実験などで決定することが好ましい。

上記反応で用いる溶媒は、適宜選択すればよいが、例えば、上記工程（１）で用いたものと同様のものを用いることができる。

Ｈ−ホスホン酸エステル化された５’保護リボヌクレオシド（ＩＩ）の溶液中の濃度は、適宜調整すればよいが、例えば、２０ｍｇ／ｍＬ以上、５００ｍｇ／ｍＬ以下程度とすることができる。

また、基質化合物（ＩＩＩ）の使用量は、適宜調整すればよいが、例えば、Ｈ−ホスホン酸エステル化された５’保護リボヌクレオシド（ＩＩ）に対して過剰量、具体的には、２倍モル以上、１００倍モル以下程度とすることができる。また、基質化合物（ＩＩＩ）を溶媒として用いることもできる。

リパーゼの使用量は特に制限されず適宜調整すればよいが、例えば、５’保護リボヌクレオシド（ＩＩ）と基質化合物（ＩＩＩ）を含む溶液に対して０．００１ｇ／ｍＬ以上、１ｇ／ｍＬ以下程度とすることができる。

反応温度は、使用するリパーゼなどに応じて適宜調整すればよく、例えば、２５℃以上、８０℃以下程度とすることができる。反応時間も適宜調整すればよく、例えば、薄層クロマトグラフィで原料化合物の消費を確認できるまでとしたり、予備実験により決定すればよい。具体的には、２時間以上、２４０時間以下程度とすることができる。

なお、いかなるリパーゼを用いても、一方の位置異性体のみが生成し、他方の位置異性体は全く生成しないということはなく、程度の差はあるが、３’ホスホン酸エステル（Ｉ）と２’ホスホン酸エステル（Ｉ’）の混合物が得られる。しかし、リパーゼに加え、基質化合物（ＩＩＩ）の種類、溶媒、温度などを調整することにより、選択率を高めることが可能である。これらの好適条件は、予備実験などにより決定すればよい。

反応終了後は、通常の後処理を行えばよい。例えば、反応後の反応混合液を濃縮した後、目的化合物を精製すればよい。なお、３’ホスホン酸エステル（Ｉ）と２’ホスホン酸エステル（Ｉ’）は、クロマトグラフィにより分離することができる。

本発明方法で製造される３’ホスホン酸エステル（Ｉ）またはその塩は、ＲＮＡ合成用のモノマーとして有用である。

また、本発明方法で製造される２’ホスホン酸エステル（Ｉ’）またはその塩は、ＲＮＡ合成用のモノマーの他、インターフェロン治療システムで用いる２−５Ａの原料化合物として有用である。

さらに、本発明に係るＲＮＡ合成用モノマーまたはその塩を用いてＲＮＡを合成する場合、従来技術ではモノマーを大過剰量用いなければならなかったのに対して、ほぼ化学量論量でも反応が進行する。よって、本発明に係るＲＮＡ合成用モノマー自体の製造コストが低い上に、本発明に係るＲＮＡ合成用モノマーを用いれば、ＲＮＡ製造のコストも低減することができる。

その他、本発明に係るＲＮＡ合成用モノマーは、２’位または３’位のアルカノイル基により、溶媒に対して適度な溶解性を有し、Ｈ−ホスホン酸部が安定化され、様々なカウンターイオンなどに対して安定性を示し、また、反応性が向上している可能性がある。

なお、本発明に係るＲＮＡ合成用モノマーまたはその塩を構成するカウンターカチオンは、特に制限されないが、例えば、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオンなどのアルカリ金属イオン；カルシウムイオンやマグネシウムイオンなどのアルカリ土類金属イオン；銀イオンなどの遷移金属イオン；アンモニウムイオン;メチルアンモニウムイオンやエチルアンモニウムなどの１級アンモニウムイオン；ジエチルアンモニウムイオン、ジイソプロピルアンモニウムイオン、グアニジニウムイオンなどの２級アンモニウムイオン;トリエチルアンモニウムイオン、トリブチルアンモニウムイオン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアンモニウムイオン、トリスヒドロキシエチルアンモニウムイオン、１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ウンデセ−７−エンイオンなどの３級アンモニウムイオン；テトラブチルアンモニウムイオンやテトラメチルアンモニウムイオンなどの４級アンモニウムイオン；ピリジニウムイオンやイミダゾリウムイオンなどの芳香族アンモニウムイオン；ｔ−ブチルイミノ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホランイオンなどのホスファゼニウムイオンを挙げることができる。

以下、本発明に係るＲＮＡの製造方法を実施の順番に従って説明する。なお、以下では３’ホスホン酸エステル型のＲＮＡの製造方法を代表的に説明するが、２’ホスホン酸エステル型ＲＮＡおよびこれらの混合型ＲＮＡも、使用する原料化合物に応じて同様に製造することができる。

（４） 縮合工程
先ず、本発明に係るＲＮＡ合成用モノマー（Ｉ）と固定化ＲＮＡ（ＶＩ）とを縮合する。

本発明における縮合工程では、従来主に用いられている固相合成ではなく液相合成を実施する。よって、Ｘは可溶性高分子である。

可溶性高分子としては、水や水溶性有機溶媒に対して十分な溶解性を示し、且つ原料化合物から明確に分離できる程度の分子量を有するものであれば特に制限されない。例えば、ポリエチレングリコールやポリエチレングリコールを用いることができる。可溶性高分子の分子量としては、例えば、平均分子量で１０００以上、５００００以下とすることができる。なお、上記Ｘの末端には、下記のとおり可溶性高分子を結合させるためのジカルボン酸の一部が含まれていてもよいものとする。

化合物（ＶＩ）は、例えば、ヌクレオシドの２’位または３’位の一方をジカルボン酸無水物でエステル化し、化合物（ＩＩＩ）（Ｒ²Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ³）を用いて他方をエステル化した後、ジカルボン酸のカルボキシ基と可溶性高分子とを反応させることにより合成できる。ここで用いられるジカルボン酸無水物としては、例えば、マロン酸無水物、コハク酸無水物、グルタル酸無水物、アジピン酸無水物、ピメリン酸無水物、スベリン酸無水物、アゼライン酸無水物、セバシン酸無水物を挙げることができる。なお、上記反応式では代表的に化合物（ＶＩ）と化合物（ＶＩＩ）を記載しているが、末端リボースの２’位と３’位は何れも最終的に脱保護するので、２’位と３’位の置換基は互いに入れ替わっていてもよい。また、各リボース単位の２’位と３’位の置換基も、互いに入れ替わっていてもよい。但し好適には、可溶性高分子が置換している末端リボース以外のリボース単位の２’位と３’位の置換基は、何れも共通することが好ましい。

固定化ＲＮＡ（ＶＩ）や（ＶＩＩ）において、塩基部分は同一であっても異なっていてもよい。

ｎは整数であり、上限は特に制限されないが、例えば、５００以下、３００以下、２００以下、１００以下、８０以下、５０以下、４０以下、３０以下とすることができる。なお、本発明者による実験により、２１量体（ｎ＝２０）までの製造実績があり、また、それ以上の多量体の製造ももちろん可能である。

従来方法では、固定化ＤＮＡに対して、ＲＮＡ合成用モノマーを過剰量用いるのが一般的であった。一方、本発明に係るＲＮＡの製造方法では、ＲＮＡ合成用モノマーの使用量をほぼ化学量論量としても反応は進行する。具体的には、固定化ＲＮＡ（ＶＩ）に対するＲＮＡ合成用モノマー（Ｉ）の割合を０．９倍モル以上、１．２倍モル以下程度にすることができる。当該割合としては、０．９５倍モル以上が好ましく、１．０倍モル以上とすることがより好ましく、また、１．１５倍モル以下とすることが好ましく、１．１倍モル以下とすることがより好ましく、１．０５倍モル以下とすることがさらに好ましい。

本工程で用いる溶媒は、上記原料化合物に対する適度な溶解性を示し、反応を阻害しないものであれば特に制限されないが、例えば、アセトニトリルなどのニトリル系溶媒；ジエチルエーテルやテトラヒドロフランなどのエーテル系溶媒；ピリジン、メチルピリジン、ジメチルピリジンなどのピリジン系溶媒；ジメチルホルムアミドやジメチルアセトアミドなどのアミド系溶媒；塩化メチレンなどのハロゲン化炭化水素系溶媒などを挙げることができる。溶媒としては、ニトリル系溶媒またはハロゲン化炭化水素系溶媒が好ましく、アセトニトリルまたは塩化メチレンがより好ましい。

反応条件としては、ＲＮＡ合成における一般的な縮合条件を適用することができる。例えば、ＲＮＡ合成用モノマー（Ｉ）と固定化ＲＮＡ（ＶＩ）の溶液に、クロロ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル、塩化ピバロイル、塩化２，４，６−トリクロロベンゾイル、トリフリオロメタンスルホニルクロリド、トリフルオロメタンスルホン酸無水物などのエステル化促進剤と、トリエチルアミン、ジメチルイソプロピルアミン、ジメチル エチルアミン、ピリジン、ジメチルピリジンなどの有機塩基を加える。エステル化促進剤は、ＲＮＡ合成用モノマー（Ｉ）および固定化ＲＮＡ（ＶＩ）に対して過剰量、具体的には１．５倍モル以上、５倍モル以下程度用いればよい。有機塩基は、エステル化促進剤と等倍モル用いればよい。

反応温度は適時選択することができ、常温でよく、また、具体的には１０℃以上、５０℃以下とすることができる。反応時間も適宜選択することができ、一方の原料化合物が無くなるまでや予備実験により決定すればよいが、例えば、５分間以上、５時間以下程度とすることができる。

反応終了後、使用した可溶性高分子などに応じた方法で目的化合物を精製してもよいが、反応液をそのまま次工程で用いてもよい。

（５） 酸化工程
上記縮合工程で得られた固定化ＲＮＡ（ＶＩＩ）では、ＲＮＡ合成用モノマー（Ｉ）と固定化ＲＮＡ（ＶＩ）とが亜リン酸ジエステル基で結合されている。そこで、当該亜リン酸ジエステル基を酸化する必要がある。

上記反応式でも、各リボース単位の２’位と３’位の置換基は、互いに入れ替わっていてもよい。但し好適には、可溶性高分子が置換している末端リボース以外のリボース単位の２’位と３’位の置換基は、何れも共通することが好ましい。

本工程は、ＲＮＡの一般的な製造方法で用いられている酸化条件に従って実施することができる。例えば、固定化ＲＮＡ（ＶＩＩ）の溶液に、ヨウ素と有機塩基を含む溶液を添加すればよい。ヨウ素は、固定化ＲＮＡ（ＶＩＩ）に対して過剰量、例えば５倍モル以上、２０倍モル以下用いることができる。有機塩基は、ヨウ素と等倍モル用いればよい。同様に、ビストリメチルシリルペルオキシドとトリメチルシリルトリフラートの組み合わせや、塩基性条件下におけるブタノンペルオキシドやｔ−ブチルヒドロペルオキシドでも酸化反応は進行する。或いは、塩基性条件下でＢｅａｕｃａｇｅ試薬、ジチオチウラムジスルフィド、ビス［（３−トリエトキシシリル）プロピル］テトラスルフィド、プロピレンスルフィド等の硫化剤を使用することで、チオエート型リン酸エステルに変換することもできる。本発明の範囲には、かかる態様も範囲に含まれるものとする。

反応温度は適時選択することができ、常温でよく、また、具体的には１０℃以上、５０℃以下とすることができる。反応時間も適宜選択することができ、固定化ＲＮＡ（ＶＩＩ）が無くなるまでや予備実験により決定すればよいが、例えば、５分間以上、５時間以下程度とすることができる。

反応終了後、使用した可溶性高分子などに応じた方法で目的化合物を精製してもよいが、反応液をそのまま次工程で用いてもよい。

（６） ５’位の脱保護工程
次に、Ｒ¹を除去し、５’位を脱保護する。下記反応式でも、上記反応式でも、各リボース単位の２’位と３’位の置換基は、互いに入れ替わっていてもよい。但し好適には、可溶性高分子が置換している末端リボース以外の各リボース単位の２’位と３’位の置換基は、何れも共通することが好ましい。

本工程は、Ｒ¹に応じて行う。具体的には、Ｒ¹がシリル系保護基である場合には、フッ化物イオンや酸性条件により容易に除去でき、トリチル系保護基である場合には、酸性条件で容易に除去することができる。何れにせよ、副反応の原因となるようなアルカリ性条件は用いる必要がない。

反応温度は適時選択することができ、常温でよく、また、具体的には１０℃以上、５０℃以下とすることができる。反応時間も適宜選択することができ、固定化ＲＮＡ（ＶＩＩＩ）が無くなるまでや予備実験により決定すればよいが、例えば、５分間以上、５時間以下程度とすることができる。

反応終了後、目的化合物である固定化ＲＮＡ（ＩＸ）を精製することが好ましい。精製は、使用した可溶性高分子に応じた方法で行うことができる。具体的には、サイズ排除クロマトグラフィ、ダイアフィルトレーション、電気透析、等電点電気泳動、疎水クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィなどにより精製することができる。その他、逆相クロマトグラフィなど、通常のクロマトグラフィでも精製することができる。

得られた固定化ＲＮＡ（ＩＸ）を上記工程（４）の固定化ＲＮＡ（ＶＩ）として用い、上記工程（４）〜（６）を繰返すことにより、ＲＮＡ鎖を伸長することが可能になる。

なお、化合物（ＶＩＩＩ）および化合物（ＩＸ）およびその塩、即ち、化合物（ＸＩ）およびその塩は、ＲＮＡの合成中間体として有用である。化合物（ＸＩ）のｍは、０である場合を除いてｎと同義とすることができる。また、化合物（ＸＩ）の塩を構成するカウンターイオンは、本発明に係るＲＮＡ合成用モノマーの塩のカウンターイオンと同様のものとすることができる。また、化合物（ＸＩ）およびその塩において、可溶性高分子を除去して２’位または３’位を水酸基とした化合物も、同様に合成中間体として有用である。

（７） ２’位および３’位の脱保護工程
上記工程（４）〜（６）を繰返し、所望の塩基配列を有するＲＮＡ鎖が得られた後は、可溶性高分子が結合した末端リボースの２’位と３’位を脱保護することによりＲＮＡとする。

固定化ＲＮＡ（ＩＸ）の２’位と３’位はアルカノイル基により保護されているか可溶性高分子はエステル結合により結合しているため、加水分解によりＲＮＡ（Ｘ）が得られる。加水分解の条件は、Ｒ²Ｃ（＝Ｏ）−基などに応じて適宜選択すればよい。

しかし通常の加水分解条件では、ＲＮＡ鎖が切断されるおそれがある。そこで、本発明においては、エステル加水分解酵素を用いることが好ましい。エステル加水分解酵素としては、リパーゼやエステラーゼを挙げることができる。リパーゼまたはエステラーゼを用いる場合には、アルコール系有機溶媒、または水とアルコール系有機溶媒との混合溶媒を用いることができる。水ではなくこれら溶媒を用いることにより、ＲＮＡ鎖の切断反応などの副反応を抑制することができる。水とアルコール系有機溶媒との混合溶媒におけるアルコール系有機溶媒の割合は、５０ｖｏｌ％以上が好ましく、６０ｖｏｌ％以上がより好ましく、７０ｖｏｌ％以上がさらに好ましく、８０ｖｏｌ％以上が特に好ましい。アルコール系有機溶媒としては、Ｃ_1-4アルコールを用いることができ、Ｃ_1-2アルコールが好ましい。

使用するリパーゼや反応条件などは、上記工程（３）と同様にすることができる。また、反応後の精製は、上記工程（６）と同様に行うことができる。また、エステラーゼとしては、ｈｏｇ ｋｉｄｎｅｙ由来のものやＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ由来のものを挙げることができる。

本願は、２０１２年７月２５日に出願された日本特許出願第２０１２−１６４９８５号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１２年７月２５日に出願された日本特許出願第２０１２−１６４９８５号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。

実施例１ ３’−Ｈ−ホスホン酸 ＲＮＡ合成用モノマーの一般的合成
（１−１） ５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−リボヌクレオシドの合成
４種のリボヌクレオシド（１００ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（２００ｍＬ）に対して、塩化ｔ−ブチルジメチルシリル（１４．３ｇ，９５ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（１００ｍＬ）を、カニュラーを用いて０℃でゆっくりと加えた。得られた反応混合液の温度を室温まで昇温したのち、４時間撹拌した。エバポレータを用いて反応混合液を濃縮した後、濃縮物を塩化メチレン（２００ｍＬ）に溶解または懸濁した。得られた溶液または懸濁液を、撹拌した蒸留水（５００ｍＬ）に滴下した。有機相を分離した後、硫酸ナトリウムで乾燥し、さらにエバポレータを用いて濃縮することにより粗生成物を得た。粗生成物は蒸留水−メタノールで再結晶することにより精製した。得られた結晶をアセトニトリルあるいはアセトンで洗浄することにより、目的の５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ体を得た（収率：８３〜８８％）。

（１−２） ５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ アデノシンの合成
アデノシン（１００ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（４００ｍＬ）に対して、塩化ｔ−ブチルジメチルシリル（１４．３ｇ，９５ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（１００ｍＬ）を、カニュラーを用いて０℃でゆっくりと加えた。得られた反応混合液の温度を室温まで昇温したのち、４時間撹拌した。エバポレータを用いて反応混合液を濃縮した後、濃縮物を塩化メチレン（２００ｍＬ）に溶解した。得られた溶液を、撹拌した蒸留水（５００ｍＬ）に滴下した。有機相を分離した後、エバポレータを用いて濃縮することにより粗生成物を得た。粗生成物はアセトニトリルで再結晶することにより精製した。得られた結晶をアセトニトリルで洗浄することにより、目的の５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ体を得た（収率：８５％）。

（１−３） ５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ シチジンの合成
シチジン（１００ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（４００ｍＬ）に対して、塩化ｔ−ブチルジメチルシリル（１４．３ｇ，９５ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（１００ｍＬ）を、カニュラーを用いて０℃でゆっくりと加えた。得られた反応混合液の温度を室温まで昇温したのち、４時間撹拌した。エバポレータを用いて反応混合液を濃縮した後、濃縮物を塩化メチレン（２００ｍＬ）に溶解または懸濁した。得られた溶液または懸濁液を、撹拌した蒸留水（５００ｍＬ）に滴下した。有機相を分離した後、酢酸エチルを加えて粗生成物を結晶として得た。さらに酢酸エチル−塩化メチレンで再結晶することにより目的の５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ体を得た（収率：８８％）。

（１−４） ５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ ウリジンの合成
ウリジン（１００ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（２００ｍＬ）に対して、塩化ｔ−ブチルジメチルシリル（１４．３ｇ，９５ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（１００ｍＬ）を、カニュラーを用いて０℃でゆっくりと加えた。得られた反応混合液の温度を室温まで昇温したのち、４時間撹拌した。エバポレータを用いて反応混合液を濃縮した後、濃縮物を塩化メチレン（２００ｍＬ）に溶解した。得られた溶液を、撹拌した蒸留水（５００ｍＬ）に滴下した。有機相を分離した後、エバポレータを用いて濃縮することにより粗生成物を得た。粗生成物を中圧クロマト装置（山善社製，製品名「ＹＦＬＣ ＡＩ−５８０」）とＨｉｇｈ−Ｆｌａｓｈ ４０μｍｓｉｚｅ４Ｌカラムを用いて、塩化メチレン−メタノールを溶出溶媒として精製し、目的の５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ体を得た（収率：８３％）。

（１−５） ５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−Ｎ³−ジメチルアミノメチニル グアノシンの合成
グアノシン（１００ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（２００ｍＬ）懸濁液に対してジメチルホルムアミドジメチルアセタール（５００ｍｍｏｌ）を加え、室温で8時間撹拌した。反応液をろ過し、得られた固体を乾燥した後、無水ピリジン溶液（２００ｍＬ）に溶解した。この溶液に塩化ｔ−ブチルジメチルシリル（１４．３ｇ，９５ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（１００ｍＬ）を、カニュラーを用いて０℃でゆっくりと加えた。得られた反応混合液の温度を室温まで昇温したのち、４時間撹拌した。エバポレータを用いて反応混合液を濃縮した後、濃縮物を塩化メチレン（２００ｍＬ）に溶解した。得られた溶液を撹拌した蒸留水（５００ｍＬ）に滴下し、有機相を分離した後、エバポレータを用いて濃縮することにより粗生成物を得た。粗生成物をアセトニトリルで再結晶することにより、目的の５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ体を得た（収率：８３〜８８％）。

（２−１） ５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−リボヌクレオシド ２’−または３’−Ｈ−ホスホン酸エステル混合物の一般的合成
上記で得られた４種の５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−リボヌクレオシド（８０ｍｍｏｌ）、１，２，４−トリアゾール（１６．６ｇ，２４０ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（３５．６ｍＬ，２４０ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（１６０ｍＬ）に対して、蒸留した三塩化リン（７．０ｍＬ，８０ｍｍｏｌ）を、カニュラーを用いて−７８℃でゆっくりと滴下し、３０分撹拌した。反応液を、０℃に冷却した５％炭酸水素ナトリウム水溶液（２００ｍＬ）に滴下し、１０分撹拌した。反応液を、排除限界分子量１００の透析膜（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｅｓｔｅｒ（ＣＥ） Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ製）に封入し、メタノールに対して１５時間透析し、反応試薬由来の不純物と溶媒を交換した。得られた溶液を濃縮し、粗生成物を得た。得られた粗生成物を下記条件のクロマトグラフィに付し、目的化合物であるホスホン酸エステル混合物を得た（収率：６５〜７７％）。

クロマトグラフィ条件
カラム担体： ＯＤＳシリカ担体（６０μｍ）
装置： 中圧逆相クロマトグラフ装置（昭光サイエンティフィック社製，Ｐｕｒｉｆ−ｃｏｍｐａｃｔ）
溶離液： ０〜５０％アセトニトリル水溶液
（２−２） ５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ アデノシン ２’−または３’−Ｈ−ホスホン酸エステル混合物の合成
イミダゾール（４９ｇ，７２０ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（２００ｍＬ）溶液に対して、蒸留した三塩化リン（１０ｍＬ，１２０ｍｍｏｌ）を−５０℃下でゆっくりと滴下した。当該溶液に５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳアデノシン（２２．９ｍｍｏｌ，６０ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（２００ｍＬ）を、カニュラーを用いてゆっくりと滴下し、３０分以上かけて０℃まで昇温し、そのまま３０分撹拌した。反応液に２８％アンモニア水（１００ｍＬ）を加え、室温で一晩撹拌した。得られた溶液を濃縮して粗生成物を得たのち、中圧クロマト装置（山善社製，製品名「ＹＦＬＣ ＡＩ−５８０」）とＨｉｇｈ−Ｆｌａｓｈ ４０μｍｓｉｚｅ４Ｌカラムを用いて、塩化メチレン−メタノールを溶出溶媒として精製し、目的化合物であるホスホン酸エステル混合物を得た（収率：７７％）。

（２−３） ５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ シチジン ２’−または３’−Ｈ−ホスホン酸エステル混合物の合成
イミダゾール（２５ｇ，３６０ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（１００ｍＬ）溶液に対して、蒸留した三塩化リン（５．０ｍＬ，６０ｍｍｏｌ）を−５０℃下でゆっくりと滴下した。当該溶液に５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳシチジン（１０．８ｇ，６０ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（１００ｍＬ）を、カニュラーを用いてゆっくりと滴下し、３０分以上かけて０℃まで昇温し、そのまま３０分撹拌した。反応液に２８％アンモニア水（１００ｍＬ）を加え、室温で一晩撹拌した。得られた溶液を濃縮して粗生成物を得たのち、粗生成物を中圧クロマト装置（山善社製，製品名「ＹＦＬＣ ＡＩ−５８０」）とＨｉｇｈ−Ｆｌａｓｈ ４０μｍｓｉｚｅ４Ｌカラムを用いて、塩化メチレン−メタノールを溶出溶媒として精製し、目的化合物であるホスホン酸エステル混合物を得た（収率：７５％）。

（２−４） ５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ ウリジン ２’−または３’−Ｈ−ホスホン酸エステル混合物の合成
イミダゾール（２５ｇ，３６０ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（１００ｍＬ）溶液に対して、蒸留した三塩化リン（５．０ｍＬ，６０ｍｍｏｌ）を−５０℃下でゆっくりと滴下した。当該溶液に５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳウリジン（１０．８ｇ，３０ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（１００ｍＬ）を、カニュラーを用いてゆっくりと滴下し、３０分以上かけて０℃まで昇温し、そのまま３０分撹拌した。反応液に２８％アンモニア水（１００ｍＬ）を加え、室温で一晩撹拌した。得られた溶液を濃縮して粗生成物を得たのち、粗生成物を中圧クロマト装置（山善社製，製品名「ＹＦＬＣ ＡＩ−５８０」）とＨｉｇｈ−Ｆｌａｓｈ ４０μｍｓｉｚｅ４Ｌカラムを用いて、塩化メチレン−メタノールを溶出溶媒として精製し、目的化合物であるホスホン酸エステル混合物を得た（収率：７５％）。

（２−５） ５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ グアノシン ２’−または３’−Ｈ−ホスホン酸エステル混合物の合成
イミダゾール（２５ｇ，３６０ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（１００ｍＬ）溶液に対して、蒸留した三塩化リン（５．０ｍＬ，６０ｍｍｏｌ）を−５０℃下でゆっくりと滴下した。当該溶液に５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳグアノシン（１３．６ｇ，３０ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（１００ｍＬ）を、カニュラーを用いてゆっくりと滴下し、３０分以上かけて０℃まで昇温し、そのまま３０分撹拌した。反応液に２８％アンモニア水（１００ｍＬ）を加え、室温で一晩撹拌した。得られた溶液を濃縮して粗生成物を得た後、中圧クロマト装置（昭光サイエンティフィック社製，製品名「ＰｒｉｆＣｏｍｐａｃｔ」）とＰｒｉｆＰａｃｋ ＯＤＳ ３０μｍｓｉｚｅ２００カラムを用いて、塩化メチレン−メタノールを溶出溶媒として精製し、目的化合物であるホスホン酸エステル混合物を得た（収率：７５％）。

（３−１） ２’−Ｏ−アセチル−５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−リボヌクレオシド ３’−Ｈ−ホスホン酸エステルの一般的合成
上記（２）で得られた４種の５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−リボヌクレオシド Ｈ−ホスホン酸エステル混合物（５０ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ溶液（２５０ｍＬ）に対して、酢酸ビニル（２３．４ｍＬ，２５０ｍｍｏｌ）とＣａｎｄｉｄａ Ｃｙｃｌｉｎｄｒａｃｅａ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）由来のリパーゼ（１．０ｇ）を加え、５５℃で２４時間振とうした。リパーゼを濾別し、濾液をエバポレータで濃縮することにより粗生成物を得た。得られた粗生成物を、溶離液を５〜２５％アセトニトリル水溶液に変更した以外は上記（２）と同様の条件のクロマトグラフィに付し、目的化合物である３’−Ｈ−ホスホン酸エステルを得た（収率：５５〜８１％）。

（３−２） ２’−Ｏ−アセチル−５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−アデノシン ３’−Ｈ−ホスホン酸エステルモノマーの合成
上記（２）で得られた５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳアデノシン Ｈ−ホスホン酸エステル混合物（１７ｇ，２５ｍｍｏｌ）のｔ−ブタノール溶液（１２５ｍＬ）に対して、無水酢酸（７．１ｍＬ，７５ｍｍｏｌ）とブタ膵臓由来のリパーゼ（１．０ｇ）を加え、３７℃で８時間振とうした。リパーゼを濾別し、濾液をエバポレータで濃縮することにより粗生成物を得た。粗生成物は昭光サイエンティフィック社製中圧クロマト装置ＰｒｉｆＣｏｍｐａｃｔ上で、ＰｒｉｆＰａｃｋ ＯＤＳ３０μｍ ｓｉｚｅ２００カラムを用いて、脱気した水−メタノールを溶出溶媒として精製し、目的化合物である３’−Ｈ−ホスホン酸エステルを得た（１３．２ｇ，収率：７６％）。
¹H NMR（500 MHz，CD₃OD）：δ8.74（1H，s），8.51（1H，s）, 8.11-8.17（2H，br S），6.93（1H，d，J = 588 Hz），6.58-6.71（1H，m），6.17-6.24（1H，m），5.09-5.47（1H，m），4.42-4.55（5H，m），3.49-3.66（2H，m），2.36（3H，s），0.82（9H，s），0.02（3H，s），-0.06（3H，s）
³¹P NMR（202.5 MHz，CD₃OD）：δ2.0
ESI-TOF MS：calcd for C₁₈H₂₉N₅O₇PSi，[M-H]^-m/z：486.16，Found m/z：486.36
得られた目的化合物を、逆相カラムを用いた下記条件のＨＰＬＣで分析した。得られたＨＰＬＣチャートを図１に示す。

高圧グラジエントユニット：日本分光社製「ＨＧ−９８０−３１」
ポンプ：日本分光社製「ＰＵ−９８０」
サンプリングユニット：日本分光社製「ＡＳ−２０５７ｐｌｕｓ」
ＵＶ−ＶＩＳ検出器：日本分光社製「ＵＶ−９７０」
カラムオーブン：日本分光社製「８６０−ＣＯ」
カラム：ナカライテスク社製「５Ｃ１８ ＣＯＳＭＯＳＩＬ−ＡＲ−ＩＩ ４．６×２５０ｍｍ」
溶出液：０．１Ｍ ＴＥＡＡ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）／ＣＨ₃ＣＮ ａｑ （ＣＨ₃ＣＮ ａｑの割合を、３０分間かけて２％から６０％とした）
溶出速度：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
分析温度：４０℃
検出波長：２６０ｎｍ
図１のとおり、酵素を用いたアセチル化により、高い立体選択性をもって２’位をアセチル化できることが実証された。

（３−３） ２’−Ｏ−アセチル−５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−シチジン ３’−Ｈ−ホスホン酸エステルモノマーの合成
上記（２）で得られた５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳシチジン Ｈ−ホスホン酸エステル混合物（６．６g，１０ｍｍｏｌ）のｔ−ブタノール溶液（２５ｍＬ）に対して、無水酢酸（２．８ｍＬ，３０ｍｍｏｌ）とブタ膵臓（０．４ｇ）を加え、３７℃で２４時間振とうした。リパーゼを濾別し、濾液をエバポレータで濃縮することにより粗生成物を得た。昭光サイエンティフィック社製中圧クロマト装置ＰｒｉｆＣｏｍｐａｃｔ上で、ＰｒｉｆＰａｃｋ ＯＤＳ３０μｍ ｓｉｚｅ２００カラムを用いて、脱気した水−メタノールを溶出溶媒として精製し、目的化合物である３’−Ｈ−ホスホン酸エステルを得た（５．５４ｇ，収率：８０％）。
¹H NMR（500 MHz，CD₃OD）：7.95-8.20（2H，br S），δ7.73（1H，d，J = 17.3），6.63（1H，d，J = 593 Hz），6.32-6.65（1H，m），6.05-6.37（1H，m），5.94（1H，d，J = 17.3），5.09-5.40（2H，m），4.18-4.63（5H，m），3.63-3.72（2H，m），2.45（3H，s），0.81（9H，s），0.04（3H，s），-0.02（3H，s）
³¹P NMR（202.5 MHz，CD₃OD）：δ2.2
ESI-TOF MS：calcd for C₁₇H₂₉N₃O₈PSi，[M-H]^-m/z：462.15，Found m/z：462.23
（３−４） ２’−Ｏ−アセチル−５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−ウリジン ３’−Ｈ−ホスホン酸エステルモノマーの合成
上記（２）で得られた５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳウリジン Ｈ−ホスホン酸エステル混合物（６．６ｇ，１０ｍｍｏｌ）のｔ−ブタノール溶液（２５ｍＬ）に対して、無水酢酸（２．８ｍＬ，３０ｍｍｏｌ）とブタ膵臓由来のリパーゼ（０．４ｇ）を加え、３７℃で２４時間振とうした。リパーゼを濾別し、濾液をエバポレータで濃縮することにより粗生成物を得た。昭光サイエンティフィック社製中圧クロマト装置ＰｒｉｆＣｏｍｐａｃｔ上で、ＰｒｉｆＰａｃｋ ＯＤＳ３０μｍ ｓｉｚｅ２００カラムを用いて、脱気した水−メタノールを溶出溶媒として精製し、目的化合物である３’−Ｈ−ホスホン酸エステルヌクレオシドモノマーを得た（５．６１ｇ，収率：８１％）。
¹H NMR（500 MHz，CD₃OD）：δ7.88（1H，d，J = 17.2），6.63（1H，d，J = 579 Hz），6.21-6.59（1H，m），5.58-6.07（1H，m），5.79（1H，d，J = 17.3），4.99-5.28（2H，m），4.10-4.73（5H，m），3.73-3.88（2H，m），2.27（3H，s），0.82（9H，s），0.01（3H，s），-0.06（3H，s）
³¹P NMR（202.5 MHz，CD₃OD）：δ2.1
ESI-TOF MS：calcd for C₁₇H₂₈N₂O₉PSi，[M-H]^-m/z：463.13，Found m/z：463.51
得られた目的化合物を、上記実施例１（３−２）と同様の条件のＨＰＬＣで分析した。得られたＨＰＬＣチャートを図２に示す。図２のとおり、酵素を用いたアセチル化により、ウリジンでも、高い立体選択性をもって２’位をアセチル化できることが実証された。

（３−５） ２’−Ｏ−アセチル−５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−グアノシン ３’−Ｈ−ホスホン酸エステルの合成
上記（２）で得られた５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳグアノシン Ｈ−ホスホン酸エステル混合物（７．０３ｇ，１０ｍｍｏｌ）のｔ−ブタノール溶液（２５ｍＬ）に対して、無水酢酸（２．８ｍＬ，３０ｍｍｏｌ）とブタ膵臓由来のリパーゼ（０．４ｇ）を加え、３７℃で２４時間振とうした。リパーゼを濾別し、濾液をエバポレータで濃縮することにより粗生成物を得た。昭光サイエンティフィック社製中圧クロマト装置ＰｒｉｆＣｏｍｐａｃｔ上で、ＰｒｉｆＰａｃｋ ＯＤＳ３０μｍ ｓｉｚｅ２００カラムを用いて、脱気した水−メタノールを溶出溶媒として精製し、目的化合物である３’−Ｈ−ホスホン酸エステルヌクレオシドモノマーを得た（４．８ｇ，収率：５５％）。
¹H NMR（500 MHz，DMSO-D₆）：δ10.46-10.64（1H，br s），8.07（1H，s），7.23-7.56（2H，br S），6.54（1H，d，J = 592 Hz），5.28-6.59（3H，m），4.45-4.98（5H，m），3.63-3.79（2H，m），2.34（3H，s），0.77（9H，s），-0.03（3H，s），-0.12（3H，s）
³¹P NMR（202.5 MHz，DMSO-D₆）：δ1.7
ESI-TOF MS：calcd for C₁₈H₂₉N₅O₇PSi，[M-H]^-m/z：502.51，Found m/z：502.77

実施例２ ２’−Ｈ−ホスホン酸 ＲＮＡ合成用モノマーの製造
（１） ３’−Ｏ−アセチル−５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−リボヌクレオシド ２’−Ｈ−ホスホン酸エステルの合成
上記実施例１（２）で得た４種の５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−リボヌクレオシド Ｈ−ホスホン酸エステル混合物（５０ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（２５０ｍＬ）に対して、酢酸ビニル（２３．４ｍＬ，２５０ｍｍｏｌ）とブタ膵臓由来リパーゼ（２．０ｇ）を加え、５５℃で２４時間振とうした。リパーゼを濾別し、濾液をエバポレータで濃縮することにより粗生成物を得た。得られた粗生成物を上記実施例１（３）と同様の条件のクロマトグラフィに付し、目的化合物である２’−Ｈ−ホスホン酸エステルモノマーを得た（収率：５２〜８０％）。

（２） ３’−Ｏ−アセチル−５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−アデノシン ２’−Ｈ−ホスホン酸エステルの合成
上記実施例１（２）で得た５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳアデノシン Ｈ−ホスホン酸エステル混合物（６．７ｇ，１０ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ溶液（２５ｍＬ）に対して、無水酢酸（２．８ｍＬ，３０ｍｍｏｌ）とＬｉｐａｓｅＰＳ ＡｍａｎｏＳＤ（０．４ｇ）を加え、３７℃で８時間振とうした。リパーゼを濾別し、濾液をエバポレータで濃縮することにより粗生成物を得た。粗生成物は昭光サイエンティフィック社製中圧クロマト装置ＰｒｉｆＣｏｍｐａｃｔ上で、ＰｒｉｆＰａｃｋ ＯＤＳ３０μｍ ｓｉｚｅ２００カラムを用いて、脱気した水−メタノールを溶出溶媒として精製し、目的化合物である２’−Ｈ−ホスホン酸エステルモノマーを得た（５．３５ｇ，収率：８０％）。
H NMR（500 MHz，CD₃OD）：δ8.72（1H，s），8.48（1H，s），8.03-12（2H，br S），6.58（¹H，d，J = 573 Hz），6.62-6.73（1H，m），5.57-6.19（2H，m），4.68-5.01（4H，m），3.49-3.66（2H，m），2.41（3H，s），0.81（9H，s），0.03（3H，s），-0.05（3H，s）
³¹P NMR（202.5 MHz，CD₃OD）：δ2.4
ESI-TOF MS：calcd for C₁₈H₂₉N₅O₇PSi，[M-H]^-m/z：486.16，Found m/z：486.41
得られた目的化合物を、上記実施例１（３−２）と同様の条件のＨＰＬＣで分析した。得られたＨＰＬＣチャートを図２に示す。図２のとおり、酵素を用いたアセチル化により、高い立体選択性をもって３’位もアセチル化できることが実証された。

以上に加えて、リパーゼ反応の条件を種々検討した。結果を表１および表２にまとめる。

実施例３ ＲＮＡ２量体の製造
（１） ５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−ウリジン ２’−アセチル−３’−酒石酸エステルおよび３’−アセチル２’−酒石酸エステル混合物の合成
５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳウリジン（１．０８ｇ，３．０ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（１０ｍＬ）に対して、無水酒石酸（３００ｍｇ，３．０ｍｍｏｌ）を０℃下で加え、そのまま１時間撹拌した。反応液に無水酢酸（５７０μＬ，６．０ｍｍｏｌ）を加え、０℃で３０分撹拌した。反応液にメタノールを加え、得られた溶液を濃縮して粗生成物を得た後、中圧クロマト装置（昭光サイエンティフィック社製，ＰｒｉｆＣｏｍｐａｃｔ）と分離精製用カラム（昭光サイエンティフィック社製，ＰｕｒｉｆＰａｃｋ ＯＤＳ３０μｍ ｓｉｚｅ６０）を用いて、脱気した水−メタノールを溶出溶媒として精製し、目的化合物である５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−ウリジン アセチル−酒石酸エステル混合物を得た（１．２ｇ，収率：７３％）。

（２） ５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ ウリジン ２’−アセチル−３’−酒石酸担持ポリエチレングリコールおよび５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ ウリジン ３’−アセチル−２’−酒石酸担持ポリエチレングリコールの混合物の合成
上記（１）で得られた５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−ウリジン アセチル−酒石酸エステル混合物（１．１ｇ，２．０ｍｍｏｌ）およびモノメトキシポリエチレングリコール（平均分子量５０００，５．０ｇ，１．０ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（１０ｍＬ）に対して、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（８１０ｍｇ，６．０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（０．９３ｍＬ，６．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。反応液にＴＢＡＦのＴＨＦ溶液（１．０Ｍ，４．０ｍＬ，４．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で撹拌した後、ＣｅｌｌｆｉｎｅＧＨ−２５（５０ｍＬ，溶離液：メタノール）を用いて精製し、ウリジン担持ポリエチレングリコールを得た（１．０ｇ，収率：９５％）。

（３） 縮合
上記（２）で得られたウリジン担持ポリエチレングリコール（１．０ｇ，１．９ｍｍｏｌ）と、上記実施例１（３−２）で得られた２’−Ｏ−アセチル−５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−アデノシン ３’−Ｈ−ホスホン酸エステルモノマー（２．０ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（４．０ｍＬ）溶液に、塩化ピバリル酸（４９０μＬ，４．０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（５６０μＬ，４．０ｍｍｏｌ）を加えた。モノマーの消費をＹＭＣ ＰａｋＤｉｏｌ６０（溶離液：０．１Ｍ，ＮａＣｌ）で追跡しながら１時間撹拌した。

（４） 亜リン酸ジエステル基の酸化
上記反応溶液に、２０ｍＭヨウ素水／ピリジン／ＴＨＦ溶液（１．０ｍＬ，２０ｍｍｏｌ）を添加して３０分撹拌した。

（５） ５’位の脱保護
さらに、上記反応液にＴＢＡＦのＴＨＦ溶液（１．０Ｍ，４．０ｍＬ，４．０ｍｍｏｌ）を加えて１時間撹拌した。次いで、ＣｅｌｌｆｉｎｅＧＨ−２５（５０ｍＬ）で精製した。

（６） ２’位と３’位の脱保護
上記担持２量体ＲＮＡをメタノール（１２５ｍＬ）に溶解し、Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ由来のリパーゼ（５．０ｍＬ）を加え、室温で４８時間振とうした。リパーゼを濾別し、反応液を凍結乾燥した後、昭光サイエンティフィック社製中圧クロマト装置ＰｒｉｆＣｏｍｐａｃｔ上で、ＹＭＣ ＯＤＳｐａｃｋ ２５μｍ ２００カラムを用いて、オートクレーブおよび脱気した水−メタノールを溶出溶媒として精製し、目的のＲＮＡ２量体（１．５ｇ）を得た。得られたＲＮＡ２量体がテトラブチルアンモニウム塩であるとして計算した通算収率は９５％であった。得られたＲＮＡ２量体の分析結果を以下に示す。
ESI-TOF MS：calcd for C₁₉H₂₃N₇O₁₂P，[M-H]^- m/z：572.11，Found m/z：572.23
また、上記実施例１（３−２）と同様の条件で、得られた溶液をＨＰＬＣで分析した。得られたＨＰＬＣチャートを図３に示す。図３のとおり、本発明方法により得られたＲＮＡ２量体の純度は高いものであった。

実施例４ ＲＮＡ２１量体の製造
上記実施例３と同様の条件で、さらに上記（３）〜（５）のプロセスを繰り返し、可溶化高分子に担持された５’−ｒＧＣＡ ＵＵＵ ＵＵＡ ＵＵＵ ＵＵＵ ＵＵＵ ＵＵＵ−３’の配列のＲＮＡ２１量体の保護体がポリエチレングリコールに固定化された化合物を合成した。

上記担持２１量体ＲＮＡをメタノール（１２５ｍＬ）に溶解し、Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ由来のリパーゼ（５．０ｍＬ）を加え、室温で４８時間振とうした。リパーゼを濾別し、反応液を凍結乾燥した後、昭光サイエンティフィック社製中圧クロマト装置ＰｒｉｆＣｏｍｐａｃｔ上で、ＹＭＣ ＯＤＳｐａｃｋ ２５μｍ ２００カラムを用いて、オートクレーブおよび脱気した２０ｍＭ酢酸アンモニウム−アセトニトリルを溶出溶媒として精製し、目的のＲＮＡ２１量体を得た（ＯＤ₂₆₀：２２５００，通算収率：２３％）。

得られたＲＮＡ２１量体を、下記の溶出液を用いた以外は上記実施例１（３−２）と同様の条件のＨＰＬＣで分析した。

溶出液：０．１Ｍ ＴＥＡＡ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）／ＣＨ₃ＣＮ ａｑ（ＣＨ₃ＣＮ ａｑの割合を、３０分間かけて４０％から６０％とした）
得られたＨＰＬＣチャートを図４に示す。

得られたＲＮＡの純度は、ＨＰＬＣチャートより９９％以上であることを確認した。

以上のとおり、本発明方法によれば、固定化ＲＮＡに対してＲＮＡ合成用モノマーをほぼ化学量論量で用いた場合であっても、２１量体を通算収率２３％という液相法としては十分な高収率で製造することができた。

また、最後の脱保護反応において、有機溶媒であるメタノール中、リパーゼを用いることができた。よって、最終段階におけるＲＮＡ分解酵素によるＲＮＡ鎖の切断などの副反応を回避できるといえる。

Claims (15)

1. 下記式（Ｉ）で表されることを特徴とするＲＮＡ合成用モノマーまたはその塩。
   ［式中、
   Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、ヒポキサンチンまたはキサンチンを示し；
   Ｒ¹は、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジメチルイソプロピルシリル基、ジエチルイソプロピルシリル基、ジメチルテキシルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリベンジルシリル基、トリ−ｐ−キシリルシリル基、トリフェニルシリル基、ジフェニルメチルシリル基およびｔ−ブチルメトキシフェニルシリル基から選択されるシリル系保護基；トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基、ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル基、ジ（ｐ−メトキシフェニル）フェニルメチル基、トリ（ｐ−メトキシフェニル）メチル基、４−（４’−ブロモフェナシルオキシ）フェニルジフェニルメチル基、４，４’，４”−トリス（４，５−ジクロロフタルイミドフェニル）メチル基、４，４’，４”−トリス（レブリノイルオキシフェニル）メチル基、４，４’，４”−トリス（ベンゾイルオキシフェニル）メチル基、３−（イミダゾイル−１−イルメチル）ビス（４’，４”−ジメトキシフェニル）メチル基および１，１−ビス（４−メトキシフェニル）−１’−ピレニルメチル基から選択されるトリチル系保護基；または、ｔ−ブトキシカルボニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびベンジルオキシカルボニル基から選択されるカーバメート系保護基を示し；
   Ｒ²は、Ｃ_1-4アルキル基、Ｃ_2-4アルケニル基またはＣ_1-4ハロゲン化アルキル基を示す］
2. 下記式（Ｉ’）で表されることを特徴とするＲＮＡ合成用モノマーまたはその塩。
   ［式中、
   Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、ヒポキサンチンまたはキサンチンを示し；
   Ｒ¹は、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジメチルイソプロピルシリル基、ジエチルイソプロピルシリル基、ジメチルテキシルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリベンジルシリル基、トリ−ｐ−キシリルシリル基、トリフェニルシリル基、ジフェニルメチルシリル基およびｔ−ブチルメトキシフェニルシリル基から選択されるシリル系保護基；トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基、ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル基、ジ（ｐ−メトキシフェニル）フェニルメチル基、トリ（ｐ−メトキシフェニル）メチル基、４−（４’−ブロモフェナシルオキシ）フェニルジフェニルメチル基、４，４’，４”−トリス（４，５−ジクロロフタルイミドフェニル）メチル基、４，４’，４”−トリス（レブリノイルオキシフェニル）メチル基、４，４’，４”−トリス（ベンゾイルオキシフェニル）メチル基、３−（イミダゾイル−１−イルメチル）ビス（４’，４”−ジメトキシフェニル）メチル基および１，１−ビス（４−メトキシフェニル）−１’−ピレニルメチル基から選択されるトリチル系保護基；または、ｔ−ブトキシカルボニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびベンジルオキシカルボニル基から選択されるカーバメート系保護基を示し；
   Ｒ²は、Ｃ_1-4アルキル基、Ｃ_2-4アルケニル基またはＣ_1-4ハロゲン化アルキル基を示す］
3. Ｂが、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、ヒポキサンチンまたはキサンチンであって、保護されていないものである請求項１または２に記載のＲＮＡ合成用モノマーまたはその塩。
4. ＲＮＡの液相合成に用いられる請求項１〜３のいずれかに記載のＲＮＡ合成用モノマーまたはその塩。
5. Ｒ¹が、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジメチルイソプロピルシリル基、ジエチルイソプロピルシリル基、ジメチルテキシルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリベンジルシリル基、トリ−ｐ−キシリルシリル基、トリフェニルシリル基、ジフェニルメチルシリル基およびｔ−ブチルメトキシフェニルシリル基から選択されるシリル系保護基を示す請求項１〜４のいずれかに記載のＲＮＡ合成用モノマーまたはその塩。
6. ＲＮＡ合成用モノマーを製造するための方法であって、
   当該ＲＮＡ合成用モノマーは、下記式（Ｉ）の３’−Ｈ−ホスホン酸エステル、下記式（Ｉ’）の２’−Ｈ−ホスホン酸エステルまたはその塩であり；
   ［式中、
   Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、ヒポキサンチンまたはキサンチンを示し；
   Ｒ¹は、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジメチルイソプロピルシリル基、ジエチルイソプロピルシリル基、ジメチルテキシルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリベンジルシリル基、トリ−ｐ−キシリルシリル基、トリフェニルシリル基、ジフェニルメチルシリル基およびｔ−ブチルメトキシフェニルシリル基から選択されるシリル系保護基；トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基、ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル基、ジ（ｐ−メトキシフェニル）フェニルメチル基、トリ（ｐ−メトキシフェニル）メチル基、４−（４’−ブロモフェナシルオキシ）フェニルジフェニルメチル基、４，４’，４”−トリス（４，５−ジクロロフタルイミドフェニル）メチル基、４，４’，４”−トリス（レブリノイルオキシフェニル）メチル基、４，４’，４”−トリス（ベンゾイルオキシフェニル）メチル基、３−（イミダゾイル−１−イルメチル）ビス（４’，４”−ジメトキシフェニル）メチル基および１，１−ビス（４−メトキシフェニル）−１’−ピレニルメチル基から選択されるトリチル系保護基；または、ｔ−ブトキシカルボニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびベンジルオキシカルボニル基から選択されるカーバメート系保護基を示し；
   Ｒ²は、Ｃ_1-4アルキル基、Ｃ_2-4アルケニル基またはＣ_1-4ハロゲン化アルキル基を示す］
   リパーゼの存在下、Ｈ−ホスホン酸エステル化された５’保護リボヌクレオシド（ＩＩ）と、下記式（ＩＩＩ）の化合物：
   Ｒ²Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ³ ・・・ （ＩＩＩ）
   ［式中、Ｒ²は前記と同義を示し；Ｒ³は、−Ｈ、Ｃ_1-6アルキル基、Ｃ_2-6アルケニル基、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ²または−Ｎ＝Ｃ（Ｃ_1-6アルキル）₂を示す］
   とを反応させることにより、２’位水酸基または３’位水酸基を選択的にエステル化する工程を含むことを特徴とする製造方法。
   ［式中、Ｒ¹、Ｒ²およびＢは上記と同義を示す］
7. さらに、５’保護リボヌクレオシド（ＩＶ）に三ハロゲン化リンを作用させ、２’位水酸基または３’位水酸基をＨ−ホスホン酸エステル化することによりＨ−ホスホン酸エステル化された５’保護リボヌクレオシド（ＩＩ）を得る工程を含む請求項６に記載の製造方法。
   ［式中、ＢおよびＲ¹は上記と同義を示す］
8. さらに、リボヌクレオシド（Ｖ）の５’位水酸基を選択的に保護することにより５’保護リボヌクレオシド（ＩＶ）を得る工程を含む請求項７に記載の製造方法。
   ［式中、ＢおよびＲ¹は上記と同義を示す］
9. ＲＮＡを製造するための方法であって、
   下記式（Ｉ）または（Ｉ’）で表されることを特徴とするＲＮＡ合成用モノマーまたはその塩と
   ［式中、
   Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、ヒポキサンチンまたはキサンチンを示し；
   Ｒ¹は、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジメチルイソプロピルシリル基、ジエチルイソプロピルシリル基、ジメチルテキシルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリベンジルシリル基、トリ−ｐ−キシリルシリル基、トリフェニルシリル基、ジフェニルメチルシリル基およびｔ−ブチルメトキシフェニルシリル基から選択されるシリル系保護基；トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基、ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル基、ジ（ｐ−メトキシフェニル）フェニルメチル基、トリ（ｐ−メトキシフェニル）メチル基、４−（４’−ブロモフェナシルオキシ）フェニルジフェニルメチル基、４，４’，４”−トリス（４，５−ジクロロフタルイミドフェニル）メチル基、４，４’，４”−トリス（レブリノイルオキシフェニル）メチル基、４，４’，４”−トリス（ベンゾイルオキシフェニル）メチル基、３−（イミダゾイル−１−イルメチル）ビス（４’，４”−ジメトキシフェニル）メチル基および１，１−ビス（４−メトキシフェニル）−１’−ピレニルメチル基から選択されるトリチル系保護基；または、ｔ−ブトキシカルボニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびベンジルオキシカルボニル基から選択されるカーバメート系保護基を示し；
   Ｒ²は、Ｃ_1-4アルキル基、Ｃ_2-4アルケニル基またはＣ_1-4ハロゲン化アルキル基を示す］
   下記式（ＶＩ）で表される固定化ＲＮＡとを縮合する工程
   ［式中、
   Ｂは上記と同義を示し、且つ、互いに同一であっても異なっていてもよく；
   Ｒ²は上記と同義を示し；
   Ｘは可溶性高分子を示し；
   ｎは整数を示す；
   但し、ｎ＝０の場合、リン酸ジエステル基は水酸基であるものとする；
   また、各リボース単位において、２’位および３’位の置換基は互いに入れ替わっていてもよいものとする］；
   亜リン酸ジエステル基を酸化する工程；および
   Ｒ¹を除去する工程を含むことを特徴とする方法。
10. Ｂが、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、ヒポキサンチンまたはキサンチンであって、保護されていないものである請求項９に記載の方法。
11. 上記縮合工程を液相合成で行なう請求項９または１０に記載の方法。
12. Ｒ¹が、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジメチルイソプロピルシリル基、ジエチルイソプロピルシリル基、ジメチルテキシルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリベンジルシリル基、トリ−ｐ−キシリルシリル基、トリフェニルシリル基、ジフェニルメチルシリル基およびｔ−ブチルメトキシフェニルシリル基から選択されるシリル系保護基を示す請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。
13. さらに、リパーゼまたはエステラーゼにより２’位のＲ²−（Ｃ＝Ｏ）−基と３’位のＸ−（Ｃ＝Ｏ）−基を除去する工程を含む請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。
14. ２’位のＲ²−（Ｃ＝Ｏ）−基と３’位のＸ−（Ｃ＝Ｏ）−基を除去する工程をＣ_1-4アルコールを含む溶媒中で行う請求項１３に記載の方法。
15. 下記式（ＸＩ）で表されることを特徴とするＲＮＡオリゴマーまたはその塩。
    ［式中、
    Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、ヒポキサンチンまたはキサンチンを示し、且つ、互いに同一であっても異なっていてもよく；
    Ｒ²は、Ｃ_1-4アルキル基、Ｃ_2-4アルケニル基またはＣ_1-4ハロゲン化アルキル基を示し；
    Ｒ⁴は、水素原子；トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジメチルイソプロピルシリル基、ジエチルイソプロピルシリル基、ジメチルテキシルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリベンジルシリル基、トリ−ｐ−キシリルシリル基、トリフェニルシリル基、ジフェニルメチルシリル基およびｔ−ブチルメトキシフェニルシリル基から選択されるシリル系保護基；トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基、ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル基、ジ（ｐ−メトキシフェニル）フェニルメチル基、トリ（ｐ−メトキシフェニル）メチル基、４−（４’−ブロモフェナシルオキシ）フェニルジフェニルメチル基、４，４’，４”−トリス（４，５−ジクロロフタルイミドフェニル）メチル基、４，４’，４”−トリス（レブリノイルオキシフェニル）メチル基、４，４’，４”−トリス（ベンゾイルオキシフェニル）メチル基、３−（イミダゾイル−１−イルメチル）ビス（４’，４”−ジメトキシフェニル）メチル基および１，１−ビス（４−メトキシフェニル）−１’−ピレニルメチル基から選択されるトリチル系保護基；または、ｔ−ブトキシカルボニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル基およびベンジルオキシカルボニル基から選択されるカーバメート系保護基を示し；
    Ｘは可溶性高分子を示し；
    ｍは１以上の整数を示す；
    但し、各リボース単位において、２’位および３’位の置換基は互いに入れ替わっていてもよいものとする］