JPWO2013183718A1 - スクリーニング方法、タンパク質の不安定性及び/又は安定性を誘導する物質、及び、タンパク質の活性評価 - Google Patents
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Abstract
Description
[式(I)において、R1は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、R2は、-R3、-C≡C-R3、-CH=CH-R3、及び-O-(CH2)n-R3からなる群から選択され、nは1〜6であり、R3は、水素原子、水酸基、C1−8アルキル基、-Si(R5)3、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、R1とR2は結合して環を形成し、-R1-R2-が、-(CH2)m-CH2-、-CH=CH-、-(CH2)m-O-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、mは1〜6であり、R4は、水素原子又はC1−6アルキル基である。R5は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、-Si(R5)3中の3つのR5はそれぞれ異なっていてもよい。]
[式(III)において、R21及びR23は、それぞれ独立して、水素原子、C1−6直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基であり、R22は、-R26、-C≡C-R26、-CH=CH-R26、及び-O-(CH2)n-R26からなる群から選択され、nは1〜6であり、R26は、水素原子、水酸基、C1−8アルキル基、-Si(R27)3、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、R21とR22は結合して環を形成し、-R21-R22-が、-(CH2)m-CH2-、-CH=CH-、-(CH2)m-O-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、mは1〜6であり、R27は水素原子、C1―6アルキル基、トリハロメチル基、又は水酸基であり、-Si(R27)3中の3つのR27はそれぞれ異なっていてもよい。R24、R25は、水素原子又はC1―6アルキル基である。]
[式(II)において、R11は、ハロゲン原子、又はハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基であり、R12は、水素原子、C1−6アルキル基、又はハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基若しくは単環式複素芳香環基であり、R13は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、Qは、-C(O/S)-C=C-R14、-C(O/S)-NH-CH2-R14、-C(O/S)-NH-C(O/S)-R14、-C(O/S)-R14、及び、-SO2-R14からなる群から選択される基であり、R14は、C1−6アルキル基、C1−6アルコキシ基、水酸基若しくはハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基又は単環式複素芳香環基である。]
[式(II)において、R11は、ハロゲン原子、又はハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基であり、R12は、水素原子、C1−6アルキル基、又はハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基若しくは単環式複素芳香環基であり、R13は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、Qは、-C(O/S)-C=C-R14、-C(O/S)-NH-CH2-R14、-C(O/S)-NH-C(O/S)-R14、-C(O/S)-R14、及び、-SO2-R14からなる群から選択される基であり、R14は、C1−6アルキル基、C1−6アルコキシ基、水酸基若しくはハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基又は単環式複素芳香環基である。]
本開示は、一又は複数の実施形態において、標的タンパク質の不安定性及び/又は安定性を誘導する物質のスクリーニング方法に関する。前記スクリーニング方法は、一又は複数の実施形態において、アッセイ細胞をテスト物質と接触させることを含む培養を行い前記アッセイ細胞が発現する内部標準タンパク質に対する前記アッセイ細胞が発現する標的タンパク質の相対量(A)を測定すること、アッセイ細胞をテスト物質と接触させることなく培養し前記アッセイ細胞が発現する前記アッセイ細胞が発現する内部標準タンパク質に対する標的タンパク質の相対量(B)を測定すること、前記相対量(A)と前記相対量(B)とを比較すること、及び、前記比較に基づいて標的タンパク質の不安定性及び/又は安定性を誘導する候補物質を選択することを含む。
本開示にかかるスクリーニング方法におけるアッセイ細胞は、一又は複数の実施形態において、標的タンパク質と内部標準タンパク質とを発現する。例えば、生きた細胞等を基盤としたスクリーニング法において標的タンパク質の量が低減したとしても、不安定化したのか、遺伝子発現を抑制したのかをスクリーニングの段階で明確に区別することは困難な場合がある。アッセイ細胞が内部標準タンパク質を発現すれば、アッセイ細胞が発現する標的タンパク質の量が増加又は減少した場合に、その理由が遺伝子発現の亢進又は抑制であるのか、或いは、タンパク質自体の安定性の変化であるのかを区別可能な点で有利である。
本開示にかかるスクリーニング方法におけるテスト物質は、特に限定されない。本開示において「物質」は、一又は複数の実施形態において、化合物、組成物、混合物、抽出物、天然物、又は合成物であってよい。テスト物質は、一又は複数の実施形態において、スクリーニングライブラリーを利用してもよく、特に限定されないが、化合物若しくはその塩、組成物、混合物、抽出物、天然物、又は合成物のライブラリーが利用できる。
本開示にかかるスクリーニング方法における相対量は、一又は複数の実施形態において、内部標準タンパク質のタンパク質量に対する標的タンパク質のタンパク質量である。相対量の測定は、特に限定されず、従前知られた又は今後開発されるタンパク質量の測定方法で測定できる。相対量の測定は、一又は複数の実施形態において、光学イメージングにより行われる。光学イメージングが採用されることにより、スクリーニングの高速化、ハイスループット化が可能となる利点がある。光学イメージングによる相対量の測定は、一又は複数の実施形態において、アッセイ細胞を顕微鏡で観察し、標的タンパク質からの蛍光又は発光、及び、内部標準タンパク質からの蛍光又は発光を測定することで行われる。アッセイ細胞からの蛍光又は発光を測定する手段は、一又は複数の実施形態において、顕微鏡を搭載した蛍光又は発光イメージング装置であり、前記装置は、一又は複数の実施形態において、さらに解析ソフト又は解析装置を含む。標的タンパク質から蛍光又は発光を得る手段は、一又は複数の実施形態において、蛍光又は発光するように免疫学的に標的タンパク質を標識することであり、一又は複数の実施形態において、標的タンパク質をタグと融合させることである。内部標準タンパク質から蛍光又は発光を得る手段は、一又は複数の実施形態において、内部標準タンパク質として蛍光タンパク質を使用することであり、一又は複数の実施形態において、蛍光又は発光するように免疫学的に内部標準タンパク質を標識することであり、一又は複数の実施形態において、内部標準タンパク質をタグと融合させることである。
本開示にかかるスクリーニング方法において「標的タンパク質」は、特に制限されない。標的タンパク質は、一又は複数の実施形態において、例えば、DARK1AやTAUなどの(但し、これに限定されない)疾患に関与するタンパク質、又は、疾患に関与すると考えられるタンパク質が挙げられる。リン酸化酵素DYRK1Aは、ダウン症候群にて過剰産生が示され、この過剰産生がダウン症候群にて高確率に発症するアルツハイマー病の原因と考えられている。また、微小管結合タンパク質TAUは、過剰リン酸化を受けることで不溶化・集積し、この過剰リン酸化タウの蓄積が神経変性疾患の発症原因と考えられている。遺伝子欠損マウスを用いた過去の解析により、TAU遺伝子を欠損させることでアルツハイマー病の発症を抑制出来ることが示されている。この結果は、TAU遺伝子産物(TAUタンパク質)を低減させれば、アルツハイマー病の発症を抑制出来ることを示唆している。
本開示にかかるスクリーニング方法において「内部標準タンパク質」は、特に制限されない。内部標準タンパク質は、一又は複数の実施形態において、例えば、GFPやEGFPなどのような(但し、これに限定されない)蛍光タンパク質である。この形態は、上述のとおり、光学イメージングにより標的タンパク質の相対量を測定する点で利点がある。
本開示にかかるスクリーニング方法は、アッセイ細胞をテスト物質と接触させることを含む培養を行い前記アッセイ細胞が発現する内部標準タンパク質に対する前記アッセイ細胞が発現する標的タンパク質の相対量(A)と、アッセイ細胞をテスト物質と接触させることなく培養し前記アッセイ細胞が発現する前記アッセイ細胞が発現する内部標準タンパク質に対する標的タンパク質の相対量(B)とを比較し、標的タンパク質の不安定性及び/又は安定性を誘導する候補物質を選択することを含む。本開示にかかるスクリーニング方法における候補物質の選択の方法は特に制限されない。候補物質の選択は、一又は複数の実施形態において、前記相対量(A)が前記相対量(B)よりも減少していれば、前記テスト物質を標的タンパク質の不安定性を誘導する候補物質として選択すること、及び/又は、前記相対量(A)が前記相対量(B)よりも増加していれば、前記テスト物質を標的タンパク質の安定性を誘導する候補物質として選択することを含む。選択された候補物質は、一又は複数の実施形態において、さらなる検討を行って、標的タンパク質の不安定性及び/又は安定性を誘導する物質と判断してもよく、一又は複数の実施形態において、選択された候補物質そのものを標的タンパク質の不安定性及び/又は安定性を誘導する物質と判断してもよい。
本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示にかかるスクリーニング方法を行うためのキットに関する。本開示にかかるキットは、本開示かかるスクリーニング方法に使用するアッセイ細胞、又は、アッセイ細胞を作製するための遺伝子発現ベクターを含む。本開示にかかるキットは、一又は複数の実施形態において、アッセイ細胞の培養に必要な培地及び試薬、アッセイ細胞を作製するために必要な試薬、ポリヌクレオチド、並びにアッセイ細胞又は遺伝子発現ベクターについての取扱説明書から選択される少なくとも1つを含みうる。
本開示にかかるキットに含まれる遺伝子発現ベクターは、一又は複数の実施形態において、標的タンパク質のmRNAと内部標準タンパク質のmRNAとが同一の発現制御下で発現されうるように構成及び適合された遺伝子発現ベクターである。前記ベクターは、アッセイ細胞の作製のために使用される。前記ベクターは、一又は複数の実施形態において、アッセイ細胞の種類に応じて発現制御機構が適宜選択されうる。前記ベクターは、一又は複数の実施形態において、一過性発現を行うタイプであってもよく、安定発現を行うタイプであってもよい。本開示にかかるキットに含まれる遺伝子発現ベクターは、一又は複数の実施形態において、標的タンパク質と内部標準タンパク質とを同一のプロモーターで発現しうる遺伝子発現ベクターである。標的タンパク質と内部標準タンパク質とを同一のプロモーターで発現しうる遺伝子発現ベクターは、一又は複数の実施形態において、標的タンパク質と内部標準タンパク質とをポリシストロニック遺伝子発現系により発現しうる遺伝子発現ベクターである。ポリシストロニック遺伝子発現系は、一又は複数の実施形態において、標的タンパク質遺伝子と内部標準タンパク質遺伝子とが内部リボゾーム結合配列又は自己開裂ペプチドをコードする遺伝子配列を介して連結された構成を含む遺伝子発現系である。
[S1] 標的タンパク質の不安定性及び/又は安定性を誘導する物質のスクリーニング方法であって、アッセイ細胞をテスト物質と接触させることを含む培養を行い前記アッセイ細胞が発現する内部標準タンパク質に対する前記アッセイ細胞が発現する標的タンパク質の相対量(A)を測定すること、アッセイ細胞をテスト物質と接触させることなく培養し前記アッセイ細胞が発現する前記アッセイ細胞が発現する内部標準タンパク質に対する標的タンパク質の相対量(B)を測定すること、前記相対量(A)と前記相対量(B)とを比較すること、及び、前記比較に基づいて標的タンパク質の不安定性及び/又は安定性を誘導する候補物質を選択することを含み、アッセイ細胞は、一又は複数の実施形態において、標的タンパク質のmRNAと内部標準タンパク質のmRNAとを同一の発現制御下で発現しうる細胞、又は、標的タンパク質のmRNAと内部標準タンパク質のmRNAとを同一の発現制御下で発現しうる手段を有する細胞である方法;
[S2] 候補物質の選択が、前記相対量(A)が前記相対量(B)よりも減少していれば、前記テスト物質を標的タンパク質の不安定性を誘導する候補物質として選択すること、及び/又は、前記相対量(A)が前記相対量(B)よりも増加していれば、前記テスト物質を標的タンパク質の安定性を誘導する候補物質として選択することを含む[S1]記載のスクリーニング方法;
[S3] アッセイ細胞が、標的タンパク質と内部標準タンパク質とを同一のプロモーターで発現しうる細胞である[S1]又は[S2]に記載のスクリーニング方法;
[S4] アッセイ細胞が、標的タンパク質と内部標準タンパク質とをポリシストロニック遺伝子発現系により発現しうる細胞である[S3]記載のスクリーニング方法;
[S5] 前記ポリシストロニック遺伝子発現系が、標的タンパク質遺伝子と内部標準タンパク質遺伝子とが内部リボゾーム結合配列又は自己開裂ペプチドをコードする遺伝子配列を介して連結された構成を含む[S4]記載のスクリーニング方法;
[S6] 標的タンパク質又は内部標準タンパク質の少なくとも一方が、タグと融合した形態でアッセイ細胞において発現される[S1]から[S5]のいずれかに記載のスクリーニング方法;
[S7] 標的タンパク質及び内部標準タンパク質が、蛍光を発光可能な形態でアッセイ細胞において発現される[S1]から[S6]のいずれかに記載のスクリーニング方法;
[S8] [S1]から[S7]のいずれかに記載のスクリーニング方法を行うためのキットであって、標的タンパク質のmRNAと内部標準タンパク質のmRNAとを同一の発現制御下で発現しうるアッセイ細胞、若しくは、標的タンパク質のmRNAと内部標準タンパク質のmRNAとを同一の発現制御下で発現しうる手段を有するアッセイ細胞、又は、任意の標的タンパク質の遺伝子を組み込むことができ、かつ、内部標準タンパク質が予め組み込まれ、標的タンパク質のmRNAと内部標準タンパク質のmRNAとが同一の発現制御下で発現されうるように構成及び適合された遺伝子発現ベクターを含むキット。
本開示は、一又は複数の実施形態において、下記一般式(I)で表される化合物又はその製薬上許容される塩に関する。
[式(I)において、R1は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、R2は、-R3、-C≡C-R3、-CH=CH-R3、及び-O-(CH2)n-R3からなる群から選択され、nは1〜6であり、R3は、水素原子、水酸基、C1−8アルキル基、-Si(R5)3、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、R1とR2は結合して環を形成し、-R1-R2-が、-(CH2)m-CH2-、-CH=CH-、-(CH2)m-O-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、mは1〜6であり、R4は、水素原子又はC1−6アルキル基である。R5は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、-Si(R5)3中の3つのR5はそれぞれ異なっていてもよい。]
[式(III)において、R21及びR23は、それぞれ独立して、水素原子、C1−6直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基であり、R22は、-R26、-C≡C-R26、-CH=CH-R26、及び-O-(CH2)n-R26からなる群から選択され、nは1〜6であり、R26は、水素原子、水酸基、C1−8アルキル基、-Si(R27)3、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、R21とR22は結合して環を形成し、-R21-R22-が、-(CH2)m-CH2-、-CH=CH-、-(CH2)m-O-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、mは1〜6であり、R27は水素原子、C1―6アルキル基、トリハロメチル基、又は水酸基であり、-Si(R27)3中の3つのR27はそれぞれ異なっていてもよい。R24、R25は、水素原子又はC1―6アルキル基である。]
で表される化合物又はその製薬上許容される塩である。
で表される化合物又はその製薬上許容される塩である。
で表される化合物又はその製薬上許容される塩である。
で表される化合物又はその製薬上許容される塩である。
本開示は、一又は複数の実施形態において、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる方法であって、前記一般式(I)又は(III)で表される化合物又はその製薬上許容される塩を前記生体又は細胞に投与することを含む方法に関する。前記生体又は細胞は、一又は複数の実施形態において、DYRK1Aタンパク質を発現する生体又は細胞である。
リン酸化酵素DYRK1Aは、ダウン症候群にて過剰産生が示され、この過剰産生がダウン症候群にて高確率に発症するアルツハイマー病の原因と考えられている。したがって、本開示は、一又は複数の実施形態において、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させるための化合物、その製薬上許容される塩、又はそれらを含む組成物を用いたアルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療の方法に関する。前記アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療の方法は、一又は複数の実施形態において、ダウン症候群において発症しうるアルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療の方法である。
[D1] 下記一般式(I)で表される化合物又はその製薬上許容される塩;
[式(I)において、R1は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、R2は、-R3、-C≡C-R3、-CH=CH-R3、及び-O-(CH2)n-R3からなる群から選択され、nは1〜6であり、R3は、水素原子、水酸基、C1−8アルキル基、-Si(R5)3、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、R1とR2は結合して環を形成し、-R1-R2-が、-(CH2)m-CH2-、-CH=CH-、-(CH2)m-O-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、mは1〜6であり、R4は、水素原子又はC1−6アルキル基である。R5は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、-Si(R5)3中の3つのR5はそれぞれ異なっていてもよい。]
[D2]
で表される化合物又はその製薬上許容される塩;
[D3] 生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させるための組成物であって、[D1]又は[D2]に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩を含む組成物;
[D4] 生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させるための[D1]又は[D2]に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩;
[D5] 生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる組成物を製造するための[D1]又は[D2]に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩の使用;
[D6] 生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる方法であって、
下記一般式(I)表される化合物又はその製薬上許容される塩を前記生体又は細胞に投与することを含む、方法;
[式(I)において、R1は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、R2は、-R3、-C≡C-R3、-CH=CH-R3、及び-O-(CH2)n-R3からなる群から選択され、nは1〜6であり、R3は、水素原子、水酸基、C1−8アルキル基、-Si(R5)3、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、R1とR2は結合して環を形成し、-R1-R2-が、-(CH2)m-CH2-、-CH=CH-、-(CH2)m-O-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、mは1〜6であり、R4は、水素原子又はC1−6アルキル基である。R5は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、-Si(R5)3中の3つのR5はそれぞれ異なっていてもよい。]
[D7] 生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる方法であって、
で表される化合物又はその製薬上許容される塩を前記生体又は細胞に投与することを含む、方法;
[D8] アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療のための医薬組成物であって、[D1]又は[D2]に記載の化合物又はその製薬上許容される塩を有効成分として含有する、医薬組成物;
[D9] アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療のための[D1]又は[D2]に記載の化合物又はその製薬上許容される塩;
[D10] アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療のための医薬組成物を製造するための[D1]又は[D2]に記載の化合物又はその製薬上許容される塩の使用;
[D11] アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療の方法であって、下記一般式(I)で表される化合物又はその製薬上許容される塩を対象に投与することを含む方法;
[式(I)において、R1は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、R2は、-R3、-C≡C-R3、-CH=CH-R3、及び-O-(CH2)n-R3からなる群から選択され、nは1〜6であり、R3は、水素原子、水酸基、C1−8アルキル基、-Si(R5)3、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、R1とR2は結合して環を形成し、-R1-R2-が、-(CH2)m-CH2-、-CH=CH-、-(CH2)m-O-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、mは1〜6であり、R4は、水素原子又はC1−6アルキル基である。R5は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、-Si(R5)3中の3つのR5はそれぞれ異なっていてもよい。]
[D12] アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療の方法であって、
で表される化合物又はその製薬上許容される塩を対象に投与することを含む方法;
[D13] アルツハイマー病が、ダウン症候群において発症しうるアルツハイマー病である、[D8]から[D12]のいずれかに記載の医薬組成物、塩、使用、又は方法。
[D’1] 下記一般式(III)で表される化合物又はその製薬上許容される塩;
[式(III)において、R21及びR23は、それぞれ独立して、水素原子、C1−6直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基であり、R22は、-R26、-C≡C-R26、-CH=CH-R26、及び-O-(CH2)n-R26からなる群から選択され、nは1〜6であり、R26は、水素原子、水酸基、C1−8アルキル基、-Si(R27)3、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、R21とR22は結合して環を形成し、-R21-R22-が、-(CH2)m-CH2-、-CH=CH-、-(CH2)m-O-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、mは1〜6であり、R27は水素原子、C1―6アルキル基、トリハロメチル基、又は水酸基であり、-Si(R27)3中の3つのR27はそれぞれ異なっていてもよい。R24、R25は、水素原子又はC1―6アルキル基である。]
[D’2]
で表される化合物又はその製薬上許容される塩;
[D’3] 生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させるための組成物であって、[D’1]又は[D’2]に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩を含む組成物;
[D’4] 生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させるための[D’1]又は[D’2]に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩;
[D’5] 生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる組成物を製造するための[D’1]又は[D’2]に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩の使用;
[D’6] 生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる方法であって、
下記一般式(III)で表される化合物又はその製薬上許容される塩を前記生体又は細胞に投与することを含む、方法;
[式(III)において、R21及びR23は、それぞれ独立して、水素原子、C1−6直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基であり、R22は、-R26、-C≡C-R26、-CH=CH-R26、及び-O-(CH2)n-R26からなる群から選択され、nは1〜6であり、R26は、水素原子、水酸基、C1−8アルキル基、-Si(R27)3、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、R21とR22は結合して環を形成し、-R21-R22-が、-(CH2)m-CH2-、-CH=CH-、-(CH2)m-O-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、mは1〜6であり、R27は水素原子、C1―6アルキル基、トリハロメチル基、又は水酸基であり、-Si(R27)3中の3つのR27はそれぞれ異なっていてもよい。R24、R25は、水素原子又はC1―6アルキル基である。]
[D’7] 生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる方法であって、
で表される化合物又はその製薬上許容される塩を前記生体又は細胞に投与することを含む、方法;
[D’8] アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療のための医薬組成物であって、[D’1]又は[D’2]に記載の化合物又はその製薬上許容される塩を有効成分として含有する、医薬組成物;
[D’9] アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療のための[D’1]又は[D’2]に記載の化合物又はその製薬上許容される塩;
[D’10] アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療のための医薬組成物を製造するための[D’1]又は[D’2]に記載の化合物又はその製薬上許容される塩の使用;
[D’11] アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療の方法であって、下記一般式(III)で表される化合物又はその製薬上許容される塩を対象に投与することを含む方法;
[式(III)において、R21及びR23は、それぞれ独立して、水素原子、C1−6直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基であり、R22は、-R26、-C≡C-R26、-CH=CH-R26、及び-O-(CH2)n-R26からなる群から選択され、nは1〜6であり、R26は、水素原子、水酸基、C1−8アルキル基、-Si(R27)3、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、R21とR22は結合して環を形成し、-R21-R22-が、-(CH2)m-CH2-、-CH=CH-、-(CH2)m-O-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、mは1〜6であり、R27は水素原子、C1―6アルキル基、トリハロメチル基、又は水酸基であり、-Si(R27)3中の3つのR27はそれぞれ異なっていてもよい。R24、R25は、水素原子又はC1―6アルキル基である。]
[D’12] アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療の方法であって、
で表される化合物又はその製薬上許容される塩を対象に投与することを含む方法;
[D’13] アルツハイマー病が、ダウン症候群において発症しうるアルツハイマー病である、[D’8]から[D’12]のいずれかに記載の医薬組成物、塩、使用、又は方法。
本開示は、一又は複数の実施形態において、下記一般式(II)で表される化合物又はその製薬上許容される塩に関する。
[式(II)において、R11は、ハロゲン原子、又はハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基であり、R12は、水素原子、C1−6アルキル基、又はハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基若しくは単環式複素芳香環基であり、R13は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、Qは、-C(O/S)-C=C-R14、-C(O/S)-NH-CH2-R14、-C(O/S)-NH-C(O/S)-R14、-C(O/S)-R14、及び、-SO2-R14からなる群から選択される基であり、R14は、C1−6アルキル基、C1−6アルコキシ基、水酸基若しくはハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基又は単環式複素芳香環基である。]
で表される化合物又はその製薬上許容される塩である。
本開示は、一又は複数の実施形態において、生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させる方法であって、前記一般式(II)で表される化合物又はその製薬上許容される塩を前記生体又は細胞に投与することを含む方法に関する。前記生体又は細胞は、一又は複数の実施形態において、TAUタンパク質を発現する生体又は細胞である。
微小管結合タンパク質TAUは、過剰リン酸化を受けることで不溶化・集積し、この過剰リン酸化タウの蓄積が神経変性疾患の発症原因と考えられている。遺伝子欠損マウスを用いた過去の解析により、TAU遺伝子を欠損させることでアルツハイマー病の発症を抑制出来ることが示されている。この結果は、TAU遺伝子産物(TAUタンパク質)を低減させれば、アルツハイマー病の発症を抑制出来ることを示唆している。また、TAUタンパク質の蓄積は、認知症の1つであるタウオパチーの原因とされている。したがって、本開示は、一又は複数の実施形態において、生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させるための化合物、その製薬上許容される塩、又はそれらを含む組成物を用いたアルツハイマー病及び又はタウオパチーの予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療の方法に関する。
[T1] 下記一般式(II)で表される化合物又はその製薬上許容される塩;
[式(II)において、R11は、ハロゲン原子、又はハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基であり、R12は、水素原子、C1−6アルキル基、又はハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基若しくは単環式複素芳香環基であり、R13は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、Qは、-C(O/S)-C=C-R14、-C(O/S)-NH-CH2-R14、-C(O/S)-NH-C(O/S)-R14、-C(O/S)-R14、及び、-SO2-R14からなる群から選択される基であり、R14は、C1−6アルキル基、C1−6アルコキシ基、水酸基若しくはハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基又は単環式複素芳香環基である。]
[T2]
で表される化合物又はその製薬上許容される塩;
[T3] 生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させるための組成物であって、[T1]又は[T2]に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩を含む組成物;
[T4] 生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させるための[T1]又は[T2]に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩;
[T5] 生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させる組成物を製造するための[T1]又は[T2]に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩の使用;
[T6] 生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させる方法であって、
下記一般式(II)表される化合物又はその製薬上許容される塩を前記生体又は細胞に投与することを含む、方法;
[式(II)において、R11は、ハロゲン原子、又はハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基であり、R12は、水素原子、C1−6アルキル基、又はハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基若しくは単環式複素芳香環基であり、R13は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、Qは、-C(O/S)-C=C-R14、-C(O/S)-NH-CH2-R14、-C(O/S)-NH-C(O/S)-R14、-C(O/S)-R14、及び、-SO2-R14からなる群から選択される基であり、R14は、C1−6アルキル基、C1−6アルコキシ基、水酸基若しくはハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基又は単環式複素芳香環基である。]
[T7] 生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させる方法であって、
で表される化合物又はその製薬上許容される塩を前記生体又は細胞に投与することを含む、方法;
[T8] アルツハイマー病及び又はタウオパチーの予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療のための医薬組成物であって、[T1]又は[T2]に記載の化合物又はその製薬上許容される塩を有効成分として含有する、医薬組成物;
[T9] アルツハイマー病及び又はタウオパチーの予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療のための[T1]又は[T2]に記載の化合物又はその製薬上許容される塩;
[T10] アルツハイマー病及び又はタウオパチーの予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療のための医薬組成物を製造するための[T1]又は[T2]に記載の化合物又はその製薬上許容される塩の使用;
[T11] アルツハイマー病及び又はタウオパチーの予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療の方法であって、下記一般式(II)で表される化合物又はその製薬上許容される塩を対象に投与することを含む方法;
[式(II)において、R11は、ハロゲン原子、又はハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基であり、R12は、水素原子、C1−6アルキル基、又はハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基若しくは単環式複素芳香環基であり、R13は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、Qは、-C(O/S)-C=C-R14、-C(O/S)-NH-CH2-R14、-C(O/S)-NH-C(O/S)-R14、-C(O/S)-R14、及び、-SO2-R14からなる群から選択される基であり、R14は、C1−6アルキル基、C1−6アルコキシ基、水酸基若しくはハロゲン原子で置換されていてもよいフェニル基又は単環式複素芳香環基である。]
[T12] アルツハイマー病及び又はタウオパチーの予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療の方法であって、
で表される化合物又はその製薬上許容される塩を対象に投与することを含む方法。
DYRK1Aの過剰発現が認められるダウン症患者及びモデルマウスでは血中ホモシステイン濃度が劇的に低下するが、この血中ホモシステイン濃度の低下は肝臓におけるDYRK1A過剰発現が原因であることが知られている(Noll et al, PLoS One. 2009)。また、DYRK1Aの阻害剤を生体(ラット)に投与すると、血中ホモシステイン濃度が向上するという知見が本発明者らによって得られた。したがって、本開示は、一又は複数の実施形態において、生体内でのDYRK1Aタンパク質活性の指標としての血中ホモシステイン濃度の使用に関する。また、本開示は、一又は複数の実施形態において、血中ホモシステイン濃度を使用した生体内でのDYRK1Aタンパク質活性のモニタリング方法に関する。本開示にかかる血中ホモシステイン濃度の使用、及び、本開示にかかるモニタリング方法によれば、例えば、血中ホモシステイン濃度を指標に、生きたまま生体内のDYRK1A活性阻害を同一個体でモニターすることが可能になる。また、本開示にかかる血中ホモシステイン濃度の使用、及び、本開示にかかるモニタリング方法は、一又は複数の実施形態において、DYRK1A活性阻害に関する開発候補化合物の投与量及び又は投与スケジュールを、モデル動物を生かしたまま検討することを可能とする。さらに、本開示にかかる血中ホモシステイン濃度の使用、及び、本開示にかかるモニタリング方法は、一又は複数の実施形態において、ヒトでの体内DYRK1A活性を間接的に測定することを可能とする。
〔標的タンパク質と内部標準タンパク質の同時発現系を持つアッセイ細胞の作成〕
図1のモデル図に示すような、FLAGタグ付きDYRK1AとEGFPの同時発現系(FLAG-DYRK1A-2A-EGFP)を持つアッセイ細胞を作製した。具体的には以下のように作製した。DYRK1AにはFLAGタグを融合させ(FLAG-DYRK1A)、さらに緑色蛍光タンパク質をコードするEGFP遺伝子と2Aペプチドを用いてin-frameに連結させた(FLAG-DYRK1A-2A-EGFP)。2Aペプチドは、バイシストロニック遺伝子発現を可能にするアミノ酸配列である。これによりFLAG-DYRK1A-2A-EGFPは一つのmRNA上から同時に翻訳される。前記遺伝子(FLAG-DYRK1A-2A-EGFP)を発現するベクターは以下のように作製した。すなわち、ベクターを構成する各DNA要素は、それぞれ別々のベクターからPCR法によりDNA断片として単離した。各断片をオーバーラップ伸長PCR法およびDNAライゲーション法を用いて順次繋ぎ合わせ、目的のベクターを構築した。ヒト胎児腎細胞由来HEK293細胞への導入には、リポフェクション法を用いた。また目的のベクターにはハイグロマイシン耐性遺伝子を組み込んでおり、ベクターの導入された細胞をハイグロマイシン存在下にて培養することにより、ベクターが染色体に安定に組み込まれた細胞のみを選択した。
FLAG-DYRK1A-2A-EGFPを発現させた培養細胞株(アッセイ細胞)をプレート上に培養し、培養液にテスト化合物を一定濃度にて加え、培養した。培養後、細胞を固定後、抗FLAGタグ抗体及び抗EGFP抗体を用いて蛍光細胞染色を行った。この染色を行った細胞サンプルを蛍光顕微鏡を搭載した解析装置により、抗FLAGタグ抗体の量と抗EGFP抗体の量をそれぞれ定量解析し、その比率を解析した。解析データの中から、テスト化合物非存在下と比較して比率を変動させるテスト化合物を候補化合物として選択した。その一例を図3に示す。図3は、テスト化合物(下記化合物1)が、内部標準のEGFPタンパク質量には影響を与えず、細胞内でFLAG-DYRK1Aのタンパク質量のみを低減させることを示すウエスタンブロット解析の一例である。
前記化合物1を以下のように製造した。
アルゴン雰囲気下、3-ブロモ-4-メトキシベンズアルデヒド(3-bromo-4-methoxybenzaldehyde)(5.00 g、23.3 mmol、商用品)、ジクロロビストリフェニルホスフィンパラジウム((Ph3P)2PdCl2)(816 mg、1.16 mmol、商用品)、ヨウ化銅(CuI)(133 mg、 0.70 mmol、商用品)のトリエチルアミン(Et3N)(100 mL)溶液に、トリメチルシリルアセチレン(trimethylsilylacetylene)(5.5 mL、40 mmol、商用品)を室温にて添加し、混合物を3時間加熱還流した。これに水を添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した(×3)。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル = 5/1)にて精製し、4-メトキシ-3-[2-(トリメチルシリル)エチニル]ベンズアルデヒド (4-methoxy-3-[2-(trimethylsilyl)ethynyl]benzaldehyde)(化合物A)(4.24 g、18.2 mmol、78.1%)を薄黄色の固体として得た。
TLC Rf 0.30 (n-hexane/ethyl acetate = 5/1)
mp 55-56 ℃
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 0.27 (s, 9H, Si(CH3)3), 3.96 (s, 3H, OCH3), 6.98 (d, J = 8.5 Hz, 1H, aromatic), 7.82 (d, J = 8.5 Hz, 1H, aromatic), 7.97 (s, 1H aromatic), 9.85 (s, 1H, CHO)
13C NMR (CDCl3, 126 MHz) δ −0.1, 56.3, 99.5, 100.1, 110.7, 113.3, 129.4, 131.8, 136.1, 164.7, 190.1
IR (cm-1) 762, 849, 1125, 1263, 1499, 1591, 1690, 2155, 2965
アルゴン雰囲気下、化合物A(2.01 g、8.62 mmol)、酢酸アンモニウム(NH4OAc)(331 mg、4.30 mmol、商用品)、ロダニン(rhodanine)(1.15 g、8.62 mmol、商用品)のアセトニトリル(MeCN)(50 mL)溶液に、酢酸(AcOH)(0.5 mL、8.62 mmol、商用品)を室温にて添加し、混合物を3時間加熱還流した。室温まで放冷した後、これに水(H2O)(10 mL)を添加し、析出した固体を桐山ロートで濾過後、ロート上で水(×3)、ジエチルエーテル(×2)で順次洗浄し、(Z)-5-(4-メトキシ-3-((トリメチルシリル)エチニル)ベンジリデン)-2-チオキソチアゾリジン-4-オン((Z)-5-(4-methoxy-3-((trimethylsilyl)ethynyl)benzylidene)-2-thioxothiazolidin-4-one)(化合物1)(2.64 g、7.60 mmol、88.2%)を黄色の固体として得た。
mp 215−216 ℃
1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 0.24 (s, 9H, Si(CH3)3), 3.90 (s, 3H, OCH3), 7.24 (d, J = 8.5 Hz, 1H, aromatic), 7.59-7.64 (m, 3H, aromatic and olefinic), 13.81 (brs, 1H, NH)
13C NMR (DMSO-d6, 126 MHz) δ−0.1, 56.3, 99.3, 100.4, 112.3, 112.5, 123.5, 125.5, 130.8, 132.7, 136.1, 161.6, 169.4, 195.3
IR (cm-1) 849, 1275, 1433, 1499, 1586, 1692, 2839, 2895, 2943, 2970, 3038, 3057, 3152
〔標的タンパク質と内部標準タンパク質の同時発現系を持つアッセイ細胞の作成〕
図5のモデル図に示すような、EGFP融合TAUとmCherryの同時発現系(mCherry-2A-EGFP-TAU)を持つアッセイ細胞を作製した。具体的には以下のように作製した。TAUにはEGFPを融合させ(EGFP-TAU)、さらに赤色蛍光タンパク質をコードするmCherry遺伝子と2Aペプチドを用いてin-frameに連結させた(mCherry-2A-EGFP-TAU)。2Aペプチドは、バイシストロニック遺伝子発現を可能にするアミノ酸配列である。これによりmCherry-2A-EGFP-TAUは一つのmRNA上から同時に翻訳される。前記遺伝子(mCherry-2A-EGFP-TAU)を発現するベクターは以下のように作製した。すなわち、ベクターを構成する各DNA要素は、それぞれ別々のベクターからPCR法によりDNA断片として単離した。各断片をオーバーラップ伸長PCR法およびDNAライゲーション法を用いて順次繋ぎ合わせ、目的のベクターを構築した。ヒト胎児腎細胞由来HEK293細胞への導入には、リポフェクション法を用いた。また目的のベクターにはハイグロマイシン耐性遺伝子を組み込んでおり、ベクターの導入された細胞をハイグロマイシン存在下にて培養することにより、ベクターが染色体に安定に組み込まれた細胞のみを選択した。
mCherry-2A-EGFP-TAUを発現させた培養細胞株(アッセイ細胞)をプレート上に培養し、培養液にテスト化合物を一定濃度にて加え、培養した。培養後、細胞を蛍光顕微鏡を搭載した解析装置により、EGFP量とmCherry量をそれぞれ定量解析し、その比率を解析した。解析データの中から、テスト化合物非存在下と比較して比率を変動させるテスト化合物を候補化合物として選択した。その一例を図6に示す。図6は、テスト化合物(下記化合物2)が、内部標準のmCherryタンパク質量には影響を与えず、細胞内でEGFP-TAUタンパク質のみを低減させることを示すウエスタンブロット解析の一例である。
前記化合物2を以下のように製造した。
1,4-ジフルオロ-2-ニトロベンゼン(1,4-difluoro-2-nitrobenzene)(2.00 g、12.6 mmol、商用品)のN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)(20 mL)溶液に、1-フェニルピペラジン(1-phenylpiperazine)(6.11 g、37.7 mmol、商用品)を室温にて添加し、混合物を13時間撹拌した。これに水を添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した(×3)。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル = 7/1)にて精製し、1-(4-フルオロ-2-ニトロフェニル)-4-フェニルピペラジン(1-(4-fluoro-2-nitrophenyl)-4-phenylpiperazine)(化合物B)(3.82 g、12.6 mmol、quant.)をオレンジ色の油状物質として得た。
TLC Rf 0.30 (n-hexane/ethyl acetate = 7/1)。
化合物B(3.82 g、12.6 mmol)のエタノール(40mL)溶液に、濃塩酸(6.86 mL、82.4 mmol)及び無水二塩化スズ(7.21 g、38.0 mmol)を0℃にて順次添加し、混合物を室温に戻し、2時間撹拌した。これに炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液を添加し、混合物を酢酸エチル(×3)で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n−ヘキサン/酢酸エチル= 19/1)にて精製し、2-(4-フェニル-1-ピペラジニル)-5-フルオロアニリン(2-(4-phenyl-1-piperazinyl)-5-fluoroaniline)(化合物C)(<3.69 g、<13.6 mmol、quant.)を無色の油状物質として得た。
TLC Rf 0.33 (n-hexane/ethyl acetate = 5/1)
mp 161-163 ℃
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ3.02 (t, J = 4.5 Hz, 4H, 2CH2), 3.20-3.45 (br, 4H, 2CH2), 4.16 (s, 2H, NH2), 6.42 (dd, J = 2.5, 8.5 Hz, 1H, aromatic), 6.45 (dd, J = 2.5, 10.5 Hz, 1H, aromatic), 6.89 (t, J = 7.5 Hz, 1H, aromatic), 6.96-7.02 (m, 3H, aromatic), 7.28-7.32 (m, 2H, aromatic)
13C NMR (CDCl3, 126 MHz) δ50.3, 51.8, 101.0 (d, J = 26.5 Hz), 104.5 (d, J = 22.7 Hz), 116.5 (d, J = 31.5 Hz), 120.1, 121.2 (d, J = 10.1 Hz), 129.4 (d, J = 3.8 Hz), 135.2 (d, J = 2.5 Hz), 143.4 (d, J = 11.3 Hz), 151.5, 160.7 (d, J = 241 Hz)
19F NMR (CDCl3, 376 MHz) δ-113.5 − -113.4 (m)
IR (cm-1) 546, 698, 768, 802, 837, 935, 972, 1142, 1159, 1175, 1207, 1229, 1260, 1290, 1310, 1377, 1450, 1493, 1504, 1576, 1599, 1612, 2835, 3354, 3453
化合物C(500 mg、1.84 mmol)のジクロロメタン(15 mL)溶液に、イソニコチン酸クロリド塩酸塩(980 mg、5.52 mmol、商用品)及びトリエチルアミン(1.15 mL、8.29 mmol)を0℃にて順次添加し、混合物を室温に戻し、13時間撹拌した。これに水を添加し、混合物を酢酸エチル(×3)で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n−ヘキサン/酢酸エチル=2/1)にて精製し、N-[5-フルオロ-2-(4-フェニル-1-ピペラジニル)フェニル]イソニコチン酸アミド(N-[5-fluoro-2-(4-phenyl-1-piperazinyl)phenyl]isonicotinamide)(化合物D)(556 mg、1.48 mmol、80.4%)を無色の固体として得た。
TLC Rf 0.47 (n-hexane/ethyl acetate = 1/1)
mp 203-204 ℃
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ3.08 (t, J = 4.5 Hz, 4H, 2CH2), 3.20-3.54 (br, 4H, 2CH2), 6.86 (ddd, J = 3.0, 8.5, 8.5 Hz, 1H, aromatic), 6.94 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 7.01 (dd, J = 1.0, 9.0 Hz, 2H, aromatic), 7.27 (dd, J = 5.5, 8.5 Hz, 1H, aromatic), 7.31-7.36 (m, 2H, aromatic), 7.74 (AA’BB’, 2H, aromatic), 8.39 (dd, 1H, J = 3.0, 10.5 Hz, 1H, aromatic), 8.83 (AA’BB’, 2H, aromatic), 9.76 (s, 1H, NH)
13C NMR (CDCl3, 126 MHz) δ50.6, 53.1, 107.3 (d, J = 29.0 Hz), 111.1 (d, J = 22.7 Hz), 116.5, 120.7, 120.8, 122.5 (d, J = 10.1 Hz), 129.5, 134.7 (d, J = 12.6 Hz), 137.3 (d, J = 3.8 Hz), 141.8, 151.1, 151.2 160.6 (d, J = 244 Hz), 162.9
19F NMR (CDCl3, 376 MHz) δ-118.2 − -118.1 (m)
IR (cm-1) 692, 748, 768, 939, 1140, 1159, 1231, 1269, 1377, 1445, 1495, 1533, 1557, 1605, 1678, 2828, 3273
化合物D(183 mg、0.486 mmol)のトルエン(30 mL)溶液に、Lawesson’s試薬(294 mg、0.729 mmol、商用品)を添加し、混合物を130℃にて20時間還流攪拌した。室温に戻した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(n−ヘキサン/酢酸エチル=2/1)にて精製し、N-[5-フルオロ-2-(4-フェニル-1-ピペラジニル)フェニル]イソニコチン酸チオアミド(N-[5-fluoro-2-(4-phenyl-1-piperazinyl)phenyl]isonicotinthioamide)(化合物2)(122 mg、0.311 mmol、64.0%)を黄色の固体として得た。
TLC Rf 0.50 (n-hexane/ethyl acetate = 1/1)
mp 183-186 ℃
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ3.08 (t, J = 4.5 Hz, 4H, 2CH2), 3.20-3.40 (br, 4H, 2CH2), 6.91-7.03 (m, 4H, aromatic), 7.27-7.34 (m, 3H, aromatic), 7.71 (d, J = 5.5 Hz, 2H, aromatic), 8.73 (d, J = 5.5 Hz, 2H, aromatic), 9.28 (d, 11.5 Hz, 1H, aromatic), 11.0 (s, 1H, NH)
13C NMR (CDCl3, 126 MHz) δ50.3, 53.0, 107.5 (d, J = 30.2 Hz), 112.9 (d, J = 22.7 Hz), 116.4, 120.1, 120.7, 122.3 (d, J = 8.8 Hz), 129.3, 135.7 (d, J = 11.3 Hz), 138.8 (d, J = 2.5 Hz), 149.3, 150.6, 150.7, 159.6 (d, J = 244 Hz), 192.2
19F NMR (CDCl3, 376 MHz) δ-112.4 − -112.6 (m)
IR (cm-1) 733, 760, 818, 937, 1155, 1229, 1263, 1314, 1364, 1377, 1410, 1449, 1495, 1518, 1599, 2826
DYRK1A阻害剤Harmineをラットへ経口投与し、投与後の血中ホモシステイン濃度を測定した。具体的な条件は以下のとおりとし、その結果を図7に示す。
〔アッセイ細胞を用いた化合物スクリーニング〕
FLAGx3-DYRK1A-2A-HAx3-EGFPを発現させた培養細胞株(アッセイ細胞)をプレート上に培養し、培養液にテスト化合物を一定濃度にて加え、培養した。培養後、ウエスタンブロット法により、FLAGx3-DYRK1A量とHAx3-EGFP量、GAPDH量をそれぞれ定量解析し、その比率を解析した。解析データの中から、テスト化合物非存在下と比較して比率を変動させるテスト化合物を候補化合物として選択した。その一例を図8に示す。図8は、テスト化合物(化合物3、4及び5)が、細胞内でFLAGx3-DYRK1Aタンパク質を低減させることを示すウエスタンブロット解析の一例である。図8に示すように、化合物3、4及び5は、4μMの濃度で細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減できうることがわかった。
下記化合物3を以下のように製造した。
アルゴン雰囲気下、3-ブロモ-4-メトキシベンズアルデヒド(3-bromo-4-methoxybenzaldehyde)(215 mg、1.00 mmol、商用品)、ジクロロビストリフェニルホスフィンパラジウム((Ph3P)2PdCl2)(35.1 mg、50.0 μmol、商用品)、ヨウ化銅(CuI)(5.7 mg、30.0 μmol、商用品)のトリエチルアミン(Et3N)(2 mL)溶液に、シクロヘキシルアセチレン(cyclohexylacetylene)(260 μL、2.00 mmol、商用品)を室温にて添加し、混合物を8時間加熱還流した。これに水を添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した(×3)。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル = 5/1)にて精製し、3-(シクロヘキシルエチニル)-4-メトキシベンズアルデヒド (3-(cyclohexylethynyl)-4-methoxybenzaldehyde)(化合物E)(211 mg、870 μmol、87.0%)を茶色の油状物質として得た。
TLC Rf 0.25 (n-hexane/ethyl acetate = 5/1)
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 1.32−1.41 (m, 3H, cyclohexyl), 1.50−1.62 (m, 3H, cyclohexyl), 1.73−1.80 (m, 2H, cyclohexyl), 1.89−1.91 (m, 2H, cyclohexyl), 2.63−2.68 (m, 1H, CH), 3.95 (s, 3H, OCH3), 6.96 (d, J = 8.5 Hz, 1H, aromatic), 7.77 (dd, J = 2.5, 8.5 Hz, 1H, aromatic), 7.90 (d, J = 2.5 Hz, 1H, aromatic), 9.84 (s, 1H, CHO)
13C NMR (CDCl3, 126 MHz) δ 24.8, 25.9, 29.9, 32.6, 56.2, 75.3, 100.1, 110.5, 114.3, 129.5, 130.9, 135.5, 164.4, 190.4
IR (cm-1) 768, 816, 1020, 1593, 1697, 2228, 2853, 2930, 3503
アルゴン雰囲気下、化合物E(242 mg、1.00 mmol)、酢酸アンモニウム(NH4OAc)(38.5 mg、500 μmol、商用品)、ロダニン(rhodanine)(133 mg、1.00 mmol、商用品)のアセトニトリル(MeCN)(2 mL)溶液に、酢酸(AcOH)(57 μL、1.00 mmol、商用品)を室温にて添加し、混合物を2時間加熱還流した。室温まで放冷した後、これに水(H2O)(1 mL)を添加し、析出した固体を桐山ロートで濾過後、ロート上で水(×3)、ジエチルエーテル(×2)で順次洗浄し、(Z)-5-(3-(シクロヘキシルエチニル)-4-メトキシベンジリデン)-2-チオキソチアゾリジン-4-オン((Z)-5-(3-(cyclohexylethynyl)-4-methoxybenzylidene)-2-thioxothiazolidin-4-one)(化合物3)(207 mg、579 μmol、57.9%)を黄色の固体として得た。
mp 185-186 ℃
1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 1.34−1.36 (m, 3H, cyclohexyl), 1.46−1.50 (m, 3H, cyclohexyl), 1.68−1.71 (m, 2H, cyclohexyl), 1.79−1.81 (m, 2H, cyclohexyl), 2.65−2.69 (m, 1H, CH), 3.87 (s, 3H, OCH3), 7.20 (d, J = 9.5 Hz, 1H, aromatic), 7.53−7.58 (m, 3H, aromatic and olefinic), 13.79 (brs, 1H, NH)
13C NMR (DMSO-d6, 126 MHz) δ 24.6, 25.8, 29.4, 32.5, 56.6, 76.4, 99.8, 112.7, 113.9, 123.5, 125.8, 131.5, 132.3, 135.8, 161.7, 169.8, 195.8
IR (cm-1), 675, 1148, 1586, 1695, 2849, 2899, 2926, 3036, 3050, 3146
下記化合物4を以下のように製造した。
アルゴン雰囲気下、3-ヨード-4-メトキシベンズアルデヒド(3-iodo-4-methoxybenzaldehyde)(262 mg、1.00 mmol、商用品)、ジクロロビストリフェニルホスフィンパラジウム((Ph3P)2PdCl2)(35.1 mg、50.0 μmol、商用品)、ヨウ化銅(CuI)(5.7 mg、30 μmol、商用品)のトリエチルアミン(Et3N)(2 mL)溶液に、1-エチニルアダマンタン(1-ethynyladamantane)(192 mg、1.20 mmol、商用品)を室温にて添加し、混合物を10時間加熱還流した。これに水を添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した(×3)。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル = 5/1)にて精製し、3-(1-アダマンチルエチニル)-4-メトキシベンズアルデヒド (3-(1-adamantylethynyl)-4-methoxybenzaldehyde)(化合物F)(172 mg、584 μmol、58.4%)を茶色の固体として得た。
mp 86−87 ℃
TLC Rf 0.35 (n-hexane/ethyl acetate = 5/1)
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 1.72 (brs, 6H, adamantyl), 1.98 (brs, 9H, adamantyl), 3.93 (s, 3H, OCH3), 6.93 (d, J = 8.5 Hz, 1H, aromatic), 7.75 (dd, J = 2.0, 8.5 Hz, 1H, aromatic), 7.88 (d, J = 2.0 Hz, 1H, aromatic), 9.83 (s, 1H, CHO)
13C NMR (CDCl3, 126 MHz) δ 27.9, 30.3, 36.3, 42.7, 56.2, 74.0, 104.0, 110.5, 114.2, 129.4, 130.8, 135.5, 164.3, 190.4
IR (cm-1) 814, 1138, 1271, 1501, 1684, 2359, 2849, 2903
アルゴン雰囲気下、化合物F(172 mg、580 μmol)、酢酸アンモニウム(NH4OAc)(22.4 mg、290 μmol、商用品)、ロダニン(rhodanine)(77.3 mg、580 μmol、商用品)のアセトニトリル(MeCN)(2 mL)溶液に、酢酸(AcOH)(33 μL、580 μmol、商用品)を室温にて添加し、混合物を3時間加熱還流した。室温まで放冷した後、これに水(H2O)(1 mL)を添加し、析出した固体を桐山ロートで濾過後、ロート上で水(×3)、ジエチルエーテル(×2)で順次洗浄し、(Z)-5-(3-(2-アダマンチルエチニル)-4-メトキシベンジリデン)-2-チオキソチアゾリジン-4-オン((Z)-5-(3-(2-adamantylethynyl)-4-methoxybenzylidene)-2-thioxothiazolidin-4-one)(化合物4)(148 mg、361 μmol、62.2%)を黄色の固体として得た。
mp 266-267 ℃
1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 1.68 (brs, 6H, adamantyl), 1.90 (brs, 6H, adamantyl), 1.95 (brs, 3H, adamantyl), 3.86 (s, 3H, OCH3), 7.18 (d, J = 8.5 Hz, 1H, aromatic), 7.50 (s, 1H, aromatic), 7.53 (d, J = 8.5 Hz, 1H, aromatic), 7.57 (s, 1H, olefinic), 13.78 (brs, 1H, CHO)
13C NMR (DMSO-d6, 126 MHz) δ 27.3, 29.9, 35.7, 42.3, 56.2, 74.6, 103.1, 112.3, 113.4, 123.0, 125.4, 131.1, 131.8, 135.4, 161.1, 169.3, 195.3
IR (cm-1) 667, 801, 1190, 1425, 1501, 1589, 1703, 2847, 2903, 2928, 3061, 3069, 3154
下記化合物5を以下のように製造した。
アルゴン雰囲気下、3-ブロモ-4-メトキシベンズアルデヒド(3-bromo-4-methoxybenzaldehyde)(215 mg、1.00 mmol、商用品)、m-methylphenyl boronic acid(163 mg、1.20 mmol)、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(Pd(PPh3)4)(57.8 mg、50.0 μmol、商用品)、炭酸ナトリウム一水和物(Na2CO3・H2O)(248 mg、2.00 mmol、商用品)の1,4-ジオキサン(1,4-dioxane)(15 mL)溶液に、水(H2O)(2 mL)を室温にて添加し、混合物を7.5時間加熱還流した。これに水を添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した(×3)。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル = 5/1)にて精製し、3-(3’-メチルフェニル)-4-メトキシベンズアルデヒド (3-(3’-methylphenyl)-4-methoxybenzaldehyde)(化合物G)(224 mg、990 μmol、99.0%)を薄黄色の油状物質として得た。
TLC Rf 0.30 (n-hexane/ethyl acetate = 5/1)
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ 2.43 (s, 3H, CH3), 3.91 (s, 3H, OCH3), 7.10 (d, J = 9.0 Hz, 1H, aromatic), 7.19−7.21 (m, 1H, aromatic), 7.34−7.52 (m, 3H, aromatic), 7.86−7.89 (m, 2H, aromatic), 9.94 (s, 1H, CHO)
13C NMR (CDCl3, 126 MHz) δ 21.4, 55.8, 110.9, 126.5, 127.9, 128.3, 129.7, 130.0, 131.2, 131.4, 132.2, 136.9, 137.7, 161.4, 190.9
IR (cm-1) 702, 791, 1022, 1202, 1370, 1499, 1595, 1686, 2837, 2943
アルゴン雰囲気下、化合物G(226 mg、1.00 mmol)、酢酸アンモニウム(NH4OAc)(38.5 mg、500 μmol、商用品)、ロダニン(rhodanine)(133 mg、1.00 mmol、商用品)のアセトニトリル(MeCN)(2 mL)溶液に、酢酸(AcOH)(57 μL、1.0 mmol、商用品)を室温にて添加し、混合物を3時間加熱還流した。室温まで放冷した後、これに水(H2O)(1 mL)を添加し、析出した固体を桐山ロートで濾過後、ロート上で水(×3)、ジエチルエーテル(×2)で順次洗浄し、(Z)-5-(3-(3’-メチルフェニル))-4-メトキシベンジリデン)-2-チオキソチアゾリジン-4-オン((Z)-5-(3-(3’-methylphenyl))-4-methoxybenzylidene)-2-thioxothiazolidin-4-one)(化合物5)(311 mg、911 μmol、91.1%)を橙色の固体として得た。
mp 204−205 ℃
1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 2.33 (s, 3H, CH3), 3.93 (s, 3H, OCH3), 7.23−7.27 (m, 3H, aromatic), 7.43 (s, 1H, aromatic), 7.44 (s, 1H, aromatic), 7.57−7.69 (m, 2H, aromatic), 7.70 (s, 1H, olefinic), 13.80 (brs, 1H, NH)
13C NMR (DMSO-d6, 126 MHz) δ 21.1, 56.3, 84.3, 94.1, 99.5, 112.4, 112.6, 119.2, 125.8, 129.4 (2C), 131.3 (2C), 132.5, 135.2, 138.7, 161.0, 196.1
IR (cm-1) 679, 1018, 1200, 1582, 1701, 2839, 2909, 2943, 2963, 3017, 3036, 3050, 3148
〔アッセイ細胞を用いた化合物スクリーニング〕
FLAGx3-DYRK1A-2A-HAx3-EGFPを発現させた培養細胞株(アッセイ細胞)をプレート上に培養し、培養液にテスト化合物を一定濃度にて加え、培養した。培養後、ウエスタンブロット法により、FLAGx3-DYRK1A量とHAx3-EGFP量、GAPDH量をそれぞれ定量解析し、その比率を解析した。解析データの中から、テスト化合物非存在下と比較して比率を変動させるテスト化合物を候補化合物として選択した。その一例を図9及び図10に示す。図9は、テスト化合物(化合物6)が、細胞内でFLAGx3-DYRK1Aタンパク質を低減させることを示すウエスタンブロット解析の一例である。また、図10左図は、テスト化合物(化合物7)が、内部標準のEGFPタンパク質量には影響を与えず、細胞内でFLAGx3-DYRK1Aタンパク質のみを低減させることを示すウエスタンブロット解析の一例である。図10右図は、テスト化合物(化合物8)が、内部標準のEGFPタンパク質量には影響を与えず、細胞内でFLAGx3-DYRK1Aタンパク質のみを増加させることを示すウエスタンブロット解析の一例である。
下記化合物6を以下のように製造した。
アルゴン雰囲気下、3-ブロモ-4-メトキシベンズアルデヒド(3-bromo-4-methoxybenzaldehyde)(215 mg、1.00 mmol、商用品)、3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニルボロン酸(3,5-bis(trifluoromethyl)phenylboronic acid)(310 mg、1.20 mmol、商用品)、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(Pd(PPh3)4)(57.8 mg、50.0 μmol、商用品)、炭酸ナトリウム一水和物(Na2CO3?H2O)(248 mg、2.00 mmol、商用品)の1,4-ジオキサン(1,4-dioxane)(15 mL)溶液に、水(H2O)(2 mL)を室温にて添加し、混合物を22時間加熱還流した。これに水を添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した(×3)。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過後、減圧濃縮し、3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニル)-4-メトキシベンズアルデヒド(3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl-4-methoxybenzaldehyde)(化合物H)を茶色の油状物質として得た。これを未精製のまま、次の反応に用いた。
アルゴン雰囲気下、化合物H(3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl-4-methoxybenzaldehyde)(<1 mmol)、酢酸アンモニウム(NH4OAc)(38.5 mg、0.500 mmol、商用品)、ロダニン(rhodanine)(133 mg、1.00 mmol、商用品)のアセトニトリル(MeCN)(2 mL)溶液に、酢酸(AcOH)(57 μL、1.0 mmol、商用品)を室温にて添加し、混合物を3時間加熱還流した。室温まで放冷した後、これに水(H2O)(10 mL)を添加し、析出した結晶を桐山ロートで濾過、水(×3)、ジエチルエーテル(×2)で洗浄し、(Z)-5-(3,5-ビス(トリフルオロメチル)-4-メトキシベンジリデン)-2-チオキソチアゾリジン-4-オン((Z)-5-(3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl-4-methoxybenzylidene)-2-thioxothiazolidin-4-one)(化合物6)(236 mg、0.509 mmol、50.9%)を黄色の固体として得た。
mp 244-245 ℃
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 3.92 (s, 3H, OCH3), 7.14 (d, J = 8.8 Hz, 1H, aromatic), 7.44 (d, J = 2.4 Hz, 1H, olefinic), 7.56 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H, aromatic), 7.66 (s, 1H, aromatic), 7.89 (s, 1H, aromatic), 7.95 (s, 2H, aromatic), 9.41 (brs, 1H, NH)
IR (cm-1) 686, 808, 1154, 1436, 1594, 1699, 3191, 3445
下記化合物7を以下のように製造した。
アルゴン雰囲気下、3-ブロモ-4-メトキシベンズアルデヒド(3-bromo-4-methoxybenzaldehyde)(215 mg、1.00 mmol、商用品)、3-(トリフルオロメチル)フェニルボロン酸(3-(trifluoromethyl)phenylboronic acid)(228 mg、1.20 mmol、商用品)、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(Pd(PPh3)4)(57.8 mg、50.0 μmol、商用品)、炭酸ナトリウム一水和物(Na2CO3?H2O)(248 mg、2.00 mmol、商用品)の1,4-ジオキサン(1,4-dioxane)(15 mL)溶液に、水(H2O)(2 mL)を室温にて添加し、混合物を22時間加熱還流した。これに水を添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した(×3)。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過後、減圧濃縮し、(3-(トリフルオロメチル)フェニル)-4-メトキシベンズアルデヒド (3-(trifluoromethyl)phenyl-4-methoxybenzaldehyde)(化合物I)を黄色の油状物質として得た。これを未精製のまま、次の反応に用いた。
アルゴン雰囲気下、化合物I(3-(trifluoromethyl)phenyl-4-methoxybenzaldehyde)(<1 mmol)、酢酸アンモニウム(NH4OAc)(38.5 mg、0.500 mmol、商用品)、ロダニン(rhodanine)(133 mg、1.00 mmol、商用品)のアセトニトリル(MeCN)(2 mL)溶液に、酢酸(AcOH)(57 μL、1.0 mmol、商用品)を室温にて添加し、混合物を3時間加熱還流した。室温まで放冷した後、これに水(H2O)(10 mL)を添加し、析出した結晶を桐山ロートで濾過、水(×3)、ジエチルエーテル(×2)で洗浄し、(Z)-5-(3-(トリフルオロメチル)-4-メトキシベンジリデン)-2-チオキソチアゾリジン-4-オン((Z)-5-(3-(trifluoromethyl)phenyl-4-methoxybenzylidene)-2-thioxothiazolidin-4-one)(化合物7)(127 mg、0.321 mmol、32.1%)を黄色の固体として得た。
mp 209−210 ℃
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 3.91 (s, 3H, OCH3), 7.11 (d, J = 8.4 Hz, 1H, aromatic), 7.44 (d, J = 2.0 Hz, 1H, olefinic), 7.52 (dd, J = 8.4, 2.0 Hz, 1H, aromatic), 7.58 (d, J = 7.6 Hz, 1H, aromatic), 7.69-7.63 (m, 3H, aromatic), 7.78 (s, 2H, aromatic), 9.22 (brs, 1H, NH)
IR (cm-1) 555, 696, 806, 1023, 1272, 1339, 1570, 1689, 3049, 3153
下記化合物8を以下のように製造した。
アルゴン雰囲気下、3-ブロモ-4-メトキシベンズアルデヒド(3-bromo-4-methoxybenzaldehyde)(215 mg、1.00 mmol、商用品)、3,5-ジメチルフェニルボロン酸(3,5-dimethylphenylboronic acid)(228 mg、1.20 mmol、商用品)、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(Pd(PPh3)4)(57.8 mg、50.0 μmol、商用品)、炭酸ナトリウム一水和物(Na2CO3・H2O)(248 mg、2.00 mmol、商用品)の1,4-ジオキサン(1,4-dioxane)(15 mL)溶液に、水(H2O)(2 mL)を室温にて添加し、混合物を22時間加熱還流した。これに水を添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した(×3)。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過後、減圧濃縮し、3,5-ジメチルフェニル)-4-メトキシベンズアルデヒド(3-(trifluoromethyl)phenyl-4-methoxybenzaldehyde)(化合物J)を黄色の油状物質として得た。これを未精製のまま、次の反応に用いた。
アルゴン雰囲気下、化合物J(3,5-dimethylphenyl-4-methoxybenzaldehyde)(<1 mmol)、酢酸アンモニウム(NH4OAc)(38.5 mg、0.500 mmol、商用品)、ロダニン(rhodanine)(133 mg、1.00 mmol、商用品)のアセトニトリル(MeCN)(2 mL)溶液に、酢酸(AcOH)(57 μL、1.0 mmol、商用品)を室温にて添加し、混合物を3時間加熱還流した。室温まで放冷した後、これに水(H2O)(10 mL)を添加し、析出した結晶を桐山ロートで濾過、水(×3)、ジエチルエーテル(×2)で洗浄し、(Z)-5-(3-(トリフルオロメチル)-4-メトキシベンジリデン)-2-チオキソチアゾリジン-4-オン((Z)-5-(3,5-dimethylphenyl-4-methoxybenzylidene)-2-thioxothiazolidin-4-one)(化合物8)(309 mg、0.870 mmol、87.0%)を黄色の固体として得た。
mp 238−239 ℃
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ2.38 (s, 6H, CH3), 3.89 (s, 3H, OCH3), 7.03 (s, 1H, aromatic), 7.07 (d, J = 8.4 Hz, 1H, aromatic), 7.10 (s, 1H, aromatic), 7.42 (d, J = 2.4 Hz, 1H, olefinic), 7.47 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H, aromatic), 7.67 (s, 1H, aromatic), 9.30 (brs, 1H, NH)
IR (cm−1) 701, 801, 849, 1025, 1286, 1397, 1568, 1686, 2870, 3047, 3143
〔アッセイ細胞を用いた化合物スクリーニング〕
FLAGx3-DYRK1A-2A-HAx3-EGFPを発現させた培養細胞株(アッセイ細胞)をプレート上に培養し、培養液にテスト化合物を一定濃度にて加え、培養した。培養後、ウエスタンブロット法により、FLAGx3-DYRK1A量とHAx3-EGFP量、GAPDH量をそれぞれ定量解析し、その比率を解析した。解析データの中から、テスト化合物非存在下と比較して比率を変動させるテスト化合物を候補化合物として選択した。その一例を図11及び図12に示す。図11は、テスト化合物(化合物9)が、内部標準のEGFPタンパク質量には影響を与えず、細胞内でFLAGx3-DYRK1Aタンパク質のみを低減させることを示すウエスタンブロット解析の一例である。図12は、テスト化合物(化合物10)が、細胞内でFLAGx3-DYRK1Aタンパク質を低減させることを示すウエスタンブロット解析の一例である。
下記化合物9を以下のように製造した。
アルゴン雰囲気下、8-ヨードハルミン(8-iodoharmine)(67.6 mg、0.200 mmol、合成品(US2007027199A1))、ジクロロビストリフェニルホスフィンパラジウム((PPh3)2PdCl2)(7.0 mg、10 μmol、商用品)、ヨウ化銅(CuI)(3.8 mg、20 μmol、商用品)、トリフェニルホスフィン(PPh3)(5.2 mg、20 μmol、商用品)のトルエン(toluene)(脱水、2.0 mL)、トリエチルアミン(Et3N)(2.0 mL)溶液に、トリメチルシリルアセチレン(trimethylsilylacetylene)(55 μL、0.40 mmol、商用品)を室温にて添加し、混合物を60℃で4時間加熱撹拌した。室温まで放冷した後、これに飽和塩化アンモニウム水溶液を添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した(×3)。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル)にて精製し、(8-[2-(トリメチルシリル)エチニル]ハルミン (8-[2-(trimethylsilyl)ethynyl]harmine)(化合物9)(35.8 mg、0.116 mmol、58.0%)を無色の固体として得た。
TLC Rf 0.40 (ethyl acetate)。
mp 185−186 ℃
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ0.37 (s, 9H, Si(CH3)3), 2.83 (s, 3H, CH3), 4.02 (s, 3H, OCH3), 6.87 (d, J = 8.5 Hz, 1H, aromatic), 7.70 (d, J = 5.0 Hz, 1H, aromatic), 7.98 (d, J = 8.5 Hz, 1H, aromatic), 8.12 (brs, 1H, NH), 8.35 (brs, 1H, aromatic)
13C NMR (CDCl3, 126 MHz) δ0.3(3C), 20.2, 56.6, 94.8, 96.9, 104.3, 104.7, 112.4, 115.8, 123.2, 128.9, 134.4, 139.5, 141.3, 142.9, 161.0
IR (cm-1) 775, 945, 1099, 1339, 1450, 1614, 2146, 2767, 2861, 2977
下記化合物10を以下のように製造した。
アルゴン雰囲気下、8-ヨードハルミン(8-iodoharmine)(33.8 mg、0.100 mmol、合成品(US2007027199A1))、ジクロロビストリフェニルホスフィンパラジウム((PPh3)2PdCl2)(3.5 mg、5.0 μmol、商用品)、ヨウ化銅(CuI)(1.9 mg、10 μmol、商用品)、トリフェニルホスフィン(PPh3)(2.6 mg、10 μmol、商用品)のトルエン(toluene)(脱水、1.0 mL)、トリエチルアミン(Et3N)(1.0 mL)溶液に、シクロヘキシルアセチレン(cyclohexylacetylene)(26 μL、0.20 mmol、商用品)を室温にて添加し、混合物を60℃で11時間加熱撹拌した。室温まで放冷した後、これに飽和塩化アンモニウム水溶液を添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した(×3)。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル)にて精製し、(8-[2-(シクロヘキシル)エチニル]ハルミン (8-[2-(cyclohexyl)ethynyl]harmine)(化合物10)(30.3 mg、95.2 μmol、95.2%)を無色の固体として得た。
TLC Rf 0.30 (ethyl acetate)。
mp 198−199 ℃
1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δ1.68 (brs, 4H, -CH2-×2), 1.44 (brs, 2H, -CH2-), 1.84 (brs, 2H, -CH2-), 2.00 (brs, 2H, -CH2-), 2.85-2.80 (m, 1H, -CH-), 2.82 (s, 3H, CH3), 4.00 (s, 3H, OCH3), 6.88 (d, J = 8.5 Hz, 1H, aromatic), 7.70 (d, J = 5.0 Hz, 1H, aromatic), 7.93 (d, J = 8.5 Hz, 1H, aromatic), 8.12 (brs, 1H, NH), 8.33 (d, J = 5.0 Hz, 1H, aromatic)
13C NMR (CDCl3, 126 MHz) δ20.2(2C), 24.9, 25.9, 30.3, 32.9(2C), 56.7, 72.3, 95.6, 104.0, 105.0, 112.4, 115.7, 121.9, 129.0, 134.4, 139.3, 141.2, 142.7, 160.4
IR (cm-1) 792, 1088, 1230, 1245, 1288, 1423, 1448, 1616, 2851, 2930
Claims (49)
- 標的タンパク質の不安定性及び/又は安定性を誘導する物質のスクリーニング方法であって、
アッセイ細胞をテスト物質と接触させることを含む培養を行い前記アッセイ細胞が発現する内部標準タンパク質に対する前記アッセイ細胞が発現する標的タンパク質の相対量(A)を測定すること、
アッセイ細胞をテスト物質と接触させることなく培養し前記アッセイ細胞が発現する前記アッセイ細胞が発現する内部標準タンパク質に対する標的タンパク質の相対量(B)を測定すること、
前記相対量(A)と前記相対量(B)とを比較すること、及び、
前記比較に基づいて標的タンパク質の不安定性及び/又は安定性を誘導する候補物質を選択することを含み、
アッセイ細胞は、一又は複数の実施形態において、標的タンパク質のmRNAと内部標準タンパク質のmRNAとを同一の発現制御下で発現しうる細胞、又は、標的タンパク質のmRNAと内部標準タンパク質のmRNAとを同一の発現制御下で発現しうる手段を有する細胞である、方法。 - 候補物質の選択が、前記相対量(A)が前記相対量(B)よりも減少していれば、前記テスト物質を標的タンパク質の不安定性を誘導する候補物質として選択すること、及び/又は、前記相対量(A)が前記相対量(B)よりも増加していれば、前記テスト物質を標的タンパク質の安定性を誘導する候補物質として選択することを含む、請求項1記載のスクリーニング方法。
- アッセイ細胞が、標的タンパク質と内部標準タンパク質とを同一のプロモーターで発現しうる細胞である、請求項1又は2に記載のスクリーニング方法。
- アッセイ細胞が、標的タンパク質と内部標準タンパク質とをポリシストロニック遺伝子発現系により発現しうる細胞である、請求項3記載のスクリーニング方法。
- 前記ポリシストロニック遺伝子発現系が、標的タンパク質遺伝子と内部標準タンパク質遺伝子とが内部リボゾーム結合配列又は自己開裂ペプチドをコードする遺伝子配列を介して連結された構成を含む、請求項4記載のスクリーニング方法。
- 標的タンパク質又は内部標準タンパク質の少なくとも一方が、タグと融合した形態でアッセイ細胞において発現される、請求項1から5のいずれかに記載のスクリーニング方法。
- 標的タンパク質及び内部標準タンパク質が、蛍光を発光可能な形態でアッセイ細胞において発現される、請求項1から6のいずれかに記載のスクリーニング方法。
- 請求項1から7のいずれかに記載のスクリーニング方法を行うためのキットであって、
標的タンパク質のmRNAと内部標準タンパク質のmRNAとを同一の発現制御下で発現しうるアッセイ細胞、若しくは、標的タンパク質のmRNAと内部標準タンパク質のmRNAとを同一の発現制御下で発現しうる手段を有するアッセイ細胞、又は、
任意の標的タンパク質の遺伝子を組み込むことができ、かつ、内部標準タンパク質が予め組み込まれ、標的タンパク質のmRNAと内部標準タンパク質のmRNAとが同一の発現制御下で発現されうるように構成及び適合された遺伝子発現ベクターを含むキット。 - 下記一般式(I)で表される化合物又はその製薬上許容される塩。
[式(I)において、R1は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、R2は、-R3、-C≡C-R3、-CH=CH-R3、及び-O-(CH2)n-R3からなる群から選択され、nは1〜6であり、R3は、水素原子、水酸基、C1−8アルキル基、-Si(R5)3、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、R1とR2は結合して環を形成し、-R1-R2-が、-(CH2)m-CH2-、-CH=CH-、-(CH2)m-O-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、mは1〜6であり、R4は、水素原子又はC1−6アルキル基である。R5は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、-Si(R5)3中の3つのR5はそれぞれ異なっていてもよい。] -
で表される化合物又はその製薬上許容される塩。 - 生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させるための組成物であって、請求項9又は10に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩を含む組成物。
- 生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させるための請求項9又は10に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩。
- 生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる組成物を製造するための請求項9又は10に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩の使用。
- 生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる方法であって、
下記一般式(I)で表される化合物又はその製薬上許容される塩を前記生体又は細胞に投与することを含む、方法。
[式(I)において、R1は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、R2は、-R3、-C≡C-R3、-CH=CH-R3、及び-O-(CH2)n-R3からなる群から選択され、nは1〜6であり、R3は、水素原子、水酸基、C1−8アルキル基、-Si(R5)3、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、R1とR2は結合して環を形成し、-R1-R2-が、-(CH2)m-CH2-、-CH=CH-、-(CH2)m-O-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、mは1〜6であり、R4は、水素原子又はC1−6アルキル基である。R5は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、-Si(R5)3中の3つのR5はそれぞれ異なっていてもよい。] - 生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる方法であって、
で表される化合物又はその製薬上許容される塩を前記生体又は細胞に投与することを含む、方法。 - アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療のための医薬組成物であって、請求項9又は10に記載の化合物又はその製薬上許容される塩を有効成分として含有する、医薬組成物。
- アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療のための請求項9又は10に記載の化合物又はその製薬上許容される塩。
- アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療のための医薬組成物を製造するための請求項9又は10に記載の化合物又はその製薬上許容される塩の使用。
- アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療の方法であって、下記一般式(I)で表される化合物又はその製薬上許容される塩を対象に投与することを含む、方法。
[式(I)において、R1は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、R2は、-R3、-C≡C-R3、-CH=CH-R3、及び-O-(CH2)n-R3からなる群から選択され、nは1〜6であり、R3は、水素原子、水酸基、C1−8アルキル基、-Si(R5)3、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、R1とR2は結合して環を形成し、-R1-R2-が、-(CH2)m-CH2-、-CH=CH-、-(CH2)m-O-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、mは1〜6であり、R4は、水素原子又はC1−6アルキル基である。R5は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、-Si(R5)3中の3つのR5はそれぞれ異なっていてもよい。] - アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療の方法であって、
で表される化合物又はその製薬上許容される塩を対象に投与することを含む、方法。 - アルツハイマー病が、ダウン症候群において発症しうるアルツハイマー病である、請求項16から20のいずれかに記載の医薬組成物、塩、使用、又は方法。
- 生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させるための組成物であって、下記一般式(II)で表される化合物又はその製薬上許容される塩を含む組成物。
[式(II)において、R11は、ハロゲン原子、又はハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基であり、R12は、水素原子、C1−6アルキル基、又はハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基若しくは単環式複素芳香環基であり、R13は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、Qは、-C(O/S)-C=C-R14、-C(O/S)-NH-CH2-R14、-C(O/S)-NH-C(O/S)-R14、-C(O/S)-R14、及び、-SO2-R14からなる群から選択される基であり、R14は、C1−6アルキル基、C1−6アルコキシ基、水酸基若しくはハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基又は単環式複素芳香環基である。] - 生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させるための化合物、又はその製薬上許容される塩であって、下記一般式(II)で表される化合物又はその製薬上許容される塩。
[式(II)において、R11は、ハロゲン原子、又はハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基であり、R12は、水素原子、C1−6アルキル基、又はハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基若しくは単環式複素芳香環基であり、R13は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、Qは、-C(O/S)-C=C-R14、-C(O/S)-NH-CH2-R14、-C(O/S)-NH-C(O/S)-R14、-C(O/S)-R14、及び、-SO2-R14からなる群から選択される基であり、R14は、C1−6アルキル基、C1−6アルコキシ基、水酸基若しくはハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基又は単環式複素芳香環基である。] - 生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させる組成物を製造するための請求項22又は23に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩であって、下記一般式(II)で表される化合物又はその製薬上許容される塩の使用。
[式(II)において、R11は、ハロゲン原子、又はハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基であり、R12は、水素原子、C1−6アルキル基、又はハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基若しくは単環式複素芳香環基であり、R13は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、Qは、-C(O/S)-C=C-R14、-C(O/S)-NH-CH2-R14、-C(O/S)-NH-C(O/S)-R14、-C(O/S)-R14、及び、-SO2-R14からなる群から選択される基であり、R14は、C1−6アルキル基、C1−6アルコキシ基、水酸基若しくはハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基又は単環式複素芳香環基である。] - 生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させる方法であって、下記一般式(II)で表される化合物又はその製薬上許容される塩を前記生体又は細胞に投与することを含む、方法。
[式(II)において、R11は、ハロゲン原子、又はハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基であり、R12は、水素原子、C1−6アルキル基、又はハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基若しくは単環式複素芳香環基であり、R13は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、Qは、-C(O/S)-C=C-R14、-C(O/S)-NH-CH2-R14、-C(O/S)-NH-C(O/S)-R14、-C(O/S)-R14、及び、-SO2-R14からなる群から選択される基であり、R14は、C1−6アルキル基、C1−6アルコキシ基、水酸基若しくはハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基又は単環式複素芳香環基である。] - 生体内又は細胞内のTAUタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のTAUタンパク質量を低減させる方法であって、
で表される化合物又はその製薬上許容される塩を前記生体又は細胞に投与することを含む、方法。 - アルツハイマー病及び又はタウオパチーの予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療のための医薬組成物であって、下記一般式(II)で表される化合物又はその製薬上許容される塩を有効成分として含有する、医薬組成物。
[式(II)において、R11は、ハロゲン原子、又はハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基であり、R12は、水素原子、C1−6アルキル基、又はハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基若しくは単環式複素芳香環基であり、R13は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、Qは、-C(O/S)-C=C-R14、-C(O/S)-NH-CH2-R14、-C(O/S)-NH-C(O/S)-R14、-C(O/S)-R14、及び、-SO2-R14からなる群から選択される基であり、R14は、C1−6アルキル基、C1−6アルコキシ基、水酸基若しくはハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基又は単環式複素芳香環基である。] - アルツハイマー病及び又はタウオパチーの予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療のための下記一般式(II)で表される化合物又はその製薬上許容される塩。
[式(II)において、R11は、ハロゲン原子、又はハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基であり、R12は、水素原子、C1−6アルキル基、又はハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基若しくは単環式複素芳香環基であり、R13は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、Qは、-C(O/S)-C=C-R14、-C(O/S)-NH-CH2-R14、-C(O/S)-NH-C(O/S)-R14、-C(O/S)-R14、及び、-SO2-R14からなる群から選択される基であり、R14は、C1−6アルキル基、C1−6アルコキシ基、水酸基若しくはハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基又は単環式複素芳香環基である。] - アルツハイマー病及び又はタウオパチーの予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療のための医薬組成物を製造するための下記一般式(II)で表される化合物又はその製薬上許容される塩の使用。
[式(II)において、R11は、ハロゲン原子、又はハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基であり、R12は、水素原子、C1−6アルキル基、又はハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基若しくは単環式複素芳香環基であり、R13は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、Qは、-C(O/S)-C=C-R14、-C(O/S)-NH-CH2-R14、-C(O/S)-NH-C(O/S)-R14、-C(O/S)-R14、及び、-SO2-R14からなる群から選択される基であり、R14は、C1−6アルキル基、C1−6アルコキシ基、水酸基若しくはハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基又は単環式複素芳香環基である。] - アルツハイマー病及び又はタウオパチーの予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療の方法であって、下記一般式(II)で表される化合物又はその製薬上許容される塩を対象に投与することを含む、方法。
[式(II)において、R11は、ハロゲン原子、又はハロゲン原子で置換されていてもよいC1−6アルキル基であり、R12は、水素原子、C1−6アルキル基、又はハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基若しくは単環式複素芳香環基であり、R13は、水素原子又はC1−6アルキル基であり、Qは、-C(O/S)-C=C-R14、-C(O/S)-NH-CH2-R14、-C(O/S)-NH-C(O/S)-R14、-C(O/S)-R14、及び、-SO2-R14からなる群から選択される基であり、R14は、C1−6アルキル基、C1−6アルコキシ基、水酸基若しくはハロゲン原子で置換された若しくは無置換のフェニル基又は単環式複素芳香環基である。] - アルツハイマー病及び又はタウオパチーの予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療の方法であって、
で表される化合物又はその製薬上許容される塩を前記生体又は細胞に投与することを含む、方法。 - 生体内でのDYRK1Aタンパク質活性の指標としての血中ホモシステイン濃度の使用。
- 個体内でのDYRK1Aタンパク質の活性を評価する方法であって、
個体の血中ホモシステイン濃度をモニタリングすること、及び、
血中ホモシステイン濃度が下降した場合にDYRK1Aタンパク質活性が亢進したと分類し、血中ホモシステイン濃度が上昇した場合にDYRK1Aタンパク質活性が抑制されたと分類する基準と比較することにより前記個体内でのDYRK1Aタンパク質活性を評価することを含む、方法。 - DYRK1A活性の阻害化合物又はその候補化合物を含む組成物の投与効果を評価する方法であって、
個体の血中ホモシステイン濃度をモニタリングすること、
前記個体にDYRK1A活性の阻害化合物又はその候補化合物を含む組成物を投与すること、及び、
投与後に血中ホモシステイン濃度が上昇した場合に前記組成物の投与によりDYRK1Aタンパク質の活性が抑制されたと評価することを含む、方法。 - アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療の方法であって、
生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる組成物を投与すること、及び、
請求項33又は34に記載の評価方法を行うことを含む、方法。 - アルツハイマー病が、ダウン症候群において発症しうるアルツハイマー病である、請求項35記載の方法。
- 下記一般式(III)で表される化合物又はその製薬上許容される塩。
[式(III)において、R21及びR23は、それぞれ独立して、水素原子、C1−6直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基であり、R22は、-R26、-C≡C-R26、-CH=CH-R26、及び-O-(CH2)n-R26からなる群から選択され、nは1〜6であり、R26は、水素原子、水酸基、C1−8アルキル基、-Si(R27)3、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、R21とR22は結合して環を形成し、-R21-R22-が、-(CH2)m-CH2-、-CH=CH-、-(CH2)m-O-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、mは1〜6であり、R27は水素原子、C1―6アルキル基、トリハロメチル基、又は水酸基であり、-Si(R27)3中の3つのR27はそれぞれ異なっていてもよい。R24、R25は、水素原子又はC1―6アルキル基である。] -
で表される化合物又はその製薬上許容される塩。 - 生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させるための組成物であって、請求項37又は38に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩を含む組成物。
- 生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させるための請求項37又は38に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩。
- 生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導するための、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる組成物を製造するための請求項37又は38に記載の化合物、又はその製薬上許容される塩の使用。
- 生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる方法であって、
下記一般式(III)で表される化合物又はその製薬上許容される塩を前記生体又は細胞に投与することを含む、方法。
[式(III)において、R21及びR23は、それぞれ独立して、水素原子、C1−6直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基であり、R22は、-R26、-C≡C-R26、-CH=CH-R26、及び-O-(CH2)n-R26からなる群から選択され、nは1〜6であり、R26は、水素原子、水酸基、C1−8アルキル基、-Si(R27)3、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、R21とR22は結合して環を形成し、-R21-R22-が、-(CH2)m-CH2-、-CH=CH-、-(CH2)m-O-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、mは1〜6であり、R27は水素原子、C1―6アルキル基、トリハロメチル基、又は水酸基であり、-Si(R27)3中の3つのR27はそれぞれ異なっていてもよい。R24、R25は、水素原子又はC1―6アルキル基である。] - 生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質に不安定性を誘導する、或いは、生体内又は細胞内のDYRK1Aタンパク質量を低減させる方法であって、
で表される化合物又はその製薬上許容される塩を前記生体又は細胞に投与することを含む、方法。 - アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療のための医薬組成物であって、請求項37又は38に記載の化合物又はその製薬上許容される塩を有効成分として含有する、医薬組成物。
- アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療のための請求項37又は38に記載の化合物又はその製薬上許容される塩。
- アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療のための医薬組成物を製造するための請求項37又は38に記載の化合物又はその製薬上許容される塩の使用。
- アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療の方法であって、下記一般式(III)で表される化合物又はその製薬上許容される塩を対象に投与することを含む、方法。
[式(III)において、R21及びR23は、それぞれ独立して、水素原子、C1−6直鎖若しくは分枝若しくは環状のアルキル基、ベンジル若しくはヘテロアリールメチル基、置換若しくは無置換のアリール基、又は置換若しくは無置換のヘテロアリール基であり、R22は、-R26、-C≡C-R26、-CH=CH-R26、及び-O-(CH2)n-R26からなる群から選択され、nは1〜6であり、R26は、水素原子、水酸基、C1−8アルキル基、-Si(R27)3、並びに、置換若しくは無置換のフェニル基、単環式複素芳香環基及び環状脂肪族基からなる群から選択され、或いは、R21とR22は結合して環を形成し、-R21-R22-が、-(CH2)m-CH2-、-CH=CH-、-(CH2)m-O-、及び、ハロゲン原子で置換されたこれらのものからなる群から選択され、mは1〜6であり、R27は水素原子、C1―6アルキル基、トリハロメチル基、又は水酸基であり、-Si(R27)3中の3つのR27はそれぞれ異なっていてもよい。R24、R25は、水素原子又はC1―6アルキル基である。] - アルツハイマー病の予防、改善、進行抑制、及び/又は、治療の方法であって、
で表される化合物又はその製薬上許容される塩を対象に投与することを含む、方法。 - アルツハイマー病が、ダウン症候群において発症しうるアルツハイマー病である、請求項44から48のいずれかに記載の医薬組成物、塩、使用、又は方法。
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