CN105899503B - 选择性grp94抑制剂和其用途 - Google Patents

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Abstract

本揭示内容涉及新颖的选择性Grp94抑制剂、包含有效量的所述化合物的组合物和治疗或预防诸如癌症等病况的方法，所述方法包含向有需要的动物投与有效量的所述化合物。

Description

选择性GRP94抑制剂和其用途
相关申请案的交叉参考
本发明主张于2013年8月16日提出申请的美国临时专利申请案第61/866,932号的优先权，所述案件的全部内容都以引用方式并入本文中。
序列表
本案含有序列表，其已用ASCII格式电子发文，且其全文并入本文作为参考。所述ASCII复本是于2014年8月12日创建，命名为2003080-0708_SL.txt且大小为17,757字节。
政府支持
本发明至少部分是利用从国立卫生研究院接收的资金进行(批准号1R21AI090501-01)。美国政府对本发明拥有某些权利。
技术领域
本揭示内容涉及选择性Grp94抑制剂、包含有效量的所述化合物的组合物和治疗或预防诸如癌症等病况的方法，所述方法包含向有需要的动物投与有效量的所述化合物。
背景技术
Hsp90是在蛋白质毒性应力和病原应力下调控和维持细胞的功能中起重要作用的分子侣伴蛋白家族(沃克曼，P.(Workman，P.)、伯罗斯，F.(Burrows，F.)、奈克斯，L.(Neckers， L.)和罗森，N.(Rosen，N.)用侣伴蛋白Hsp90对癌症给药：癌基因成瘾性和肿瘤应力的组合疗法开发(Drugging the cancer chaperone Hsp90：combinatorialtherapeutic exploitation of oncogene addiction and tumor stress).纽约科学院年报(Ann.N.Y.Acad.Sci.)1113，202-216 (2007))。在人类中，细胞质热休克蛋白90α和β(Hsp90α和β)、内质网(ER)葡萄糖调控蛋白质94(Grp94)和线粒体肿瘤坏死因子受体相关蛋白质1(Trap-1)是四种已知的Hsp90 同种同源物(斯里达，A.S.(Sreedhar，A.S.)、卡尔玛，E.(Kalmar，E.)、卡瑟米里，P.(Csermely， P.)和沈，Y.F.(Shen，Y.F.)，Hsp90亚型：功能、表达和临床重要性(Hsp90 isoforms：functions，expression and clinical importance)，欧洲生物化学学会联合会快报(FEBS letters).562， 11-15(2004)；约翰逊，J.L.(Johnson，J.L.)，不同Hsp90同系物和共侣伴蛋白的进化与功能(Evolution and functionof diverse Hsp90 homologs and cochaperone proteins).生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta.).1823，607-613(2012))。这些蛋白质具有ATP 依赖性且属于GHKL(回旋酶B、Hsp90、组氨酸激酶、MutL)ATPase超家族，其特征在于位于N-末端结构域(NTD)中的特殊ATP结合“贝尔热拉(Bergerat)折叠”(谢纳， P.(Chene，P.)作为药物靶的ATPase：从其结构来了解(ATPases as drug targets：learning from their structure).自然评论：药物发现(Nat.Rev.Drug Discov.)1，665-673(2002))。核苷酸的结合和释放驱动Hsp90的催化循环且由此经由一系列缔合-解离催化循环帮助客户蛋白重新折叠。小分子抑制剂占据这个调控袋会使Hsp90侣伴蛋白功能失活，并且已证实当在癌症、神经变性、感染和炎症疾病模型中测试时，若干泛-Hsp90抑制剂可有效逆转疾病表型。由于这些治疗活性，还已将所选数目的这些化合物运到诊所用于治疗癌症 (贾哈维利，K.(Jhaveri，K.)、塔尔多内，T.(Taldone，T.)、莫迪，S.(Modi，S.)和谢尔西斯，G. (Chiosis，G.)热休克蛋白90(Hsp90)在癌症中的临床研发进展(Advances in the clinical development of heatshock protein 90(Hsp90)inhibitors in cancers.)生物化学与生物物理学报.1823，742-755(2012))。
尽管业内对使用药理学Hsp90抑制剂治疗疾病非常感兴趣，但对每一同种同源物对所观察到之治疗益处的贡献了解甚少。迄今为止，所有公开的研究已使用泛-Hsp90抑制剂来使Hsp90和依赖于其的过程失活，从而使得个别同种同源物的作用不可能与生物效应相关。考虑到这些Hsp90的陪伴作用不重叠，这尤其令人不满意。因此，例如，尽管关于细胞溶质Hsp90对抑制剂的反应存在大量文献，但没有研究能令人满意地区分α和β同种同源物的作用。此外，尽管Grp94和Trap-1二者在癌细胞中含量丰富，但对其对恶性表型的贡献了解甚少(斯里达，A.S.、卡尔玛，E.、卡瑟米里，P.和沈，Y.F.Hsp90亚型：功能、表达和临床重要性，欧洲生物化学学会联合会快报.562，11-15(2004)；约翰逊，J.L. 不同Hsp90同系物和共侣伴蛋白的进化与功能.生物化学与生物物理学报.1823，607-613 (2012)；马扎克，M.(Marzec，M.)、依莱托，D.(Eletto，D.)和阿尔贡，Y.(Argon，Y.)GRP94：专门用于内质网中的蛋白质折叠和质量控制的HSP90样蛋白(GRP94：An HSP90-like protein specialized forprotein folding and quality control in the endoplasmic reticulum).生物化学与生物物理学报.1823，774-787(2012)；陈，B.(Chen，B.)人类基因组中的HSP90 基因家族：对其发散和进化的了解(The HSP90 family of genes in the human genome： Insightsinto their divergence and evolution).基因组学(Genomics)86，627-637(2005))。
在很大程度上，无法在癌细胞中研究个别同种同源物(尽管其作用趋异)的困境源于没有适宜的工具。尽管在酵母和人类细胞、突变细胞系和基因缺陷小鼠中的泛-Hsp90抑制剂遗传操纵已阐明了若干Hsp90依赖性癌症机制，但仍存在许多挑战。具体来说，需要策略来阐述Hsp90和其个别同种同源物在其中侣伴蛋白受限但并非不存在的内源性细胞环境(即在未改造癌细胞系中和在原始试样中)中的生物学。理想地，可以通过以受控方式探测并操纵蛋白质功能的化学工具来填补这个空白。所述工具可通过帮助在活体外和在其天然生物情况下对生物分子进行分子表征来补充传统的生物化学和生物方法。
尽管既可用作治疗剂又可用作剖析在所选表型中与Hsp90同种同源物相关的细胞特异性效应和机制的工具，但由于同种同源物特异性Hsp90抑制剂的ATP调控配体结合腔(即与已知合成配体结合的袋)的高度保守，其发现尤其具有挑战性。实际上，我们和其它人发现，大部分报道的Hsp90抑制剂同样良好地结合到这些同种同源物中的大多数(马扎克，M.、依莱托，D.和阿尔贡，Y.GRP94：专门用于内质网中的蛋白质折叠和质量控制的 HSP90样蛋白.生物化学与生物物理学报.1823，774-787(2012)；舒尔特，T.W.(Schulte，T. W.)等人，根赤壳菌素与分子侣伴蛋白的热休克蛋白90家族成员的相互作用(Interaction ofradicicol with members of the heat shock protein 90 family of molecularchaperones).分子内分泌学(Mol.Endo.)13，1435-1448(1999)。呈脱辅基形式或呈与调控核苷酸或小分子之复合物的细胞质Hsp90(α和β)N-末端结构域的晶体结构是基本上可叠合的(伊莫尔米诺，R. M.(Immormino，R.M.)、姜，Y.(Kang，Y.)、谢尔西斯，G.和格沃斯，D.T.(Gewirth，D.T.)8- 芳基-硫基腺嘌呤类Hsp90抑制剂的结构和量子化学研究(Structuraland quantum chemical studies of 8-aryl-sulfanyl adenine class Hsp90inhibitors).医药化学杂志.(J.Med.Chem.)49， 4953-4960(2006)；索尔达诺，K.L.(Soldano，K.L.)、吉旺，A.(Jivan，A.)、尼基塔，C.V. (Nicchitta，C.V.)和格沃斯，D.T.，GRP94的N-末端结构域的结构：配体特异性和调控的基础(Structure of the N-terminaldomain of GRP94：Basis for ligand specificity and regulation.)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)279，48330-48338(2003))。另外，尽管在一些小分子配体结合到Hsp90和Grp94时观察到对接取向略有不同，但迄今为止还不能经由个别同种同源物抑制将其转化成显著选择性和特定细胞活性(马扎克，M.、依莱托，D.和阿尔贡，Y.GRP94：专门用于内质网中的蛋白质折叠和质量控制的HSP90样蛋白.生物化学与生物物理学报.1823，774-787(2012)；伊莫尔米诺，R.M.等人，配体和侣伴蛋白在抑制剂结合的Hsp90和GRP94中的不同位姿：暗示同种同源物特异性药物设计(Different poses for ligand and chaperone ininhibitor-bound Hsp90 and GRP94：implications for paralog-specific drugdesign)，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)388，10331042(2009)；(杜菲尔德，A.S.(Duerfeldt，A.S.)等人，Grp94抑制剂之发展(Development of a Grp94 inhibitor). 美国化学学会会志(J.Am.Chem.Soc.)134，9796-9804(2012))。
自相矛盾地，尽管其ATP结合袋具有高序列保守性，但结晶学和生物化学研究已显示，在结合到核苷酸时，Hsp90α/β、Grp94和Trap-1采用显著不同的构象且以显著不同的速率水解ATP。特定来说，在结合到腺苷酰基亚氨基二磷酸(AMP-PNP，一种不可水解的ATP类似物)时，酵母Hsp90α二聚体的两个N-末端结构域(NTD)的“盖(lid)”从“开放”移动到“闭合”构象，从而将所结合的核苷酸截留在ATP结合腔内。然后两个闭合的NTD相遇形成第二二聚体界面，其补充两个C-末端结构域贡献的必须二聚体相互作用，并且重要的是对准用于ATP水解的催化残基。相反，Grp94的NTD“盖”在核苷酸结合时不闭合，相反采用独特的“延伸开放”构象，其不覆盖ATP结合袋且不容许NTD 之间的强二聚体相互作用。因此，核苷酸结合的Grp94采用扭转“V”形状，且其NTD 并非对称对置，而是以相对方向取向(阿里，M.M.(Ali，M.M.)等人，Hsp90-核苷酸 -p23/Sba1闭合侣伴分子复合物的晶体结构(Crystalstructure of an Hsp90-nucleotide-p23/Sba1 closed chaperone complex).自然(Nature)440，1013-1017 (2006)；道林斯，D.E.(Dollins，D.E.)、伊莫尔米诺，R.M.和格沃斯，D.T.未结合配体的 GRP94内质网Hsp90的结构(Structure of unliganded GRP94，theendoplasmic reticulum Hsp90).核苷酸诱导的构象变化的基础(Basis for nucleotide-induced conformational change).生物化学杂志280，30438-30447(2005))。在Trap-1中，ATP结合导致大部分闭合的构象，但其动力学慢于在细胞溶质Hsp90中(莱什科瓦尔，A.(Leskovar，A.)、韦格勒， H.(Wegele，H.)、威尔贝克，N.D.(Werbeck，N.D.)、布克纳，J.(Buchner，J.)和莱因斯坦，J. (Reinstein，J.)，线粒体Hsp90类似物Trap1的ATPase循环(The ATPase cycle of the mitochondrial Hsp90 analog Trap1).生物化学杂志283，11677-11688(2008))。但是这不足以指定Trap-1用于核苷酸水解且相反，之后重新打开侣伴蛋白构象。总之，生物化学证据表明，蛋白质的整体结构和构象柔性在配置这些侣伴蛋白的ATP结合位点中起重要作用。
在本发明中，利用同种同源物之间的构象区别且使用刻印成嘌呤-架构种类的化学多样性来证实可能鉴别Hsp90同种同源物特异性配体。使用结构和建模分析来解释同种同源物结合特异性的来源。随后使用若干种经鉴别的同种同源物特异性抑制剂提供对个别Hsp90对客户蛋白的肿瘤特异性陪伴的新颖认识。
发明内容
本发明涉及以下发现：尽管Hsp90的同种同源物极为类似，但其以极为不同的方式与结构上相关的抑制剂相互作用。对这些抑制剂的结构属性和其与靶蛋白的结合的了解已引起研发对如本文所述Hsp90的具体同种同源物具有选择性的抑制剂。具体来说，已研发对Grp94显示高特异性的新颖化合物。在一些实施例中，Grp94选择性化合物能够抑制Grp94而不抑制其它Hsp90同种同源物，包括Hsp90α、Hsp90β和Trap-1。因此，本揭示内容的选择性Grp94抑制剂可用于治疗各种类型的癌症。此外，可获得治疗益处而不反馈上调抗细胞凋亡和抗性调节热休克蛋白(例如Hsp70)。
本揭示内容提供以下证据：Grp94具有与ATP/ADP结合位点部分重叠且含有在其它Hsp90同种同源物中不完全暴露的疏水性袋的变构结合位点。本揭示内容的Grp94抑制剂含有可占据变构结合位点且因此防止ATP/ADP结合的化学部分。
人类Grp94的全长氨基酸序列(SEQ ID NO：1)示于表1中。如本文中所论述，本揭示内容的选择性Grp94抑制剂与构成Grp94的N-末端结构域(NTD)的特定氨基酸相互作用。具体来说，本揭示内容的Grp94抑制剂可与SEQ ID NO：1的两个特异性结合位点(在本文中称作“结合位点1”和“结合位点2”)相互作用(例如，产生空间和静电接触)。结合位点1包括至少5个氨基酸，包括Ile247、Val211、Phe199、Met154和Leu163。结合位点 1还可包括氨基酸Leu159、Tyr 200和Trp223。配体(例如，ATP或小分子抑制剂)与构成结合位点1的氨基酸的相互作用在所有四种同种同源物(Grp94、Hsp90α、Hsp90β和Trap-1) 中保守。结合位点2包括SEQ ID NO：1的至少7个氨基酸，包括Phe195、Gly198、Val209、 Ala202、Leu104、Leu249和Phe203。对于Grp94同种同源物具有特异性的结合位点2(在本文中还称作“Grp94特异性结合位点”)位于邻接ATP/ADP结合位点的裂缝区中。值得注意的是，到结合位点2的通路由Hsp90α和Hsp90β中的Phe138和Trap-1中的Phe205 阻断。因此，本揭示内容的Grp94抑制剂能够与占据Grp94 NTD的结合位点2的特定氨基酸相互作用，这容许选择性结合到Grp94同种同源物。在一些实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂展现较Grp94弱的与其它Hsp90同种同源物的结合。
因此，在一个方面中，本揭示内容提供对Grp94展现亲和性且因此能够抑制Grp94的生物活性的新颖化合物。在一些实施例中，Grp94抑制剂与构成Grp94NTD的结合位点1和结合位点2的6个或更多个氨基酸相互作用。在具体实施例中，本揭示内容的Grp94 抑制剂可与构成Grp94NTD的结合位点1和结合位点2的6、7、8、9、10、11或12个氨基酸相互作用。在其它实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂与6个或更多个选自以下的氨基酸相互作用：SEQID NO：1的Phe195、Gly198、Val209、Ala202、Ile247、Leu249、 Phe203、Leu104、Val211、Phe199、Met154和Leu163。例如，本揭示内容的Grp94抑制剂可与6、7、8、9、10、11或12个选自以下的氨基酸相互作用：SEQ ID NO.1的Phe195、 Gly198、Val209、Ala202、Ile247、Leu249、Phe203、Leu104、Val211、Phe199、Met154 和Leu163。
在具体实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂能够与Grp94 NTD的结合位点2(即，Grp94选择性结合位点)中的3个或更多个氨基酸相互作用。例如，Grp94抑制剂可与Grp94NTD的结合位点2的3、4、5、6或7个氨基酸相互作用。在一些所述实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂能够与3个或更多个选自以下的氨基酸相互作用：SEQ ID NO：1 的Phe195、Gly198、Val209、Ala202、Leu104、Leu249和Phe203。例如，本揭示内容的Grp94抑制剂可与3、4、5、6或7个选自以下的氨基酸相互作用：SEQ ID NO：1的 Phe195、Gly198、Val209、Ala202、Leu104、Leu249和Phe203。
在具体实施例中，本揭示内容的Grp94选择性抑制剂能够与SEQ ID NO：1的氨基酸Ala202、Leu104和Leu249相互作用。在其它实施例中，本揭示内容的Grp94选择性抑制剂能够与SEQ ID NO：1的氨基酸Gly198、Val209、Ala202、Leu249和Phe203相互作用。在其它实施例中，本揭示内容的Grp94选择性抑制剂能够与SEQ ID NO：1的氨基酸 Phe195、Val209、Ala202相互作用。在其它实施例中，本揭示内容的Grp94选择性抑制剂能够与SEQ ID NO：1的氨基酸Leu104、Val209、Ala202相互作用。在其它实施例中，本揭示内容的Grp94选择性抑制剂能够与SEQ ID NO：1的氨基酸Phe195、Leu249和 Leu104相互作用。在其它实施例中，本揭示内容的Grp94选择性抑制剂能够与SEQ ID NO：1的氨基酸Phe195、Gly198和Val209相互作用。在其它实施例中，本揭示内容的 Grp94选择性抑制剂能够与SEQ ID NO：1的氨基酸Leu104、Leu249和Phe203相互作用。
本揭示内容的Grp94抑制剂可为嘌呤-架构化合物或可基于嘌呤相关架构(例如，稠合氨基吡啶化合物)。所有含有嘌呤架构或嘌呤相关架构的Grp94抑制剂将在下文中称作嘌呤-架构抑制剂或嘌呤-架构化合物。在一些实施例中，Grp94抑制剂是腺嘌呤架构抑制剂。在一些实施例中，Grp94抑制剂是腺嘌呤架构化合物。
在具体实施例中，嘌呤-架构(例如，腺嘌呤-架构)抑制剂可在8位经键结到芳基或杂芳基的连接体基团取代。例如，键结到嘌呤环的8位的取代基可为芳基硫基、芳基硫氧基、芳基磺酰基、苄基、芳基羰基、苯氨基或苯氧基。在一些所述实施例中，嘌呤环8 位的芳基或杂芳基与构成SEQ ID NO：1的结合位点1和结合位点2的氨基酸相互作用。例如，嘌呤环的8位的芳基或杂芳基可与6、7、8、9、10、11或12个选自以下的氨基酸相互作用：SEQ ID NO.1的Phe195、Gly198、Val209、Ala202、Ile247、Leu249、Phe203、 Leu104、Val211、Phe199、Met154和Leu163。在其它实施例中，嘌呤环的8位的芳基或杂芳基可与3、4、5、6或7个选自以下的氨基酸相互作用：SEQ ID NO：1的Phe195、 Gly198、Val209、Ala202、Leu104、Leu249和Phe203。本揭示内容的嘌呤-架构Grp94 抑制剂的嘌呤部分通常与在所有Hsp90同种同源物中保守的氨基酸相互作用。例如，嘌呤部分可与SEQ ID NO：1的Asp149、Thr245、Ala111、Gly153、Lys114、Asp110、Ala108 和Asn107形成有利的相互作用。
在一些实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂具有水溶性。如本文所用，水溶性定义为在环境温度下在蒸馏水中溶解度高于0.5mg/mL。在一些实施例中，本揭示内容的嘌呤-架构抑制剂在环境温度下在蒸馏水中的水溶解度可大于3mg/mL、大于4mg/mL、大于5mg/mL、大于10mg/mL、大于20mg/mL或大于40mg/mL。如本文中将论述，可将本揭示内容的嘌呤-架构抑制剂调配为盐以提高其水溶解度。
在一个实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂是式(I)化合物。在另一实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂是式(II)化合物。在另一实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂是式(III)化合物。在另一实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂是式(IV)化合物。在另一实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂是式(V)化合物。
相对于其它Hsp90同种同源物，本揭示内容的Grp94抑制剂对Grp94具有高度选择性。在一些实施例中，Grp94抑制剂对Grp94的优先性为对Hsp90α、Hsp90β和/或Trap-1 的优先性的10倍以上。在其它实施例中，Grp94抑制剂对Grp94的优先性为对Hsp90α、 Hsp90β和/或Trap-1的优先性的20倍以上。在其它实施例中，Grp94抑制剂对Grp94的优先性为对Hsp90α、Hsp90β和/或Trap-1的优先性的50倍以上。在其它实施例中，Grp94 抑制剂对Grp94的优先性为对Hsp90α、Hsp90β和/或Trap-1的优先性的100倍以上。在其它实施例中，Grp94抑制剂对Grp94的优先性为对Hsp90α、Hsp90β和/或Trap-1的优先性的500倍以上。在一些实施例中，使用荧光偏振分析测量Grp94抑制剂结合到Grp94 优于其它Hsp90同种同源物的选择性。例如，可如本文所述在荧光偏振分析中测量所述选择性。
Grp94抑制剂可用于治疗多种Hsp90癌症，包括(但不限于)结肠直肠癌、胰脏癌、甲状腺癌、基底细胞癌、黑色素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、乳癌、神经母细胞瘤、胃肠癌(包括胃肠道间质瘤)、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、肛门癌、脑肿瘤(包括神经胶质瘤)、淋巴瘤(包括滤泡型淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤)、白血病、骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤)、骨髓增殖性赘瘤和妇科癌症(包括卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌)。在一些实施例中，Grp94抑制剂可与辐射疗法组合使用。在其它实施例中，Grp94抑制剂可与基于氟嘧啶或基于铂的化学疗法组合使用。
在具体实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂可用于治疗人类表皮生长因子受体2(HER2)依赖性癌症，例如乳癌、卵巢癌、胃癌、食道癌和非小细胞肺癌。在一些所述实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂可与干扰HER2受体的治疗剂(例如，曲妥珠单抗(trastuzumab)(赫赛汀(herceptin)))组合使用。
在一些实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂可用于治疗表皮生长因子受体(EGFR) 依赖性癌症，例如胰脏癌、颈癌、乳癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌和食道癌。在一些所述实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂可用于治疗内分泌抗性乳癌和卵巢癌(例如，对他莫昔芬(tamoxifen)具有抗性的肿瘤)。本揭示内容的Grp94抑制剂可与抗雌激素药(例如选择性雌激素受体调节剂(例如，他莫昔芬)或芳香酶抑制剂(例如，依西美坦(exemestone)或阿那曲唑(anastrozole))组合使用。
在一些实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂可用于治疗对EGFR抑制剂疗法具有抗性的EGFR依赖性癌症。在一个所述实施例中，癌症是对EGFR抑制剂疗法具有抗性的胰脏癌。Grp94抑制剂可与EGFR抑制剂组合使用。在具体实施例中，Grp94抑制剂是与EGFR抑制剂埃罗替尼组合用于治疗胰脏癌。
在其它实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂可用于治疗胰岛素生长因子1受体(IGF1R)依赖性肿瘤。具体来说，本揭示内容的Grp94抑制剂可用于治疗具有IGF1R表达变化的癌症，其中受体对于致病机制和肿瘤进展是必需的。在具体实施例中，IGF1R 依赖性癌症是尤因氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)。在另一具体实施例中，IGF1R依赖性肿瘤是卵巢癌。
本发明的Grp94抑制剂还可用于治疗自体免疫疾病、炎症和神经变性疾病、类风湿性关节炎和糖尿病。在一些所述实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂在1型糖尿病中具有抗血管生成效应。具体来说，本揭示内容的Grp94抑制剂可对人类内皮细胞展示抗血管生成效应。
本揭示内容的Grp94抑制剂能够经由抑制类铎受体(TLR)、尤其TLR9的Grp94陪伴来调节炎症反应。在具体实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂可用于治疗炎症疾病，例如红斑狼疮、类风湿性关节炎、缺血性再灌注损伤、粥样硬化损害、抗生素相关结肠炎和败血性休克。
如本文所述，在以足够低的剂量提供时，可向癌症患者投与本揭示内容的Grp94抑制剂而不反馈上调抗细胞凋亡和抗性调节热休克蛋白(例如Hsp70)。因此，可向患者投与本揭示内容的Grp94抑制剂，而不同时投与Hsp70抑制剂。因此，根据本揭示内容的一个方面，提供通过在不上调Hsp70的情况下治疗患有癌症的人类患者来治疗癌症的方法。所述方法涉及以足以抑制Grp94而不抑制其它Hsp90同种同源物(即，Hsp90α、Hsp90β和/或Trap-1)的量投与本揭示内容的Grp94抑制剂。在一个实施例中，可以足以抑制Grp94 而不抑制Hsp90α的量向癌症患者投与本揭示内容的Grp94抑制剂。在一个实施例中，可以足以抑制Grp94而不抑制Hsp90β的量向癌症患者投与本揭示内容的Grp94抑制剂。在另一实施例中，可以足以抑制Grp94而不抑制TRAP-1的量向癌症患者投与本揭示内容的Grp94抑制剂。在另一实施例中，可以足以抑制Grp94而不上调Hsp70的量向癌症患者投与本揭示内容的Grp94抑制剂。
此外，本揭示内容的Grp94抑制剂尤其有效地诱导过表达酪氨酸激酶受体、尤其HER2和EGFR的癌细胞的细胞凋亡。Grp94抑制剂诱导细胞凋亡的能力部分源于本发明者的以下发现：Grp94在于质膜处维持高密度HER2和EGFR物质中发挥作用。这些过表达蛋白质的相关异常信号传导也需要Grp94。本发明涵盖以下认识：过表达HER2和 EGFR的肿瘤的Grp94抑制对Grp94抑制高度敏感且在投与选择性Grp94抑制剂时易于经历细胞凋亡。因此，在一个方面中，提供通过投与本揭示内容的Grp94抑制剂来诱导过表达HER2和EGFR的肿瘤的细胞凋亡的方法。
在另一方面中，本揭示内容提供可快速精确地测试所有主要Hsp90同种同源物的结合亲和性并且测试范围跨越低纳摩尔浓度到毫摩尔浓度结合亲和性的通用实验分析。分析依赖于在荧光偏振(FP)分析中使用新颖荧光标记探针。荧光标记探针(在本文中称作FP探针或FP示踪剂)能够结合到四种Hsp90同种同源物(Grp94、Hsp90α、Hsp90β和Trap-1)，并且因此可用于测定Hsp90抑制剂对这四种Hsp90同种同源物的亲和性和选择性。本文描述例示性新颖FP探针。
附图说明
图1a显示所选Grp94选择性化合物的结构和其亚型分类。图1b显示Grp94选择性化合物对四种Hsp90同种同源物的结合亲和性。数据呈现为平均值±s.d.(n＝3)。呈现泛 -Hsp90抑制剂PU-H71的值用于比较。图1c显示所选配体的选择性概况分析。
图2中的a至e显示PU-H54揭露Grp94中的新颖可药化袋。图2中的a显示Grp94 Apo采用类似于在所有Hsp90 N结构中观察到的“开放”构象。图2中的b显示在 Grp94N：PU-H54复合物中观察到的“部分闭合”构象，其特征在于将股1纳入较长螺旋1中和螺旋1向下旋转远离N-结构域的核心。螺旋4和5重新取向以跨骑重新定位的螺旋1。图2中的c显示在Grp94N的所有核苷酸结合结构中观察到的“延伸开放”盖构型。由核苷酸的磷酸酯部分贡献的空间和静电对撞引起螺旋1、4和5向上打开以完全暴露 ATP结合袋。图2中的d显示结合Hsp90和结合Grp94的PU-H54的叠加揭示在插入Grp94 特异性通道中时，围绕硫基连接体(以红色突出显示)的80°扭转旋转。图2中的e显示结合到Grp94的PU-H54的相互作用，其显示在结合到位点2中时8-芳基的疏水稳定增加。图2f显示简单二维示意图，其显示Grp94的结合位点1和结合位点2的氨基酸的大概位置。
图3a和3b显示结合到Hsp90αNTD的位点1的PU-H54。嘌呤架构维持所有先前观察的嘌呤-蛋白质接触，并且8-芳基向上延伸到螺旋3与β片核心之间的疏水性通道中，其中其夹在位点1中，所述位点1是由一侧上的Leu107和另一侧上的Phe138的非极性侧链形成。N3位的戊-4-炔基尾部填塞在嘌呤环下方，如先前对于此取代基所观察。 PU-H54的不对称8-芳基在晶体结构中采用s-反式(25％)和s-顺式(75％)构型二者，从而在结合袋中产生假对称8-芳基环。图3c显示结合到Grp94的PU-H54。结合到Grp94的 PU-H54的结构显示，尽管配体的嘌呤部分维持与ATP袋中的保守残基的接触，但8-芳基采用与结合Hsp90的PU-H54相比显著不同的构象，特定来说“反向”取向。与配体的这种反向位姿一致，Grp94的Phe199摆动远离结合袋
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以暴露几乎完全疏水的深裂缝。疏水性裂缝衬有结合位点2氨基酸Phe195、Gly198、Val209、Ala202、Leu104、Leu249 和Phe203以及一部分结合位点1氨基酸Phe199、Ile247、Val211、Met154和Leu163。
图4a至图4f显示赋予Grp94选择性和Hsp90α/β选择性的官能团：图4a和图4d显示描绘两个Grp94选择性配体亚型和两个Hsp90α/β选择性配体亚型的一般方案。图4b 和图4c显示两个Grp94选择性配体亚型与赋予对Grp94的选择性和亲和性并减少与 Hsp90α、Hsp90β和Trap-1的结合的同种同源物的相互作用。图4e和图4f显示两个 Hsp90α/β选择性配体亚型与减少与Grp94和Trap-1的结合并赋予对Hsp90α/β的选择性和亲和性的同种同源物的相互作用。
图5a至图5g显示Grp94和Hsp90α/β选择性化合物展现对分化C2C12细胞的IGF-II分泌的选择性同种同源物抑制。图5a显示将分化C2C12细胞用指示化合物处理24hr。针对仅经媒剂处理的细胞(DMSO)测量并定量每一实验条件下培养基中的IGF-II分泌。数据呈现为平均值±SEM(n＝4)。图5b显示如图5a中的细胞的代表性西方印迹。仅泛 -Hsp90抑制剂(格尔德霉素(geldanamycin)(GM)和PU-H71)和Hsp90抑制剂(PU-29F)诱导 Hsp70并降解AKT，而Grp94抑制剂(PU-WS13)对这些Hsp90调介的功能无效应。图5c 通过光学显微镜目视检查C2C12细胞的活力。首先用或不用分化剂(2％马血清)处理细胞，随后添加媒剂(DMSO)或指示浓度的抑制剂并保持24h。经GM处理条件中的圆形漂浮细胞之外观指示细胞杀灭。显示代表性图像。图5d和5f显示将类铎受体9(TLR9)输送到细胞表面。图5d(左)显示经空白载体或HA-TLR9转染并如所指示染色的HEK293细胞的代表性共焦显微镜图像。图5d(右)显示确认如左图中所指示的细胞的HA-TLR9转染的代表性西方印迹。图5e显示经HA-TLR9转染(红色)并用指示浓度的PU-WS13或 PU-29F处理24h的HEK293细胞的一式四份实验条件的代表性图像和定量。蓝色＝DAPI。图5f显示经HA-TLR9转染(绿色)并用指示浓度的PU-WS13或PU-29F处理24h的 HEK293细胞的代表性图像。仅泛-Hsp90抑制剂(GM，PU-H71)既抑制TLR9输送还诱导 Hsp70。Hsp90抑制剂(PU-29F)不能抑制TLR9输送，但其诱导Hsp70。Grp94抑制剂 (PU-WS13)抑制TLR9输送，但不能诱导Hsp70。图5g显示如图5f中的细胞的代表性西方印迹。
图6a至图6f显示，HER2以肿瘤特异性方式对Hsp90同种同源物抑制敏感。图6a 显示将经定量且正规化的HER2水平针对SKBr3细胞和MCF7细胞中的抑制剂浓度绘图，所述细胞经媒剂(DMSO)或指示浓度的Grp94选择性抑制剂PU-WS13和PU-H39(上图) 或Hsp90α/β选择性抑制剂PU-29F、PU-20F和PU-11(下图)处理24h。图6b显示与图 6a中相同，但其中借助siRNA敲弱Grp94(上图)或Hsp90α/β(下图)的细胞除外。图6c 显示与图6a中相同，但HER2和Raf-1水平除外。在每一图下呈现Hsp90同种同源物结合亲和性的数据。图6a-c数据呈现为平均值±s.d.(n＝3)。图6d显示Hsp90同种同源物亲和性对所选化合物(n＝7)的HER2降解活性的相关性分析。在GraphPad Prism软件中分析数据。图6e显示通过用抗HER2抗体或非特异性IgG沉淀分离的MCF7萃取物中的 HER2的代表性西方印迹(WB)。图6f显示用PU-WS13(15μM)或PU-11(40μM)处理指示时间的MCF7细胞的代表性WB。将膜和细胞溶质部分中的蛋白质水平针对处理时间绘图。数据呈现为平均值±SEM(n＝3)。
图7a-1至图7d显示，HER2是在细胞隔室中以细胞特异性方式由Hsp90同种同源物调控。图7a-1和图7a-2显示，Grp94抑制导致在SKBr3细胞中而非MCF7细胞中HER2 的稳态水平降低，而Hsp90抑制下调SKBr3细胞和MCF7细胞二者中的HER2。图7a-1 显示经泛-Hsp90抑制剂PU-H71(1μM)、媒剂(DMSO)、PU-WS13(15μM)或指示浓度的 Grp94选择性抑制剂PU-WS13和PU-H39处理24h的SKBr3细胞和MCF7细胞的代表性西方印迹。图7a-2显示经泛-Hsp90抑制剂PU-H71(1μM)、媒剂(DMSO)或指示浓度的Hsp90α/β选择性抑制剂PU-29F、PU-20F和PU-11处理24h的SKBr3细胞和MCF7 细胞的代表性西方印迹。图7b显示，Grp94敲弱导致在SKBr3细胞中而非MCF7细胞中 HER2的稳态水平降低，而Hsp90敲弱下调SKBr3细胞和MCF7细胞二者中的HER2。图7b(上图)显示SKBr3细胞和MCF7细胞的代表性西方印迹，其中借助3种针对Grp94 生成的不同siRNA或通过对照siRNA(乱序)敲弱Grp94。为进行比较，还将细胞用泛 -Hsp90抑制剂PU-H71(1μM)、媒剂(DMSO)和Grp94抑制剂PU-WS13(15μM)和PU-H39 (40μM)处理24h。图7b(下图)显示SKBr3细胞和MCF7细胞的代表性西方印迹，其中借助8种针对指示Hsp90同种同源物生成的不同siRNA或通过对照siRNA(乱序)敲弱 Hsp90。为进行比较，还将细胞用泛-Hsp90抑制剂PU-H71(1μM)、媒剂(DMSO)和Hsp90 抑制剂PU-29F(25μM)和PU-20F(30μM)处理24h。图7c显示与图7b中相同，但将Hsp90 同种同源物水平正规化到β-肌动蛋白且将细胞溶质Hsp90同种同源物的变化图示为“倍数变化”。注意在Hsp90α敲弱后Hsp90β的反馈诱导。图7d显示经DMSO、PU-WS13(15 μM)、PU-29F(20μM)或PU-H71(1μM)处理4h且随后在固定和渗透化处理后经指示标记物染色的SKBr3细胞的荧光显微镜图像。抑制剂去稳化的HER2与邻接质膜的核内体结构(对于Grp94抑制)或与那些在胞质溶胶内发现者(对于Hsp90抑制)共定位。
图8a至图8j显示Grp94和Hsp90调控过表达HER2的癌细胞中的不同HER2功能。图8a显示经Grp94特异性抗体或同种型对照抗体染色的SKBr3细胞的代表性流式细胞术显示Grp94的细胞表面定位，所述Grp94由蛋白质输送抑制剂布雷菲德菌素A (Brefeldin A)减少。图8b显示经DMSO或PU-WS13(15μM)处理4h且随后在固定和渗透化处理后经指示标记物染色的SKBr3细胞的荧光显微镜图像。图8c显示经生物素化学标记且使用链霉抗生物素管柱纯化的表面暴露蛋白的代表性印迹。对组蛋白H4进行印迹用于膜不渗透性的对照。总细胞萃取物；总计，上清液；非表面蛋白质。将从链霉抗生物素管柱洗脱的蛋白质亲和纯化并如所指示通过WB来分析。图8d显示如所指示从质膜萃取物(部分5)分离的Grp94和HER2复合物的代表性WB。CP和IP分别为化学沉淀和免疫沉淀。图8e显示从萃取物分离的复合物中的Grp94与HER2水平之间的代表性亲和纯化印迹和相关性分析，在所述萃取物中首先通过IP利用所指示抗体减少Grp94水平。图8f和图8g显示经媒剂或抑制剂处理4h且随后在固定和渗透化处理后经指示标记物染色的SKBr3细胞的荧光显微镜图像。图8h和图8i显示经20μMPU-WS13或PU-29F处理指示时间的SKBr3细胞的代表性WB。将膜和细胞溶质部分中的蛋白质针对处理时间绘图。数据呈现为平均值±SEM(n＝3)。图8j显示在Grp94抑制后SKBr3细胞在质膜处出现的HER2结构和功能二者的变化的示意图。
图9显示概述Hsp90同种同源物对HER2的肿瘤特异性调控的示意图。所有上皮细胞都含有HER2编码基因的两个拷贝且在细胞表面上表达少量HER2受体。在致癌转化期间，每个细胞的基因拷贝数可增加，如SKBr3细胞系中，从而导致mRNA转录增加且细胞表面上的HER2受体数增加100倍到1,000倍。对于具有低到中HER2表达的大部分细胞中的HER2功能，Hsp90足矣。在其中蛋白质组改变(即HER2血浆过表达)对细胞施加应力的条件下，Grp94也起作用，并且在这些条件中Grp94的陪伴功能对于适当的HER2 功能至关重要。因为在这些细胞中HER2是主要癌基因，所以其对Grp94的依赖性使得细胞对适当Grp94功能成瘾。因此，Grp94成为所述癌症中的靶。
图10a至图10f显示仅Grp94抑制即足以诱导过表达HER2的乳癌细胞的细胞凋亡并降低所述细胞的活力。图10a和图10b显示乳癌细胞的活力，在所述乳癌细胞中Grp94 经PU-WS13抑制或借助siRNA敲弱。使用定量ATP水平的分析评定细胞活力。图10c 显示在经PU-WS13(15μM)处理指示时间的SKBr3细胞中测定细胞杀灭(亚G1群体)。图 10d和10e显示经PU-WS13或媒剂处理24h的癌细胞的代表性WB。图10f显示利用膜联蛋白V和7AAD的双重染色指示在将指示乳癌细胞用PU-WS13(10μM)处理48h后诱导细胞凋亡。
图11a至图11d显示单独Grp94而非Hsp90抑制即足以诱导过表达HER2的细胞死亡。图11a和11b显示经泛-Hsp90抑制剂PU-H71(1μM)、媒剂(DMSO)或指示浓度的 Grp94选择性抑制剂PU-WS13或Hsp90α/β选择性抑制剂PU-29F、PU-20F和PU-11处理 24h的过表达HER2的细胞的代表性西方印迹。监测裂解PARP(cPARP)和裂解半胱天冬酶-3(cCaspase-3)水平以证实对细胞凋亡的诱导或无所述诱导。β-肌动蛋白，载量对照。 Hsp70，特异性对照。Hsp90抑制剂的Hsp70诱导指示于测试浓度下对细胞溶质Hsp90 的抑制。Grp94抑制剂的无Hsp70诱导或极小Hsp70诱导指示于测试浓度下不抑制细胞溶质Hsp90。图11c显示将HER2++乳癌细胞用Hsp90α/β选择性抑制剂PU-29F或Grp94 选择性抑制剂PU-WS13处理72h且使用定量ATP水平的活力分析评定细胞活力。0下方的Y轴值指示杀灭初始细胞群体。图11d显示利用膜联蛋白V和7AAD的双重染色指示在将过表达HER2的SKBr3细胞用PU-WS13(10μM)处理48h后诱导细胞凋亡。
图12(上图)显示胃癌和食道癌细胞对选择性Grp94抑制剂的敏感性。过表达高水平HER2的OE19和NCI-N87细胞易受Grp94抑制影响。不过表达HER2的MNK74细胞不易受Grp94抑制影响。图12(下图)显示利用膜联蛋白V和7AAD的双重染色指示在将指示胃癌细胞和食道癌细胞用PU-WS13(10μM)处理48h后诱导细胞凋亡。
图13a至图13c显示，过表达EGFR的三重阴性乳癌细胞对选择性Grp94抑制剂 PU-WS13敏感。利用膜联蛋白V和7AAD双重染色针对细胞凋亡细胞的存在(图13a、13b)和通过免疫印迹针对裂解PARP的存在(图13c)测试过表达EGFR的三重阴性乳癌细胞的敏感性。
图14a和图14b显示，过表达EGFR的癌细胞对Grp94选择性抑制剂PU-WS13敏感。图14a显示，选择性Grp94抑制剂PU-WS13有效地抑制过表达EGFR的PANC-1细胞的生长，但对Capan-2细胞无效应，且对CFPAC细胞的生长的效应不大(图14a)。图14b 显示，展现针对PANC-1细胞而非针对Capan-2细胞观察的早期和晚期细胞凋亡的标记物的细胞显著增加，如通过利用膜联蛋白V和7AAD的双重染色所指示。
图15显示，用Grp94选择性抑制剂PU-WS13处理过表达EGFR的PANC-1细胞在经由细胞凋亡杀灭细胞方面较泛-HSP90抑制剂PU-H71和HSP90α抑制剂PU-29F更有效。利用膜联蛋白V和7AAD的双重染色指示细胞凋亡的诱导。
图16显示，Grp94选择性抑制剂PU-WS13诱导IGF1R过表达尤因肉瘤细胞系的细胞凋亡(左图)。利用膜联蛋白V和7AAD的双重染色指示细胞凋亡的诱导(右图)。
图17显示，Grp94选择性抑制剂PU-WS13诱导源自分化较差的血清腺癌的IGF1R 和TGFβ过表达卵巢癌细胞系的细胞凋亡。
图18a和图18b显示，天然Grp94和从糖尿病个体血浆纯化的含IgG部分二者的血管生成效应(称作峰2(p2mQ))受Grp94抑制剂PU-H54的抑制(图18a)。Grp94通过细胞因子类机制促进人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)的血管生成转化。总之，在PU-H54存在下观察到的形态变化证实，Grp94抑制展示对HUVEC的抗血管生成效应，同时其对细胞增殖没有显著影响(图18b)。
图19a和图19b显示Grp94选择性抑制剂PU-WS13(图19a)和PU-H54(图19b)抑制小鼠巨噬细胞中的TLR9配体、CpG DNA、诱导的TNF-α产生。
图20显示化合物40的化学结构。
图21a显示基于Hsp90抑制剂PU-H71设计FP探针的策略。图21b显示探针43a对接到HSP90α ATP结合袋(PDB ID：2FWZ)中，如通过Glide(5.0版)所生成。建模显示探针与含有少于3个碳的连接体的Leu107之间的潜在空间碰撞。
图22a至图22c显示指示探针与癌细胞萃取物的Hsp90同种同源物(a)或与个别Hsp90 同种同源物(b-c)的结合的剂量-反应曲线。于4℃下将不同量的蛋白质与配体一起培育且在平衡(24h)时测量反应。通过从在指定蛋白质浓度存在下记录的值减去无探针值来获得分析范围数据。在Prism 4.0中分析数据并绘图。呈现一式两份实验的平均值。
图23显示使用本揭示内容的荧光偏振方法分析的已知Hsp90抑制剂的结构。
图24(上图)显示一组癌细胞中的PU-WS13的活性的西方印迹分析；(左下图)将MDA-MB-468细胞用指示浓度的PU-WS13或媒剂(-)处理24h；(右下图)将HMEC细胞用指示浓度的PU-WS13、PU29F或媒剂(-)处理24h。通过西方印迹分析HER2和EGFR 的表达以及经由这些受体(STAT、AKT ERK)的下游信号传导中所涉及的蛋白质的表达和活性。
图25a至图25d显示PU-WS13肿瘤滞留和Grp94癌症功能的选择性靶向的PK/PD 分析。向具有肿瘤的小鼠ip注射75mg/kg PU-WS13。在PU-WS13注射后的指示时间杀死小鼠，并收集组织、肿瘤和血浆。通过LCMSMS分析指示肿瘤(A)或组织(C)中的PU- WS13水平。通过西方印迹分析指示肿瘤(B)或组织(D)中的蛋白质。
具体实施方式
本发明尤其提供Grp94选择性抑制剂。这些Grp94选择性抑制剂能够抑制Grp94而不抑制其它Hsp90同种同源物，包括Hsp90α、HSP90β和Trap-1。因此，本揭示内容的 Grp94抑制剂可拮抗Grp94的侣伴蛋白功能而不抑制其它Hsp90同种同源物(包括Hsp90α、 HSP90β和Trap-1)的侣伴蛋白功能。本揭示内容的化合物可用于治疗方法中，所述治疗方法向需要治疗癌症、神经变性疾病、自体免疫疾病、炎症疾病或与Grp94抑制相关的其它病况的个体(包括人类)投与治疗有效量的本揭示内容的化合物。在具体实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂可以抑制Grp94而不抑制Hsp90α、HSP90β和/或Trap-1的生物活性(例如，侣伴蛋白功能)的剂量投与。
如本申请案中所用术语“治疗”是指延迟个体的癌症、神经变性疾病或其它病况的症状的发作、减轻其严重度或延迟其症状进展。不要求疾病的治愈落在治疗范畴内。此外，应了解，这些治疗目标的特定结果将因个体而异，并且一些个体可获得大于或小于代表性群体的统计平均值的益处。因此，治疗是指向有需要的个体投与组合物，且预期所述个体将获得治疗益处。
术语“投与”是指向个体中引入治疗化合物的动作。一般来说，可使用任何投与途径。因此，根据要治疗的病况的性质，通过经口、鞘内、静脉内、肌内或非经肠注射投与是适当的。还可通过吸入向脑投与，这是因为在鼻的上侧存在与脑连接且无血脑屏障毛细管的隔室。对于此投与模式来说，不横跨血脑屏障的化合物是优选的，但并不严格需要此特性。
术语“治疗有效量”涵盖所投与化合物的量和投与时间表二者，其在统计基础上获得预防个体的疾病、减轻其严重度或延迟其进展的结果。如将了解，优选量应因化合物而异以平衡毒性/耐受性与治疗功效和投与模式。
5.1 Grp94选择性结合位点的鉴别
为鉴别同种同源物特异性Hsp90抑制剂，在基于荧光偏振(FP)的分析中内部生成超过130个嘌呤-架构(PU)-化合物的库以测试与重组Hsp90α和Grp94的结合。本文所述FP方法利用结合到不同Hsp90同种同源物的荧光标记探针(示踪剂)。因此，本发明的一个方面提供荧光标记的Grp94抑制剂，其中本文所述的任何化合物都利用荧光标记衍生。制备所述经标记化合物的方法描述于本文和国际专利公开案第WO/2013/009657号中，所述案件的全部内容是以引用方式并入本文中。本发明还涵盖所提供化合物的放射性标记类似物。制造所述放射性标记化合物的方法为业内已知，例如在国际专利公开案第 WO/2013/009655号中，所述案件的全部内容是以引用方式并入本文中。
通过测量抑制剂破坏荧光标记探针与特异性Hsp90同种同源物结合的能力测定相应同种同源物的潜在抑制剂。本发明提供一系列新颖荧光标记探针，其被描述为可结合到所有四种Hsp90同种同源物。因此，可针对所分析不同Hsp90同种同源物中的每一者使用单一荧光标记探针实施竞争分析。或者，可在结合分析中使用一个以上经标记探针。例如，在测定小分子抑制剂与Hsp90α、Hsp90β和Grp94的结合中使用探针Cy3B-GM，而在测定小分子抑制剂与Trap-1的结合中使用荧光标记探针PU-FITC3。下文显示 Cy3B-GM和PU-FITC3的结构：
Figure GDA0002463350460000161
还分析所选衍生物与Hsp90β和Trap-1的结合。设计具有对与Hsp90贝尔热拉型袋结合的偏倚的嘌呤-架构库。如根据Hsp90 ATP-结合袋中的高度类似性预期，所测试的大多数化合物展现对两种同种同源物类似的亲和性且包含极小或无选择性的化学空间。然而，鉴别对Grp94具有选择性的化学空间。这些化合物的结构以及其对HSP90的不同同种同源物的结合亲和性示于图1a-1c中。重要的是，Grp94选择性化学空间的所选化合物展现对Grp94的优先性为对Hsp90α/β的优先性的100倍以上且为对Trap-1的优先性的 10到100倍。
尽管筛选实验中未揭露强Grp94选择性，但将这些化合物建模成现有Grp94和Hsp90 结构的ATP结合袋未揭示可解释所观察到的结合选择性的显著差异。因此，测定与Grp94 和人类Hsp90α二者的NTD片段(分别为Grp94N和Hsp90 NTD)复合的Grp94特异性配体PU-H54的结构(图2和3a-3c )。与先前晶体结构一致，与PU-H54复合的Hsp90的三级结构与所有其它hHsp90N-配体复合物的三级结构基本上相同(伊莫尔米诺，R.M.、姜，Y.、谢尔西斯，G.和格沃斯，D.T.8-芳基-硫基腺嘌呤类Hsp90抑制剂的结构和量子化学研究. 医药化学杂志.49，4953-4960(2006))(图2中的a、b)。尽管插入此袋中，但PU-H54没有赋予其强结合的X2-Ar取代基，从而解释了此配体对Hsp90的低亲和性(图1b)。
另一方面，在Grp94：PU-H54复合物的结构中，Grp94中的螺旋1、4、5“盖”区采用新颖“部分闭合”构象，由此将股1和螺旋1拉离N结构域的核心，并且螺旋4和5 向上位移以跨骑螺旋1的顶部(图2中的a-c)。这些重排还重新定位Grp94的螺旋3，从而产生略大的ATP结合袋。结合到Grp94的PU-H54的结构显示，尽管配体的嘌呤部分维持与ATP袋中的保守残基的接触(图2中的c)，但8-芳基采用与Hsp90结合的PU-H54 的构象相比显著不同的构象(图2中的d)。叠加结合Hsp90和结合Grp94的PU-H54配体揭示8-芳基围绕硫基连接体约80°的扭转旋转，其中结合Hsp90的配体采用“正向”旋转，并且结合Grp94的配体采用新颖的“反向”旋转(图2中的d)。与配体的这种反向位姿一致，Grp94的Phe199摆动远离结合袋
Figure GDA0002463350460000171
以暴露几乎完全疏水的深裂缝(图2中的e -并未绘示结合位点的所有氨基酸残基)。
为便于说明，已将疏水性裂缝分成两个不同结合位点，称作Grp94的NTD的“结合位点1”和“结合位点2”。人类Grp94的全长序列在下表1中显示为SEQ ID NO：1。还参见美国专利第7,991,601号和第7,589,174号。人类Hsp90α的N-末端结构域的序列(氨基酸1-236)在表1中显示为SEQ ID NO：2。人类Hsp90β的N-末端结构域的序列(氨基酸 1-233)在表1中显示为SEQ ID NO：3。人类TRAP-1的全长序列在表1中显示为SEQ ID NO：4。显示结合位点1和结合位点2的氨基酸的大概位置的简单二维示意图显示于图2f 中。结合位点1至少衬有SEQID NO：1的氨基酸Ile247、Val211、Phe199、Met154和Leu163。结合位点1还可包括SEQ IDNO：1的氨基酸Leu159、Trp223和Tyr200(未显示)。值得注意的是，配体(例如，ATP或小分子抑制剂)与构成结合位点1的氨基酸的相互作用在 Hsp90α、Hsp90β和Trap-1中保守。结合位点2衬有SEQ ID NO：1的氨基酸Phe195、Gly198、 Val209、Ala202、Phe203、Leu104和Leu249。结合位点2的由等效保守残基构成的类似腔还存于其它Grp94同种同源物中，但到结合位点2的通路在Hsp90α和Hsp90β中被 Phe138阻断，且在Trap-1中被Phe205阻断。因此，SEQ IDNO：1的结合位点2是Grp94 特异性结合位点。将结合Grp94的PU-H54的疏水性X2-Ar插入此新揭示的非极性结合位点2中且产生与其至少5个残基的稳定化接触。在图2f中，残基Leu159、Tyr200和 Trp223(以三角形标记)不与本揭示内容的Grp94选择性抑制剂相互作用。然而，这些残基能够与泛-Hsp90抑制剂(例如，PU-H71)相互作用。值得注意的是，残基Asp149、Asn107、 Thr245、Ala111、Gly153、Ala108和Lys 114(图2f)在所有Hsp90同种同源物中都保守。因此，泛-Hsp90抑制剂和本揭示内容的选择性Grp94抑制剂的嘌呤部分与这些残基相互作用。
表1：人类Hsp90同种同源物的序列
Figure GDA0002463350460000181
Figure GDA0002463350460000191
5.2赋予Grp94选择性的配体特性
接下来分析在附接到嘌呤-架构时赋予Grp94特异性结合的官能团。在紧密检查时，可将Grp94选择性抑制剂分类成两个结构亚型：Ar-X2依赖性和X3依赖性(图1a和图4a)。在Ar-X2依赖性亚型中，鉴别对Grp94(图1b)具有高结合亲和性并且还具有对Grp94相对于Hsp90α/β和Trap-1的显著选择性(大于100倍)的化合物。能量最小化指示，这些化合物的子集甚至在未结合状态下也偏好反向弯曲构象。另外，观察到Grp94选择性结合位点中疏水性取代基的优先存在。这些取代基容许有利地接近Grp94的结合位点2和结合位点1(参见图2f)的侧链。这些匹配疏水性相互作用提供这些基团在Grp94选择性配体上优先存在的理论依据。值得注意的是，由于与若干袋残基(图4c，上图)的不利相互作用，Hsp90α/β和Trap-1同种同源物不能适应这些衍生物。
在X3依赖性亚型中，在N9烷基链的C1’位存在甲基也可产生对Grp94的选择性为对Hsp90α/β和Trap-1的选择性10倍以上的化合物。分子建模指示，C1’甲基有利于将 8-芳基环置于反向弯曲构象中，从而导致结合到Grp94的位点2(图4b，下图)。与上述 Ar-X2依赖性亚型相反，这些化合物对Grp94的亲和性不高(60-90μM)，这反映X2-取代基(即三甲氧基)的较小疏水性特性。Hsp90α/β和Trap-1无法适应这些抑制剂，可能是由于C1’甲基与8-芳基环上的取代基之间和配体与若干袋残基(图4c，下图)之间的不利相互作用所致。
因此，在嘌呤-架构系列中，相对于其它Hsp90同种同源物对Grp94具有2log选择性和有利的亲和性限于那些偏爱或可适应“反向”构象且特征为在上述构型中的2’、3’、 4’和/或5’位上具有疏水性取代基的芳基环的化合物。两种特性预示配体与Grp94的位点 2的有利相互作用。
基于上文，基于其适应“反向”构象和产生与Grp94的氨基酸衬里结合位点1和结合位点2的有利疏水性接触的能力来鉴别具有基于嘌呤的架构的新颖Grp94抑制剂。因此，在一个方面中，本揭示内容提供展现对Grp94的亲和性且因此能够抑制Grp94的生物活性的新颖化合物。在一些实施例中，Grp94抑制剂与构成Grp94 NTD的结合位点1 和结合位点2的6个或更多个氨基酸相互作用。在具体实施例中，本揭示内容的Grp94 抑制剂可与构成Grp94NTD的结合位点1和结合位点2的6、7、8、9、10、11或12个氨基酸相互作用。在其它实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂与6个或更多个选自以下的氨基酸相互作用：SEQ ID NO：1的Phe195、Gly198、Val209、Ala202、Ile247、Leu249、 Phe203、Leu104、Val211、Phe199、Met154和Leu163。例如，本揭示内容的Grp94抑制剂可与6、7、8、9、10、11或12个选自以下的氨基酸相互作用：SEQ ID NO.1的Phe195、Gly198、Val209、Ala202、Ile247、Leu249、Phe203、Leu104、Val211、Phe199、Met154 和Leu163。
在具体实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂能够与Grp94 NTD的结合位点2(即，Grp94选择性结合位点)中的3个或更多个氨基酸相互作用。例如，Grp94抑制剂可与Grp94NTD的结合位点2的3、4、5、6或7个氨基酸相互作用。在一些所述实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂能够与3个或更多个选自以下的氨基酸相互作用：SEQ ID NO：1 的Phe195、Gly198、Val209、Ala202、Leu104、Leu249和Phe203。例如，本揭示内容的Grp94抑制剂可与3、4、5、6或7个选自以下的氨基酸相互作用：SEQ ID NO：1的 Phe195、Gly198、Val209、Ala202、Leu104、Leu249和Phe203。
在一些实施例中，本揭示内容的Grp94选择性抑制剂能够与SEQ ID NO：1的氨基酸Ala202、Leu104和Leu249相互作用。在其它实施例中，本揭示内容的Grp94选择性抑制剂能够与SEQ ID NO：1的氨基酸Gly198、Val209、Ala202、Leu249和Phe203相互作用。在其它实施例中，本揭示内容的Grp94选择性抑制剂能够与SEQ ID NO：1的氨基酸 Phe195、Val209、Ala202相互作用。在其它实施例中，本揭示内容的Grp94选择性抑制剂能够与SEQ ID NO：1的氨基酸Leu104、Val209、Ala202相互作用。在其它实施例中，本揭示内容的Grp94选择性抑制剂能够与SEQ ID NO：1的氨基酸Phe195、Leu249和 Leu104相互作用。在其它实施例中，本揭示内容的Grp94选择性抑制剂能够与SEQ ID NO：1的氨基酸Phe195、Gly198和Val209相互作用。在其它实施例中，本揭示内容的 Grp94选择性抑制剂能够与SEQ ID NO：1的氨基酸Leu104、Leu249和Phe203相互作用。
5.3具有基于嘌呤的架构的Grp94抑制剂
在一个方面中，本揭示内容提供具有嘌呤相关架构(例如，稠合氨基吡啶化合物)的选择性Grp94抑制剂。在一些实施例中，Grp94抑制剂是腺嘌呤架构抑制剂。在一些实施例中，Grp94抑制剂是腺嘌呤架构抑制剂。
在具体实施例中，嘌呤-架构(例如，腺嘌呤-架构)抑制剂可在8位经键结到芳基或杂芳基的连接体基团取代。例如，键结到嘌呤环的8位的取代基可为芳基硫基、芳基硫氧基、芳基磺酰基、苄基、苯氨基、芳基羰基或苯氧基。在一些所述实施例中，嘌呤环的 8位的芳基或杂芳基与构成SEQ ID NO：1的结合位点1和结合位点2的氨基酸相互作用。例如，嘌呤环的8位的芳基或杂芳基可与6、7、8、9、10、11或12个选自以下的氨基酸相互作用：SEQ ID NO.1的Phe195、Gly198、Val209、Ala202、Ile247、Leu249、Phe203、 Leu104、Val211、Phe199、Met154和Leu163。在其它实施例中，嘌呤环的8位的芳基或杂芳基可与3、4、5、6或7个选自以下的氨基酸相互作用：SEQ ID NO：1的Phe195、Gly198、Val209、Ala202、Ile247、Leu249和Phe203。本揭示内容的嘌呤-架构Grp94抑制剂的嘌呤部分通常与在所有Hsp90同种同源物中保守的氨基酸相互作用。例如，嘌呤部分可与SEQ ID NO：1的Asp149、Thr245、Ala111、Gly153、Lys114、Ala108和Asn107 形成有利的相互作用。
由于负责配体与Grp94受体结合的分子间相互作用的疏水性质，研发具有所需细胞渗透性水平的水溶性抑制剂提出挑战。令人惊讶地，已发现通过嘌呤架构的N-9或N-3 位的官能团的规范修饰，可研发保留其相对于其它Hsp90同种同源物对Grp94的高选择性的水溶性抑制剂。因此，在具体实施例中，本揭示内容的嘌呤-架构Grp94抑制剂具有水溶性。例如，在中性pH和环境温度下，本揭示内容的嘌呤-架构抑制剂的水溶解度可大于0.5mg/mL。例如，在环境温度下在蒸馏水中，本揭示内容的嘌呤-架构抑制剂的水溶解度可大于0.5mg/mL、大于1mg/mL、大于2mg/mL、大于1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、大于4mg/mL、大于5mg/mL、大于6mg/mL、大于10mg/mL、大于15mg/mL、大于 20mg/mL、大于25mg/mL、大于30mg/mL、大于40mg/mL或大于50mg/mL。
在本揭示内容的Grp94抑制剂仅微溶或不溶的实施例中，可在增加其溶解性的媒剂中调配抑制剂。例如，本揭示内容的Grp94抑制剂可在囊泡、具体来说脂质体中递送。
在所有本发明化合物中，化合物可如所绘示或呈其医药上可接受的盐形式。在一个实施例中，医药上可接受的盐是盐酸盐、磷酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、酒石酸盐、乳糖酸盐、琥珀酸盐或延胡索酸盐。在另一实施例中，医药上可接受的盐是盐酸盐或硫酸盐。在另一实施例中，医药上可接受的盐是盐酸盐。在另一实施例中，医药上可接受的盐是硫酸盐。在另一实施例中，医药上可接受的盐是磷酸盐。
在X1、X2、X3、X4、X5、X6、Y、Q、Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、R1、R2、 R3、R4、R7和R8的命名选择中，名称是指直接附接到中心结构的基团的类型，所述基团可包括额外官能团。因此，“烷基”是指直链、环状或具支链饱和烃，例如具有1到10 个碳原子的烃，其中直接附接到中心结构的原子是碳原子。所述烷基可包括除氢外的取代基，例如含氧基团，包括但不限于羟基和烷氧基；卤素；含氮基团，包括但不限于氨基、酰胺基和烷基氨基；芳基；含硫基团，包括但不限于硫烷基；和/或非芳族环状基团，包括杂环和碳环。这些取代基中的碳原子可在不背离本发明的情况下将烷基中的碳原子总数增加到10以上。除非上下文明确相反，否则在说明书和其权利要求书中提到的所有烷基都涵盖经取代和未经取代的烷基。
如本文所用，“脂族”或“脂族基团”意指完全饱和或含有一或多个不饱和单元的直链(即，无支链)或具支链的经取代或未经取代的烃链，或完全饱和或含有一或多个不饱和单元的单环烃或二环烃，但其并非芳族(在本文中还称作“碳环”、“碳环状”、“环脂族”或“环烷基”)且具有附接到分子其余部分的单一点。除非另外指定，否则脂族基团含有1-6个脂族碳原子。在一些实施例中，脂族基团含有1-5个脂族碳原子。在其它实施例中，脂族基团含有1-4个脂族碳原子。在其它实施例中，脂族基团含有1-3个脂族碳原子，并且在其它实施例中，脂族基团含有1-2个脂族碳原子。在一些实施例中，“碳环状”(或“环脂族”或“碳环”或“环烷基”)是指完全饱和或含有一或多个不饱和单元的单环C3-C8烃，但其并非芳族且具有附接到分子其余部分的单一点。适宜脂族基团包括(但不限于)直链或具支链的经取代或未经取代的烷基、烯基、炔基和其杂合物，例如 (环烷基)烷基、(环烯基)烷基或(环烷基)烯基。
“烯基”是指直链、环状或具支链烃，例如具有1到10个碳原子和至少一个双键的烃，其中直接附接到中心结构的原子是碳原子。烯基可包括上文针对烷基所提到的取代基中的任一者。除非上下文明确相反，否则在说明书和其权利要求书中提到的所有烯基都涵盖经取代和未经取代的烯基。
“炔基”是指直链、环状或具支链烃，例如具有1到10个碳原子和至少一个三键的烃，其中直接附接到中心结构的原子是碳原子。炔基可包括上文针对烷基提到的取代基中的任一者。除非上下文明确相反，否则在说明书和其权利要求书中提到的所有炔基都涵盖经取代和未经取代的炔基。
“芳基”是指衍生自简单芳族环的任一基团。芳基包括杂芳基。芳基氧基取代基是经由氧原子连接到中心结构的芳基。芳基可包括上文针对烷基提到的取代基中的任一者，并且另外，芳基可包括烷基、烯基或炔基。除非上下文明确相反，否则在说明书和其权利要求书中提到的所有芳基都涵盖经取代和未经取代的芳基。
“芳基烷基”是指氢原子经芳基置换的烷基。所述基团包括(但不限于)苄基、肉桂基和二氢肉桂基。
“氨基”是指由通过单键附接到碳或氢原子的氮组成的任何基团。在某些情形下，氨基氮直接键结到中心结构。在其它情形下，氨基可为基团上或基团内的取代基，且氨基氮是经由一或多个插入原子附接到中心结构。氨基的实例包括NH2、烷基氨基、烯基氨基和含N非芳族杂环部分(即，环状氨)。氨基可经取代或未经取代。除非上下文明确相反，否则在说明书和其权利要求书中提到的所有氨基都涵盖经取代和未经取代的氨基。
“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
“杂环”基团是指在环结构内含有至少一个碳原子和至少一个非碳元素原子(例如硫、氧或氮)的部分。这些杂环基团可为芳族环或饱和和不饱和非芳族环。杂环基团可经取代或未经取代。除非上下文明确相反，否则在说明书和权利要求书中提到的所有杂环基团都涵盖经取代和未经取代的杂环基团。
“-(C3-C8)环烷基”是指具有3、4、5、6、7、或8个碳原子的饱和单环烃。代表性 (C3-C8)环烷基包括-环丙基、-环丁基、-环戊基、-环己基、-环庚基和-环辛基。
“-(C3-C8)杂环烷基”是指具有3、4、5、6、7个碳原子和一个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的饱和单环烃。
“-(5或6元)杂芳基”是指5或6元单环芳族杂环，即包含至少一个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的单环芳族环。在一个实施例中，-(5或6元)杂芳基环含有至少一个碳原子。代表性-(5或6元)杂芳基包括吡啶基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、咪唑基、噻唑基、异噁唑基、1，2，3-噁二唑基、1，3，4-噁二唑基、1，2，5-噁二唑基、1，2，3-三唑基、吡唑基、异噻唑基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、1，2，3-噻二唑基、1，3，4-噻二唑基、1，2，5-噻二唑基、 1，3，5-三嗪基和噻吩基。
如本文所用术语“可检测部分”可与术语“标记”和“报告基因”互换使用，且是指能够检测到的任何部分，例如一级标记和二级标记。可使用用于定量(以绝对、近似或相对方式)所研究系统中的可检测部分的方法来测量可检测部分的存在。在一些实施例中，所述方法已为所属领域技术人员所熟知且包括定量报告基因部分(例如，标记、染料、光交联剂、细胞毒性化合物、药物、亲和性标记、光亲和性标记、反应性化合物、抗体或抗体片段、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含有金属的部分、放射性部分、量子点、新颖官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光捕获部分、光化辐射兴奋部分、配体、光可异构化部分、生物素、生物素类似物(例如，生物素亚砜)、纳入重原子的部分、化学可裂解基团、光可裂解基团、氧化还原活性剂、同位素标记的部分、生物物理探针、发磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、嵌入基团、生色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记和上述的任何组合)的任何方法。
一级标记(例如放射性同位素(例如，氚、32P、33P、35S、14C、123I、124I、125I或131I)、质量标签(包括但不限于稳定同位素(例如，13C、2H、17O、18O、15N、19F和127I)、正电子发射同位素(例如，11C、18F、13N、124I和15O)和荧光标记)是不经进一步修饰即可检测到的信号生成报告基因基团。可通过包括但不限于以下的方法来分析可检测部分：荧光、正电子发射断层扫描、SPECT医疗成像、化学发光、电子自旋共振、紫外光/可见光吸光度光谱、质谱、核磁共振、磁共振、流式细胞术、放射自显影、闪烁计数、光成像和电化学方法。
如本文所用术语“二级标记”是指可检测信号的产生需要第二中间体存在的部分，例如生物素和各种蛋白质抗原。对于生物素，二级中间体可包括链霉抗生物素-酶结合物。对于抗原标记，二级中间体可包括抗体-酶结合物。一些荧光基团用作二级标记，这是因为其在非放射性荧光共振能量转移(FRET)的过程中将能量转移到另一基团，并且第二基团产生检测信号。
如本文所用术语“荧光标记”、“荧光染料”和“荧光团”是指吸收所界定激发波长的光能且发射不同波长的光能的部分。荧光标记的实例包括(但不限于)Alexa Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor568、 Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660和Alexa Fluor 680)、AMCA、AMCA-S、 BODIPY染料(BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY TR、BODIPY 493/503、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/59l、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665)、羧基罗丹明6G(Carboxyrhodamine 6G)、羧基-X- 罗丹明(ROX)、瀑布蓝(Cascade Blue)、瀑布黄、香豆素343、Cya9染料(Cy3、Cy5、Cy3.5、 Cy5.5)、丹酰(Dansyl)、Dapoxyl、二烷基氨基香豆素、4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基-荧光素、 DM-NERF、曙红(Eosin)、赤藓红、荧光素、FAM、羟基香豆素、IR染料(IRD40、IRD 700、 IRD 800)、JOE、丽丝氨罗丹明B(Lissamine rhodamine B)、玛丽娜蓝(Marina Blue)、甲氧基香豆素、萘荧光素、俄勒冈绿(Oregon Green)488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝(PacificBlue)、PyMPO、芘、罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明绿、罗丹明红、对甲氨基酚绿(Rhodol格林)、2′，4′，5′，7′-四-溴砜-荧光素、四甲基-罗丹明(TMR)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、德克萨斯红(Texas Red)、德克萨斯红-X、5(6)-羧基荧光素、2，7-二氯荧光素、N，N-双(2，4，6-三甲基苯基)-3，4：9，10-苝双(二甲酰亚胺、HPTS、乙曙红、DY-490XL 梅咖斯图克(MegaStoke)、DY-485XL梅咖斯图克、亚迪隆达克绿520(Adirondack Green 520)、ATTO 465、ATTO 488、ATTO 495、YOYO-1，5-FAM、BCECF、二氯荧光素、罗丹明110、罗丹明123、YO-PRO-1、SYTOX绿、钠绿(Sodium Green)、SYBR绿I、Alexa Fluor 500、FITC、Fluo-3、Fluo-4、氟-祖母绿、YoYo-1 ssDNA、YoYo-1 dsDNA、YoYo-1、 SYTO RNASelect、迪福沙绿(Diversa Green)-FP、龙绿(Dragon Green)、艾娃绿(EvaGreen)、湖水绿EX(Surf Green EX)、光谱绿(SpectrumGreen)、尼如果特拉斯500525(NeuroTrace 500525)、NBD-X、MitoTracker绿FM、LysoTracker Green DND-26、CBQCA、PA-GFP(活化后)、WEGFP(活化后)、FlASH-CCXXCC、阿扎米绿单体(Azami Green monomeric)、阿扎米绿、绿荧光蛋白质(GFP)、EGFP(坎贝尔Tsien2003)、EGFP(Patterson 2001)、枫绿 (Kaede Green)、7-苄基氨基-4-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑、Bexl、多柔比星(Doxorubicin)、卢米奥绿(Lumio Green)和SuperGlo GFP。
除非另有说明，否则本文中绘示的结构还打算包括结构的所有异构体(例如、对映异构体、非对映异构体和几何(或构象))形式；例如，每一不对称中心的R和S构型，Z和 E双键异构体，以及Z和E构象异构体。因此，本发明化合物的单一立体化学异构体以及对映异构体、非对映异构体和几何(或构象)混合物在本发明范畴内。除非另有说明，否则本发明化合物的所有互变异构体形式都在本发明范畴内。另外，除非另有说明，否则本文绘示的结构还打算包括差异仅为存在一或多个同位素富集原子的化合物。例如，包括用氘或氚置换氢或用13C-或14C富集碳置换碳的具有本结构的化合物在本发明范畴内。根据本发明，所述化合物可用作(例如)分析工具、生物分析中的探针或治疗剂。
在本发明的化合物中，所有原子都具有足够氢或非氢取代基以满足化合价，或化合物包括医药上可接受的抗衡离子，例如在季胺情形下。
5.3.1式(I)的Grp94抑制剂
在一个方面中，本揭示内容涵盖在8位经键结到芳基或杂芳基的连接体基团取代且在N-9位进一步经取代的嘌呤-架构化合物。所述化合物是以式(I)示意性表示：
Figure GDA0002463350460000261
或其医药上可接受的盐，其中：
(a)Y是-C(RY)2-、-S-、-NR-、-O-、
Figure GDA0002463350460000262
(b)Z1和Z3各自独立地是-CH-或-N-；
(c)Z2是-N-或-CR10-，其中R10是H或未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基；
(d)Z4、Z5、Z6、Z7和Z8各自独立地是-C-或-N-，前提是Z4、Z6和Z7中的至少一者是-C-且Z4到Z8没有3个连续N；
(e)X1是-H、-卤基、-N(R)2、-OR、-CN或未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基；
(f)X2、X3、X4、X5和X6各自独立地是-H、-卤基、-SR、-N(R)2、-OR、-CN、-NO2、 -CN、-C(O)R、-C(O)2R、-S(O)R、-S(O)2R、-C(O)N(R)2、-SO2N(R)2、-OC(O)R、-N(R)C(O)R、-N(R)SO2R、-OC(O)N(R)2、未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基或未经取代或经取代的选自(5或6元)芳基、(5或6元)芳基烷基和(5或6元)杂环芳族或杂环非芳族基团的基团；前提是X2、X4和X5中的至少一者是-H且在Z4是-N-时X2不存在，在Z5是-N-时X3不存在，在Z6是-N-时X4不存在且在Z7是-N-时X5不存在；
(g)R1是-(C1-C6)脂族基-N+-(R2)(R3)(R4)、-(C1-C6)脂族基-N-R3R4、-(C1-C6)脂族基 -C(＝O)N-R3R4、-(C1-C6)脂族基-R3R4、-(C1-C6)脂族基-R2R3R4、-(C1-C6)脂族基-N-CR2R3R4、 -(C1-C6)脂族基-C(卤基)3、-(C1-C6)脂族基-烯基、-(C1-C6)脂族基-炔基、-(C1-C6)脂族基 -(C3-C8)环烷基、-(C1-C6)脂族基-(C3-C8)杂环基、-(C1-C6)脂族基-苯基、-(C1-C6)脂族基-(5 或6元)杂芳基、-(C1-C6)脂族基-氰基，其中环烷基、杂环基、杂芳基或苯基未经取代或经取代，前提是在所有R2-R4都存在时，所述化合物进一步包含医药上可接受的抗衡离子；
(h)R2和R3独立地是氢、-N(R)2、-CH2CH(OH)R4、-CH(OH)CH2R4、-CH2SO2NHR4、 -CH2NHSO2R4或未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基，或R3和R4在与其附接的氮一起时形成未经取代或经取代的3到7元杂环；
(i)R4是氢、卤素或未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基；
(j)每一RY独立地是R、-OR或卤基；
(k)Z3可与X2环化以形成环状芳基、杂芳基、烷基或杂烷基环；且
(l)每一R独立地是氢、未经取代的C1-6脂族基或经卤基、-OH、-CN或-NH2取代的C1-6脂族基；
其中每一经取代的基团都经一或多个选自以下的基团取代：卤基、-N(R)2、-OR、-CN、氧代基、未经取代的C1-6脂族基或经卤基、-OH、-CN或-NH2取代的C1-6脂族基。
在一些实施例中，定义式(I)化合物或其医药上可接受的盐，其中：
(a)Y是-CH2-、-S-、-NH-、-O-、
Figure GDA0002463350460000271
(b)Z1和Z3各自独立地是-CH-或-N-；
(c)Z2是-CH-、-N-或-CR10-，其中R10是-(C1-C6)烷基；
(d)Z4、Z5、Z6、Z7和Z8各自独立地是-C-或-N-，前提是Z4、Z6和Z7中的至少一者是-C-且Z4到Z8没有3个连续N；
(e)X1是-H、-卤基、-NH2、-CN、-(C1-C6)烷基、-O(C1-C6)烷基、-CH2OH、-C(卤基)3、 -CH(卤基)2、-CH2(卤基)、-OC(卤基)3、-OCH(卤基)2或-OCH2(卤基)；
(f)X2、X3、X4和X5各自独立地是-H、-卤基、-NH2、-CN、-(C1-C6)烷基、-O(C1-C6) 烷基、-CH2OH、-C(卤基)3、-CH(卤基)2、-CH2(卤基)、-OC(卤基)3、-OCH(卤基)2、-OCH2(卤基)或选自以下的未经取代或经取代的(5-或6元)芳基、杂环芳族或非芳族基团：吡啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、咪唑基、苯基、苄基、噻唑烷基、噻二唑基、噻唑基、异噁唑基、吡唑基、异噻唑基、哒嗪基、嘧啶基、三嗪基、吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、2，3-二氢呋喃基、二氢吡啶基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基或四氢硫吡喃基，前提是X2、X4和X5中的至少一者是-H且在Z4是-N-时X2不存在，在Z5是-N-时X3不存在，在Z6是-N-时X4不存在且在Z7是-N-时X5不存在；
(g)X6在Z8是-C-时是-H，或在Z8是-N-时不存在；
(h)R1是-(CH2)m-N+-(R2)(R3)(R4)、-(CH2)m-N-R3R4、-(CH2)m-C(＝O)N-R3R4、 -(CH2)m-R3R4、-(CH2)m-C(卤基)3、-(CH2)m-烯基、-(CH2)m-烯基-CH3、-(CH2)m-炔基、-(CH2)m-炔基-CH3、-(CH2)m-(C3-C8)环烷基、-(CH2)m-(C3-C8)杂环烷基、-(CH2)m-苯基、-(CH2)m-(5 或6元)杂芳基、-(CH2)m-氰基，其中m是1、2、3、4或5且其中环烷基、杂环或苯基未经取代或经一或多个X1基团取代，前提是在所有R2-R4都存在时，所述化合物进一步包含医药上可接受的抗衡离子；
(i)R2和R3独立地是氢、甲基、乙基、乙烯基、乙炔基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、环丙基、叔丁基、异丁基、-C(卤基)3、-CH(卤基)2、-CH2(卤基)、-CH2C(卤基)3、 -CH2CH(卤基)2、-CH2CH2(卤基)、-NHCH2C(卤基)3、-CH2CH(卤基)2、-CH2CH2(卤基)、 -CH2OH、-CH2CH2OH、-CH2C(CH3)2OH、-CH2CH(CH3)OH、-C(CH3)2CH2OH、 -CH2CH(OH)R4、-CH2SO2NHR4、-CH2SO2NHR4，或R2和R3在与其附接的氮一起时形成未经取代或经取代的氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯烷、哌嗪或哌啶环；
(j)R4是氢、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、异丁基或-C(卤基)3；且
(k)Z3可与X2环化以形成环状芳基、杂芳基、烷基或杂烷基环。
在一个实施例中，Z1、Z2和Z3是-N-。在另一实施例中，Z1和Z3是-N-且Z2是-CH-。在另一实施例中，Z1是-CH-且Z2和Z3是-N-。
在另一实施例中，Z4、Z5、Z6、Z7和Z8是-C-。在另一实施例中，Z4是-N-且Z5、Z6、 Z7和Z8是-C-。在另一实施例中，Z5是-N-且Z4、Z6、Z7和Z8是-C-。在另一实施例中， Z6是-N-且Z4、Z5、Z7和Z8是-C-。在另一实施例中，Z7是-N-且Z4、Z5、Z6和Z8是-C-。在另一实施例中，Z8是-N-且Z4、Z5、Z6和Z7是-C-。在另一实施例中，Z7和Z4是-N-且 Z5、Z6和Z8是-C-。在另一实施例中，Z5和Z8是-N-且Z4、Z6和Z7是-C-。
在另一实施例中，Y是-S-、-CH2-或
Figure GDA0002463350460000281
在另一实施例中，Y是S或
Figure GDA0002463350460000282
在另一实施例中，Y是-S-或-CH2-。在另一实施例中，Y是-S-或-O-。在另一实施例中，Y 是-S-。在另一实施例中，Y是-CH2-。在另一实施例中，Y是
Figure GDA0002463350460000291
在一些实施例中， Y是-C(RY)2-，其中每一RY独立地是氢、-OH或卤基。
在某些实施例中，R1是-(CH2)m-N-(R3)(R4)。在一个所述实施例中，R1是 -(CH2)2-N-(R3)(R4)。在另一所述实施例中，R1是-(CH2)3-N-(R3)(R4)。在另一所述实施例中，R1是-(CH2)2-N-(R3)(R4)，R3是-H且R4是异丙基或异丁基。在另一所述实施例中， R1是-(CH2)3-N-(R3)(R4)，R3是-H且R4是异丙基或异丁基。在另一所述实施例中，R1是 -(CH2)3-N-(R3)(R4)，R3是-H且R4是异丁基。在另一所述实施例中，R1是-(CH2)3-N-(R3)(R4)， R3是-H且R4是异丙基。应了解，在这些实施例中，胺官能团可以游离碱形式或以酸加成盐形式存在。酸加成盐可通过加成适宜酸制得，如业内充分了解。在具体实施例中，酸加成盐可为盐酸盐、磷酸盐、硫酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐或延胡索酸盐。在另一实施例中，酸加成盐是盐酸盐或硫酸盐。在另一实施例中，酸加成盐是盐酸盐。在另一实施例中，酸加成盐是硫酸盐。在另一实施例中，酸加成盐是磷酸盐。在制备为酸加成盐时，使得嘌呤-架构抑制剂具有水溶性。甚至可通过产生较高阶盐、尤其二盐进一步增加溶解性。例如，在Z1是-N-的实施例中，氮可离子化且可在强酸性条件(例如，pH小于3)下转化成酸加成盐。因此，本揭示内容的Grp94 抑制剂(其中Z1是-N-且R1基团含有胺官能团)可转化成二盐。在某些实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂可呈二-HCl盐形式。
在一些实施例中，R2和R3独立地是氢、甲基、乙基、乙烯基、乙炔基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、环丙基、叔丁基、异丁基、-C(卤基)3、-CH(卤基)2、-CH2(卤基)、 -CH2C(卤基)3、-CH2CH(卤基)2、-CH2CH2(卤基)、-NHCH2C(卤基)3、-CH2CH(卤基)2、 -CH2CH2(卤基)、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH2C(CH3)2OH、-CH2CH(CH3)OH、-C(CH3)2CH2OH、-CH(CH3)-CH2OH、-CH(CH3)CH(OH)R4、-CH2CH(OH)R4、-CH2SO2NHR4、 -CH2NHSO2R4，或R2和R3在与其附接的氮一起时形成未经取代或经取代的氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯烷、哌嗪或哌啶环。
在一些实施例中，R3和R4在与其附接的氮一起时形成未经取代或经取代的3到7元杂环。在一些实施例中，R2和R3在与其附接的氮一起时形成未经取代或经取代的3到7 元杂环。
在某些实施例中，R1是-(CH2)m-CF3。在一个所述实施例中，R1是-(CH2)3-CF3。在另一所述实施例中，R1是-(CH2)4-CF3。
在一些实施例中，R1是-(C1-C6)脂族基-炔基。在一些实施例中，R1是-(CH2)3CCH。
在一些实施例中，R1是-(C1-C6)脂族基-R3R4。
在一些实施例中，R1是-(C1-C6)脂族基-苯基。在一些实施例中，R1是-(C1-C6)脂族基 -杂芳基。在一些实施例中，R1是-(C1-C6)脂族基-杂环基。
在一些实施例中，R1是-(CH2)m-NHR2。
在某些实施例中，R1是-(CH2)m-C(＝O)N-(R3)(R4)。在一个所述实施例中，R1是 -(CH2)3-C(＝O)NH2。在另一所述实施例中，R1是(CH2)4-C(＝O)NH2。在另一所述实施例中，R1是(CH2)5-C(＝O)NH2。
在另一实施例中，X1是-H。在另一实施例中，X1是卤素原子。在另一实施例中，X1是-F。在另一实施例中，X1是-Cl。
在另一实施例中，X2是卤素原子-OCH3或-OCF3且X3、X4、X5和X6是-H。在另一实施例中，X2是-C1且X3、X4、X5和X6是-H。在另一实施例中，X2是-OCH3且X3、 X4、X5和X6是-H。在另一实施例中，X2是-OCF3且X3、X4、X5和X6是-H。
在另一实施例中，X4是卤素原子且X2、X3、X5和X6是-H。在另一实施例中，X4是-C1且X2、X3、X5和X6是-H。在另一实施例中，X4是-OCH3且X2、X3、X5和X6是 -H。在另一实施例中，X4是-OCF3且X2、X3、X5和X6是-H。
在一些实施例中，X2、X3和X5是卤素且X4和X6是氢。在一些实施例中，X2、X3和X4是卤素且X5和X6是氢。在一些实施例中，X2、X3和X5是卤素且X4和X6是氢。在一些实施例中，X3、X4和X5是卤素且X2和X6是氢。
在一些实施例中，X2、X4和X6是甲基且X3和X5是氢。
在某些实施例中，Z4和Z6是-C-，X2和X4独立地选自-H、-卤基、-(C1-C3)烷基和 -O(C1-C3)烷基且Z5、Z7和Z8是未经取代的碳或氮原子。在一个所述实施例中，X2和X4中的至少一者是-卤基。在另一所述实施例中，X2和X4二者都为-Cl。在另一所述实施例中，X2和X4中的至少一者是烷基。在另一所述实施例中，X2和X4二者都为-CH3。在另一所述实施例中，X2和X4中的至少一者是-OCH3。在另一所述实施例中，X2和X4中的至少一者是-CF3。
在某些实施例中，Z4和Z7是-C-，X2和X5独立地选自-H、-卤基、-(C1-C3)烷基和 -O(C1-C3)烷基且Z5、Z6和Z8是未经取代的碳或氮原子。在一个所述实施例中，X2和X5中的至少一者是卤素原子。在另一所述实施例中，X2和X5二者都为-Cl。在另一所述实施例中，X2和X4中的至少一者是烷基。在另一所述实施例中，X2和X5二者都为-CH3。在另一所述实施例中，X2和X4中的至少一者是-CF3。
在某些实施例中，Z5和Z7是-C-，X3和X5独立地选自-H、-卤基、-(C1-C3)烷基、-O(C1-C3) 烷基、未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基或未经取代或经取代的苯基，且Z4、Z6和Z8是未经取代的碳或氮原子。在一个所述实施例中，X3和X5中的至少一者是卤素原子。在另一所述实施例中，X3和X5二者都为-Cl。在另一所述实施例中，X3和X5中的至少一者是烷基。在另一所述实施例中，X3和X5二者都为-CH3。在另一所述实施例中，X3和X5中的至少一者是-CF3。
在一些实施例中，式(I)的Grp94抑制剂具有式(Ia)：
Figure GDA0002463350460000311
或其医药上可接受的盐，其中X1、Z2、R1、Y、X3和X5各自如上文所定义且单独和组合地描述于本文中的种类和亚类中。
在一些实施例中，式(I)的Grp94抑制剂具有式(Ib)：
Figure GDA0002463350460000312
或其医药上可接受的盐，其中R1如上文所定义，其中i)附接到环氮的-(C1-C6)脂族基团是-(CH2)3-或ii)m是3；且X1、Z2、Y、X2、X3、X4、X5和X6各自如上文所定义且单独和组合地描述于本文中的种类和亚类中。
在一些实施例中，式(I)Grp94抑制剂具有表2中的一个化学式，其中每一取代基如上文所定义且单独和组合地描述于本文中的种类和亚类中。
表2
Figure GDA0002463350460000313
Figure GDA0002463350460000321
Figure GDA0002463350460000331
Figure GDA0002463350460000341
Figure GDA0002463350460000351
Figure GDA0002463350460000361
Figure GDA0002463350460000371
Figure GDA0002463350460000381
Figure GDA0002463350460000391
Figure GDA0002463350460000401
Figure GDA0002463350460000411
Figure GDA0002463350460000421
式(I)的阐释性化合物列举于下表2A、2B、2C、2D和3中。
表2A
Figure GDA0002463350460000422
和其医药上可接受的盐，其中：
Figure GDA0002463350460000423
Figure GDA0002463350460000431
Figure GDA0002463350460000441
Figure GDA0002463350460000451
Figure GDA0002463350460000461
Figure GDA0002463350460000471
Figure GDA0002463350460000481
Figure GDA0002463350460000491
Figure GDA0002463350460000501
Figure GDA0002463350460000511
Figure GDA0002463350460000521
Figure GDA0002463350460000531
Figure GDA0002463350460000541
Figure GDA0002463350460000551
Figure GDA0002463350460000561
Figure GDA0002463350460000571
Figure GDA0002463350460000581
Figure GDA0002463350460000591
表2B
Figure GDA0002463350460000601
和其医药上可接受的盐，其中：
Figure GDA0002463350460000602
Figure GDA0002463350460000611
Figure GDA0002463350460000621
Figure GDA0002463350460000631
Figure GDA0002463350460000641
Figure GDA0002463350460000651
Figure GDA0002463350460000661
Figure GDA0002463350460000671
Figure GDA0002463350460000681
Figure GDA0002463350460000691
Figure GDA0002463350460000701
表2C
Figure GDA0002463350460000711
和其医药上可接受的盐，其中：
Figure GDA0002463350460000712
Figure GDA0002463350460000721
Figure GDA0002463350460000731
Figure GDA0002463350460000741
Figure GDA0002463350460000751
Figure GDA0002463350460000761
Figure GDA0002463350460000771
Figure GDA0002463350460000781
Figure GDA0002463350460000791
Figure GDA0002463350460000801
表2D
Figure GDA0002463350460000811
和其医药上可接受的盐，其中：
Figure GDA0002463350460000812
Figure GDA0002463350460000821
Figure GDA0002463350460000831
Figure GDA0002463350460000841
Figure GDA0002463350460000851
Figure GDA0002463350460000861
Figure GDA0002463350460000871
Figure GDA0002463350460000881
Figure GDA0002463350460000891
Figure GDA0002463350460000901
Figure GDA0002463350460000911
表3
Figure GDA0002463350460000921
和其医药上可接受的盐，其中：
Figure GDA0002463350460000922
Figure GDA0002463350460000931
Figure GDA0002463350460000941
Figure GDA0002463350460000951
Figure GDA0002463350460000961
Figure GDA0002463350460000971
Figure GDA0002463350460000981
Figure GDA0002463350460000991
Figure GDA0002463350460001001
Figure GDA0002463350460001011
Figure GDA0002463350460001021
Figure GDA0002463350460001031
Figure GDA0002463350460001041
Figure GDA0002463350460001051
Figure GDA0002463350460001061
Figure GDA0002463350460001071
Figure GDA0002463350460001081
Figure GDA0002463350460001091
5.3.2式(II)的Grp94抑制剂
在一个方面中，本揭示内容涵盖在8位经键结到2，4，6-三取代芳基的连接体基团取代且在N-9位进一步经取代的嘌呤-架构化合物。所述化合物是以式(II)示意性表示：
Figure GDA0002463350460001092
或其医药上可接受的盐，其中：
(a)Y是-C(RY)2-、-S-、-NR-、-O-、
Figure GDA0002463350460001093
(b)Z1和Z3各自独立地是-CH-或-N-；
(c)Z2是-N-或-CR10-，其中R10是H或未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基；
(d)X1是-H、-卤基、-N(R)2、-OR、-CN或未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基；
(e)X2、X4和X6各自独立地是-H、-卤基、-SR、-N(R)2、-OR、-CN、-NO2、-CN、 -C(O)R、-C(O)2R、-S(O)R、-S(O)2R、-C(O)N(R)2、-SO2N(R)2、-OC(O)R、-N(R)C(O)R、 -N(R)SO2R、-OC(O)N(R)2、未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基或未经取代或经取代的选自(5或6元)芳基、(5或6元)芳基烷基和(5或6元)杂环芳族或杂环非芳族基团的基团；
(f)R1是-(C1-C6)脂族基-N+-(R2)(R3)(R4)、-(C1-C6)脂族基-N-R3R4、-(C1-C6)脂族基 -C(＝O)N-R3R4、-(C1-C6)脂族基-R3R4、-(C1-C6)脂族基-R2R3R4、-(C1-C6)脂族基-N-CR2R3R4、 -(C1-C6)脂族基-C(卤基)3、-(C1-C6)脂族基-烯基、-(C1-C6)脂族基-炔基、-(C1-C6)脂族基 -(C3-C8)环烷基、-(C1-C6)脂族基-(C3-C8)杂环烷基、-(C1-C6)脂族基-苯基、-(C1-C6)脂族基 -(5或6元)杂芳基、-(C1-C6)脂族基-氰基，前提是在所有R2-R4都存在时，所述化合物进一步包含医药上可接受的抗衡离子；
(g)R2和R3独立地是氢、-N(R)2、-CH2CH(OH)R4、-CH(OH)CH2R4、-CH2SO2NHR4、 -CH2NHSO2R4或未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基，或R3和R4在与其附接的氮一起时形成未经取代或经取代的3到7元杂环；
(h)每一RY独立地是R、-OR或卤基；
(i)R4是氢、卤素或未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基；且
(j)每一R独立地是氢、未经取代的C1-6脂族基或经卤基、-OH、-CN或-NH2取代的C1-6脂族基；
其中每一经取代基团经一或多个选自以下的基团取代：卤基、-N(R)2、-OR、-CN、氧代基、未经取代的C1-6脂族基或经卤基、-OH、-CN或-NH2取代的C1-6脂族基。
在一些实施例中，定义式(II)化合物或其医药上可接受的盐，其中：
(a)Y是-CH2-、-S-、-NH-、-O-、
Figure GDA0002463350460001101
(b)Z1和Z3各自独立地是-CH-或-N-；
(c)Z2是-CH-、-N-或-CR10-，其中R10是-(C1-C6)烷基；
(d)X1是-H、-卤基、-NH2、-CN、-(C1-C6)烷基、-O(C1-C6)烷基、-CH2OH、-C(卤基)3、 -CH(卤基)2、-CH2(卤基)、-OC(卤基)3、-OCH(卤基)2或-OCH2(卤基)；
(e)X2、X4和X6各自独立地是-H、-卤基、-NH2、-CN、-(C1-C6)烷基、-O(C1-C6)烷基、-CH2OH、-C(卤基)3、-CH(卤基)2、-CH2(卤基)、-OC(卤基)3、-OCH(卤基)2、-OCH2(卤基)或选自以下的(5或6元)芳基、杂环芳族或非芳族基团：吡啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、咪唑基、苯基、苄基、噻唑烷基、噻二唑基、噻唑基、异噁唑基、吡唑基、异噻唑基、哒嗪基、嘧啶基、三嗪基、吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、2，3-二氢呋喃基、二氢吡啶基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基或四氢硫吡喃基；
(f)R1是-(CH2)m-N+-(R2)(R3)(R4)、-(CH2)m-N-R3R4、-(CH2)m-C(＝O)N-R3R4、 -(CH2)m-R3R4、-(CH2)m-C(卤基)3、-(CH2)m-烯基、-(CH2)m-烯基-CH3、-(CH2)m-炔基、-(CH2)m-炔基-CH3、-(CH2)m-(C3-C8)环烷基、-(CH2)m-(C3-C8)杂环烷基、-(CH2)m-苯基、-(CH2)m-(5 或6元)杂芳基、-(CH2)m-氰基，其中m是1、2、3、4或5且其中所述环烷基、杂环或苯基未经取代或经一或多个X1基团取代，前提是在所有R2-R4都存在时，所述化合物进一步包含医药上可接受的抗衡离子；
(g)R2和R3独立地是氢、甲基、乙基、乙烯基、乙炔基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、叔丁基、异丁基、-C(卤基)3、-CH(卤基)2、-CH2(卤基)、-CH2C(卤基)3、-CH2CH(卤基)2、-CH2CH2(卤基)、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH2C(CH3)2OH、-CH2CH(CH3)OH、 -C(CH3)2CH2OH、-CH(CH3)CH2OH、-CH(CH3)CH(OH)R4、-CH2CH(OH)R4、-CH2SO2NHR4、 -CH2SO2NHR4，或R2和R3在与其附接的氮一起时形成未经取代或经取代的氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯烷、哌嗪或哌啶环；且
(h)R4是氢、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、异丁基或-C(卤基)3。
在一个实施例中，Z1、Z2和Z3是-N-。在另一实施例中，Z1和Z3是-N-且Z2是-CH-。在另一实施例中，Z1是-CH-且Z2和Z3是-N-。
在另一实施例中，Y是-S-、-CH2-或
Figure GDA0002463350460001111
在另一实施例中，Y是S或
Figure GDA0002463350460001112
在另一实施例中，Y是-S-或-CH2-。在另一实施例中，Y是-S-或-O-。在另一实施例中，Y 是-S-。在另一实施例中，Y是-CH2-。在另一实施例中，Y是
Figure GDA0002463350460001113
在一些实施例中， Y是-C(RY)2-，其中每一RY独立地是氢、-OH或卤基。
在某一实施例中，R1是-(CH2)m-N-(R3)(R4)。在一个所述实施例中，R1是 -(CH2)2-N-(R3)(R4)。在另一所述实施例中，R1是-(CH2)3-N-(R3)(R4)。在另一所述实施例中，R1是-(CH2)2-N-(R3)(R4)，R3是H且R4是异丙基或异丁基。在另一所述实施例中， R1是-(CH2)2-N-(R3)(R4)，R3是-H且R4是异丙基。在另一所述实施例中，R1是 -(CH2)3-N-(R3)(R4)，R3是-H且R4是异丁基。在另一所述实施例中，R1是-(CH2)3-N-(R3)(R4)， R3是-H且R4是异丙基。应了解，在这些实施例中，胺官能团可以游离碱形式或以酸加成盐形式存在。酸加成盐可通过加成适宜酸制得，如业内充分了解。在具体实施例中，酸加成盐可为盐酸盐、磷酸盐、硫酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、甲磺酸盐、酒石酸盐、乳糖酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐或延胡索酸盐。在另一实施例中，酸加成盐是盐酸盐或硫酸盐。在另一实施例中，酸加成盐是盐酸盐。在另一实施例中，酸加成盐是硫酸盐。在另一实施例中，酸加成盐是磷酸盐。
在某些实施例中，R1是-(CH2)m-CF3。在一个所述实施例中，R1是-(CH2)3-CF3。在另一所述实施例中，R1是-(CH2)4-CF3。
在一些实施例中，R1是--(CH2)3-CCH。
在一些实施例中，R2或R3是-CH2NHSO2R4。
在一些实施例中，R2和R3独立地是氢、甲基、乙基、乙烯基、乙炔基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、叔丁基、异丁基、-C(卤基)3、-CH(卤基)2、-CH2(卤基)、-CH2C(卤基)3、-CH2CH(卤基)2、-CH2CH2(卤基)、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH2C(CH3)2OH、 -CH2CH(CH3)OH、-C(CH3)2CH2OH、-CH(CH3)CH2OH、-CH(CH3)CH(OH)R4、-CH2CH(OH)R4、-CH2SO2NHR4、-CH2NHSO2R4，或R2和R3在与其附接的氮一起时形成未经取代或经取代的氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯烷、哌嗪或哌啶环。
在其它实施例中，式(II)的Grp94抑制剂具有表4中的一个化学式，其中每一取代基如上文所定义且单独和组合地描述于本文中的种类和亚类中。
表4
Figure GDA0002463350460001121
Figure GDA0002463350460001131
式(II)的阐释性化合物列举于下表5中。
表5
Figure GDA0002463350460001141
和其医药上可接受的盐，其中：
Figure GDA0002463350460001142
Figure GDA0002463350460001151
Figure GDA0002463350460001161
Figure GDA0002463350460001171
Figure GDA0002463350460001181
Figure GDA0002463350460001191
Figure GDA0002463350460001201
5.3.3式(III)的Grp94抑制剂
在一个方面中，本揭示内容涵盖在8位经键结到二环基团的连接体基团取代且在N-9 位进一步经取代的嘌呤-架构化合物。所述化合物是以式(III)示意性表示：
Figure GDA0002463350460001202
或其医药上可接受的盐，其中：
(a)Y是-C(RY)2-、-S-、-NR-、-O-、
Figure GDA0002463350460001203
(b)Z1和Z3各自独立地是-CH-或-N-；
(c)Z2是-N-或-CR10-，其中R10是H或未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基；
(d)Z6、Z7和Z8各自独立地是-C-或-N-，前提是Z6到Z8中的至少一者是-C-；
(e)X1是-H、-卤基、-N(R)2、-OR、-CN或未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基；
(f)X4、X5和X6各自独立地是-H、-卤基、-SR、-N(R)2、-OR、-CN、-NO2、-CN、 -C(O)R、-C(O)2R、-S(O)R、-S(O)2R、-C(O)N(R)2、-SO2N(R)2、-OC(O)R、-N(R)C(O)R、 -N(R)SO2R、-OC(O)N(R)2、未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基或未经取代或经取代的选自(5或6元)芳基、(5或6元)芳基烷基和(5或6元)杂环芳族或杂环非芳族基团的基团；前提是在Z6是氮时X4不存在，在Z7是氮时X5不存在，并且在Z8是氮时X6不存在；
(g)R7是-(C1-C6)脂族基-N+-(R2)(R3)(R4)、-(C1-C6)脂族基-N-R3R4、-(C1-C6)脂族基 -C(＝O)N-R3R4、-(C1-C6)脂族基-R3R4、-(C1-C6)脂族基-R2R3R4、-(C1-C6)脂族基-N-CR2R3R4、 -(C1-C6)脂族基-C(卤基)3、-(C1-C6)脂族基-烯基、-(C1-C6)脂族基-炔基、-(C1-C6)脂族基-(C3-C8)环烷基、-(C1-C6)脂族基-(C3-C8)杂环烷基、-(C1-C6)脂族基-苯基、-(C1-C6)脂族基-(5或6元)杂芳基、-(C1-C6)脂族基-氰基，前提是在所有R2-R4都存在时，所述化合物进一步包含医药上可接受的抗衡离子；
(h)Q是稠合苯并基、稠合(5或6元)杂芳基、稠合4到7元环烷基环或稠合4到7 元非芳族杂环；
(i)R2和R3独立地是氢、-N(R)2、-CH2CH(OH)R4、-CH(OH)CH2R4、-CH2SO2NHR4、 -CH2NHSO2R4或未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基，或R3和R4在与其附接的氮一起时形成未经取代或经取代的3到7元杂环；
(j)R4是氢、卤素或未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基；
(k)每一R8独立地是-H、-卤基、-N(R)2、-OR、-CN或未经取代或经取代的选自-CH2-苯基或-(C1-C6)脂族基的基团；
(l)每一RY独立地是R、-OR或卤基；
(m)a是选自0、1和2的整数；且
(n)每一R独立地是氢、未经取代的C1-6脂族基或经卤基、-OH、-CN或-NH2取代的C1-6脂族基；
其中每一经取代基团经一或多个选自以下的基团取代：卤基、-N(R)2、-OR、-CN、氧代基、未经取代的C1-6脂族基或经卤基、-OH、-CN或-NH2取代的C1-6脂族基。
在一些实施例中，定义式(III)化合物或其医药上可接受的盐，其中：
(a)Y是-CH2-、-S-、-N-、-O-、
Figure GDA0002463350460001211
(b)Z1和Z3各自独立地是-C-或-N-；
(c)Z2是-CH-、-N-或-CR10-，其中R10是-(C1-C6)烷基；
(d)Z6、Z7和Z8各自独立地是-C-或-N-，前提是Z6到Z8中的至少一者是-C-；
(e)X1是-H、-卤基、-NH2、-CN、-(C1-C6)烷基、-O(C1-C6)烷基、-CH2OH、-C(卤基)3、 -CH(卤基)2、-CH2(卤基)、-OC(卤基)3、-OCH(卤基)2或-OCH2(卤基)；
(f)X4、X5和X6各自独立地是-H、-卤基、-NH2、-CN、-(C1-C6)烷基、-O(C1-C6)烷基、 -CH2OH、-C(卤基)3、-CH(卤基)2、-CH2(卤基)、-OC(卤基)3、-OCH(卤基)2、-OCH2(卤基) 或选自以下的(5或6元)芳基、杂环芳族或非芳族基团：吡啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、咪唑基、噻唑烷基、噻二唑基、噻唑基、异噁唑基、吡唑基、异噻唑基、哒嗪基、嘧啶基、三嗪基、吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、2，3-二氢呋喃基、二氢吡啶基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基或四氢硫吡喃基，前提是在Z6是氮时X4不存在，在Z7是氮时X5不存在，并且在Z8是氮时X6不存在；
(g)R7是-(CH2)m-N+-(R2)(R3)(R4)、-(CH2)m-N-R3R4、-(CH2)m-C(＝O)N-R3R4、 -(CH2)mR3R4、-(CH2)m-C(卤基)3、-(CH2)m-烯基、(CH2)m-烯基-CH3、-(CH2)m-炔基、(CH2)m- 炔基-CH3、(CH2)m-(C3-C8)环烷基、-(CH2)m-(C3-C8)杂环烷基、-(CH2)m-苯基、-(CH2)m-(5 或6元)杂芳基、-(CH2)m-氰基，其中m是1、2、3、4或5且其中所述环烷基、杂环或苯基未经取代或经一或多个X1基团取代，前提是在所有R2-R4都存在时，所述化合物进一步包含医药上可接受的抗衡离子；
(h)Q是稠合苯并基、稠合(5或6元)杂芳基、稠合4到7元环烷基环或选自以下的稠合4到7元非芳族杂环：吡咯并基、吡啶并基、嘧啶并基、吡嗪并基、哒嗪并基、噁二唑并基、噻二唑并基、二氧戊环并基、咪唑并基或咪唑并[1，2-a]吡啶；
(i)R2和R3独立地是氢、甲基、乙基、乙烯基、乙炔基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、叔丁基、异丁基、-C(卤基)3、-CH(卤基)2、-CH2(卤基)、-CH2C(卤基)3、-CH2CH(卤基)2、-CH2CH2(卤基)、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH2C(CH3)2OH、-CH2CH(CH3)OH、 -C(CH3)2CH2OH、-CH(CH3)CH2OH、-CH(CH3)CH(OH)R4、-CH2CH(OH)R4、-CH2SO2NHR4、 -CH3SO2NHR4，或R2和R3在与其附接的氮一起时形成未经取代或经取代的氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯烷、哌嗪或哌啶环；
(j)R4是氢、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、异丁基或-C(卤基)3；
(k)R8是-H、-卤基、-NH2、-CN、-(C1-C6)烷基、-O(C1-C6)烷基、-CH2OH、-C(卤基)3、 -CH(卤基)2、-CH2(卤基)、-OC(卤基)3、-OCH(卤基)2和-OCH2(卤基)；且
(l)a是选自0、1和2的整数。
在一个实施例中，Z1、Z2和Z3是-N-。在另一实施例中，Z1和Z3是-N-且Z2是-CH-。在另一实施例中，Z1是-C-且Z2和Z3是-N-。
在另一实施例中，Z6、Z7和Z8是-C-。在另一实施例中，Z6是-N-且Z7和Z8是-C-。
在另一实施例中，Y是-S-、-CH2-或
Figure GDA0002463350460001221
在另一实施例中，Y是S或
Figure GDA0002463350460001222
在另一实施例中，Y是-S-或-CH2-。在另一实施例中，Y是-S-或-O-。在另一实施例中，Y 是-S-。在另一实施例中，Y是-CH2-。在另一实施例中，Y是
Figure GDA0002463350460001223
在一些实施例中， Y是-C(RY)2-，其中每一RY独立地是氢、-OH或卤基。
在一些实施例中，R2或R3是-CH2NHSO2R4。
在一些实施例中，R2和R3独立地是氢、-N(R)2、-CH2CH(OH)R4、-CH(OH)CH2R4、-CH2SO2NHR4、-CH2NHSO2R4或未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基，或R3和R4在与其附接的氮一起时形成未经取代或经取代的3到7元杂环；
在一些实施例中，R2和R3独立地是氢、甲基、乙基、乙烯基、乙炔基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、叔丁基、异丁基、-C(卤基)3、-CH(卤基)2、-CH2(卤基)、-CH2C(卤基)3、-CH2CH(卤基)2、-CH2CH2(卤基)、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH2C(CH3)2OH、 -CH2CH(CH3)OH、-C(CH3)2CH2OH、-CH(CH3)CH2OH、-CH(CH3)CH(OH)R4、 -CH2CH(OH)R4、-CH2SO2NHR4、-CH2NHSO2R4，或R2和R3在与其附接的氮一起时形成未经取代或经取代的氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯烷、哌嗪或哌啶环。
在某些实施例中，R7是-(CH2)m-N-(R3)(R4)。在一个所述实施例中，R7是 -(CH2)2-N-(R3)(R4)。在另一所述实施例中，R7是-(CH2)3-N-(R3)(R4)。在另一所述实施例中，R7是-(CH2)2-N-(R3)(R4)，R3是H且R4是异丙基或异丁基。在另一所述实施例中， R7是-(CH2)3-N-(R3)(R4)，R3是H且R4是异丙基。在另一所述实施例中，R7是 -(CH2)3-N-(R3)(R4)，R3是H且R4是异丁基。
在某些实施例中，R7是-(CH2)m-CF3。在一个所述实施例中，R7是-(CH2)3-CF3。在另一所述实施例中，R7是-(CH2)4-CF3。
在某些实施例中，R7是-(CH2)m-烯基。在一个所述实施例中，R7是-(CH2)3-烯基。在另一所述实施例中，R7是-(CH2)4-烯基。
在另一实施例中，R7是-(CH2)3-炔基。在另一实施例中，R7是-(CH2)3-CCH。在另一实施例中，R7是-(CH2)4-炔基。在另一实施例中，R7是-(CH2)m-氰基。在另一实施例中， R7是-(CH2)3-氰基。在另一实施例中，R7是-(CH2)4-氰基。
在另一实施例中，Q是苯并基、吡咯并基、吡啶并基、嘧啶并基、吡嗪并基或哒嗪并基。在另一实施例中，Q是苯并基或吡啶并基，其中优选地，吡啶并基的2位和3位稠合到6元含氮环。在另一实施例中，Q是苯并基。在另一实施例中，Q是噁二唑并基、噻二唑并基、二氧戊环并基或咪唑并基。在另一实施例中，Q与芳基环稠合以形成咪唑并[1，2-a]吡啶环。
在另一实施例中，Q是哌嗪基、哌啶基、2H-吡喃基、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、吗啉基、氧代基咪唑烷基、2-氧代基吡咯烷基、硫代吗啉基或噻唑烷基。
在另一实施例中，Q是环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基。
在其它实施例中，式(III)的Grp94抑制剂具有表6中的一个化学式，其中每一取代基如上文所定义且单独和组合地描述于本文中的种类和亚类中。
表6
Figure GDA0002463350460001241
Figure GDA0002463350460001251
Figure GDA0002463350460001261
Figure GDA0002463350460001271
其中每一R9都是R。
式(III)的阐释性化合物列举于下表7中。
表7
Figure GDA0002463350460001281
和其医药上可接受的盐，其中：
Figure GDA0002463350460001282
5.3.4式(IV)的Grp94抑制剂
在一个方面中，本揭示内容涵盖以式(IV)示意性表示的嘌呤-架构化合物：
Figure GDA0002463350460001291
或其医药上可接受的盐，其中：
(a)Y是-C(RY)2-、-S-、-NR-、-O-、
Figure GDA0002463350460001292
(b)Z1、Z3、Z9、Z10、Z11和Z12各自独立地是-CH-或-N-；
(c)Z2是-N-或-CR10-，其中R10是H或未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基；
(d)X8和X9各自独立地是-CH-、-S-、-N-或-O-；
(e)X1是-H、-卤基、-N(R)2、-OR、-CN或未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基；
(f)R7是-(C1-C6)脂族基-N+-(R2)(R3)(R4)、-(C1-C6)脂族基-N-R3R4、-(C1-C6)脂族基 -C(＝O)N-R3R4、-(C1-C6)脂族基-R3R4、-(C1-C6)脂族基-R2R3R4、-(C1-C6)脂族基-N-CR2R3R4、 -(C1-C6)脂族基-C(卤基)3、-(C1-C6)脂族基-烯基、-(C1-C6)脂族基-炔基、-(C1-C6)脂族基 -(C3-C8)环烷基、-(C1-C6)脂族基-(C3-C8)杂环烷基、-(C1-C6)脂族基-苯基、-(C1-C6)脂族基 -(5或6元)杂芳基、-(C1-C6)脂族基-氰基，前提是在所有R2-R4都存在时，所述化合物进一步包含医药上可接受的抗衡离子；
(g)R2和R3独立地是氢、-N(R)2、-CH2CH(OH)R4、-CH(OH)CH2R4、-CH2SO2NHR4、 -CH2NHSO2R4或未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基，或R3和R4在与其附接的氮一起时形成未经取代或经取代的3到7元杂环；
(h)R4是氢、卤素或未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基；
(i)每一R8独立地是-H、-卤基、-N(R)2、-OR、-CN或未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基；
(j)R9是-H、(C1-C6)脂族基-环烷基、-(C1-C6)脂族基-杂环烷基、-(C1-C6)脂族基-芳基、 -(C1-C6)脂族基-杂芳基或-(C1-C6)脂族基-氰基，其中每一环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基未经取代或经取代，前提是在X9是-S-或-O-时R9不存在；
(k)每一RY独立地是R、-OR或卤基；
(l)a是选自0、1和2的整数；且
(m)每一R独立地是氢、未经取代的C1-6脂族基或经卤基、-OH、-CN或-NH2取代的C1-6脂族基；且
其中每一经取代基团经一或多个选自以下的基团取代：卤基、-N(R)2、-OR、-CN、氧代基、未经取代的C1-6脂族基或经卤基、-OH、-CN或-NH2取代的C1-6脂族基。
在一些实施例中，定义式(IV)化合物或其医药上可接受的盐，其中：
(a)Y是-CH2-、-S-、-N-、-O-、
Figure GDA0002463350460001301
(b)Z1、Z3、Z9、Z10、Z11和Z12各自独立地是-CH-或-N-；
(c)Z2是-CH-、-N-或-CR10-，其中R10是-(C1-C6)烷基；
(d)X8和X9各自独立地是-CH-、-S-、-N-或-O-；
(e)X1是-H、-卤基、-NH2、-CN、-(C1-C6)烷基、-O(C1-C6)烷基、-CH2OH、-C(卤基)3、 -CH(卤基)2、-CH2(卤基)、-OC(卤基)3、-OCH(卤基)2或-OCH2(卤基)；
(f)R7是-(CH2)m-N+-(R2)(R3)(R4)、-(CH2)m-N-R3R4、-(CH2)m-C(＝O)N-R3R4、 -(CH2)m-R3R4、-(CH2)m-C(卤基)3、-(CH2)m-烯基、(CH2)m-烯基-CH3、-(CH2)m-炔基、(CH2)m- 炔基-CH3、(CH2)m-(C3-C8)环烷基、-(CH2)m-(C3-C8)杂环烷基、-(CH2)m-苯基、-(CH2)m-(5 或6元)杂芳基、-(CH2)m-氰基，其中m是1、2、3、4或5且其中所述环烷基、杂环或苯基未经取代或经一或多个X1基团取代，前提是在所有R2-R4都存在时，所述化合物进一步包含医药上可接受的抗衡离子；
(g)R2和R3独立地是氢、甲基、乙基、乙烯基、乙炔基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、叔丁基、异丁基、-C(卤基)3、-CH(卤基)2、-CH2(卤基)、-CH2C(卤基)3、-CH2CH(卤基)2、-CH2CH2(卤基)、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH2C(CH3)2OH、-CH2CH(CH3)OH、 -C(CH3)2CH2OH、-CH(CH3)CH2OH，或R2和R3在与其附接的氮一起时形成未经取代或经取代的氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯烷、哌嗪或哌啶环；
(h)R4是氢、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、异丁基或-C(卤基)3；
(i)R8是-H、-卤基、-NH2、-CN、-(C1-C6)烷基、-O(C1-C6)烷基、-CH2OH、-C(卤基)3、 -CH(卤基)2、-CH2(卤基)、-OC(卤基)3、-OCH(卤基)2和-OCH2(卤基)；
(j)R9是-H、(CH2)n-环烷基、-(CH2)n-杂环烷基、-(CH2)n-芳基、-(CH2)n-杂芳基或-(CH2)n- 氰基，其中所述环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基任选地经一或多个X1基团取代；
(k)a是选自0、1和2的整数；且
(l)n是选自1、2、3或4的整数。
在某些实施例中，Y是-S-、-CH2-或
Figure GDA0002463350460001311
在另一实施例中，Y是S或
Figure GDA0002463350460001312
在另一实施例中，Y是-S-或-CH2-。在另一实施例中，Y是-S-或-O-。在另一实施例中，Y 是-S-。在另一实施例中，Y是-CH2-。在另一实施例中，Y是
Figure GDA0002463350460001313
在一些实施例中， Y是-C(RY)2-，其中每一RY独立地是氢、-OH或卤基。
在某些实施例中，Z1和Z2是-N-。在其它实施例中，Z1是-N-且Z2是-C-。
在某些实施例中，R7是-(CH2)m-N-(R3)(R4)。在一个所述实施例中，R1是 -(CH2)2-N-(R3)(R4)。在另一所述实施例中，R1是-(CH2)3-N-(R3)(R4)。在另一所述实施例中，R7是-(CH2)2-N-(R3)(R4)，R3是H且R4是异丙基或异丁基。在另一所述实施例中， R7是-(CH2)3-N-R3R4，R3是H且R4是异丙基或异丁基。在另一所述实施例中，R7是 -(CH2)2-N-R3R4，R3是H且R4是异丙基。应了解，在这些实施例中，胺官能团可以游离碱形式或以酸加成盐形式存在。酸加成盐可通过加成适宜酸制得，如业内充分了解。在具体实施例中，酸加成盐可为盐酸盐、磷酸盐、硫酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、苯磺酸盐、甲磺酸盐、酒石酸盐、乳糖酸盐、对甲苯磺酸盐或延胡索酸盐。在另一实施例中，酸加成盐是盐酸盐或硫酸盐。在另一实施例中，酸加成盐是盐酸盐。在另一实施例中，酸加成盐是硫酸盐。在另一实施例中，酸加成盐是磷酸盐。在制备为酸加成盐时，使得嘌呤-架构抑制剂具有水溶性。甚至可通过产生较高阶盐、尤其二盐进一步增加溶解性。例如，在Z1是-N-的实施例中，氮可离子化且可在强酸性条件(例如，pH小于约3) 下转化成酸加成盐。因此，本揭示内容的Grp94抑制剂(其中Z1是-N-且R7基团含有胺官能团)可转化成二盐。在某些实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂可呈二-HCl盐形式。
在某些实施例中，R7是-(CH2)m-CF3。在一个所述实施例中，R7是-(CH2)3-CF3。在另一所述实施例中，R7是-(CH2)4-CF3。在另一所述实施例中，R7是-(CH2)2-CF3。
在另一实施例中，R7是-(CH2)3-炔基。在另一实施例中，R7是-(CH2)3-CCH。在另一实施例中，R7是-(CH2)4-炔基。在另一实施例中，R7是-(CH2)m-氰基。
在某些实施例中，R9是-(CH2)n-芳基。在一个所述实施例中，R9是-(CH2)n-芳基。在另一所述实施例中，R9是未经取代的苄基。在另一所述实施例中，R9是经取代的苄基。在另一所述实施例中，R9是经对位取代的经取代的苄基。在另一所述实施例中，R9是对位甲氧基取代的苄基。
在其它实施例中，化学式(IV)的Grp94抑制剂具有表8中的一个化学式，其中每一取代基如上文所定义且单独和组合地描述于本文中的种类和亚类中。
表8
Figure GDA0002463350460001321
Figure GDA0002463350460001331
式(IV)的阐释性化合物列举于下表9中。
表9
Figure GDA0002463350460001332
和其医药上可接受的盐，其中：
Figure GDA0002463350460001333
Figure GDA0002463350460001341
5.3.5式(V)的Grp94抑制剂
在一个方面中，本揭示内容涵盖在8位经键结到芳基或杂芳基的连接体基团取代且在N-3位进一步经取代的嘌呤-架构化合物。所述化合物是以式(V)示意性表示：
Figure GDA0002463350460001342
或其医药上可接受的盐，其中：
(a)Y是-C(RY)2-、-S-、-NR-、-O-、
Figure GDA0002463350460001343
(b)Z1和Z3各自独立地是-CH-或-N-；
(c)Z2是-N-或-CR10-，其中R10是H或未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基；
(d)Z4、Z5、Z6、Z7和Z8各自独立地是-C-或-N-，前提是Z4到Z8没有3个连续N；
(e)X1是-H、-卤基、-N(R)2、-OR、-CN或未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基；
(f)X4、X5和X6各自独立地是-H、-卤基、-SR、-N(R)2、-OR、-CN、-NO2、-CN、 -C(O)R、-C(O)2R、-S(O)R、-S(O)2R、-C(O)N(R)2、-SO2N(R)2、-OC(O)R、-N(R)C(O)R、 -N(R)SO2R、-OC(O)N(R)2、未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基或未经取代或经取代的选自(5或6元)芳基、(5或6元)芳基烷基和(5或6元)杂环芳族或杂环非芳族基团的基团；前提是X2、X4和X5中的至少一者是-H且在Z4是-N-时X2不存在，在Z5是-N-时X3不存在，在Z6是-N-时X4不存在且在Z7是-N-时X5不存在；
(g)X2和X3各自独立地选自
(1)-H、-卤基、-SR、-N(R)2、-OR、-CN、-NO2、-CN、-C(O)R、-C(O)2R、-S(O)R、 -S(O)2R、-C(O)N(R)2、-SO2N(R)2、-OC(O)R、-N(R)C(O)R、-N(R)SO2R、-OC(O)N(R)2、未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基或未经取代或经取代的选自(5或6元)芳基、(5或6 元)芳基烷基和(5或6元)杂环芳族或杂环非芳族基团的基团；或
(2)X2和X3一起形成可经一或多个R8基团取代的稠合苯并基或稠合(5或6元)杂芳基；
(h)R7是-(C1-C6)脂族基-N+-(R2)(R3)(R4)、-(C1-C6)脂族基-N-R3R4、-(C1-C6)脂族基 -C(＝O)N-R3R4、-(C1-C6)脂族基-R3R4、-(C1-C6)脂族基-R2R3R4、-(C1-C6)脂族基-N-CR2R3R4、 -(C1-C6)脂族基-C(卤基)3、-(C1-C6)脂族基-烯基、-(C1-C6)脂族基-炔基、-(C1-C6)脂族基 -(C3-C8)环烷基、-(C1-C6)脂族基-(C3-C8)杂环烷基、-(C1-C6)脂族基-苯基、-(C1-C6)脂族基-(5或6元)杂芳基、-(C1-C6)脂族基-氰基，前提是在所有R2-R4都存在时，所述化合物进一步包含医药上可接受的抗衡离子；
(i)R2和R3独立地是氢、-N(R)2、-CH2CH(OH)R4、-CH(OH)CH2R4、-CH2SO2NHR4、 -CH2NHSO2R4或未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基，或R3和R4在与其附接的氮一起时形成未经取代或经取代的3到7元杂环；
(j)R8是-H、-卤基、-SR、-N(R)2、-OR、-CN、-NO2、-CN、-C(O)R、-C(O)2R、-S(O)R、 -S(O)2R、-C(O)N(R)2、-SO2N(R)2、-OC(O)R、-N(R)C(O)R、-N(R)SO2R、-OC(O)N(R)2、未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基或未经取代或经取代的选自(5或6元)芳基、(5或6 元)芳基烷基和(5或6元)杂环芳族或杂环非芳族基团的基团；
(k)每一RY独立地是R、-OR或卤基；
(l)R4是氢、卤素或未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基；且
(m)每一R独立地是氢、未经取代的C1-6脂族基或经卤基、-OH、-CN或-NH2取代的C1-6脂族基；
其中每一经取代基团经一或多个选自以下的基团取代：卤基、-N(R)2、-OR、-CN、氧代基、未经取代的C1-6脂族基或经卤基、-OH、-CN或-NH2取代的C1-6脂族基。
在一些实施例中，定义式(V)化合物或其医药上可接受的盐，其中：
(a)Y是-CH2-、-S-、-N-、-O-、
Figure GDA0002463350460001361
(b)Z1和Z3各自独立地是-CH-或-N-；
(c)Z2是-CH-、-N-或-CR10-，其中R10是-(C1-C6)烷基；
(d)Z4、Z5、Z6、Z7和Z8各自独立地是-CH-或-N-，前提是Z4到Z8没有3个连续N；
(e)X1是-H、-卤基、-NH2、-CN、-(C1-C6)烷基、-O(C1-C6)烷基、-CH2OH、-C(卤基)3、 -CH(卤基)2、-CH2(卤基)、-OC(卤基)3、-OCH(卤基)2或-OCH2(卤基)；
(f)X4、X5和X6各自独立地是-H、-卤基、-NH2、-CN、-(C1-C6)烷基、-O(C1-C6)烷基、 -CH2OH、-C(卤基)3、-CH(卤基)2、-CH2(卤基)、-OC(卤基)3、-OCH(卤基)2、-OCH2(卤基)、吡啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、咪唑基、噻唑烷基、噻二唑基、噻唑基、异噁唑基、吡唑基、异噻唑基、哒嗪基、嘧啶基、三嗪基、吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、2，3-二氢呋喃基、二氢吡啶基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基或四氢硫吡喃基；
(g)X2和X3各自独立地选自
(l)-H、-卤基、-NH2、-CN、-(C1-C6)烷基、-O(C1-C6)烷基、-CH2OH、-C(卤基)3、-CH(卤基)2、-CH2(卤基)、-OC(卤基)3、-OCH(卤基)2、-OCH2(卤基)、吡啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、咪唑基、噻唑烷基、噻二唑基、噻唑基、异噁唑基、吡唑基、异噻唑基、哒嗪基、嘧啶基、三嗪基、吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、2，3- 二氢呋喃基、二氢吡啶基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基或四氢硫吡喃基；和
(2)X2和X3一起形成可经一或多个R8基团取代的稠合苯并基或稠合(5或6元)杂芳基；
(h)R7是-(CH2)m-N+-(R2)(R3)(R4)、-(CH2)m-N-R3R4、-(CH2)m-C(＝O)N-R3R4、 -(CH2)m-C(卤基)3、-(CH2)m-烯基、(CH2)m-烯基-CH3、-(CH2)m-炔基、(CH2)m-炔基-CH3、 (CH2)m-(C3-C8)环烷基、-(CH2)m-(C3-C8)杂环烷基、-(CH2)m-苯基、-(CH2)m-(5或6元)杂芳基、-(CH2)m-氰基，其中m是1、2、3、4或5且其中所述环烷基、杂环或苯基未经取代或经一或多个X1基团取代，前提是在所有R2-R4都存在时，所述化合物进一步包含医药上可接受的抗衡离子；
(i)R2和R3独立地是氢、甲基、乙基、乙烯基、乙炔基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、叔丁基、异丁基、-C(卤基)3、-CH(卤基)2、-CH2(卤基)、-CH2C(卤基)3、-CH2CH(卤基)2、-CH2CH2(卤基)、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH2C(CH3)2OH、-CH2CH(CH3)OH、 -C(CH3)2CH2OH、-CH(CH3)CH2OH，或R2和R3在与其附接的氮一起时形成未经取代或经取代的氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯烷、哌嗪或哌啶环；
(j)R4是氢、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、异丁基或-C(卤基)3；且
(k)R8是-H、-卤基、-NH2、-CN、-(C1-C6)烷基、-O(C1-C6)烷基、-CH2OH、-C(卤基)3、 -CH(卤基)2、-CH2(卤基)、-OC(卤基)3、-OCH(卤基)2和-OCH2(卤基)，并且X3、X4、X5和X6独立地选自-H、-卤基、-NH2、-CN、-(C1-C6)烷基、-O(C1-C6)烷基、-CH2OH、-C(卤基)3、-CH(卤基)2、-CH2(卤基)、-OC(卤基)3、-OCH(卤基)2、-OCH2(卤基)、吡啶基、呋喃基、苯基、苄基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、咪唑基、噻唑烷基、噻二唑基、噻唑基、异噁唑基、吡唑基、异噻唑基、哒嗪基、嘧啶基、三嗪基、吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、2，3-二氢呋喃基、二氢吡啶基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基或四氢硫吡喃基。
在一个实施例中，Z1和Z3是-N-。在另一实施例中，Z1是-N-且Z3是-C-。在另一实施例中，Z1是-C-且Z3是-N-。
在另一实施例中，Z4、Z5、Z6、Z7和Z8是-C-。在另一实施例中，Z4是-N-且Z5、Z6、 Z7和Z8是-C-。在另一实施例中，Z5是-N-且Z4、Z6、Z7和Z8是-C-。在另一实施例中， Z6是-N-且Z4、Z5、Z7和Z8是-C-。在另一实施例中，Z7是-N-且Z4、Z5、Z6和Z8是-C-。在另一实施例中，Z8是-N-且Z4、Z5、Z6和Z7是-C-。在另一实施例中，Z7和Z4是-N-且 Z5、Z6和Z8是-C-。在另一实施例中，Z5和Z8是-N-且Z4、Z6和Z7是-C-。
在另一实施例中，Y是-S-、-CH2-或
Figure GDA0002463350460001371
在另一实施例中，Y是S或
Figure GDA0002463350460001372
在另一实施例中，Y是-S-或-CH2-。在另一实施例中，Y是-S-或-O-。在另一实施例中，Y 是-S-。在另一实施例中，Y是-CH2-。在另一实施例中，Y是
Figure GDA0002463350460001373
在一些实施例中， Y是-C(RY)2-，其中每一RY独立地是氢、-OH或卤基。
在某一实施例中，R7是-(CH2)m-N-(R3)(R4)。在一个所述实施例中，R1是 -(CH2)2-N-(R3)(R4)。在另一所述实施例中，R1是-(CH2)3-N-(R3)(R4)。在另一所述实施例中，R7是-(CH2)2-N-(R3)(R4)，R3是H且R4是异丙基或异丁基。在另一所述实施例中， R7是-(CH2)3-N-(R3)(R4)，R3是H且R4是异丙基或异丁基。在另一所述实施例中，R7是 -(CH2)3-N-(R3)(R4)，R3是H且R4是异丙基。在另一所述实施例中，R7是-(CH2)3-N-(R3)(R4)， R3是H且R4是异丁基。应了解，在这些实施例中，胺官能团可以游离碱形式或以酸加成盐形式存在。酸加成盐可通过加成适宜酸制得，如业内充分了解。在具体实施例中，酸加成盐可为盐酸盐、磷酸盐、硫酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、甲磺酸盐、酒石酸盐、乳糖酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐或延胡索酸盐。在另一实施例中，酸加成盐是盐酸盐或硫酸盐。在另一实施例中，酸加成盐是盐酸盐。在另一实施例中，酸加成盐是硫酸盐。在另一实施例中，酸加成盐是磷酸盐。在制备为酸加成盐时，使得嘌呤-架构抑制剂具有水溶性。甚至可通过产生较高阶盐、尤其二盐进一步增加溶解性。例如，在Z1是-N-的实施例中，氮可离子化且可在强酸性条件(例如，pH小于3)下转化成酸加成盐。因此，本揭示内容的Grp94抑制剂(其中Z1是-N-且R7基团含有胺官能团)可转化成二盐。在某些实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂可呈二-HCl盐形式。
在某些实施例中，R7是-(CH2)m-CF3。在一个所述实施例中，R7是-(CH2)3-CF3。在另一所述实施例中，R7是-(CH2)4-CF3。
在另一实施例中，R7是-(CH2)3-烯基。在另一实施例中，R7是-(CH2)3-CCH。在另一实施例中，R7是-(CH2)4-烯基。
在一些实施例中，R7是CH2CCCH3。
在另一实施例中，R7是-(CH2)2-炔基。在另一实施例中，R7是-(CH2)3-炔基。在另一实施例中，R7是-(CH2)3-CCH。在另一实施例中，R7是-(CH2)4-炔基。在另一实施例中， R7是-(CH2)4-CCH。在另一实施例中，R7是-(CH2)m-氰基。
在一些实施例中，R7是苄基。
在另一实施例中，X1是-H。在另一实施例中，X1是卤素原子。在另一实施例中，X1是-F。在另一实施例中，X1是-Cl。
在另一实施例中，X2是卤素原子且X3、X4、X5和X6是氢。在另一实施例中，X2是 -C1且X3、X4、X5和X6是氢。在另一实施例中，X2是-OCH3且X3、X4、X5和X6是氢。在另一实施例中，X2是-OCF3且X3、X4、X5和X6是氢。
在另一实施例中，X4是卤素原子且X2、X3、X5和X6是氢。在另一实施例中，X4是 -C1且X2、X3、X5和X6是氢。在另一实施例中，X4是-OCH3且X2、X3、X5和X6是氢。在另一实施例中，X4是-OCF3且X2、X3、X5和X6是氢。
在某些实施例中，Z4和Z6是-C-，X2和X4独立地选自-H、-卤基、-(C1-C3)烷基和 -O(C1-C3)烷基且Z5、Z7和Z8是未经取代的碳或氮原子。在一个所述实施例中，X2和X4中的至少一者是-卤基。在另一所述实施例中，X2和X4二者都为-Cl。在另一所述实施例中，X2和X4中的至少一者是烷基。在另一所述实施例中，X2和X4二者都为-CH3。在另一所述实施例中，X2和X4中的至少一者是-OCH3。在另一所述实施例中，X2和X4中的至少一者是-CF3。
在某些实施例中，Z4和Z7是-C-，X2和X5独立地选自-H、-卤基、-(C1-C3)烷基、-(C1-C3) 卤烷基、-(C1-C3)卤烷基和-O(C1-C3)烷基且Z5、Z6和Z8是未经取代的碳或氮原子。在一个所述实施例中，X2和X5中的至少一者是卤素原子。在另一所述实施例中，X2和X5二者都为-Cl。在另一所述实施例中，X2和X4中的至少一者是烷基。在另一所述实施例中， X2和X5二者都为-CH3。在另一所述实施例中，X2和X4中的至少一者是-CF3。
在某些实施例中，Z5和Z7是-C-，X3和X5独立地选自-H、-卤基、-(C1-C3)烷基、-(C1-C3) 卤烷基、-O(C1-C3)卤烷基和-O(C1-C3)烷基且Z4、Z6和Z8是未经取代的碳或氮原子。在一个所述实施例中，X3和X5中的至少一者是卤素原子。在另一所述实施例中，X3和X5二者都为-Cl。在另一所述实施例中，X3和X5中的至少一者是烷基。在另一所述实施例中，X3和X5二者都为-CH3。在另一所述实施例中，X3和X5中的至少一者是-CF3。
在一些实施例中，X3和X4是卤基且X2、X5和X6是氢。
在一些实施例中，X2、X4和X5是卤基且X3和X6是氢。在一些实施例中，X2、X3和X5是卤基且X4和X6是氢。在一些实施例中，X2、X3和X4是卤基且X5和X6是氢。
在一些实施例中，X2、X4和X6是甲基且X3和X5是氢。
在另一实施例中，X2和X3一起形成稠合苯并基。在另一实施例中，X2和X3一起形成稠合吡啶基。
在一些实施例中，式(V)的Grp94抑制剂具有式(Va)：
Figure GDA0002463350460001391
或其医药上可接受的盐，其中X1、R7、Y、X3和X5各自如上文所定义且单独和组合地描述于本文中的种类和亚类中。
在一些实施例中，式(V)的Grp94抑制剂具有式(Vb)：
Figure GDA0002463350460001401
或其医药上可接受的盐，其中R7如上文所定义，其中i)附接到环氮的-(C1-C6)脂族基团是-(CH2)3-或ii)m是3；且X1、Y、X2、X3、X4、X5和X6各自如上文所定义且单独和组合地描述于本文中的种类和亚类中。
在其它实施例中，化学式(V)的Grp94抑制剂具有表10中的一个化学式，其中每一取代基如上文所定义且单独和组合地描述于本文中的种类和亚类中。
表10
Figure GDA0002463350460001402
Figure GDA0002463350460001411
Figure GDA0002463350460001421
Figure GDA0002463350460001431
表11
Figure GDA0002463350460001432
和其医药上可接受的盐，其中：
Figure GDA0002463350460001433
Figure GDA0002463350460001441
Figure GDA0002463350460001451
Figure GDA0002463350460001461
Figure GDA0002463350460001471
Figure GDA0002463350460001481
Figure GDA0002463350460001491
Figure GDA0002463350460001501
Figure GDA0002463350460001511
Figure GDA0002463350460001521
Figure GDA0002463350460001531
Figure GDA0002463350460001541
Figure GDA0002463350460001551
Figure GDA0002463350460001561
Figure GDA0002463350460001571
Figure GDA0002463350460001581
Figure GDA0002463350460001591
Figure GDA0002463350460001601
Figure GDA0002463350460001611
Figure GDA0002463350460001621
Figure GDA0002463350460001631
Figure GDA0002463350460001641
表12
Figure GDA0002463350460001642
和其医药上可接受的盐，其中：
Figure GDA0002463350460001643
Figure GDA0002463350460001651
Figure GDA0002463350460001661
Figure GDA0002463350460001671
Figure GDA0002463350460001681
Figure GDA0002463350460001691
Figure GDA0002463350460001701
Figure GDA0002463350460001711
Figure GDA0002463350460001721
Figure GDA0002463350460001731
Figure GDA0002463350460001741
Figure GDA0002463350460001751
Figure GDA0002463350460001761
Figure GDA0002463350460001771
Figure GDA0002463350460001781
Figure GDA0002463350460001791
Figure GDA0002463350460001801
Figure GDA0002463350460001811
Figure GDA0002463350460001821
Figure GDA0002463350460001831
Figure GDA0002463350460001841
5.4本揭示内容的Grp94抑制剂在细胞中展现选择性同种同源物抑制
已确立本揭示内容的化合物选择性抑制Grp94，接下来研究Grp94特异性抑制剂在细胞中的效应。使用选择性Grp94抑制剂PU-WS13作为测试化合物，其具有以下化学结构：
Figure GDA0002463350460001842
比较PU-WS13与选择性Hsp90α/β抑制剂(称作(PU-29F))的活体外效应，所述PU-29F 具有以下化学结构：
Figure GDA0002463350460001851
通过若干不同读数测试这些化合物在细胞中的选择性靶调节(图5a至图5g)。特定来说，证实PU-WS13以剂量依赖性方式抑制IGF-II分泌(图5a)和类铎受体9(TLR9)输送(图5e)。这二者都是明确定义的Grp94调介的细胞事件(杜菲尔德，A.S.等人，Grp94抑制剂之发展.美国化学学会会志134，9796-9804(2012)；奥斯特洛夫斯基，O.(Ostrovsky，O.)、艾哈迈德，N.T.(Ahmed，N.T.)和阿尔贡，Y.GRP94对胰岛素样生长因子II的侣伴蛋白活性为对血清剥夺的应力反应所必需(The chaperone activity of GRP94 toward insulin-likegrowth factor II is necessary for the stress response to serum deprivation).细胞分子生物学 (Mol.Biol.Cell)20，1855-1864(2009))；在抑制Grp94活性的PU-WS13浓度下，观察到对Hsp90无抑制，如通过没有Hsp70诱导和AKT降解(图5b、f、g)所显示，所述二者是细胞溶质Hsp90α抑制的标志。(沃克曼，P.，伯罗斯，F.，奈克斯，L.和罗森，N.用侣伴蛋白 Hsp90对癌症给药：癌基因成瘾性和肿瘤应力的组合疗法开发.纽约科学院年报1113，202-216(2007)；珀尔，L.H.(Pearl，L.H.)、普罗德罗姆，C.(Prodromou，C.)和沃克曼，P.Hsp90分子侣伴蛋白：对于治疗一目了然(The Hsp90 molecular chaperone：an open andshut case for treatment).生物化学杂志410，439-453(2008))。因此，用选择性Hsp90α/β抑制剂PU-29F治疗导致Hsp90水平以剂量依赖性方式升高和AKT降解(图5b、f、g)，同时最低程度地实现Grp94标志(图5a、e、f)。重要的是，PU-WS13对两个非恶性细胞系C2C12 (小鼠骨骼肌成肌细胞)和HEK293(人类胚肾细胞)无毒(图5c、f)。
5.5本揭示内容的Grp94抑制剂的治疗用途
本揭示内容的Grp94抑制剂可用于治疗或预防任何可通过抑制Grp94的活性治疗或预防的病况。所述病况包括(但不限于)癌症、自体免疫疾病、神经变性疾病和炎症疾病。本揭示内容的Grp94抑制剂因其活性而有利地可用于人类医疗中。在投与动物时，本揭示内容的Grp94抑制剂可作为包含医药上可接受的载剂或赋形剂的组合物的组份投与。本揭示内容的组合物可经口、真皮内、肌内、腹膜腔内、非经肠、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、舌下、大脑内、阴道内、经皮、经直肠或局部投与。
在纳入本揭示内容的Grp94抑制剂用于通过注射(例如，连续输注或浓注)非经肠投与时，用于非经肠投与的调配物可呈油性或水性媒剂中的悬浮液、溶液、乳液形式，并且所述调配物可进一步包含医药上必需的添加剂，例如一或多种稳定剂、悬浮剂、分散剂和诸如此类。本揭示内容的Grp94抑制剂还可呈粉剂形式用于重构为可注射调配物。
在本揭示内容的Grp94抑制剂经调配用于经口投与时，调配物可呈片剂、胶囊、凝胶帽、胶囊剂、菱形片剂、水性或油性溶液、悬浮液、颗粒剂、粉剂、乳液或糖浆。经口调配物可包括一或多种医药上可接受的赋形剂，例如稀释剂、悬浮剂、增溶剂、粘合剂、崩解剂、防腐剂、着色剂、润滑剂。Grp94抑制剂可在囊泡中且具体来说在脂质体中投与。
本揭示内容的Grp94抑制剂是以不抑制Hsp90α、Hsp90β和Trap-1的剂量提供。例如，本揭示内容的Grp94抑制剂可以介于1mg/m2与260mg/m2之间的范围内的剂量投与。在具体实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂可以介于2mg/m2与100mg/m2之间的范围内的剂量投与。在其它实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂可以介于5mg/m2与50 mg/m2之间的范围内的剂量投与。在其它实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂可以介于5mg/m2与20mg/m2之间或介于10mg/m2与20mg/m2之间的范围内的剂量投与。
5.5.1癌症
本揭示内容的Grp94抑制剂可用于治疗各种依赖于Hsp90的癌症，包括(但不限于)结肠直肠癌、胰脏癌、甲状腺癌、基底细胞癌、黑色素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、乳癌、神经母细胞瘤、胃肠癌(包括胃肠道间质瘤)、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、肛门癌、脑肿瘤(包括神经胶质瘤)、淋巴瘤(包括滤泡型淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤)、白血病、骨髓瘤、骨髓增殖性赘瘤和妇科癌症(包括卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌)。
要采用的Grp94抑制剂的精确剂量将取决于(例如)投与途径和癌症阶段。根据本揭示内容，可向患者投与本揭示内容的Grp94抑制剂，使得其它Hsp90同种同源物不受影响或受影响水平最小。使对其它Hsp90同种同源物的抑制最小化可通过足以抑制Grp94与其客户蛋白的结合而不抑制其它Hsp90同种同源物的结合的量实现。因此，在一个实施例中，可以足以抑制Grp94与其客户蛋白的结合而不抑制其它HSP90同种同源物(包括 Hsp90α、HSP90β和Trap-1)的量向癌症患者投与本揭示内容的Grp94抑制剂。如本文所论述，以所述剂量范围投与本揭示内容的Grp94抑制剂的具体优势在于，可大体上避免抗细胞凋亡和抗性调节热休克蛋白(例如，Hsp70)的反馈上调。因此，可向患者投与本揭示内容的Grp94抑制剂而不同时投与Hsp70抑制剂。因此，根据本揭示内容的一个方面，提供通过在不上调Hsp70的情况下治疗患有癌症的人类患者来治疗癌症的方法。所述方法涉及以足以抑制Grp94与其客户蛋白的结合而不抑制其它Hsp90同种同源物(即， Hsp90α、Hsp90β和/或Trap-1)的结合的量投与本揭示内容的Grp94抑制剂。在一个实施例中，可以足以抑制Grp94与其客户蛋白的结合而不抑制客户蛋白与其它Hsp90同种同源物的结合的量向癌症患者投与本揭示内容的Grp94抑制剂。在另一实施例中，可以足以抑制Grp94与其客户蛋白的结合而不上调Hsp70的量向癌症患者投与本揭示内容的 Grp94抑制剂。此外，如下文所论述，本揭示内容的Grp94抑制剂能够在表达致癌蛋白质的癌细胞中诱导细胞凋亡，所述致癌蛋白质的存活和/或维持其在癌细胞的存活或增殖中的功能依赖于Grp94。例如，如下文所论述，Grp94在稳定质膜处的具体受体酪氨酸激酶(RTK)中起重要作用，此容许RTK在肿瘤的发生和进展中具有活性。本揭示内容的 Grp94抑制剂能够使膜RTK去稳化，由此抑制其信号传导性质。
在某些实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂可与一或多种用于治疗癌症的其它治疗剂组合。组合疗法的治疗剂可同时投与或可依序投与。在具体实施例中，Grp94抑制剂可与化学治疗剂(例如毒素或放射性分子)一起投与。在其它实施例中，Grp94抑制剂可与抗血管生成剂(例如VEGF拮抗剂)一起投与。在其它实施例中，Grp94抑制剂可与TNF-α拮抗剂一起投与。下文将论述组合疗法的特定实例。
5.5.2 HER2依赖性肿瘤
利用本揭示内容的Grp94抑制剂，研究Hsp90同种同源物对典型Hsp90客户蛋白HER2的特定作用。HER2是受体酪氨酸激酶，其在活化时导致刺激许多癌症驱动的信号传导途径。HER2的表达在许多上皮肿瘤(例如乳癌、卵巢癌、胃癌和非小细胞肺癌)中改变，并且已显示HER2水平与乳癌的预后负相关。HER2也是研究最多的Hsp90的癌蛋白客户中的一者，并且是对泛-Hsp90抑制最敏感者之一。
通过Hsp90侣伴蛋白调控HER2的当前观点来自使用泛-Hsp90抑制剂的研究。这些研究表明，这些药剂对HER2的效应是通过破坏Hsp90与HER2细胞质结构域之间的相互作用来调介(徐，W.(Xu，W.)、米诺姆，E.G.(Mimnaugh，E.G.)、金，J.S.(Kim，J.S.)、翠普， J.B.(Trepel，J.B.)和奈克斯，L.M.Hsp90而不是Grp94调控新生ErbB2的细胞内输送和稳定性(Hsp90，not Grp94，regulates the intracellular trafficking and stability ofnascent ErbB2). 细胞应力与侣伴蛋白(Cell Stress Chaperones)7，91-96(2002))，从而导致经由26S蛋白酶体使HER2聚-遍在蛋白化和降解。泛-Hsp90抑制剂似乎还作用于Grp94，这是因为其调控ER中新合成的HER2，从而导致HER2在ER中不稳定且滞留，且仅痕量遍在蛋白化(亚登，Y.(Yarden，Y.)和希利科沃夫斯基，M.X.(Sliwkowski，M.X.)解开ErbB信号传导网络 (Untangling the ErbB signaling network).自然综述-分子细胞生物学(Nat.Rev.Mol.Cell Biol)2，127-137(2001))。
本揭示内容的Grp94抑制剂可用于治疗HER2依赖性癌症，例如乳癌、卵巢癌、胃癌、食道癌和非小细胞肺癌。如下文更详细论述，已发现在过表达HER2的细胞中Grp94 的抑制或耗尽引起所述细胞凋亡以及由HER2调介的信号传导事件的减少或终止。此外， Grp94的抑制与抗细胞凋亡蛋白(例如热休克蛋白70(Hsp70))的反馈上调无关。因此，选择性Grp94抑制剂能够以显著大于泛-Hsp90抑制剂的程度诱导过表达HER2的癌细胞的细胞凋亡，其中Hsp70的上调减轻抑制剂的抗细胞凋亡效应且可导致抗性。因此，本揭示内容提供选择性诱导过表达HER2的癌细胞的细胞凋亡的方法。此外，本揭示内容提供通过投与治疗有效量的选择性Grp94抑制剂来治疗过表达HER2的癌症的方法。
在具体实施例中，本揭示内容提供通过投与治疗有效量的选择性Grp94抑制剂治疗过表达HER2的乳癌的方法。在其它实施例中，本揭示内容提供通过投与治疗有效量的选择性Grp94抑制剂治疗过表达HER2的卵巢癌的方法。在其它实施例中，本揭示内容提供通过投与治疗有效量的选择性Grp94抑制剂治疗过表达HER2的胃癌的方法。
在一些实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂可与干扰HER2受体的治疗剂(例如，曲妥珠单抗(赫赛汀))组合使用。
5.5.2.1 Hsp90同种同源物以肿瘤特异性方式调控HER2
为评定Hsp90同种同源物在HER2依赖性癌症中的作用，使用Grp94选择性PU-WS13和PU-H39(图1a-1c)以及Hsp90α/β选择性抑制剂PU-20F、PU-29F和PU-11，其具有以下化学结构：
Figure GDA0002463350460001881
为进行比较，还采用泛-Hsp90抑制剂PU-H71(图1a)以模拟(如果有关)利用个别选择性Grp94和Hsp90α/β抑制剂观察到的组合表型。另外，通过使用至少三种同种同源物特异性siRNA构筑体确认有关表型。还利用固体支撑的固定化探针执行确认性同种同源物选择性亲和纯化。对于每一化合物，通过若干功能读数(包括Hsp70诱导和Raf-1和/或 AKT降解)对照细胞中的选择性靶调节，以及如下文将论述的其它细胞隔室特异性效应。这些对照组合提供选择性同种同源物抑制的细胞效应的独立量度且容许测试Grp94和 Hsp90α/β抑制剂在产生经验证选择性靶抑制的浓度下的细胞效应。
利用此手持式工具组，探测两个乳癌细胞系SKBr3(高HER2表达)和MCF7(低HER2表达)中Hsp90同种同源物在HER2调控中的个别作用。令人惊讶地发现，在SKBr3细胞中而非在MCF7细胞中，HER2的稳态水平对Grp94的选择性抑制敏感(图6a上图和图7a-1和7a-2)。通过siRNA的敲弱Grp94水平来模拟Grp94抑制剂的效应。在两种情形下，在SKBr3细胞中而非在MCF7细胞中观察到HER2稳态水平的类似降低(图6b上图和图7b)。
此外，本揭示内容的Grp94化合物不能显示主要致癌激酶的显著结合和抑制。例如，在Discoverx scanEDGE中筛选PU-WS13和PU-H39二者。当在10uM下测试时，这些化合物对所测试97种激酶中的任一种无显著效应。所测试激酶分布遍及AGC、CAMK、 CMGC、CK1、STE、TK、TKL、脂质和非典型激酶家族以及重要突变形式。此外，Grp94 抑制化合物的效应并不直接作用于HER2，这是因为拉帕替尼(lapatinib，一种结合到HER2 的激酶结构域的小分子)不能模拟PU-WS13在SKBr3细胞上观察到的表型。如所见，拉帕替尼不破坏质膜处的HER2架构。相反，结果明确显示，在Grp94抑制后，信号传导和HER2-血浆结构二者都受到干扰。总之，这些数据将本揭示内容的Grp94抑制剂的生物效应与其对Grp94调介的HER2功能的抑制相关联。
相反，在两种细胞类型中，HER2的稳态水平对Hsp90α/β抑制(图6a和图7a-1和7a-2) 和Hsp90α/β敲弱(图6b和图7b)敏感。在高HER2 SKBr3细胞中，HER2水平仅在指示同时抑制Hsp90α和Hsp90β的抑制剂浓度下降低(图6c)，从而模拟另一Hsp90α/β客户蛋白 Raf-1的情形(沃克曼，P.、伯罗斯，F.、奈克斯，L.和罗森，N.用侣伴蛋白Hsp90对癌症给药：癌基因成瘾性和肿瘤应力的组合疗法开发.纽约科学院年报1113，202-216(2007)) (图6c)。这一点通过siRNA敲弱来确认，其中仅双重Hsp90α/βsiRNA敲弱模拟Hsp90α/β抑制剂在这种细胞系中的效应(图6b和图7b)。Hsp90α或Hsp90β的选择性siRNA敲弱导致HER2水平仅部分降低(图6b)。然而，在低HER2 MCF7细胞中，HER2水平在以选择性结合到Hsp90α而非Hsp90β为特征的较低抑制剂浓度下降低(图6a、c)。还发现了MCF7 细胞中HER2降解与Hsp90α亲和性而非Hsp90β亲和性、Grp94亲和性和Trap-1亲和性之间的显著相关性(图6d，r2分别＝0.83、0.137、0.217和0.005)。在这些细胞中，HER2 还特定地与Hsp90α共纯化(图6e)。然而，借助siRNA选择性减少Hsp90α不能降低MCF7 细胞中的HER2水平(图6b和图7b)，这可能是由于在抑制Hsp90α时反馈诱导Hsp90β所致(图7b、c)。
由于HER2位于与ER和高尔基体(Golgi)网状结构或质膜相连的膜隔室中，或输送穿过胞质溶胶，故继续研究Hsp90特异性抑制剂对这些位置中的HER2的效应。发现在 MCF7细胞中，细胞溶质HER2蛋白质水平以及其它Hsp90验证激酶(例如Raf-1和ERK) 的活性通过Hsp90α/β抑制剂而非通过Grp94选择性抑制剂快速降低(图6f)，从而进一步确认在MCF7细胞中Hsp90是细胞溶质HER2的主要调控剂。
总之，在高HER2 SKBr3细胞而非低HER2 MCF7细胞中，Grp94的抑制或下调导致HER2的稳态水平降低。类似地，在高HER2 SKBr3细胞而非低HER2 MCF7细胞中， Hsp90α和Hsp90β二者的抑制或下调降低HER2水平，其中仅抑制Hsp90α同种同源物显著损害HER2稳定性。这些数据表明Hsp90同种同源物在HER2的陪伴中的肿瘤特异性参与。特定来说，其提出Hsp90α同种同源物对于低HER2细胞(例如MCF7)中的HER2 功能足够。另一方面，在具有过量HER2的细胞(例如SKBr3)中，所有三种Hsp90同种同源物似乎都起重要作用。
5.5.2.2 Grp94调控SKBr3细胞中的质膜HER2
接下来研究多种Hsp90同种同源物参与SKBr3细胞中的HER2调控的罕见需求。与MCF7不同，SKBr3细胞在质膜处表达高密度的HER2蛋白质(沙瓦尼，C.(Chavany，C.) 等人p185erbB2在活体内结合到GRP94。在p185erbB2耗尽之前p185erbB2/GRP94杂合物通过苯醌安沙霉素解离(p185erbB2 binds to GRP94 in vivo.Dissociation of the p185erbB2/GRP94 heterocomplex by benzoquinone ansamycins precedes depletion ofp185erbB2).生物化学杂志271，4974-4977(1996))，其中有趣的是还检测到Grp94(图 8a-d)而非Hsp90(图8c、d)。质膜相关Grp94代表总细胞Grp94的小但重要的部分(图8a-c)。发现质膜相关Grp94与HER2共定位(图8b，DMSO；图8c、d)且共沉淀(图8c、d)。特定复合物形成是通过Grp94/HER2复合物的化学和往复免疫纯化(图8c、d)和通过在细胞裂解物中利用Grp94特异性化学工具执行亲和纯化来确认，其中Grp94水平因Grp94特异性抗体的免疫纯化而降低(图8e)。
接下来研究SKBr3细胞的质膜处HER2与Grp94的独特缔合的生物意义。由于本文所述Grp94抑制剂靶向Grp94的ATP-结合袋，故其影响Grp94侣伴蛋白活性。因此，假设Grp94可作用于质膜处的HER2以稳定蛋白质并调控其功能。实际上，用Grp94选择性化合物短暂处理SKBr3细胞导致破坏质膜处的HER2的圆形架构，从而产生“细条”HER2图案(图8b、f PU-WS13)。在用拉帕替尼(图8f，拉帕替尼，一种结合到HER2 的ATP调控袋的小分子)直接抑制HER2时未观察到所述效应(金，T.E.和米伦，J.R. (Murren，J.R.)拉帕替尼二甲苯磺酸盐葛兰素史克(GlaxoSmithKline).研究药物杂志 (IDrugs)6，886-893(2003))，从而进一步确认PU-WS13对HER2的效应是经由Grp94调介。
发现在Grp94抑制时，HER2分子易位到早期核内体和质膜毗邻溶酶体(图8g，LAMP-1染色；和图7d，EEA1染色)。Grp94抑制的HER2不与ER和高尔基体结构共定位(图7d，钙联接蛋白(Calnexin)和58k-9染色)。膜HER2分子而非细胞溶质HER2分子在SKBr3细胞中的Grp94抑制时以时间依赖性方式减少(图8h)，总之，从而进一步证实 Grp94特定地调控SKBr3细胞中质膜处的HER2。
在SKBr3细胞和其它过表达HER2的乳癌细胞中，细胞膜处的高密度HER2酪氨酸激酶形成引起信号传导增加和若干存活和增殖诱导信号传导途径的活化，例如那些通过Raf-MAPK、AKT和STAT3通道化者(亚登，Y.和希利科沃夫斯基，M.X.解开ErbB信号传导网络.自然综述-分子细胞生物学2，127-137(2001))。对于Raf-MAPK轴的情形，HER2 促使Raf-1滞留于质膜中，从而引起MAP激酶级联的延长活化(张，L.(Zhang，L.)、比伊克，M.(Bewick，M.)和拉弗雷尼尔，R.M.(Lafrenie，R.M.)EGFR和ErbB2差异性调控 Raf-1易位与活化(EGFRand ErbB2 differentially regulate Raf-1 translocation and activation). 实验室研究(Lab.Invest.)82，71-78(2002))。进一步根据Grp94在调控质膜处的HER2功能的作用，发现SKBr3细胞中的Grp94的药理学失活引起在膜处而非在胞质溶胶中对 Raf-1-MAPK信号传导的快速抑制(图8i)。
总之，这些发现指示，在SKBr3细胞中，需要Grp94陪伴以维持高密度HER2架构和其信号传导在质膜处而非在胞质溶胶中的有效流线化(图8j)。在无Grp94陪伴的情况下，HER2的质膜架构被破坏，从而导致其信号传导能力停止。改变的质膜HER2分子被溶酶体和核内体结构吞食，最终引起HER2清除。
5.5.2.3 Hsp90α/β调控细胞溶质HER2物质
使用我们的同种同源物特异性化学工具组，已显示Grp94在调控高HER2 SKBr3细胞的质膜处的HER2中起关键作用。接下来希望研究Hsp90在调控细胞溶质HER2中的作用。与先前提出的Hsp90对细胞溶质HER2的专门作用一致，Hsp90α/β抑制剂不能干扰SKBr3细胞中的膜HER2架构，并且主要改变细胞溶质HER2物质(图8g；PU-29F)。因此，在Hsp90α/β抑制后，观察朝向分布遍及胞质溶胶的溶酶体和早期核内体结构的显著HER2重新分布(图8g，LAMP-1染色和图7d，EEA1染色；PU-29F)。另外，截至Hsp90α/β抑制后30min，细胞溶质而非膜相关HER2的稳态水平显著降低(图8h)，此类似于在MCF7 细胞中所见(图6f)。在细胞溶质HER2耗尽后，注意到质膜相关HER2减少(图8h)，从而确认先前提出的Hsp90在细胞溶质HER2物质的输送和调控中的作用(徐，W.、米诺姆， E.G.、金，J.S.、翠普，J.B.和奈克斯，L.M.Hsp90而不是Grp94调控新生ErbB2的细胞内输送和稳定性.细胞应力与侣伴蛋白7，91-96(2002))。
总之，数据指向细胞中的蛋白质组改变指定的HER2调控的不同Hsp90同种同源物需求(图9)。为陪伴过表达HER2的细胞(其中高密度/高信号传导HER2物质的维持是其致癌性质的机制)中改变的HER2表达和活性，细胞似乎采用Hsp90α、Hsp90β和Grp94。细胞溶质HER2需要Hsp90α和Hsp90β二者。异常高的质膜HER2水平需要Grp94。在具有低HER2表达的细胞中，与之相比，仅Hsp90α的活性似乎足以维持HER2功能，但敲弱研究指示，Hsp90β可补偿这些细胞中Hsp90α表达的损失(图7b、c)。
5.5.2.4仅抑制Grp94足以降低过表达HER2的细胞的活力
由于所鉴别Grp94在高HER2 SKBr3细胞中在质膜HER2稳定性和功能中的重要作用，接下来探询使Grp94失活是否降低SKBr3癌细胞活力。实际上，Grp94抑制(图10a) 和Grp94敲弱(图10b)二者都损害SKBr3活力。此效应并不限于SKBr3细胞系，这是因为观察到所测试的所有其它过表达HER2的乳癌细胞(例如AU565、BT474、MDA-MB-453 和MDA-MB-361)都对Grp94抑制敏感(图10a)。特定来说，在用PU-WS13处理这些细胞时，注意到早在处理后1-2h观察到的细胞在亚G1期中的快速累积(图10c)、PARP裂解(图 10d、e和图11a)以及展现早期和晚期细胞凋亡标记物的细胞显著增加(图10f)。
已特定设计利用7-AAD的膜联蛋白V细胞凋亡用于鉴别细胞凋亡和坏死细胞。膜联蛋白V(或膜联蛋白A5)是细胞内蛋白质的膜联蛋白家族的成员，其以钙依赖性方式结合到磷脂酰丝氨酸(PS)。PS通常仅在健康细胞中质膜的细胞内小叶上发现，但在早期细胞凋亡期间，膜不对称性损失且PS易位到外部小叶。随后可使用荧光染料标记的膜联蛋白 V特定地靶向并鉴别细胞凋亡细胞。仅膜联蛋白V结合无法区分细胞凋亡与坏死细胞。为帮助区分坏死与细胞凋亡细胞，使用7-氨基-放线菌素D(7-AAD)。早期细胞凋亡细胞将排除7-AAD，而晚期细胞凋亡细胞将阳性染色，这是因为这些染料通过进入核中，其中其结合到DNA。7-AAD(7-氨基-放线菌素D)具有高DNA结合常数且被完整细胞有效排除。在流式细胞分析期间，其可用于DNA分析和死细胞辨别。在通过488激光激发时，在光谱的远红范围(650nm长通滤波器)中检测7-AAD荧光。
如图11a至图11d中所示，泛-Hsp90抑制剂和细胞溶质Hsp90抑制剂二者都不能诱导两种HER2++细胞系SKBr3和AU565的细胞凋亡，如通过无PARP裂解(图11a、b) 和极少或无细胞凋亡(图11d)所证明。
重要的是，与泛-Hsp90和细胞溶质Hsp90抑制剂不同，PU-WS13不能活化反馈热休克反应，如通过极小或无Hsp70诱导所证明(图10d、e和图11a至11d)。尽管大体上耗尽HER2，但仅Hsp90α/β抑制在杀灭这些细胞方面的效率较低且相反地引发主要细胞生长抑制效应(图11b、c)。两种抑制剂均未使这些细胞中的ER Hsp70同种同源物Grp78显著增加(图5b、图11a至11d)。Grp94水平的下调也不能在SKBr3细胞中诱导Grp78(图 7b)。
5.5.2.5 Grp94抑制剂可用于治疗过表达HER2的胃癌
胃癌显示较差预后且是癌症有关的死亡的第二主要原因。估计其发病率为934,000 例，56％新病例在东亚，41％在中国，并且11％在日本。尽管目前在世界范围内基于氟嘧啶和铂的组合化学疗法的接受最广泛，但其益处未转化成较高整体存活率。尽管近期对胃癌的分子理解有进展，但在此恶性肿瘤的临床发展中仍显著缺乏靶向疗法。因此，需要用于胃癌的更有效疗法。在胃癌中，已鉴别EGFR、HER2和HER3过表达且表明与预后有关。因此，抑制经由包括HER2的异二聚物信号转导可能为患有胃癌的患者提供更多益处。最近，ToGA试验[曲妥珠单抗(赫赛汀)在HER2阳性晚期且不能手术的胃癌中的III期研究]在向过表达HER2的胃癌患者的化学疗法中添加曲妥珠单抗时显示存活益处且食品药品管理局(Foodand Drug Administration)已批准曲妥珠单抗用于HER2阳性转移性胃癌和胃食道连接部癌症。因此，已将抗HER2疗法鉴别为具有临床意义。HER2 的扩增与胃癌的肠病理亚型以及与从胃食道连接部产生的肿瘤相关。迄今为止对胃癌中 HER2扩增的发生率的最大分析来自最近报道的III期临床实验，其评价患有转移性胃癌的患者中曲妥珠单抗与化学疗法的组合。在此研究中，总HER2扩增率据报道为22％，且在患有胃食道连接部肿瘤的患者中百分比较高(34％)。
已发现表达高水平HER2的胃癌对Grp94抑制尤其敏感。另一方面，不过表达HER2的胃癌对Grp94抑制疗法不敏感。使用Grp94选择性抑制剂PU-WS13测试OE19(即HER2 基因100倍扩增的食道腺癌)对Grp94抑制的敏感性。同样，利用Grp94选择性抑制剂 PU-WS13针对对Grp94抑制的敏感性测试NCI-N87(即表达高水平的HER2的胃癌)的敏感性。如图12(上图)中所示，OE19和NCI-N87细胞二者都对Grp94抑制非常敏感。另一方面，MKN74(无HER2扩增的胃腺癌)对Grp94抑制不敏感。此外，如图12(下图) 中所示，对于OE19和NCI-N87细胞而非MKN74细胞，观察到展现早期和晚期细胞凋亡标记物的细胞显著增加。
5.5.3 EGFR依赖性肿瘤
位于染色体7p12上的表皮生长因子受体(EGFR)基因编码170kDa膜糖蛋白。在通过特异性配体(例如EGF)活化后，其固有激酶活化且起始多个信号传导途径。上调的EGFR 信号传导在众多种肿瘤中与进展到侵袭和转移相关。EGFR最初是从人类鳞状细胞癌细胞系A431纯化，所述细胞系过表达EGFR 2到100倍，这是由于相称的EGFR基因拷贝数的3到110倍增加所致。其后，已显示许多类型的上皮恶性肿瘤在细胞膜上表达增加水平的EGFR表达，伴随或不伴随基因扩增。已将EGFR鉴别为头颈癌、乳癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌和食道癌中的强预后指示物。已显示高EGFR表达与一系列肿瘤(包括鼻咽癌、NSCLC、卵巢癌和乳癌)中的较差存活相关。在患有鼻咽癌的患者中，还已注意到高EGFR水平与较差存活之间显著相关。在卵巢癌样品中，61％评分为EGFR阳性，并且在EGFR表达与较短整体无进展存活之间观察到显著相关性。此研究还使EGFR状态与对含铂化学疗法的抗性相关。另外，若干研究已报道，EGFR表达预测患有乳癌的患者的显著较短的无疾病整体存活。潜在地解释与较差患者结果的相关性，EGFR的表达与对激素疗法和化学治疗剂二者的抗性相关联。越来越多证据证实，生长因子途径与乳癌生长控制中的雌激素受体信号传导高度相互作用。在他莫昔芬抗性乳癌细胞系中，抗雌激素抗性与EGFR途径的上调相关。
本揭示内容的Grp94抑制剂可用于治疗EGFR依赖性癌症，例如胰脏癌、颈癌、乳癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌和食道癌。已发现在过表达EGFR的细胞中抑制或耗尽Grp94 引起细胞凋亡以及由EGFR调介的信号传导事件减少或终止。此外，Grp94的抑制与抗细胞凋亡蛋白(包括热休克蛋白70(Hsp70))的反馈上调无关。因此，选择性EGFR抑制剂能够以显著大于泛-Hsp90抑制剂的程度诱导过表达HER2的癌细胞的细胞凋亡，其中 Hsp70的上调减轻抑制剂的抗细胞凋亡效应。因此，本揭示内容提供选择性诱导过表达 EGFR的癌细胞的细胞凋亡的方法。此外，本揭示内容提供通过投与治疗有效量的选择性Grp94抑制剂治疗过表达EGFR的癌症的方法。
在具体实施例中，本揭示内容提供通过投与治疗有效量的选择性Grp94抑制剂治疗过表达EGFR的乳癌的方法。在一些所述实施例中，乳癌是三重阴性乳癌。在其它实施例中，本揭示内容提供通过投与治疗有效量的选择性Grp94抑制剂治疗过表达EGFR的胰脏癌的方法。在其它实施例中，本揭示内容提供通过投与治疗有效量的选择性Grp94 抑制剂治疗过表达HER2的卵巢癌的方法。
在一些实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂可用于治疗内分泌抗性乳癌和卵巢癌 (例如，对他莫昔芬具有抗性的肿瘤)。本揭示内容的Grp94抑制剂可与抗雌激素药(例如选择性雌激素受体调节剂(例如，他莫昔芬)或芳香酶抑制剂(例如，依西美坦或阿那曲唑)组合使用。
本揭示内容的Grp94抑制剂可用于治疗患有过表达EGFR的三重阴性乳癌的患者。如图13a-c中所示，过表达EGFR的三重阴性乳癌细胞对选择性Grp94抑制剂PU-WS13 敏感。针对细胞凋亡细胞的存在通过膜联蛋白V染色(13a、13b)和针对裂解PARP的存在通过免疫印迹(13c)测试过表达EGFR的三重阴性乳癌细胞的敏感性。展现早期和晚期细胞凋亡标记物的三重阴性乳癌细胞显著增加(图13a、b)且在Grp94而非Hsp90抑制后 PARP裂解增加(图13c)。因此，Grp94抑制引起三重阴性乳癌细胞的细胞凋亡。本揭示内容的Grp94抑制剂可用于治疗患有过表达EGFR的胰脏癌的患者。EGFR家族蛋白质 (EGFR是跨膜蛋白质的受体酪氨酸激酶超家族的成员)的配体活化引起多种下游信号传导级联的干扰。基于本文所述研究，尚未发现Grp94在质膜处、尤其在需要EGFR以使扩增信号传导经由受体通道化的细胞(例如，过表达EGFR的胰脏细胞)中维持高密度 EGFR形成的架构。因此，Grp94抑制引起EGFR信号传导的显著衰减。
如图14a和14b中所示，过表达EGFR的癌细胞对Grp94抑制剂PU-WS13敏感。相对于在Capan-2细胞中所观察到者，PANC-1细胞中的EGFR水平是10-17倍。CFPAC 也表达低EGFR水平。HER2水平在细胞系之间类似。选择性Grp94抑制剂PU-WS13有效抑制过表达EGFR的PANC-1细胞的生长，但对Capan-2细胞无效应(图14a)。Grp94 选择性抑制剂对CFPAC细胞生长的效应不大(图14a)。此外，如图14b中所示，对于 PANC-1细胞而非Capan-2细胞观察到展现早期和晚期细胞凋亡标记物的细胞显著增加。相反，泛-Hsp90抑制剂PU-H71(图1a)和HSP90α抑制剂PU29F对诱导PANC-1细胞的细胞凋亡的效应极小(图15)。
应注意，据报道过表达EGFR的PANC1细胞对EGFR抑制剂埃罗替尼具有抗性(分子癌症治疗(Mol Cancer Ther)2006；5：2051-2059)，表明在胰脏癌中Grp94抑制剂对EGFR 信号传导的抑制比EGFR激酶抑制剂对EGFR的抑制更有效。埃罗替尼(塔西法(Tarceva)， OSI-774，OSI制药公司(OSI Pharmaceuticals，Inc.))是低分子量口服生物利用EGFR抑制剂，且展现相对于其它受体酪氨酸激酶(包括PDGFR、胰岛素样生长因子-I受体和HER-2)对 EGFR的＞100倍的选择性。
本揭示内容的Grp94抑制剂可用于治疗对EGFR抑制剂疗法具有抗性的EGFR依赖性癌症。在一个所述实施例中，癌症是对EGFR抑制剂疗法具有抗性的胰脏癌。Grp94 抑制剂可与EGFR抑制剂组合使用。在具体实施例中，Grp94抑制剂与EGFR抑制剂埃罗替尼组合用于治疗胰脏癌。
在至多60％的卵巢癌中检测到异常表皮生长因子受体(EGFR)表达且其在所有组织学亚型中出现。此外，异常EGFR表达与卵巢癌患者的较差结果相关。已在9％-62％的人类卵巢癌中检测到EGFR蛋白质的过表达；这些研究的频率差异可能反映不同抗体的利用和过表达的截止值。EGFR基因扩增或蛋白质过表达横跨所有上皮卵巢癌组织型出现。增加的EGFR表达与高肿瘤等级、高细胞增殖指数、异常P53表达和较差患者结果相关(西瓦克(Siwak)等人，肿瘤学杂志(Journal of Oncology)2010；doi：10.1155/2010/568938)。本揭示内容的Grp94抑制剂可用于治疗EGFR依赖性卵巢癌。
5.5.4 Grp94抑制剂不影响正常细胞中的RTK表达和活性
图24显示通过HER2或EGFR受体酪氨酸激酶的过表达驱动的一组癌细胞系中的PU-WS13的活性。为进行比较，还在正常细胞系人类乳房上皮细胞(HMEC)中测试所述试剂。应注意，Grp94抑制剂PU-WS13不影响特征在于EGFR的正常表达和功能的正常细胞中(例如HMEC细胞中)的EGFR和其下游信号传导。不希望受限于任何具体理论，据信Grp94选择性抑制剂因此可具有比直接RTK调节剂(即TKI或抗体)更好的治疗指数，这是因为其将仅在致癌过表达的条件中作用于RTK(参见TNBC细胞系对HMEC中的 EGFR)。因此，其应没有一般与直接抑制RTK的疗法相关的副作用(对于曲妥珠单抗和拉帕替尼为心脏毒性，对于卡奈替尼(Canertinib，一种不可逆的泛-HER TKI)为腹泻、无力和口炎；由于正常组织中的RTK抑制，对于EGFR/HER2 TKI为腹泻和皮疹)。Grp94抑制还应在EGFR+肿瘤中比直接TKI更具活性。约一半三重阴性乳癌(TNBC)和炎症乳癌 (IBC)病例过表达EGFR，然而，测试EGFR抑制剂的临床试验报道没有益处或益处有限(益田H.(Masuda H.)等人，乳癌研究和治疗(BreastCancer Res Treat).2012年11月； 136(2)：331-45)。不希望受限于任何具体理论，据信所述无效性是由于EGFR与c-Met或其它RTK之间的串扰所致，这是因为通过siRNA或通过诱导EGFR稳健降解的抗体混合物敲弱EGFR导致TNBC细胞的活力降低(米勒(Mueller)等人，乳癌研究(Breast Cancer Res)2012年7月12日；14(4)：R104；费拉罗(Ferraro)等人，美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A).2013年1月29日；110(5)：1815-20.PMID：23319610)。根据我们的发现， Grp94抑制还诱导TNBC细胞中的稳健EGFR降解和细胞凋亡，并且此效应可提供优于 TKI的治疗优势。此指示在某些肿瘤中，例如在那些对血浆RTK过表达的存活成瘾者中， Grp94抑制可提供比泛-HSP90抑制剂更好的肿瘤抑制。尽管Grp94抑制下调RTK水平和其下游信号传导(类似于泛-HSP90抑制剂)，但其不能上调反馈应力反应(即Hsp70诱导)。
细胞系
细胞SKBr3、BT474、MDA-MB-468、HCC1806和MDA-MB-453是从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)获得。在补充有1％Glutamax和1％青霉素和链霉素(Pen/Strep)的McCoy's 5A(10％FBS、SKBr3)、DME/F12(10％FBS、BT474 和MDA-MB-468)、RPMI(10％FBS、HCC1806)和L-15(20％FBS、MDA-MB-453)中以常规方式培养细胞。HMEC细胞是从龙沙(Lonza)购得且使用Clonetics MEGM Bulletkit 培养。在培养时，将L-15培养基中的细胞保持于37℃下无CO2的加湿气氛中且于37℃下在具有CO2的加湿细胞培育箱中培育所有其它细胞系。
生长抑制分析
使用染料阿尔玛蓝(Alamar blue)评价抑制剂的抗增殖效应。这种试剂在细胞培养基中提供细胞活力的快速目标测量，并且其使用指示物染料刃天青(resazurin)测量细胞的代谢能力，即细胞活力的指示物。简单来说，将MDA-MB-468细胞以1500个细胞/孔平铺于 Costar 96孔板上。在药物处理之前使细胞在37℃下培育24h。以指示浓度一式三份地添加药物，并且将板培育72h。添加阿尔玛蓝(440μM)，并且在6h后使用Softmax Pro 6 软件(荧光强度模式，激发530nm，发射580nm，利用560nm二向色镜)读板。使用 GraphPad Prism5分析结果。通过比较从经处理细胞对对照细胞获得的荧光读数，虑及初始细胞群体(零时间)计算细胞生长抑制％。将IC50计算为将细胞生长抑制50％的药物浓度。
5.5.5相对于持家(即正常、生理)功能，Grp94抑制剂针对肿瘤有关Grp94功能的活性较高
图25a至图25d显示Grp94抑制剂PU-WS13针对持家功能和肿瘤有关Grp94功能的活性。出于此目的，使用具有MDA-MB-468肿瘤(过表达EGFR的三重阴性乳房肿瘤) 的小鼠。由于所提供Grp94抑制剂对肿瘤Grp94的特异性亲和性，执行出于此目的加以调整的PK/PD研究。在此PK/PD研究中，纳入两个时间点，即投与后杀死的2h和24h 时间。纳入早期时间点以测试试剂到其作用位点(即肿瘤)的生物分布；PU-WS13易于分布到肿瘤物质，且在2h时在肿瘤中记录到约850μM，与之相比在血浆中记录到100μM (图25a)。在24h时，试剂在肿瘤对血浆中的比率从投与单一剂量后2h的7∶1增加到200∶1，并且AUC0-24h肿瘤/血浆是9134/1255，指示PU-WS13在肿瘤物质中的特异性滞留(图25a； AUC单位是μM×h-1)。在投与75mg/kg单一剂量后24h，PU-WS13在肿瘤中的浓度是0.5 μM。与肿瘤PK相关的相关PD效应即反映PU-WS13的肿瘤浓度且指示下游EGFR信号传导的部分抑制(图25b，参见p-AKT和p-ERK抑制)，证实PU-WS13于此浓度下作用于肿瘤Grp94。还分析PU-WS13对正常Grp94功能的潜在抑制。使用条件性敲弱小鼠模型鉴别Grp94的“持家”功能；所述研究发现Grp94在正常GI细胞中的作用，即调控 Wnt受体LRP6(刘(Liu)等人，美国国家科学院院刊.2013年4月23日；110(17)：6877-82)。由于大部分小分子(例如PU-WS13)主要是经由GI道清除，故GI是随试剂在体内期间暴露于所述试剂最多的正常器官。胃和大肠的AUC0-24h实际上分别比肿瘤AUC0-24h高1.4倍和2倍(图25c)；然而，未能检测到LRP6(正常GI中由“持家”Grp94调控的Wnt受体)显著减少(图25d)。将PU-WS13的投与剂量增加到150mg/kg；GI道的AUC0-24h增加约6倍，然而，未观察到急性毒性或LRP6水平的变化。
从塔克尼农场(Taconic Farms)获得4到6周龄的nu/nu无胸腺雌性小鼠。实验是在机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准的方案下实施，并且遵守研究动物的适当且人道使用的机构指南。使用20规针在小鼠右侧腹中皮下植入 MDA-MB-468(1×107个细胞)并使其生长。在疗法期间，所有小鼠都在其饮用水中接受力百汀(Augmentin)(阿莫西林(amoxicillin)/克拉维酸钾(clavulanatepotassium)；史克必成 (SmithKline Beecham))。
对于药效学和药物代谢动力学分析，给予具有确立MDA-MB-468肿瘤的小鼠分配剂量的抑制剂或媒剂(腹膜腔内)。通过CO2窒息使小鼠无痛致死且在抑制剂投与后的指定时间收获所有相关组织(调配于60mM柠檬酸盐缓冲液中的30％captisol中)。将组织在液氮中急骤冷冻，并且分成两半。将一半冷冻组织干燥并称重，之后在750μl水/乙腈 (70：30)溶液中均质化。用600μl二氯甲烷从组织两次萃取试样且随后在genevac中干燥。随后，将试样溶解于溶剂(75％水∶25％乙腈+0.1％甲酸)中，于4℃下旋转沉降，并且通过高效LC-MS/MS使用氟派醇(haloperidol)作为内标测定组织中的抑制剂浓度。在6410 LC-MS/MS系统(安捷伦科技(Agilent Technologies))上执行化合物分析。使用Zorbax Eclipse XDB-C18管柱(2.1×50mm，3.5μm)进行LC分离，并且将分析物在等度条件(65％ H2O+0.1％HCOOH∶35％CH3CN)下以0.35ml/min的流速洗脱5分钟。
评价另一半肿瘤组织的EGFR和其它PD标记物的变化，如实验室中所确立。简单来说，将肿瘤组织与钢珠粒和组织萃取缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 8.0)、150mM NaCl、 2mMEDTA、0.25％脱氧胆酸钠、0.5％NP40、0.25％Triton X-100、蛋白酶抑制剂)混合。于4℃下通过子弹破碎仪(Bullet Blender)(奈科斯特艾德(Next Advance)公司)均质化试样。随后将裂解物转移到洁净管并于4℃下以13,200rpm离心5min。在通过BCA定量蛋白质浓度后，将25-100ug蛋白质加载到SDS-PAGE中并使其经受免疫印迹。
免疫印迹
将细胞用DMSO(媒剂)或指示化合物处理24hr并在补充有混合剂蛋白酶抑制剂(罗氏(Roche))的RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 8.0)、150mM NaCl、0.5％脱氧胆酸钠和0.5％NP40)中裂解以产生全细胞裂解物。使用BCA试剂盒(皮尔斯(Pierce))根据制造商说明书测定蛋白质浓度。通过SDS-PAGE电泳解析蛋白质裂解物(10-50μg)，将其转移到硝化纤维素膜上并用针对以下的指示一级抗体探测：HER2(赛迈德(Zymed)，28004)、EGFR (细胞信号传导(Cell Signaling)，4267)、β-肌动蛋白(西格玛(Sigma)，A1978)、磷酸 -STAT3(细胞信号传导，9145)、STAT3(细胞信号传导，12640)、Hsp70(斯托珍(Stressgen)， SPA-810)、ERK1/2(细胞信号传导，4695)、磷酸-ERK1/2(细胞信号传导，4370)、磷酸-AKT (细胞信号传导，4060)、AKT(细胞信号传导，9272)、裂解PARP(普洛麦格(Promega)， G7341)和LRP6(细胞信号传导，2560)。在洗去过量抗体后，将膜与相应的结合辣根过氧化物酶(HRP)的二级抗体一起培育。通过放射自显影使用增强的化学发光检测系统(通用医疗(GE Healthcare))根据制造商说明书使印迹显现。对于所有凝胶，使用β-肌动蛋白作为蛋白质载量对照。
5.5.6 IGF1R依赖性肿瘤
本揭示内容的Grp94抑制剂可用于治疗胰岛素生长因子1受体(IGF1R)依赖性肿瘤。具体来说，本揭示内容的Grp94抑制剂可用于治疗IGF1R的表达变化的癌症，其中所述受体为致病机制和肿瘤进展所必需。
除在正常细胞生长、维持和发育中起重要作用外，胰岛素样生长因子受体(IGF1R)和其配体还在恶性表型的确立和维持中起重要作用。IGF-1和IGF-II配体与IGF1R的结合起始导致促有丝分裂信号传导途径(Ras/Raf/MAPK)和抗细胞凋亡/存活途径 (PI3K-Akt/mTOP)活化的一连串事件，从而引起肿瘤细胞的增殖、转化和存活(D.里罗伊斯(D.LeRoith)等人，癌症快报(Cancer Lett.)，195(2)：127-37(2003)；R.巴塞尔加(R.Baserga) 等人，国际癌症杂志(Int.J.Cancer)；107：873-7(2003))。已在多种肿瘤类型中观察到IGF1R 过表达和/或增强活性，此表明靶向此途径的试剂的潜在治疗用途是广泛的。IGF1R在多个肿瘤类型中提供关键存活信号。这种受体的表达是较差预后的指示物，因此，其是作为用以抑制癌症患者中多个肿瘤类型进展的癌症疗法的有吸引力且令人注目的靶出现。近年来已探索多种药物发现方法以调节IGF1R的功能。已显示在临床前模型中旨在使用多种策略降低受体数或酶活性的方法可逆转肿瘤细胞中的恶性表型。这些策略包括反义 (L.荣(L.Long)等人，癌症研究(Cancer Res)，55(5)：1006-9(1995)，D.安德鲁斯(D.Andrews) 等人，临床肿瘤学杂志(J.Clin.Oncol.)，19(8)：2189-200(2001))、单克隆抗体(C.阿尔特加(C.Arteaga)等人，癌症研究，49(22)：6237-41(1989))、小分子抑制剂(M.威特曼(M.Wittman) 等人，医药化学杂志.，9月8日；48(18)：5639-43(2005)，C.加西亚-埃切维里亚(C. Garcia-Echeverria)等人，癌细胞(Cancer Cell)，5(3)：231-9(2004))、IGF-1模拟肽(Z.皮耶特日科夫斯基(Z.Pietrzkowski)等人，癌症研究，53(5)：1102-6(1993))以及无酶活性的显性阴性突变体(C.丹布罗西奥(C.D′Ambrosio)等人，癌症研究，56(17)：4013-20(1996))。
本揭示内容提供以下证据：Grp94抑制剂有效治疗IGF1R表达变化且所述受体为致病机制和肿瘤进展所必需的癌症。具体来说，本揭示内容的Grp94抑制剂能够诱导过表达IGF1R的细胞的细胞凋亡。例如，图16显示，Grp94选择性抑制剂PU-WS13能够诱导两种过表达IGF1R的尤因肉瘤细胞系(A673和TC71)的细胞凋亡。特定来说，展现早期和晚期细胞凋亡的标记物的尤因肉瘤细胞显著增加。
5.5.7 TGFβ依赖性肿瘤
转化生长因子-β(TGF-β)是调控细胞增殖、细胞凋亡、分化、迁移和侵袭的多效细胞因子。TGF-β经由跨膜I型(TβRI)和II型(TβRII)受体传导信号以起始下游信号传导。在标准途径中，TGF-β结合到TβRII会募集并磷酸化TβRI，从而引起TβRI活化。活化的TβRI 磷酸化受体调控的Smad蛋白质Smad2和Smad3。随后磷酸化的Smad2和Smad3与Smad4 共缔合，易位到核中并通过结合到TGF-β调控基因启动子中的Smad特异性结合元件来调控基因表达。在人类中，已在许多癌症类型中检测到TGF-β过表达且其与肿瘤转移、进展和预后相关。许多研究已指示，TGF-β可根据情况发挥肿瘤抑制剂和促进剂功能。 TGF-β通过抑制细胞增殖用作肿瘤抑制剂，而作为肿瘤促进剂，TGF-β诱导上皮-间质转换(EMT)、细胞运动和侵袭。
将EMT识别为胚胎发育和转移的关键过程。经历EMT的细胞下调E-钙粘蛋白上皮标记物的表达且增加N-钙粘蛋白(一种间质标记物)的表达。已显示这个过程是经由一组转录因子(包括Snail和Slug锌指蛋白、Twist bHLH因子和ZEB1锌指蛋白)进行。TGF-β是EMT的潜在诱导剂，其首先在培养的正常乳房上皮细胞中识别出。TGF-β可通过活化 Smad依赖性和非Smad依赖性途径诱导EMT。Smad2或Smad3与Smad4的异位表达增强EMT，而显性阴性Smad2、Smad3或Smad4的异位表达阻断TGF-β诱导的EMT。
TGF-β在癌症进展的早期阶段中用作肿瘤抑制剂，并且其在晚期阶段成为肿瘤促进剂。已在人类卵巢肿瘤中报道TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3过表达。人们认为卵巢癌是从正常卵巢表面上皮(OSE)产生。已显示TGF-β可抑制人类OSE增殖并诱导细胞凋亡，其可防止细胞在正常排卵周期期间过度增殖。在卵巢癌晚期中，TGF-β增强肿瘤细胞增殖并通过诱导EMT促进转移。
最近已认识到，高级浆液性卵巢癌(HGC)和低级浆液性卵巢癌(LGC)是从不同分子途径产生的基础不同的肿瘤类型。与HGC相比，LGC占所有浆液性卵巢癌的小比例(9％)。侵袭性LGC是从非侵袭性交界浆液性卵巢肿瘤(SBOT)产生。在卵巢癌中，据信TGF-β诱导的EMT在细胞侵袭和转移的调控中起重要作用。已显示，TGF-β和TβRII在原代人类交界卵巢肿瘤中表达。最近研究证实，E-钙粘蛋白下调诱导SBOT细胞侵袭，表明EMT 参与从非侵袭性SBOT进展到侵袭性LGC，且TGF-β通过活化EMT诱导SBOT侵袭(程 J-C(Cheng J-C)，(2012)TGF-β通过活化EMT诱导浆液性交界卵巢肿瘤细胞侵袭，但在低等级浆液性卵巢癌细胞中触发细胞凋亡(TGF-Beta Induces Serous Borderline Ovarian Tumor Cell Invasion byActivating EMT but Triggers Apoptosis in Low-Grade Serous Ovarian CarcinomaCells).公共科学图书馆-综合(PLoS ONE)7(8)：e42436.doi：10.1371)。
PEO1是源自患有分化不良的浆液性腺癌的患者的腹膜腹水的恶性渗出液的粘附细胞系。顺铂敏感性卵巢癌细胞系PEO1和顺铂抗性PEO4是在治疗前且在对基于铂的化学疗法产生抗性后从同一患者建立。PEO1和PEO4表达IGF-I的mRNA和IGF I型、IGF II 型和胰岛素受体的mRNA；I型IGF受体的存在是通过免疫细胞化学来确认。IGF-I和胰岛素显著刺激PEO1和PEO4的增殖。二者都表达TGFβ1和3的mRNA(巴特利特(Bartlett) 等人，英国癌症杂 志(Brit J.Cancer.)1992年5月；65(5)：655-60)。TGFβ受体途径在这些细胞中也有所改变。
5.5.8 Grp94抑制剂的抗血管生成效应
最近，费纳提(Finotti)等人证实，Grp94通过细胞因子样机制促进人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)的血管生成转化，并且这种效应在Grp94呈与人类IgG的复合物时更显著(特拉门托齐(Tramentozzi)等人，2008；特拉门托齐等人，2009)。已用从1型糖尿病个体的血浆纯化的IgG与Grp94的复合物观察到类似的强血管生成转化性质，这个发现间接证明这些复合物在活体内促进和维持炎症反应的能力，从而预测稳定血管改变的发生。如下文所论述，显示Grp94的增殖和血管生成-转化能力受Grp94抑制影响。
在Grp94抑制剂PU-H54不存在和存在下在HUVEC培养物中测试从糖尿病个体血浆纯化的天然Grp94和含IgG部分(进一步称作峰2)二者。如中图18b所示，利用Grp94 和峰2观察的形态变化类似于那些通常表征内皮细胞分化成毛细血管样结构者，其中放大细胞的长细胞质突出彼此连接以毗连散布有较小细胞簇的新管的腔。PU-H54尤其在 10μM的最高浓度下能够改变由Grp94和峰2诱导的HUVEC的血管生成样转化。总之，在PU-H54存在下观察到的形态变化显示，PU-H54在其IC50下展示对HUVEC的抗血管生成效应，同时其不显著影响细胞增殖(参见图18a)。
5.5.9炎症性疾病
类铎受体(TLR)在炎症反应中起重要作用。Grp94陪伴多重TLR，并且为这些受体的功能所需。TLR9检测非甲基化DNA且已知在全身性红斑狼疮或类风湿性关节炎中起作用。最近研究证实Grp94在TLR9稳定性和构象中的作用。基于下述实验，已发现本揭示内容的Grp94抑制剂能够经由抑制类铎受体(TLR)、尤其TLR9的Grp94陪伴来调节炎症反应。在具体实施例中，本揭示内容的Grp94抑制剂可用于治疗炎症疾病，例如红斑狼疮和类风湿性关节炎。
为评价Grp94抑制剂对针对刺激的TLR9反应的效应，用选择性Grp94抑制剂 PU-WS13(图19a)和PU-H54(图19b)处理细胞。TLR9配体CpG DNA诱导从小鼠巨噬细胞(RAW264.7)产生TNF-α。用PU-WS13(图19a)和PU-H54(图19b)处理以浓度依赖性方式抑制这种反应。仅用媒剂处理不会抑制信号传导(未显示)。因此，这些研究表明，选择性Grp94抑制剂在TLR9起作用的疾病中改良炎症症状。
5.6荧光偏振分析
本揭示内容提供通用实验荧光偏振(FP)分析，其可快速并精确地测试所有主要Hsp90 同种同源物的结合亲和性，且测试范围跨越低纳摩尔浓度到毫摩尔浓度结合亲和性。
5.6.1 FP探针的研发
大多数迄今已公开且用于评定小分子与四种Hsp90同种同源物的结合的分析(例如固有色氨酸荧光、亲和性-树脂竞争性结合和等温滴定量热法)由于其利用大量蛋白质而费力且成本高。对于细胞溶质Hsp90，FP分析已成为最广泛用于鉴别并测试Hsp90抑制剂的分析。为什么FP是测量蛋白质-配体相互作用的理想方法以及为什么其成为Hsp90的最佳工具存在多种原因。首先，其快速、均质(也就是无需分离游离和结合配体)、具有高再现性且便于自动化分析。通过简单混合蛋白质与荧光标记配体，FP能够在溶液中实时测量蛋白质-配体相互作用，其中荧光标记配体(也称作FP探针)与蛋白质的结合引起偏振值增加且与结合配体的分率成正比。其理论最早由佩兰(Perrin)于1926年描述且是基于以下观察：如果荧光分子在荧光团激发期间保持静止，那么溶液中经平面偏振光激发的所述分子会将光发射回固定平面(即光保持偏振)。然而，分子旋转且翻转，且向其中发射光的平面与用于初始激发的平面不同。然而，在小探针结合到蛋白质(即缓慢旋转的大分子) 后，运动性降低，导致较高FP。结合到蛋白质的未标记配体将与探针竞争，导致较低FP。因此，FP提供探针结合到蛋白质的程度的直接读数。第二，FP还非常适于Hsp90，这是因为其是无需改造蛋白质的分析。如所报道，Hsp90是高柔性分子侣伴蛋白，其功能对其构象模态的干扰(例如标记的附接可导致者)极为敏感，且因此FP最适合于这类蛋白质。第三，存在多种Hsp90抑制剂化学型，已广泛研发其化学性质且通过晶体学揭示其与 Hsp90的结合，并且因此，可获得FP探针的选择和关于其荧光标记位点的了解。然而，迄今为止，尚未报道有效测试小分子对所有四种Hsp90同种同源物的亲和性和选择性的 FP分析。
已报道结合到NBD的若干用于Hsp90的FP示踪剂且包括许多基于格尔德霉素(GM)者(GM-BODIPY、GM-Cy3b)和两种基于吡唑架构的羧基荧光素(FAM)探针 (VER-00045864和VER-00051001)。最近，已报道桑羧氟酰胺(Sansalvamide)A-酰胺衍生物的FP探针，其与其它探针相反，在N-末端/中间结构域处结合Hsp90。
上文提到的探针都未针对其在利用每一同种同源物的FP分析中作为示踪剂的适宜性进行过系统性评定。尽管GM和吡唑探针已广泛用于测量与癌细胞裂解物中Hsp90α、Hsp90β以及总Hsp90的结合，但其在测量与Grp94和Trap-1的结合中的使用更有限。我们自己已发现，GM-Cy3b不适合作为Trap-1的示踪剂。为得到适宜的分析范围，其使用需要大量蛋白质且因此较不适于大型结构-活性关系研究。
因此，本文继续基于经由具有荧光素(FITC)的不同连接体标记的Hsp90抑制剂PU-H71设计FP探针。假设由于其已知结合模式和充分确立的化学，可围绕这种配体产生符合同种同源物选择性测试的有用FP探针。分析中还包括化合物40，其为对于流式细胞术和荧光显微镜具有最佳性质的PU-H71的FITC衍生物(图20)。参见塔尔多内，T.；戈麦斯-达伽马，E.M.(Gomes-DaGama，E.M.)；钟，H.(Zong，H.)；森，S.(Sen，S.)；阿尔波， M.L.(Alpaugh，M.L.)；扎托斯基，D.(Zatorska，D.)；阿隆索-萨瓦德尔，R.(Alonso-Sabadell， R.)；古茨曼，M.L.(Guzman，M.L.)；谢尔西斯，G.用于流式细胞术和荧光显微术中的针对热休克蛋白90的嘌呤-架构荧光探针的合成(Synthesis of purine-scaffold fluorescent probesfor heat shock protein 90 with use in flow cytometry and fluorescencemicroscopy).生物有机化学与医药化学通讯(Bioorg.Med.Chem.Lett.)2011，21，5347-5352。
可根据可用结构研究针对PU-H71预测连接体和其附接模式二者，由于所述二者可影响与靶蛋白的结合，故其在FP化学探针的合成中都很重要。对于适宜FP探针的制备，同样重要的是，由于螺旋桨效应连接体不能过长或柔性过大。由于染料附接中的柔性而去偏振(称作“螺旋桨效应”)扭曲了荧光偏振与分子量之间的关系。因此，在荧光偏振分析探针的制备中，通常优选地使用在荧光团与反应基团之间无长脂族连接体的染料。
为确定最适于结合到所有Hsp90同种同源物的连接体长度，将连接体修饰的PU-H71 配体对接到相应Hsp90同种同源物中，即Hsp90α(PDB ID：2FWZ_ENREF_32(伊莫尔米诺，R.M.；姜，Y.；谢尔西斯，G.；格沃斯，D.T.8-芳基-硫基腺嘌呤类Hsp90抑制剂的结构和量子化学研究.医药化学杂志.2006，49，4953-4960.))、Hsp90β(PDB ID：3NMQ(尹，T. J.(Yun，T.J.)；哈宁，E.K.(Harning，E.K.)；吉萨，K.(Giza，K.)；拉巴赫，D.(Rabah，D.)；李，P.(Li，P.)；阿尔恩特，J.W.(Arndt，J.W.)；卢凯蒂，D.(Luchetti，D.)；比亚蒙特，M.A. (Biamonte，M.A.)；史，J.(Shi，J.)；龙格尔，K.(Lundgren，K.)；曼宁，A.(Manning，A.)；盖瑞，M.R.(Kehry，M.R.)热休克蛋白90的合成抑制剂EC144在炎症和自体免疫模型中阻断先天和适应性免疫反应(EC144，a Synthetic Inhibitor of Heat Shock Protein 90，Blocks Innateand Adaptive Immune Responses in Models of Inflammation and Autoimmunity).免疫学杂志(The Journal of Immunology)2011，186，563-575))、Grp94(PDB ID：3O2F，2EXL(伊莫尔米诺，R.M.；梅茨格，L.E.(Metzger，L.E.)；里尔顿，P.N.(Reardon，P.N.)；道林斯，D.E.；布莱格，B.S.(Blagg，B.S.)；格沃斯，D.T.配体和侣伴蛋白在抑制剂结合的 Hsp90和GRP94中的不同位姿：暗示同种同源物特异性药物设计.分子生物学杂志2009， 388，1033-1042))和Trap-1(同源性模型(Homology Model))。FITC经由至少三碳连接体共价键结到嘌呤-架构的N-9位，因为这可使探针朝向溶剂取向，而不影响与靶蛋白的结合 (图21a)。较短连接体可导致探针与所有同种同源物中定位于结合位点出口处的亮氨酸残基(Hsp90α和Hsp90β中的Leu107、Grp94中的Leu163和Trap-1中的Leu172)之间对撞(对于Hsp90α，图21b)。
为确定最适于FP性质的链长度，合成多种具有介于3到8个碳范围内的连接体的探针(方案20)。这些探针是通过三步式序列从112制得，以利用ω-溴酞酰亚胺N9-烷基化开始，从而得到113a-113d(方案20)。在用肼暴露胺并附接FITC后，在HPLC纯化后获得114a-114d(方案20)。
5.6.2 FP探针与Hsp90同种同源物的结合
首先评价合成FITC-衍生物作为与癌细胞均质物中的Hsp90结合的FP示踪剂的潜能 (图22a)。最初通过用递增量的裂解物滴定直到50μg总蛋白质来评价潜在示踪剂(图22a)。为可用于FP，探针的结合亲和性应较高且结合范围(即分析范围，定义为饱和时的mP值减去仅针对探针记录的mP)应较大。如图22a中所观察，随着裂解物和因此Hsp90的量增加，分析范围也有所增加。对于所有探针都观察到良好性能，且对于化合物115a，优异分析范围＞100mP。类似于其它Hsp90FP分析探针，当在4℃下测量以维持Hsp90的适当折叠时，化合物115a与Hsp90之间的结合分析经8h达到平衡且保持稳定24h以上 (未显示)。尽管化合物115a(具有3碳连接体的类似物)最适合，但化合物40(化合物115a 的N-异丙基类似物)和化合物115b和115c(分别是4碳或6碳连接体化合物)的性能也可接受(图22a)。
接下来在测量不同浓度蛋白质存在下的配体结合的标准饱和结合实验中测定这些配体作为Hsp90同种同源物的探针的能力(图22b-c)。总之，利用化合物115a的饱和结合实验显示其是每一Hsp90同种同源物的优异示踪剂，且分析范围＞150mP，且对于Hsp90α、Hsp90β、Grp94和Trap-1，表观Kd分别＝1.4、1.6、6.6和5.9nM(图22b)，且本文进一步继续在评价Hsp90抑制剂和Hsp90内源性配体的同种同源物选择性结合中使用其作为探针。有趣的是，化合物40对Hsp90α、Hsp90β和Trap-1显示超过Grp94的1-log优先性(对于Hsp90α、Hsp90β、Grp94和Trap-1，表观Kd分别＝3.9、2.8、30.7和5.8nM)，且对于Grp94分析范围较差，即小于100mP(图22c)。
5.6.3.FP分析用于评价小分子对Hsp90同种同源物的选择性和亲和性的适宜性
已发现有效结合到所有四种Hsp90同种同源物的探针，接下来验证其评价小分子配体的同种同源物亲和性和选择性的能力。特定来说，评价两种内源性Hsp90同种同源物配体ATP和ADP的结合，针对其的同种同源物结合亲和性已借助固有色氨酸荧光和等温滴定量热法广泛探索。针对这些配体观察与先前针对每一同种同源物所报道者一致的相对亲和性(表13)。特定来说，据报道，ADP与Hsp90的相互作用显著比ATP更紧密(41 μM对840μM)，(麦克劳克林，S.H.(McLaughlin，S.H.)；冯特拉斯，L.A.(Ventouras，L.A.)；罗贝佐沃，B.(Lobbezoo，B.)；杰克逊，S.E.(Jackson，S.E.)Hsp90亚单元的独立ATPase 活性产生柔性组装平台(Independent ATPase activity of Hsp90 subunits creates a flexibleassembly platform).分子生物学杂志2004，344，813-826)，这与我们的发现极为一致(表13)。据报道，ADP对Hsp90α的结合稍微弱于对Hsp90β的结合(51μM对34μM)，(里克特，K.(Richter，K.)；索罗卡，J.(Soroka，J.)；斯科尼亚，L.(Skalniak，L.)；莱什科瓦尔，A.；赫斯林，M.(Hessling，M.)；莱因斯坦，J.；布克纳，J.人类hsp90的ATPase循环中的保守构象变化(Conserved conformational changes in the ATPase cycle of human hsp90).生物化学杂志2008，283，17757-17765)，这是我们所发现的(59μM对42μM，表13)。另外，如先前所报道，显示Grp94和Trap-1在两种核苷酸之间显示极小区别。Grp94相对紧密地结合两种核苷酸，且所报道结合亲和性介于2.3μM到3.4μM到5μM范围内(弗雷，S. (Frey，S.)；莱什科瓦尔，A.；莱因斯坦，J.；布克纳，J.内质网侣伴蛋白Grp94的ATPase 循环(The ATPase cycleof the endoplasmic chaperone Grp94).生物化学杂志2007，282， 35612-35620)，此胜过分别针对ATP和ADP记录的3.2μM和11.4μM(表13)。如在我们的研究中发现，与ADP相比，ATP是稍微更紧密的Grp94粘合剂。据报道Trap-1(其最接近地类似于细菌Hsp90、HtpG)结合ATP的亲和性比Hsp90大约10倍。
接下来使用新研发的FP分析来评价涵盖多个化学种类的Hsp90 NBD抑制剂的同种同源物亲和性和选择性(图23)。除GM外的所有抑制剂都已针对癌症进行了临床评价或仍在针对癌症进行临床评价。每一Hsp90同种同源物的结果概述于表13中且显示，所有抑制剂都有效地与化合物115a竞争，从而证实了对探针的结合特异性。针对这些抑制剂测量的对Hsp90α/β的低纳摩尔浓度结合亲和性与其在若干癌细胞中测定的生物活性密切相关。
表13：在使用43a作为FP探针的临床研发中测定Hsp90抑制剂的Hsp90同种同源物亲和性。还呈现Hsp90调控核苷酸的同种同源物结合亲和性。
Figure GDA0002463350460002061
有趣的是，尽管人们相信临床Hsp90抑制剂同等程度地结合到所有同种同源物，但测定到一系列同种同源物结合优先性(表13)。应注意，所有这些抑制剂都大致相等程度地以低纳摩尔浓度亲和性结合到细胞溶质Hsp90，如先前通过其与袋形成的广泛相互作用所指示。
与之相比，发现在若干试剂关于其对Grp94和Trap-1的亲和性之间的显著差异。最显著者是针对17-AAG和CUDC-305/Debio092记录的对Trap-1的亲和性的2-log损失 (Hsp90对Trap-1：针对17-AAG为46nM对1.5μM，针对CUDC-305/Debio092为35nM 对1.5μM)。对于其它试剂也观察到对Trap-1的较低结合功效，且减少介于对于GM和 SNX-2112的25倍、对于STA-9090的10倍到对于BIIB021和PU-H71的5倍和对于 NVP-AUY922的2倍范围内。尽管这些试剂对Grp94的亲和性Hsp90与对大部分试剂相当，但对于几种抑制剂仍显著较低。特定来说，对于BIIB021、CUDC-305和SNX-2112 记录到约10倍亲和性损失(Hsp90对Grp94：分别为19nM对124nM、33nM对190nM 和29nM对578nM)。
表14：WS-13盐于水中的溶解度.
Figure GDA0002463350460002062
Figure GDA0002463350460002071
WS-13的甲磺酸盐于水中具有较高溶解度。
表15：WS-13盐于磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH＝7.4)中的溶解度.
Figure GDA0002463350460002072
Figure GDA0002463350460002081
WS-13的甲磺酸盐于PBS中具有较高溶解度。
实例
6.1材料和方法
生物化学和细胞分析.通过免疫印迹分析蛋白质的表达和磷酸化。执行化学沉淀和免疫沉淀分析以测定Hsp90同种同源物与蛋白质之间的相互作用。通过流式细胞术实施对 Grp94的细胞周期和细胞表面表达的分析。
X射线结构测定.通过在结晶之前向浓缩的Hsp90αN或Grp94N溶液中添加2-3倍摩尔过量的PU-H54形成复合物。通过X射线衍射分别以
Figure GDA0002463350460002082
和
Figure GDA0002463350460002083
的分辨率测定Hsp90 和Grp94复合物结构，并且通过分子置换解析。
分子建模.所有计算都是在具有Ubuntu 8.10操作系统的HP工作站xw8200上实施。使用Schrodinger软件图形用户界面Maestro(8.5版)中的蛋白质制备向导制备蛋白质结构。分别从NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)和RCSB(www.rcsb.org)数据库下载蛋白质序列和晶体结构。在Prime(2.0版)中构筑Trap-1同源性模型且通过使用Macromodel(9.6版)最小化进一步精化粗制同源性模型。对蛋白质结构执行SiteMap(2.2版)分析，如所指示。利用Glide(5.0版)执行所有对接研究。
统计学分析.在Prism5(GraphPad)中通过不成对的2尾t-测试分析结果。数据呈现为一式两份或一式三份的平均值±SD或SEM。误差棒代表平均SD或SEM。在呈现单一面板时，其代表两个或三个个别实验。
试剂.重组Hsp90α(ADI-SPP-776)、Hsp90β(ADI-SPP-777)和Trap-l(ADI-SPP-848)购自恩佐生命科学(Enzo Life Sciences)。如先前报道生成Grp94(道林斯，D.E.、伊莫尔米诺，R.M.和格沃斯，D.T.未结合配体的GRP94内质网Hsp90的结构.核苷酸诱导的构象变化的基础.生物化学杂志280，30438-47(2005)；道林斯，D.E.、华伦，J.J.(Warren，J.J.)、伊莫尔米诺，R.M.和格沃斯，D.T.GRP94-核苷酸复合物的结构揭示hsp90侣伴蛋白之间的机械差异(Structures of GRP94-nucleotide complexes reveal mechanistic differencesbetween the hsp90 chaperones).分子细胞学(Mol.Cell)28，41-56(2007))。其它文献报道嘌呤-架构化合物和化学工具的合成和表征(廖赫尔，L.(Llauger，L.)等人，作为热休克蛋白90的抑制剂的8-芳基硫基、8-芳基硫氧基和8-芳基磺酰基腺嘌呤衍生物(Evaluationof 8-arylsulfanyl， 8-arylsulfoxyl，and 8-arylsulfonyl adenine derivatives asinhibitors of the heat shock protein 90).医药化学杂志.48，2892-905(2005)；何，H.(He，H.)等人，热休克蛋白90的潜在水溶性嘌呤-架构抑制剂的鉴别(Identification ofpotent water soluble purine-scaffold inhibitors of the heat shock protein90).医药化学杂志.49，381-90(2006)；莫里克，K.(Moulick，K.) 等人，基于亲和性的蛋白质组学揭示通过Hsp90协调的癌症特异性网络(Affinity-based proteomics revealcancer-specific networks coordinated by Hsp90).自然化学生物学(Nat.Chem.Biol.)7，818-26(2011))。格尔德霉素是从西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)购得且拉帕替尼是从赛力克化学(Selleck Chemicals)购得。合成的化合物经完全表征且通过与先前报道直接比较来确认结构且经测定具有＞98％的纯度。
细胞系.过表达HER2的乳癌细胞SKBr3、BT474、MDA-MB-361、MDA-MB-453和 AU565以及低HER2乳癌细胞MCF7、BT20和MDA-MB-231是从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。在补充有1％Glutamax和1％青霉素和链霉素(Pen/Strep)的McCoy's 5A(10％FBS、SKBr3)、DME/F12(10％FBS、BT474和MDA-MB-231)、RPMI(10％FBS、 AU565)、MEM(10％FBS、MCF7和BT20)和L-15(20％FBS、MDA-MB-361和 MDA-MB-453)中以常规方式培养细胞。C2C12和HEK293细胞是从ATCC购得且在10％ FBS和1％青霉素/链霉素存在下在DMEM中培养。使胃癌细胞系OE19、NCI-N87和 MKN74在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DME培养基(MKN74)或RPMI培养基中生长。卵巢癌细胞系PEO-1、PEO-4、OV-1847、OVCAR4和A2780、尤因氏肉瘤细胞系TC71和A673是来自麦尔坎A.S.摩尔博士实验室(Dr.Malcolm A.S.Moore lab)的慷慨馈赠。使所有细胞系在补充有10％FBS、1％GlutaMax(Gibco，目录号35050-061)和1％青霉素/链霉素的M-5培养基中生长。胰脏癌细胞系PANC-1、CAPAN2和CFPAC是从 ATCC购得且使其在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DME(PANC-1)、McCoy′s 5a 改良培养基(CAPAN-2)和IMDM培养基中生长。乳癌细胞系HCC1806、MDA-MB-231 和MDA-MB-468是从ATCC购得且使其在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI (HCC1806)和DME(MDA-MB-231和MDA-MB-468)培养基中生长。在培养时，将L-15 培养基中的细胞保持于37℃下无CO2的加湿气氛中且所有其它细胞系是在37℃下在含有 CO2的加湿细胞培育箱中培育。
Grp94和hHsp90 PU-H54复合物的结晶.如先前所述纯化重组犬Grp94N A41和人类Hsp90aN。在结晶之前，通过在10mM Tris(pH 7.6)、100mM NaCl和1mM DTT中向30mg/ml的Grp94中添加2倍摩尔过量的PU-H54或向30mg/ml的人类Hsp90中添加3 倍摩尔过量的PU-H54形成蛋白质-抑制剂复合物。通过将蛋白质以1∶1比率混合到含有 14-17％异丙醇、300-375mM MgCl2、0.1-1.0％甘油和100mM Hepes(pH 7.4)的储存溶液中，通过在18℃下悬滴气相扩散使Grp94晶体生长。通过快速通过含有30％甘油、5％异丙醇和100mM Hepes(pH 7.4)的溶液，之后在液氮中急骤冷冻来对Grp94晶体进行低温保护。通过将蛋白质以1∶1比率混合到含有(11-15％PEG 2K MME、200mM MgCl2和 100mM二甲基胂酸钠，pH 6.5)的储存溶液，通过在4℃下悬滴气相扩散使Hsp90晶体生长。通过依序快速通过储存溶液，之后通过含有35％PEG 2K MME、200mM MgCl2和 100mM二甲基胂酸钠(pH 6.5)的低温保护剂溶液，之后在液氮中急骤冷冻来对Hsp90晶体进行低温保护。
数据收集、结构测定和精化.在MAR-325 CCD检测器上于SSRL光束线11-1下使用
Figure GDA0002463350460002101
的X射线波长收集Grp94NA41+PU-H54和人类Hsp90N+PU-H54共晶体的X 射线衍射数据。使用HKL2000对数据进行索引和定标。使用CCP4套装软件中的Phaser 软件通过分子置换获得共晶体的初始相。Grp94NA41的搜索模型是Grp94NA41+ATP (PDB ID 1TC0)的核心区(残基100-166和200-337)，并且hHsp90的搜索模型是Hsp90+ PU-H71(PDB ID 2FWZ)。在Coot中人工重建初始分子置换模型且使用CCP4中的Refmac 5.5精化。使用Dundee PRODRG服务器生成PU-H54的配体拓扑文件。对于Grp94NA41 +PU-H54结构，使用CCP4中的DM软件实施密度修改且在精化的最终阶段中应用使用
Figure GDA0002463350460002102
生成的TLS参数。最终模型不含拉玛钱德兰(Ramachandran)离群值，并且对于 Grp94NA41+PU-H54和Hsp90N+PU-H54结构，95.1％和97.6％的残基分别落在拉玛钱德兰有利区中。
序列比对.使用Jalview 2.7中的T-咖啡多序列比对(T-Coffee MultipleSequence Alignment)(http://www.tcoffee.org/Projects/tcoffee/)程序比对序列并显示为一致性百分比视图。
Trap-1的同源性模型.使用Hsp90αNTD(PDB ID：2FWZ)、Grp94NTD(PDB ID： 3O2F)的蛋白质结构和Trap-1蛋白质的氨基酸序列(登录号：Q12931)进行模型构建。为产生模型，在Prime结构制备向导中录入Trap-1蛋白质的蛋白质序列(登录号：Q12931)作为输入序列。输入具有31％一致性、47％阳性、20％空位的同源蛋白质Hsp90α(PDB ID： 2FWZ)和具有28％一致性、45％阳性和28％空位的Grp94(PDB ID：3O2F)。比对NTD Trap-1序列与模板且随后使用如Prime中所实施的参数进行编辑。在Prime的“构建结构”选项中，氨基酸179-196(Grp94)选自PDP ID 3O2F，而其余氨基酸是来自Hsp90α(PDB ID：2FWZ)。随后使用模板的所选择序列比对，经由在Prime中实施的一系列算法，考虑到溶剂、配体、力场和其它贡献来构建结构。通过插入20个以上残基的模板空位最优化结构不连续性。利用Prime的缺省参数设置精化所有回路。使用Maestro(8.5版)中可获得的蛋白质制备向导进一步精化所获得的Trap-1同源性模型。根据OLPS-AA力场分配部分原子电荷。为获得更可靠的Trap-1 3D结构，使同源性模型进一步经受一系列由以下组成的能量最小化步骤：5,000次最速下降(SD)和共轭梯度(CG)重复，直到均方根偏差(rmsd)低于
Figure GDA0002463350460002115
为止。
配体制备.使用Maestro(8.5版)的片段词典构筑所有化合物。使用Macromodel程序 (9.6版)和OLPS-AA力场最优化化合物的几何结构7。使用纽约薛定谔LLC.(
Figure GDA0002463350460002116
LLC.)提供的Ligprep(2.2版)实用程序进一步制备所得配体。
对接.首先使用蛋白质结构比对工具比对呈与PU-H71(PDB ID：2FWZ)的复合物的Hsp90αNTD、呈与EC44(PDB ID：3NMQ)的复合物的Hsp90βNTD、呈与PU-H54(PDB ID： 3O2F)的复合物的Grp94 NTD、ADP(PDB ID：1TC6)和未结合配体的(PDB ID：1YT0)和 Trap-1同源性模型的x射线晶体结构，随后使用由薛定谔LLC提供的蛋白质制备向导中的缺省参数最优化用于后续网格生成和对接。随后使用Glide中的受体网格生成工具(5.0 版)制备网格(弗里斯纳，R.A.(Friesner，R.A.)等人，Glide：快速准确地对接和评分的新方法.1.对接准确度的方法和评定(Glide：a new approach for rapid，accurate docking andscoring.1.Method and assessment of docking accuracy).医药化学杂志.47，1739-49(2004)；哈尔格伦，T.A.(Halgren，T.A.)等人，Glide：快速准确地对接和评分的新方法.2.数据库筛选中的富集因子(Glide：a new approach for rapid，accurate docking andscoring.2. Enrichment factors in database screening).医药化学杂志47，1750-9(2004)；弗里斯纳，R.A. 等人，高精确度glide：纳入蛋白质-配体复合物的疏水外壳的模型的对接和评分(Extra precision glide：Docking and scoring incorporating a modelof hydrophobic enclosure for protein-ligand complexes).医药化学杂志49，6177-6196(2006))。接下来，使用高精确度 (XP)Glide对接方法将化合物柔性对接到Hsp90同种同源物的ATP结合位点中。在完成每一对接计算后，每次对接运行至多100个位姿且每个配体容许生成至多10个位姿。分析基于Glide评分(GScore)功能的最高评分对接位姿(取向加构象)。为验证对接参数和实验设置，从结合位点移出内源性配体(PU-H71、PDB ID：2FWZ；EC44、PDB ID：3NMQ； PU-H54，PDB ID：3O2F；ADP、PDB ID：1TC6)并重新对接。在如从对接分析获得的抑制剂位姿与如在晶体结构中捕获的抑制剂位姿之间(
Figure GDA0002463350460002111
的RMSD；PDB ID：2FWZ，
Figure GDA0002463350460002112
PDB ID：3NMQ，
Figure GDA0002463350460002113
PDB ID：3O2F和
Figure GDA0002463350460002114
PDB ID：1TC6)，在预测构象与观察x射线结晶学构象之间发现极高一致性，从而验证所述对接策略。
结合位点分析：使用“评价单一结合位点区(Evaluate a single binding siteregion)”使用SiteMap(2.2版)中实施的缺省参数对Hsp90α(PDB ID：2FWZ)、Hsp90β(PDBID：3NMQ) 和Grp94(PDB ID：3O2F)的x射线晶体结构和Trap-1的精化同源性模型实施SiteMap(哈尔格伦，T.A.鉴别并表征结合位点并评定成药性(Identifying andCharacterizing Binding Sites and Assessing Druggability).化学杂志(J.Chem.)信息与建模(Information and Modeling)49，377-389(2009)；哈尔格伦，T.快速准确地鉴别并分析结合位点的新方法 (New method for fast and accurate binding-siteidentification and analysis).化学生物学与药物设计(Chemical Biology&DrugDesign)69，146-148(2007))分析。接下来，为研究ATP 结合位点，使用如“管理表面”功能中实施的缺省参数构筑疏水性和亲水性等值线图。
Hsp90饱和结合分析.在Analyst GT仪器(分子仪器(Molecular Devices)，桑尼维尔，加利福尼亚州)上执行Hsp90FP饱和分析且在黑色96孔微量滴定板(康宁(Corning)编号3650)中在每一孔中以100μL的总体积实施。在DMSO中制备10μM 40或115a-115d的储液且用Felts缓冲液(20mM Hepes(K)(pH 7.3)、50mM KCl、2mM DTT、5mM MgCl2、 20mM Na2MoO4和0.01％NP40与0.1mg/mL BGG)稀释。为测定112或115a-115d的平衡结合，将增加量的Hsp90α、Hsp90β、Grp94或Trap-1(至多250nM)或SKBr3裂解物(至多50μg总蛋白质)与3nM 40或115a-115d一起培育。将分析板于4℃下在振荡器上培育指示时间且测量FP值(以mP表示)。分析范围计算为针对结合荧光示踪剂记录的FP值与针对游离荧光示踪剂记录的FP值之间的差(定义为mP-mPf)。
关于本揭示内容的Grp94抑制剂的荧光偏振(FP)测量.如下文所述对本揭示内容的 Grp94抑制剂执行Hsp90FP竞争分析。
使用新探针的荧光偏振(FP)测量.在Analyst GT仪器(分子仪器，桑尼维尔，加利福尼亚州)上执行Hsp90FP饱和分析且在黑色96孔微量滴定板(康宁编号3650)中在每一孔中以100μL的总体积实施。在DMSO中制备10μM 112或115a-115d的储液且用Felts 缓冲液(20mM Hepes(K)(pH 7.3)、50mM KCl、2mM DTT、5mM MgCl2、20mM Na2MoO4和0.01％NP40与0.1mg/mL BGG)稀释。向每一孔中添加于100μL最终体积的HFB缓冲液中的3nM荧光40或115a-115d、蛋白质(25nM Hsp90α、25nM Hsp90β、25nM Grp94、 30nM Trap-1)或SKBr3裂解物(4.5μg总蛋白质)和所测试抑制剂(DMSO中的初始储液)。以一式三份向孔中添加化合物。对于每一分析，在每一分析板上包括背景孔(仅缓冲液)、探针对照(游离，仅探针)和结合探针对照(在蛋白质或SKBr3裂解物存在下的探针)。将分析板于4℃下在振荡器上培育24h且测量FP值(以mP表示)。结合到Hsp90的探针的分率与mP值相关且将所述分率针对竞争剂浓度值绘图。通过拟合数据获得在其下50％结合探针经置换的抑制剂浓度。使用SOFTmax Pro4.3.1分析所有实验数据且使用Prism 4.0 (格拉芙帕德(Graphpad Software)公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)绘图。
细胞分级分离和免疫印迹.将细胞用DMSO(媒剂)或指示化合物处理24hr并在补充有混合剂蛋白酶抑制剂(罗氏)的RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.4)、150mM NaCl、0.5％脱氧胆酸钠和0.5％NP40)中裂解以产生全细胞裂解物。使用蛋白质提取亚细胞蛋白质组萃取试剂盒(ProteoExtract Subcellular Proteome Extraction Kit，卡尔生化(Calbiochem)) 遵循制造商的说明书收获胞质溶胶和膜部分的裂解物。使用BCA试剂盒(皮尔斯)根据制造商说明书测定蛋白质浓度。通过SDS-PAGE电泳解析蛋白质裂解物(5-50pg)，将其转移到硝化纤维素膜上并利用针对以下的所指示一级抗体来探测：HER2(赛迈德，28004)、 Hsp70(斯托珍，SPA-810)、Grp94(斯托珍，SPA-850)、Hsp90α(艾博抗(Abcam)，Ab2928)、 Hsp90β(斯杰马克(StressMarq)，SMC-107B)、Grp78(细胞信号传导，3183)、Raf-1(圣克鲁斯(Santa Cruz)，sc-133)、磷酸-Raf-1(细胞信号传导，9421)、MEK1/2(细胞信号传导，8727)、磷酸-MEK1/2(细胞信号传导，9154)、ERK1/2(细胞信号传导，4695)、磷酸-ERK1/2(细胞信号传导，4370)、AKT(细胞信号传导，9272)、GM130(细胞信号传导，2296)、浮舰蛋白(Flotillin)2(细胞信号传导，3436)、组蛋白H4(细胞信号传导，2592)、组蛋白H1(圣克鲁斯，sc-8030)、半胱天冬酶3(细胞信号传导，9665)、裂解PARP(普洛麦格，G7341)、α-微管蛋白(西格玛，T5168)和3-肌动蛋白(西格玛，A1978)。在洗去过量抗体后，将膜与结合到二级抗体的相应辣根过氧化物酶(HRP)一起培育。通过放射自显影使用增强的化学发光检测系统(通用医疗)根据制造商说明书，使印迹显现。对于所有凝胶，使用3-肌动蛋白作为蛋白质载量对照。
密度测定分析.在Adobe Photoshop CS5中扫描薄膜且使用ImageJ(NIH)执行定量密度测定分析。
蛋白质水平定量.在所有执行蛋白质定量时的情形中，首先将蛋白质水平正规化到3- 肌动蛋白，随后正规化到仅媒剂处理的实验条件的水平。所有经定量的蛋白质水平都报道为对照的分率(即将实验条件中获得的值除以在媒剂处理细胞中获得的值)。
化学沉淀(CP).将与Hsp90抑制剂结合的琼脂糖珠粒用Felts缓冲液(20mM HEPES、50mM KCl、5mM MgCl2、0.01％NP40、20mM Na2MoO4，pH 7.2～7.3)洗涤三次并最终悬浮于其中(莫里克，K.等人，基于亲和性的蛋白质组学揭示通过Hsp90协调的癌症特异性网络.自然化学生物学7，818-26(2011))。随后将珠粒结合物(50μL)与指示量的细胞裂解物于4℃下一起培育4hr，并且用Felts缓冲液将体积调节到500pl。随后将复合物用Felts缓冲液洗涤三次且通过免疫印迹分析下拉中的蛋白质。对于PU-WS13-生物素下拉分析，首先将细胞裂解物与生物素化PU-WS13于4℃下一起培育过夜，随后与50μL高容量链霉抗生物素珠粒(赛默科技(Thermosci))一起培育2hr。将珠粒用Felts缓冲液洗涤三次并通过免疫印迹鉴别下拉中的蛋白质。使用含有2-甲氧基乙胺(一种Hsp90惰性分子) 或D-生物素的对照珠粒进行非特异性结合的对照。
免疫沉淀(IP).将HER2抗体(细胞信号传导，2165)、Grp94抗体(艾博抗，Ab13509)或正常兔IgG(圣克鲁斯生物技术(Santa Cruz Biotechnology))与指示量的细胞裂解物和40 pL蛋白质A琼脂糖珠粒(罗氏)一起培育。将混合物于4℃下在旋转器上培育过夜。将珠粒用RIPA缓冲液洗涤三次并通过SDS-PAGE和之后的标准免疫印迹程序来分离。
Grp94消耗分析.将Grp94抗体(艾博抗，Ab13509；博奥森(Bioss)，bs-0194R)或正常兔 IgG(圣克鲁斯生物技术)与指示量的细胞裂解物以及与40pL蛋白质A琼脂糖珠粒(罗氏) 一起培育。将混合物于4℃下在旋转器上培育4小时。在离心后收集上清液，随后与Grp94 抗体或正常兔IgG一起培育，且随后与40μL蛋白质A琼脂糖珠粒一起培育以进一步消耗细胞裂解物中的Grp94。在三轮抗体消耗后，收集上清液并与PU-WS13-生物素珠粒于 4℃下一起培育过夜。将珠粒用Felts缓冲液洗涤三次并通过SDS-PAGE和之后的标准免疫印迹程序来分离。
Hsp90α、Hsp90β和Grp94的siRNA敲弱.通过使用Lipofectamine RNAiMax试剂(英杰(Invitrogen)，对于SKBr3细胞)或利用Neon转染系统(生命技术(Life Technologies)，对于MCF7细胞)的电穿孔根据制造商说明书实施瞬时转染。对于每一靶，四种不同siRNA 是从凯杰(Qiagen)购得且针对Hsp90α(基因Hsp90AA1)、Hsp90β(基因Hsp90AB1)或Grp94 (基因Hsp90B1)的开放读码框进行设计。用乱序siRNA(scramble siRNA)转染对照细胞。用20nMsiRNA转染细胞并在指示时间通过免疫印迹来评价敲弱效率。最优化MCF7中的电穿孔且在Neon转染系统(生命技术)上使用两个1230v 20ms脉冲执行实验。将SKBr3 细胞用20nMsiRNA转染72hr，随后用20nM siRNA再次再转染48hr，之后进行WB 分析。
激酶筛选.对于大多数分析，使激酶标记的T7噬菌体菌株在24孔板中在源自BL21菌株的大肠杆菌(E.coli)宿主中平行生长。使大肠杆菌生长到对数期且经来自冷冻储液的T7噬菌体感染(感染复数＝0.4)，并在32℃和振荡下培育直到裂解(90-150min)。将裂解物离心(6,000×g)并过滤(0.2μm)以移除细胞碎片。在HEK-293细胞中产生其余激酶且随后经DNA标记以供qPCR检测。于室温下将链霉抗生物素涂覆的磁性珠粒用生物素化小分子配体处理30分钟以生成用于激酶分析的亲和性树脂。将结合配体的珠粒用过量生物素封阻并用封阻缓冲液(SeaBlock(皮尔斯)、1％BSA、0.05％Tween 20、1mM DTT)洗涤以移除未结合配体并减少非特异性噬菌体结合。通过在1×结合缓冲液(20％SeaBlock、 0.17×PBS、0.05％Tween 20、6mM DTT)中合并激酶、结合配体的亲和性珠粒和测试化合物来组合结合反应。将测试化合物制备为于100％DMSO中的40×储液且直接稀释到分析中。所有反应都是以0.04ml的最终体积在聚丙烯384孔板中进行。将分析板于室温下振荡培育1小时并用洗涤缓冲液(1×PBS、0.05％Tween 20)洗涤亲和性珠粒。随后将珠粒重新悬浮于洗脱缓冲液(1×PBS、0.05％Tween 20、0.5μm非生物素化亲和性配体)中并于室温下振荡培育30分钟。通过qPCR测量洗脱物中的激酶浓度。KINOMEscan的选择性分数(S)是化合物选择性的定量量度。其是通过将结合到化合物的激酶数除以所测试不同激酶的总数(不包括突变变体)来计算。TREEspotTM是通过KINOMEscan研发的专利性数据视觉化软件工具。用红色圆圈标记发现结合的激酶，其中较大圆圈指示较高亲和性结合。在科学和细胞信号传导技术(Science andCell Signaling Technology)公司许可下修改激酶树状图并重新制作。
细胞活力评定.将细胞用指示抑制剂处理72h或用Grp94 siRNA或对照siRNA转染72h，且如先前所述使用CellTiter-Glo发光细胞活力分析(普洛麦格)评定其活力(罗迪纳，A. (Rodina，A.)等人，选择性化合物将Hsp90定义为小细胞肺癌中的主要细胞凋亡抑制剂(Selective compounds define Hsp90 as a major inhibitor of apoptosis in small-cell lung cancer).自然化学生物学3，498-507(2007)；卡尔达斯-洛佩斯，E.(Caldas-Lopes，E.)等人， Hsp90抑制剂PU-H71，一种恶性肿瘤的多重抑制剂，其在三重阴性乳癌模型中诱导完全反应(Hsp90 inhibitor PU-H71，a multimodal inhibitor of malignancy，induces complete responses in triple-negative breast cancer models).美国国家科学院院刊106，8368-73 (2009))。所述方法依据所存在ATP的定量来测定培养物中的活细胞数，所述ATP产生代表代谢活性细胞存在的信号。
免疫荧光.接种细胞并使其在培养载玻片(BD Falcon)上生长24hr。在用冷PBS洗涤后，通过于4℃下用PBS中的4％对甲醛处理20min来固定细胞，用含有10％FBS的PBS中的0.1％Triton X-100渗透化处理10min，并用2％BSA封阻1hr。在用PBS洗涤四次后，将一级抗体添加到室上并将细胞于4℃下培育过夜，再次用PBS洗涤，之后于室温下与二级抗体一起培育1hr。洗涤细胞且随后封固并在显微镜(Leica Upright Confocal SP5)下观察。分析中所用的一级抗体是针对：HER2(赛迈德，28004)、Grp94(斯托珍，SPA-850)、 Hsp70(斯托珍，SPA-810)、LAMP1-FITC(艾博抗，ab25406)、EEA1(艾博抗，ab70521)、58K Golgi-FITC(艾博抗，ab27043)和钙联接蛋白(BD，610523)。
流式细胞术.使用MACSQuant分析仪(美天旎生物技术(Miltenyi Biotec))执行流式细胞术分析。将5×104到5×105个细胞接种于35mm盘中并以500g离心5min。移除过量培养基并将细胞沉淀物重新悬浮于含有人类AB血清的冷培养基中以供封阻。随后将一级抗体Grp94-PE(恩佐，SPA-850PE)或同种型对照添加到每一管中。将细胞在冰上培育 60min，随后用冷PBS洗涤。随后将细胞在冰上用7-AAD染色15分钟并用冷PBS洗涤一次。最后将细胞重新悬浮于1％对甲醛中并经受流式细胞术分析。通过FlowJo(亚什兰 (Ashland))进一步分析数据。从分析排除具有阳性7-AAD染色的死细胞。对于布雷菲德菌素A输送分析，根据制造商说明书将细胞用GolgiPlug(BD生物科学(BD biosciences)， 555029)处理4h。随后处理细胞用于活细胞染色，或首先用0.1％Triton-X100进行渗透化处理，之后使用MACSQuant分析仪进行流量分析。
细胞表面蛋白的评定.根据制造商说明书使用细胞表面蛋白分离试剂盒(皮尔斯)来生物素化细胞表面上的蛋白质。简单来说，将4个75cm(道林斯，D.E.、华伦，J.J.、伊莫尔米诺，R.M.和格沃斯，D.T.GRP94-核苷酸复合物的结构揭示hsp90侣伴蛋白之间的机械差异.分子细胞学28，41-56(2007))烧瓶的细胞与磺基-NHS-SS-生物素于4℃下一起培育30min，随后骤冷反应并裂解细胞。使用NeutrAvidin琼脂糖珠粒分离生物素化蛋白质，随后用Laemmli缓冲液洗脱并使其经受SDS-PAGE分析和免疫印迹。或者，在生物素标记细胞表面蛋白后，通过使用单体抗生物素蛋白珠粒、之后通过于4℃下与2mM生物素一起培育6小时从珠粒洗脱蛋白质来纯化生物素化蛋白质。
细胞周期和细胞凋亡评定.在用碘化丙啶(PI，BD法明恩(BD Pharmingen))单次染色或分别用膜联蛋白V-FITC(BD法明恩)和7AAD(BD法明恩)双重染色后，通过流式细胞术评定细胞周期和细胞凋亡。特定来说，对于细胞周期分析，将细胞用冷PBS洗涤两次并于4℃下于70％乙醇中固定过夜。以1800rpm经10min收集经固定细胞并在室温下在黑暗中用含有PI和无DNase的RNase A(西格玛-奥德里奇)的PBS染色1h。通过BD LSRII 流式细胞仪测量DNA水平并使用FloJo(亚什兰，俄勒冈州)中的细胞周期分析程序进一步分析细胞。使用鸡红细胞核单态(CEN，拜索尔(Biosure))作为参照。对于细胞凋亡评定，收集活细胞，用冷PBS洗涤两次，重新悬浮于结合缓冲液中并于室温下在黑暗中用膜联蛋白V-FITC和7AAD染色15min。通过MACSQuant分析仪收集来自FL1和FL3通道的信号并使用FloJo进一步分析。将早期细胞凋亡定义为膜联蛋白V+/7AAD-，并且观察到晚期细胞凋亡为膜联蛋白V+/7AAD+。
C2C12分化和IGF-II分泌分析(范德林，S.(Wanderling，S.)等人，GRP94是中胚层诱导和肌肉发育所必需的，因为其调节胰岛素样生长因子的分泌(GRP94 is essentialfor mesoderm induction and muscle development because it regulates insulin-like growth factor secretion).细胞分子生物学18，3764-75(2007)；奥斯特洛夫斯基，O.、艾哈迈德，N.T.和阿尔贡，Y.GRP94对胰岛素样生长因子II的侣伴蛋白活性为对血清剥夺的应力反应所必需.细胞分子生物学20，1855-64(2009))。在10％FBS和1％青霉素/链霉素存在下在 DMEM(培养基)中维持并培养C2C12细胞。C2C12是最初源自2月龄雌性小鼠供体大腿肌肉的卫星细胞的小鼠骨骼成肌细胞的永生系。在适当培养条件下，这些细胞充分分化为肌细胞。此处，通过用补充有2％马血清和1％青霉素/链霉素的DMEM(分化培养基) 更换培养基来诱导细胞以分化36-48小时。通过使用IGF-II小鼠ELISA试剂盒(艾博抗，AB100696)根据制造商说明书定量所分泌的IGF-II。简单来说，在将培养基替换为分化培养基后，将C2C12细胞用指示化合物处理24hr。随后将每一实验条件的培养基转移到经抗IGF-II涂覆的ELISA板中并于4℃下培育过夜。用生物素化抗IGF-II抗体检测结合 IGF-II。在依序与HRP结合的链霉抗生物素、TMB一步式底物试剂和停止溶液一起培育后，于450nm下测量吸光度。针对试剂盒提供的用重组IGF-II生成的标准曲线定量所分泌的IGF-II。
TLR9-输送分析(杨，Y.(Yang，Y.)等人，热休克蛋白gp96是类铎受体的主要侣伴蛋白并且对于巨噬细胞的先天功能很重要(Heat shock protein gp96 is a masterchaperone for toll-like receptors and is important in the innate function ofmacrophages).免疫(Immunity) 26，215-26(2007))。使用X-tremgene HP(罗氏)根据制造商说明书用pUNO-hTLR9-HA(英伟沃基(Invivogen))转染HEK 293T细胞。在转染后24hr时，将细胞分离到细胞培养室载玻片(Lab-Tek)上。随后将细胞用不同浓度的指示化合物处理24hr。在处理后，将细胞在 PBS中的4％对甲醛中固定20min，用PBS中的0.1％Triton-X 100渗透化处理10min，用PBS中的3％BSA封阻30min，之后用抗HA抗体(艾博抗，ab9110)或正常兔IgG染色 1hr。用PBS洗涤细胞，用抗兔-Cy3抗体(英杰)染色且最后于4℃下在黑暗中用Prolong Gold Antifade试剂(具有DAPI)封固。在共焦显微镜(Leica Upright ConfocalSP5)下目视检查细胞。使用MetaMorph显微镜自动化和图像分析软件(分子仪器公司)定量荧光强度并正规化到细胞数。
粗制质膜的制备(索科沃夫斯卡，I.(Sokolowska，I.)等人，从未分化和分化HepaRG细胞分离的质膜的蛋白质组分析(Proteomic analysis of plasma membranesisolated from undifferentiated and differentiated HepaRG cells).蛋白质组科学(Proteome Sci.)10，47 (2012))。所有步骤都是在4℃下执行且所有缓冲液在使用之前都在冰上冷冻。在PBS中轻柔刮下细胞，通过以600×g离心5min沉淀并重新悬浮于1mL 1×低渗萃取缓冲液(西格玛，H8412，10mM HEPES，pH7.8，1mM EGTA，25mM KCl)中20min，以容许细胞溶胀。随后，以1000×g经5min收集细胞，将其重新悬浮于0.5mL 1×等渗萃取缓冲液(西格玛，I3533，10mM HEPES，pH 7.8，0.25M蔗糖，1mM EGTA，25mM KCl)中，用Dounce均质器均质化20个行程，且随后以1000g离心10min。小心收集具有漂浮脂质层的上清液并在12mL等渗萃取缓冲液中的30％Percoll(西格玛，P4937)的顶部上分层，之后在TH641旋转器(赛默科技)中以28，184rpm超速离心45min。粗制质膜部分在距管底部5.4cm处可见呈环。
利用从糖尿病患者的血浆纯化的HUVEC细胞的血管发生研究：通过对至少三个不同脐带施用胶原酶处理(贾菲(Jaffe)等人，1973)从钢收集的脐静脉分离HUVEC。于37℃下在加湿95％空气、5％CO2气氛中将细胞维持在补充有10％(v/v)FBS、100单位/ml青霉素、10μg/ml链霉素、0.1％(v/v)rHEGF、0.1％(v/v)氢化可的松的(hydrocortisone)和0.4％牛脑萃取物的内皮基础培养基(EBM)中，直到细胞达到亚融合。将第4到第5代的HUVEC 以25×104/孔的密度接种于12孔(每孔2ml)板中的补充有10％FBS的EBM中，并且使其附接到孔塑料24h。在一式三份孔中添加新鲜等份试样(2ml)的无血清培养基与天然 Grp94(10ng/ml和100ng/ml，最终浓度)、单-Q管柱的峰2(10ng/ml)，二者具有和不具有抑制剂。在即将添加Grp94和峰2之前向细胞中添加抑制剂。仅具有抑制剂和其中溶解有抑制剂的稀释剂(DMSO)的孔用作对照。在18h培育后，用Leica DMI 4000B显微镜对细胞执行形态检查。随后收集培养基并用PBS洗涤细胞，0.05％胰蛋白酶和0.2％EDTA 的溶液从孔脱离并在血球计中计数。PU-H54是以1和10μM的最终浓度使用。HUVEC 的图片代表并显示每种条件的重叠特征。
TNFαELISA方案：在具有2mM Glutamax、50U/mL青霉素/链霉素、10mM HEPES、 1mM丙酮酸钠和10％低内毒素FBS的DMEM培养基(英杰)中培养小鼠巨噬细胞 RAW264.7。将细胞保持在37℃下具有CO2的加湿细胞培育箱中。使用脂多糖(LPS，西格玛)和CpG DNA ODN1585(5′-G*G*GGTCAACGTTGAGG*G*G*G*G-3′(SEQ ID NO： 5)，IDT)刺激RAW264.7细胞中的TNF-α产生。使用来自经抑制剂预处理的细胞上清液的小鼠TNF-αELISA MAX Set(百进生技(Biolegend))测定TNF-α产生。简单来说，将 RAW264.7细胞用指示浓度的抑制剂预处理2小时，随后用10ng/mL LPS或2.5uM CpG DNA刺激18小时。随后将来自每一实验条件的培养基转移到ELISA板(经捕获抗体预涂覆并封阻)中并于室温(RT)下振荡培育2小时。用试剂盒中的检测抗体检测所捕获的 TNF-α。在依序与HRP结合的链霉抗生物素、TMB底物试剂和停止溶液一起培育后，于 450nm下测量吸光度。最后针对试剂盒提供的用重组TNF-α生成的标准曲线定量所产生的TNF-α。
6.2 Grp94抑制剂的制备
6.2.1式4a-t化合物的合成(方案1)
方案1：
Figure GDA0002463350460002191
试剂和条件：(a)ArI、新亚铜试剂、CuI、NaOt-Bu、DMF，110℃，24-36h；(b)ArI、叔丁基溴化铵、CuI、NaOt-Bu、DMF、MW，190℃，1.5-2h；(c)5-溴戊-1-炔、Cs2CO3、 DMF，rt到60℃，2-6h。
8-芳基硫基衍生物2a-w的一般合成程序
方法A：常规加热反应.将8-巯基腺嘌呤(3.6mmol)、新亚铜试剂水合物(0.36mmol)、 CuI(0.36mmol)、NaO-t-Bu(7.2mmol)、相应芳基碘(10.8mmol)和无水DMF(24mL)置于用氮冲洗的圆底烧瓶中。用铁氟龙(Teflon)带密封烧瓶，于110℃下加热，并在氮下磁力搅拌24-36h。在减压下移除溶剂并对所得残余物进行色谱(CH2Cl2∶MeOH∶AcOH，20∶1∶0.5)。
方法B：微波偶合反应.在圆锥形底部微波小瓶中，装入8巯基腺嘌呤(0.1mmol)、相应芳基碘(0.1mmol)、CuI(0.02mmol)、NaOt-Bu(0.3mmol)和叔丁基溴化铵(0.02mmol) 于DMF(2mL)中的混合物。将密封小瓶于150℃下微波辐照1.5h。在冷却后，将反应混合物在减压下冷凝并通过急骤色谱(CH2Cl2∶MeOH∶AcOH，20∶1∶0.5)纯化。
8-((4-溴-2-乙基苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(2a).通过方法B以浅黄色固体形式以49％产率获得。MS(ESI)：m/z 351.8[M+H]+。
8-((4-溴-2-氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(2b).通过方法B以浅黄色固体形式以42％产率获得。MS(ESI)：m/z 357.6[M+H]+。
8-((4-氯-2-(三氟甲基)苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(2c).通过方法B以浅黄色固体形式以 43％产率获得。MS(ESI)：m/z 343.9[M-H]-。
8-((2，4-双(三氟甲基)苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(2d).通过方法B以浅黄色固体形式以 45％产率获得。MS(ESI)：m/z 380.0[M+H]+。
8-((3-溴-5-氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(2e).通过方法B以浅黄色固体形式以42％产率获得。MS(ESI)：m/z 358.1[M+H]+。
8-((3，5-二溴苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(2f).通过方法B以浅黄色固体形式以40％产率获得。MS(ESI)：m/z 401.9[M+H]+。
8-((3-溴-5-碘苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(2g).通过方法B以浅黄色固体形式以16％产率获得。MS(ESI)：m/z 449.8[M+H]+。
8-((3-溴-5-(三氟甲氧基)苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(2h).通过方法A以浅黄色固体形式以41％产率获得。MS(ESI)：m/z 407.8[M+H]+。
8-((2，3-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(2i).通过方法A以黄色固体形式以47％产率获得。MS(ESI)：m/z 311.9[M+H]+。
8-((3，4-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(2j).通过方法B以黄色固体形式以69％产率获得。MS(ESI)：m/z 312.0[M+H]+。
8-((3，4，5-三氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(2k).通过方法A以浅黄色固体形式以42％产率获得。MS(ESI)：m/z 347.8[M+H]+。
8-((2，3，4-三氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(2l).通过方法A以黄色固体形式以43％产率获得。MS(ESI)：m/z 347.7[M+H]+。
8-((2，3，5-三氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(2m).通过方法A以浅黄色固体形式以49％产率获得。MS(ESI)：m/z 347.4[M+H]+。
8-((5-溴吡啶-2-基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(2n).通过方法B以浅黄色固体形式以40％产率获得。MS(ESI)：m/z 324.9[M+H]+。
8-(萘-1-基硫基)-9H-嘌呤-6-胺(2o).通过方法A以黄色固体形式以39％产率获得。MS (ESI)：m/z 294.0[M+H]+。
8-((4-氯萘-1-基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(2p).通过方法B以浅黄色固体形式以39％产率获得。MS(ESI)：m/z 328.4[M+H]+。
8-((4，6-二氯喹啉-8-基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(2q).通过方法B以浅黄色固体形式以39％产率获得。MS(ESI)：m/z 362.9[M+H]+。
8-((4-(1H-吡咯-1-基)苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(2r).通过方法B以黄色固体形式以58％产率获得。MS(ESI)：m/z 309.3[M+H]+。
8-((5-溴-1-(4-甲氧基苄基)-1H-吲哚-7-基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(2s).通过方法B以白色固体形式以53％产率获得。MS(ESI)：m/z 483.3[M+H]+。
8-((5-溴-1-(4-甲氧基苄基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-3-基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(2t).通过方法B以浅黄色固体形式以47％产率获得。MS(ESI)：m/z 483.1[M+H]+。
8-(2，4-二甲基-苯基硫基)腺嘌呤(2u).通过方法B以白色固体形式以62％产率获得。1H NMR(400MHz，DMSO)δ13.2(br s，1H)，8.05(s，1H)，7.03-7.26(m，5H)，2.30(s，3H)，2.26 (s，3H)；13C NMR(100MHz，DMSO)δ154.6，152.2，139.4，138.5，133.0，131.6，127.7，20.6， 20.24；MS(ESI)：m/z 272.1[M+H]+。
8-((3，5-双(三氟甲基)苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(2v).通过方法A以57％产率获得。1H NMR(600MHz，DMSO)δ13.6(br s，1H)，8.09-8.14(m，4H)，7.44(br s，2H)；MS(ESI)：m/z 380.1[M+H]+。
8-(三甲苯基硫基)-9H-嘌呤-6-胺(2w).通过方法A以53％产率获得。1H NMR(400MHz， DMSO)δ13.1(br s，1H)，8.02(s，1H)，6.93-7.04(m，5H)，2.33(s，6H)，2.25(s，3H)；MS(ESI)： m/z 286.1[M+H]+。
N9和N3烷基化8-芳基硫基衍生物3a-t和4a-t的一般合成程序
将8-芳基硫基腺嘌呤(2a-r，1.21mmol)溶解于DMF(15mL)中并添加Cs2CO3(1.45mmol)和5-溴-戊-1-炔(2.42mmol)并将混合物在氮下于40℃下搅拌2-6h。在减压下移除溶剂并对所得残余物进行色谱(CH2Cl2∶MeOH∶AcOH，20∶1∶0.5)，从而获得所需化合物3a-t 和4a-t。
8-((4-溴-2-乙基苯基)硫基)-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-6-胺(3a).以白色固体形式以 40％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.30(1H，s)，7.44(1H，d，J＝2.1Hz)，7.27-7.29 (1H，m)，7.15(1H，d，J＝8.3Hz)，5.89(2H，br s)，4.29(2H，t，J＝7.4Hz)，2.28(2H，td，J＝ 6.9，2.5Hz)，2.01-2.06(2H，m)，1.98(1H，t，J＝2.6Hz)；13C-NMR(CDCl3)δ154.3，152.8， 151.7，147.3，145.9，134.0，132.3，130.2，128.2，123.4，114.9，82.4，69.5，42.8，28.3，27.216.0， 14.5；HRMS(ESI)m/z [M+H]+ C18H19N5SBr的计算值416.0545；实验值416.0536。
8-((4-溴-2-氯苯基)硫基)-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-6-胺(3b).以白色固体形式以39％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.29(1H，s)，7.54(1H，d，J＝2.0Hz)，7.24(1H，dd， J＝8.4，2.0Hz)，6.99(1H，d，J＝8.5Hz)，5.72(2H，br s)，4.26(2H，t，J＝7.3Hz)，2.20(2H，td， J＝6.9，2.6Hz)，1.96(2H，p，J＝7.2Hz)，1.91(1H，t，J＝2.6Hz)；13C-NMR(CDCl3)δ154.6，153.5，151.7，143.7，135.1，132.9，132.4，130.9，130.5，122.2，116.5，82.2，69.6，43.1，28.4， 16.1；HRMS(ESI)m/z [M+H]+ C16H14N5SBrCl的计算值421.9842；实验值421.9823。
8-((4-氯-2-(三氟甲基)苯基)硫基)-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-6-胺(3c).以白色固体形式以41％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.34(1H，s)，7.72(1H，s)，7.41(1H，d，J＝ 8.1Hz)，7.33(1H，d，J＝8.3Hz)，6.23(2H，br s)，4.29(2H，t，J＝7.1Hz)，2.21-2.28(2H，m)， 1.95-2.02(3H，m)；13C-NMR(CDCl3)δ154.9，151.6，143.7，134.5，132.7，131.4，131.0，129.1， 127.7，124.0，121.3，120.3，82.1，70.6，43.0，28.3，15.9；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C17H14N5SF3Cl2的计算值412.0611；实验值412.0612。
8-((2，4-双(三氟甲基)苯基)硫基)-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-6-胺(3d).以白色固体形式以39％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.36(1H，s)，7.96(2H，s)，7.83(1H，s)，5.70 (2H，br s)，4.37(2H，t，J＝7.2Hz)，2.27(2H，td，J＝6.9，2.6Hz)，1.98-2.07(3H，m)；13C-NMR (CDCl3)δ154.6，153.5，151.7，143.6，134.3，132.9，132.6，130.7，124.1，121.4，120.3，82.2， 69.6，42.9，28.3，16.0；MS(ESI)：m/z 446.1[M+H]+。
8-((3-溴-5-氯苯基)硫基)-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-6-胺(3e).以白色固体形式以37％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.36(1H，s)，7.42-7.44(2H，m)，7.33(1H，s)，6.19 (2H，br s)，4.33(2H，t，J＝7.3Hz)，2.27(2H，td，J＝6.6，2.4Hz)，1.99-2.03(3H，m)；13C-NMR (CDCl3)δ154.9，153.5，151.5，143.5，135.9，134.7，131.2，131.0，128.7，123.4，120.3，82.3， 69.7，43.0，28.3，16.0；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C16H14N5SClBr的计算值423.9821；实验值423.9822。
8-((3，5-二溴苯基)硫基)-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-6-胺(3f).以白色固体形式以37％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.31(1H，s)，7.62(1H，t，J＝1.6Hz)，7.50(2H，d，J＝ 1.7Hz)，6.22(2H，br s)，4.33(2H，t，J＝7.5Hz)，2.27(2H，td，J＝6.8，2.6Hz)，1.99-2.05(3H， m)；13C-NMR(CDCl3)δ154.2，152.9，151.6，145.8，134.1，131.8，128.2，123.6，114.5，82.4， 69.7，43.0，28.2，16.0；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C16H14N5SBr2的计算值465.9337；实验值 465.9329。
8-((3，5-二溴苯基)硫基)-3-(戊-4-炔-1-基)-3H-嘌呤-6-胺(4f).以白色固体形式以16％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.04(1H，s)，7.66(2H，s)，7.52-7.55(1H，m)，4.22(2H，t，J＝6.2Hz)，2.18-2.24(4H，m)，2.05-2.08(1H，m)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C16H14N5SBr2的计算值465.9337；实验值465.9331。
8-((3-溴-5-碘苯基)硫基)-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-6-胺(3g).以白色固体形式以35％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.29(1H，s)，7.79(1H，s)，7.70(1H，s)，7.53(1H，s)， 6.57(2H，bs)，4.33(2H，t，J＝7.4Hz)，2.27(2H，td，J＝6.6，2.4Hz)，1.97-2.04(3H，m)；13C-NMR(CDCl3)δ154.9，152.8，151.4，144.1，139.6，137.5，134.5，132.5，123.6，119.2，94.8， 82.2，69.7，43.1，28.2，16.0；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C16H14N5SBrI的计算值513.9198；实验值513.9202。
8-((3-溴-5-(三氟甲氧基)苯基)硫基)-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-6-胺(3h，PDP-120-A). 以黄色固体形式以36％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.33(1H，s)，7.49(1H，t，J ＝1.5Hz)，7.33(1H，s)，7.25(1H，s)，6.15(2H，bs)，4.34(2H，t，J＝7.4Hz)，2.27(2H，td，J＝6.8，2.6Hz)，2.02-2.05(2H，m)，1.99(1H，t，J＝2.5Hz)；13C-NMR(CDCl3)δ161.0，154.8， 153.2，151.5，149.8，143.6，135.1，131.1，123.9，123.5，121.4，120.2，82.2，69.6，43.0，28.3， 16.0；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C17H14N5OF3SBr的计算值474.0034；实验值474.0035。
8-((3-溴-5-(三氟甲氧基)苯基)硫基)-3-(戊-4-炔-1-基)-3H-嘌呤-6-胺(4h).以黄色固体形式以14％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.05(1H，s)，7.63(1H，s)，7.41(1H，s)， 7.23(1H，s)，4.50(2H，t，J＝7.4Hz)，2.20-2.23(2H，m)，2.04-2.07(3H，m)；13C-NMR(CDCl3) δ158.6，153.1，152.0，149.3，145.2，142.5，138.1，135.8，130.9，122.5，121.3，120.1，81.7，70.7， 53.5，26.8，15.3；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C17H14N5OF3SBr的计算值474.0034；实验值 474.0033。
8-((3，4-二氯苯基)硫基)-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-6-胺(3i).以黄色固体形式以54％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.25(1H，s)，7.58(1H，d，J＝2.2Hz)，7.40(1H，d，J＝ 8.4Hz)，7.25(1H，dd，J＝8.3，2.1Hz)，6.97(2H，br s)，4.32(2H，t，J＝7.4Hz)，2.28(2H，td，J ＝6.8，2.6Hz)，1.97-2.02(3H，m)；13C-NMR(CDCl3)δ154.8，153.3，151.5，144.6，133.6， 133.0，132.5，131.3，130.6，130.2，120.1，82.3，69.6，42.9，28.2，16.0；HRMS(ESI)m/z [M+H]+ C16H14N5SCl2的计算值378.0347；实验值378.0353。
8-((3，4-二氯苯基)硫基)-3-(戊-4-炔-1-基)-3H-嘌呤-6-胺(4i).以黄色固体形式以18％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.07(1H，s)，7.70(1H，d，J＝2.2Hz)，7.42-7.44(2H， m)，4.46(2H，t，J＝6.6Hz)，2.23-2.25(2H，m)，2.16-2.20(2H，m)，2.08-2.10(1H，m)；13C-NMR(CDCl3)δ159.3，152.5，151.1，142.5，133.4，132.9，132.5，131.9，131.0，130.7，121.6，81.7，70.8，49.2，26.9，15.3；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C16H14N5SCl2的计算值378.0347；实验值378.0359。
8-((2，3-二氯苯基)硫基)-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-6-胺(3j).以白色固体形式以34％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.38(1H，s)，7.38(1H，d，J＝8.0Hz)，7.10(1H，t，J＝ 7.9Hz)，6.93(1H，d，J＝8.0Hz)，5.89(2H，br s)，4.33(2H，t，J＝7.3Hz)，2.25(2H，td，J＝6.8， 2.6Hz)，2.02(2H，p，J＝7.0Hz)，1.97(1H，t，J＝2.6Hz)；13C-NMR(CDCl3)δ154.8，153.6， 151.6，143.4，134.5，134.2，131.5，129.4，128.1，127.9，120.5，82.2，69.6，43.2，28.4，16.0； HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C16H14N5SCl2的计算值378.0347；实验值378.0342。
9-(戊-4-炔-1-基)-8-((3，4，5-三氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(3k).以黄色固体形式以39％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.35(1H，s)，7.47(2H，s)，5.74(2H，br s)，4.34(2H， t，J＝7.3Hz)，2.28(2H，td，J＝6.9，2.8Hz)，2.03-2.07(2H，m)，2.01(1H，t，J＝2.6Hz)；13C-NMR(CDCl3)δ154.8，153.2，151.5，149.8，143.6，135.1，131.1，123.9，123.5，121.4，120.2，82.2，69.6，43.0，28.3，16.0；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C16H13N5SCl3的计算值411.9957；实验值411.9944。
9-(戊-4-炔-1-基)-8-((2，3，5-三氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(3l).以黄色固体形式以41％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.30(1H，s)，7.39(1H，d，J＝2.1Hz)，6.97(1H，d，J ＝2.1Hz)；6.80(2H，br s)，4.36(2H，t，J＝7.2Hz)，2.27(2H，td，J＝6.8，2.5Hz)，2.03(2H，五重峰，J＝6.9Hz)，1.97(1H，t，J＝2.5Hz)；13C-NMR(CDCl3)δ155.2，152.9，151.3，142.5， 135.4，134.7，133.4，130.0，129.3，127.9，120.3，82.0，69.7，43.3，28.4，16.0；HRMS(ESI)m/z [M+H]+ C16H13N5SCl3的计算值411.9957；实验值411.9953。
3-(戊-4-炔-1-基)-8-((2，3，5-三氯苯基)硫基)-3H-嘌呤-6-胺(4l).以黄色固体形式以16％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.09(1H，s)，7.31(1H，s)，7.25(1H，s)，6.24(2H，br s)，4.51(2H，t，J＝6.8Hz)，2.17-2.23(2H，m)，2.06-2.09(3H，m)；13C-NMR(CDCl3)δ156.3， 153.9，150.5，143.4，138.0，133.9，132.5，129.8，128.3，127.9，121.3，81.7，70.7，49.3，26.9， 15.3；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C16H13N5SCl3的计算值411.9957；实验值411.9969。
9-(戊-4-炔-1-基)-8-((2，3，4-三氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(3m).以黄色固体形式以39％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.35(1H，s)，7.29(1H，d，J＝8.6Hz)，6.97(1H，d，J ＝8.6Hz)，6.18(2H，bs)，4.34(2H，t，J＝7.3Hz)，2.26(2H，td，J＝6.8，2.4Hz)，2.03(2H，五重峰，J＝6.9Hz)，1.98(1H，t，J＝2.5Hz)；13C-NMR(CDCl3)δ154.8，153.6，151.5，143.2， 133.5，133.4，133.0，132.4，128.8，128.4，120.5，82.1，69.7，43.1，28.4，16.0；HRMS(ESI)m/z [M+H]+ C16H13N5SCl3的计算值411.9957；实验值411.9967。
3-(戊-4-炔-1-基)-8-((2，3，4-三氯苯基)硫基)-3H-嘌呤-6-胺(4m).以黄色固体形式以15％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.05(1H，s)，7.24-7.26(2H，m)，6.97(1H，d，J＝8.6 Hz)，4.48(2H，t，J＝6.7Hz)，2.06-2.20(5H，m)；13C-NMR(CDCl3)δ157.7，153.6，150.7， 143.0，134.5，134.2，132.4，132.2，129.7，128.1，121.6，81.7，70.7，49.1，27.0，15.3；HRMS (ESI)m/z[M+H]+ C16H13N5SCl3的计算值411.9957；实验值411.9963。
8-((5-溴吡啶-2-基)硫基)-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-6-胺(3n).以白色固体形式以34％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.44(1H，d，J＝2.2Hz)，8.39(1H，s)，7.71(1H，dd， J＝8.4，2.3Hz)，7.17(1H，d，J＝8.4Hz)，5.85(2H，br s)，4.36(2H，t，J＝7.3Hz)，2.25(2H，td， J＝6.9，2.5Hz)，2.07(2H，五重峰，J＝7.0Hz)，1.93(2H，t，J＝2.6Hz)；13C-NMR(CDCl3)δ 155.0，154.7，153.7，151.6，151.2，142.1，139.9，123.6，120.7，118.6，82.4，69.4，43.3，28.4， 16.0；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C15H14N6SBr的计算值389.0184；实验值389.0201。
8-((5-溴吡啶-2-基)硫基)-3-(戊-4-炔-1-基)-3H-嘌呤-6-胺(4n).以白色固体形式以15％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ7.97(1H，s)，7.50(1H，s)，7.27(1H，d，J＝8.4Hz)， 7.19-7.21(1H，m)，5.72(2H，br s)，4.42(2H，t，J＝6.2Hz)，2.15-2.18(4H，m)，1.99-2.01(1H， m)；MS(ESI)：m/z 391.1[M+H]+。
8-(萘-1-基硫基)-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-6-胺(3o).以白色固体形式以33％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.37(1H，d，J＝8.1Hz)，8.28(1H，s)，7.85-7.87(2H，m)，7.64 (1H，d，J＝7.1Hz)，7.54-7.60(2H，m)，7.40-7.43(1H，m)，5.99(2H，br s)，4.29(2H，t，J＝7.3 Hz)，2.18(2H，td，J＝6.9，2.6Hz)，1.97(2H，五重峰，J＝7.1Hz)，1.90(1H，t，J＝2.5Hz)；13C NMR(CDCl3)δ154.4，152.7，151.7，146.5，134.3，133.1，131.9，129.9，128.8，127.4， 127.2，126.7，125.9，124.9，120.0，82.4，69.5，42.9，28.1，16.1；MS(ESI)：m/z 360.5[M+H]+。
8-((4-氯萘-1-基)硫基)-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-6-胺(3p).以白色固体形式以35％产率获得。1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ8.41(1H，d，J＝7.9Hz)，8.31(1H，d，J＝8.2Hz)，7.96 (1H，s)，7.87(1H，d，J＝6.8Hz)，7.55-7.63(3H，m)，4.40(2H，t，J＝7.3Hz)，2.13-2.15(2H， m)，2.04-2.10(3H，m)；MS(ESI)：m/z 394.2[M+H]+。
8-((4，6-二氯喹啉-8-基)硫基)-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-6-胺(3q).以白色固体形式以 37％产率获得。1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ8.77(1H，d，J＝4.8Hz)，8.38(1H，d，J＝2.2 Hz)，8.36(1H，s)，8.28(1H，d，J＝2.2Hz)，7.11(1H，J＝4.8Hz)，6.15(2H，br s)，4.34(2H，t， J＝7.3Hz)，2.23(2H，td，J＝6.8，2.6Hz)，2.02(2H，五重峰，J＝6.8Hz)，1.87(2H，t，J＝2.6 Hz)。
8-((4，6-二氯喹啉-8-基)硫基)-3-(戊-4-炔-1-基)-3H-嘌呤-6-胺(4q).以白色固体形式以 12％产率获得。1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ8.75(1H，d，J＝4.7Hz)，8.30-8.31(2H，m)， 8.08(1H，s)，7.52(1H，J＝4.7Hz)，4.50(2H，t，J＝6.3Hz)，2.19-2.24(4H，m)，2.07(1H，t，J ＝2.4Hz)。
8-(4-(1H-吡咯-1-基)苯基硫基)-9-(戊-4-炔基)-9H-嘌呤-6-胺(3r).以白色固体形式以 52％产率获得。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.37(s，1H)，7.55(2H，d，J＝8.2Hz)，7.38(2H， d，J＝8.2Hz)，7.07(2H，d，J＝4.3Hz)，6.36(2H，d，J＝4.3Hz)，5.76(2H，br s)，4.33(2H，t，J ＝7.1Hz)，2.22-2.29(2H，m)，1.98-2.07(3H，m)；13C NMR(CDCl3)δ154.3，152.9，151.7， 146.3，140.9，133.1，126.8，121.1，120.4，119.1，111.1，82.4，69.5，42.8，28.2，16.1；HRMS (ESI)m/z[M+H]+ C20H19N6S的计算值375.1392；实验值375.1397。
8-(4-(1H-吡咯-1-基)苯基硫基)-3-(戊-4-炔基)-3H-嘌呤-6-胺(4r).以白色固体形式以 19％产率获得。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.02(1H，s)，7.68(2H，d，J＝8.4Hz)，7.46(2H， d，J＝8.5Hz)，7.06-7.08(2H，m)，6.34(2H，d，J＝2.0Hz)，5.72(2H，br s)，4.47(2H，t，J＝5.6 Hz)，2.19-2.26(4H，m)，2.00-2.04(1H，m)；13C NMR(CDCl3)δ159.5，152.2，151.6，142.1，141.0，134.8，121.1，119.5，111.2，82.2，71.1，54.1，27.4，15.7；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C20H19N6S的计算值375.1392；实验值375.1395。
8-((5-溴-1-(4-甲氧基苄基)-1H-吲哚-7-基)硫基)-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-6-胺(3s).以白色固体形式以25％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.22(1H，s)，7.86(1H，d，J＝ 1.7Hz)，7.50(1H，d，J＝1.5Hz)，7.12(1H，d，J＝3.1Hz)，6.73(2H，d，J＝8.5Hz)，6.61(2H， d，J＝8.6Hz)，6.57(1H，d，J＝3.1Hz)，5.75(2H，s)，4.14(2H，t，J＝7.2Hz)，3.63(3H，s)， 2.22(2H，td，J＝6.9，2.5Hz)，2.02-2.06(2H，m)，1.98(1H，t，J＝2.6Hz)；13C-NMR(CDCl3)δ 158.7，153.8，152.2，151.6，147.9，134.6，133.9，132.9，132.5，129.8，126.9，126.2，113.7， 113.0，112.4，110.3，102.2，82.4，69.6，55.1，51.4，42.5，28.2，16.0；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C26H24N6OSBr的计算值547.0916；实验值547.0925。
8-((5-溴-1-(4-甲氧基苄基)-1H-吲哚-7-基)硫基)-3-(戊-4-炔-1-基)-3H-嘌呤-6-胺(4s).以白色固体形式以12％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ7.88(1H，s)，7.82(1H，s)， 7.65(1H，s)，7.03(1H，d，J＝3.0Hz)，6.75(2H，d，J＝8.4Hz)，6.58(2H，d，J＝8.6Hz)，6.52 (1H，d，J＝3.1Hz)，5.77(2H，s)，4.31(2H，t，J＝6.8Hz)，3.66(3H，s)，2.05-2.17(5H，m)；MS (ESI)：m/z 549.2[M+H]+。
8-((5-溴-1-(4-甲氧基苄基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-3-基)硫基)-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-6-胺(3t).以黄色固体形式以23％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.4l(1H，d，J ＝2.1Hz)，8.20(1H，s)，8.12(1H，d，J＝2.1Hz)，7.56(1H，s)，7.24(2H，d，J＝8.6Hz)，6.86 (2H，d，J＝8.6Hz)，6.11(2H，br s)，5.39(2H，s)，4.36(2H，t，J＝7.2Hz)，3.79(3H，s)，2.32 (2H，td，J＝6.9，2.7Hz)，2.06-2.09(2H，m)，2.03(1H，t，J＝2.6Hz)；13C-NMR(CDCl3)δ 159.6，153.9，151.8，148.2，146.3，144.9，135.5，130.0，129.5，128.2，123.5，119.4，117.1， 114.3，113.3，95.0，82.5，69.7，55.3，48.0，42.6，28.1，16.1；MS(ESI)：m/z548.1[M+H]+。
8-((5-溴-1-(4-甲氧基苄基)-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-3-基)硫基)-3-(戊-4-炔-1-基)-3H-嘌呤-6-胺(4t).以黄色固体形式以10％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.37(1H，s)， 8.10(1H，s)，7.93(1H，s)，7.49(1H，s)，7.21(2H，d，J＝8.3Hz)，6.84(2H，d，J＝8.5Hz)，5.32 (2H，s)，4.38(2H，t，J＝7.2Hz)，3.78(3H，s)，2.06-2.15(5H，m)；13C-NMR(CDCl3)δ159.7， 153.8，147.9，146.6，144.2，134.8，130.6，129.4，128.6，127.8，121.7，118.3，115.3，114.7， 112.6，94.7，81.8，70.6，55.3，48.9，47.8，28.1，15.2；MS(ESI)：m/z548.4[M+H]+。
6.2.1式8a-d和9的化合物的合成(方案2)
方案2：
Figure GDA0002463350460002271
试剂和条件：(a)Br2、H2O，rt；(b)5-氯戊-1-炔、Cs2CO3、DMF，80℃；(c)ArSH、 t-BuOK、DMF，130℃；(d)ArOH、t-BuOK、DMF，130℃。
8-溴-9H-嘌呤-6-胺(6).向溴(6.0mL，117.7mmol)于水(200mL)中的溶液中添加腺嘌呤 (2.2g，16.3mmol)，并将所得混合物于室温下搅拌过夜。将溶剂蒸发到干燥，并且溴化产物6未经额外纯化即进一步使用。MS(ESI)：m/z 213.5/215.6[M+H]+。
8-溴-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-6-胺(7).将6(2.0g，9.4mmol)、Cs2CO3(4.6g，14.1 mmol)和5-氯戊-1-炔(1.92ml，18.8mmol)于DMF(25mL)中的混合物在氮保护下在80℃下加热3h。在移除溶剂后，通过制备型TLC(CH2Cl3∶MeOH∶AcOH，20∶1∶0.1)纯化粗制材料以提供0.52g(23％)7。1H NMR(500MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ8.29(s，1H)，4.33(t，J＝ 7.2Hz，2H)，2.28-2.33(m，2H)，2.09(五重峰，J＝7.0Hz，2H)，2.02(t，J＝2.6Hz，1H)；13C NMR(125MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ154.4，153.1，151.3，127.4，119.9，82.4，69.7，43.8，28.2，16.1；MS(ESI)：m/z 280.1/282.2[M+H]+。
8a-d和9的一般合成程序.
将噻吩或苯酚(0.069mmol)和t-BuOK(0.069mmol)于DMF(1.5ml)中的混合物于室温下搅拌15分钟。添加7(0.057mmol)并将反应混合物于80℃下搅拌2h。在移除溶剂后，通过制备型TLC(CH2Cl2∶MeOH，20∶1)纯化粗制材料，从而获得相应衍生物8a-d和 9。
5-((6-氨基-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-8-基)硫基)异酞腈(8a；HJP-III-26).产率，10.2 mg(51％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.38(s，1H)，7.98(s，2H)，7.85(s，1H)，4.37(t，J＝7.3Hz，2H)，2.27-2.30(m，2H)，2.05(五重峰，J＝6.9Hz，2H)，2.01-2.03(t，1H)；13CNMR (150MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ154.7，153.8，151.7，142.2，136.9，136.1，134.3，120.5，115.8， 115.2，82.2，69.8，43.1，28.3，15.9；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C18H14N7S的计算值360.1031；实验值360.1028。
4-((6-氨基-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-8-基)硫基)-2-(三氟甲基)苄腈(8b；HJP-III-29). 产率，16.5mg(42％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.39(s，1H)，7.85(s，1H)，7.76(d，J＝8.2 Hz，1H)，7.59(d，J＝8.1Hz，1H)，5.90(br s，2H)，4.37(t，J＝7.4Hz，2H)，2.26(td，J＝6.8和 2.6Hz，2H)，2.02-2.07(m，2H)，1.97(t，J＝2.6Hz，1H)；13C NMR(150MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ155.1，154.1，151.8，141.9，140.2，135.5，133.9(q，J＝32.9Hz)，132.1，126.9(q，J＝4.7Hz)，124.7，121.9(q，J＝272.9Hz)，120.7，115.1，108.9，82.3，69.9，43.3，28.6，16.1；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C18H14F3N6S的计算值403.0953；实验值403.0956。
4-((6-氨基-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-8-基)硫基)-2-溴苄腈(8c；HJP-III-32).产率， 6.5mg(22％)。1H NMR(600MHz，CDCl3δ)8.39(s，1H)，7.68(d，J＝1.7Hz，1H)，7.57(d，J ＝8.2Hz，1H)，7.33(dd，J＝8.1和1.7Hz，1H)，5.74(br s，2H)，4.35(t，J＝7.4Hz，2H)，2.26 (td，J＝6.9和2.6Hz，2H)，2.01-2.06(m，2H)，1.98(t，J＝2.6Hz，1H)；13C NMR(150MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ155.0，154.1，151.8，142.2，140.6，134.8，132.7，127.8，126.3，120.7，116.8，114.8，82.4，69.9，43.3，28.6，16.2；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C17H14BrN6S的计算值413.0184；实验值413.0192。
4-((6-氨基-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-8-基)硫基)-2-氯苄腈(8d；HJP-III-33).产率， 17.8mg(62％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.38(s，1H)，7.58(d，J＝8.3Hz，1H)，7.49(d，J ＝1.7Hz，1H)，7.28(dd，J＝8.3，1.7Hz，1H)，6.12(br s，2H)，4.35(t，J＝7.4Hz，2H)，2.26(td， J＝6.9，2.6Hz，2H)，2.00-2.06(m，2H)，1.98(t，J＝2.6Hz，1H)；13C NMR(150MHz， CDCl3/MeOH-d4)δ155.2，154.1，151.7，141.9，140.7，137.9，134.5，129.6，127.2，120.7，115.6， 112.3，82.4，69.9，43.3，28.6，16.2；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C17H14ClN6S的计算值369.0689；实验值369.0684。
8-(2，4-二氯苯氧基)-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-6-胺(9；HJP-V-45).产率，16.2mg， (51％).1H-NMR(600MHz，CDCl3)δ8.22(s，1H)，7.45(d，J＝2.5Hz，1H)，7.43(d，J＝8.7 Hz，1H)，7.27(dd，J＝8.7，2.5Hz，1H)，5.42(br s，2H)，4.26(t，J＝7.1Hz，2H)，2.27(td，J＝ 7.0，2.6Hz，2H)，2.09-2.14(m，2H)，1.90(t，J＝2.6Hz，1H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ 153.2，152.7，151.4，149.9，147.4，132.1，130.6，128.9，128.3，127.1，123.7，115.4，82.5，69.4， 41.2，27.9，16.1；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C16H14Cl2N5O的计算值362.0575；实验值 362.0570。
6.2.3式14a-c的化合物的合成(方案3)
方案3：
Figure GDA0002463350460002291
试剂和条件：(a)P(OPh)3、吡啶，微波220℃，30min.；(b)5-氯戊-1-炔、Cs2CO3、DMF，80℃；(c)2当量Cs2CO3、DMF，80℃。
8-芳基甲基-9H-嘌呤-6-胺(12a-f)的一般合成程序
在圆锥形底部史密斯工艺小瓶(Smith process vial)中，装入4，5，6-三氨基嘧啶(10，0.21 g，1.7mmol)、芳基乙酸11a-f(0.25g，1.4mmol)和三苯基亚磷酸酯(0.52g，443μL，1.7 mmol)于1.5mL无水吡啶中的混合物。将密封小瓶于220℃下微波辐照30min。在冷却后，在真空下浓缩反应混合物并通过管柱色谱(CH2Cl2∶MeOH，10∶0到10∶1)纯化残余物，从而产生所需产物12a-f。
8-(2，4，6-三甲基苄基)-9H-嘌呤-6-胺(12a；HJP-V-32).产率，0.24g(65％)。MS(ESI) m/z 268.17[M+H]+。
8-(2，4-二氯苄基)-9H-嘌呤-6-胺(12b；HJP-V-33).产率，0.33g(79％)。MS(ESI)：m/z 294.04[M+H]+。
8-(2，6-二氯苄基)-9H-嘌呤-6-胺(12c；HJP-V-34).产率，0.18g(44％)。MS(ESI)：m/z 294.04[M+H]+。
8-(3，5-二氯苄基)-9H-嘌呤-6-胺(12d；HJP-V-35).产率，0.21g(51％)。MS(ESI)：m/z 294.04[M+H]+。
8-(2，5-二氯苄基)-9H-嘌呤-6-胺(12e；HJP-V-50).产率，0.18g(44％)。MS(ESI)：m/z 294.03[M+H]+。
8-(2，3-二氯苄基)-9H-嘌呤-6-胺(12f；HJP-V-51).产率，0.24g(58％)。MS(ESI)：m/z 294.04[M+H]+。
13a-f的一般合成程序
在氮保护下将8-苄基腺嘌呤12a-f(100mmol)、Cs2CO3(100mmol)和1-氯-戊-4-炔(120 mmol)于DMF(1.3mL)中的混合物于80℃下加热1-2h。在移除溶剂后，通过制备型TLC(CH2Cl2∶CH3OH-NH3(7N)，20∶1或CH2Cl2∶MeOH∶AcOH，15∶1∶0.1)纯化粗制材料以提供相应9-烷基-8-苄基腺嘌呤衍生物13a-f。
9-(戊-4-炔-1-基)-8-(2，4，6-三甲基苄基)-9H-嘌呤-6-胺(13a；HJP-V-36).产率，12.2mg (49％)。1H-NMR(600MHz，CDCl3)δ8.16(s，1H)，6.84(s，2H)，6.09(br s，2H)，4.23(t，J＝ 7.3Hz，2H)，2.18-2.20(m，5H)，2.15(s，6H)，1.95-1.98(m，3H)；13C NMR(150MHz，CDCl3) δ153.3，150.2，150.1，149.7，136.1，135.8，128.2，128.1，117.4，81.6，68.8，40.7，27.2，27.1， 19.9，19.3，14.8；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C20H24N5的计算值334.2032；实验值334.2020。
8-(2，4-二氯苄基)-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-6-胺(13b；HJP-V-37L).产率，3mg(13％)。1H-NMR(600MHz，CDCl3)δ8.25(s，1H)，7.38(d，J＝2.2Hz，1H)，7.13(dd，J＝8.3和2.2 Hz，1H)，7.01(d，J＝8.3Hz，1H)，5.86(br s，2H)，4.29(s，2H)，4.15(t，J＝7.4Hz，2H)，2.17 (td，J＝6.8和2.6Hz，2H)，1.90-1.96(m，3H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ154.3，151.7，151.4，150.2，134.7，134.1，132.4，131.4，129.8，127.8，118.9，82.5，70.1，42.3，31.3，28.4，15.9； HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C17H16Cl2N5的计算值360.0783；实验值360.0772。
8-(2，6-二氯苄基)-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-6-胺(13c；HJP-V-38).产率，11.9mg (48％)。1H-NMR(600MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ8.17(s，1H)，7.36(d，J＝8.1Hz，1H)，7.21-7.24(m，2H)，4.47(s，2H)，4.35(t，J＝7.2Hz，2H)，2.28(td，J＝6.7和2.5Hz，2H)，2.05-2.11(m，2H)，2.02(t，J＝2.6Hz，1H)；13C NMR(150MHz，CDCl3/MeOD)δ153.2， 150.5，149.7，147.9，135.2，130.7，128.4，127.4，116.9，81.5，69.1，40.8，28.9，27.2，14.8； HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C17H16Cl2N5的计算值360.0783；实验值360.0776。
8-(3，5-二氯苄基)-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-6-胺(13d；HJP-V-39L).产率，4.1mg (17％)。1H-NMR(600MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ8.22(s，1H)，7.26(s，1H)，7.11(s，1H)，4.19 (s，2H)，4.17(t，J＝6.9Hz，2H)，2.20(td，J＝6.4和2.1Hz，2H)，2.05(t，J＝2.5Hz，1H)， 1.87-1.95(m，2H)；13C NMR(150MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ151.7，149.8，148.6，147.9，136.9，134.6，126.9，126.3，116.9，81.3，69.3，41.3，28.7，26.9，14.7；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C17H16Cl2N5的计算值360.0783；实验值360.0767。
8-(2，5-二氯苄基)-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-6-胺(13e；HJP-V-54L).产率，5mg(21％)。1H-NMR(600MHz，CDCl3)δ8.27(s，1H)，7.30(d，J＝8.5Hz，1H)，7.17(dd，J＝8.6，2.4Hz， 1H)，7.07(d，J＝2.4Hz，1H)，5.88(br s，2H)，4.30(s，2H)，4.17(t，J＝7.3Hz，2H)，2.17(td，J ＝6.7，2.6Hz，2H)，1.93-1.96(m，3H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ154.1，151.3，151.2， 149.8，135.2，133.2，132.1，130.8，130.4，128.9，118.8，82.3，70.0，42.1，31.5，28.2，15.8； HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C17H16Cl2N5的计算值360.0783；实验值360.0776。
8-(2，3-二氯苄基)-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-6-胺(13f；HJP-V-55).产率，8.1mg(34％)。1H-NMR(600MHz，CDCl3)δ8.26(s，1H)，7.34(d，J＝8.0Hz，1H)，7.08(t，J＝7.9，1H)，6.92 (d，J＝7.8Hz，1H)，5.87(br s，2H)，4.38(s，2H)，4.14(t，J＝7.3Hz，2H)，2.16(td，J＝6.7，2.6 Hz，2H)，1.95(t，J＝2.6Hz，1H)，1.89-1.94(m，2H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ154.2， 151.5，151.2，150.0，135.9，133.6，132.2，129.6，128.3，127.6，118.8，82.2，70.0，42.1，32.5， 28.1，15.8；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C17H16Cl2N5的计算值360.0783；实验值360.0766。
14a-c的一般合成程序
将13b或13d或13e(100mmol)和Cs2CO3(200mmol)于DMF(1.3mL)中的混合物于 80℃下加热3h。在移除溶剂后，通过制备型TLC(CH2Cl2∶CH3OH-NH3(7N)，20∶1)纯化粗制材料以提供相应芳基酮衍生物14a-c。
(6-氨基-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-8-基)(2，4-二氯苯基)甲酮(14a；HJP-V-37T).产率， 12mg(50％)。1H-NMR(600MHz，CDCl3)δ8.25(s，1H)，7.49(d，J＝8.2Hz，1H)，7.43(d，J ＝1.9Hz，1H)，7.33(dd，J＝8.3，1.9Hz，1H)，6.26(br s，2H)，4.73(t，J＝7.2Hz，2H)，2.28(td， J＝7.0，2.6Hz，2H)，2.07-2.13(m，2H)，1.88(t，J＝2.6Hz，1H)；13C NMR(150MHz，CDCl3) δ185.5，155.9，153.5，151.3，144.4，137.9，135.5，133.5，131.4，130.3，127.1，119.6，82.4，69.3， 44.1，28.9，16.1；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C17H14Cl2N5O的计算值374.0575；实验值 374.0571。
(6-氨基-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-8-基)(3，5-二氯苯基)甲酮(14b；HJP-V-39T).产率， 10mg(42％)。1H-NMR(600MHz，CDCl3)δ8.41(s，1H)，8.13(d，J＝1.9Hz，2H)，7.55(t，J ＝1.9Hz，1H)，6.13(br s，2H)，4.68(t，J＝7.2Hz，2H)，2.26(td，J＝6.9和2.6Hz，2H)，2.05-2.10(m，2H)，1.87(t，J＝2.6Hz，1H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ181.2，155.6，153.7，150.3，142.6，137.6，134.2，132.2，128.4，118.4，81.4，68.2，43.2，27.8，15.1；HRMS(ESI)m/z [M+H]+ C17H14Cl2N5O的计算值374.0575；实验值374.0567。
(6-氨基-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-8-基)(2，5-二氯苯基)甲酮(14c；HJP-V-54T).产率， 14mg(58％).1H-NMR(600MHz，CDCl3)δ8.37(s，1H)，7.49(d，J＝2.5Hz，1H)，7.31-7.33 (m，2H)，6.14(br s，2H)，4.72(t，J＝7.2Hz，2H)，2.28(td，J＝7.0和2.6Hz，2H)，2.07-2.13(m， 2H)，1.90(t，J＝2.6Hz，1H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ184.1，156.0，154.4，150.4，142.6， 137.6，131.6，130.8，130.2，129.5，129.0，118.9，81.5，68.2，42.9，27.9，15.1；HRMS(ESI)m/z [M+H]+ C17H14Cl2N5O的计算值374.0575；实验值374.0560。
6.2.4式17a-I的化合物的合成(方案4)
方案4
Figure GDA0002463350460002321
试剂和条件：(a)芳基碘、CuI、NaOt-Bu、DMF、MW，190℃，1.5-2h；(b)RBr、 Cs2CO3、DMF，rt-60℃，2-6h(c)ROH、PPh3、DBAD、CH2Cl2-甲苯，rt。
8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(15).向经氮冲洗的圆底烧瓶中添加8-巯基腺嘌呤(3.6mmol)、新亚铜试剂水合物(0.36mmol)、CuI(0.36mmol)、NaO-t-Bu(7.2mmol)、 3，5-二氯-碘苯(10.8mmol)和无水DMF(24mL)。将烧瓶用铁氟龙带密封并在搅拌下于110 ℃下在氮下加热24-36h。在减压下移除溶剂并对所得残余物进行色谱 (CH2Cl2∶MeOH∶AcOH，20∶1∶0.5)，从而以44％产率得到黄色固体状15。1H-NMR(400MHz， DMSO-d6)δ13.49(1H，br s)，8.13(1H，s)，7.59(1H，s)，7.47(2H，s)，7.36(2H，br s)；MS (ESI)：m/z312.1[M+H+]。
N9和N3烷基化8-芳基硫基衍生物16a-l和17a-l的一般合成程序
将15(1.21mmol)溶解于DMF(15mL)中。添加Cs2CO3(1.45mmol)和相应溴化物(2.42mmol)并将混合物在氮下于rt到60℃下搅拌2-6h。在减压下移除溶剂并对所得残余物进行色谱(CH2Cl2∶MeOH∶AcOH，20∶1∶0.5)，从而获得所需化合物16a-l和17a-l。
8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9-(3，3，3-三氟丙基)-9H-嘌呤-6-胺(16a，PDP-I-13-A).以白色固体形式以43％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.33(1H，s)，7.29(3H，s)，6.44(2H， br s)，4.49(2H，t，J＝6.8Hz)，2.64-2.68(2H，m)；13C-NMR(CDCl3)δ155.0，153.4，151.2， 143.5，136.0，133.8，128.8，128.4，126.6，120.2，37.3，33.3；HRMS(ESI)：m/z[M+H]+C14H11N5SCl2F3的计算值408.0064；实验值408.0074。
8-((3，5-二氯苯基)硫基)-3-(3，3，3-三氟丙基)-3H-嘌呤-6-胺(17a，PDP-13B).以白色固体形式以20％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ7.99(1H，s)，7.46(2H，s)，7.32(1H，s)， 4.55(2H，t，J＝6.3Hz)，2.86-2.93(2H，m)；13C-NMR(CDCl3)δ159.3，153.1，150.3，142.5， 135.9，135.2，129.7，127.8，125.3，121.7，32.7，29.6；HRMS(ESI)：m/z[M+H]+C14H11N5SCl2F3的计算值408.0064；实验值408.0065。
8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9-(4，4，4-三氟丁基)-9H-嘌呤-6-胺(16b，PDP-I-15-A).以白色固体形式以44％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.36(1H，s)，7.28(3H，s)，6.16(2H， br s)，4.30(2H，t，J＝6.6Hz)，2.10-2.14(2H，m)，2.03-2.05(2H，m)；13C-NMR(CDCl3)δ154.9，153.7，151.5，143.2，135.9，134.2，128.6，128.1，125.1，120.3，42.5，31.3，22.5；HRMS (ESI)：m/z[M+H]+ C15H13N5SCl2F3的计算值422.0221；实验值422.0222。
8-((3，5-二氯苯基)硫基)-3-(戊-4-炔-1-基)-3H-嘌呤-6-胺(17b，PDP-I-15-B).以白色固体形式以15％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.02(1H，s)，7.12(3H，s)，5.89(2H，s)， 4.08(2H，t，J＝6.6Hz)，2.09-2.11(4H，m)；13C-NMR(CDCl3)δ155.5，153.1，150.7，149.9， 136.1，134.2，128.0，127.1，125.3，115.6，40.1，31.4，21.9；MS(ESI)：m/z 421.9[M+H]+。
8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9-(5，5，5-三氟苯基)-9H-嘌呤-6-胺(16c，PDP-109A).以白色固体形式以45％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)，δ8.28(1H，s)，7.28(3H，s)，6.82(2H， br s)，4.25(2H，t，J＝7.2Hz)，2.07-2.14(2H，m)，1.85(2H，五重峰，J＝7.4Hz)，1.57(2H，五重峰，J＝7.5Hz)；13C-NMR(CDCl3)δ155.1，152.7，151.2，143.5，135.9，134.1，128.6，128.2，125.4，120.1，43.3，33.1，28.8，19.2；HRMS(ESI)：m/z[M+H]+ C16H15N5SF3Cl2的计算值436.0377；实验值436.0363。
8-((3，5-二氯苯基)硫基)-3-(5，5，5-三氟苯基)-3H-嘌呤-6-胺(17c，PDP-109B).以白色固体形式以16％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ7.96(1H，s)，7.43(2H，s)，7.17(1H， s)，4.36(2H，t，J＝6.8Hz)，2.05-2.17(4H，m)，1.59-1.67(2H，m)；13C-NMR(CDCl3)δ157.8， 152.9，150.8，142.1，136.2，135.1，129.6，127.7，122.0，117.7，48.8，33.1，28.4，19.0；HRMS (ESI)：m/z[M+H]+ C16H15N5F3SCl2的计算值436.0377；实验值436.0398。
8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9-(6，6，6-三氟己基)-9H-嘌呤-6-胺(16d，PDP-101B).以白色固体形式以47％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)，δ8.35(1H，s)，7.29(3H，s)，6.33(2H， br s)，4.24(2H，t，J＝7.2Hz)，2.00-2.07(2H，m)，1.79(2H，五重峰，J＝7.4Hz)，1.57(2H，五重峰，J＝7.6Hz)，1.37(2H，五重峰，J＝7.8Hz)；13C-NMR(CDCl3)δ155.1，152.8，151.3， 143.4，135.9，134.4，128.5，128.1，125.8，120.0，43.6，33.9，29.4，25.7，21.4；HRMS(ESI)： m/z[M+H]+ C17H17N5SCl2F3的计算值450.0534；实验值450.0549。
8-((3，5-二氯苯基)硫基)-3-(6，6，6-三氟己基)-3H-嘌呤-6-胺(17d，PDP-101-A).以白色固体形式以14％产率获得。1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.95(1H，s)，7.43(2H，s)，7.09(1H，s)，4.34(2H，t，J＝7.0Hz)，1.40-1.72(8H，m)；13C-NMR(CDCl3)δ155.0，153.5，151.4，143.1， 135.9，134.7，128.3，127.8，125.6，120.3，43.6，33.6，29.4，25.7，21.5；HRMS(ESI)：m/z [M+H]+ C17H17N5SCl2F3的计算值450.0534；实验值450.0539。
9-(4-溴戊基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(16e，PDP-II-99A).以白色固体形式以43％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.36(1H，s)，7.28(1H，s)，7.24(2H，s)， 6.08(2H，br s)，4.27(2H，t，J＝7.2Hz)，4.09(1H，六重峰，J＝6.6Hz)，2.01-2.05(1H，m)，1.89-1.94(1H，m)，1.72-1.78(2H，m)，1.65(3H，d，J＝6.7Hz)；13C-NMR(CDCl3)，δ154.9，153.6，151.5，143.3，135.9，134.7，128.4，127.9，120.3，50.1，43.1，37.7，28.2，26.4；HRMS(ESI)：m/z[M+H]+ C16H14N5SOCl2的计算值461.9745；实验值461.9748。
3-(4-溴戊基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-3H-嘌呤-6-胺(17e，PDP-99-B).以白色固体形式以16％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ7.99(1H，s)，7.40(2H，s)，7.16(1H，s)，4.39 (2H，t，J＝7.1Hz)，4.12(1H，六重峰，J＝6.5Hz)，2.15-2.23(2H，m)，1.80-1.86(2H，m)，1.68 (3H，d，J＝6.5Hz)；13C-NMR(CDCl)3，δ152.5，150.7，148.4，142.0，135.9，134.9，127.9， 126.9，117.3，49.9，40.3，37.5，27.9，26.4；HRMS(ESI)：m/z[M+H]+ C16H14N5SOCl2的计算值461.9745；实验值461.9728。
9-(丁-2-炔-1-基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(16f，PDP-102-A).以白色固体形式以40％产率获得。1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ8.33(1H，s)，7.32(2H，s)，7.28(1H，s)， 6.63(2H，br s)，4.98-4.99(2H，m)，1.70(3H，m)；13C-NMR(CDCl3)δ155.1，153.2，150.8， 143.3，135.7，134.5，128.5，128.3，120.0，82.1，71.7，33.4，3.5；HRMS(ESI)：m/z[M+H]+ C15H12N5SCl2的计算值364.0190；实验值364.0197。
3-(丁-2-炔-1-基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-3H-嘌呤-6-胺(17f，PDP-102B).以白色固体形式以17％产率获得。1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ8.36(1H，s)，7.40(2H，s)，7.20(1H，s)， 5.09-5.10(2H，m)，1.93(3H，m)；13C-NMR(CDCl3)δ158.1，153.4，150.5，141.7，137.1，135.0， 128.5，127.1，121.4，86.5，69.4，39.7，3.7；HRMS(ESI)：m/z[M+H]+ C15H12N5SCl2的计算值 364.0190；实验值364.0190。
9-(丁-3-炔-1-基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(16g，PDP-I-14-A).以白色固体形式以47％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.37(1H，s)，7.28(3H，s)，6.04(2H，bs)， 4.45(2H，t，J＝7.0Hz)，2.76(2H，td，J＝6.8，2.3Hz)，1.95(1H，t，J＝2.4Hz)；13C-NMR (CDCl3)δ154.9，153.6，151.3，143.7，135.8，134.9，128.3，127.9，120.4，79.4，71.5，42.3，19.5； HRMS(ESI)：m/z[M+H]+ C15H12N5SCl2的计算值364.0190；实验值364.0194。
3-(丁-3-炔-1-基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-3H-嘌呤-6-胺(17g，PDP-I-14-B).以白色固体形式以18％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.08(1H，s)，7.43(2H，s)，7.30(1H，s)， 4.44(2H，t，J＝6.0Hz)，2.08-2.10(3H，m)；13C-NMR(CDCl3)δ153.1，150.3，142.9，136.6， 136.2，135.2，129.5，127.7，121.9，79.2，72.5，47.3，19.2；HRMS(ESI)：m/z[M+H]+C15H12N5SCl2的计算值364.0190；实验值364.0192。
8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9-(己-5-炔-1-基)-9H-嘌呤-6-胺(16h，PDP-112A).以白色固体形式以41％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.29(1H，s)，7.28(3H，s)，6.7l(2H，bs)，4.26(2H，t，J＝7.2Hz)，2.22(2H，td，J＝6.8，2.7Hz)，1.95(1H，t，J＝2.6Hz)，1.87-1.93(2H， m)，1.53(2H，五重峰，J＝6.8Hz)；13C-NMR(CDCl3)δ155.0，151.2，143.6，135.9，134.4， 129.0，128.5，128.2，120.0，83.3，69.1，43.5，28.8，25.3，17.9；HRMS(ESI)：m/z[M+H]+ C17H15N5SCl2的计算值392.0503；实验值392.0493。
8-((3，5-二氯苯基)硫基)-3-(己-5-炔-1-基)-3H-嘌呤-6-胺(17h，PDP-112-B).以白色固体形式以15％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ7.99(1H，s)，7.44(2H，s)，7.20(1H，s)， 4.38(2H，t，J＝6.9Hz)，2.27(2H，td，J＝6.8，2.7Hz)，2.11-2.15(2H，m)，1.97(1H，t，J＝2.5 Hz)，1.58(2H，五重峰，J＝6.8Hz)；13C-NMR(CDCl3)δ156.3，152.4，143.4，135.0，134.9， 129.0，128.4，127.0，118.6，83.2，69.4，50.2，28.5，25.1，17.9；HRMS(ESI)：m/z[M+H]+ C17H15N5SCl2的计算值392.0503；实验值392.0489。
4-(6-氨基-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)丁腈(16i，PDP-93).以白色固体形式以41％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.34(1H，s)，7.31(3H，s)，6.04(2H，bs)，4.36 (2H，t，J＝7.0Hz)，2.42(2H，t，J＝7.1Hz)，2.18(2H，五重峰，J＝7.2Hz)；13C-NMR(CDCl3) δ154.8，152.7，151.5，143.4，136.0，133.9，129.2，127.5，120.2，118.3，42.4，25.6，14.9；HRMS (ESI)：m/z[M+H]+ C15H13N6SCl2的计算值379.0299；实验值379.0303。
4-(6-氨基-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-3H-嘌呤-3-基)丁腈(17i，PDP-II-93B)以白色固体形式以16％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.08(1H，s)，7.34(2H，s)，7.31(1H，s)， 4.44(2H，t，J＝6.9Hz)，2.50(2H，t，J＝7.0Hz)，2.36(2H，五重峰，J＝6.9Hz)；13C-NMR(CDCl3)δ155.1，152.6，151.3，142.6，136.0，135.2，129.5，127.7，120.3，118.2，39.6，24.8， 14.3；HRMS(ESI)：m/z[M+H]+ C15H13N6SCl2的计算值379.0299；实验值379.0290。
9-(环己基甲基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(16j，PDP-110-A).以白色固体形式以43％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.29(1H，s)，7.26(3H，s)，6.68(2H，br s)，4.06(2H，d，J＝7.5Hz)，1.85-1.88(1H，m)，1.65-1.71(4H，m)，1.51-1.54(2H，m)，1.11-1.16(2H，m)，1.02-1.06(2H，m)；13C-NMR(CDCl3)δ154.9，152.6，151.5，144.2，135.8，134.6，128.3，122.8，120.0，49.9，38.2，30.5，27.8，26.1；HRMS(ESI)：m/z[M+H]+C18H19N5SCl2的计算值408.0816；实验值408.0805。
9-苄基-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(16k，PDP-107-A).以白色固体形式以 48％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.43(1H，s)，7.23(3H，s)，7.15-7.19(3H，m)，7.04-7.05(2H，m)，5.97(2H，br s)，5.45(2H，s)；13C-NMR(CDCl3)δ154.9，153.9，151.7，143.6，135.6，135.3，134.5，128.7，128.2，128.1，127.9，127.5，120.8，47.0；HRMS(ESI)：m/z [M+H]+ C18H14N5SCl2的计算值402.0347；实验值402.0335。
3-苄基-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-3H-嘌呤-6-胺(17k，PDP-107B).以白色固体形式以 16％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.01(1H，s)，7.45(3H，s)，7.34-7.38(5H，m)，5.48(2H，s)；HRMS(ESI)：m/z[M+H]+ C18H14N5SCl2的计算值402.0347；实验值402.0343。
8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9-苯乙基-9H-嘌呤-6-胺(16l，PDP-127-A).以黄色固体形式以 45％产率获得。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.35(1H，s)，7.22-7.26(4H，m)，7.19-7.20(2H， m)，7.04-7.06(2H，m)，6.45(2H，br s)，4.47(2H，t，J＝7.2Hz)，3.09(2H，t，J＝7.3Hz)；13C-NMR(CDCl3)δ153.8，151.5，151.2，145.1，136.8，135.8，134.0，128.9，128.8，128.6， 128.5，127.2，120.1，45.5，35.7；HRMS(ESI)：m/z[M+H]+ C19H16N5SCl2的计算值416.0503；实验值416.0508。
16m的一般合成方法
在氮保护下向8-((2，4-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(18，1.0mmol)于CH2Cl2∶甲苯 (0.5∶2.5mL)中的悬浮液中添加PPh3(4.0mmol)和醇(2.0mmol)。在搅拌10min后，添加DBAD(6mmol)并将反应混合物于rt下搅拌2-5h。在移除溶剂后，通过制备型TLC (CH2Cl2∶CH3OH∶AcOH，20∶1∶0.1或CH2Cl2∶NH3-CH3OH(7N)，20∶1)纯化粗制材料，从而获得所需化合物16m-。
8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9-(戊-2-基)-9H-嘌呤-6-胺(16m；HJP-V-123).产率，7.8mg (15％)。1H NMR(600MHz，CDCl3+5滴MeOD，2种旋转异构体)δ8.17-8.21(m，1H)， 7.40-7.56(m，3H)，4.76-4.79(m，0.4H)，4.65-4.69(m，0.6H)，2.21-2.27(m，0.6H)，1.97-2.03(m，0.4H)，1.81-1.92(m，1H)，1.60-1.63(m，3H)，1.03-1.28(m，2H)，0.87-0.89(m，3H)；13CNMR(150MHz，CDCl3+5滴MeOD)δ153.3，151.2，150.0，145.6，135.9，135.2，133.5， 130.2，129.1，128.1，120.4，54.4，36.7，19.8，19.7，13.6；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C16H18Cl2N5S的计算值382.0660；实验值382.0663。
6.2.5式20a-e的化合物的合成(方案5)
方案5：
Figure GDA0002463350460002361
试剂和条件：(a)新亚铜试剂、CuI、NaOt-Bu、DMF，110℃；(b)ArCH2CH2Br或 5-氯戊-1-炔、Cs2CO3、DMF，80℃；(c)ROH、PPh3、DBAD、CH2Cl2-甲苯，rt。
8-((2，4-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(18).在氮保护的干燥容器中装入8-巯基腺嘌呤(1，1.23g，7mmol)、1-碘-2，4-二氯苯(3g，11mmol)、新亚铜试剂水合物(0.3g，1.4mmol)、 CuI(0.28g，1.4mmol)、NaOt-Bu(1.4g，14mmol)和DMF(20mL)。将反应容器密封并放置于油浴(110℃)中并搅拌24hr。随后将反应混合物冷却到室温并在真空中移除DMF。通过硅胶急骤色谱(CH2Cl2∶CH3OH∶CH3COOH，60∶1∶0.5到20∶1∶0.5)纯化粗制材料，从而获得2.0g(87％)18。MS(ESI)：m/z 312.0[M+H]+。
19a-e和20a-e的一般合成方法
在氮保护下将8-((2，4-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(18，1.0mmol)、Cs2CO3(1.5mmol) 和芳基乙基溴(3.0mmol)于DMF(1.5mL)中的混合物于室温下搅拌1-2h。在移除溶剂后，通过制备型TLC(CH2Cl2∶CH3OH∶AcOH，20∶1∶0.1)纯化粗制材料，从而获得所需N-9化合物。
8-((2，4-二氯苯基)硫基)-9-(2-(吡啶-2-基)乙基)-9H-嘌呤-6-胺(19a；HJP-V-93-N9).产率，7.8mg(15％)。1H NMR(600MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ8.52(d，J＝4.9Hz，1H)，8.25(s， 1H)，7.58(t，J＝7.7Hz，1H)，7.49-7.51(m，1H)，7.30(d，J＝8.4Hz，1H)，7.18-7.26(m，2H)， 7.01(d，J＝7.7Hz，1H)，4.68(t，J＝6.9，2H)，3.35(t，J＝7.0，2H)；13C NMR(150MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ156.8，153.4，151.2，150.9，149.3，146.3，137.1，136.9，135.9，134.5，130.3， 128.2，127.7，123.8，122.3，119.5，43.7，37.2；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C18H15Cl2N6S的计算值417.0456；实验值417.0447。
8-((2，4-二氯苯基)硫基)-9-(2-氟苯乙基)-9H-嘌呤-6-胺(19b；HJP-V-96).产率，7.2mg (27％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.25(s，1H)，7.38(d，J＝2.0Hz，1H)，7.06-7.19(m，3H)， 6.85-6.94(m，3H)，6.05(br s，2H)，4.44(t，J＝7.1，2H)，3.11(t，J＝7.2，2H)；13CNMR(150 MHz，CDCl3)δ161.4(d，J＝244.7Hz)，153.4，151.3，151.2，145.6，135.7，135.1，133.1，131.1 (d，J＝4.5Hz)，130.2，129.1(d，J＝8.1Hz)，128.9，128.1，124.3(d，J＝3.7Hz)，123.8(d，J＝ 15.9Hz)，120.1，115.5(d，J＝21.5Hz)，43.9，29.5；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C19H15Cl2FN5S 的计算值434.0409；实验值434.0407。
9-(2-氯苯乙基)-8-((2，4-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(19c；HJP-V-97).产率，5.2mg (19％).1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.32(s，1H)，7.46(d，J＝2.0Hz，1H)，7.46(dd，J＝8.0 和2.0Hz，1H)，7.15-7.19(m，3H)，7.10(td，J＝7.5和1.2Hz，1H)，6.94(dd，J＝7.6和1.8Hz， 1H)，6.30(bs，2H)，4.55(t，J＝7.0，2H)，3.29(t，J＝7.0，2H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ 152.9，151.3，150.1，146.3，135.9，135.2，134.5，134.4，133.3，131.1，130.3，129.8，128.8， 128.5，128.1，127.1，119.9，43.6，33.6；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C19H15Cl3N5S的计算值 450.0114；实验值450.0099。
8-((2，4-二氯苯基)硫基)-9-(2-(三氟甲基)苯乙基)-9H-嘌呤-6-胺(19d；HJP-V-98).产率， 7.7mg(26％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.24(s，1H)，7.59(d，J＝7.7Hz，1H)，7.39(s， 1H)，7.32(t，J＝7.6Hz，1H)，7.28(t，J＝7.4Hz，1H)，7.11(s，2H)，6.94(d，J＝7.4Hz，1H)， 6.41(br s，2H)，4.45(t，J＝7.1，2H)，3.25(t，J＝7.2，2H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ153.2，151.2，150.4，146.1，136.0，135.4，133.4，132.1，131.8，131.4，130.3，129.1(q，J＝29.7)， 128.3，128.1，127.4，126.4(q，J＝5.5)，124.8(q，J＝272.1)，119.9，44.9，32.7；HRMS(ESI) m/z[M+H]+ C20H15Cl2F3N5S的计算值484.0377；实验值484.0367。
9-(3-(异丙基氨基)丙基)-8-((2，4，5-三氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(19e；HJP-V-103-N9). 产率，7.4mg(18％)。1H NMR(600MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ8.20(s，1H)，7.58(s，1H)，7.45 (s，1H)，4.29(t，J＝6.9，2H)，2.76(七重峰，J＝6.2，1H)，2.56(t，J＝6.8，2H)，2.02(五重峰，J ＝6.8，2H)，1.05(d，J＝6.4，6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ154.6，152.9，151.2， 144.1，134.4，134.1，133.8，132.1，131.6，129.4，119.7，42.9，41.4，29.6，29.2，21.7；HRMS (ESI)m/z[M+H]+ C17H20Cl3N6S的计算值445.0536；实验值445.0520。
8-((2，4-二氯苯基)硫基)-3-(2-(吡啶-2-基)乙基)-3H-嘌呤-6-胺(20a；HJP-V-93-N3).产率，7.9mg(15％)。1H NMR(600MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ8.59(d，J＝4.8Hz，1H)，7.85(s， 1H)，7.56(t，J＝7.6Hz，1H)，7.45(s，1H)，7.44(d，J＝6.7Hz，1H)，7.14-7.19(m，2H)，6.95(d， J＝7.7Hz，1H)，4.86(t，J＝6.4，2H)，3.49(t，J＝6.4，2H)；13C NMR(150MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ158.3，156.6，152.8，150.9，149.6，143.0，136.8，136.6，135.2，133.4，132.9，132.1， 129.6，127.5，124.1，122.2，49.4，36.3；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C18H15Cl2N6S的计算值 417.0456；实验值417.0443。
3-(3-(异丙基氨基)丙基)-8-((2，4，5-三氯苯基)硫基)-3H-嘌呤-6-胺(20e；HJP-V-103-N3). 产率，7.3mg(18％)。1H NMR(600MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ8.06(s，1H)，7.57(s，1H)，7.50 (s，1H)，4.38(t，J＝6.9，2H)，2.79(七重峰，J＝6.4，1H)，2.60(t，J＝6.5，2H)，2.12(五重峰，J ＝6.5，2H)，1.07(d，J＝6.3，6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ157.6，153.1，150.8，143.4，133.9，133.5，132.8，132.2，131.4，130.9，121.9，47.9，42.7，29.7，28.9，21.7；HRMS (ESI)m/z[M+H]+ C17H20Cl3N6S的计算值445.0536；实验值445.0523。
19f-h的一般合成方法
在氮保护下向8-((2，4-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(18，1.0mmol)于CH2Cl2∶甲苯 (0.5∶2.5mL)中的悬浮液中添加PPh3(4.0mmol)和醇(2.0mmol)。在搅拌10min.后，添加DBAD(6mmol)并将反应混合物于rt下搅拌2-5h。在移除溶剂后，通过制备型TLC (CH2Cl2∶CH3OH∶AcOH，20∶1∶0.1或CH2Cl2∶NH3-CH3OH(7N)，20∶1)纯化粗制材料，从而获得所需化合物19f-h。
8-((2，4-二氯苯基)硫基)-9-(戊-2-基)-9H-嘌呤-6-胺(19f；HJP-V-114).产率，7.8mg (15％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.22(s，1H)，7.43(d，J＝1.8Hz，1H)，7.13-7.20(m，2H)， 6.14(br s，2H)，4.65-4.70(m，1H)，2.17-2.23(m，1H)，1.80-1.86(m，1H)，1.54(d，J＝6.9Hz， 3H)，1.12-1.19(m，1H)，0.97-1.02(m，1H)，0.79(t，J＝7.4Hz，3H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ153.3，151.2，150.0，145.6，135.9，135.2，133.5，130.2，129.1，128.1，120.4，54.4， 36.7，19.8，19.7，13.6；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C16H18Cl2N5S的计算值382.0660；实验值 382.0663。
8-((2，4-二氯苯基)硫基)-9-(2-(吡啶-3-基)乙基)-9H-嘌呤-6-胺(19g；HJP-V-116).产率， 7.8mg(15％)。1H NMR(600MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ8.41(s，1H)，8.31(s，1H)，8.24(s，1H)， 7.40(d，J＝2.0Hz，1H)，7.37(d，J＝7.9Hz，1H)，7.08-7.14(m，3H)，6.16(br s，2H)，4.41(t，J ＝7.3，2H)，3.07(t，J＝7.3，2H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ153.0，151.0，150.1，148.9， 147.3，143.6，135.6，134.5，134.2，132.1，131.5，129.2，127.7，127.2，122.6，119.0，43.8，31.9； HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C18H15Cl2N6S的计算值417.0456；实验值417.0448。
8-((2，4-二氯苯基)硫基)-9-(2-(吡啶-4-基)乙基)-9H-嘌呤-6-胺(19h；HJP-V-118).产率， 7.8mg(15％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.43(s，2H)，8.27(s，1H)，7.41(d，J＝2.1Hz， 1H)，7.13(dd，J＝8.5和2.2Hz，1H)，7.08(d，J＝8.5Hz，1H)，7.01(d，J＝5.0Hz，2H)5.89 (br s，2H)，4.42(t，J＝7.4，2H)，3.07(t，J＝7.4，2H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ154.3， 152.9，151.3，149.9，146.1，144.3，135.6，135.2，133.1，128.9，128.2，124.3，120.2，44.2，35.1； HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C18H15Cl2N6S的计算值417.0456；实验值417.0448。
8-((2，4-二氯苯基)硫基)-9-(己-5-炔-3-基)-9H-嘌呤-6-胺(19i；HJP-V-117).产率，3.8 mg(24％)。1H NMR(600MHz，MeOD)δ8.27(s，1H)，7.69(d，J＝2.2Hz，1H)，7.63(d，J＝ 8.5Hz，1H)，7.42(d，J＝8.5和2.3Hz，1H)，4.75-4.79(m，1H)，3.24-3.28(m，1H)，2.89-2.94 (m，1H)，2.35-2.41(m，1H)，2.25(t，J＝2.6Hz，1H)，2.05-2.10(m，1H)，0.84(t，J＝7.4Hz， 3H)；13C NMR(150MHz，MeOD)δ153.3，151.2，150.0，145.6，135.9，135.2，133.5，130.2， 129.1，128.1，120.4，54.4，36.7，19.8，19.7，13.6；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C17H16Cl2N5S的计算值392.0660；实验值392.0663。
6.2.6式22a-b的化合物的合成(方案6)
方案6：
Figure GDA0002463350460002401
试剂和条件：(a)m-CPBA，30min，rt。
21与m-CPBA反应产生亚砜22a和砜22b.在氮保护下将21(20mg，0.053mmol)和 m-CPBA(18.2mg，0.106mmol)于THF∶CH2Cl2(2mL)中的混合物于室温下搅拌30min。在移除溶剂后，通过制备型TLC(CH2Cl2∶CH3OH-NH3(7N)，20∶1)纯化粗制材料，从而获得所需产物22a和22b。
8-((2，4-二氯苯基)亚磺酰基)-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-6-胺(22a；HJP-V-62M).产率， 3.4mg(23％)。1H-NMR(600MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ8.29(s，1H)，8.04(d，J＝8.5Hz，1H)， 7.58(dd，J＝8.5，2.0Hz，1H)，7.41(d，J＝2.0Hz，1H)，4.57(t，J＝7.1Hz，2H)，2.30(td，J＝ 7.0，2.6Hz，2H)，2.06-2.20(m，2H)，1.98(t，J＝2.6Hz，1H)；13C NMR(150MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ155.1，152.6，150.6，139.2，136.3，131.9，130.1，128.7，128.6，119.1，81.9， 70.0，43.5，28.7，16.0；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C16H14Cl2N5OS的计算值394.0296；实验值394.0279。
8-((2，4-二氯苯基)磺酰基)-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-6-胺(22b；HJP-V-62T).产率， 5.1mg(34％)。1H-NMR(600MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ8.39(s，1H)，8.24(d，J＝8.4Hz，1H)， 7.48-7.51(m，2H)，6.24(br s，2H)，4.88(t，J＝7.6Hz，2H)，2.29(td，J＝7.0，2.6Hz，2H)， 2.10-2.16(m，2H)，1.92(t，J＝2.6Hz，1H)；13C NMR(150MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ155.4， 153.3，150.7，146.2，142.2，134.9，134.8，132.6，132.0，127.9，119.3，82.1，69.6，44.4，28.9， 16.1；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C16H14Cl2N5O2S的计算值410.0245；实验值410.0228。
6.2.7式24a-o的化合物的合成(方案7)
方案7：
Figure GDA0002463350460002411
试剂和条件：(a)1，2-二溴乙烷、Cs2CO3、DMF；(b)胺、DMF，16-24h。
9-(2-溴乙基)-8-((2，4-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(23).在氮保护下将8-((2，4-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(18，0.4g，1.28mmol)、Cs2CO3(0.63g，1.92mmol)和1，2-二溴丙烷 (1.21g，0.55mL，6.43mmol)于DMF(10mL)中的混合物于室温下搅拌30min。在移除溶剂后，通过急骤色谱(CH2Cl2∶CH3OH∶AcOH，100∶1∶0.5到20∶1∶0.5)纯化粗制材料，从而获得23。产率，0.19g(36％)。1H-NMR(500MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ8.27(s，1H)，7.52(d，J ＝2.2Hz，1H)，7.36(d，J＝8.5Hz，1H)，7.26(dd，J＝8.4，2.2Hz，1H)，4.68(d，J＝6.5Hz，2H)，3.77(t，J＝6.5Hz，2H)；13C NMR(125MHz，CDC13/MeOH-d4)δ154.6，153.1，150.9，145.0，136.3，135.7，133.9，130.3，128.4，128.2，119.8，45.0，28.5。
24a-m的一般合成程序
在氮保护下将23(10mg，0.024mmol)和胺(1.19mmol，50当量)于DMF(1mL)中的混合物于室温下搅拌16-24hr。在移除溶剂后，通过制备型TLC(CH2Cl2∶CH3OH-NH3(7N)， 20∶1或15∶1)纯化粗制材料，从而获得所需产物24a-m。
8-((2，4-二氯苯基)硫基)-9-(2-(新戊基氨基)乙基)-9H-嘌呤-6-胺(24a；HJP-V-81).产率， 10.1mg(82％)。1H-NMR(600MHz，CDCl3)δ8.27(s，1H)，7.39(s，1H)，7.09(s，2H)，5.71(bs， 2H)，4.27-4.29(m，2H)，2.93(t，J＝5.8Hz，2H)，2.26(s，2H)，0.77(s，9H)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ154.7，153.3，151.6，144.5，134.9，134.5，132.3，130.3，130.1，128.1，120.4， 61.9，49.8，44.0，31.6，27.7；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C18H23Cl2N6S的计算值425.1082；实验值425.1081。
1-((2-(6-氨基-8-((2，4-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)乙基)氨基)丙-2-醇(24b； HJP-V-82).产率，8.2mg(69％)。1H NMR(600MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ8.25(s，1H)，7.53(s，1H)，7.35(d，J＝8.3Hz，1H)，7.28(d，J＝8.4Hz，1H)，4.37(t，J＝5.6Hz，2H)，3.73-3.78(m，1H)，2.97-3.09(m，2H)，2.70-2.73(m，1H)，2.45-2.51(m，1H)，1.13(d，J＝5.9Hz，3H)；13CNMR(150MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ154.4，152.8，151.1，145.3，136.5，135.8，134.1， 130.4，128.2，128.1，119.6，65.6，56.5，48.3，43.8，20.4；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C16H19 Cl2N6OS的计算值413.0718；实验值413.0720。
1-(2-(6-氨基-8-((2，4-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)乙基)哌啶-3-醇(24c；HJP-V-83). 产率，8.7mg(69％)。1H-NMR(600MHz，CDCl3)δ8.26(s，1H)，7.39(d，J＝2.2Hz，1H)，7.17 (d，J＝8.5Hz，1H)，7.12(dd，J＝8.5，2.2Hz，1H)，5.84(br s，2H)，4.23-4.34(m，2H)， 3.71-3.74(m，1H)，2.67(t，J＝4.3Hz，2H)，2.45-2.55(m，3H)，2.25-2.31(m，1H)，1.67-1.70 (m，1H)，1.39-1.48(m，3H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ154.6，153.3，151.5，144.5，135.3， 134.9，132.9，130.1，129.7，128.1，120.2，65.8，60.5，57.3，54.0，41.6，31.3，21.3；HRMS(ESI) m/z[M+H]+ C18H21Cl2N6OS的计算值439.0875；实验值439.0867。
2-((2-(6-氨基-8-((2，4-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)乙基)氨基)-2-甲基丙-1-醇(24d； HJP-V-84).产率，7.3mg(72％)。1H-NMR(600MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ8.25(s，1H)，7.53 (d，J＝2.2Hz，1H)，7.37(d，J＝8.5Hz，1H)，7.27(dd，J＝8.4，2.2Hz，1H)，4.38(t，J＝5.9Hz， 2H)，3.32(s，2H)，2.96(t，J＝5.8Hz，2H)，1.02(s，6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ154.6， 154.5，152.7，150.9，145.5，136.7，135.8，134.3，130.4，128.2，119.6，67.8，54.8，44.4，41.0， 23.1；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C17H21Cl2N6OS的计算值427.0875；实验值427.0884。
1-((2-(6-氨基-8-((2，4-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)乙基)氨基)-2-甲基丙-2-醇(24e； HJP-V-85).产率，6.1mg(60％)。1H-NMR(600MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ8.24(s，1H)，7.53 (d，J＝1.7Hz，1H)，7.35(d，J＝8.4Hz，1H)，7.28(dd，J＝8.4，1.8Hz，1H)，4.39(t，J＝5.4Hz， 2H)，3.09(t，J＝5.3Hz，2H)，2.61(s，2H)，1.17(s，6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ154.5， 152.7，151.1，145.3，136.6，135.9，134.2，130.4，128.3，128.1，119.6，69.4，59.9，49.9，43.8， 26.9；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C17H21Cl2N6OS的计算值427.0875；实验值427.0881。
2-((2-(6-氨基-8-((2，4-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)乙基)氨基)丙-1-醇(24f； HJP-V-86).产率，6.5mg(66％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.25(s，1H)，7.41(d，J＝1.9Hz，1H)，7.11-7.17(m，2H)，5.78(bs，2H)，4.27-4.38(m，2H)，3.51(dd，J＝11.0和3.7Hz，1H)，3.21(dd，J＝11.0和7.4Hz，1H)，3.09-3.14(m，1H)，2.90-2.95(m，1H)，2.74-2.77(m，1H)，0.96(d，J＝6.5Hz，3H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ154.7，153.3，151.6，144.4，135.3，134.9，132.8，130.2，129.5，128.2，120.2，65.5，55.1，46.2，44.4，16.9；HRMS(ESI)m/z [M+H]+ C16H19Cl2N6OS的计算值413.0718；实验值413.0707。
8-((2，4-二氯苯基)硫基)-9-(2-((2，2-二氟乙基)氨基)乙基)-9H-嘌呤-6-胺(24g； HJP-V-88).产率，4.5mg(57％)。1H NMR(600MHz，MeOD)δ8.32(s，1H)，7.69(d，J＝2.3Hz，1H)，7.53(d，J＝8.5Hz，1H)，7.41(dd，J＝8.5和2.3Hz，1H)，6.29(tt，J＝53.8和2.8Hz，1H)，4.69(t，J＝5.9，2H)，3.61-3.68(m，4H)；13C NMR(150MHz，MeOD)δ153.8，152.3， 149.9，148.2，137.9，137.3，136.2，131.5，129.7，129.1，120.7，114.1(t，J＝239.1Hz)，49.7(t，J＝24.3Hz)，48.3，41.9；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C15H15Cl2F2N6OS的计算值418.0330；实验值418.0331。
8-((2，4-二氯苯基)硫基)-9-(2-((2，2，2-三氟乙基)氨基)乙基)-9H-嘌呤-6-胺(24h； HJP-V-89).产率，6.5mg(64％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.27(s，1H)，7.40(d，J＝1.9Hz，1H)，7.12-7.16(m，2H)，5.87(br s，2H)，4.28(t，J＝6.1，2H)，3.05-3.11(m，4H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ154.1，152.1，151.0，145.7，136.5，135.8，134.2，130.3，128.2， 125.3(q，J＝278.4Hz)，119.5，51.8(q，J＝31.2Hz)，47.9，43.8；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C15H14Cl2F3N6OS的计算值437.0330；实验值437.0331。
1-(2-(6-氨基-8-((2，4-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)乙基)哌啶-4-醇(24i；HJP-V-90). 产率，4.6mg(45％).1H NMR(600MHz，MeOD)δ8.22(s，1H)，7.65(d，J＝2.0Hz，1H)，7.41 (d，J＝8.5Hz，1H)，7.38(dd，J＝8.5和2.1Hz，1H)，4.41-4.63(m，3H)，3.71-3.84(m，1H)， 3.15-3.25(m，4H)，1.93-1.98(m，2H)，1.61-1.69(m，2H)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C18H21Cl2N6OS的计算值439.0875；实验值439.0885。
8-((2，4-二氯苯基)硫基)-9-(2-吗啉基乙基)-9H-嘌呤-6-胺(24j；HJP-V-91).产率，5.6 mg(55％).1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.27(s，1H)，7.38(d，J＝2.1Hz，1H)，7.14(d，J＝8.5Hz，1H)，7.10(dd，J＝8.5和2.1Hz，1H)，5.77(br s，2H)，4.30(t，J＝6.1，2H)，3.56-3.59(m，4H)，2.66(t，J＝6.1，2H)，2.43-2.45(m，4H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ154.5，153.1，151.4，144.7，134.8，134.5，132.2，130.5，130.1，128.0，120.4，66.8，57.6，53.8，41.1；HRMS (ESI)m/z[M+H]+ C17H18Cl2N6OS的计算值425.0718；实验值425.0716。
8-((2，4-二氯苯基)硫基)-9-(2-(异丁基氨基)乙基)-9H-嘌呤-6-胺(24k；HJP-V-92). Yield，7.3mg(81％)。1H NMR(600MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ8.21(s，1H)，7.43(d，J＝2.0Hz， 1H)，7.22(d，J＝8.0Hz，1H)，7.16(dd，J＝8.5，2.0Hz，1H)，4.31(t，J＝5.9Hz，2H)，2.94(t，J ＝5.7，2H)，2.34-2.37(m，2H)，1.62-1.66(m，1H)，0.80(d，J＝6.5，6H)；13C NMR(150MHz， CDCl3/MeOH-d4)δ154.5，152.9，151.2，145.2，136.1，135.4，133.7，130.3，128.9，128.2，119.8， 57.3，48.6，43.7，28.0，20.4；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C17H21Cl2N6S的计算值411.0925；实验值411.0917。
8-((2，4-二氯苯基)硫基)-9-(2-(甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)乙基)-9H-嘌呤-6-胺(24l； HJP-V-100).产率，6.4mg(72％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.25(s，1H)，7.40(d，J＝2.0Hz，1H)，7.22(d，J＝8.5Hz，1H)，7.14(dd，J＝8.5，2.0Hz，1H)，6.29(br s，2H)，4.31(t，J＝6.2，2H)，3.29(s，2H)，2.82(d，J＝6.1Hz，2H)，2.28(s，3H)，2.11(s，1H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ153.1，151.2，150.2，146.4，135.6，135.1，133.3，130.2，129.4，128.1，120.0，77.6，73.8，54.1，45.8，41.9，41.8；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C17H17Cl2N6S的计算值407.0925；实验值407.0917。
1(R)-1-((2-(6-氨基-8-((2，4-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)乙基)氨基)丙-2-醇(24m； HJP-V-104).产率，4.2mg(53％)。1H NMR(600MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ8.22(s，1H)，7.49 (d，J＝2.2Hz，1H)，7.31(d，J＝8.5Hz，1H)，7.24(dd，J＝8.5，2.2Hz，1H)，4.36-4.40(m，2H)， 3.78-3.81(m，1H)，2.98-3.13(m，2H)，2.73-2.76(m，1H)，2.46-2.50(m，1H)，1.12(d，J＝6.3 Hz，3H)；13C NMR(150MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ154.6，152.9，151.1，145.1，136.5，135.8， 134.1，130.4，128.3，128.2，119.7，65.2，56.3，48.2，43.6，20.4；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C17H19Cl2N6OS的计算值413.0718；实验值413.0729。
1(S)-1-((2-(6-氨基-8-((2，4-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)乙基)氨基)丙-2-醇(24n； HJP-V-105).产率，3.8mg(48％)。1H NMR(600MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ8.22(s，1H)，7.49 (d，J＝2.2Hz，1H)，7.31(d，J＝8.5Hz，1H)，7.24(dd，J＝8.5，2.2Hz，1H)，4.36-4.40(m，2H)， 3.78-3.81(m，1H)，2.98-3.13(m，2H)，2.73-2.76(m，1H)，2.46-2.50(m，1H)，1.12(d，J＝6.3 Hz，3H)；13C NMR(150MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ154.6，152.9，151.1，145.1，136.5，135.8， 134.1，130.4，128.3，128.2，119.7，65.2，56.3，48.2，43.6，20.4；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C17H19Cl2N6OS的计算值413.0718；实验值413.0729。
2-((2-(6-氨基-8-((2，4-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)乙基)(丙-2-炔-1-基)氨基)乙醇 (24o；HJP-V-110).产率，8.3mg(79％)。1H NMR(600MHz，CD3CN)δ8.32(s，1H)，7.67 (d，J＝2.1Hz，1H)，7.39(d，J＝8.5Hz，1H)，7.36(dd，J＝8.5，2.1Hz，1H)，4.56(t，J＝5.9， 2H)，3.94(d，J＝2.2Hz，2H)，3.68(t，J＝5.2，2H)，3.43(t，J＝5.9，2H)，3.11(t，J＝5.3，2H)， 2.79(t，J＝2.2Hz，1H)；13C NMR(150MHz，CD3CN)δ151.6，150.4，146.4，146.1，134.9， 134.4，133.2，129.6，128.8，127.9，119.3，77.1，73.8，56.8，55.4，51.8，42.1，40.5；HRMS(ESI) m/z[M+H]+ C18H19Cl2N6OS的计算值437.0718；实验值437.0709。
6.2.8式26的化合物的合成(方案8)
方案8：
Figure GDA0002463350460002451
试剂和条件：(a)1，2-二溴乙烷、Cs2CO3、DMF，rt，4h；(b)炔丙胺、DMF，rt，24h。
9-(2-溴乙基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(25，PDP-129).将15(1.21mmol)溶解于DMF(15mL)中。添加Cs2CO3(1.45mmol)和1，2-二溴乙烷(2.42mmol)并将混合物在氮下于rt下搅拌4h。在减压下移除溶剂并对所得残余物进行色谱(CH2Cl2∶MeOH∶AcOH， 20∶1∶0.5)，从而以38％产率获得白色固体状25。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.34(s，1H)， 7.28(s，2H)，7.25(s，1H)，6.54(s，2H)，4.66(t，J＝6.5Hz，2H)，3.74(t，J＝6.5Hz，2H)；MS (ESI)：m/z 420.2[M+H]+。
8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9-(2-(丙-2-炔-1-基氨基)乙基)-9H-嘌呤-6-胺(26，PDP-131). 将25(0.09mmol)溶解于DMF(5mL)中。添加炔丙胺(0.9mmol)并将混合物在氮下于rt 下搅拌24h。在减压下移除溶剂并对所得残余物进行色谱(CH2Cl2∶NH3/MeOH，30∶1)，从而以80％产率获得白色固体状26。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.36(s，1H)，7.28(s，3H)， 5.84(br s，2H)，4.38(t，J＝6.1Hz，2H)，3.40(d，J＝2.2Hz，2H)，3.10(t，J＝6.1Hz，2H)， 2.17-2.19(m，2H)；13C-NMR(CDCl3)δ154.8，153.5，151.6，143.8，135.8，135.3，128.2，127.8，120.4，81.5，71.8，47.1，43.6，37.7；HRMS(ESI)：m/z[M+H]+ C16H15N6SCl2的计算值393.0456；实验值393.0459。
6.2.9式27a-d和28a-d的化合物的合成(方案9)
方案9：
Figure GDA0002463350460002452
试剂和条件：(a)甲苯磺酸3-(叔丁氧基羰基-异丙基-氨基)-丙基酯、Cs2CO3、DMF，rt；(b)TFA，0℃。
27a-d和28a-d的一般合成程序：在氮保护下将8-芳基硫基腺嘌呤(100mmol)、Cs2CO3 (100mmol)和甲苯磺酸3-(叔丁氧基羰基-异丙基-氨基)-丙基酯(200mmol)于DMF(1.3mL) 中的混合物于80℃下加热30min。在移除溶剂后，通过制备型TLC利用 CH2Cl2∶MeOH∶AcOH(20∶1∶0.1)纯化粗制材料，从而获得Boc保护的N-9和N-3烷基化化合物。于0℃下将其用TFA(1ml)分开处理1.5h，以提供相应9-烷基-8-芳基硫基腺嘌呤衍生物和3-烷基-8-芳基硫基腺嘌呤衍生物。
8-((2，4-二氯苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(27a；WS12).1H-NMR (600MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ8.23(s，1H)，7.55(s，1H)，7.38(d，J＝8.3Hz，1H)，7.30(d，J＝ 8.3Hz，1H)，4.34(t，J＝6.7Hz，2H)，2.92(七重峰，J＝5.8Hz，1H)，2.69(t，J＝6.4Hz，2H)， 2.13(五重峰，J＝6.5Hz，2H)，1.16(d，J＝5.7Hz，6H)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C17H21Cl2N6S的计算值411.0925；实验值411.0907。
8-((2，4-二甲基苯基)硫基)-3-(3-(异丙基氨基)丙基)-3H-嘌呤-6-胺(28b；WS11). 1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.96(s，1H)，7.48(d，J＝7.9Hz，1H)，7.11(s，1H)，7.00(d，J＝ 7.8Hz，1H)，4.48(t，J＝6.3Hz，2H)，2.91(七重峰，J＝6.3Hz，1H)，2.65(t，J＝6.1Hz，2H)， 2.25-2.29(m，2H)，1.18(d，J＝6.3Hz，6H)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C19H27N6S的计算值371.2018；实验值371.2035。
8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(27c；WS13).1H-NMR (600MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ8.21(s，1H)，7.26(t，J＝1.7Hz，1H)，7.24(d，J＝1.9Hz，2H)， 4.23(t，J＝6.9Hz，2H)，2.63(七重峰，J＝6.2Hz，1H)，2.46(t，J＝6.4Hz，2H)，1.89(五重峰， J＝6.9Hz，2H)，0.97(d，J＝6.3Hz，6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ154.7，153.1，151.3， 144.1，135.9，133.7，128.8，128.7，119.7，48.6，43.4，41.6，29.8，22.4；HRMS(ESI)m/z [M+H]+ C17H21Cl2N6S的计算值411.0925；实验值411.0917。
8-((3，5-二氯苯基)硫基)-3-(3-(异丙基氨基)丙基)-3H-嘌呤-6-胺(28c；WS13-N3). 1H-NMR(600MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ7.98(s，1H)，7.33(d，J＝1.8Hz，2H)，7.06(t，J＝1.8Hz，1H)，4.40(t，J＝6.7Hz，2H)，2.66(七重峰，J＝6.2Hz，1H)，2.51(t，J＝6.4Hz，2H)，2.06(五重峰，J＝6.5Hz，2H)，0.96(d，J＝6.2Hz，6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ157.9， 153.4，151.0，142.8，137.8，134.9，127.9，126.8，122.6，48.9，48.1，43.0，29.5，22.9；HRMS (ESI)m/z[M+H]+ C17H21Cl2N6S的计算值411.0925；实验值411.0928。
8-((3，5-双(三氟甲基)苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(27d；WS14). 1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ8.33(s，1H)，7.26-7.28(m，3H)，5.77(br s，2H)，4.33(t，J＝7.0 Hz，2H)，2.71-2.76(m，1H)，2.57(t，J＝6.9Hz，2H)，1.96-1.99(m，2H)，1.05(d，J＝6.4Hz，6H)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C19H21F6N6S的计算值479.1453；实验值479.1444。
6.2.10式30a-n的化合物的合成(方案10)
方案10：
Figure GDA0002463350460002471
试剂和条件：(a)4-甲苯磺酸戊-4-炔-1-基酯、Cs2CO3、DMF，80℃。
30a-n的一般合成程序
在氮保护下将8-芳基硫基腺嘌呤(29a-n；100mmol)、Cs2CO3(100mmol)和戊-4-炔基-4-甲苯磺酸酯(120mmol)于DMF(1.3mL)中的混合物于80℃下加热30min。在移除溶剂后，通过制备型TLC(CHCl3∶MeOH∶NH4OH，10∶1∶0.5或CHCl3∶MeOH∶AcOH，10∶1∶0.5) 纯化粗制材料以提供相应3-烷基-8-芳基硫基腺嘌呤衍生物30a-n。
8-(2-氯苯基硫基)-3-(戊-4-炔基)-3H-嘌呤-6-胺(30a).产率，10％。1H NMR(400MHz， CDCl3)δ8.02(s，1H)，7.48-7.51(m，1H)，7.40-7.42(m，1H)，7.14-7.17(m，2H)，4.49-4.51(m， 2H)，2.17-2.22(m，4H)，2.05-2.06(m，1H)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C16H15N5ClS的计算值 344.0737；实验值344.0720。
8-(2-甲氧基苯基硫基)-3-(戊-4-炔基)-3H-嘌呤-6-胺(30b).产率，25％。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ7.97(s，1H)，7.45(d，J＝7.7Hz，1H)，7.22(d，J＝7.8Hz，1H)，6.86-6.90(m， 2H)，4.47(t，J＝6.6Hz，2H)，3.87(s，3H)，2.21-2.26(m，4H)，2.05-2.07(m，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ157.7，152.6，141.8，132.5，128.3，121.1，111.1，81.6，70.5，55.9，49.0，27.0，15.3；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C17H18N5OS的计算值340.1232；实验值340.1218。
(2-(6-氨基-3-(戊-4-炔基)-3H-嘌呤-8-基硫基)苯基)甲醇(30c).产率，21％。1HNMR (400MHz，CDCl3)δ7.96(s，1H)，7.74(d，J＝7.6Hz，1H)，7.60(d，J＝7.5Hz，1H)，7.44(t，J ＝7.4Hz，1H)，7.29(t，J＝7.5Hz，1H)，4.92(s，2H)，4.40(t，J＝6.4Hz，2H)，3.47(br s，1H)， 2.11-2.20(m，4H)，2.03-2.06(m，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ146.2，142.6，137.3，131.5，130.9，129.1，82.1，71.2，64.9，49.6，27.1，15.6；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C17H18N5OS的计算值340.1232；实验值340.1242。
3-(戊-4-炔基)-8-(2-(三氟甲氧基)苯基硫基)-3H-嘌呤-6-胺(30d).产率，19％。1HNMR (400MHz，CDCl3)δ8.01(s，1H)，7.50(d，J＝7.9Hz，1H)，7.21-7.27(m，2H)，7.13(t，J＝7.1 Hz，1H)，4.48(t，J＝6.1Hz，2H)，2.17-2.20(m，4H)，2.04-2.05(m，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ158.3，153.1，142.2，132.1，128.1，127.9，126.9，122.5，120.7，81.8，70.5，49.0，26.9， 15.2；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C17H15N5F3OS的计算值394.0949；实验值394.0946。
8-(2，4-二氯苯基硫基)-3-(戊-4-炔基)-3H-嘌呤-6-胺(30e).产率，22％。1H NMR(400 MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ8.10(s，1H)，7.50(s，1H)，7.42(d，J＝8.4Hz，1H)，7.23-7.25(m，1H)，4.46(t，J＝6.5Hz，2H)，2.24-2.27(m，2H)，2.14-2.19(m，3H)；13C NMR(100MHz， CDCl3/MeOH-d4)δ154.8，152.9，150.0，142.8，133.9，132.3，130.6，129.3，128.8，127.2，120.4，81.3，70.0，49.8，26.7，14.7；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C16H14N5Cl2S的计算值378.0347；实验值378.0335。
8-(2，4-二甲基苯基硫基)-3-(戊-4-炔基)-3H-嘌呤-6-胺(30f).产率，27％。1HNMR(400 MHz，CDCl3)δ7.94(s，1H)，7.48(d，J＝7.7Hz，1H)，7.08(s，1H)，6.97(d，J＝7.7Hz，1H)， 4.36(t，J＝6.1Hz，2H)，2.51(s，3H)，2.39(s，3H)，2.15-2.19(m，4H)，2.03-2.05(m，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ162.6，151.9，151.1，141.5，141.1，138.6，134.5，131.3，127.3， 127.2，121.7，81.8，70.5，48.8，26.9，21.1，20.8，15.2；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C18H20N5S的计算值338.1439；实验值338.1427。
8-(2，4-二甲氧基苯基硫基)-3-(戊-4-炔基)-3H-嘌呤-6-胺(30g).产率，7％。1HNMR (400MHz，CDCl3)δ7.99(s，lH)，7.53(d，J＝8.1Hz，1H)，6.56-6.59(m，2H)，4.43(t，J＝6.8 Hz，2H)，3.86(s，3H)，3.82(s，3H)，2.12-2.26(m，5H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ162.2，160.6，151.8，141.6，137.3，135.2，108.8，105.3，99.1，81.5，70.1，55.6，55.1，26.7，14.8；HRMS (ESI)m/z[M+H]+ C18H20N5O2S的计算值370.1338；实验值370.1350。
8-(2，5-二氯苯基硫基)-3-(戊-4-炔基)-3H-嘌呤-6-胺(30h).产率，21％。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ8.06(s，1H)，7.43(s，1H)，7.26-7.28(m，1H)，7.06-7.08(m，1H)，4.50-4.52(m， 2H)，2.21-2.24(m，4H)，2.05-2.06(m，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)δ153.6，142.6，132.7，130.3，129.7，127.3，81.7，70.6，49.2，26.9，15.2；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C16H14N5Cl2S的计算值378.0347；实验值378.0362。
8-(2，5-二甲基苯基硫基)-3-(戊-4-炔基)-3H-嘌呤-6-胺(30i).产率，20％。1HNMR(400 MHz，CDCl3)δ7.96(s，1H)，7.41(s，1H)，7.13(d，J＝7.7Hz，1H)，7.04(d，J＝7.7Hz，1H)， 4.45(t，J＝6.3Hz，2H)，2.43(s，3H)，2.37(s，3H)，2.17-2.27(m，3H)，2.04(m，2H)；13CNMR (100MHz，CDCl3)δ152.0，151.2，141.7，137.7，135.9，134.5，130.9，130.2，129.2，81.8，70.5， 48.9，27.0，20.8，20.4，15.3；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C18H20N5S的计算值338.1439；实验值338.1435。
8-(2-氯-5-(三氟甲基)苯基硫基)-3-(戊-4-炔基)-3H-嘌呤-6-胺(30j).产率，18％。1H NMR(400MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ8.08(s，1H)，7.84(s，1H)，7.57(d，J＝8.3Hz，1H)，7.47 (d，J＝8.4Hz，1H)，4.48(t，J＝6.5Hz，2H)，2.16-2.26(m，4H)，2.09-2.10(m，1H)；13CNMR (100MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ157.4，153.2，150.4，142.8，138.2，134.5，130.1，129.4，128.9， 124.8，121.9，81.5，70.4，28.3，26.7，15.0；MS(ESI)：m/z 411.8[M+H]+。
8-(3，5-二氯苯基硫基)-3-(戊-4-炔基)-3H-嘌呤-6-胺(30k).产率，14％。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ8.03(s，1H)，7.46(s，2H)，7.30(s，1H)，4.50-4.52(m，2H)，2.20-2.24(m，3H)， 2.04-2.07(m，2H)；13C NMR(100MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ157.6，152.6，150.8，142.9，136.3， 134.8，128.7，127.1，120.4，81.3，70.1，43.8，26.7，14.7；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C14H15N5Cl2S的计算值378.0347；实验值378.0340。
8-(3，5-二甲基苯基硫基)-3-(戊-4-炔基)-3H-嘌呤-6-胺(30l).产率，16％。1HNMR(400 MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ8.01(s，1H)，7.23(s，2H)，7.00(s，1H)，4.45(t，J＝7.5Hz，2H)， 2.26(s，6H)，2.21-2.25(m，4H)，1.94-1.99(m，1H)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C18H20N5S的计算值338.1439；实验值338.1426。
3-(戊-4-炔基)-8-(2，4，5-三氯苯基硫基)-3H-嘌呤-6-胺(30m).产率，23％。1HNMR(400 MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ8.04(s，1H)，7.73(s，1H)，7.55(s，1H)，4.50(t，J＝6.4Hz，2H)， 2.08-2.29(m，4H)，2.06-2.07(m，1H)；13C NMR(100MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ159.6，154.7， 152.4，144.3，135.3，134.9，134.7，133.5，132.9，132.4，128.8，83.4，72.2，48.6，28.6，16.8； HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C16H13N5Cl3S的计算值411.9957；实验值411.9947。
8-(三甲苯基硫基)-3-(戊-4-炔基)-3H-嘌呤-6-胺(30n).产率，15％1H NMR(400MHz， CDCl3/MeOH-d4)δ7.93(s，1H)，6.97(s，2H)，4.38(t，J＝6.5Hz，2H)，2.41(s，6H)，2.30(s， 3H)，2.04-2.16(m，5H)；13C NMR(100MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ157.4，150.4，143.0，142.2， 139.2，128.9，124.8，81.5，70.1，26.7，21.6，21.3，20.5，14.8；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C19H22N5S的计算值352.1596；实验值352.1594。
6.2.11式32-34的化合物的合成(方案11)
方案11：
Figure GDA0002463350460002501
8-((3-氯-5-碘苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(31).将8-巯基腺嘌呤(3.6mmol)、新亚铜试剂水合物(0.36mmol)、CuI(0.36mmol)、NaO-t-Bu(7.2mmol)、1-氯-3，5-二碘苯(10.8mmol) 和无水DMF(24mL)置于经氮冲洗的圆底烧瓶中。将烧瓶用铁氟龙带密封，于110℃下加热，并在氮下磁力搅拌24h。在减压下移除溶剂并对所得残余物进行色谱 (CH2Cl2∶MeOH∶AcOH，20∶1∶0.5)。以浅黄色固体形式以67％产率获得。MS(ESI)：m/z 403.7 [M+H]+。化合物15是以类似方式制得。
32-34的一般合成程序
在氮保护下向偶合产物(15或31，1.0mmol)于CH2Cl2∶甲苯(0.5∶2.5mL)中的悬浮液中添加PPh3(4.0mmol)和醇(2.0mmol)。在搅拌10min后，添加DBAD(6mmol)并将反应混合物于rt下搅拌2-5h。在移除溶剂后，通过制备型TLC(CH2Cl2∶CH3OH∶AcOH，20∶1∶0.1 或CH2Cl2∶NH3-CH3OH(7N)，20∶1)纯化粗制材料，从而获得所需化合物32-34。
8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9-(己-5-炔-3-基)-9H-嘌呤-6-胺(32，HJP-V-125).产率，9.2mg (37％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.25(s，1H)，7.35-7.37(m，2H)，7.33(t，J＝1.7Hz，1H)， 4.71-4.74(m，1H)，3.27-3.33(m，1H)，2.80-2.84(m，1H)，2.32-2.35(m，1H)，2.02-2.05(m， 1H)，1.84(t，J＝2.5Hz，1H)，0.79(t，J＝7.4Hz，3H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ153.6， 150.5，147.7，135.8，133.6，132.1，131.9，129.3，128.9，128.4，79.6，71.1，59.9，26.2，23.3，10.9； HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C17H15Cl2N5S的计算值392.0503；实验值392.0503。
8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9-(2-(吡啶-3-基)乙基)-9H-嘌呤-6-胺(33，HJP-V-140).产率， 9.6mg(36.9％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.33-8.47(m，2H)，8.20(s，1H)，7.69(d，J＝ 7.4Hz，1H)，7.45-7.55(m，1H)，7.39(t，J＝1.7Hz，1H)，7.35-7.37(m，2H)，4.55(t，J＝7.2Hz，2H)，3.27(t，J＝7.0，Hz，2H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ150.9，150.3，148.8，146.8， 145.6，144.9，139.6，136.1，130.9，130.6，130.4，130.0，119.3，44.8，32.8`；HRMS(ESI)m/z [M+H]+ C18H15Cl2N6S的计算值417.0456；实验值417.0446。
8-((3-氯-5-碘苯基)硫基)-9-(2-(吡啶-3-基)乙基)-9H-嘌呤-6-胺(34，HJP-V-147).产率， 8.1mg(32％)。1H NMR(600MHz，CD3CN)δ8.57(d，J＝5.5Hz，1H)，8.50(s，1H)，8.14(d，J ＝8.0Hz，1H)，7.80(t，J＝1.6Hz，1H)，7.70-7.78(m，1H)，7.73(t，J＝1.5Hz，1H)，7.47(t，J＝ 1.7Hz，1H)，4.58(t，J＝7.4Hz，2H)，3.34(t，J＝6.4，Hz，2H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ 150.5，150.1，147.1，146.1，144.2，141.8，140.4，137.2，137.1，136.8，134.9，132.8，129.8， 126.5，119.3，93.8，44.1，31.5；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C18H15IClN6S的计算值508.9812；实验值508.9826。
6.2.12式36-48的化合物的合成(方案12)
方案12：
Figure GDA0002463350460002511
9-(3-溴丙基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(35).化合物35的合成是以与化合物25类似的方式来实施，但用1，3-二溴丙烷取代1，2-二溴乙烷。在移除溶剂后，通过制备型TLC(CH2Cl2∶MeOH∶AcOH，20∶1∶0.1)纯化粗制材料以提供所需异构体35。1H-NMR(600MHz，CDCl3)δ8.36(s，1H)，7.26-7.31(m，3H)，5.68(br s，2H)，4.31(t，J＝7.3Hz，2H)，3.15(t，J＝6.7Hz，2H)，2.28-2.35(m，2H)；MS(ESI)：m/z 432.1[M+H]+。
36-40的一般合成程序
在氮保护下将35(0.027mmol)和胺(1.35mmol，50当量)于DMF(1mL)中的混合物于室温下搅拌16-24hr。在移除溶剂后，通过制备型TLC(CH2Cl2∶CH3OH-NH3(7N)，20∶1 或15∶1)纯化粗制材料，从而获得所需产物36-40。
1-((3-(6-氨基-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)丙基)氨基)丙-2-醇(36， HJP-V-130).产率，6.1mg(76％)。1H NMR(600MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ8.22(s，1H)，7.28-7.33(m，3H)，4.27(t，J＝6.9Hz，2H)，3.77-3.83(m，1H)，2.51-2.62(m，3H)，2.37-2.42(m，1H)，1.93-1.95(m，2H)，1.11(d，J＝6.2Hz，3H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ154.6， 153.1，151.2，144.4，135.9，133.3，129.1，128.9，119.6，65.4，56.5，45.7，41.4，29.4，20.6； HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C17H21Cl2N6OS的计算值427.0875；实验值427.0887。
2-((3-(6-氨基-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)丙基)(丙-2-炔-1-基)氨基)乙醇 (37，HJP-V-132).产率，6.2mg(60％)。1H NMR(600MHz，CD3CN)δ8.31(s，1H)，7.48(t， J＝1.6Hz，1H)，7.49-7.51(m，2H)，4.33(t，J＝6.5Hz，2H)，3.99-4.05(m，2H)，3.78-3.81(m， 2H)，3.18-3.21(m，4H)，2.90(s，1H)，2.22-2.28(m，2H)；13C NMR(150MHz，CD3CN)δ151.3，150.5，146.3，145.9，135.1，133.6，128.7，128.2，117.8，79.1，71.2，55.6，54.9，50.4，42.0， 40.8，23.7；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C19H21Cl2N6OS的计算值451.0875；实验值451.0879。
1-(3-(6-氨基-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)丙基)氮杂环丁-3-醇(38， HJP-V-134).产率，4.2mg(36％)。1H NMR(600MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ8.27(s，1H)，7.37(t，J＝1.7Hz，1H)，7.32-7.34(m，2H)，4.38-4.44(m，1H)，4.28(t，J＝7.2Hz，2H)，3.7(t， J＝7.2Hz，2H)，3.05(t，J＝7.2Hz，2H)，2.59-2.63(m，2H)，1.87-1.93(m，2H)；13C NMR(150 MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ154.7，153.2，151.2，144.6，136.0，122.6，129.2，129.0，119.8， 63.8，61.4，55.7，41.8，27.2；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C17H19Cl2N6OS的计算值425.0718；实验值425.0718。
(S)-9-(3-((1-环丙基乙基)氨基)丙基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(39， SO-III-127B).向于无水DMF(1mL)中的9-(3-溴丙基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤 -6-胺(12mg，0.027mmol)添加(S)-1-环丙基乙胺(58.3μL，0.554mmol)，随后将反应混合物在rt下搅拌4天。在减压下移除溶剂并通过制备型TLC(CH2Cl2∶MeOH-NH3(7N)，15∶1) 纯化残余物，从而获得6.0mg(51％)SO-III-127B。1H NMR(600MHz，CDCl3)：δ8.36(s，1H)，7.27-7.30(m，3H)，5.68(br s，2H)，4.31-4.34(m，2H)，2.55-2.68(m，2H)，1.95-1.99(m，2H)，1.75-1.79(m，1H)，1.11(d，J＝6.3Hz，3H)，0.64-0.69(m，1H)，0.46-0.50(m，1H)，0.39-0.42(m，1H)，0.13-0.17(m，1H)，0.02-0.06(m，1H)。13C NMR(150MHz，CDCl3)：δ 154.6，153.4，151.6，143.6，135.8，134.7，128.4，128.0，120.3，58.9，43.9，41.8，30.4，20.6，17.7， 4.6，1.7。HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C19H23N6SCl2的计算值437.1082；实验值437.1083。
(R)-9-(3-((1-环丙基乙基)氨基)丙基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(40， SO-III-128B).向于无水DMF(1mL)中的9-(3-溴丙基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤 -6-胺(12mg，0.027mmol)添加(R)-1-环丙基乙胺(58.3μL，0.554mmol)，随后将反应混合物在rt下搅拌4天。在减压下移除溶剂并通过制备型TLC(CH2Cl2∶MeOH-NH3(7N)，15∶1) 纯化残余物，从而获得6.1mg(52％)SO-III-128B。1H NMR(600MHz，CDCl3)：δ8.36(s，1H)，7.27-7.30(m，3H)，5.68(br s，2H)，4.31-4.34(m，2H)，2.55-2.68(m，2H)，1.95-1.99(m， 2H)，1.75-1.79(m，1H)，1.11(d，J＝6.3Hz，3H)，0.64-0.69(m，1H)，0.46-0.50(m，1H)，0.39-0.42(m，1H)，0.13-0.17(m，1H)，0.02-0.06(m，1H)。13C NMR(150MHz，CDCl3)：δ 154.6，153.4，151.6，143.6，135.8，134.7，128.4，128.0，120.3，58.9，43.9，41.8，30.4，20.6，17.7， 4.6，1.7。HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C19H23N6SCl2的计算值437.1082；实验值437.1077。
9-(3-(1H-咪唑-1-基)丙基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(41，SO-III-103A).向于无水DMF(3mL)中的8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(60mg，0.192mmol)中添加 Cs2CO3(75mg，0.230mmol)和1-(3-溴丙基)-1H-咪唑(181mg，0.96mmol)且随后将反应混合物于rt下搅拌2小时。随后向反应混合物中再添加一份Cs2CO3(20mg)，将其进一步再搅拌1小时。在减压下移除溶剂并通过制备型TLC(CH2Cl2∶MeOH-NH3(7N)，10∶1)纯化残余物，从而获得4.9mg(6％)SO-III-103A。1H NMR(600MHz，CDCl3)：δ8.38(s，1H)，7.64(s，1H)，7.32(t，J＝1.8Hz，1H)，7.24(d，J＝1.8Hz，2H)，7.12(m，1H)，6.97(m，1H)，5.68(br s，2H)，4.23(t，J＝7.0Hz，2H)，4.02(t，J＝7.0Hz，2H)，2.27(m，2H)。13C NMR(150MHz，CDCl3)：δ154.7，153.7，151.6，143.3，137.1，135.9，134.0，129.6，128.7，128.2，120.2， 118.7，44.2，40.9，31.1。HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C17H16N7SCl2的计算值420.0565；实验值 420.0555。
9-(2-(环丙基氨基)乙基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(42，SO-III-35A).向于无水DMF(1mL)中的9-(2-溴乙基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(10mg，0.0238 mmol)中添加环丙胺(8.26μL，0.119mmol)，随后将反应混合物于rt下搅拌24h。随后向反应混合物中再添加环丙胺(17.3μL，0.25mmol)并将反应物于rt下进一步搅拌48h。在减压下移除溶剂并通过制备型TLC(CH2Cl2∶MeOH-NH3(7N)，30∶1)纯化残余物，从而获得 6.0mg(64％)SO-III-35A。1H NMR(600MHz，CDCl3)：δ8.37(s，1H)，7.27-7.29(m，3H)，5.6(br s，2H)，4.35(t，J＝6.4Hz，2H)，3.08(t，J＝6.4Hz，2H)，2.14(m，1H)，0.39(m，2H)，0.23(m，2H)。13C NMR(150MHz，CDCl3)：δ154.7，153.5，151.6，144.0，135.7，135.1，128.2，127.9，120.3，48.4，44.1，30.1，6.5。HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C16H17N6SCl2的计算值395.0612；实验值395.0626。
(R)-9-(2-((1-环丙基乙基)氨基)乙基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(43， SO-III-36A).向于无水DMF(1mL)中的9-(2-溴乙基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6- 胺(10mg，0.0238mmol)添加(R)-1-环丙基乙胺(12.7μL，0.119mmol)，随后将反应混合物于rt下搅拌24h。随后向反应混合物中添加更多(R)-1-环丙基乙胺(12.7μL，0.119mmol) 并将反应物于rt下进一步搅拌24h。在减压下移除溶剂并通过制备型TLC(CH2Cl2∶MeOH-NH3(7N)，30∶1)纯化残余物，从而获得5.7mg(57％)SO-III-36A。1H NMR(500MHz，CDCl3∶CD3OD)：δ8.27(s，1H)，7.33-7.35(m，3H)，4.35(t，J＝6.6Hz，2H)， 3.03-3.07(m，1H)，2.95-3.0(m，1H)，1.87(m，1H)，1.09(d，J＝6.3Hz，3H)，0.63(m，1H)， 0.40-0.47(m，2H)，0.13(m，1H)，0.04(m，1H)。13C NMR(150MHz，CDCl3：CD3OD)：δ 154.8，153.2，151.3，144.9，136.0，134.1，129.1，128.9，119.9，58.6，46.1，44.2，20.3，17.3，4.6， 1.7。HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C18H21N6SCl2的计算值423.0925；实验值423.0909。
(S)-9-(2-((1-环丙基乙基)氨基)乙基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(44， SO-III-37A).向于无水DMF(1mL)中的9-(2-溴乙基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6- 胺(10mg，0.0238mmol)中添加(S)-1-环丙基乙胺(12.7μL，0.119mmol)，随后将反应混合物于rt下搅拌24h。随后向反应混合物中添加更多(S)-1-环丙基乙胺(12.7μL，0.119mmol) 并将反应物于rt下进一步搅拌24h。在减压下移除溶剂并通过制备型TLC(CH2Cl2∶MeOH-NH3(7N)，30∶1)纯化残余物，从而获得6.4mg(64％)SO-III-37A。1H NMR(500MHz，CDCl3：CD3OD)：δ8.27(s，1H)，7.33-7.35(m，3H)，4.35(t，J＝6.6Hz，2H)， 3.03-3.07(m，1H)，2.95-3.0(m，1H)，1.87(m，1H)，1.09(d，J＝6.3Hz，3H)，0.63(m，1H)， 0.40-0.47(m，2H)，0.13(m，1H)，0.04(m，1H)。13C NMR(150MHz，CDCl3：CD3OD)：δ 154.8，153.2，151.3，144.9，136.0，134.1，129.1，128.9，119.9，58.6，46.1，44.2，20.3，17.3，4.6， 1.7。HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C18H21N6SCl2的计算值423.0925；实验值423.0909。
8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙基)-9H-嘌呤-6-胺(45，S0-III-39A). 向于无水DMF(1mL)中的9-(2-溴乙基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(10mg， 0.0238mmol)中添加1-甲基哌嗪(51μL，0.46mmol)，随后将反应混合物于rt下搅拌48h。在减压下移除溶剂并通过制备型TLC(CH2Cl2∶MeOH-NH3(7N)，15∶1)纯化残余物，从而获得8mg(77％)SO-III-39A。1H NMR(600MHz，CDCl3)：δ8.36(s，1H)，7.27(m，1H)，7.24 (m，2H)，5.69(br s，2H)，4.35(t，J＝6.2Hz，2H)，2.71(t，J＝6.2Hz，2H)，2.48-2.58(m，4H)，2.32-2.42(m，4H)，2.26(s，3H)。13C NMR(150MHz，CDCl3)：δ154.7，153.4，151.4，144.0，135.8，135.7，128.0，127.6，120.5，56.9，54.9，53.2，45.9，41.4。HRMS(ESI)m/z[M+H]+C18H22N7SCl2的计算值438.1034；实验值438.1024。
9-(2-((2-环丙基丙-2-基)氨基)乙基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(46， SO-III-40A).向于无水DMF(1mL)中的9-(2-溴乙基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6- 胺(10mg，0.023mmol)中添加2-环丙基-2-丙基胺对甲苯磺酸盐(125mg，0.46mmol)和 Et3N(50μL)，随后将反应混合物于rt下搅拌10天。在减压下移除溶剂并通过制备型TLC(CH2Cl2∶MeOH-NH3(7N)，10∶1)纯化残余物，从而获得3.8mg(38％)SO-III-40A。1H NMR(600MHz，CDCl3：CD3OD)：δ8.26(s，1H)，7.35-7.37(m，3H)，4.47(m，2H)，2.99(m，2H)， 0.91(sbr，6H)，0.88(m，1H)，0.39(m，2H)，0.24(m，2H)。HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C19H23N6SCl2的计算值437.1082；实验值437.1090。
8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9-(2-((2-甲氧基丙基)氨基)乙基)-9H-嘌呤-6-胺(47， SO-III-75A).向于无水DMF(1mL)中的9-(2-溴乙基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6- 胺(10mg，0.023mmol)中添加2-甲氧基-1-丙胺盐酸盐(24.5mg，0.195mmol)、Et3N(50μL)，并将反应混合物于rt下搅拌3天。在减压下移除溶剂并通过制备型TLC (CH2Cl2∶MeOH-NH3(7N)，20∶1)纯化残余物，从而获得9.0mg(92％)SO-III-75A。1H NMR (600MHz，CDCl3)：δ8.36(s，1H)，7.25-7.28(m，3H)，5.93(br s，2H)，4.35(t，J＝6.4Hz，2H)， 3.34-3.37(m，1H)，3.29(s，3H)，2.95-3.03(m，2H)，2.55-2.58(m，2H)，1.07(d，J＝6.2Hz， 3H)。13CNMR(150MHz，CDCl3)：δ154.8，153.4，151.5，144.0，135.7，135.3，128.1，127.8， 120.4，75.9，56.2，55.1，48.7，43.9，16.9。HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C17H21N6OSCl2的计算值427.0875；实验值427.0860。
8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9-(2-(异丙基氨基)乙基)-9H-嘌呤-6-胺(48，SO-III-116A).向于无水DMF中的9-(2-溴丙基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(20mg，0.047mmol) 中添加异丙胺(121μL，1.41mmol)并将反应混合物于rt下搅拌72小时。在减压下移除溶剂并通过制备型TLC(CH2Cl2∶MeOH-NH3(7N)，20∶1)纯化残余物，从而获得12.6mg(68％) SO-III-116A。1H NMR(600MHz，CDCl3)：δ8.36(s，1H)，7.26-7.28(m，3H)，5.82(br s，2H)， 4.34(t，J＝6.5Hz，2H)，2.97(t，J＝6.5Hz，2H)，2.74-2.76(m，1H)，0.96(d，J＝6.2Hz，6H)。13C NMR(150MHz，CDCl3)：δ154.8，153.5，151.5，144.0，135.7，135.3，128.1，127.8，120.4， 48.5，46.1，44.5，22.8。HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C16H19N6SCl2的计算值397.0769；实验值 397.0765。
6.2.13式51的化合物的合成(方案13a)
方案13a：
Figure GDA0002463350460002561
8-((2，6-二氯吡啶-4-基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(50).将8-巯基腺嘌呤(3.6mmol)、新亚铜试剂水合物(0.36mmol)、CuI(0.36mmol)、NaO-t-Bu(7.2mmol)、2，6-二氯-4-碘吡啶(10.8 mmol)和无水DMF(24mL)置于经氮冲洗的圆底烧瓶中。将烧瓶用铁氟龙带密封，于110℃下加热，并在氮下磁力搅拌24h。在减压下移除溶剂并对所得残余物进行色谱 (CH2Cl2∶MeOH∶AcOH，20∶1∶0.5)。以浅黄色固体形式以50％产率获得。MS(ESI)：m/z 312.8 [M+H]+。
8-((2，6-二氯吡啶-4-基)硫基)-9-(戊-4-炔-1-基)-9H-嘌呤-6-胺(51，HJP-VI-66).将8-芳基硫基腺嘌呤(1.21mmol)溶解于DMF(15mL)中并添加Cs2CO3(1.45mmol)和5-氯戊-1- 炔(2.42mmol)并将混合物在氮下搅拌3h。在减压下移除溶剂并通过制备型色谱(CH2Cl2∶MeOH∶AcOH，20∶1∶0.5)纯化所得残余物，从而获得所需化合物HJP-VI-66。以固体形式以22％产率获得。1H NMR(600MHz，CDCl3+5滴CD3OD)：δ8.32(s，1H)，7.47(s， 1H)，7.18(s，1H)，4.38(t，J＝7.2Hz，2H)，2.26-2.29(m，2H)，2.03-2.05(m，3H)，0.13(m， 1H)，0.04(m，1H)。13C NMR(150MHz，CDCl3：CD3OD)：δ159.3，157.6，155，154.9，153.9， 124.4，124.3，85.8，73.6，47.3，41.7，32.3，19.7；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C15H13N6SCl2的计算值379.0299；实验值379.0312。
6.2.13式53-56的化合物的合成(方案13b)
方案13b：
Figure GDA0002463350460002571
9-(3-溴丙基)-8-((3-氯-5-碘苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(52).将8-芳基硫基腺嘌呤(1.21 mmol)溶解于DMF(15mL)中并添加Cs2CO3(1.45mmol)和1，3-二溴丙烷(2.42mmol)并将混合物在氮下搅拌2-4h。在减压下移除溶剂并对所得残余物进行色谱 (CH2Cl2∶MeOH∶AcOH，20∶1∶0.5)，从而获得所需化合物52。以固体形式以25％产率获得。 MS(ESI)：m/z523.9[M+H]+。
53-56的一般合成程序
在氮保护下将52(12mg，0.028mmol)和胺(1.40mmol，50当量)于DMF(1mL)中的混合物于室温下搅拌16-24hr。在移除溶剂后，通过制备型TLC(CH2Cl2∶CH3OH-NH3(7N)， 20∶1或15∶1)纯化粗制材料，从而获得所需产物53-56。
8-((3-氯-5-碘苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(53，HJP-V-149).产率，9.5mg(83％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.34(s，1H)，7.62(t，J＝1.4Hz，1H)，7.60(t， J＝1.6Hz，1H)，7.34(t，J＝1.7Hz，1H)，6.13(br s，2H)，4.32(t，J＝7.0Hz，2H)，2.67-2.73(m， 1H)，2.55(t，J＝6.7Hz，2H)，1.92-1.98(m，2H)，1.03(d，J＝6.2Hz，6H)；13C NMR(150MHz， CDCl3)δ154.8，153.4，151.6，143.6，136.7，136.6，135.7，134.7，129.3，120.2，94.4，48.7，43.8， 41.8，30.3，22.9；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C17H21IClN6S的计算值503.0282；实验值 503.0260。
8-((3-氯-5-碘苯基)硫基)-9-(3-(异丁基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(54，HJP-VI-4).产率，10.2mg(85％)。1H NMR(600MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ8.26(s，1H)，7.70(t，J＝1.6Hz， 1H)，7.68(t，J＝1.6Hz，1H)，7.40(t，J＝1.7Hz，1H)，4.30(t，J＝7.0Hz，2H)，2.55(t，J＝6.9， Hz，2H)，2.35(d，J＝6.9Hz，2H)，1.95-2.01(m，2H)，1.72-1.79(m，1H)，0.92(d，J＝6.7Hz， 6H)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C18H23IClN6S的计算值517.0438；实验值517.0457。
8-((3-氯-5-碘苯基)硫基)-9-(3-(新戊基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(55，HJP-VI-5).产率， 10.3mg(85％)。1H NMR(600MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ8.24(S，1H)，7.72(t，J＝1.5Hz，1H)，7.69(t，J＝1.4Hz，1H)，7.41(t，J＝1.6Hz，1H)，4.31(t，J＝7.0Hz，2H)，2.60(t，J＝6.8 Hz，2H)，2.33(S，2H)，1.99-2.05(m，2H)，0.95(S，9H)；13C NMR(150MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ158.6，156.8，155.1，148.6，141.7，141.3，139.8，137.3，134.3，123.6，65.8，50.8，45.5，35.1，32.9，31.6；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C19H25IClN6S的计算值531.0595；实验值531.0587。
9-(3-(叔丁基氨基)丙基)-8-((3-氯-5-碘苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(56，HJP-VI-6).产率， 10.8mg(91.5％)。1H NMR(600MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ8.26(s，1H)，7.72(t，J＝1.4 Hz，1H)，7.70(t，J＝1.4Hz，1H)，7.43(t，J＝1.7Hz，1H)，4.35(t，J＝6.9Hz，2H)，2.64(t，J＝ 6.5Hz，2H)，2.09-2.13(m，2H)，1.20(s，9H)；13C NMR(150MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ154.7，152.8，151.3，144.9，138.0，137.6，135.9，133.1，130.7，119.6，94.6，53.1，41.3，38.4， 29.1，27.6；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C19H25IClN6S的计算值531.0595；实验值531.0587。
6.2.14式57-87的化合物的合成(方案14)
方案14：
Figure GDA0002463350460002581
一般条件：
方法A：向配备有磁力搅拌棒和橡胶隔片的10mL RBF中的HJP-V-149(53，15mg，0.0298mmol，1当量)和NaHCO3(3当量)中添加
Figure GDA0002463350460002582
酸或频哪醇酯(1.5-3当量)。添加DMF(0.5mL)并排空反应混合物并回填氮。将此重复四次，随后使氮鼓泡通过反应混合物达10min。随后添加H2O(0.1mL)和PdCl2(PPh3)2(10-20mol％)并将反应混合物在氮下于90 ℃下加热2-24h。在减压下移除溶剂并通过制备型TLC纯化所得残余物，从而得到所需化合物57-63、65-73、81-85、87。
方法B：排空配备有磁力搅拌棒和橡胶隔片的10mL RBF中的HJP-V-149(15mg，0.0298mmol，1当量)、(n-Bu)3SnR(4当量)、LiCl(2当量)和Pd(PPh3)4(10-20mol％)于 DMF(1mL)中的混合物并回填氮。将此重复四次，随后将反应混合物在氮下于90℃到100 ℃下加热18h。在减压下移除溶剂并通过制备型TLC纯化所得残余物，从而得到化合物 74(HJP-VI-49)和86(HJP-VI-78)。
方法C：向经氩冲洗的密封管中的HJP-V-149(15mg，0.0298mmol，1当量)于DMF(2mL)中的溶液中添加CuI(0.5当量)、PdCl2(PPh3)2(15mol％)、炔烃(2-2.5当量)和三乙胺(5当量)。将反应混合物于90℃到100℃下加热24h。在减压下移除溶剂并通过制备型 TLC纯化所得残余物，从而得到化合物76(HJP-VI-51)、77(HJP-VI-52)、78(HJP-VI-53)、 64(HJP-VI-18)、75(HJP-VI-50)、79(HJP-VI-58)、80(HJP-VI-59)。
8-((5-氯-4′-甲氧基-[1，1′-联苯基]-3-基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺 (57，HJP-VI-3).产率，9.6mg(67％)。1H NMR(600MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ8.22(s， 1H)，7.65(t，J＝1.6Hz，1H)，7.60(t，J＝1.7Hz，1H)，7.52(d，J＝8.8，Hz，2H)，7.44(t，J＝1.7 Hz，1H)，7.01(d，J＝8.8，Hz，2H)，4.42(t，J＝6.9Hz，2H)，3.86(s，3H)，3.30-3.34(m，1H)， 3.01(t，J＝7.3Hz，2H)，2.27-2.31(m，2H)，1.37(d，J＝6.5Hz，6H)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C24H28ClN6OS的计算值483.1734；实验值483.1713。
8-((5-氯-3′-甲氧基-[1，1′-联苯基]-3-基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺 (58，HJP-VI-7).产率，5.1mg(35％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.32(s，1H)，7.65(t，J＝ 1.6Hz，1H)，7.52(t，J＝1.6Hz，1H)，7.50(t，J＝1.7，Hz，1H)，7.37(t，J＝1.7Hz，1H)，7.35(t， J＝7.9，Hz，1H)，7.08(d，J＝7.6Hz，1H)，7.02(s，1H)，6.92(dd，J＝8.2和1.9Hz，1H)，5.72 (br s，2H)，4.35(t，J＝6.9Hz，2H)，3.84(s，3H)，2.74-2.79(m，1H)，2.58(t，J＝6.7Hz，2H)， 2.01-2.06(m，2H)，1.07(d，J＝6.2Hz，6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ160.0，154.6， 153.1，151.7，144.9，144.0，140.0，135.6，132.9，130.1，129.0，127.6，127.4，120.1，119.5， 113.8，112.8，55.4，49.1，43.4，41.5，29.6，22.3；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C24H28ClN6OS的计算值483.1734；实验值483.1721。
8-((5-氯-3′-硝基-[1，1′-联苯基]-3-基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(59， HJP-VI-8).产率，11.8mg(78％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.40(s，1H)，8.33(s，1H)， 8.25(d，J＝8.0Hz，1H)，7.85(d，J＝7.9Hz，1H)，7.65(s，1H)，7.63(t，J＝8.0Hz，1H)，7.54(s，1H)，7.46(s，1H)，5.82(br s，2H)，4.36(t，J＝6.9Hz，2H)，2.70-2.74(m，1H)，2.58(t，J＝6.8， Hz，2H)，1.98-2.04(m，2H)，1.03(d，J＝6.2Hz，6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ154.6， 153.2，151.6，148.7，144.5，141.4，140.3，136.0，133.9，132.9，130.1，130.0，127.5，127.2， 123.2，122.1，120.1，48.8，43.7，41.7，30.2，22.8；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C23H25ClN7O2S的计算值498.1479；实验值498.1483。
8-((5-氯-3′-(三氟甲基)-[1，1′-联苯基]-3-基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6- 胺(60，HJP-VI-9).产率，9.0mg(59％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.33(s，1H)，7.76(s， 1H)，7.69(d，J＝7.7Hz，1H)，7.65(d，J＝7.7Hz，1H)，7.55-7.59(m，2H)，7.51(t，J＝1.7Hz， 1H)，7.42(t，J＝1.7Hz，1H)，5.74(br s，2H)，4.35(t，J＝6.9Hz，2H)，2.72-2.77(m，1H)， 2.58(t，J＝6.7Hz，2H)，1.99-2.05(m，2H)，1.04(d，J＝6.2Hz，6H)；13C NMR(150MHz， CDCl3)δ154.6，153.2，151.7，144.7，142.6，139.4，135.8，133.6，131.5(q，JC-F＝32.1Hz)， 130.4，129.62，129.61，127.5，127.3，125.1(q，JC-F＝3.5Hz)，123.94(q，JC-F＝3.8Hz)，123.87 (q，JC-F＝270.8Hz)120.1，48.9，43.6，41.6，29.9，22.5；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C24H25ClN6F3S的计算值521.1502；实验值521.1513。
8-((3-氯-5-(噻吩-2-基)苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(61， HJP-VI-10).产率，11.0mg(80％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.33(s，1H)，7.55(t，J＝1.5 Hz，1H)，7.51(t，J＝1.7Hz，1H)，7.33(d，J＝5.1Hz，1H)，7.29(d，J＝3.6Hz，1H)，7.27(t，J ＝1.7Hz，1H)，7.07(t，J＝5.0Hz，1H)，5.81(br s，2H)，4.34(t，J＝6.9Hz，2H)，2.71-2.75 (m，1H)，2.56(t，J＝6.7Hz，2H)，1.96-2.03(m，2H)，1.04(d，J＝6.2Hz，6H)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ154.6，153.2，151.6，144.6，141.3，137.1，135.7，133.5，128.7，128.3，126.4， 125.9，125.7，124.7，120.1，48.8，43.7，41.7，30.0，22.6；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C21H24ClN6S2的计算值459.1192；实验值459.1202。
8-((3-氯-5-(丙-1-烯-2-基)苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(62， HJP-VI-12).产率，9.2mg(75％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.32(s，1H)，7.39(t，J＝1.6 Hz，1H)，7.33(t，J＝1.7Hz，1H)，7.26(t，J＝1.8Hz，1H)，5.33-5.36(m，1H)，5.10-5.15(m， 1H)，6.16(br s，2H)，4.31(t，J＝7.1Hz，2H)，2.65-2.72(m，1H)，2.53(t，J＝6.8Hz，2H)， 2.07(s，3H)，1.92-1.98(m，2H)，1.02(d，J＝6.2Hz，6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ154.8， 153.2，151.6，144.6，144.1，141.1，135.2，132.8，128.8，125.8，125.7，120.1，114.9，48.7，43.8， 41.8，30.3，22.9，21.5；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C20H26ClN6S的计算值417.1628；实验值 417.1630。
8-((3-氯-5-(3-甲基丁-2-烯-2-基)苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(63， HJP-VI-14).产率，9.6mg(72％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.33(s，1H)，7.22(t，J＝1.8 Hz，1H)，7.05(t，J＝1.5Hz，1H)，7.01(t，J＝1.6Hz，1H)，5.76(br s，2H)，4.30(t，J＝7.0Hz， 2H)，2.68-2.72(m，1H)，2.53(t，J＝6.7Hz，2H)，1.92-1.98(m，2H)，1.89(s，3H)，1.76(s， 3H)，1.54(s，3H)，1.03(d，J＝6.2Hz，6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ154.6，153.1，151.6， 148.1，144.9，134.7，132.4，129.5，128.7，128.5，127.8，127.3，120.1，48.7，43.7，41.7，30.1， 22.8，22.1，20.6，20.5；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C22H30ClN6S的计算值445.1941；实验值 445.1939。
8-((3-氯-5-乙炔基苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(64，HJP-VI-18). 产率，9mg(76％)。1H NMR(600MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ8.26(s，1H)，7.46(t，J＝1.5 Hz，1H)，7.45(t，J＝1.5Hz，1H)，7.43(t，J＝1.7Hz，1H)，4.31(t，J＝6.9Hz，2H)，3.22(s， 1H)，2.73-2.79(m，1H)，2.56(t，J＝6.8Hz，2H)，1.98-2.06(m，2H)，1.08(d，J＝6.3Hz，6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ154.6，152.9，151.4，144.9，135.4，132.9，132.3，132.2，131.6，125.3，119.7，80.9，80.3，48.9，43.2，41.5，29.5，22.1；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C19H22ClN6S的计算值401.1315；实验值401.1324。
8-((3-氯-5-(1H-吡咯-2-基)苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(65， HJP-VI-28).产率，7.4mg(68％)。1H NMR(600MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ8.24(s，1H)，7.62(s，1H)，7.54(s，1H)，7.25(s，1H)，6.87-6.90(m，1H)，6.53(d，J＝3.4Hz，1H)，6.25(t，J＝3.1Hz，1H)，4.31(t，J＝7.1Hz，2H)，2.75-2.78(m，1H)，2.59(t，J＝6.9Hz，2H)， 1.96-2.01(m，2H)，1.07(d，J＝6.3Hz，6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ 154.5，152.9，151.2，146.1，136.5，135.6，131.5，129.3，128.5，125.6，124.9，120.7，119.4， 110.0，107.6，49.0，43.4，41.5，29.2，21.9；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C21H25ClN7S的计算值 442.1581；实验值442.1592。
8-((3-氯-5-(1H-吡唑-5-基)苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(66， HJP-VI-29).产率，8.2mg(94％)。1H NMR(600MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ8.33(s，1H)，7.77(s，1H)，7.60(t，J＝1.4Hz，1H)，7.56(d，J＝2.2Hz，1H)，7.35(t，J＝1.7Hz，1H)6.69(brs，2H)，6.53(d，J＝2.2Hz，1H)，4.33(t，J＝7.0Hz，2H)，2.70-2.75(m，1H)，2.58(t，J＝6.8Hz，2H)，1.94-1.98(m，2H)，1.03(d，J＝6.3Hz，6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3+5滴 CD3OD)δ154.9，153.2，151.4，147.6，144.4，135.8，133.3，131.3，129.1，125.8，125.7，120.0，102.9，48.8，43.6，41.8，30.5，22.5；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C20H24ClN8S的计算值 443.1533；实验值443.1522。
8-((3-氯-5-(呋喃-2-基)苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(67， HJP-VI-30).产率，9.2mg(69％)。1H NMR(600MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ8.26(s，1H)，7.66(t，J＝1.4Hz，1H)，7.63(t，J＝1.6Hz，1H)，7.49(d，J＝1.3Hz，1H)，6.72(d，J＝3.4Hz，1H)，6.48-6.50(m，1H)，4.33(t，J＝6.9Hz，2H)，2.78-2.81(m，1H)，2.58(t，J＝6.8Hz，2H)，2.02-2.07(m，2H)，1.09(d，J＝6.3Hz，6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ154.6，153.7，152.8，151.4，149.4，145.9，135.8，134.0，131.8，129.2，124.6，123.7，119.5，108.6，108.4，49.9，43.3，41.5，29.3，22.0，13.7；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C22H26ClN6OS的计算值457.1577；实验值457.1578。
8-((3-氯-5-乙烯基苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(68，HJP-VI-31). 产率，6.7mg(56％)。1H NMR(600MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ8.25(s，1H)，7.41(s，1H)， 7.39(s，1H)，7.33(s，1H)，6.58-6.65(m，1H)，5.79(d，J＝17.5Hz，1H)，5.38(d，J＝10.9Hz， 1H)，4.32(t，J＝6.8Hz，2H)，2.81-2.86(m，1H)，2.61(t，J＝6.8Hz，2H)，2.03-2.05(m，2H)， 1.13(d，J＝6.3Hz，6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ154.6，152.8，151.4，145.9，140.8，135.7，134.4，131.5，130.5，127.9，126.7，119.5，117.2，49.3，48.7，43.0，41.3， 28.9，21.7；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ Cl9H24ClN6S的计算值403.1472；实验值403.1461。
8-((3-氯-5-(5-甲基呋喃-2-基)苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(69， HJP-VI-38).产率，10.1mg(74％)。1H NMR(600MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ8.24(s，1H)， 7.63(s，1H)，7.59(s，1H)，7.25(s，1H)，6.61(d，J＝3.2Hz，1H)，6.08(d，J＝3.1Hz，1H)，4.32 (t，J＝6.9Hz，2H)，2.74-2.78(m，1H)，2.57(t，J＝6.8Hz，2H)，2.36(s，3H)，1.98-2.04(m， 2H)，1.07(d，J＝6.3Hz，6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ154.6，152.8，151.4，151.1，145.6，143.4，135.8，133.7，132.1，129.6，124.9，124.1，119.6，112.1，107.5，49.1， 43.1，41.4，29.2，21.9；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C21H24ClN6OS的计算值443.1421；实验值 443.1403。
8-((3-氯-5-(呋喃-3-基)苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(70， HJP-VI-39).产率，8.8mg(67％)。1H NMR(600MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ8.24(s，1H)，7.79(s，1H)，7.54(s，1H)，7.50(s，1H)，7.48(s，1H)，7.34(s，1H)，6.67(s，1H)，4.38(t，J＝6.7 Hz，2H)，2.99-3.03(m，1H)，2.73(t，J＝6.7Hz，2H)，2.16-2.21(m，2H)，1.24(d，J＝6.4Hz， 6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ154.6，152.7，151.4，146.1，144.4，139.7，135.9，131.4，129.9，127.6，126.6，124.3，119.4，108.5，50.0，42.4，40.9，31.6，20.6；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C21H24ClN6OS的计算值443.1421；实验值443.1410。
8-((3-氯-5-(1H-吡咯-3-基)苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(71， HJP-VI-44).产率，4.4mg(35％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.32(s，1H)，7.45(t，J＝1.5 Hz，1H)，7.43(t，J＝1.5Hz，1H)，7.16(t，J＝1.7Hz，1H)，7.05-7.06(m，1H)，6.81-6.83(m， 1H)，6.44-6.46(m，1H)，5.68(br s，2H)，4.33(t，J＝6.9Hz，2H)，2.72-2.76(m，1H)，2.56(t， J＝6.7Hz，2H)，1.95-2.02(m，2H)，1.04(d，J＝6.2Hz，6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ154.5，153.1，151.7，145.2，138.9，135.4，132.6，126.9，125.5，125.1，122.6，120.0，119.5， 115.5，106.5，48.9，43.6，41.6，28.7，22.5；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C21H25ClN7S的计算值 442.1581；实验值442.1586。
8-((3-氯-5-(1H-吡唑-4-基)苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(72， HJP-VI-46).产率，8.9mg(67％)。1H NMR(600MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ8.24(s，1H)，7.83(s，2H)，7.54(s，1H)，7.49(s，1H)，7.29(s，1H)，4.33(t，J＝6.8Hz，2H)，2.82-2.87(m，1H)，2.64(t，J＝6.7Hz，2H)，2.05-2.11(m，2H)，1.12(d，J＝6.2Hz，6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ154.7，154.6，152.7，151.3，145.9，136.1，135.8，131.7，129.2，127.2，126.2，119.9，119.5，119.4，49.3，43.0，41.3，28.9，21.6；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C20H24ClN8S的计算值443.1533；实验值443.1536。
8-((3-氯-5-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺 (73，HJP-VI-47).产率，10.8mg(79％)。1H NMR(600MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ8.27(s， 1H)，7.67(s，1H)，7.58(s，1H)，7.53-7.55(m，1H)，7.31(s，1H)，6.39(s，1H)，4.33(t，J＝6.7 Hz，2H)，3.27-3.32(m，1H)，3.02(t，J＝7.3Hz，2H)，2.30-2.33(m，2H)，1.33(d，J＝6.5Hz， 6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ150.5，150.4，150.1，144.7，140.9，138.9，136.0，133.9，133.4，132.2，130.4，129.1，118.9，107.1，50.8，41.9，41.3，37.5，26.1，18.9； HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C21H26ClN8S的计算值457.1690；实验值457.1685。
8-((3-氯-5-(噁唑-2-基)苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(74， HJP-VI-49).产率，7.6mg(57％)。1H NMR(600MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ8.24(s，1H)，8.09(s，1H)，8.04(s，1H)，7.77(s，1H)，7.55(s，1H)，7.30(s，1H)，4.39(t，J＝6.6Hz，2H)，3.01-3.06(m，1H)，3.74(t，J＝6.7Hz，2H)，2.18-2.24(m，2H)，1.25(d，J＝6.4Hz，6H)；13CNMR(150MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ159.5，154.7，152.7，151.4，145.4，139.8，136.1， 132.9，132.5，130.1，128.8，127.5，126.8，119.6，50.1，42.3，40.9，27.8，20.5；HRMS(ESI)m/z [M+H]+ C20H23ClN7OS的计算值444.1373；实验值444.1362。
8-((3-氯-5-(丙-1-炔-1-基)苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(75， HJP-VI-50).产率，4.8mg(40％)。1H NMR(600MHz，CD3OD)δ8.31(s，1H)，7.54(t，J＝1.8 Hz，1H)，7.47(t，J＝1.4Hz，1H)，7.42(t，J＝1.6Hz，1H)，4.43(t，J＝6.9Hz，2H)，3.30-3.34 (m，1H)，3.06(t，J＝6.9Hz，2H)，2.18-2.21(m，2H)，2.03(s，3H)，1.31(d，J＝6.5Hz，6H)；13C NMR(150MHz，CD3OD)δ153.6，152.2，149.7，148.8，136.4，134.2，132.9，132.8，132.0， 128.8，120.7，90.5，78.1，52.2，43.3，40.4，27.7，19.3，3.8；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C20H24ClN6S的计算值415.1472；实验值415.1474。
8-((3-氯-5-(3-甲基丁-1-炔-1-基)苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(76， HJP-VI-51).产率，9.2mg(70％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.33(s，1H)，7.30(t，J＝1.6 Hz，1H)，7.29(t，J＝1.4Hz，1H)，7.27(m，1H)，5.84(br s，2H)，4.30(t，J＝7.1Hz，2H)， 2.68-2.75(m，2H)，2.53(t，J＝6.8Hz，2H)，1.93-1.96(m，2H)，1.22(d，J＝6.9Hz，6H)，1.03 (d，J＝6.2Hz，6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ154.7，153.3，151.6，144.3，134.9，132.9， 131.3，131.2，129.1，126.9，120.2，98.8，77.6，48.7，43.8，41.8，30.2，22.8，22.7，21.1；HRMS (ESI)m/z[M+H]+ C22H28ClN6S的计算值443.1785；实验值443.1774。
8-((3-氯-5-(环丙基乙炔基)苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(77， HJP-VI-52).产率，8.4mg(64％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.34(s，1H)，7.25-7.27(m， 2H)，7.24(t，J＝1.4Hz，1H)，5.85(br s，2H)，4.29(t，J＝7.0Hz，2H)，2.68-2.72(m，2H)，2.53 (t，J＝6.8Hz，2H)，1.93-1.96(m，2H)，1.40-1.42(m，1H)，1.02(d，J＝6.2Hz，6H)，0.85-0.89 (m，2H)，0.78-0.81(m，2H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ154.6，153.2，151.5，144.1，134.8， 132.9，131.1，131.0，128.8，126.8，120.1，96.5，73.5，48.6，43.7，41.7，30.1，22.7，8.6；HRMS (ESI)m/z[M+H]+ C22H26ClN6S的计算值441.1628；实验值441.1628。
8-((3-氯-5-(3，3-二甲基丁-1-炔-1-基)苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6- 胺(78，HJP-VI-53).产率，9.1mg(67％)。1H NMR(600MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ8.26 (s，lH)，7.35-7.37(m，2H)，7.32(t，J＝1.7Hz，1H)，4.29(t，J＝6.9Hz，2H)，2.65-2.67(m，1H)， 2.54(t，J＝6.8Hz，2H)，1.96-1.99(m，2H)，1.29(s，9H)，1.06(d，J＝6.3Hz，6H)；13CNMR (150MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ154.6，152.9，151.4，145.3，135.1，132.6，131.9，131.6，130.3，127.3，119.6，101.8，76.8，48.8，43.3，41.5，30.7，29.6，28.0，22.3；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C23H30ClN6S的计算值457.1941；实验值457.1945。
3-(3-((6-氨基-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-8-基)硫基)-5-氯苯基)丙-2-炔-1-醇(79， HJP-VI-58).产率，4.5mg(35％)。1H NMR(600MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ8.26(s，1H)， 7.41(t，J＝1.8Hz，1H)，7.37-7.38(m，2H)，4.31(t，J＝6.9Hz，2H)，2.81-2.84(m，1H)，2.61(t，J＝6.8Hz，2H)，2.01-2.06(m，2H)，1.12(d，J＝6.3Hz，6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3+5 滴CD3OD)δ154.6，152.9，151.3，145.1，135.3，132.6，131.9，131.7，131.1，126.0，119.6，90.9， 82.3，50.8，49.2，43.0，41.4，29.0，21.7；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C20H24ClN6OS的计算值 431.1421；实验值431.1431。
4-(3-((6-氨基-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-8-基)硫基)-5-氯苯基)丁-3-炔-2-醇(80， HJP-VI-59).产率，5.6mg(42％)。1H NMR(600MHz，CD3OD)δ8.35(s，1H)，7.60(s，1H)， 7.52(s，1H)，7.48-7.49(m，1H)，4.64-4.68(m，1H)，4.43(t，J＝6.9Hz，2H)，3.30-3.31(m，1H)，3.07(t，J＝7.7Hz，2H)，2.19-2.21(m，2H)，1.46(d，J＝6.7Hz，3H)，1.31(d，J＝6.54Hz， 6H)；13C NMR(150MHz，CD3OD)δ153.7，152.2，149.8，148.6，136.5，134.2，133.2，132.9， 132.7，127.6，95.7，81.4，58.9，49.6，43.3，42.1，27.7，24.5，19.3；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C20H24ClN6OS的计算值431.1421；实验值431.1431。
8-((3-氯-5-(2-甲基丙-1-烯-1-基)苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(81， HJP-VI-62).产率，5.4mg(42％)。1H NMR(600MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ8.28(s，1H)， 7.38(s，1H)，7.28-7.31(m，2H)，6.18(s，1H)，4.38(t，J＝6.7Hz，2H)，3.27-3.29(m，1H)，2.98 (t，J＝7.02Hz，2H)，2.25-2.29(m，2H)，1.92(s，3H)，1.85(s，3H)，1.33(d，J＝6.5Hz，6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ151.4，150.8，149.9，146.9，142.3，139.5，135.2， 132.1，130.3，130.2，128.3，122.6，50.9，41.9，41.0，26.9，26.2，19.5，18.9；HRMS(ESI)m/z [M+H]+ C21H28ClN6S的计算值431.1785；实验值431.1794。
(E)-8-((3-氯-5-(丙-1-烯-1-基)苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(82， HJP-VI-63).产率，7.3mg(59％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.32(s，1H)，7.21(t，J＝1.6 Hz，1H)，7.19(t，J＝1.5Hz，1H)，7.18(t，J＝1.7Hz，1H)，6.22-6.25(m，2H)，6.17(br s，2H)， 4.64-4.68(m，1H)，4.29(t，J＝7.1Hz，2H)，2.67-2.71(m，1H)，2.52(t，J＝6.8Hz，2H)， 1.91-1.97(m，2H)，1.85(d，J＝4.9Hz，3H)，1.02(d，J＝6.2Hz，6H)；13C NMR(150MHz， CDCl3)δ154.8，153.2，151.6，144.5，140.8，135.3，132.9，129.2，128.8，127.9，125.9，125.5， 120.1，48.7，43.8，41.8，30.2，22.8，18.5；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C20H26ClN6S的计算值 417.1628；实验值417.1627。
(E)-8-((3-氯-5-(2-环丙基乙烯基)苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺 (83，HJP-VI-64).产率，8.2mg(62％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.25(s，1H)，7.28-7.29 (m，1H)，7.25-7.26(m，1H)，7.21(t，J＝1.7Hz，1H)，6.35(d，J＝15.7Hz，1H)，5.72-5.78(m， 1H)，4.28(t，J＝7.0Hz，2H)，2.68-2.72(m，1H)，2.52(t，J＝6.9Hz，2H)，1.95-1.98(m，2H)， 1.54-1.57(m，1H)，1.22(s，1H)，1.05(d，J＝6.3Hz，6H)，0.84-0.88(m，2H)，0.52-0.55(m， 2H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ154.5，152.8，151.4，145.9，141.1，135.8，135.5，131.5， 128.9，127.2，125.9，124.8，119.5，48.7，43.4，41.5，29.7，24.6，22.4，14.8，7.67；HRMS(ESI) m/z[M+H]+ C22H28ClN6S的计算值443.1785；实验值443.1775。
8-((3-氯-5-(3，3，3-三氟丙-1-烯-2-基)苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺 (84，HJP-VI-70).产率，8.8mg(61％)。1H NMR(600MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ8.23(s， 1H)，7.52-7.53(m，1H)，7.50(s，1H)，7.47(s，1H)，6.08(s，1H)，5.90(s，1H)，4.40(t，J＝6.7 Hz，2H)，3.18-3.23(m，1H)，2.86(t，J＝6.8Hz，2H)，2.25-2.31(m，2H)，1.35(d，J＝6.5Hz， 6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ154.8，152.7，151.3，145.9，136.7(q，JC-F＝30.9Hz)，136.6，135.9，132.1，131.6，129.2，128.4，122.8(q，JC-F＝272.2Hz)，123.1(q，JC-F＝ 5.5Hz)，119.5，50.9，41.9，40.6，26.9，19.5；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C20H23F3ClN6S的计算值471.1346；实验值471.1338。
(E)-8-((3-氯-5-(3，3-二甲基丁-1-烯-1-基)苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤 -6-胺(85，HJP-VI-72).产率，9.2mg(67％)。1H NMR(600MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ8.22 (s，1H)，7.37-7.39(m，2H)，7.29-7.33(m，1H)，6.32(d，J＝16.1Hz，1H)，6.21(d，J＝16.1Hz， 1H)，4.37(t，J＝6.3Hz，2H)，3.11-3.14(m，1H)，2.79(t，J＝6.4Hz，2H)，2.21-2.25(m，2H)， 1.31(d，J＝6.2Hz，6H)，1.11(s，9H)；13C NMR(150MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ154.7，152.5，151.3，146.5，145.4，141.6，135.6，130.7，129.8，126.8，122.4，119.4，50.5，42.1，40.7， 33.7，29.33，27.2，19.9；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C23H32ClN6S的计算值459.2098；实验值 459.2083。
(Z)-8-((3-氯-5-(丙-1-烯-1-基)苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(86， HJP-VI-78).产率，5.3mg(43％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.32(s，1H)，7.18-7.26(m， 3H)，6.25-6.31(m，1H)，5.83-5.89(m，1H)，5.79(br s，2H)，4.33(t，J＝6.8Hz，2H)，2.74-2.78 (m，1H)，2.57(t，J＝6.7Hz，2H)，1.97-2.04(m，2H)，1.82(dd，J＝7.2和1.7Hz，3H)，1.08(d， J＝6.3Hz，6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ154.6，153.1，151.6，145.0，140.4，134.9，132.4，129.7，128.9，128.7，127.9，127.6，120.1，49.0，43.5，41.5，29.7，22.4，18.5；HRMS(ESI) m/z[M+H]+ C20H26ClN6S的计算值417.1628；实验值417.1634。
(E)-8-((3-(丁-2-烯-2-基)-5-氯苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(87， HJP-VI-79).产率，9.4mg(73％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.33(s，1H)，7.29-7.30(m， 1H)，7.26-7.27(m，1H)，7.21-7.22(m，1H)，5.84-5.89(m，1H)，5.82(br s，2H)，4.30(t，J＝7.0 Hz，2H)，2.68-2.73(m，1H)，2.54(t，J＝6.8Hz，2H)，1.93-1.98(m，5H)，1.77(d，J＝6.8Hz， 3H)，1.02(d，J＝6.2Hz，6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ154.6，153.1，151.6，145.9，135.0， 133.5，132.3，128.0，126.1，125.8，125.2，120.1，48.8，43.7，41.7，30.1，22.8，15.3，14.4；HRMS (ESI)m/z[M+H]+ C21H28ClN6S的计算值431.1785；实验值431.1782。
6.2.15式91-95的化合物的合成(方案15)
方案15：
Figure GDA0002463350460002671
8-((4-氯-2-硝基苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(89).将8-巯基腺嘌呤(3.6mmol)、新亚铜试剂水合物(0.36mmol)、CuI(0.36mmol)、NaO-t-Bu(7.2mmol)、4-氯-1-碘-2-硝基苯(10.8 mmol)和无水DMF(24mL)置于经氮冲洗的圆底烧瓶中。将烧瓶用铁氟龙带密封，于110℃下加热，并在氮下磁力搅拌18h。在减压下移除溶剂并对所得残余物进行色谱 (CH2Cl2∶MeOH∶AcOH，20∶1∶0.5)。以黄色固体形式以85％产率获得。MS(ESI)：m/z 332.8 [M+H]+。
9-(3-溴丙基)-8-((4-氯-2-硝基苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(90).将8-芳基硫基腺嘌呤(89， 1.21mmol)溶解于DMF(15mL)中并添加Cs2CO3(1.45mmol)和1，3-二溴丙烷(2.42mmol) 并将混合物在氮下搅拌2-4h。在减压下移除溶剂并对所得残余物进行色谱(CH2Cl2∶MeOH∶AcOH，20∶1∶0.5)，从而获得所需化合物90。以固体形式以35％产率获得。 MS(ESI)：m/z 442.9[M+H]+。
8-((4-氯-2-硝基苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(91，HJP-VI-32).在氮保护下将90(600mg，1.357mmol)和胺(67.9mmol，50当量)于DMF(8mL)中的混合物于室温下搅拌20hr。在移除溶剂后，通过管柱色谱(CH2Cl2∶CH3OH-NH3(7N)，100∶1到 20∶1)纯化粗制材料，从而获得所需产物91。产率，510mg(85％)。1H NMR(600MHz，CDCl3 +5滴CD3OD)δ8.35(s，1H)，8.30(d，J＝2.2Hz，1H)，7.43(dd，J＝8.7和2.2Hz，1H)，6.81 (d，J＝8.7Hz，1H)，4.29(t，J＝6.9Hz，2H)，2.67-2.73(m，1H)，2.52(t，J＝6.8Hz，2H)， 1.93-1.98(m，2H)，1.03(d，J＝6.3Hz，6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ 154.3，153.9，151.3，145.8，142.0，134.5，133.3，131.9，129.7，126.2，120.4，48.7，43.3，41.9，30.1，22.3；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C17H21ClN7OS的计算值422.1166；实验值422.1170。
8-((2-氨基-4-氯苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(92，HJP-VI-34).将 91(510mg，1.21mmol)和铁粉(250mg)于乙酸(6mL)中的混合物于室温下搅拌4hr。在完成后，通过于0℃下添加固体Na2CO3中和反应物并用EtOAc(75ml×3)洗涤。在经MgSO4干燥并移除溶剂后，通过管柱色谱(CH2Cl2∶CH3OH-NH3(7N)，50∶1到15∶1)纯化粗制材料，从而获得所需产物92。产率，426.3mg(90％)。1H NMR(600MHz，CDCl3+5滴CD3OD) δ8.16(s，1H)，7.39(d，J＝8.3Hz，1H)，6.84(d，J＝2.2Hz，1H)，6.73(dd，J＝8.3和2.2Hz， 1H)，4.36(t，J＝6.7Hz，2H)，3.40-3.41(m，1H)，2.83(t，J＝6.8Hz，2H)，2.26-2.32(m，2H)， 1.34(d，J＝6.5Hz，6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ154.2，151.9，151.4， 150.5，147.3，138.3，138.1，118.9，115.7，107.0，74.4，50.6，42.1，40.4，31.1，19.8；HRMS(ESI) m/z[M+H]+ C17H23ClN7S的计算值392.1424；实验值392.1419。
8-((4-氯-2-碘苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(93，HJP-VI-36).将92 (426mg，1.09mmol)、NaNO2(1.2当量)和碘化钾(2当量)于乙酸(5mL)中的混合物于室温下搅拌4hr。在完成后，通过于0℃下添加固体Na2CO3中和反应物并用EtOAc(75ml×3) 洗涤。在经MgSO4干燥并移除溶剂后，通过管柱色谱(CH2Cl2∶CH3OH-NH3(7N)，80∶1到 20∶1)纯化粗制材料，从而获得所需产物93。产率，436.4mg(79％)。1H NMR(600MHz， CDCl3+5滴CD3OD)δ8.35(s，1H)，7.87(d，J＝2.2Hz，1H)，7.23(dd，J＝8.5和2.2Hz，1H)， 7.07(d，J＝2.2Hz，1H)，5.87(br s，2H)，4.30(t，J＝6.9Hz，2H)，2.68-2.72(m，1H)，2.56(t，J ＝6.8Hz，2H)，1.95-1.99(m，2H)，1.03(d，J＝6.2Hz，6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3+5 滴CD3OD)δ154.7，153.3，151.6，144.8，139.3，135.9，134.1，131.1，129.5，120.4，99.8，48.7， 43.8，41.9，30.3，22.9；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C17H21IClN6S的计算值503.0282；实验值 503.0277。
一般条件.方法A：向配备有磁力搅拌棒和橡胶隔片的10mL RBF中的HJP-VI-36(93， 15mg，0.0298mmol，1当量)和NaHCO3(3当量)中添加
Figure GDA0002463350460002681
酸或频哪醇酯(1.5-3当量)。添加DMF(0.5mL)并排空反应混合物并回填氮。将此重复四次，随后使氮鼓泡通过反应混合物达10min。随后添加H2O(0.1mL)和PdCl2(PPh3)2(10-20mol％)并将反应混合物在氮下于90℃下加热2-24h。在减压下移除溶剂并通过制备型TLC纯化所得残余物，从而得到化合物HJP-VI-42(94)和HJP-VI-43(95)。
8-((4-氯-2-(1H-吡咯-2-基)苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(94， HJP-VI-42).产率，2.3mg(24％)。1H NMR(600MHz，CD3OD)δ8.29(s，1H)，7.57(d，J＝2.3Hz，1H)，7.53(d，J＝8.5Hz，1H)，7.31(dd，J＝8.4和2.3Hz，1H)，6.85-6.88(m，1H)，6.42-6.44(m，1H)，6.13-6.16(m，1H)，4.29(t，J＝6.9Hz，2H)，3.28-3.32(m，1H)，2.99(t，J ＝6.2Hz，2H)，2.10-2.16(m，2H)，1.29(d，J＝6.5Hz，6H)；13C NMR(150MHz，CD3OD)δ 152.8，152.0，150.9，148.7，139.9，137.5，136.9，129.2，128.5，126.2，121.3，121.2，120.4，111.7，110.0，49.6，43.3，41.9，27.6，19.3；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C21H25ClN7S的计算值442.1581；实验值442.1573。
8-((4-氯-2-(1H-吡唑-5-基)苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(95， HJP-VI-43).产率，10.4mg(28％)。1H NMR(600MHz，CD3OD)δ8.28(s，1H)，7.97(s，1H)，7.69(d，J＝2.2Hz，1H)，7.68(d，J＝2.2Hz，1H)，7.46(d，J＝8.5Hz，1H)，7.41(dd，J＝8.5和2.3Hz，1H)，4.28(t，J＝7.0Hz，2H)，3.27-3.31(m，1H)，2.99(t，J＝8.0Hz，2H)， 2.05-2.11(m，2H)，1.29(d，J＝6.6Hz，6H)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C20H24ClN8S的计算值443.1533；实验值443.1520。
6.2.16式100-102的化合物的合成(方案16)
方案16：
Figure GDA0002463350460002691
8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-2，6-二胺(97).将2，6-二氨基-9H-嘌呤-8-硫醇(3.6 mmol)、新亚铜试剂水合物(0.36mmol)、CuI(0.36mmol)、NaO-t-Bu(7.2mmol)、1，3-二氯-5-碘苯(10.8mmol)和无水DMF(24mL)置于经氮冲洗的圆底烧瓶中。将烧瓶用铁氟龙带密封，于110℃下加热，并在氮下磁力搅拌20h。在减压下移除溶剂并对所得残余物进行色谱(CH2Cl2∶MeOH∶AcOH，20∶1∶0.5)。以浅黄色固体形式以65％产率获得。MS(ESI)： m/z 326.9[M+H]+。
8-((3，5-二氯苯基)硫基)-2-氟-9H-嘌呤-6-胺(98).向97(350mg，1.073mmol)于HF/吡啶 (1.5mL)中的冷却溶液(0℃)中缓慢添加NaNO2(126.2mg，1.73mmol)。将所得混合物于室温下搅拌1h且随后通过与CH2Cl2(7.5mL)中的14mg CaCO3一起搅拌1h骤冷。将粗制材料吸收于CH2Cl2中，用水洗涤并经无水Na2SO4干燥。在移除溶剂后，在制备型硅胶板上纯化残余物(CHCl3∶己烷∶EtOAc∶i-PrOH，2∶2∶1∶0.1)，从而获得98(180mg，47％产率)。 MS(ESI)：m/z 329.80[M+H]+。
9-(3-溴丙基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-2-氟-9H-嘌呤-6-胺(99).将8-芳基硫基腺嘌呤(98， 0.549mmol)溶解于DMF(15mL)中并添加Cs2CO3(0.659mmol)和1，3-二溴丙烷(1.3752 mmol)并将混合物在氮下搅拌2h。在减压下移除溶剂并对所得残余物进行色谱(CH2Cl2∶MeOH∶AcOH，40∶1∶0.5-20∶1∶0.5)，从而获得所需化合物99。以固体形式以25％产率获得。1H NMR(500MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ7.28-7.34(m，3H)，4.31(t，J＝7.1Hz， 2H)，3.40(t，J＝6.1Hz，2H)，2.29-2.36(m，2H)；MS(ESI)：m/z 449.9[M+H]+。
100-102的一般合成程序
在氮保护下将99(12mg，0.0267mmol)和胺(1.336mmol，50当量)于DMF(1mL)中的混合物于室温下搅拌16-24hr。在移除溶剂后，通过制备型TLC(CH2Cl2∶CH3OH-NH3 (7N)，20∶1或15∶1)纯化粗制材料，从而获得所需产物100-102。
8-((3，5-二氯苯基)硫基)-2-氟-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(100，HJP-VI-69). 产率，9.3mg(81.6％)。1H NMR(600MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ7.30-7.36(m，3H)，4.23 (t，J＝6.9Hz，2H)，2.71-2.76(m，1H)，2.54(t，J＝6.8Hz，2H)，1.94-1.99(m，2H)，1.06(d，J＝6.2Hz，6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ159.2(d，JC-F＝211.2Hz)，156.4(d，JC-F＝20Hz)，152.7(d，JC-F＝18.9Hz)，143.9(d，JC-F＝2.5Hz)，136.1，133.7，128.9，128.8，117.9(d，JC-F＝3.5Hz)，48.9，43.4，41.8，29.7，22.3；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C17H20Cl2FN6S的计算值429.0831；实验值429.0834。
8-((3，5-二氯苯基)硫基)-2-氟-9-(3-(新戊基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(101，HJP-VI-85). 产率，10.2mg(84％)。1H NMR(600MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ7.35(t，J＝1.7Hz，1H)， 7.30-7.32(m，2H)，4.25(t，J＝7.0Hz，2H)，2.60(t，J＝6.8Hz，2H)，2.31(s，2H)，1.96-2.01(m， 2H)，0.93(s，9H)；13C NMR(150MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ159.3(d，JC-F＝211.1Hz)，156.4(d，JC-F＝20.1Hz)，152.8(d，JC-F＝19.1Hz)，144.1(d，JC-F＝2.4Hz)，136.1，133.8，128.9，128.8，117.9(d，JC-F＝3.5Hz)，61.9，47.1，42.0，31.3，29.2，27.8；HRMS(ESI)m/z [M+H]+ C19H24Cl2FN6S的计算值457.1144；实验值457.1152。
9-(3-(叔丁基氨基)丙基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-2-氟-9H-嘌呤-6-胺(102，HJP-VI-86). 产率，9.6mg(80％)。1H NMR(600MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ7.36(t，J＝1.7Hz，1H)， 7.32-7.34(m，2H)，4.28(t，J＝6.8Hz，2H)，2.66(t，J＝6.8Hz，2H)，2.09-2.12(m，2H)，1.21(s， 9H)；13C NMR(150MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ159.1(d，JC-F＝211.5Hz)，156.4(d，JC-F＝20.1Hz)，152.7(d，JC-F＝18.8Hz)，144.3(d，JC-F＝2.3Hz)，136.1，133.3，129.1，129.0，117.9(d，JC-F＝3.5Hz)，53.3，41.6，38.5，28.9，27.4；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C18H22Cl2FN6S的计算值443.0988；实验值443.1007。
6.2.18式106的化合物的合成(方案18)
方案18：
Figure GDA0002463350460002711
104a-c的一般合成程序.
向4-氨基-1-(4-甲氧基苄基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-2-硫醇(103)(50mg，0.174mmol) 中添加相应碘(0.348mmol)、新亚铜试剂水合物(3.6mg，0.0174mmol)、CuI(3.3mg，0.0174 mmol)、叔丁醇钠(25mg，0.261mmol)并且最后添加DMF(5mL)并将反应混合物于110℃下搅拌24小时。随后，在减压下移除溶剂并通过制备型TLC(CH2Cl2∶MeOH-NH3(7N)， 10∶1)纯化粗产物，从而获得所需化合物104a-c。
2-((3，5-二氯苯基)硫基)-1-(4-甲氧基苄基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-4-胺(104a).以浅黄色固体形式以39％产率获得。LCMS实验值m/z 430.97[M+H]+。
1-(4-甲氧基苄基)-2-(萘-1-基硫基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-4-胺(104b).以白色固体形式以38％产率获得。1H NMR(500MHz，CDCl3)：δ8.33(d，J＝8.1Hz，1H)，7.83(m，1H)，7.78(d，J＝5.8Hz，1H)，7.75(d，J＝8.2Hz，1H)，7.51-7.55(m，2H)，7.44(d，J＝7.2Hz，1H)，7.33(m，1H)，6.88(d，J＝8.6Hz，2H)，6.68(d，J＝8.6Hz，2H)，6.55(d，J＝5.9Hz，1H)，5.25(s，2H)，5.23(br s，2H)，3.73(s，3H)。LCMS实验值m/z 413.08[M+H]+。
2-((2，4-二氯苯基)硫基)-1-(4-甲氧基苄基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-4-胺(104c).以淡黄色固体形式以40％产率获得。1H NMR(500MHz，CDCl3)：δ7.78(d，J＝5.9Hz，1H)，7.36(d， J＝2.1Hz，1H)，7.02(dd，J＝8.5，2.1Hz，1H)，6.98(d，J＝8.6Hz，2H)，6.91(d，J＝8.6Hz， 1H)，6.73(d，J＝8.6Hz，2H)，6.65(d，J＝6.0Hz，1H)，5.30(s，2H)，3.75(s，3H)。LCMS实验值m/z 430.86[M+H]+。
化合物(103)可如美国专利第8,017,780号和国际专利公开案第WO2008115262号中所述来制备。
105a-c的一般合成程序.
向偶合产物(104a-c)(0.067mmol)中添加三氟乙酸(3mL)并将反应混合物于80℃下搅拌3小时。随后，在减压下移除溶剂并通过制备型TLC(CH2Cl2∶MeOH-NH3(7N)，15∶1) 纯化粗产物，从而获得去保护的化合物105a-c。
2-((3，5-二氯苯基)硫基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-4-胺(105a).以黄色固体形式以71％产率获得。1H NMR(500MHz，CD3OD)：δ7.47(d，J＝6.7Hz，1H)，7.41-7.43(m，3H)，6.96(d， J＝6.7Hz，1H)。LCMS实验值m/z 310.84[M+H]+。
2-(萘-1-基硫基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-4-胺(105b).以黄色固体形式以66％产率获得。 LCMS实验值m/z 292.95[M+H]+。
2-((2，4-二氯苯基)硫基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-4-胺(105c).以黄色固体形式以92％产率获得。1H NMR(500MHz，CDCl3∶CD3OD 1∶1)：δ7.46-7.48(m，2H)，7.30(d，J＝8.5Hz， 1H)，7.02(dd，J＝8.5，2.2Hz，1H)，6.85(d，J＝6.4Hz，1H)。MS m/z 310.8(M+H)++。
2-((3，5-二氯苯基)硫基)-1-(3-(异丙基氨基)丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-4-胺(106a).向于无水DMF(1.5mL)中的2-((3，5-二氯苯基)硫基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-4-胺(105a)(14.9 mg，0.0477mmol)中添加Cs2CO3(18.6mg，0.0572mmol)并且最后添加1，3-二溴丙烷(24μL， 0.0238mmol)并将反应混合物于rt下搅拌2h。在减压下移除溶剂并通过制备型TLC (CH2Cl2∶MeOH-NH3(7N)，20∶1)纯化粗产物，从而获得7.6mg(37％)1-(3-溴丙基)-2-((3，5- 二氯苯基)硫基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-4-胺。LCMS实验值m/z 433.01[M+H]+。向于无水 DMF中的1-(3-溴丙基)-2-((3，5-二氯苯基)硫基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-4-胺(7.6mg，0.0175 mmol)中添加异丙胺(30μL，0.35mmol)并将反应混合物于rt下搅拌24小时。随后，在减压下移除溶剂并通过制备型TLC(CH2Cl2∶MeOH-NH3(7N)，15∶1)纯化粗产物，从而获得 5.7mg(79％)SO-III-154A(106)。1H NMR(500MHz，CDCl3)：δ7.88(d，J＝5.9Hz，1H)，7.21-7.25(m，3H)，6.75(d，J＝5.9Hz，1H)，5.26(br s，2H)，4.26(t，J＝7.1Hz，2H)，2.71(m，1H)，2.56(t，J＝6.8Hz，2H)，1.88(m，2H)，1.02(d，J＝6.2Hz，3H)。13C NMR(150MHz， CDCl3)：δ151.3，142.7，141.7，140.8，135.9，135.7，127.8，127.5，127.0，97.6，48.8，44.0，43.3，30.5，22.8.HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C18H22N5SCl2的计算值410.0973；实验值410.0978。
1-(3-(异丙基氨基)丙基)-2-(萘-1-基硫基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-4-胺(106b).向于无水 DMF(1.5mL)中的2-(萘-1-基硫基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-4-胺(105b)(12.6mg，0.043 mmol)中添加Cs2CO3(16.8mg，0.0517mmol)并且最后添加1，3-二溴丙烷(17.4μL，0.172 mmol)并将反应混合物于rt下搅拌一个半小时。在减压下移除溶剂并通过制备型TLC (CH2Cl2∶MeOH-NH3(7N)，15∶1)纯化粗产物，从而获得9.8mg(55％)1-(3-溴丙基)-2-(萘-1- 基硫基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-4-胺。LCMS实验值m/z 412.95[M+H]+。向于无水DMF 中的1-(3-溴丙基)-2-(萘-1-基硫基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-4-胺(9.8mg，0.0237mmol)中添加异丙胺(50.9μL，0.592mmol)并将反应混合物于rt下搅拌24小时。然后，在减压下移除溶剂并通过制备型TLC(CH2Cl2∶MeOH-NH3(7N)，15∶1)纯化粗产物，从而获得5.6mg (60％)SO-IV-03A(106b)。1H NMR(600MHz，CDCl3)：δ8.40(d，J＝8.4Hz，1H)，7.88(d，J＝8.1Hz，1H)，7.82(m，2H)，7.55-7.62(m，2H)，7.48(d，J＝7.3Hz，1H)，7.38(t，J＝7.7Hz，1H)，6.69(d，J＝5.9Hz，1H)，5.21(br s，2H)，4.18(t，J＝7.3Hz，2H)，2.62(m，1H)，2.42(t，J＝6.9Hz，2H)，1.71-1.75(m，2H)，0.96(d，J＝6.2Hz，6H)。13C NMR(150MHz，CDCl3)：δ151.0，145.3，141.2，141.0，134.1，132.4，129.9，129.1，128.9，128.7，127.3，127.2，126.7，125.9， 124.5，97.6，48.7，44.0，43.3，30.3，22.9。LCMS实验值m/z 392.13[M+H]+。
2-((2，4-二氯苯基)硫基)-1-(3-(异丙基氨基)丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-4-胺(106c).向于无水DMF(2mL)中的2-((2，4-二氯苯基)硫基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-4-胺(105c)(20mg， 0.064mmol)中添加Cs2CO3(25.2mg，0.0768mmol)并且最后添加1，3-二溴丙烷(32.7μL， 0.323mmol)并将反应混合物于rt下搅拌2h。随后再添加一份Cs2CO3(40mg，0.122mmol) 和1，3-二溴丙烷(20μL)并将反应混合物再搅拌1小时。在减压下移除溶剂并通过制备型 TLC(CH2Cl2∶MeOH-NH3(7N)，20∶1，2×)纯化粗产物，从而获得11.6mg(42％)1-(3-溴丙基)-2-((2，4-二氯苯基)硫基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-4-胺。LCMS实验值m/z 432.81[M+H]+。向于无水DMF中的1-(3-溴丙基)-2-((2，4-二氯苯基)硫基)-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-4-胺(11.6 mg，0.0268mmol)中添加异丙胺(110μL，1.34mmol)并将反应混合物于rt下搅拌24小时。随后，在减压下移除溶剂并通过制备型TLC(CH2Cl2∶MeOH-NH3(7N)，20∶1)纯化粗产物，从而获得8.3mg(75％)HJP-VI-101(106c)。1H NMR(500MHz，CDCl3)：δ7.86(d，J＝5.9Hz，1H)，7.43(d，J＝2.2Hz，1H)，7.13(dd，J＝8.5，2.2Hz，1H)，7.02(d，J＝8.6Hz，1H)，6.75(d，J＝5.9Hz，1H)，5.29(br s，2H)，4.25(t，J＝7.1Hz，2H)，2.71(m，1H)，2.56(t，J＝6.8Hz，2H)，1.88(m，2H)，1.02(d，J＝6.3Hz，6H)。LCMS实验值m/z 410.08[M+H]+。
6.2.19式110-111的化合物的合成(方案19)
方案19：
Figure GDA0002463350460002741
108a和108b的的一般合成程序.
将8-巯基腺嘌呤(3.6mmol)、新亚铜试剂水合物(0.36mmol)、CuI(0.36mmol)、NaO-t-Bu(7.2mmol)、相应芳基碘(10.8mmol)和无水DMF(24mL)置于经氮冲洗的圆底烧瓶中。将烧瓶用铁氟龙带密封，于110℃下加热，并在氮下磁力搅拌24h。在减压下移除溶剂并对所得残余物进行色谱(CH2Cl2∶MeOH∶AcOH，20∶1∶0.5)。
8-((4-氯-2-氟苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(108a).以浅黄色固体形式以49％产率获得。 MS(ESI)：m/z 296.1[M+H]+。
8-((2-氯-4-氟苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(108b).以浅黄色固体形式以49％产率获得。 MS(ESI)：m/z 296.1[M+H]+。
N9烷基化8-芳基硫基衍生物109a和109b的一般合成程序.
将8-芳基硫基腺嘌呤(108a或108b，1.21mmol)溶解于DMF(15mL)中并添加Cs2CO3(1.45mmol)和1，3-二溴丙烷(2.42mmol)并将混合物在氮下搅拌2-4h。在减压下移除溶剂并对所得残余物进行色谱(CH2Cl2∶MeOH∶AcOH，20∶1∶0.5)，从而获得所需化合物109a和 109b。
9-(3-溴丙基)-8-((4-氯-2-氟苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(109a).以固体形式以35％产率获得。MS(ESI)：m/z 415.9[M+H]+。
9-(3-溴丙基)-8-((2-氯-4-氟苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(109b).以固体形式以29％产率获得。MS(ESI)：m/z 415.9[M+H]+。
110和111的一般合成程序
在氮保护下将109a或109b(12mg，0.028mmol)和胺(1.40mmol，50当量)于DMF(1mL)中的混合物于室温下搅拌16-24hr。在移除溶剂后，通过制备型TLC (CH2Cl2∶CH3OH-NH3(7N)，20∶1或15∶1)纯化粗制材料，从而获得所需产物110-111。
8-((4-氯-2-氟苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(110，HJP-VI-23).产率15％。1H NMR(600MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ8.23(s，1H)，7.62(t，J＝7.9Hz，1H)，7.27-7.32(m，2H)，4.42(t，J＝6.7Hz，2H)，3.26-3.29(m，1H)，3.00(t，J＝7.4Hz，2H)，2.31-2.37(m，2H)，1.35(d，J＝6.5Hz，6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3+5滴CD3OD)δ 162.9，161.2，150.6，150.5，149.5，145.6，138.8(d，JC-F＝9.8Hz)，137.3，126.1(d，JC-F＝3.5 Hz)，117.8(d，JC-F＝25.5Hz)，112.4(d，JC-F＝18.3Hz)，50.8，41.8，41.1，26.1，19.0；HRMS (ESI)m/z[M+H]+ C17H21ClFN6S的计算值395.1221；实验值395.1216。
8-((2-氯-4-氟苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(111，HJP-VI-25).产率16％。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.31(s，1H)，7.34(dd，J＝8.8和5.8Hz，1H)，7.23(dd， J＝8.2和2.7Hz，1H)，6.95(dt，J＝7.9和2.7Hz，1H)，6.24(br s，2H)，4.32(t，J＝7.0Hz，2H)， 2.68-2.72(m，1H)，2.56(t，J＝6.9Hz，2H)，1.95-1.99(m，2H)，1.02(d，J＝6.2Hz，6H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ163.3，161.6，154.7，153.0，151.6，144.7，136.4(d，JC-F＝10.4Hz)， 134.2(d，JC-F＝8.8Hz)，125.7(d，JC-F＝3.8Hz)，120.1，118.1(d，JC-F＝25.1Hz)，115.3(d， JC-F＝21.7Hz)，48.7，43.7，41.7，30.3，22.9；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C17H21ClFN6S的计算值395.1221；实验值395.1222。
6.3 PU-H71型荧光标记探针的合成
方案20：
Figure GDA0002463350460002751
2-(4-(6-氨基-8-((6-碘苯并[d][1，3]间二氧环戊烯-5-基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)丁基)异吲哚啉-1，3-二酮(113b).将200mg(0.484mmol)112溶解于DMF(8mL)中。添加466mg(1.43 mmol)Cs2CO3和683mg(2.42mmol)N-(4-溴丁基)酞酰亚胺并将混合物超声波处理30 min。添加31.5mg(0.097mmol)Cs2CO3并将混合物再次超声波处理30min。将此再重复两次，总反应时间2h。移除DMF并通过制备型TLC(CH2Cl2∶MeOH∶AcOH，15∶1∶0.5) 纯化所得残余物，从而产生134mg(45％)113b。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.18(s，1H)，7.84(dd，J＝5.5，3.1Hz，2H)，7.72(dd，J＝5.5，3.1Hz，2H)，7.22(s，1H)，6.89(s，1H)，6.76 (br s，2H)，5.99(s，2H)，4.23(t，J＝7.1Hz，2H)，3.69(t，J＝7.0Hz，2H)，1.67-1.83(m，4H)； MS(ESI)m/z615.2[M+H]+。
9-(4-氨基丁基)-8-((6-碘苯并[d][1，3]间二氧环戊烯-5-基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(114b). 向113b(38.9mg，0.063mmol)于2mL MeOH/CH2Cl2(7∶1mL)中的悬浮液中添加肼水合物 (46μL，0.950mmol)并将混合物于rt下搅拌12h。在减压下移除溶剂并通过制备型TLC(CH2Cl2∶MeOH-NH3(7N)，10∶1)纯化所得残余物，从而产生18mg(59％)114b。1H NMR(500MHz，CDCl3/MeOH-d4)δ8.22(s，1H)，7.38(s，1H)，7.04(s，1H)，6.05(s，2H)，4.23(t，J ＝7.4Hz，2H)，2.78(t，J＝7.1Hz，2H)，1.82-1.91(m，2H)，1.55-1.63(m，2H)；MS(ESI)m/z485.0[M+H]+。
PU-C4-FITC(115b).将于DMF(0.2mL)中的114b(9.7mg，0.020mmol)、FITC(8.57mg，0.022mmol)和Et3N(0.1mL)在rt下搅拌3h。通过HPLC直接纯化反应混合物，从而产生5.2mg(30％)115b。1H NMR(600MHz，MeOH-d4)δ8.22(s，1H)，8.00(s，1H)，7.61 (d，J＝7.6Hz，1H)，7.37(s，1H)，7.19(s，1H)，7.06(d，J＝8.2Hz，1H)，6.58-6.67(m，4H)， 6.48(dd，J＝8.7，2.0Hz，2H)，5.97(s，2H)，4.30(t，J＝7.0Hz，2H)，3.58(br s，2H)，1.90-2.00 (m，2H)，1.61-1.70(m，2H)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C37H29IN7O7S2的计算值874.0615；实验值874.0610；HPLC Rt＝9.57(98％)。
2-(6-(6-氨基-8-((6-碘苯并[d][1，3]间二氧环戊烯-5-基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)己基)异吲哚啉-1，3-二酮(113c).将200mg(0.484mmol)112溶解于DMF(8mL)中。添加466mg(1.43 mmol)Cs2CO3和751mg(2.42mmol)N-(6-溴己基)酞酰亚胺并将混合物超声波处理2h。在减压下移除溶剂并通过制备型TLC(CH2Cl2∶MeOH∶AcOH，15∶1∶0.5)纯化所得残余物，从而产生100mg(32％)113c。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.26(s，1H)，7.83(dd，J＝5.4， 3.1Hz，2H)，7.70(dd，J＝5.4，3.0Hz，2H)，7.26(s，1H)，6.87(s，1H)，6.36(br s，2H)，5.96(s， 2H)，4.18(t，J＝7.5Hz，2H)，3.66(t，J＝7.2Hz，2H)，1.70-1.79(m，2H)，1.60-1.68(m，2H)，1.32-1.43(m，4H)；MS(ESI)m/z 643.2[M+H]+。
9-(6-氨基己基)-8-((6-碘苯并[d][1，3]间二氧环戊烯-5-基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(114c).向 113c(97mg，0.1511mmol)于4mL MeOH/CH2Cl2(7∶1mL)中的悬浮液中添加肼水合物 (110μL，2.27mmol)并将混合物于rt下搅拌12h。在减压下移除溶剂并通过制备型TLC(CH2Cl2∶MeOH-NH3(7N)，10∶1)纯化所得残余物，从而产生47mg(61％)114c。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.32(s，1H)，7.31(s，1H)，6.90(s，1H)，5.99(s，2H)，5.84(br s，2H)，4.20(t，J＝7.5Hz，2H)，2.67(t，J＝6.5Hz，2H)，1.72-1.84(m，2H)，1.31-1.45(m，6H)；MS(ESI)m/z 513.0[M+H]+。
PU-C6-FITC(115c).将于DMF(0.2mL)中的114c(9.7mg，0.01894mmol)、FITC(8.11mg，0.0208mmol)和Et3N(0.1mL)在rt下搅拌3h。通过HPLC直接纯化反应混合物，从而产生8.0mg(47％)115c。1H NMR(600MHz，MeOH-d4)δ8.23(s，1H)，8.09(s，1H)， 7.65(d，J＝7.9Hz，1H)，7.35(s，1H)，7.16(s，1H)，7.08(d，J＝8.3Hz，1H)，6.71(d，J＝8.8 Hz，2H)，6.67(d，J＝2.2Hz，2H)，6.53(dd，J＝8.8，2.2Hz，2H)，5.96(s，2H)，4.24(t，J＝7.1 Hz，2H)，3.50(br s，2H)，1.79-1.88(m，2H)，1.52-1.61(m，2H)，1.31-1.42(m，4H)；HRMS (ESI)m/z[M+H]+C39H33IN7O7S2的计算值902.0928；实验值902.0939；HPLC Rt＝10.02 (99％)。
2-(8-(6-氨基-8-((6-碘苯并[d][1，3]间二氧环戊烯-5-基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)辛基)异吲哚啉-1，3-二酮(113d).将200mg(0.484mmol)112溶解于DMF(8mL)中。添加466mg(1.43 mmol)Cs2CO3和819mg(2.42mmol)N-(8-溴辛基)酞酰亚胺并将混合物超声波处理1.5h。在减压下移除溶剂并通过制备型TLC(CH2Cl2∶MeOH∶AcOH，15∶1∶0.5)纯化所得残余物，从而产生120mg(34％)113d。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.29(s，1H)，7.84(dd，J＝5.5，3.1Hz，2H)，7.70(dd，J＝5.5，3.1Hz，2H)，7.28(s，1H)，6.87(s，1H)，6.29(br s，2H)，5.96(s， 2H)，4.18(t，J＝7.5Hz，2H)，3.67(t，J＝7.3Hz，2H)，1.62-1.77(m，4H)，1.25-1.36(m，8H)； MS(ESI)m/z 671.3[M+H]+。
9-(8-氨基辛基)-8-((6-碘苯并[d][1，3]间二氧环戊烯-5-基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(114d). 向113d(90.1mg，0.1345mmol)于4mL MeOH/CH2Cl2(7∶1mL)中的悬浮液中添加肼水合物(98μL，2.017mmol)并将混合物于rt下搅拌12h。在减压下移除溶剂并通过制备型TLC(CH2Cl2∶MeOH-NH3(7N)，10∶1)纯化所得残余物，从而产生25mg(34％)114d。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.33(s，1H)，7.31(s，1H)，6.90(s，1H)，5.99(s，2H)，5.72(br s，2H)，4.20(t，J＝7.5Hz，2H)，2.66(t，J＝7.1Hz，2H)，1.70-1.80(m，2H)，1.36-1.45(m，2H)，1.21-1.35(m，8H)；MS(ESI)m/z 541.1[M+H]+。
PU-C8-FITC(115d).将于DMF(0.2mL)中的114d(15.0mg，0.028mmol)、FITC(11.9mg，0.031mmol)和Et3N(0.1mL)在rt下搅拌4h。通过HPLC直接纯化反应混合物，从而产生16.9mg(66％)115d。1H NMR(600MHz，MeOH-d4)δ8.22(s，1H)，8.11(s，1H)，7.68(d， J＝7.8Hz，1H)，7.34(s，1H)，7.12(s，1H)，7.09(d，J＝8.2Hz，1H)，6.72(d，J＝8.7Hz，2H)， 6.67(d，J＝2.0Hz，2H)，6.53(dd，J＝8.7，2.0Hz，2H)，5.96(s，2H)，4.20(t，J＝7.1Hz，2H)， 3.50(br s，2H)，1.74-1.81(m，2H)，1.52-1.59(m，2H)，1.23-1.35(m，8H)；HRMS(ESI)m/z [M+H]+C41H37IN7O7S2的计算值930.1241；实验值930.1231；HPLC Rt＝10.60(96％)。
6.4.PU-WS13珠粒的合成
方案21：
Figure GDA0002463350460002781
9-(3-溴丙基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(116)：向15(0.4g，1.29mmol)于 20ml无水DMF中的溶液中添加0.65g(2.00mmol，1.55当量)Cs2CO3并使其于室温下搅拌15分钟。随后添加0.9g(4.47mmol，3.5当量)1，3-二溴丙烷并将反应混合物于室温下搅拌2hr。在减压下移除溶剂并通过管柱色谱(CH2Cl2∶CH3OH∶CH3COOH；20∶1∶0.1)纯化残余物，从而得到0.15g(27％)所需N-9异构体(116)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.36 (s，1H)，7.31(m，3H)，4.31(t，J＝7.1Hz，2H)，3.15(t，J＝6.7Hz，2H)，2.32(五重峰，J＝6.8 Hz，2H)；13C NMR(125MHz，CDCl3)154.7，153.6，151.6，143.7，135.9，134.3，128.6，128.3， 120.3，42.6，33.0，29.3.MS(ESI)m/z 432.1[M+H]+。
(6-((3-(6-氨基-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)丙基)氨基)己基)氨基甲酸叔丁基酯(117)：将于DMF(5mL)中的化合物116(0.15g，0.348mmol)和6-氨基己基氨基甲酸叔丁基酯(0.752g，3.48mmol)于rt下搅拌24h。浓缩反应混合物并通过制备型TLC[CH2Cl2/MeOH-NH3(7N)，20∶1]纯化残余物，从而产生81mg(41％)黄色固体状117。1H NMR(400MHz，CDCl3/MeOH-d4，δ)8.19(s，1H)，7.46(d，J＝1.7Hz，2H)，7.44(d，J＝1.6 Hz，1H)，4.31(t，J＝6.9Hz，2H)，3.05(m，2H)，2.56(t，J＝6.7Hz，2H)，2.51(t，J＝7.0Hz， 2H)，1.99(m，2H)，1.44(m，13H)，1.30(m，4H)；MS(ESI)：m/z 568.2[M+H]+。
N1-(3-(6-氨基-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)丙基)己烷-1，6-二胺(118)：将化合物117(81mg，0.143mmol)溶解于10mL CH2Cl2/TFA(4∶1)中并将溶液于室温下搅拌45 min。在减压下移除溶剂并通过制备型TLC[CH2Cl2/MeOH-NH3(7N)，20∶1-10∶1]纯化残余物，从而产生41mg(62％产率)白色固体状118。1H NMR(400MHz，CDCl3)，δ8.34(s， 1H)，7.32(m，3H)，6.04(bs，2H)，4.31(t，J＝7.0Hz，2H)，2.49-2.51(m，4H)，1.94-2.03(m， 2H)，1.31-1.44(m，12H)；MS(ESI)：m/z 468.3[M+H]+。
化合物-
Figure GDA0002463350460002791
10珠粒(119)：将118(41mg，0.087mmol)溶解于DMF(4mL)中并添加到固相肽合成容器中的10mL
Figure GDA0002463350460002792
10珠粒(预洗涤，3×20mL DMF)中。添加 75μL N，N-二异丙基乙胺和若干DMAP晶体并将其于室温下振荡2.5h。随后添加2-甲氧基乙胺(17.5mg，20μl，0.23mmol)并继续振荡30min。随后移除溶剂并用CH2Cl2/Et3N(9∶1， 4×20mL)、DMF(3×20mL)、Felts缓冲液(3×20mL)和i-PrOH(3×20mL)洗涤珠粒，每次10min。将珠粒119于-80℃下储存于i-PrOH中(珠粒/i-PrOH(1∶2)，v/v)。
6.5PU-WS13生物素类似物和荧光标记探针的合成
方案22：
Figure GDA0002463350460002793
2-(3-(6-氨基-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)丙基)异吲哚啉-1，3-二酮(120a)：向15(0.4g，1.29mmol)于20ml无水DMF中的溶液中添加0.65g(2.00mmol，1.55当量) Cs2CO3并使其于室温下搅拌15分钟。随后添加1.2g(4.47mmol，3.5当量)溴丙基酞酰胺并将反应混合物于室温下搅拌2hr。在减压下移除溶剂并通过管柱色谱 (CH2Cl2∶CH3OH∶CH3COOH；20∶1∶0.1)纯化残余物，从而得到0.15g(25％)所需N-9异构体(120a)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.16(s，1H)，7.82-7.86(m，2H)，7.71-7.75(m，2H)， 7.24(t，J＝1.65Hz，1H)，7.18(t，J＝1.6Hz，1H)，4.31(t，J＝7.5Hz，2H)，3.37(t，J＝6.7Hz， 2H)，2.21(五重峰，J＝6.8Hz，2H)；13C NMR(125MHz，CDCl3)176.1，168.1，155.1，152.2， 150.8，143.6，135.8，134.1，133.9，131.8，128.6，128.2，123.3，41.8，35.3，28.6。MS(ESI)m/z 498.95/501.13[M+H]+。
9-(3-氨基丙基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(121a)：向120a(0.15g，0.3 mmol)于14ml CH2Cl2+2ml CH3OH中的溶液中添加194μL(4.03mmol，15当量)肼水合物并使其于室温下搅拌12h。在减压下移除溶剂并通过管柱色谱(CH2Cl2∶CH3OH-NH3(7N)；20∶1)纯化残余物，从而得到65mg(66％)121a。1H NMR(500MHz，CDCl3+5滴 CD3OD)δ8.26(s，1H)，7.34-7.39(m，3H)，4.31(t，J＝6.9Hz，2H)，2.65(t，J＝6.6Hz，2H)， 1.93(五重峰，J＝6.8Hz，2H)；13C NMR(125MHz，CDCl3)154.6，152.9，151.2，144.3，135.9， 133.2，129.1，128.9，119.6，40.9，37.9，32.6。MS(ESI)m/z 369.14/371.22[M+H]+。
N-(3-(6-氨基-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)丙基)-1-(5-((3aS，4R，6aR)-2-氧代基六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)-3，6，9，12-四氧杂十五-15-酰胺(122a)：将于 DMF(1.5ml)中的121a(18mg，0.0487mmol)、
Figure GDA0002463350460002801
NHS-PEG4-生物素(31.6mg， 0.0536mmol)和DIEA(12.6mg，16.9μL 0.0974mmol)于rt下搅拌1h。在减压下浓缩反应混合物并通过制备型TLC(CH2Cl2-MeOH-NH3(7N)，10∶1)纯化所得残余物，从而产生30mg(73％)122a。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.30(s，1H)，7.51(t，J＝5.8Hz，1H)， 7.26-7.29(m，3H)，7.05(t，J＝4.9Hz，1H)，6.82(s，1H)，6.63(s，1H)，6.00(s，1H)，4.79-4.50 (m，1H)，4.29-4.32(m，1H)，4.28(t，J＝6.7Hz，2H)，3.77(t，J＝6.1Hz，2H)，3.59-3.65(m， 12H)，3.55(t，J＝5.0Hz，2H)，3.40-3.43(m，2H)，3.18(q，J＝6.1Hz，2H)，3.11-3.15(m，1H)，2.86-2.90(m，2H)，2.52(t，J＝6.0Hz，2H)，2.19(t，J＝7.4Hz，2H)，1.94(五重峰，J＝6.7Hz，2H)，1.69-1.76(m，2H)，1.58-1.67(m，2H)，1.38-1.44(m，2H)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C35H50Cl2N9O7S2的计算值842.2652；实验值842.2657；HPLC(方法A)Rt＝8.29。
N-(3-(6-氨基-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)丙基)-6-(6-(5-((3aS，4R，6aR)-2-氧代基六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)己酰胺基)己酰胺(123a)：将于DMF(0.5 ml)中的121a(5mg，0.0128mmol)、
Figure GDA0002463350460002802
NHS-LC_LC-生物素(10.2mg，0.018mmol) 和DIEA(4.21mg，5.7μL，0.0326mmol)于rt下搅拌1h。在减压下浓缩反应混合物并通过制备型TLC(CH2Cl2-MeOH-NH3(7N)，10∶1)纯化所得残余物，从而产生6.3mg(60％)所需化合物。1H NMR(500MHz，CDCl3+3滴CD3OD)δ8.26(s，1H)，7.38(t，J＝1.7Hz，1H)，7.35(d，J＝1.8Hz，2H)，4.48-4.52(m，1H)，4.29-4.33(m，1H)，4.26(t，J＝6.9Hz，2H)，3.09-3.15(m，8H)，2.24(t，J＝6.9Hz，2H)，2.10-2.20(m，8H)，1.94(五重峰，J＝6.3Hz，2H)，1.58-1.71(m，10H)，1.45-1.53(m，4H)，1.41-1.44(m，3H)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C36H51Cl2N10O4S2的计算值821.2913；实验值821.2941；HPLC(方法A)Rt＝9.92。
2-(6-(6-氨基-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)己基)异吲哚啉-1，3-二酮(120b)：向15(0.4g，1.29mmol)于20ml无水DMF中的溶液中添加0.75g(2.31mmol，1.8当量) Cs2CO3并于室温下搅拌15分钟。随后添加1.4g(4.5mmol，3.5当量)溴己基酞酰胺并于室温下将反应混合物搅拌4hr。在减压下移除溶剂并通过管柱色谱 (CH2Cl2∶CH3OH∶CH3COOH；20∶1∶0.1)纯化残余物，从而得到0.10g(15％)所需N-9异构体(120b)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.25(s，1H)，7.83-7.85(m，2H)，7.73-7.74(m，2H)， 7.32(m，3H)，4.21(t，J＝7.4Hz，2H)，3.66(t，J＝7.2Hz，2H)，1.75-1.78(m，2H)，1.62-1.65 (m，2H)，1.32-1.38(m，4H)。MS(ESI)m/z 541.33/543.24[M+H]+。
9-(3-氨基己基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(121b)：向120b(0.10g，0.18 mmol)于10ml CH2Cl2+1.5ml CH3OH中的溶液中添加140μL(2.77mmol，15当量)肼水合物并于室温下搅拌12h。在减压下移除溶剂并通过管柱色谱(CH2Cl2∶CH3OH-NH3(7N)；20∶1)纯化残余物，从而得到56mg(74％)121b。1H NMR(600MHz，CDCl3+5滴CD3OD) δ8.31(s，1H)，7.31-7.34(m，3H)，4.22(t，J＝7.9Hz，2H)，2.65(t，J＝7.3Hz，2H)，1.76-1.78 (m，2H)，1.41-1.43(m，2H)，1.31-1.36(m，4H)；13C NMR(150MHz，CDCl3+5滴CD3OD) 154.8，153.2，151.2，143.8，135.9，134.1，128.7，128.6，119.9，43.8，41.6，33.0，29.7，26.4，26.3。 MS(ESI)m/z 411.24/413.24[M+H]+。
N-(6-(6-氨基-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)己基)-1-(5-((3aS，4R，6aR)-2-氧代基六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)-3，6，9，12-四氧杂十五-15-酰胺(122b)：将于 DMF(0.5ml)中的121b(6.4mg，0.0156mmol)、
Figure GDA0002463350460002811
NHS-PEG4-生物素(10.1mg，0.017mmol)和DIEA(4mg，5.5μL，0.031mmol)于rt下搅拌1h。在减压下浓缩反应混合物并通过制备型TLC(CH2Cl2-MeOH-NH3(7N)，10∶1)纯化所得残余物，从而产生9.6mg(77％)122b。1H NMR(600MHz，CD2Cl2)δ8.27(s，1H)，7.30(t，J＝1.8Hz，1H)，7.28(d，J＝1.8Hz，2H)，6.76(t，J＝5.2Hz，1H)，6.59(t，J＝5.3Hz，1H)，6.46(s，1H)，6.35(s，2H)，5.54(s，1H)，4.45-4.49(m，1H)，4.27-4.31(m，1H)，4.20(t，J＝7.3Hz，2H)，3.68(t，J＝5.9Hz，2H)， 3.55-3.59(m，14H)，3.53(t，J＝5.1Hz，2H)，3.38(q，J＝5.1Hz，2H)，3.14(q，J＝7.1Hz，3H)， 2.87-2.91(m，1H)，2.67-2.73(m，1H)，2.39(t，J＝6.0Hz，2H)，2.16(t，J＝7.4Hz，2H)，1.57-1.76(m，7H)，1.37-1.44(m，5H)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C38H56Cl2N9O752的计算值 884.3121；实验值884.3157；HPLC(方法A)Rt＝9.00。
N-(6-(6-氨基-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)己基)-6-(6-(5-((3aS，4R，6aR)-2-氧代基六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)己酰胺基)己酰胺(123b)：将于DMF(0.5 ml)中的121b(5mg，0.0122mmol)、
Figure GDA0002463350460002821
NHS-LC_LC-生物素(9.65mg，0.0146mmol) 和DIEA(4mg，5.5μL，0.031mmol)于rt下搅拌1h。在减压下浓缩反应混合物并通过制备型TLC(CH2Cl2-MeOH-NH3(7N)，10∶1)纯化所得残余物，从而产生4.2mg(42％)123b。1H NMR(600MHz，CD2Cl2+5滴CD3OD)δ8.16(s，1H)，7.26-7.31(m，3H)，4.38-4.42(m， 1H)，4.20-4.23(m，1H)，4.13(t，J＝7.3Hz，2H)，3.03-3.09(m，8H)，2.80-2.85(m，1H)，2.61-2.65(m，1H)，2.03-2.11(m，7H)，1.25-1.69(m，24H)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+C39H57Cl2N10O4S2的计算值863.3383；实验值863.3402；HPLC(方法A)Rt＝9.47。
2-(6-(6-氨基-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)辛基)异吲哚啉-1，3-二酮(120c)：向15(0.4g，1.29mmol)于20ml无水DMF中的溶液中添加0.75g(2.31mmol，1.8当量) Cs2CO3并于室温下搅拌15分钟。随后添加1.5g(4.48mmol，3.5当量)溴辛基酞酰胺并将反应混合物于室温下搅拌2hr。在减压下移除溶剂并通过管柱色谱 (CH2Cl2∶CH3OH∶CH3COOH；20∶1∶0.1)纯化残余物，从而得到0.15g(21％)所需N-9异构体(120c)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.18(s，1H)，7.71-7.75(m，2H)，7.60-7.64(m，2H)， 7.21(m，3H)，4.13(t，J＝7.3Hz，2H)，3.57(t，J＝7.2Hz，2H)，1.55-1.64(m，4H)，1.19-1.21 (m，8H)；13C NMR(125MHz，CDCl3)174.5，167.6，153.1，149.9，149.6，144.1，134.9，133.0， 132.5，131.0，128.1，127.9，122.2，48.9，43.3，36.9，28.6，27.9，27.5，25.7，25.5。MS(ESI)m/z 569.22/571.13[M+H]+。
9-(3-氨基己基)-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-6-胺(121c)：向120c(0.15g，0.26 mmol)于10ml CH2Cl2+1.5ml CH3OH中的溶液中添加194μL(3.90mmol，15当量)肼水合物并于室温下搅拌12h。在减压下移除溶剂并通过管柱色谱(CH2Cl2∶CH3OH-NH3(7N)；20∶1)纯化残余物，从而得到57mg(50％)121c。1H NMR(600MHz，CDCl3+5滴CD3OD) δ8.26(s，1H)，7.12-7.16(m，3H)，4.12(t，J＝7.3Hz，2H)，2.64(t，J＝6.9Hz，2H)，1.62-1.68 (m，2H)，1.35-1.41(m，2H)，1.13-1.20(m，8H)；13C NMR(125MHz，CDCl3+5滴CD3OD) 155.3，153.4，151.3，142.8，135.7，134.9，128.1，127.8，120.3，43.9，41.5，30.9，29.8，29.1，28.9，26.7，26.5。MS(ESI)m/z 439.16/441.15[M+H]+。
N-(8-(6-氨基-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)辛基)-1-(5-((3aS，4R，6aR)-2-氧代基六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)-3，6，9，12-四氧杂十五-15-酰胺(122c)：将于DMF(0.5ml)中的121c(5.7mg，0.013mmol)、
Figure GDA0002463350460002831
NHS-PEG4-生物素(8.4mg，0.014 mmol)和DIEA(3.4mg，4.5μL，0.026mmol)于rt下搅拌1h。在减压下浓缩反应混合物并通过制备型TLC(CH2Cl2-MeOH-NH3(7N)，10∶1)纯化所得残余物，从而产生6.6mg(56％) 122c。1H NMR(600MHz，CD2Cl2+5滴CD3OD)δ8.15(s，1H)，7.30(t，J＝1.7Hz，1H)，7.26(d，J＝1.7Hz，2H)，4.38-4.43(m，1H)，4.20-4.23(m，1H)，4.13(t，J＝7.4Hz，2H)，3.61(t，J＝ 6.0Hz，2H)，3.50-3.55(m，14H)，3.45(t，J＝5.3Hz，2H)，3.27-3.31(m，4H)，3.07(t，J＝7.3 Hz，3H)，2.81-2.85(m，1H)，2.60-2.64(m，1H)，2.34(t，J＝6.0Hz，2H)，2.12(t，J＝7.6Hz， 2H)，1.49-1.67(m，8H)，1.30-1.39(m，6H)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C40H60Cl2N9O7S2的计算值912.3410；实验值912.3455；HPLC(方法B)Rt＝4.25。
N-(8-(6-氨基-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)辛基)-6-(6-(5-((3aS，4R，6aR)-2-氧代基六氢-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)己酰胺基)己酰胺(123c)：将于DMF(0.5 ml)中的121c(5.7mg，0.013mmol)、
Figure GDA0002463350460002832
NHS-LC_LC-生物素(8.1mg，0.014mmol) 和DIEA(3.4mg，4.5μL，0.026mmol)于rt下搅拌1h。在减压下浓缩反应混合物并通过制备型TLC(CH2Cl2-MeOH-NH3(7N)，10∶1)纯化所得残余物，从而产生3.7mg(34％)123c。1H NMR(600MHz，CD2Cl2+5滴CD3OD)δ8.15(s，1H)，7.29(t，J＝1.8Hz，1H)，7.26(d，J ＝1.7Hz，2H)，4.40-4.42(m，1H)，4.20-4.23(m，1H)，4.12(t，J＝7.4Hz，2H)，3.03-3.10(m， 8H)，2.79-2.85(m，1H)，2.58-2.64(m，1H)，2.03-2.13(m，8H)，1.25-1.69(m，27H)；HRMS (ESI)m/z[M+H]+ C41H61Cl2N10O4S2的计算值891.3707；实验值891.3696；HPLC(方法B)Rt＝4.52。
5-(3-(3-(6-氨基-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)丙基)硫基脲基)-2-(6-羟基-3- 氧代基-3H-氧杂蒽-9-基)苯甲酸WS-13-FITC2(124a)：将于DMF(0.5mL)中的121a(9.4 mg，0.0255mmol)、FITC(10.7mg，0.0281mmol)和Et3N(0.1mL)于rt下搅拌12h。在减压下浓缩反应混合物并通过HPLC纯化残余物，从而产生14.8mg(76％)124a。1H NMR(600MHz，MeOH-d4)δ8.26(s，1H)，8.17(s，1H)，7.72(d，J＝8.2Hz，1H)，7.54(d，J＝1.8Hz，2H)，7.43(t，J＝1.8Hz，1H)，7.11(d，J＝8.2Hz，1H)，6.83(d，J＝8.6Hz，2H)，6.76(s，2H)，6.62(d，J＝8.7Hz，2H)，4.35(t，J＝6.8Hz，2H)，3.57(m，2H)，2.17(q，J＝6.8Hz，2H)； HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C35H26Cl2N7O5S2的计算值758.0814；实验值758.0818。
5-(3-(6-(6-氨基-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)己基)硫基脲基)-2-(6-羟基-3- 氧代基-3H-氧杂蒽-9-基)苯甲酸WS-13-FITC3(124b)：将于DMF(0.5mL)中的121b(7.2 mg，0.0175mmol)、FITC(7.5mg，0.0193mmol)和Et3N(0.1mL)于rt下搅拌12h。在减压下浓缩反应混合物并通过HPLC纯化残余物，从而产生12.4mg(86％)124b。1H NMR(600MHz，MeOH-d4)δ8.26(s，1H)，8.13(s，1H)，7.67(d，J＝7.7Hz，1H)，7.50(d，J＝1.9Hz，2H)，7.43(t，J＝1.8Hz，1H)，7.09(d，J＝8.2Hz，1H)，6.77(d，J＝8.7Hz，2H)，6.71(s，2H)，6.56(d，J＝8.8Hz，2H)，4.25(t，J＝7.1Hz，2H)，3.88(m，2H)，1.76(q，J＝7.0Hz，2H)，1.54(q，J＝6.9Hz，2H)，1.25-1.35(m，4H)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C35H32Cl2N7O5S2的计算值 800.1324；实验值800.1329。
5-(3-(8-(6-氨基-8-((3，5-二氯苯基)硫基)-9H-嘌呤-9-基)辛基)硫基脲基)-2-(6-羟基-3- 氧代基-3H-氧杂蒽-9-基)苯甲酸WS-13-FITC4(124c)：将于DMF(0.5mL)中的121c(6.4 mg，0.0146mmol)、FITC(6.0mg，0.0153mmol)和Et3N(0.1mL)于rt下搅拌12h。在减压下浓缩反应混合物并通过HPLC纯化残余物，从而产生8.3mg(72％)124c。1H NMR(600MHz，MeOH-d4)δ8.30(s，1H)，8.18(s，1H)，7.93(d，J＝8.2Hz，1H)，7.49(d，J＝1.7Hz，2H)，7.48(t，J＝1.7Hz，1H)，7.15(d，J＝8.2Hz，1H)，6.79-6.83(m，4H)，6.64(d，J＝8.7Hz，2H)，4.27(t，J＝7.3Hz，2H)，3.62(m，2H)，1.82(q，J＝6.8Hz，2H)，1.65(q，J＝6.9Hz，2H)， 1.21-1.39(m，8H)；HRMS(ESI)m/z[M+H]+ C40H36Cl2N7O5S2的计算值828.1596；实验值 828.1609。
6.6式125的[131I]-HJP-V-149的合成(方案23)
方案23：
Figure GDA0002463350460002841
8-((3-氯-5-(三甲基锡烷基)苯基)硫基)-9-(3-(异丙基氨基)丙基)-9H-嘌呤-6-胺(124， HJP-VI-81).排空配备有磁力搅拌棒和橡胶隔片的10mL RBF中的53(15mg，0.0298mmol， 1当量)、[(Me)3Sn]2(4当量)、LiCl(2当量)和Pd(PPh3)4(10-20mol％)于二噁烷(1mL)中的混合物并回填氮。将此重复四次，随后将反应混合物在氮下于90℃下加热15h。在减压下移除溶剂并通过制备型TLC(DCM∶EtOAc∶己烷∶MeOH-NH3(7N)，4∶2∶4∶1，2×)纯化所得残余物，从而得到化合物124。产率，11.2mg(70％)。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ8.32 (s，1H)，7.40-7.42(m，1H)，7.36-7.37(m，1H)，7.30-7.32(m，1H)，5.84(br s，2H)，4.30(t，J＝6.8Hz，2H)，2.74-2.77(m，1H)，2.56(t，J＝6.7Hz，2H)，1.97-2.03(m，2H)，1.07(d，J＝6.2Hz，6H)，0.31(s，9H)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ154.5，153.0，151.6，146.6，145.3，135.5，135.2，135.1，132.1，130.0，120.1，48.9，43.5，41.5，29.8，22.5，-9.2。
[131I]-HJP-V-149(125)的合成.将20μg Me3Sn前体124溶解于埃彭道夫管(Eppendorf tube)中的25μL甲醇中，并向所得溶液中添加[131I]-NaI溶液(0.2mCi，2μl，于0.1N NaOH 中)并将溶液涡旋。向此溶液中添加2μl氯胺-T(2mg/ml乙酸)并涡旋并使其反应1min 并以300rpm离心15s。通过流经C-18 250×4.6mm的RP Luna HPLC管柱(菲罗门(Phenomenex)，托伦斯，加利福尼亚州，C18，5μ，110°A)实现纯化，使用0.1％TFA(A) 和乙腈(B)的双溶剂系统作为洗脱剂，在20-80％B(3-10min)的梯度下，流速为1ml/min。在上述条件下，产物具有约9.7分钟的滞留时间。纯化的[131I]-化合物HJP-V-149(125) 的HPLC谱
6.7 Hsp90同种同源物竞争分析
Hsp90 FP竞争分析是在Analyst GT仪器(分子仪器，桑尼维尔，加利福尼亚州)上执行且在黑色96孔微量滴定板(康宁编号3650)中实施，每一孔中总体积为100μL。在DMSO中制备10μM Cy3B-GM和115a的储液且用Felts缓冲液(20mM Hepes(K)(pH 7.3)、50 mMKCl、2mM DTT、5mM MgCl2、20mM Na2MoO4和0.01％NP40与0.1mg/mL BGG) 稀释。以100μL最终体积的Felts缓冲液向每一孔中添加荧光染料标记的Hsp90配体(对于Hsp90α、Hsp90β和Grp94为6nM Cy3B-GM，并且对于Trap-1为3nM 115a)、蛋白质(10nM Hsp90α、10nM Hsp90β、10nM Grp94、30nM Trap-1)和测试抑制剂(DMSO中的初始储液)。在一式两份或一式三份孔中添加化合物。对于每一分析，每一分析板上包括背景孔(仅缓冲液)、示踪剂对照(游离，仅荧光染料标记的Hsp90配体)和结合对照(在蛋白质存在下的荧光染料标记的Hsp90配体)。于4℃下将分析板在振荡器上培育24h且测量FP值(以mP表示)。结合到Hsp90的荧光染料标记的Hsp90配体的分率与mP值相关且将其针对竞争剂浓度值绘图。通过拟合数据获得在其下50％结合的荧光染料标记的 Hsp90配体经置换的抑制剂浓度。对于cy3B-GM，使用530nm的激发滤波器和580nm 的发射滤波器与561nm的二向色镜。对于115a，使用485nm的激发滤波器和530nm 的发射滤波器与505nm的二向色镜。使用SOFTmax Pro 4.3.1分析所有实验数据且使用 Prism 4.0(格拉芙帕德公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)绘图且将结合亲和性值以相对结合亲和性值(EC50，50％荧光配体由化合物竞争除去的浓度)给出。
根据本揭示内容产生的特定化合物的竞争分析结果示于下表16中：
Figure GDA0002463350460002861
Figure GDA0002463350460002871
Figure GDA0002463350460002881
Figure GDA0002463350460002891
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Figure GDA0002463350460002951
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Figure GDA0002463350460002971
Figure GDA0002463350460002981
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Figure GDA0002463350460003001
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Figure GDA0002463350460003021
Figure GDA0002463350460003031
Figure GDA0002463350460003041
Figure GDA0002463350460003051
Figure GDA0002463350460003061
Figure GDA0002463350460003071
Figure GDA0002463350460003081
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Figure GDA0002463350460003101
Figure GDA0002463350460003111
Figure GDA0002463350460003121
Figure GDA0002463350460003131
Figure GDA0002463350460003141
Figure GDA0002463350460003151
Figure GDA0002463350460003161
Figure GDA0002463350460003171
Figure GDA0002463350460003181
Figure GDA0002463350460003191
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Figure GDA0002463350460003221
Figure GDA0002463350460003231
Figure GDA0002463350460003241
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Figure GDA0002463350460003301
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Figure GDA0002463350460003331
Figure GDA0002463350460003341
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Figure GDA0002463350460003371
Figure GDA0002463350460003381
Figure GDA0002463350460003391
Figure GDA0002463350460003401
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Figure GDA0002463350460003441
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Figure GDA0002463350460003531
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Figure IDA0000964294220000011
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Figure IDA0000964294220000091
Figure IDA0000964294220000101

Claims (26)

1.一种式(I)化合物，
Figure FDA0002463350450000011
或其医药上可接受的盐，其中：
(a)Y是-S-；
(b)Z1和Z3各自独立地是-N-；
(c)Z2是-N-或-CH-；
(d)Z4、Z5、Z6、Z7和Z8各自独立地是-C-；
(e)X1是-H或-卤基；
(f)X2和X6各自独立地是-H、-卤基和5或6元杂环芳族的基团；X3、X4和X5各自独立地是-H、卤基或未经取代的–(C1-C6)脂族基；前提是X2、X4和X5中的至少一者是-H；
(g)R1是-(C1-C6)脂族基-N+-(R2)(R3)(R4)、-(C1-C6)脂族基-N-R3R4、-(C1-C6)脂族基-C(＝O)N-R3R4、-(C1-C6)脂族基-N-CR2R3R4、-(C1-C6)脂族基-C(卤基)3、-(C1-C6)脂族基-(C3-C8)环烷基、-(C1-C6)脂族基-(C3-C8)杂环基、-(C1-C6)脂族基-5或6元杂芳基、-(C1-C6)脂族基-氰基，其中所述环烷基、杂环基或杂芳基未经取代或经取代，前提是在所有R2-R4都存在时，所述化合物进一步包含医药上可接受的抗衡离子；
(h)R2和R3独立地是氢、-N(R)2、-CH2CH(OH)R4、-CH(OH)CH2R4、-CH2SO2NHR4、-CH2NHSO2R4或未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基，或R3和R4在与其附接的氮一起时形成未经取代或经取代的3到7元杂环；
(i)R4是氢、卤素或未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基；
且
(l)每一R独立地是氢、未经取代的C1-6脂族基或经卤基、-OH、-CN或-NH2取代的C1-6脂族基；
其中每一经取代基团经一或多个选自以下的基团取代：卤基、-N(R)2、-OR、-CN、氧代基、未经取代的C1-6脂族基或经卤基、-OH、-CN或-NH2取代的C1-6脂族基。
2.一种式(I)化合物，
Figure FDA0002463350450000021
或其医药上可接受的盐，其中：
(a)Y是-S-；
(b)Z1和Z3各自独立地是-N-；
(c)Z2是-CH-或-N-；
(d)Z4、Z5、Z6、Z7和Z8各自独立地是-C-；
(e)X1是-H或-卤基；
(f)X2是-H、-卤基或选自以下的杂环芳族基团：吡啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、咪唑基、噻唑烷基、噻二唑基、噻唑基、异噁唑基、吡唑基、异噻唑基、哒嗪基、嘧啶基或三嗪基，X3、X4和X5各自独立地是-H、卤基或未经取代的–(C1-C6)烷基；前提是X2、X4和X5中的至少一者是-H；
(g)X6是-H；
(h)R1是-(CH2)m-N+-(R2)(R3)(R4)、-(CH2)m-N-R3R4、-(CH2)m-C(＝O)N-R3R4、-(CH2)m-C(卤基)3、-(CH2)m-(C3-C8)环烷基、-(CH2)m-(C3-C8)杂环烷基、-(CH2)m-5或6元杂芳基、-(CH2)m-氰基，其中m是1、2、3、4或5且其中所述环烷基或杂环未经取代或经一或多个X1基团取代，前提是在所有R2-R4都存在时，所述化合物进一步包含医药上可接受的抗衡离子；
(i)R2和R3独立地是氢、甲基、乙基、乙烯基、乙炔基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、叔丁基、异丁基、-C(卤基)3、-CH(卤基)2、-CH2(卤基)、-CH2C(卤基)3、-CH2CH(卤基)2、-CH2CH2(卤基)、-CH2OH、-CH2C(CH3)2OH、-CH2CH(CH3)OH、-C(CH3)2CH2OH、-CH(CH3)CH(OH)R4、-CH2CH(OH)R4、-CH2SO2NHR4、-CH2NHSO2R4，或R4和R3在与其附接的氮一起时形成未经取代或经取代的氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯烷或哌啶环；且
(j)R4是氢、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、异丁基或-C(卤基)3；并且
(k)每一R独立地是氢、未经取代的C1-6脂族基或经卤基、-OH、-CN或-NH2取代的C1-6脂族基；
其中每一经取代基团经一或多个选自以下的基团取代：卤基、-N(R)2、-OR、-CN、氧代基、未经取代的C1-6脂族基或经卤基、-OH、-CN或-NH2取代的C1-6脂族基。
3.根据权利要求1所述的化合物，其具有下式：
Figure FDA0002463350450000031
或其医药上可接受的盐。
4.根据权利要求1或2所述的化合物，其具有下式：
Figure FDA0002463350450000032
或其医药上可接受的盐。
5.根据权利要求1或2所述的化合物，其具有下式：
Figure FDA0002463350450000033
或其医药上可接受的盐。
6.根据权利要求1或2所述的化合物，其具有下式：
Figure FDA0002463350450000041
或其医药上可接受的盐。
7.根据权利要求1或2所述的化合物，其具有下式：
Figure FDA0002463350450000042
或其医药上可接受的盐。
8.根据权利要求1或2所述的化合物，其具有下式：
Figure FDA0002463350450000043
或其医药上可接受的盐。
9.根据权利要求1或2所述的化合物，其具有下式：
Figure FDA0002463350450000044
或其医药上可接受的盐。
10.根据权利要求1或2所述的化合物，其具有下式：
Figure FDA0002463350450000051
或其医药上可接受的盐。
11.一种式(II)化合物，
Figure FDA0002463350450000052
或其医药上可接受的盐，其中：
(a)Y是-S-；
(b)Z1和Z3各自独立地是-N-；
(c)Z2是-N-或-CH-；
(d)X1是-H或-卤基；
(e)X2和X6各自独立地是-H、-卤基和5或6元杂环芳族的基团，X4是-H、卤基或未经取代的–(C1-C6)脂族基；
(f)R1是-(C1-C6)脂族基-N+-(R2)(R3)(R4)、-(C1-C6)脂族基-N-R3R4、-(C1-C6)脂族基-C(＝O)N-R3R4、-(C1-C6)脂族基-N-CR2R3R4、-(C1-C6)脂族基-C(卤基)3、-(C1-C6)脂族基-(C3-C8)环烷基、-(C1-C6)脂族基-(C3-C8)杂环烷基、-(C1-C6)脂族基-5或6元杂芳基、-(C1-C6)脂族基-氰基，前提是在所有R2-R4都存在时，所述化合物进一步包含医药上可接受的抗衡离子；
(g)R2和R3独立地是氢、-N(R)2、-CH2CH(OH)R4、-CH(OH)CH2R4、-CH2SO2NHR4、-CH2NHSO2R4或未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基，或R3和R4在与其附接的氮一起时形成未经取代或经取代的3到7元杂环；
(i)R4是氢、卤素或未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基；且
(j)每一R独立地是氢、未经取代的C1-6脂族基或经卤基、-OH、-CN或-NH2取代的C1-6脂族基；
其中每一经取代基团经一或多个选自以下的基团取代：卤基、-N(R)2、-OR、-CN、氧代基、未经取代的C1-6脂族基或经卤基、-OH、-CN或-NH2取代的C1-6脂族基。
12.一种式(II)化合物，
Figure FDA0002463350450000061
或其医药上可接受的盐，其中：
(a)Y是-S-；
(b)Z1和Z3各自独立地是-N-；
(c)Z2是-CH-或-N-；
(d)X1是-H或-卤基；
(e)X2和X6各自独立地是-H、-卤基、或选自以下的杂环芳族：吡啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、咪唑基、噻唑烷基、噻二唑基、噻唑基、异噁唑基、吡唑基、异噻唑基、哒嗪基、嘧啶基或三嗪基；X4是-H、卤基或未经取代的–(C1-C6)烷基；
(f)R1是-(CH2)m-N+-(R2)(R3)(R4)、-(CH2)m-N-R3R4、-(CH2)m-C(＝O)N-R3R4、-(CH2)m-C(卤基)3、-(CH2)m-(C3-C8)环烷基、-(CH2)m-(C3-C8)杂环烷基、-(CH2)m-5或6元杂芳基、-(CH2)m-氰基，其中m是1、2、3、4或5且其中所述环烷基或杂环未经取代或经一或多个X1基团取代，前提是在所有R2-R4都存在时，所述化合物进一步包含医药上可接受的抗衡离子；
(g)R2和R3独立地是氢、甲基、乙基、乙烯基、乙炔基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、叔丁基、异丁基、-C(卤基)3、-CH(卤基)2、-CH2(卤基)、-CH2C(卤基)3、-CH2CH(卤基)2、-CH2CH2(卤基)、-CH2OH、-CH2C(CH3)2OH、-CH2CH(CH3)OH、-C(CH3)2CH2OH、-CH(CH3)CH(OH)R4、-CH2CH(OH)R4、-CH2SO2NHR4、-CH2NHSO2R4，或R4和R3在与其附接的氮一起时形成未经取代或经取代的氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯烷或哌啶环；且
(h)R4是氢、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、异丁基或-C(卤基)3；并且
(i)每一R独立地是氢、未经取代的C1-6脂族基或经卤基、-OH、-CN或-NH2取代的C1-6脂族基；
其中每一经取代基团经一或多个选自以下的基团取代：卤基、-N(R)2、-OR、-CN、氧代基、未经取代的C1-6脂族基或经卤基、-OH、-CN或-NH2取代的C1-6脂族基。
13.根据权利要求11或12所述的化合物，其具有下式：
Figure FDA0002463350450000071
或其医药上可接受的盐。
14.根据权利要求11或12所述的化合物，其具有下式：
Figure FDA0002463350450000072
或其医药上可接受的盐。
15.一种式(V)化合物，
Figure FDA0002463350450000073
或其医药上可接受的盐，其中：
(a)Y是-S-；
(b)Z1和Z3各自独立地是-N-；
(c)Z2是-N-或-CH-；
(d)Z4、Z5、Z6、Z7和Z8各自独立地是-C-；
(e)X1是-H或-卤基；
(f)X6是-H、-卤基、未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基；X4和X5各自独立地是-H、卤基或未经取代的–(C1-C6)脂族基；前提是X2、X4和X5中的至少一者是-H；
(g)X2选自
-H、-卤基、未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基；X3是-H、卤基或未经取代的–(C1-C6)脂族基；
(h)R7是-(C1-C6)脂族基-N+-(R2)(R3)(R4)、-(C1-C6)脂族基-N-R3R4、-(C1-C6)脂族基-C(＝O)N-R3R4、-(C1-C6)脂族基-N-CR2R3R4、-(C1-C6)脂族基-C(卤基)3、-(C1-C6)脂族基-(C3-C8)环烷基、-(C1-C6)脂族基-(C3-C8)杂环烷基、-(C1-C6)脂族基-5或6元杂芳基、-(C1-C6)脂族基-氰基，前提是在所有R2-R4都存在时，所述化合物进一步包含医药上可接受的抗衡离子；
(i)R2和R3独立地是氢、-N(R)2、-CH2CH(OH)R4、-CH(OH)CH2R4、-CH2SO2NHR4、-CH2NHSO2R4或未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基，或R3和R4在与其附接的氮一起时形成未经取代或经取代的3到7元杂环；
(k)R4是氢、卤素或未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基；且
(l)每一R独立地是氢、未经取代的C1-6脂族基或经卤基、-OH、-CN或-NH2取代的C1-6脂族基；
其中每一经取代基团经一或多个选自以下的基团取代：卤基、-N(R)2、-OR、-CN、氧代基、未经取代的C1-6脂族基或经卤基、-OH、-CN或-NH2取代的C1-6脂族基。
16.一种式(V)化合物，
Figure FDA0002463350450000081
或其医药上可接受的盐，其中：
(a)Y是-S-；
(b)Z1和Z3各自独立地是-N-；
(c)Z2是-CH-或-N-；
(d)Z4、Z5、Z6、Z7和Z8各自独立地是-CH-；
(e)X1是-H或-卤基；
(f)X6是-H、-卤基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、咪唑基、噻唑烷基、噻二唑基、噻唑基、异噁唑基、吡唑基、异噻唑基、哒嗪基、嘧啶基或三嗪基；X4和X5各自独立地是-H、卤基或未经取代的–(C1-C6)烷基；
(g)X2选自
-H、-卤基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、咪唑基、噻唑烷基、噻二唑基、噻唑基、异噁唑基、吡唑基、异噻唑基、哒嗪基、嘧啶基或三嗪基；和
X3是-H、卤基或未经取代的–(C1-C6)烷基；
(h)R7是-(CH2)m-N+-(R2)(R3)(R4)、-(CH2)m-N-R3R4、-(CH2)m-C(＝O)N-R3R4、-(CH2)m-C(卤基)3、(CH2)m-(C3-C8)环烷基、-(CH2)m-(C3-C8)杂环烷基、-(CH2)m-5或6元杂芳基、-(CH2)m-氰基，其中m是1、2、3、4或5且其中所述环烷基或杂环未经取代或经一或多个X1基团取代，前提是在所有R2-R4都存在时，所述化合物进一步包含医药上可接受的抗衡离子；
(i)R2和R3独立地是氢、甲基、乙基、乙烯基、乙炔基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、叔丁基、异丁基、-C(卤基)3、-CH(卤基)2、-CH2(卤基)、-CH2C(卤基)3、-CH2CH(卤基)2、-CH2CH2(卤基)、-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH2C(CH3)2OH、-CH2CH(CH3)OH、-C(CH3)2CH2OH、-CH(CH3)CH2OH，或R4和R3在与其附接的氮一起时形成未经取代或经取代的氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯烷或哌啶环；
(j)R4是氢、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、异丁基或-C(卤基)3；并且
其中每一经取代基团经一或多个选自以下的基团取代：卤基、-N(R)2、-OR、-CN、氧代基、未经取代的C1-6脂族基或经卤基、-OH、-CN或-NH2取代的C1-6脂族基，并且每一R独立地是氢、未经取代的C1-6脂族基或经卤基、-OH、-CN或-NH2取代的C1-6脂族基。
17.根据权利要求15或16所述的化合物，其具有下式：
Figure FDA0002463350450000101
或其医药上可接受的盐。
18.根据权利要求15或16所述的化合物，其具有下式：
Figure FDA0002463350450000102
或其医药上可接受的盐。
19.根据权利要求15或16所述的化合物，其具有下式：
Figure FDA0002463350450000103
或其医药上可接受的盐。
20.一种化合物，其具有下式：
Figure FDA0002463350450000104
或其医药上可接受的盐
其中：
(a)X1是-H或-卤基；
(b)X3和X5各自独立地是-H、-卤基和5或6元杂环芳族的基团；
(c)R1是-(C1-C6)脂族基-N+-(R2)(R3)(R4)、-(C1-C6)脂族基-N-R3R4、-(C1-C6)脂族基-C(＝O)N-R3R4、-(C1-C6)脂族基-N-CR2R3R4、-(C1-C6)脂族基-C(卤基)3、-(C1-C6)脂族基-(C3-C8)环烷基、-(C1-C6)脂族基-(C3-C8)杂环基、-(C1-C6)脂族基-5或6元杂芳基、-(C1-C6)脂族基-氰基，其中所述环烷基、杂环基或杂芳基未经取代或经取代，前提是在所有R2-R4都存在时，所述化合物进一步包含医药上可接受的抗衡离子；
(d)R2和R3独立地是氢、-N(R)2、-CH2CH(OH)R4、-CH(OH)CH2R4、-CH2SO2NHR4、-CH2NHSO2R4、或未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基，或R3和R4在与其附接的氮一起时形成未经取代或经取代的3到7元杂环；
(e)R4是氢、卤素或未经取代或经取代的-(C1-C6)脂族基；
其中每一经取代基团经一或多个选自以下的基团取代：卤基、-N(R)2、-OR、-CN、氧代基、未经取代的C1-6脂族基或经卤基、-OH、-CN或-NH2取代的C1-6脂族基，
每一R独立地为氢、未经取代的C1-6脂族基或经卤基、-OH、-CN或-NH2取代的C1-6脂族基。
21.一种化合物，其选自：
Figure FDA0002463350450000111
Figure FDA0002463350450000121
或其医药上可接受的盐。
22.一种化合物，其选自：
Figure FDA0002463350450000122
或其医药上可接受的盐。
23.一种化合物，其具有下式：
Figure FDA0002463350450000123
Figure FDA0002463350450000131
Figure FDA0002463350450000141
Figure FDA0002463350450000151
Figure FDA0002463350450000161
Figure FDA0002463350450000162
或其医药上可接受的盐。
24.一种医药组合物，其包含根据权利要求1到23中任一权利要求所述的化合物和医药上可接受的赋形剂。
25.一种治疗有效量的根据权利要求1到23中任一权利要求所述的化合物在制备用于治疗动物的癌症的药物中的用途。
26.一种治疗有效量的根据权利要求1到23中任一权利要求所述的化合物在制备用于治疗动物的自体免疫疾病、炎症疾病、神经变性疾病、类风湿性关节炎或糖尿病的药物中的用途。
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