JPWO2009098867A1 - 蛍光検出装置および蛍光検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
細胞内の局所情報を調べるためには、計測分解能を従来に比べて向上させることが必要である。
前記フローセル体の表面には、レーザ光の光路を横切るようにレンズが設けられレンズが設けられ、このレンズは、測定対象物の前記測定点を通る、測定対象物の移動方向と垂直な面で仮想的に切断したとき、前記レンズの断面が前記測定点を中心とした円形形状の一部分を成していることを特徴とする蛍光検出装置を提供する。
また、前記フローセル体と前記レンズは同じ材料で構成されていることが好ましい。
さらに、前記測定点と前記受光部との間の蛍光の光路中の前記フローセル体の表面に、レンズの断面が前記測定点を中心とした円形形状の一部分を成した別のレンズが設けられていることも好ましい。
測定対象物を、フローセル体に設けられた流路に流すステップと、
測定対象物の測定点を通り、測定対象物の移動方向と垂直な面で仮想的に切断したとき、断面が前記測定点を中心とした円形形状の一部分を成している、前記フローセル体の表面に設けられたレンズを用いて収束させたレーザ光を、前記流路中の測定点を通過する測定対象物に対して照射させるステップと、
レーザ光の照射された測定対象物の蛍光を受光して受光信号を出力するステップと、
出力した前記受光信号から、蛍光強度の出力値を出力するステップと、を有することを特徴とする蛍光検出方法を提供する。
また、上記レンズを用いて蛍光を検出する方法においても、従来に比べてNA(開口数)を高めることができ、レーザ光の集光ビームの直径を小さくすることができる。特に、測定点を焦点位置とする球体形状の一部分を成す球面レンズを用いることで、レーザ光の集光ビームの直径を効率よく小さくすることができる。
したがって、タンパク質等の細胞内の局所情報を調べる程度に測定分解能を向上することができる。
12 試料
20 信号処理装置
22 レーザ光源部
22r R光源
22g G光源
22b B光源
23a1,23a2,26b1,26b2 ダイクロイックミラー
23c.26a レンズ系
24,26 受光部
26c1,26c2,26c3 バンドパスフィルタ
27a〜27c 光電変換器
28 処理部
29 制御部
30 管路
31 フローセル体
31a 球面レンズ
31b 流路
32 回収容器
34r,34g,34b レーザドライバ
80 分析装置
図1は、本発明の蛍光検出装置を用いたフローサイトメータ10の概略構成図である。
フローサイトメータ10は、レーザ光を測定対象とする細胞等の試料12に照射し、試料12中のタンパク質等の一部分から発する蛍光を検出して信号処理する信号処理装置(蛍光検出装置)20と、信号処理装置20で得られた処理結果をから試料12中の測定対象物の分析を行なう分析装置80とを有する。
レーザ光源部22は、R光源22r、G光源22g、B光源22bと、ダイクロイックミラー23a1、23a2と、レンズ系23cと、レーザドライバ34r,34gおよび34bと、パワースプリッタ35と、を有して構成される。
R光源22r、G光源22g、B光源22bは、350nm〜800nmの可視光の、レーザ光を出射する部分で、R光源22rは、主に赤色のレーザ光Rを所定の強度で出射する。G光源22gは、緑色のレーザ光Gを所定の強度で出射する。B光源22bは、青色のレーザ光Bを所定の強度で出射する。
ダイクロイックミラー23a1、23a2は、特定の波長帯域のレーザ光を透過し、他の波長帯域のレーザ光を反射する。
レンズ系23cは、レーザ光R,GおよびBからなるレーザ光を管路30中の測定点に集束させる。レーザドライバ34r,34gおよび34bは、R光源22r、G光源22gおよびB光源22bのぞれぞれを駆動する。
パワースプリッタ35は、供給された信号をレーザドライバ34r,34gおよび34bにそれぞれ分配する。
これらのレーザ光を出射する光源として例えば半導体レーザが用いられる。
この構成によりレーザ光R,GおよびBが合成されて、測定点を通過する試料12を照射する照射光となる。
図3は、受光部26の一例の概略の構成を示す概略構成図である。
レンズ系26aは、受光部26に入射した蛍光を光電変換器27a〜27cの受光面に集束させるように構成されている。
ダイクロイックミラー26b1,26b2は、所定の範囲の波長帯域の蛍光を反射させて、それ以外は透過させるミラーである。バンドパスフィルタ26c1〜26c3でフィルタリングして光電変換器27a〜27cで所定の波長帯域の蛍光を取り込むように、ダイクロイックミラー26b1,26b2の反射波長帯域および透過波長帯域が設定されている。
処理部28は、所定の信号処理を行って蛍光強度の出力値を分析装置80に出力する部分である。
フローセル体31は、長方体を成した透明部材であり、石英等によって作られている。フローセル体31の側面からレーザ光が入射され、フローセル体31の内部を通過し、フローセル体30に設けられた、管路30から縦方向に延びる流路31bの中心で集束するようになっており、この集束位置が測定点Pとなっている。この測定点Pは、レーザ光源部22のレンズ系23cの焦点位置である。
このように、フローセル体31のレーザ光の入射面に球面レンズ31aを設けるのは、レーザ光の集光ビームの直径を小さくし、測定分解能を向上させるためである。
具体的には、フローセル体31を通過するレーザ光の集光ビームのNAは、(媒質の屈折率)×sinθで表される。ここで、θはレーザ光のフローセル体31への入射角度である。このとき、球面レンズ31aでは、レンズ系23cを通過したレーザ光は常に入射角度0度で入射するのでθは変化せず、球面レンズ31aを通過したときNAは媒質の屈折率×sinθの値になる。一方、図5に示す従来例のように、球面レンズ31aがない場合、レーザ光がフローセル体31の側面に入射する入射角度は、レーザ光の光軸の部分を除いて、0度ではない。このため、フローセル体31を通過する集光ビームにおけるNAはスネルの法則よりsinθとなる。以上より、本発明では、フローセル体31をレーザ光が通過するとき、フローセル体31の境界面でNAが従来のように低下しないように、球面レンズ31aを設ける。
球面レンズ31aを設けることにより、下記式に従って、従来に比べてのNAを増大させることができる。これによって集光ビームの直径を小さくすることができる。下記式は、レーザ光がガウシアン分布を想定した式である。
ここで、λはレーザ光の波長、fはレンズ焦点距離、Dはレンズ系23cの開口径である。
なお、本実施形態の球面レンズ31aは、直方体形状をしたフローセル体31の1つの側面に設けるが、受光部26の蛍光の測定分解能を向上させるために、蛍光が通過し受光部26に至るフローセル体31の別の側面に球面レンズ31を設けてもよい。この場合においても、測定点Pの位置に球面レンズ31の焦点位置が来るように配置する。
焦点深度z=0.64/(NA)2
すなわち、フローセル体31に設けられた流路31bの断面形状は、図4(b)に示すように矩形形状であり、レーザ光は、光軸がこの矩形形状の一辺に平行になるように照射される。このとき、流路31bの矩形形状の、レーザ光の光軸に平行な一辺の長さL1に対する、この一辺に対して直交する他辺の長さL2の比率が、1〜2.5である。このような比率の矩形形状の流路31bを形成することで、レーザ光の光軸方向において試料12が通過する位置を規制することができる。このため、NAを高くすることで浅くなった焦点深度の不都合を、流路31bの矩形形状の比率を1〜2.5とし、試料12の流れる位置を規制することにより、解決することができる。また、測定する試料12の平均サイズ(直径)に対して長さL1を30〜200倍とすることが好ましい。
フローサイトメータ10は以上のように構成される。
試料12を、フローセル体31に設けられた流路にシース液を用いて流す。そして、フローセル体31の表面に設けられた球面レンズ31aを用いて収束させたレーザ光を、流路中の測定点を通過する試料12に対して照射させる。球面レンズ31aは、試料12の測定点を通り、試料12の移動方向と垂直な面で仮想的に切断したとき、断面が測定点を中心とした円形形状の一部分を成しているレンズである。このとき、レーザ光の照射された試料12の発する蛍光を受光して受光信号を出力する。出力した受光信号から、蛍光強度の出力値を出力する。
なお、球面レンズ31は、測定点を焦点位置とする球体形状の一部分を成している。
Claims (9)
- 測定対象物にレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を測定する蛍光検出装置であって、
測定対象物が流れる流路が形成されたフローセル体と、
流路中の測定点を通過する測定対象物に対してレーザ光を照射するレーザ光源部と、
レーザ光の照射された測定対象物の蛍光を受光して受光信号を出力する受光部と、
前記受光部から出力した受光信号から、蛍光強度の出力値を出力する処理部と、を有し、
前記フローセル体の表面には、レーザ光の光路を横切るようにレンズが設けられ、このレンズは、測定対象物の測定点を通る、測定対象物の移動方向と垂直な面で仮想的に切断したとき、前記レンズの断面が前記測定点を中心とした円形形状の一部分を成していることを特徴とする蛍光検出装置。 - 前記レンズは、前記測定点を焦点位置とする球体形状の一部分を成す球面レンズである請求項1に記載の蛍光検出装置。
- 前記ブローセル体に形成される前記流路の断面形状は、矩形形状であり、前記レーザ光は、光軸がこの矩形形状の一辺に平行になるように照射され、
前記矩形形状の、前記レーザ光の光軸に平行な一辺の長さに対する、この一辺に対して直交する他辺の長さの比率が、1〜2.5である請求項1または2に記載の蛍光検出装置。 - 前記レーザ光の光軸に平行な一辺の長さは、測定対象物の平均直径に対して30倍以上200倍以下の長さである請求項3に記載の蛍光検出装置。
- 前記フローセル体と前記レンズは同じ材料で構成されている請求項1〜4のいずれか1項に記載の蛍光検出装置。
- 前記測定点と前記受光部との間の蛍光の光路中の前記フローセル体の表面に、レンズの断面が前記測定点を中心とした円形形状の一部分を成した別のレンズが設けられている請求項1〜5のいずれか1項に記載の蛍光検出装置。
- 測定対象物は細胞であり、
前記レーザ光は、前記測定点において細胞内の一部分を照射し、
前記受光部は、細胞内のタンパク質が発する蛍光を受光する請求項1〜6のいずれか1項に記載の蛍光検出装置。 - 測定対象物にレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光を測定する蛍光検出方法であって、
測定対象物を、フローセル体に設けられた流路に流すステップと、
測定対象物の測定点を通り、測定対象物の移動方向と垂直な面で仮想的に切断したとき、断面が前記測定点を中心とした円形形状の一部分を成している、前記フローセル体の表面に設けられたレンズを用いて収束させたレーザ光を、前記流路中の測定点を通過する測定対象物に対して照射させるステップと、
レーザ光の照射された測定対象物の蛍光を受光して受光信号を出力するステップと、
出力した前記受光信号から、蛍光強度の出力値を出力するステップと、を有することを特徴とする蛍光検出方法。 - 前記レンズは、前記測定点を焦点位置とする球体形状の一部分を成す球面レンズである請求項8に記載の蛍光検出方法。
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