JPWO2004020552A1 - ラジカル反応抑制剤及びラジカル反応抑制方法並びにその用途 - Google Patents

Abstract

本発明は、不飽和化合物がラジカル反応を起こして分解が進むのを防止するラジカル反応抑制剤、不飽和化合物からのラジカルの生成及びそのラジカル反応を抑制する方法、及びラジカルの生成、ラジカル反応、又はそれらの進行が抑制された組成物を提供することを課題とし、環状四糖、又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物を有効成分として含有するラジカル反応抑制剤、当該抑制剤を用いて不飽和化合物からのラジカルの生成及びそのラジカル反応を抑制する方法、当該抑制剤を含有するラジカルの生成、ラジカル反応、又はそれらの進行が抑制された組成物を確立することにより前記課題を解決するものである。

Description

本発明は、新規なラジカル反応抑制剤及びその用途、より詳細には、グルコースが４個、α−１，３とα−１，６結合で環状に結合した非還元性の糖質、即ち、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝で示される環状四糖（以下、単に「環状四糖」という。）、又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物を有効成分とする新規なラジカル反応抑制剤、該ラジカル反応抑制剤とともに不飽和化合物を含む組成物、及び、該抑制剤を不飽和化合物を含む組成物に含有させることを特徴とするラジカル反応の抑制方法に関するものである。

脂質、染料、合成高分子をはじめとする有機化合物を主体とする製品が、その保存中に異臭の発生、変色・退色、硬化、分解、変性などにより品質劣化や機能低下を起こすことはよく知られている。また、飲食品や医薬品などの場合には、ラジカル反応により生じる過酸化物が、タンパク質、ペプチド及び／又はアミノ酸などの不飽和化合物以外の成分を変性させ、該製品の品質や機能の一層の低下をもたらすことが知られている。しかも、近年、ラジカル反応により生じる過酸化物は、細胞、組織に対する傷害作用があることから生活習慣病をはじめとする各種疾患との関連も注目されている。
このような品質劣化や機能の低下、ひいてはヒトの健康に害を及ぼすとさえいわれる成分の生成をもたらす主要な反応は、有機化合物が無触媒下に起こす化学反応である。つまり、ラジカル化し易い有機化合物ほど上記のような品質劣化、すなわち化学的変化を起こし易いといえる。そして、ラジカル化のし易さは、分子内に不飽和結合が存在するか否か、ならびに、その存在様式と密接に関連しているといわれている。更に、有機化合物のラジカルが何らかの原因で一旦生成すると、該ラジカルとその近傍に存在する他の未反応の分子や分子状酸素との間で多様な反応が連鎖的に進行し、より大きな品質劣化や機能低下を引き起こすこととなる。有機化合物のラジカル化は、光照射や加温など日常的に起こり得る環境条件下で容易に誘発されるため、ラジカルにより連鎖的に進行する反応（以下、「ラジカル反応」という。）による製品の化学的変化は、食品分野、化粧品分野、医薬品分野、化学工業品分野などの広範な分野で起こり得る問題である。このため、ラジカル反応を阻止、抑制することは、特定の分野に限らず、製品の品質や機能を保持する上で極めて重要な課題のひとつである。
この課題を解決するための手段として、現在のところ、各分野において最も汎用されている手段は、一般にラジカルスカベンジャーと呼ばれる物質、すなわち、既に存在しているラジカルと反応し、それ自体が化学的に変化することによりラジカルの反応性を阻止ないしは抑制する物質を製品又はその原料に添加することである。しかしながら、ラジカルスカベンジャーによるラジカル反応の抑制効果は際限なく持続するものではないという欠点がある。
このような状況をふまえて、例えば、特開２００１−１２３１９４号公報（以下、「特許文献１」と言う。）には、α，α−トレハロース及び／又はマルチトールを含有せしめることにより、脂肪酸類からの揮発性アルデヒドの産生を抑制する方法が提案されている。しかしながら、現在の多様な食生活に対応するためには、継続的に摂取しても、食品の味、香り、食感などの風味の低下をもたらすことがなく、しかも、安全なラジカル反応の抑制効果を有する機能性に優れた食品素材のさらなる開発が望まれている。
一方、本発明者らは、国際公開ＷＯ ０１／９０３３８号明細書（以下、「特許文献２」と言う。）、或いは、国際公開ＷＯ ０２／１０３６１号明細書（以下、「特許文献３」と言う。）において、環状四糖が、脂質の劣化抑制やタンパク質の変性抑制効果を有することを開示したものの、その実体については依然として不明であり、また、これら特許文献１〜３には、環状四糖、又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物が、不飽和化合物のラジカル化、或いは、それに続く一連のラジカル反応の進行を抑制することについてはなんら記載されていない。

本発明は、不飽和化合物がラジカル反応を起こして分解が進行し、それを含む組成物の保存中に異臭の発生、褐変、退色、硬化、分解、変性などが発生することに加え、ラジカル反応により生成する過酸化物が、さらに、共存するタンパク質、ペプチド、アミノ酸などの不飽和化合物以外の成分を修飾することに起因する製品の品質や機能の一層の低下を改善するために、ラジカルの生成及びラジカル反応の進行（ラジカル反応により生成した過酸化物が、さらに、共存するタンパク質、ペプチド類、アミノ酸類などの不飽和化合物以外の成分を修飾、変性させる反応も含む）を抑制、阻止するためのラジカル反応抑制剤を提供することを第一の課題とし、該ラジカル反応抑制剤を用いた不飽和化合物のラジカルの生成及びラジカル反応を抑制する方法を提供することを第二の課題として、該ラジカル反応抑制剤を含有するラジカル反応が抑制された組成物を提供することを第三の課題とするものである。
本発明者らは、上記の課題を解決する目的で、糖質を用いるラジカルの生成及びラジカル反応の抑制並びタンパク質の変性抑制の方法について長年に渡り研究を進めてきた。その結果、環状四糖、又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物が、不飽和化合物のラジカルの生成及びラジカル反応の進行の抑制に強く働くこと、さらには、該ラジカル反応により生じた過酸化物が、タンパク質をはじめとする不飽和物質以外の成分を修飾乃至変性させることを抑制することを新たに見いだし、ラジカル反応抑制剤を確立するとともに、それを用いたラジカルの生成抑制方法及びラジカル反応の抑制方法を確立し、更に、ラジカル反応抑制剤を含有する組成物を確立することにより、本発明を完成するに至った。即ち、環状四糖、又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物がラジカルの生成及びラジカル反応の進行を抑制できることを明らかにし、環状四糖、又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物を有効成分として含有するラジカル反応抑制剤を確立し、ラジカルの生成及びラジカル反応が発生する前、または、発生している有機の不飽和化合物を含む反応系に上記のラジカル反応抑制剤を含有させることで、ラジカルの生成及びラジカル反応の進行を抑制する方法を確立し、更に、不飽和化合物を含有する食品、化粧品、医薬品、化学工業品などにラジカル反応抑制剤を含有させた組成物を確立することにより、本発明を完成するに至った。

本発明で使用される環状四糖、又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物は、その由来や製法は問わず、発酵法、酵素法、有機合成法などにより製造されたものでもよく、それらの方法により得られる反応液は、環状四糖、又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物を含む溶液として、そのまま、部分精製して、或いは、高純度に精製して使用することも自由である。環状四糖、又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物は、例えば、本発明者らが、特許文献２に開示した、パノースをα−イソマルトシル転移酵素によって環状四糖に変換する方法、或いは、特許文献３に開示した、澱粉から直接α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素及びα−イソマルトシル転移酵素を組み合わせて環状四糖、又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物を製造する方法などの、澱粉質或いはそれ由来の糖質を原料とした酵素法により製造することができる。これらの製造方法は、豊富で安価な澱粉質を原料とし、高効率かつ安価に環状四糖やその誘導体を製造できることから、工業的に有利に実施できる。また、環状四糖には、無水非晶質、無水結晶、１含水結晶、５含水結晶が存在し、その何れを使用することも可能である。さらに、環状四糖のうち無水結晶、１含水結晶及び無水非晶質のものは、優れた脱水能を有していることから、不飽和化合物を含有する含水物を粉末、固化する場合には、該含水物に添加することにより脱水剤としても作用し、環状四糖を有効成分として含有する高品質の粉末、固型製品の製造に有利に使用できる。
また、本発明でいう環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物とは、環状四糖とともに環状四糖に１種又は２種以上のグリコシル基が１個又は２個以上結合した環状四糖の糖質誘導体との混合物、或いは、該環状四糖と環状四糖の糖質誘導体とともにそれら糖質以外の糖質を含有するものをいう。環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物は、例えば、α−イソマルトシルグルコ糖質生成酵素及びα−イソマルトシル転移酵素を組み合わせて殿粉に作用させて得られる糖液のように、環状四糖と環状四糖分子の１個又は２個以上のＯＨ基に、１個又は２個以上のグルコースが結合した糖質誘導体及び／又は該糖質誘導体とグルコース、マルトオリゴ糖、マルトデキストリンなどの糖質混合物、或いは、それらを、イオン交換樹脂などで部分精製したものや高純度に精製したものであってもよい。また、糖質組成物中に環状四糖を含んでいるものであれば、例えば、本発明者等が国際公開ＷＯ ０２／０７２５９４号明細において開示した方法などにより、環状四糖と環状四糖に１個又は２個以上のグルコースの結合した環状四糖の糖質誘導体との混合物に、さらに、例えば、サイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、リゾチームなどの糖転移能を有する酵素の１種又は２種以上を、該酵素の基質となる単糖、オリゴ糖及び／又は多糖の存在下で作用させて、環状四糖と環状四糖に１個又は２個以上のグルコースの結合した糖質誘導体の１個又は２個以上の任意のＯＨ基に、さらに、１個又は２個以上のα−Ｄ−グルコピラノシル基、β−Ｄ−ガラクトピラノシル基、β−Ｄ−キトサミニル基などのグリコシル基の１種又は２種以上を転移させて得られる糖質誘導体、或いは、それを部分精製したものや高純度に精製したものであってもよい。
本発明でいう不飽和化合物とは、炭素鎖に、炭素−炭素間の不飽和結合（以下、単に「不飽和結合」という。）すなわち、二重結合又は三重結合を有する炭化水素、ならびに斯かる炭化水素におげる水素原子を他の元素や基などで置換した誘導体を意味し、脂肪酸類、アルコール類、単純脂質類、複合脂質類、テルペン類、合成高分子類、ビニル類などに属する化合物を挙げることができる。
本発明でいう脂肪酸類とは、カルボキシル基を１又は２個有し、分岐構造、環状構造及び／又はヒドロキシル基を有することもある鎖式化合物ならびにその塩を意味する。具体例としては、オレイン酸、パルミトレイン酸、ネルボン酸、ツズ酸、トウハク酸、バクセン酸などのモノエン型脂肪酸（二重結合を１個有する）、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、プロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエンなどのポリエン型脂肪酸（二重結合を２個以上有する）、リリン酸、キシメニン酸、エリトロゲン酸、クレペニン酸、マイコマイシンなどのアセチレン型脂肪酸（三重結合を１個以上有する）、ムコン酸などのポリエンジカルボン酸型脂肪酸（２個以上の二重結合と２個のカルボキシル基を有する）などが挙げられる。
アルコール類とは、鎖式炭化水素の水素原子を水酸基で置換した化合物を意味し、水酸基を１個有する１価アルコールと、水酸基を２個以上有する多価アルコールとを含む。具体例としては、オレイルアルコールが挙げられる。
単純脂質類とは、構成原子が炭素原子、水素原子及び酸素原子からなり、分子中に脂肪酸類化合物に相当する炭化水素鎖を有する有機化合物を意味し、代表的なものとしては、脂肪酸類化合物とアルコール類化合物との脱水縮合物（エステル）ならびにその相当物が挙げられる。具体的としては、アルコール部分が１価アルコールであるオレイン酸デシル及びオレイン酸オクチルドデシル、アルコール部分がプロピレングリコールであるジオレイン酸プロピレングリコール、アルコール部分がグリセロールであり、脂肪酸部分が上記に例示したような不飽和脂肪酸であって、１分子中に１個、２個又は３個の脂肪酸部分を含むモノアシルグリセロール、ジアシルグリセロールならびにトリアシルグリセロール（以上３種をまとめて「中性脂肪」という場合がある）、アルコール部分がグリセリン重合体であり、脂肪酸部分が上記に例示したような不飽和脂肪酸であるポリグリセリン脂肪酸エステル、アルコール部分がショ糖である（ショ糖脂肪酸エステル）、ショ糖モノオレアート、ショ糖モノリノラート及びショ糖ジオレアートなどが挙げられる。なお、通常「油脂」と呼ばれるものはトリアシルグリセロールを主体とする油溶性物質を含む組成物であり、また、油脂はさらに、常温で液体の「脂肪油」と常温で個体の「脂肪」とに分類されており、これらは通常不飽和化合物を含んでいるので、当然ながら本発明の対象となり得る。
複合脂質類とは、上記で定義した単純脂質類と同じく分子中に脂肪酸類化合物に相当する炭化水素鎖を有する一方、構成原子として炭素原子、水素原子及び酸素原子に加えて、リン原子や窒素原子などを含む有機化合物を意味する。複合糖脂質類は一般に、グリセロリン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴリン脂質、スフィンゴ糖脂質の４種に大別され、さらに本発明においてはこれらの誘導体や部分分解物、例えば、セラミドなども複合脂質類に含まれるものである。具体例としては、グリセロリン脂質としては、レシチン（ホスファチジルコリン）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトールなどが、グリセロ糖脂質としては、分子内に１個又は２個以上のグルコシル基やガラクトシル基などの糖残基を有するジアシルグリセロールなどが、スフィンゴリン脂質としては、スフィンゴミエリンなどが、スフィンゴ糖脂質としては、セレブロシド、セラミドなどがそれぞれ挙げられる。
テルペン類とは、化学式ＣＨ_２＝Ｃ（ＣＨ_３）ＣＨ＝ＣＨ_２で表されるイソプレンを構成単位とする有機化合物を意味し、鎖状構造を有するものと環状構造を有するものがある。また、本発明においては、イソプレン構造を部分的に含む複合テルペンもテルペン類に含まれるものとする。具体例としては、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、スクアレン、テトラテルペン、カロテノイドなどのほか、α−カロテン、β−カロテン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、アブシジン酸、ビタミンＡ、ビタミンＥなどの複合テルペンが挙げられる。
合成高分子類とは、有機化学的に合成された高分子物質を意味し、合成ゴム、熱硬化性樹脂、熱可塑性樹脂に大別される。合成ゴムの多くは不飽和結合を有しているので本発明の有効な対象であり、具体例としては、イソプレンゴム、ブタジエンゴム、スチレン−ブタジエンゴム、ニトリルゴム、ニトリル−イソプレンゴムなどが挙げられる。また、熱硬化性樹脂の例としては不飽和ポリエステル樹脂などが挙げられる。
ビニル類とは、化学式ＣＨ_２＝ＣＨ−で表されるビニル基、化学式ＣＨ_２＝Ｃ＝で表されるビニリデン基若しくは化学式−ＣＨ＝ＣＨ−で表されるビニレン基を有する有機化合物を意味する。具体例としては、エチレン、プロピレン、ブチレン、イソブチレンなどのオレフィン炭化水素、ブタジエン、イソプレンなどのポリエン炭化水素、酢酸ビニル、ラウリン酸ビニルなどの酸ビニルエステル、アクリル酸メチル、アクリル酸エチルなどのアクリル酸エステル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチルなどのメタクリル酸エステル、ラウリルビニルエーテルなどのビニルエーテルのほか、塩化ビニル、塩化ビニリデン、スチレン、アクリロニトリル、アクリルアミド、マレイン酸、ビタミンＤ、ビタミンＫ、さらには、同じ特許出願人による特許第３２３２５１２号公報（特願平１１−３４３２１１号）に開示されたスチリル色素、同じ特許出願人による国際公開ＷＯ ０１／０４０３８２号明細書（国際特許出願ＰＣＴ／ＪＰ００／０８２９８号）に開示されたインドレニン系ペンタメチンシアニン色素、同じ特許出願人による特開２００２−２１２４５４号公報（特願２０００−４１００１号）に開示されたトリメチンシアニン色素、同じ特許出願人による国際公開ＷＯ ０１／０６２８５３号明細書（国際特許出願ＰＣＴ／ＪＰ００／０９２５７号）明細書に開示されたトリメチンシアニン色素、同じ特許出願人による国際公開ＷＯ ０１／０１９９２３号明細書（国際特許出願ＰＣＴ／ＪＰ００／０６３１２号）に開示されたジメチン系スチリル色素、同じ特許出願人による特開２００１−３２１７９号公報（特願２０００−２０３８７３号）に開示されたスチリル色素、同じ特許出願人による特開２００１−３２３１７９号公報（特願２０００−２７５７６４）に開示された非対称型インドレニン系ペンタメチンシアニン色素、同じ特許出願人による国際公開ＷＯ ００／０６１６８７号明細書（国際特許出願ＰＣＴ／ＪＰ００／０２３４９号）に開示された非対称型トリメチン系シアニン色素、化粧品原料基準（日本公定書協会編、『化粧品原料基準 第二版注解 Ｉ』、１９８４年、薬事日報社発行）に収載されている感光素１０１号（別名プラトニン）、感光素２０１号（別名ピオニン）、感光素３０１号（別名タカナール）、感光素４０１号（別名ルミネキス）などが挙げられる。
本発明でいうラジカル化は特定の原因に限定されるものではない。例えば、不飽和化合物は一般に、無触媒下で光照射や加温などにより、また、金属触媒などの適宜の触媒の作用により、さらに、活性酸素などの他のラジカルの作用によりラジカル化することが知られている。
本発明のラジカル反応抑制剤は、不飽和化合物又は不飽和化合物を含む組成物を原材料、添加物、製品などとして扱う分野であって、且つ、不飽和化合物の化学的変化の回避が求められる諸種の分野、例えば、飲食品分野、農林水産分野、化粧品分野、医薬品分野、日用品分野、化学工業分野、染料分野、塗料分野、建材分野、香料分野、化学薬品分野、合成繊維分野、色素分野、感光色素分野、光記録媒体分野ならびに、これらの分野で利用される原材料、又は添加物の製造分野などの極めて広範な分野において有用である。
飲食品分野にあっては、不飽和化合物である脂質とともにタンパク質を含有する組成物が大部分を占めることから、脂質のラジカル化、該ラジカル反応の進行を抑制するとともに、ラジカル反応によって生じる脂質過酸化物がタンパク質を修飾、変性させる過程を抑制することのできる本発明のラジカル反応抑制剤は、タンパク変性抑制剤として飲食品の風味（品質）保持に極めて有利に利用できる。しかも、本発明のラジカル反応抑制剤は、過酸化物を含有する飲食品を摂取した場合であっても、過酸化物によって組織や組織に存在する酵素が修飾、変性することが効果的に抑制されることに加え、環状四糖、又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物が、食物繊維作用や体脂肪の蓄積を抑制する作用なども有していることから、健康食品用の原料としても有利に利用できる。
さらに、本発明のラジカル反応抑制剤は、活性などを失い易い各種生理活性物質又はこれを含む健康食品、医薬品などの安定化剤として有利に適応できる。例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ツモア・ネクロシス・ファクター−α、ツモア・ネクロシス・ファクター−β、マクロファージ遊走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、インターロイキン類などのリンホカイン含有液、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエチン、卵細胞刺激ホルモン、胎盤ホルモンなどのホルモン含有液、ＢＣＧワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤含有液、フィコシアニン、フィコエリトリンをはじめとする色素タンパク質、リパーゼ、エラスターゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼ、補体系などの酵素や血液成分などのペプチド或いはタンパク質の変性を抑制し、それらの生理活性を安定に保持することができるので、高品質の健康食品、医薬品或いは試薬などの製造にも有利に利用できる。
また、特に、組織や細胞レベルのラジカルの発生及びそれに引き続く一連のラジカル反応を抑制することから、生体内で発生するラジカルの生成を伴う炎症反応の抑制剤として、アトピーをはじめとする皮膚炎、湿疹、蕁麻疹、虫刺され、火傷、日焼け、免疫反応を介する各種の炎症性疾患、口内炎、歯肉炎、結膜炎、胃炎、大腸炎、潰瘍性大腸炎、クローン病などの臓器の炎症性疾患などの予防、治療にも有利に利用できる。
本発明のラジカル反応抑制剤は、環状四糖、又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物を、環状四糖の無水物としての換算で約１ｗ／ｗ％（以下、本明細書では特に断らない限り、ｗ／ｗ％を単に％と表記する。）以上、望ましくは、１０％以上、さらに望ましくは３０％以上含有するものが好適である。本発明のラジカル反応抑制剤は、不飽和化合物のラジカルの生成及びラジカル反応の進行の抑制効果を発揮出来ればよく、有効成分である環状四糖、又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物のみで構成されていてもよいし、該糖質とともに、環状四糖の製造工程において共存するグルコース、イソマルトース、マルトース、マルトトリオース、マルトデキストリンなど、環状四糖及び環状四糖の糖質誘導体以外の糖質を含有していてもよい。逆に、本発明のラジカル反応抑制剤を使用する組成物が、アミノ酸などのように分子内にアミノ基を有する物質を含む場合には、グルコースをはじめとする還元性糖類が混在するとメーラード反応などにより該組成物中の有効成分及び／又は該組成物自体の品質低下が特に問題となることが予想される場合には、本発明のラジカル反応剤として、環状四糖を、９８％以上、望ましく９９％以上、さらに望ましくは９９．５％以上含有するものが好適であり、或いは、環状四糖、又は、環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物と共存する還元性の糖質に水素添加して、その還元性を低減したものを使用することも可能である。また、環状四糖は安定な糖質なので、本発明のラジカル反応抑制剤を使用する組成物の品質を低下させない限り、必要に応じて、ラジカルスカベンジャーの他、分散性を高めたり、増量などの目的に応じて、還元性糖質類、非還元性糖質類、糖アルコール類、水溶性多糖類、無機塩類、乳化剤、酸化防止剤及びキレート作用を有する物質から選ばれる１種又は２種以上と併用することも随意である。さらに必要であれば、公知の着色料、着香料、保存料、安定剤などを適量併用することも随意である。このようにして得られたラジカル反応抑制剤は、その形状を問わず、例えば、シラップ、マスキット、ペースト、粉末、結晶、顆粒、錠剤などの何れの形状であってもよい。
また、本発明のラジカル反応抑制剤と併用される非還元性糖類としては、トレハロース（α，α−トレハロース、α，β−トレハロース或いはβ，β−トレハロースの１種又は２種以上の組み合わせ）が、又、糖アルコール類としてはマルチトールが、何れも、優れた脂質の変敗抑制効果や脂質からのアルデヒド類の生成を抑制する効果を有する点から望ましく、α，α−トレハロースは、それらの効果が極めて高いことから、特に望ましい。
本発明のラジカル反応抑制剤は、その各々の使用分野において通常使用される酸化防止方法と組み合わせて用いることにより、単独の使用よりも更に効率的にラジカル反応を抑制することができる。酸化防止方法としては、例えば、抗酸化剤、脱酸素剤、ラジカルスカベンジャー、金属のキレート剤などとの併用や、本発明のラジカル反応抑制剤を含有する組成物を、カプセルへ封入したり、コーティング処理、密封容器での保存、不活性ガスの封入などにより酸素との接触の遮断、さらには、遮光、低温保存などからえらばれる１種又は２種以上を適宜組み合わせて使用することができる。
本発明でいうラジカルスカベンジャーとは、反応中に生じるラジカルを効率的に捉えるために使用される化合物であれば、何れでもよく、ラジカル反応抑制剤の使途に応じて１種又２種以上が、適宜選択される。例えば、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_２誘導体、ヘスペリジン、ルチン或いはその誘導体などのビタミン類、ポリフェノール類などのフラボノイド類、ジブチルヒドロキシトルエン、没食子酸プロピル、ジフェニルピクリルヒドラジル、ガルビノキシル、ハイドロキノン、ハイドロキノン誘導体などを挙げることができ、また、前記不飽和化合物の中からも、例えば、ビタミンＡ、ビタミンＥやそれらの誘導体などに代表されるテルペン類、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などに代表される不飽和脂肪酸のような不飽和化合物を、その用途に応じて適宜使用することも自由である。
本発明でいう、環状四糖、又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物を含有させる、或いは、それらを有効成分とするラジカル反応抑制剤を含有させるとは、当該成分とそれ以外の成分が直接接触できるように、その利用目的に応じて、原料の段階から製品の段階に至るまでの適宜の工程、或いは、既存の製品に対して、例えば、混和、混捏、溶解、融解、分散、懸濁、乳化、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、晶出、固化などの方法で接触させることを意味する。また、本発明で使用する環状四糖、又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物の形態に特に制限はなく、例えば、シラップ、マスキット、固状物及び粉末の１種又は２種以上を適宜選択して使用することができる。
環状四糖、又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物を含有させる量は、不飽和化合物のラジカルの生成抑制及び／又はラジカル反応の進行の抑制効果を発揮できる量であればよく、特に制限はないが、通常、不飽和化合物に対して、環状四糖の無水物としての換算で約０．０１％以上約９９．９％未満、さらに好ましくは、約１．０％以上約９０％未満をできるだけ均一に含有せしめるのが好適である。通常０．０１％未満では、不飽和化合物のラジカルの生成及びラジカル反応の進行を効果的に抑制するには不充分である。
以下、実験例に基づいて環状四糖、又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物による、不飽和化合物のラジカルの生成抑制及び／又はラジカル反応の進行の抑制についてより詳細に説明する。
実験１−１ 環状四糖及び環状四糖の糖質誘導体の調製
特許文献３に開示された実施例２の方法に準じて、固形分あたり環状四糖６１．７％、環状四糖の糖質誘導体５．１％を含有するシラップを調製した。同様に、特許文献３に開示された実施例３の方法に準じて、タピオカ澱粉を原料として調製した環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物を含有するシラップを、特許文献３の実施例５に記載の方法に準じて精製、濃縮、乾燥・結晶化して、純度９８．５％の環状四糖５含水結晶を得た。さらに、前記環状四糖５含水結晶をさらに、特許文献３に開示された実験３１或いは実験３２の方法に準じて乾燥し、環状四糖１含水結晶粉末及び環状四糖無水結晶粉末を調製した。
実験１−２ ラジカル生成抑制に及ぼす環状四糖の影響
ラジカル生成抑制に及ぼす環状四糖の影響を調べるための実験は次のようにして行った。１ｍＭ過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）溶液５０μｌに順次、８９ｍＭ５，５−ジメチル−１−ピロリン−オキシド（ＤＭＰＯ、和光純薬株式会社販売）溶液５０μｌ、実験１−１で調製した環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物を含有するシラップ、環状四糖５含水結晶、環状四糖１含水結晶或いは、環状四糖無水結晶を、各々環状四糖としての換算で１５ｍＭ、３８ｍＭ、７５ｍＭ、１５０ｍＭとなるように調製した水溶液５０μｌ又は蒸留水５０μｌ、各１ｍＭの硫酸鉄、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−５酢酸（ＤＴＰＡ、和光純薬株式会社販売）溶液５０μｌを添加混合して反応を開始させ、電子スピン共鳴スペクトル（ＥＳＲ）測定用セルに入れて、測定装置にセットして、反応開始一定時間後のヒドロキシラジカルの生成量を測定した。なお、陽性対照として、環状四糖に代えて、ラジカル生成抑制効果のあることが知られているα，α−トレハロース（（株）林原商事販売、商品名『トレハ』）を使用して、同様の測定を行った。ＥＳＲの測定には（株）日本電子製装置「Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ ＭｏｎｉｔｏｒＪＥＳ−ＦＲ３０」を用い、ヒドロキシラジカルの生成量は、スピントラップ剤として使用した５，５−ジメチル−１−ピロリン−オキシド−ＯＨ（ヒドロキシラジカル）に特有の４つのシグナルピークの内、測定開始後最初に観察されるピークと、ＪＥＳ−ＦＲ３０装置に装着されている外部標準のＭｎ^２＋のピークの高さとの比を求めて、相対値として表１に示す。なお、環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物を含有するシラップ、環状四糖５含水結晶、環状四糖１含水結晶或いは、環状四糖無水結晶は何れも同様の５，５−ジメチル−１−ピロリン−オキシド−ＯＨ（ヒドロキシラジカル）に特有の４つのシグナルピークを示したので、環状四糖５含水結晶を使用した場合の結果のみを示す。

結果
ヒドロキシラジカルの生成は環状四糖の添加量の増加とともに減少し、糖質無添加の場合と比較して、７５ｍＭ濃度の時で約８％の生成率となり、１５０ｍＭ濃度では約４％の生成率となった。α，α−トレハロースの場合も、同じ濃度でのヒドロキシラジカルの生成率は、ほぼ同じ値を示した。しかし、３８ｍＭ以下の低い濃度範囲で、その生成率は、糖質無添加の場合と比較して、環状四糖を添加した場合には、１５ｍＭ濃度で約３４％、３８ｍＭ濃度で約９％となって、ヒドロキシラジカルの生成が強く抑制されたのに対して、α，α−トレハロースを添加した場合には、５ｍＭ濃度で約６６％、３８ｍＭ濃度で２３％となり、環状四糖を添加した場合に比して２倍以上のヒドロキシラジカルの生成率となった。この結果より、環状四糖のヒドロキシラジカル生成抑制効果はα，α−トレハロースよりも明らかに大きいことが判明した。
実験１−３ 低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）酸化抑制に及ぼす環状四糖の影響
低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）酸化抑制に及ぼす環状四糖の影響を調べるための実験は次のようにして行った。すなわち、０．５ｍｇ／ｍｌ低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）−リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）２．５ｍｌと、実験１−１で調製した環状四糖５含水結晶、環状四糖１含水結晶、環状四糖無水結晶の何れかの１００ｍＭＰＢＳ溶液２．５ｍｌ、或いは、環状四糖無添加のＰＢＳ溶液２．５ｍｌとを混合後、１００ｍＭ２，２′−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液５０μｌを添加、混合し、３７℃で反応を行った。反応は、経時変化を求めるために、２４０分間継続した。各反応液は、反応開始０、３０、６０、１２０、１８０、２４０分のものについて、ＬＤＬ酸化物の増加に比例して増大する吸光度（２３４ｎｍ）を測定した。実験により得られたＬＤＬ酸化物の量（２３４ｎｍ吸光度）の経時変化を表２に示す。なお、環状四糖５含水結晶、環状四糖１含水結晶或いは、環状四糖無水結晶は何れも同様の酸化抑制パターンを示したので、環状四糖５含水結晶を使用した場合の結果のみを示す。また、０．５ｍｇ／ｍｌ低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）のＰＢＳ溶液２．５ｍｌと、実験１−１で調製した環状四糖５含水結晶を２ｍＭ、１０ｍＭ或いは２０ｍＭとなるように溶解したＰＢＳ溶液２．５ｍｌ、或いは、環状四糖無添加のＰＢＳ溶液２．５ｍｌとを混合後、同様に２３４ｎｍの吸光度を測定して、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）のＡＡＰＨ酸化に対する環状四糖の影響を調べた。環状四糖の添加量と反応１２０分後のＬＤＬの酸化量（２３４ｎｍ吸光度）の関係を表３に示す。

表２に示すように、環状四糖無添加（０ｍＭ）の系および環状四糖添加（５０ｍＭ）の系ともに、反応開始後６０分間はＬＤＬの酸化物が経時的に増加し、その後はほぼ平衡に達することが明らかとなった。２４０分経過時でのＬＤＬ酸化物の生成は、糖質無添加の系と比較して、環状四糖を添加した場合には、約２３％となり、強い抑制が認められた。また、表３から明らかなように、ＬＤＬ酸化物の生成は、環状四糖の添加量の増加とともに生成が減少し、糖質無添加の場合と比較して、１０ｍＭの添加では約１３％にまで抑制された。これらの結果より、環状四糖はＬＤＬの酸化を効果的に抑制することが判明した。
実験１−４ リノール酸のラジカル酸化に及ぼす環状四糖の影響
リノール酸のラジカル酸化に及ぼす環状四糖の影響を調べるための実験は、次のようにして行った。
リノール酸酸化に及ぼす環状四糖の影響の測定
１１．７ｍｇ／ｍｌリノール酸−エタノール溶液１ｍｌ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍｌ、１００ｍＭ２，２，−アゾビス（２−アミジノプロパン）２塩酸塩（ＡＡＰＨ）溶液１ｍｌ、実験１−１で調製した環状四糖５含水結晶の２００ｍＭＰＢＳ（５０ｍＭ、ｐＨ７．２）溶液２ｍｌを混合し、３７℃で静置し、混合後、０、１、２、６時間で試験標品をサンプリングし、該試験標品中に生成した共役ジエン量及びチオバルビツール酸との反応生成物（ＴＢＡＲＳ）量を測定した。陰性対照として、環状四糖無添加のＰＢＳを使用して同様の測定を行った。共役ジエン量は、岡村らの方法（『ジャーナル オブ アグリカルチャラル アンド フード ケミストリー』（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第４２巻、１６１２頁、（１９９４年））に従って、２３４ｎｍの吸光度を測定することにより求めた。ＴＢＡＲＳ量は、大河原らの方法（『ジャーナル オブ リピッド リサーチ』（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１９巻、１０５３頁（１９７８年））に従って、サンプリングした各試験標品をチオバルビツール酸と反応させた後、５３２ｎｍの吸光度を測定することにより求めた。なお、ＴＢＡＲＳ生成量は、１，１，３，３−テトラエトキシプロパンをエタノールで、１０、５０、１００μｇ／ｍｌに希釈した溶液を、試験標品と同様にチオバルビツール酸と反応させて、その吸光度を測定し、生じるＴＢＡＲＳ量（計算値）と、測定した吸光度から作成した検量線を用いて、試験標品中のＴＢＡＲＳ量を求めた。また、共役ジエン生成量は、前記『ジャーナル オブ アグリカルチャラル アンド フード ケミストリー』、第４２巻、第１６１２頁（１９９４年）に記載された、分子のモル吸光計数に基づき、以下の実験により得られた吸光度から計算により求めた。生成する共役ジエン生成量の測定結果を表４に、ＴＢＡＲＳ生成量の測定結果を表５に示す。

結果
表４から明らかなように、共役ジエンの生成は、反応開始後６時間で、環状四糖の添加では、糖質無添加の場合と比較して、約４０％にまで抑制された。また、表５の結果から明らかなように、ＴＢＡＲＳの生成は、反応開始後６時間で、環状四糖の添加では、糖質無添加の場合と比較して、約３０％にまで抑制された。これらの結果より、環状四糖は、リノール酸のラジカル酸化による共役ジエン生成ならびにＴＢＡＲＳ生成を効果的に抑制することが判明した。
実験１−５ 脂質過酸化物によるタンパク質或いはリジン修飾抑制に及ぼす環状四糖及び他の糖質の影響
脂質のラジカル反応により生成する代表的な脂質過酸化物（２，４−デカジエナール及びマロンジアルデヒド（ＭＤＡ））によるタンパク質或いはリジンの修飾、変性に及ぼす各種糖質の影響を、環状四糖、マルチトール、α，α−トレハロース、ショ糖或いはそれらの混合物を使用して調べるための実験を、該脂質過酸化物がタンパク質或いはリジンと反応して生じるアルデヒド付加体（タンパクカルボニル及び酸化脂質／アミノ酸反応産物（ＯＬＡＡＲＰｓ））の生成を指標にして、次のようにして行った。なお、実験は、溶液中の糖質の総モル濃度が一定となるよう各種糖質溶液を調製して行った。
試験用の各種糖質溶液の調製
５ｍｌのＰＢＳ（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）あたり、実験１−１で調製した環状四糖５含水結晶５００ｍｇ、無水結晶マルチトール（（株）林原商事販売、商品名『マビット』）２５０ｍｇ、含水結晶α，α−トレハロース（（株）林原商事販売、商品名『トレハ』）２５０ｍｇ或いはショ糖（試薬特級 和光純薬販売）２５０ｍｇを溶解して、試験用糖質溶液とした。２種の糖質を組み合わせた試験には、５ｍｌのＰＢＳあたり、環状四糖２５０ｍｇ及びその他の糖質１２５ｍｇを、３種類の糖質（環状四糖、含水結晶α，α−トレハロース、無水結晶マルチトール）を組み合わせた試験では、環状四糖１６６．７ｍｇ及びその他の糖質を各々８３．３ｍｇを、それぞれ溶解して試験用糖質溶液を調製した。陰性対照としてＰＢＳを使用した。
試験方法
調製した各試験用糖質溶液及び陰性対照５ｍｌに対して、各々、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）又はＬ−リジンを１０ｍｇ添加して溶解した後、脂質過酸化物として２，４−デカジエナール又はマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）２５μｇを添加して、３７℃で２４時間反応した。反応終了後、生成したアルデヒド付加体のタンパクカルボニル及び酸化脂質／アミノ酸反応産物（ＯＬＡＡＲＰｓ）を比色法により定量した。ＢＳＡと脂質過酸化物の反応結果を表６に、Ｌ−リジンと脂質過酸化物の反応結果を表７に示す。なお、タンパクカルボニル量及びＯＬＡＡＲＰｓ量は、バイオケム．バイオフィジ．アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）、第１２５８号、第３１９〜３２７頁（１９８５年）に記載された、それぞれの分子のモル吸光計数に基づき、以下の実験により得られた吸光度から計算により求めた。
タンパクカルボニル量の測定方法
ＢＳＡを溶解した試験用糖質液或いは陰性対照と、脂質過酸化物との反応終了後、該溶液２ｍｌに１２．５ｍＭジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）／２．５Ｎ塩酸溶液２ｍｌを加え、室温で１時間放置し、これに３０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）２ｍｌを加え０℃で１時間放置した。１０，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により沈殿物を得、これをエタノール／酢酸エチル（１：１）２ｍｌで４回洗浄し、６Ｍグアニジン塩酸塩／２０ｍＭＮａＰｉ／トリフルオル酢酸（ＴＦＡ．ｐＨ２．３）２ｍｌを加え、３７℃で３０分間放置後、吸光度（３７０ｎｍ、ε＝２２，０００Ｍ^−１ｃｍ^−１）を測定した。また、Ｌ−リジンを溶解した各試験用糖質液液或いは陰性対照と、脂質過酸化物との反応終了後、該溶液２ｍｌにジエチルエーテル２ｍｌを加え未反応の脂質過酸化物を除去し、これに、１２．５ｍＭＤＮＰＨ／２．５Ｎ塩酸溶液２ｍｌを加え、室温で１時間放置後、吸光度（３７０ｎｍ、ε＝２２，０００Ｍ^−１ｃｍ^−１）を測定した。
ＯＬＡＡＲＰｓの測定方法
ＢＳＡを溶解した試験用糖質液或いは陰性対照と脂質過酸化物を反応後、該溶液１ｍｌに、エーリッヒ試薬（ジメチルベンズアルデヒド２００ｍｇ、エタノール２ｍｌ、３．５Ｎ塩酸８ｍｌ）１５０μｌを加え、４５℃で３０分間放置した。これに３０％トリクロロ酢酸を６００μｌ加え、０℃で１時間放置し、１０，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により沈殿物を得、これをエタノール／酢酸エチル（１：１）２ｍｌで４回洗浄し、６Ｍグアニジン塩酸塩／２０ｍＭＮａＰｉ／ＴＦＡ（ｐＨ２．３）１．５ｍｌを加え、３７℃で３０分間放置後、吸光度（５８０ｎｍ、ε＝３５，０００Ｍ^−１ｃｍ^−１）を測定した。また、Ｌ−リジンを溶解した試験用糖質液或いは陰性対照と脂質過酸化物の反応後、該溶液１ｍｌにジエチルエーテル２ｍｌを加え未反応の脂質過酸化物を除去し、エーリッヒ試薬１５０μｌを加え、４５℃で３０分間放置した。これに、１２．５ｍＭＤＮＰＨ／２．５Ｎ塩酸溶液２ｍｌを加え、４５℃で３０分間放置後、吸光度（５８０ｎｍ、ε＝３５，０００Ｍ^−１ｃｍ^−１）を測定した。

結果
表６から明らかなように、環状四糖は、脂質過酸化物の２，４−デカジエナール或いはマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の添加によるＢＳＡからのタンパクカルボニル生成を、糖質無添加に比して、２，４−デカジエナール或いはＭＤＡの何れの場合にも約４５％に抑制した。環状四糖に代えてα，α−トレハロース或いはマルチトールを添加した場合にも抑制が認められたものの、その程度は、環状四糖に比して低いものであった。また、２，４−デカジエナール或いはＭＤＡの添加によるＢＳＡからのＯＬＡＡＲＰｓの生成は、環状四糖の添加では、糖質無添加の場合に比して、２，４−デカジエナールでは約６９％に、ＭＤＡでは約８０％に抑制された。ＬＡＡＲＰｓの生成は、α，α−トレハロース或いはマルチトールの添加でも抑制が認められ、その程度は、２，４−デカジエナールの添加では環状四糖とほぼ同程度であり、ＭＤＡの添加では、環状四糖よりも、α，α−トレハロース或いはマルチトールを添加した場合の方が大きかった。一方、ショ糖は、前記アルデヒド付加体の生成を殆ど抑制せず、逆に、ＯＬＡＡＲＰｓ生成は、糖質無添加の場合よりも増加した。２種或いは３種の糖質を混合した場合には、何れも、無添加に比して、ＢＳＡからのタンパクカルボニル生成及びＯＬＡＡＲＰｓ生成が抑制されており、ショ糖と組み合わせた場合でも、これらアルデヒドの付加体の産生が増強されることはなかった。
表７から明らかなように、２，４−デカジエナール或いはＭＤＡの添加による、Ｌ−リジンからのタンパクカルボニルの生成は、環状四糖の添加により、糖質無添加の場合に比して、２，４−デカジエナールでは約４８％に、ＭＤＡでは約６６％に抑制された。Ｌ−リジンからのＯＬＡＡＲＰｓの生成は、環状四糖の添加では、糖質無添加の場合に比して、２，４−デカジエナールでは約６７％に、ＭＤＡでは３９％に抑制された。また、２，４−デカジエナール或いはＭＤＡの添加によるＬ−リジンからのタンパクカルボニル及びＯＬＡＡＲＰｓの生成は、環状四糖に代えてα，α−トレハロース及びマルチトールを添加した場合にも抑制が認められ、その程度は、マルチトールを添加した場合に、２，４−デカジエナールの添加でのタンパクカルボニルの生成の抑制が、使用した糖質中で最も高かった以外は、環状四糖とほぼ同程度か、それよりも少し低かった。一方、ショ糖は、前記ＢＳＡの場合と同様に、アルデヒド付加体であるタンパクカルボニルやＯＬＡＡＲＰｓの生成に対して、殆ど抑制効果を示さなかったものの、これらアルデヒド付加体の生成を増強することもなかった。２種或いは３種の糖質を混合したものを使用した場合には、何れもリジンからのタンパクカルボニル生成及びＯＬＡＡＲＰｓ生成が抑制されており、糖質の組み合わせにより、これらアルデヒドの付加体の産生が増強されることはなかった。これらの結果より、環状四糖は不飽和化合物である脂質からラジカル反応により生じる脂質過酸化物によるＢＳＡ或いはＬ−リジンの修飾、変性を効果的に抑制することが判明した。また、他の糖質と併せて使用した場合にも、脂質過酸化物による修飾、変性を増強しないことが判明した。
実験１−６ ラジカルによる小腸粘膜障害に対する環状四糖の影響
ラジカルによる小腸粘膜障害に対する環状四糖の影響のモデル系として、２，２−アゾビス（２−アミジノプロパン）２塩酸塩（ＡＡＰＨ）によるラット小腸粘膜酵素液の酸化に対する環状四糖の影響を検討した。
ラット小腸粘膜の酸化に及ぼす環状四糖の影響の測定
ラット小腸粘膜アセトン粉末（シグマ社製）２ｇに５０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．２）２０ｍｌを添加し、氷中でホモジナイズし、１０，０００ｒｐｍ１０分間遠心分離した上清を、ラット小腸粘膜酵素液（１０ｍｇタンパク質／ｍｌ）として使用した。ラット小腸粘膜酵素液０．５ｍｌ、１００ｍＭＡＡＰＨ溶液０．５ｍｌ、実験１−１で調製した環状四糖５含水結晶の２００ｍＭ水溶液０．５ｍｌを混合し、３７℃で２時間、６時間反応後の共役ジエン生成量及び、６時間反応後のＴＢＡＲＳ生成量を測定した。表８に、小腸粘膜酵素液ラジカル酸化による共役ジエン生成量の測定結果を、表９に、ＴＢＡＲＳ生成量の測定結果を示す。
ラット小腸粘膜酵素の酸化に及ぼす環状四糖の影響の測定
前記ラット小腸粘膜酵素液１ｍｌ、１００ｍＭＡＡＰＨ溶液１ｍｌ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍｌ、実験１−１で調製した環状四糖５含水結晶の４００ｍＭ水溶液１ｍｌを混合し、３７℃で２時間静置した後、スクラーゼ及びマルターゼの活性を測定した。表１０にラット小腸粘膜酵素液のラジカル酸化によるスクラーゼ及びマルターゼの活性低下の測定結果を示す。
スクラーゼ活性の測定法
５０ｍＭマレイン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）に１％となるようにショ糖を溶解した溶液０．５ｍｌに、ＡＡＰＨ−ラット小腸粘膜酵素反応液０．１ｍｌを添加し、３７℃で３０分間反応後遊離するグルコース量をＧＯＤ法により測定した。酵素活性は、ショ糖より３７℃で１分間に１μｍｏｌのグルコースを遊離する酵素量を１単位（Ｕ）とした。
マルターゼ活性の測定法
５０ｍＭマレイン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）に１％となるようにマルトースを溶解した溶液０．５ｍｌに、ＡＡＰＨ−ラット小腸粘膜酵素反応液０．０５ｍｌを添加し、３７℃で３０分間反応後遊離するグルコース量をＧＯＤ法により測定した。酵素活性は、マルトースより３７℃で１分間に２μｍｏｌのグルコースを遊離する酵素量を１単位（Ｕ）とした。

表８或いは表９から明らかなように、環状四糖は、ＡＡＰＨによるラット小腸酵素液の酸化により生成する共役ジエン及びＴＢＡＲＳを、実験１−４のリノール酸のラジカル化の場合と同様に効果的に抑制した。また、表１０から明らかなように、環状四糖は、ＡＡＰＨによるラット小腸酵素液の酸化によるスクラーゼ及びマルターゼの活性低下を効果的に抑制し、環状四糖が、ラジカルの生成及びラジカル反応の進行のみでなく、ラジカル反応により生成した過酸化物により、共存する酵素タンパク質が修飾、変性を受けることを抑制することから、環状四糖は、ラジカル或いはラジカル反応による小腸粘膜障害を抑制することが示唆された。
以上の実験結果から、本発明を応用し、環状四糖、又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物を、ラジカルの生成及びラジカル反応により分解が進行し、保存中に異臭の発生、退色、硬化、分解、変性などの品質劣化や機能低下が生じる恐れのある不飽和化合物を含む物質に含有させることにより、ラジカルの生成及びラジカル反応の進行を抑制することができることが判明した。さらに、環状四糖、又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物は、不飽和化合物がラジカル化されて生じる過酸物がタンパク質やアミノ酸を修飾、変性させることを抑制することができる。特に、環状四糖、又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物は、ラジカルによる細胞溶解（自己溶解を含む）や組織の障害を抑制することから、ラジカルの発性により増悪する、火傷、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、潰瘍性大腸炎、胃炎、腸炎などの炎症性疾患の予防剤、治療剤や移植時などの臓器保存剤としても有利に利用できる。このように、本発明の環状四糖、又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物を有効成分として含有するラジカル反応抑制剤は、不飽和化合物を含む物質の安定化に大きく寄与できることから、工業的には不飽和化合物を含有する食品分野、化粧品分野、医薬品分野、化学工業品分野などの広範な分野での製品の生産、輸送、保存などにおいて極めて有利に利用できる。
以下に、本発明のラジカル反応抑制剤及び該ラジカル反応抑制剤を含有せしめた組成物の例具体的に挙げて説明する。しかし、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１ ラジカル反応抑制剤
特許文献３に開示された実施例２の方法に準じて、馬鈴薯澱粉から、濃度８０％、固形物当たり、グルコース０．６％、イソマルトース１．５％、マルトース１２．３％、環状四糖６３．５％、環状四糖の糖質誘導体５．２％及びその他の糖質１６．９％を含有する環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物を含有するシラップを調製した。本品は、加工飲食品、化粧品、医薬部外品、医薬品、飼料、餌料、化学工業品を始めとする、ラジカルの生成及びラジカル反応を起こして分解が進行し、保存中に異臭の発生、退色、硬化、分解、変性などの品質劣化や機能低下が生じ易い不飽和化合物を含有する組成物に含有させることにより、ラジカルの生成及びラジカル反応の進行を抑制し、安定に保つためのラジカル反応抑制剤として好適である。
実施例２ ラジカル反応抑制剤
特許文献３に開示された実施例９に記載された方法に準じて（α−グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼ処理はせず。）、トウモロコシ澱粉から、濃度７３％、固形物当たり、グルコース４．１％、マルトース、イソマルトースなどの二糖類８．１％、マルトトリオースなどの三糖類４．０％、環状四糖３６．５％、環状四糖の糖質誘導体１７．６％、その他の糖質２９．７％を含有する環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物を含有するシラップを調製した。本品は、加工飲食品、化粧品、医薬部外品、医薬品、飼料、餌料、化学工業品を始めとする、ラジカルの生成及びラジカル反応を起こして分解が進行し、保存中に異臭の発生、退色、硬化、分解、変性などの品質劣化や機能低下が生じ易い不飽和化合物を含有する組成物に含有させることにより、ラジカルの生成及びラジカル反応の進行を抑制し、安定に保つためのラジカル反応抑制剤として好適である。
実施例３ ラジカル反応抑制剤
特許文献３に開示された実施例４の方法に準じて、コーンスターチを原料として、実験１−１の方法と同様方法により、タピオカ澱粉を原料として調製した環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物を含有するシラップを、特許文献３の実施例６及び実施例７記載の方法に準じて精製、濃縮、乾燥・結晶化して、純度９９．６％の環状四糖５含水結晶を得た。本品は、加工飲食品、化粧品、医薬部外品、医薬品、飼料、餌料、化学工業品を始めとする、ラジカルの生成及びラジカル反応を起こして分解が進行し、保存中に異臭の発生、退色、硬化、分解、変性などの品質劣化や機能低下が生じ易い不飽和化合物を含有する組成物に含有させることにより、ラジカルの生成及びラジカル反応の進行を抑制し、安定に保つためのラジカル反応抑制剤として利用することができる。
前記環状四糖５含水結晶をさらに、特許文献３に開示された実験３１或いは実験３２の方法に準じて乾燥し、環状四糖１含水結晶粉末及び環状四糖無水結晶粉末を調製した。これらの環状四糖は、環状四糖五含水結晶粉末と同様にラジカル反応抑制剤として有利に利用できるだけでなく、ラジカル酸化を受けやすい、揮発性香料、有機色素、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥなどの脂溶性ビタミンなどを、ラジカル酸化を抑制しつつ、常温、常圧で粉末化するための乾燥剤としても極めて有利に利用できる。
実施例４ ラジカル反応抑制剤
実施例３で得た環状四糖５含水結晶６０重量部に対して、市販の無水結晶マルチトール（（株）林原商事販売、商品名『マビット』）を４０重量部を混合し、粉末混合物を得た。本品は、加工飲食品、化粧品、医薬部外品、医薬品、飼料、餌料、化学工業品を始めとする、ラジカルの生成及びラジカル反応を起こして分解が進行し、保存中に異臭の発生、退色、硬化、分解、変性などの品質劣化や機能低下が生じ易い不飽和化合物を含有する組成物に含有させることにより、ラジカルの生成及びラジカル反応の進行を抑制し、安定に保つためのラジカル反応抑制剤として利用することができる。
実施例５ ラジカル反応抑制剤
実施例３で得た環状四糖５含水結晶５０重量部に対して、市販の食品級含水結晶α，α−トレハロース（（株）林原商事販売、商品名『トレハ』）５０重量部を混合し、粉末混合物を得た。本品は、加工飲食品、化粧品、医薬部外品、医薬品、飼料、餌料、化学工業品を始めとする、ラジカルの生成及びラジカル反応を起こして分解が進行し、保存中に異臭の発生、退色、硬化、分解、変性などの品質劣化や機能低下が生じ易い不飽和化合物を含有する組成物に含有させることにより、ラジカルの生成及びラジカル反応の進行を抑制し、安定に保つためのラジカル反応抑制剤として利用することができる。また、本品は、直接、或いは、シュガーエステルなどを添加して、造粒、さらには、打錠して、顆粒、錠剤の形態での利用も容易である。
実施例６ ラジカル反応抑制剤
市販の食品級含水結晶α，α−トレハロース（（株）林原商事販売、商品名『トレハ』）を、さらに、水に溶解し、６０℃に加熱しながら、減圧濃縮して、トレハロースの濃度が７５％の溶液を調製し、室温に放置して結晶を析出させ、該結晶を水で洗浄する操作を２回くり返した後、乾燥、粉砕して調製した、純度９９．８％の含水結晶α，α−トレハロース粉末５０重量部と、実施例３で得た環状四糖５含水結晶５０重量部とを均質混合して、粉末混合物を得た。本品は、加工飲食品、化粧品、医薬部外品、医薬品、飼料、餌料、化学工業品を始めとする、ラジカルの生成及びラジカル反応を起こして分解が進行し、保存中に異臭の発生、退色、硬化、分解、変性などの品質劣化や機能低下が生じ易い不飽和化合物を含有する組成物に含有させることにより、ラジカルの生成及びラジカル反応の進行を抑制し、安定に保つためのラジカル反応抑制剤として利用することができる。本品は、高純度の環状四糖及びα，α−トレハロースで構成されているので、反応性が極めて低く、安定なので、特に、分子内にアミノ基を含み、還元性の糖とメーラード反応を起こし、その品質に劣化を来すような組成物に対して好適に使用できる。また、本品は、直接、或いは、シュガーエステルなどを添加して、造粒、さらには、打錠して、顆粒、錠剤の形態での利用も容易である。
実施例７ ラジカル反応抑制剤
実施例１で得た環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物を含有するシラップ７０重量部に対して、アスコルビン酸２重量部、ビタミンＥ１重量部、グリセリン脂肪酸エステル０．５重量部を含有する組成物を調製した。本品は、加工飲食品、化粧品、医薬部外品、医薬品、飼料、餌料、化学工業品を始めとする、ラジカルの生成及びラジカル反応を起こして分解が進行し、保存中に異臭の発生、退色、硬化、分解、変性などの品質劣化や機能低下が生じ易い不飽和化合物を含有する組成物に含有させることにより、ラジカルの生成及びラジカル反応の進行を抑制し、安定に保つためのラジカル反応抑制剤として利用することができる。
実施例８ ラジカル反応抑制剤
実施例３で得た環状四糖５含水結晶７０重量部に対して、アスコルビン酸２−グルコシド（（株）林原生物化学研究所販売）２重量部、酵素処理ルチン２重量部（東洋精糖株式会社販売、商品名『αＧルチン』）、を混合し、粉末混合物を得た。本品は、加工飲食品、化粧品、医薬部外品、医薬品、飼料、餌料、化学工業品を始めとする、ラジカルの生成及びラジカル反応を起こして分解が進行し、保存中に異臭の発生、退色、硬化、分解、変性などの品質劣化や機能低下が生じ易い不飽和化合物を含有する組成物に含有させることにより、ラジカルの生成及びラジカル反応の進行を抑制し、安定に保つためのラジカル反応抑制剤として利用することができる。
実施例９ 魚肉練製品
水晒ししたスケトウダラの生肉４，０００重量部に対し、実施例１で調製したラジカル反応抑制剤２００重量部、クエン酸ナトリウム５重量部を加えて、スリ身を製造し、−２０℃で凍結して冷凍スリ身を製造した。冷凍スリ身を９０日間−２０℃で冷凍保存後に解凍し、グルタミン酸ナトリウム８０重量部、馬鈴薯澱粉２００重量部、氷水３００重量部、トリポリリン酸ナトリウム８重量部、食塩１２０重量部及びマルチトール１０重量部とを溶解しておいた水溶液１００重量部を加えて擂漬し、約１２０ｇずつを定形して板付した。これらを、３０分間で内部の品温が約８０度になるように蒸し上げた。次いで、室温で放冷したのち、４℃で２４時間放置して魚肉練製品を得た。スケトウダラの冷凍スリ身は、環状四糖、及び／又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物がタンパク質に対して優れた冷凍耐性を付与するため、冷凍保存後も、鮮度が十分に保持されており、それを原料とした本品は、風味良好、肌面が細やかで、艶やかな光沢を有していた。しかも、本品に含まれる脂質をはじめとする不飽和化合物の安定性が、環状四糖、及び／又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物により高められているばかりでなく、ラジカル化した不飽和化合物の過酸化物によるタンパク質やアミノ酸の修飾、変性も抑制されるので、保存安定性にも優れているという特徴がある。
実施例１０ 生鮮魚介類の鮮度保持剤
実施例５で調製した環状四糖とα，α−トレハロースを等量混合した粉末混合物１００重量部と、クエン酸（結晶）１０重量部、酵素処理ルチン１重量部、ポリフェノール２重量部とを均一に混合し、粉末状の生鮮魚介類の鮮度保持剤を得た。本品は、環状四糖が、魚の油脂成分のラジカル反応を抑制することに加えて、環状四糖、α，α−トレハロース、ポリフェノール、有機酸、酵素処理ルチンが相乗的に作用して、魚肉の冷凍変性を抑制することから、生鮮魚介類及びその冷凍品の鮮度保持剤として好適である。
本品４００重量部を１２Ｌの海水に溶解し、さらに、細かく砕いた市販の氷４ｋｇを入れて冷却した。この水溶液に、漁港で水揚げした直後のアジ５ｋｇを、浸漬処理し、１０時間後に取り出して、体表及び鰓の状態を観察したところ、水揚げ直後と変わらない外観を呈していた。さらに、これを密封容器に入れて、−２０℃の冷凍庫で１０日間保存後、解凍してその状態を観察したところ、アジの体表は全く変化が起きておらず新鮮な状態を保っていた。
実施例１１ 米飯
水洗いして水切りした米３００重量部に水を米の１．２５倍量と実施例４で調製したラジカル反応抑制剤１３．５重量部を混合して浸漬後、家庭用炊飯器にて炊飯して米飯を得た。本品は、米飯中の脂質をはじめとする不飽和化合物の安定性が環状四糖により高められているばかりでなく、ラジカル化した不飽和化合物の過酸化物によるタンパク質やアミノ酸の修飾、変性も抑制されるので、不快な米糠臭の発生が抑制され、比較的長期間炊飯直後の好ましい風味が保持されるという特徴がある。また、環状四糖は、澱粉の老化防止効果、タンパク質の冷蔵・冷凍変性防止効果を併せ持っているので、本品は、老化や冷凍変性の発生するチルド冷蔵用や冷凍保存用の米飯として有利に利用できる。
実施例１２ 粉末油脂
大豆サラダ油１００重量部及びレシチン１重量部に水１０重量部を室温で混合した後、これに実施例５のラジカル反応抑制剤１００重量部を混合して粉末化し、篩にかけて粉末油脂を得た。本品における不飽和化合物は、環状四糖によりラジカルの生成及びラジカル反応の進行が抑制され、又、α，α−トレハロースが不飽和化合物と会合物を形成することによって、その安定性が高められているうえ、種々の食品素材とともに配合された際に、その配合される食品素材における不飽和化合物の安定化をも達成することができ、また、食品素材がタンパク質やアミノ酸を含有するものにあっては、ラジカル化した不飽和化合物の過酸化物によるタンパク質やアミノ酸の修飾、変性も抑制されるので、マヨネーズ、ドレッシングなどの調味材料、高カロリー経管栄養剤、配合飼料などに有利に利用できる。
実施例１３ サラダドレッシング
水４０．８質量部、蒸留ホワイトビネガー２０質量部、植物油１５質量部、砂糖５質量部、食塩２質量部、ガーリックパウダー１．０質量部、タマネギパウダー０．７質量部、グランドホワイトペッパー０．１質量部、キサンタンガム０．３質量部、ソルビン酸カリウム０．１質量部、実施例３で調製した粉末状のラジカル反応抑制剤１５質量部を混合してサラダドレッシングを調製した。本品は、環状四糖によりラジカル反応が抑制されるので、油性成分のの劣化や、ガーリックパウダー、タマネギパウダー、グランドホワイトペッパーなどの風味味の劣化が抑制されるので、長期間、その品質が安定に保持される。また、本品は、環状四糖が、脂肪の代替品として、脂肪のもつクリーム様の、豊かな口当たりを付与するので、植物油を通常のドレッシングの半量しか使用してしていないにも関わらず、ドレッシングの好ましさを失わず、脂肪含有時よりも著しく低カロリーのドレッシングである。しかも、本品は、その水相に環状四糖を含有しているので、砂糖のみを含有するドレッシングに比して、油相との分離が早く、しかも、その分離度が高い、高品質のサラダドレッシングである。
実施例１４ クリーム
シア分別脂（融点３８℃）８０部と菜種ヤシ油（融点３５℃）２０部との混合油脂３５質量部、大豆レシチン（ＨＬＢ３）０．３質量部、モノグリセリン脂肪酸エステル（ＨＬＢ３）０．０３質量部、ヘキサグリセリンペンタエステル（ＨＬＢ４）０．１５質量部、水６０質量部、脱脂粉乳４質量部、リン酸のアルカリ金属塩０．１質量部を使用し、常法により、予備乳化を行い、７０Ｋｇ／ｃｍ^２の加圧条件で均質化後、１４５℃、数秒程度の超高温加熱滅菌処理し、７０Ｋｇ／ｃｍ^２の加圧条件にて再均質化した後、冷却し、約２４時間エージングを行い起泡性乳化物を調製した。この起泡性乳化物１００質量部に対して、実施例３で調製した粉末状のラジカル反応抑制剤８質量部を加えて、ケンウッドミキサーを使用して、２分４５秒間ホイップして、オーバーラン７５％のクリームを調製した。本品は、環状四糖がラジカル反応を抑制するので、風味の劣化が抑制されており、５〜２０℃で７日間保存後のもの、或いは、−２０℃に１４日間凍結保存後解凍したしたものは、いずれも、保形性、風味、口溶けがよく、また、冷凍保存時にも、ひび割れも認められなかった。
実施例１５ 可食性フィルム
プルラン（商品名『ＰＩ−２０』、株式会社林原商事販売）３０重量部、水７０重量部、及び実施例２で調製したラジカル反応抑制剤１．５重量部を加えて完全に溶解した。この溶解液１００重量部に対して、カラギーナン１重量部及びレシチン０．１重量部を加えて溶解混合し、均一な溶液とした。これを、常法にしたがって、ポリエステルフィルム上に流延し、引取速度３ｍ／分で、厚さ０．０３ｍｍのフィルムとし、９０℃の熱風で乾燥させて製品とした。本品は、プルランのみを使用したフィルムとは違って、水系で速溶せず、徐々に溶解、崩壊する可食性フィルムであり、しかも、本品に含まれる不飽和化合物の安定性が環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物により高められているので、保存安定性にも優れているという特長がある。従って、本品はオブラートなどと同様に、食品分野や医薬品分野などで有利に利用できる。
実施例１６ 焙煎アーモンド
精選したアーモンド１００重量部を常法により焙煎し、この高温のアーモンドを撹拌しつつ、実施例５で調製したラジカル抑制剤を予め水に溶解して２０％水溶液としたもの３重量部をできるだけ均一に噴霧混合し、次いで、食塩粉末をまぶして焙煎アーモンドを得た。本品は風味の優れた焙煎アーモンドであり、脂質のラジカル反応が抑制されることから、その保存安定性に優れており、そのまま或いは、製菓・製パン用の材料として好適である。
実施例１７ 茶飲料
緑茶の茶葉２５ｇに７０℃の脱イオン水８００ｇを添加して６分間、茶の成分を抽出した後、濾過により茶葉の残渣を除去して、７００ｍｌの抽出液を得た。得られた抽出液を脱イオン水で５倍に希釈して、Ｌ−アスコルビン酸を４５０ｐｐｍとなるように添加し、炭酸水素ナトリウムにより、ｐＨを６．２に調整した。次いで、実施例３で調製した環状四糖５含水結晶粉末を重量換算で０．２％となるように添加後、耐熱性ガラス容器に３５０ｍｌづつ分注・密閉し、１２１℃、１０分間の殺菌を行って茶飲料とした。本品は、環状四糖が、殆ど甘味がないことから、茶本来の風味が妨げられることはなく、本品は、２０℃で６ケ月保存後も、褐変が抑制され、茶の緑色がよく保持されているとともに香りも良好な茶飲料である。なお、本品は、酵素処理ルチンを併用することにより、更に、その保存安定性が向上する。
実施例１８ 脂肪含有乳剤
精製大豆油１００ｇに精製大豆レシチン１２ｇ及びグリセリン２５ｇを加え、湯浴で加温し、ポリトロンホモジナイザーで乳化を行った後、μフルイダイザーを使用して、さらに乳化した。得られた乳化液に予め、実施例５で調製したラジカル反応抑制剤８０ｇを溶解した水溶液２５０ｍｌを加え、さらに蒸留水を加えて、全液量を１，０００ｍｌに調整した。次いで、炭酸水素ナトリウムを加えて、ｐＨを７．２に調整し、メンブランフィルターで濾過後、濾液を２５０ｍｌのバイアルに充填し、１２０℃で２０分間高圧蒸気滅菌を行い環状四糖含有脂肪乳剤を得た。本品は、環状四糖によりラジカル反応が抑制されるので、ブドウ糖などの糖の使用時に問題となるギ酸をはじめとする有機酸の発生や、生体に有害な遊離脂肪酸の生成が抑制されており、長期に安定な、脂肪乳剤であり、そのままで、或いは、アミノ酸やビタミン類などを添加して、経口或いは非経口的な栄養補給に有利に利用できる。
実施例１９ 香料
水１００ｇにＨＬＢ１５のショ糖脂肪酸エステル５ｇ、実施例４で調製したラジカル反応抑制剤７５ｇを加えて溶解し、８５〜９０℃で１５分間加熱殺菌した。この溶液を約４０℃に冷却後ホモミキサーで撹拌しながら、レモンオイル１０ｇを混合して乳化液を得た。本品は、さらに、噴霧乾燥などの方法で乾燥することにより、容易に粉末香料とすることができる。本品及び本品を粉末化したレモンオイル香料は、いずれも長期保存による劣化臭の発生がなく良好な香気香味を保持していた。
実施例２０ ビタミンＥ製剤
ビタミンＥ（α−トコフェロール、和光純薬株式会社製）をエタノール（試薬特級、片山化学株式会社販売）に溶解し、ビタミンＥを１０％濃度含むエタノール溶液を調製した。実施例３で調製した環状四糖無水結晶粉末１０ｇをガラス製の乳鉢に採り、それにエタノール又は酢酸を少量添加しガラス棒でよく混合し、液状物質の添加と混合を粉末状態が維持できなくなる直前まで繰り返し、ビタミンＥ製剤を調製した。対照として、分枝サイクロデキストリン粉末（商品名『イソエリートＰ』、塩水港精糖株式会社製造）、特開平７−２１３２８３号に記載の方法に準じて調製したα，α−トレハロース無水結晶粉末、デキストリン粉末（商品名『パインファイバー』、松谷化学株式会社製造）、及び可溶性澱粉（試薬特級、片山化学株式会社販売）を用いて、同様の方法でビタミンＥ製剤を調製した。尚、本実施例に使用した環状四糖及び対照として使用した各糖質は、何れも、予め８０℃で１６時間真空乾燥して使用し、ビタミンＥ・エタノール含有環状四糖粉末、及び、ビタミンＥ・エタノール含有分岐サイクロデキストリン粉末、ビタミンＥ・エタノール含有α，α−トレハロース粉末、ビタミンＥ・エタノール含有デキストリン粉末、ビタミンＥ・エタノール含有可溶性澱粉粉末を調製した。次いで、それぞれの粉末を五酸化リンの入ったデシケーター中で、室温で、５時間、減圧乾燥してエタノールを揮散させ、それぞれビタミンＥ含有粉末を調製した。得られた５種類の糖質とビタミンＥからなる粉末を、それぞれ約０．５ｇを精秤して２０ｍｌ容のガラス製バイアル瓶５本に採り、密栓し、常圧、６０℃で保存し、試験標品の、調製直後、保存１日間、保存３日間、保存７日間、保存１４日間の、それぞれの時点でのビタミンＥ量を調べた。各試験標品中のビタミンＥの定量は、試験標品の入ったバイアルビンにエタノールを１０ｍｌ加えよく懸濁してビタミンＥを抽出し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分間）して得た上清を用いて、ガスクロマトグラフィー法（ＧＣ）で各試験標品のビタミンＥを定量した。尚、ＧＣはカラムＤＢ−１（内径０．２５ｍｍ、長さ３０ｍ、Ｊ＆Ｗサイエンス社製）を装着したＧＬ装置ＧＣ−１４Ａ（島津株式会社製）を用いて行った。各ビタミンＥ含有糖質粉末それぞれ１ｇ当たりのビタミンＥ量及び調製直後の試験標品のビタミンＥ量を１００％とした相対値を、抑制率として表１１に示す。

表１１の結果から明らかなように、糖質として環状四糖を使用したビタミンＥ製剤粉末は、ビタミンＥ含有分岐サイクロデキストリン粉末やビタミンＥ含有α，α−トレハロース粉末、ビタミンＥ含有デキストリン粉末、ビタミンＥ含有可溶性澱粉粉末と比べ、残存するビタミンＥ量は高いことがわかる。このように本発明のラジカル反応抑制剤（環状四糖）を含有する、ビタミンＥ製剤は、常圧、６０℃の過酷な条件ですら、ラジカル反応を抑制しビタミンＥの酸化分解を抑制することから、その粉末化、製剤化の工程管理が容易であり、しかも、該製剤は、脱酸素剤の併用や酸素不透過性のカプセルに封入するなどの通常のビタミンＥ製剤の保存条件下にあっては、環状四糖以外の糖質を使用したビタミンＥ製剤に比して、長期間安定なビタミンＥ製剤として有利に利用できる。
実施例２１ ビタミンＤ錠剤
ビタミンＤとしてビタミンＤ_３（コレカルシフェロール、和光純薬株式会社製）をエタノール（試薬特級、片山化学株式会社販売）に溶解し、ビタミンＤを３％濃度含むエタノール溶液を１．５ｍｌを、実施例３で調製した環状四糖無水粉末を８ｇに添加し、実施例２０と同様の方法により粉末化し、減圧乾燥して、環状四糖を含有するビタミンＤ３製剤粉末を調製した。対照として、実施例２０で使用した分枝サイクロデキストリン粉末（商品名『イソエリートＰ』）、実施例２０で使用したα，α−トレハロース無水結晶粉末、無水結晶マルトース（株式会社林原商事販売、商品名『ファイントース』）、及び、セルロース（商品名『フナセルＳＦ』、フナコシ株式会社製造）を糖質として使用し、環状四糖を含有するビタミンＤ３製剤粉末を調製したと同様の方法により、それぞれの糖質を含有するビタミＤ３粉末を調製した。得られた各々の糖質を含有するビタミンＤ３粉末を、それぞれ約０．３ｇを採り、打錠機で２００Ｋｇ／ｃｍ^２、２分間加圧して、各々の糖質を含有するビタミンＤ３錠剤を調製した。得られた錠剤を精秤した後、各々の糖質を含有するビタミンＤ３錠剤について、１個ずつ５本の２０ｍｌ容のガラス製バイアル瓶に入れ、密栓し、常圧、６０℃で保存し、試験標品の、調製直後、保存２時間、保存１日間、保存２日間、保存７日間の、それぞれの時点のビタミンＤ３量を調べるための試験標品とした。錠剤中のビタミンＤの定量は、試験標品の入ったバイアル瓶に、７０％エタノール水溶液を１０ｍｌ加えガラス棒で錠剤を粉砕してビタミンＤ３を抽出した後、全量を５０ｍｌとし、さらに、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分間）して得た上清を精密濾過し、得られた濾過液の吸光度を２６５ｎｍの波長で測定した。ビタミンＤ３量は、波長２６５ｎｍにおける吸光度係数Ｅ_１％を４７５として計算した。各々の糖質を含有するビタミンＤ３錠剤それぞれ１ｇ当たりのビタミンＤ３量及び調製直後の試験標品のビタミンＤ量を１００％とした相対値を、抑制率として表１２に示す。

表１２の結果から明らかなように、分岐サイクロデキストリン含有ビタミンＤ_３錠剤、α α−トレハロース含有ビタミンＤ_３錠剤、デキストリン含有ビタミンＤ_３錠剤、可溶性澱粉含有ビタミンＤ_３錠剤が、保存開始７日目には５３〜７５％のビタミンＤ_３残存量であるのに対し、環状四糖含有ビタミンＤ_３錠剤は、９０％のビタミンＤ_３が残存し、１４日間の保存後にも、他の糖質を含有する錠剤が、何れも約４０％或いはそれ以下のビタミンＤ_３残存量でしかないのに対して、環状四糖を含有する錠剤では、その６１％が残存していることが確認された。このように本発明のラジカル反応抑制剤（環状四糖）を含有するビタミンＤ_３錠剤は、他の糖質を含有する錠剤に比して、常圧、６０℃の過酷な条件ですら、ラジカル反応を抑制し、ビタミンＤ_３の酸化分解を抑制することから、その粉末化、錠剤化の工程管理が容易であり、しかも、該錠剤は、脱酸素剤の併用や酸素不透過性の皮膜でコーティングするなどの通常のビタミンＤ_３錠剤の保存条件下にあっては、環状四糖以外の糖質を含有するビタミンＤ_３錠剤に比して、長期間安定なビタミンＤ_３錠剤として有利に利用できる。
実施例２２ 皮膚外用化粧クリーム
精製水４８重量部にプロピレングリコール５重量部と実施例８で調製したラジカル反応抑制剤１０重量部とを加え、７０℃にまで加温して水相部を調製した。一方、スクワラン４０重量部、還元ラノリン１５重量部、ミツロウ１０重量部、オレイルアルコール８重量部、脂肪酸グリセリン５重量部、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．）３重量部、親油型モノステアリン酸グリセリン３重量部、グリチルリチン酸ジカリウム１重量部、藍の水抽出液２重量部と香料ならびに抗酸化剤の適量を７０℃の条件下で均一な状態にまで混合し、油相部を調製した。この油相部を上記の水相部に加えて、常法にしたがい予備乳化した後、ホモミキサーで均一に乳化し、冷却して、水中油型の皮膚外用クリームを得た。本品は皮膚に対して優れた保湿性を発揮するうえ、その保湿性の主体である油性成分における不飽和化合物の安定性が環状四糖並びにα，α−トレハロースにより高められているので、保存安定性に優れた高品質の皮膚外用剤として有利に利用できる。また、該クリームは、環状四糖により脂質のラジカル反応が抑制されるだけでなく、グリチルリチン酸及び／又は藍の成分に由来するヒアルロニダーゼ活性阻害作用をはじめとする種々の作用により、皮膚の炎症が抑制され、その結果、シミ、しわやこじわの発生などに代表される皮膚の老化が抑制され、はりのあるみずみずしい肌を維持する効果を奏することができる。
実施例２３ 点眼剤
実施例６で調製したラジカル反応抑制剤４．５重量部、塩化ナトリウム０．４重量部、塩化カリウム０．１５重量部、リン酸２水素ナトリウム０．２重量部、硼砂０．１５重量部、アスコルビン酸２−グルコシド（株式会社林原生物化学研究所販売）０．１重量部を滅菌精製水に溶解し、全量を１００ｍｌとして、公知の方法により無菌製剤を調製して点眼剤を調製した。ｐＨは７．３に調整した。本品は、ラジカル反応抑制剤に含有される環状四糖が眼の炎症を抑制するとともに、α，α−トレハロースが眼の粘膜を乾燥から保護する効果を発揮し、しかも、アスコルビン酸２−グルコシドが、酵素的により徐々に分解されてビタミンＣの持続的な給源となることから、本点眼剤は、眼の疲労の回復や、アレルギー性の眼の炎症やドライアイなどの眼性疾患の予防、治療、或いは、洗眼剤として有利に利用できる。
実施例２４ 外傷治療用軟膏
実施例３の方法により調製した環状四糖５含水結晶粉末５００重量部に感光素１０１号を０．０２重量部添加混合後、更に１０％プルラン水溶液２００重量部を加えて混合し、適度の伸び、付着性を有する外傷治療用軟膏を得た。本品は創傷面に直接塗るか、ガーゼなどに塗るなどして患部に使用することにより、切傷、擦り傷、火傷、水虫などの外傷を治療することができる。また、本品は、環状四糖が、感光素１０１号のラジカル反応を抑制して製剤を安定化するととも、ラジカル反応に起因する患部の炎症を抑制するので、その治療期間が短縮され、創面もきれいに回復することができる。しかも、環状四糖は、サイクロデキストリンで報告されているような溶血作用がなく、逆に、溶血を抑制する作用があることから、本発明の外傷治療用軟膏は出血性の外傷に対しても有利に使用できるという特徴を有している。
実施例２５ インターフェロン−α含有座剤
インターフェロン−α製剤（大塚製薬株式会社販売、商品名「オーアイエフＯＩＦ注射用１，０００万単位」）を０．１ｍｌの蒸留水に溶解し、その０．１重量部を、実施例６の方法により調製した環状四糖の粉末をガラス容器に入れ、予め１４０℃に加熱したオイルバス中にそのガラス容器を３０分間保持して調製した環状四糖の１含水結晶０．９重量部とを均質に混合したものと、予め４０℃に加温溶解した油脂性基剤のファーマゾル９重量部とを混合し、これを型に流し、冷却してインターフェロン−α含有座剤を得た。本品１ｇは、インターフェロン活性１００万単位を含有している。本品は、インターフェロン−αが安定化された座剤であり、ヘルペスウイルス感染症、肝炎、悪性腫瘍をはじめとするインターフェロン−α感受性疾患の治療に有利に利用できる。
実施例２６ 酵素剤
微生物由来の乳酸脱水素酵素（東洋紡株式会社製、フナコシ株式会社販売、４２９単位／ｍｇ）４ｍｇを１０ｍｌの脱イオン水に溶解した酵素剤の水溶液０．３ｍｌと、脱イオン水に実施例４で調製した環状四糖を３．５％となるように溶解した水溶液０．３ｍｌを凍結乾燥用ガラス容器（液溜まり部の直径１０ｍｍ、高さ５０ｍｍ）内で穏やかに撹拌、混合後、常法により凍結乾燥して、乳酸脱水素酵素の粉末標品を調製した。本品は、環状四糖により、凍結乾燥時の冷凍、乾燥変性が抑制されるために、製造時の活性に酵素活性が減少することもなく、また、室温、冷蔵、或いは冷凍保存でも活性は長期間安定に保持される。さらに、本品の水溶液を約４乃至約−１℃で冷蔵保存、或いは、それを凍結して保存した場合にも、その酵素活性は長期間安定に保持することが可能である。
実施例２７ 凍結乾燥補体製剤
モルモットから血液を採取後、血清画分を分離し、その１重量部に対して、予め実施例５のラジカル反応抑制剤１重量部を生理食塩水（株式会社大塚製薬工場製造、商品名『大塚生食注』）９重量部に溶解しておいた溶液１重量部を加え、均質になるように撹拌溶解し、０．２ｍｌずつ２ｍｌ容の管瓶に分注し、常法に従って、最終到達温度２５℃の乾燥条件で、凍結乾燥した。本品は、本品に含まれる脂質をはじめとする不飽和化合物の安定性が環状四糖により高められているため、血清中の不飽和化合物のラジカル化により生成する過酸化物による補体の修飾、変性が抑制されるので、補体の持つ一連の酵素反応系やその他の生理活性は、冷蔵或いは室温で長期保存した場合にも安定に保持されるという特徴がある。しかも、環状四糖は、凍結及び／又は乾燥による変性からタンパク質を保護するために、凍結乾燥時の補体の活性の低下も抑制されるので、本品は、高品質の臨床診断或いは免疫学の試験用の試薬として有利に利用できる。
実施例２８ 塩化ビニル樹脂
塩化ビニル樹脂１００重量部、テトラヒドロフラン５００重量部、ステアリン酸バリウム０．００１重量部、ステアリン酸亜鉛０．００１重量部に実施例３で調製した環状四糖無水結晶粉末０．６重量部を添加して、均質になるように混合し、更に、１８０℃に加温して、５分間混練し、厚さ０．５ｍｍのシートを作成した。本品は、添加した環状四糖により紫外線などに起因するラジカル反応が抑制されるため、耐光性に優れた塩化ビニル樹脂である。また、本品は環状四糖を添加することにより、その耐熱性も向上することから、環状四糖は、樹脂の安定化剤として好適であることが判明した。

産業上の利用の可能性

本発明は、ラジカルの生成及びラジカル反応を起こして不飽和化合物の分解が進行すること、さらには、不飽和化合物の過酸化物によるタンパク質などの修飾、変性をも抑制するために、グルコースを構成糖とする非還元性糖質である環状四糖、又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物が、ラジカルの生成及びラジカル反応の抑制作用が強いことを見出し、ラジカルの生成及びラジカル反応が発生する前、または、発生している有機の不飽和化合物を含む反応系に上記の環状四糖、又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物を有効成分とするラジカル反応抑制剤を含有させることで、不飽和化合物のラジカルの生成及びラジカル反応の進行を抑制し、さらには、不飽和化合物の過酸化物によるタンパク質などの修飾、変性をも抑制するものである。しかも、環状四糖、又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物は、食品として安全で、且つ、非常に安定であることから、本発明による環状四糖、又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物を含有するラジカル反応抑制剤の利用分野は、食品分野、農林水産分野、化粧品分野、医薬部外品、医薬品分野を含めて、日用品分野、化学工業分野、染料分野、塗料分野、建材分野、香料分野、化学薬品分野、合成繊維分野、色素分野、感光色素分野、光記録媒体分野など多岐に渡る。本発明は、この様に顕著な作用効果を有する発明であり、産業上の貢献は誠に大きく、意義のある発明である。

Claims (15)

1. サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝で示される環状四糖、又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物を有効成分とするラジカル反応抑制剤。
2. サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝で示される環状四糖、又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物とともに、トレハロース及び／又はマルチトールを含有することを特徴とする請求の範囲第１項に記載のラジカル反応抑制剤。
3. サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝で示される環状四糖、又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物とともに、ラジカルスカベンジャーを含有することを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項に記載のラジカル反応抑制剤。
4. ラジカルスカベンジャーが、ビタミン類、フラボノイド類、ポリフェノール類、テルペン類、不飽和脂肪酸及び酸化防止剤から選ばれる１種又は２種以上であることを特徴とする請求の範囲第３項に記載のラジカル反応抑制剤。
5. サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝で示される環状四糖、又は、この環状四糖と環状四糖の糖質誘導体との混合物とともに、還元性糖質、非還元性糖質、サイクロデキストリン類、水溶性多糖類、香辛料、酸味料、旨味料、酒類、無機塩、乳化剤、香料及び色素から選ばれる１種又は２種以上を含有することを特徴とする請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに記載のラジカル反応抑制剤。
6. サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝で示される環状四糖を、無水物換算で、１ｗ／ｗ％以上含有することを特徴とする請求の範囲第１項乃至第５項のいずれかに記載のラジカル反応抑制剤。
7. 請求の範囲第１項乃至第６項のいずれかに記載のラジカル反応抑制剤とともに不飽和化合物を含む、ラジカル反応の抑制された組成物。
8. 不飽和化合物が、脂肪酸類、単純脂質類、複合脂質類、テルペン類、アルコール類、配糖体、ビタミン類、タンパク質、ペプチド、アミノ酸類、酵素類、ホルモン類、サイトカイン類、抗体類、香料、色素、乳化剤、合成高分子類及びビニル類から選ばれる１種又は２種以上であることを特徴とする請求の範囲第７項に記載のラジカル反応の抑制された組成物。
9. ビタミン類がビタミンＤ、ビタミンＥ及びそれらの誘導体から選ばれる１種又は２種以上であることを特徴とする請求の範囲第８項に記載のラジカル反応の抑制された組成物。
10. 飲食品、化粧品、医薬部外品、医薬品、飼料、餌料、雑貨、化学工業品、又は高分子形成物である請求項７乃至９のいずれかに記載のラジカル反応の抑制された組成物。
11. 請求の範囲第１項乃至第６項のいずれかに記載のラジカル反応抑制剤を、不飽和化合物を含む組成物に含有させることを特徴とするラジカル反応の抑制方法。
12. 請求の範囲第１項乃至第６項のいずれかに記載のラジカル反応抑制剤を、不飽和化合物を含む組成物に含有させ、ラジカル反応により生じる不飽和化合物の過酸化物が、不飽和化合物以外の成分を変性させることを抑制することを特徴とするラジカル反応の抑制方法。
13. 不飽和化合物が、脂肪酸類、単純脂質類、複合脂質類、テルペン類、アルコール類、配糖体類、ビタミン類、タンパク質類、ペプチド類、アミノ酸類、酵素類、ホルモン類、サイトカイン類、抗体類、香料、色素、乳化剤、合成高分子類及びビニル類から選ばれる１種又は２種以上であることを特徴とする請求の範囲第１１項又は第１２項のいずれかに記載のラジカル反応の抑制方法。
14. ビタミン類がビタミンＤ、ビタミンＥ及びそれらの誘導体から選ばれる１種又は２種以上であることを特徴とする請求の範囲第１３項に記載のラジカル反応の抑制方法。
15. 不飽和化合物を含む組成物が飲食品、化粧品、医薬部外品、医薬品、飼料、餌料、雑貨、化学工業品、又は高分子形成物であることを特徴とする請求の範囲第１１項乃至第１４項のいずれかに記載のラジカル反応の抑制方法。