JPS6322181A - 新菌種サ−マス・ル−ベンス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規好熱性フマラーゼ、その製造法および該酵
素を生産する能力を有する微生物ならびに該酵素を利用
するＬ−リンゴ酸の製造法に関する。

Ｌ−リンゴｒＲＦｉ輸液の成分として利用され、また清
涼飲料水の酸味料としての用途も広がシつつある重要な
物質である。現在Ｌ　　ＩＪンゴ酸の製造法としてはマ
レイン酸よシ化学的に得られるＤＬ−！Ｊンゴ酸の光学
分割法、微生物由来のフマラーゼを利用する方法、微生
物の直接発酵による方法などがあるが、微生物由来のフ
マラーゼを利用する方法が実用的である。微生物由来の
フマラーゼを利用した例としては、北原等による乳酸菌
ラクトバチルス・プレビスをフマール酸カルシウムに作
用させＬ−リンゴ酸カルシウムとして析出させる方法（
特公昭３７−≠！／ｌ）、酵母を用いフマール酸から酵
素的ＫＬ−リンゴ酸を製造する方法（％開昭！コーｔｙ
ｏｔｒ７）およびブレビバクテリウム・アンモニアゲネ
スを用いフマール酸から酵素的にＬ−リンゴ酸を製造す
る方法（ヨーロピアン・ジャーナル・オン・アプライド
・ミクロバイオロジー、第３巻、／２り頁、ｌり７を年
）などが知られている。特公昭Ｊ７−４よ／−／記載の
方法は、石膏の副生および増殖不良などの欠点があシ、
後二者は酵素反応を常温で行うので実用上難点がある。

発酵操作、ひ素反応などを高温榮件で行なえることは、
雑菌汚染防止、酵素反応の迅速性、冷却エネルギーの節
約などの点から極めて有利である。

本発明者らは、熱安定なフマラーゼを得る目的で菰々の
好熱性細菌についてフマラーゼ活性を調べた結果、サー
マス属およびバチルス属に属する高度好熱性ｍ’ＦＡが
好熱性の７マラーゼ活性を有することを見出し本発明を
完成するに到った。

従って本発明は、新規好熱性フマラーゼ、その製造法お
よびＫｎ素を生産する能力を有する微生物ならびに該酵
素を利用するＬ　　ＩＪンゴ酸の製造法に関し、以下に
その詳細を説明する。

本発明に係る高度好熱性フマラーゼは、該酵素を生産す
る能力を有する微生物を栄養培地に培養し、培養物中に
該酵素を蓄積せしめ、該培養物から該ひ素を採取するこ
とによって製造することができる。

本発明で使用する微生物は高度好熱性フマラーゼを生産
する能力を有するものならいかなる菌株を用いてもよい
が、具体的にはサーマス戊またはバチルス属に属する菌
株、例えばサーマ人ＴＣＣＪ／よｔｒ）、サーマス・ラ
フテラス・ムＴｃｃ３ｔｚｒ７’）、サーマス・ルーベ
ンス・ムＴＣＣＪ／ｊｊＪ）、サーマス・アクアティク
スＡＴＣＣＪ！１０≠、サーマス・アクアティクスムＴ
ＣＣ２ｊ１０６．サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒ
ｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕリムＴＣＣコアｔＪ４
！、１７３１号、ＮＲＲＬ　　Ｂ−／２ｏｘ４Ａ）、バ
チルＢ−７ｘＯ，ｚｒ）、バチルス・ズブチリス（Ｂａ
ｃｉｌ’ｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉすＡＴＣＣ７ｏｊｏ、
バチルス・リケニホルミスＡＴＣＣ／／！１０．バチル
ス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉ：Ｌｌｕｓｓｔ
ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）　Ａ　Ｔ　ＣＣ／
　２０　／　Ａ。

バチルス・コアギュラｙ　ス（Ｂａｃｉｌｌｕ８ｃｏａ
ｇｕ−１ｉｎｓ）ＡＴＣＣ７ｏｊｏなどがあげられる。

上記微生物の菌学的性質については下記文献にそれぞれ
記載がある。

サーマスーアクアテイクｙ、　　　Ｂａｒｇｅｙ’ａ　
Ｍａｎｕａｌ　ｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　　Ｂ
ａｃｔｅ−ｒｉｏｌｏｇｙ　Ｍ　ｒｐＪＬ２　ｒ　！頁
す−マス・サーモフィルス　特開昭！／−／／よりｒＩ
ｒ号公報 バチルス・リケニホルミス　　Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａ
ｎｕａｌ　ｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　　Ｂａｃ
ｔｓ−ｒｉＯ１０ｇ７第２版、！３４Ｌ頁 バチルス・フミルス　　同上、　！　Ｊ　Ｊ〜！３弘頁
バテル２・ズブチリス　同上、！Ｊ／−４１３３頁ノサ
にス・ステアロサーモフィラス　同上、！３２〜！＜１
０頁バチルス・コアギユランス　　同上、ｊ　４’　０
〜！≠／頁尚、本発明者らが分離したサーマス・アクア
ブ・エスビ）ノに１０２の菌学的性質および同定の根拠
について以下に示す。

上述の菌学的性質をもとにして、パージ−のマニュアル
・オン・デターミナテイプ・バクテリオロジー第を版お
よびジャーナル・オブ・バクテリオロラー２ｒ巻λｔタ
ーλ２７頁（ｌりＡ！Ｐ）、インターナショナル・ジャ
ーナル・オブ・システマテイツク・バクテリオロジーコ
≠巻ｌＯコー／’Ｉコ頁（／Ｐ７弘）、同コ！巻Ｊｊ７
−ＪＡ４Ａ頁（／Ｐ７ｊ）、アグリカルチユラル・バイ
オロジカルケミストリー３を巻コ３！７−コＪｔｔ頁を
参考にして、公知の菌株とその異同を検討した。

上記の３菌株は、ダラム陰性、無胞子、非運動性、好気
性の桿菌ないし糸状桿菌で、生育至適温度１０℃以上の
個性好熱菌であるところから、サーマス属ＫＦ４するも
のと考えられる。

１６１０４ｃ菌は、同定実験に際し対照菌として使用し
たサーマス・アクアティクスの標準法についての実験結
果あるいは、前記報文中の記載とほぼ完全く一致するの
で、サーマス・アクアティクスと同定した。＊ｉｏｒ菌
株は、（１）コロニーがクリーム色であること　（２）
ガラクトース、ラクトーズ、グリセロールからの酸生成
が異なること　（３）グルタミ７ｒＩｌの要求性がない
点からサーマス・アクアティクスと区別でき、新種と見
なし、サーマス・ラフテラス・ノブ・エスピーと命名し
た。ｓｉｏコ菌は、（１）コロニーカ赤橙色であること
　（２）生育至適温度が低いこと（３）至適ｐＨが低い
こと　（４）グリセロール、マニトールからの酸生成が
異なる点からサーマス・アクアティクスと区別でき、新
都と見なし、サーマス・ルーベンス・ノブやニスヒート
命名した。

これらの菌株の培養について述べる。これらの菌株の培
養においては通常の好熱性細菌の培養法が一般に用いら
れる。

災素源としてはシュークロース、マンノース、澱粉、糖
蜜、グリセリン、マニトール等の糖質および糖アルコー
ルが単独または組合せて用いられる。また菌の資化性に
よっては炭化水素、アルコール類、有機酸等も用いうる
。窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム
、硝酸アンモニウム、硝酸ソーダ、尿素等の無機窒素源
、あるいはポリペブト／、ペグトン、イーストエキス、
コーン嗜スチーブ・ＩＪカー１７ミノ酸等の有機窒素源
を単独または組合せて用いることができる。

また７マ一ル酸等有機酸やＭｎ（＋−１ＣＯｎ−、Ｍ　
ｇ＋、ＭＯ＋＋を含む各槌塩の添加によシ菌の生育や酵
素の生産が促進される。培養法としては液体培養法が適
している。培養温度は１０−ｒθ℃でｐｌｉは中性付近
で培養を行なうことが盟ましい。

培養終了後、培養液よシ好熱性７７２−ゼを採取するに
は一般の酵素採取法を用いることができ、本酵素は菌体
内ｅ素であるため、例えば次のような方法で単離するこ
とができる。

まず得られた菌体をｒｏｐ７ｉ程度の濃度でグイノーミ
ル（シンマルエンタープライス）Ｋかけ無細胞抽出液を
得る。これをｐｏ〜７θチの硫酸アンモニウムで２４を
時間塩析する。緩衝液は０．　／　Ｍ　）　ＩＪス・塩
酸液を使用する。

？＆Ｋ、ＤＥＡＲ・セファデックスＧ−２３（生化学工
業社！！りカラムに吸着させθ〜０．　ｊ　Ｍ食塩水で
濃度勾配に溶出させ活性区分を集める。

次にこの画分を硫酸アンモニウム７０チ飽和にし、生じ
た沈澱を集めてｐＨ約Ａ、ｊのリン酸緩衝液で透析する
。さらにＤＥＡＥ・セルロース（生化学工業社製）、Ｄ
ＥＡＥ・セファデックスＧ−１０（生化学工業社製）、
最後にノ・イドロキシ・アパタト（゛生化学工業社ｊ！
りＫ吸着・溶出させて本酵素を得る。

本Ｔｉ＃素の活性の測定は次のように行う。

０、　／　Ｍフマールはナトリウムと本酵素、菌体また
は菌体処理物とを（ＤＣＷ換算ｌｏｌ／／ｌ）接触させ
、ｐ　Ｈ７，０、温ｆｉ４！０〜７０℃で３０分間反応
を行う。反応液をＬＩＪンゴ酸としてよ〜ｒｏｒ程度に
なるように稀釈する。

稀釈液／　ｍｅを採取し、これに濃硫酸ｔＬｔを加えて
十分に攪拌後、シアーナフタレンジオール（／Ｉ／１０
０４−濃硫酸）０．７ＪＩｌを加えて沸とう水中に２０
分間浸漬する。

これを冷却後３りＱｎｍでの吸収値よ！Ｄ　Ｌ　−リン
ゴ酸量を算出し、この値から酵素活性を算出する。その
他高速液体クロマトグラフィー法、マリツクエンザイム
法、過マンガン酸カリウムによるフマール酸の定量法等
が使用可能である。

いずれの場合も酵素活性は国際単位（凹１ψ・ｍｌっで
表示する。

次に得られた酵素の性質について述べる。サーマス属、
バチルス属によシ生産される酵素は若干性質に差がある
ので、別々に記載する。

サーマス属菌（サーマス・アクアティク−ｘＪ１６１０
≠よシ得た酵素を代表として示す） （１１作用および基質特異性 フマール酸およびＬ−リンゴ酸にのみ作用し、ＬＩＪン
ゴ酸からフマール酸および水を生成する反応およびその
逆反応を触媒する。

（２）至適ｐＨ ６１２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ，／１−ｒ）、０．２Ｍト
リス・塩酸緩衝液（ｐＨｒ〜り）中での活性をｔＯ℃Ｉ
Ｏ分間処理にて測定した。結果はＭ／図に示す通シであ
って、ｐＨ７，２付近に至適ｐＨがある。一般に動物起
源、および常温菌産生の７マラーゼはアルカリ側に至適
ｐＨがあるが、好熱性７マラーゼは一般的に中性かある
いは若干酸性側に至適ｐＨを有している。

（３）安定ｐＪ（範囲 ０、２　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨよｒ〜ｒ、ｏ）、ｏ、コ
Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐＨｒ、Ｏ−＊Ｑ）中、ＪＯ’
Ｃ，７７時間処理し、／Ｍ７マール酸ナトリウム（ｐＨ
７，ｚ）を添加しｔＯ℃、３０分反応して活性を測定し
た。結果は第一図に示す通シである。ｐ　Ｈｒ、　０で
バッファーによシ活性に約１倍の差が生じたが図のよう
にｐＨよｊ　−７，ｊ−ｉでは相対的に安定と思われる
。

（４）作用適温の範囲 ！０〜ｒｊ”ｃの範囲でｐ　Ｈ７，ｕで１０分間反応し
た。結果は第３図の通シであシ、７０℃付近に至適温度
がある。

（５）温度安定性 本酵素をｏ、　／　Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨｙ、コ）中
ｊｏ−ｔｏ℃に３Ｑ〜１２０分間処理した後／Ｍフマー
ル酸ナトリウムを加えてｔｏ℃、１０分間反応して活性
を測定した。結果は第φ図に示す通りである。ｔｏ℃ま
ではｉｏ。

多安定である。

（６）阻害、活性化および安定化 本１１索はある覆の１価の金属イオンにて若干の活性化
を示す。その順序はＣＯ″）　Ｚｎ＋）Ｍｇ＋であＦ）
、Ｃｕ＋は若干の阻害作用を示す。〇−７エナンスロリ
ン、α、α１−ジピリジルなどの金属キレート試薬によ
）阻害を受ける。

（７）分子量 内部標準蛋白としてチトクローム−〇、オパルブミン、
ｒ−グロブリンを使用してセファデックスＧ−λ００に
よるゲル濾過を行った結果、分子量は約ｉｔ万であった
。

バチルスＲ菌（バチルス・ｖケニホルミスＴ−Ｊｕｌよ
シ得た酵素を代表として示す）（１）作用および基質’
！？具性 フマール酸およびＬ−リンゴ酸にのみ作用し、Ｌ−リン
ゴ酸からフマール酸および水を生成する反応およびその
逆反応を触媒する。

（２）至適ｐＨ 本酵素を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨｊ−ムよ）、０．２
Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ＆ｊ　〜ｒ、ｊ）、０．２Ｍトリ
ス・塩酸緩衝液（ｐＨｒ、ｊ　〜／　０．０　）中での
活性を、ｔＯ℃３０分間処理にて測定した。結果は第３
図に示す通りであって、ｐＨ７０付近に至適ｐＨを有す
る。

（３）　　安定ｐＨＮ囲 上記の緩衝液中！Ｏ℃でｐｇ範囲Ｊ：ｏ〜ｉｏ、。

にて７６時間処理後、ｔｏ℃、ｐｌｉ’ｙ、ｏで活性を
測定した。結果は第を図に示す通シで、安定ｐＨ範囲は
ｐＨ７０〜ｚｔで安定である。

（４）作用適・温の範囲 ｐｏ−ｔｏ℃の範囲でＰ　Ｈ７，０で１０分間反応した
。結果は第７図に示す通υであυ、１０〜ｔｏ″ＣＩＣ
至適温度がある。

（５）温度安定性 酵素液を４ｔｏ−ｔｏ℃にＰ　Ｈ７，０テＪＯ〜／２０
分間処理した後／Ｍフマール酸ナトリウムを添加して１
０℃、ｉｏ分間反応して活性を測定した。第１図に示す
ようにｔｏ″Ｃまでは１００チ安定である。

（６）阻害、活性化および安定化 本酵素はｃｏ４＋、Ｚｎ’！＋、Ｍｇ＋＋、ＭＯ”　等
’７）　２　価（Ｄ　金属イオンにて若干の活性化を示
す。基質であるフマール酸塩の存在で安定化作用が認め
られている。Ｃｕ′＋および０−７エナンスロリン、α
、α１−ジピリジルなどの金属キレート試薬は若干の阻
害作用を示す。

（力分子量゛ 内部標準蛋白としてチトクロームＣ１オパルプミン、γ
−グロブリンを使用してセファデックスＧ−２００１１
Ｃよるゲル濾過を行った結果、分子量は約１ｊｒ万であ
った。

本酵素、本酵素を含有する菌体または該菌体ＯＭ処理物
フマール酸に作用させることにょってＬ　　ＩＪンゴ酸
を製造することができる。反応は通常ｔＬｔｏ−ｒｏ℃
、ｐｕｔ、、ｏ−ｒ、ｏで行う。

反応に際してのフマール酸濃度はＯ９，２〜ｔ７モル程
度が適当である。また酵素濃度はｊ−ｊＯｕｎｉｔｓ　
／ｒｎｌ　８度が適当である。

反応に際してフマール酸は通常塩として用いる。用いら
れる塩としてはナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウ
ム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩などがあげられる。従来
の７マラーゼを用いる場合は、溶解度の関係から１価の
金属塩の使用に限られていたが、本発明の耐熱性７マラ
ーゼの使用により２価の金属塩の使用も可能になシ、Ｌ
−リンゴ酸への転換率が著しく向上した。

反応に際しては酵素、菌体、菌体処理物を固定化して用
いるとよシ実用的１ｃＬ−リンゴ酸を製造することがで
きる。これらの固定化は酵素、菌体等の固定化に用いら
れる一般的方法によ）行うことができる。たとえば、酵
素液はフマラーゼを吸着しうる一般的な防イオン交換樹
脂と接触させればよく、菌体の固定化には、エチルセル
ロース、酢酸・酪酸セルロース等によるマイクロカプセ
ル化、アクリルアミド系単量体によるゲル包括、ポリビ
ニールアルコールによる包括、コラーゲンによる膜状包
括等が用いられる。また単に菌体を充填混合剤と混合し
、架橋剤等で処理する方法、たとえばゼラチン・ゲルタ
ールアルデヒド法、キトサン・ゲルタールアルデヒド法
、カラゲーニン・ゲルタールアルデヒド法、アルブミン
・ジアルデヒドデンプン法などが利用できる。

反応液からのＬＩＪンゴ酸の採取は反応液を常法によシ
イオン交換樹脂、活性炭処理を行った後、濃縮、晶析す
ることにょシ得ることができる。

実施例ｔ ポリペプトンｏ、ｒｊ７ａ、イーストエキスｏ、４ｔｇ
７ｃｕ１塩化ナトリウムｏ、、ｙ、ｇ７ｔｔｔの組成を
有しｐＨ７，０ＶＣ調整した培地３０ｎｌを含む３ｏ。

耐容量フラスコにサーマス・アクアティクス腐／　ＯＩ
Ｉ■、サーマス・ラフテラス・ノブ・エスピー／ｌ６１
０１菌、サーマス・ルーベンス・ノブ・エスピーＡ１０
λ菌、サーマス・アクアティクスＡＴＣＣコ１１０≠、
ＡＴＣＣλｊ／θ！、サーマス・サーモフィルスＡＴＣ
Ｃｕ７ＡＪＦを接種し、よ０−１０℃にて／を時間振と
う培養する。次にこの培養物全量を同組成の培地ＪＯＯ
ｎｌを含む、２１容量バツフル付フラスコに植菌し同温
度でコロ時間部ｙう培養する。この培養液をさらに同組
成の培地３！を含むｊｔ容量ジャーファーメンタ−に植
菌して５０〜１０℃、通気量ｏ、　ｒ　’ｉｖ−ｍ−ｒ
　ａ拌ｊ　００　ｒｉ、ＩＩＩＬにて２弘時間培養した
結果第２表に示す量の菌体が得られた。得られた菌体を
／　０．０００　Ｇにて遠心分離を行ない、２度洗浄を
縁シ返した後、凍結乾燥した。この乾燥菌体を１モルの
７マール酸ナトリウムと接触させ５０〜１０℃、３０分
反応し生成するＬ−リンゴ酸よシフマラーゼ活性を測定
したところ第２表に示す如き結果であった。

第　２　弐 実施例よ 実施例１と同様の培地にフマール酸をＯ０δ７ｄｌｆｆ
ａ加り、−ｃｖ−マス・ルーベンス・ノブ・エスピーＡ
１０λ菌を２０℃で２弘時間培養した。

７マラーゼ活性を測定したところ？００ｕｎＬｔ／１１
−　ｃａｌｌの菌体が得られた。この菌体を凍結乾燥し
、との凍結乾燥菌体を用いて固定化微生物を作成した。

分散媒としての水ｔｏｏｙに分散剤トシてエマルゲン−
ｍ（花王アトラス社製）を２コＳ、セロゲンーＰＲ（第
一工業製薬社製）を３１溶解し、強攪拌下よ〜ｉｏ℃に
冷却しておく。一方凍結乾燥菌体／よｌをＯ，タチ生理
食塩水！０ＬＬＩと菌体凝集剤である／％キトサン水／
！４に均一に懸濁しておく。酢酸・酪酸セルロースＪｌ
ｒ／−２０（イーストマン・ケミカルインターナショナ
ルＬｔａ製）／！Ｉと分散剤としてアルシセル−１３（
花王アトラス社製）Ｊ７を７３！ｌの酢酸イソブチルに
溶かしたものを十分に攪拌し、均一なＷ１０エマルジョ
ンとする。仁の菌体懸濁液と酢酸・酪酸セルロースニヨ
るＷ１０エマルジョンを先の冷却攪拌中の分散媒にロー
トを用いて滴下し、滴下後ｎ−ヘキサン／２００ｒｔｌ
を徐々に定量ポンプで添加する。その結果、酢酸・酪酸
セルロース内に菌体が包括された、強固で均一な粒径の
固定化微生物が液中に析出する。これを戸布等で戸数し
、十分に洗浄して反応に使用する。

得られた固定化微生物を用いて７Ｍ−７マール酸ナトリ
ウムからＬ−リンゴ酸への転換をｔ。

℃、流速ｓ　ｖ　＝＝　ｏ、　ｊにて連続カラム運転に
よって行ったところ、７よ一以上の転換率でＬ−リンゴ
酸の生産が７ケ月以上可能であった。

さらに常温では使用しがたいフマール酸マグネシウムも
一モルの濃度で２０℃では可溶であシ、これを用いたと
ころｒｔ１以上の転換率で安定したＬ−リンゴ酸マグネ
シウムが得られた。これによシ常温で使用し難いマグネ
シウム塩を用いたことによシ反応率が７０チ以上上昇し
未反応フマール酸の回収工程も縮少され精製工程も簡略
された。

実施例３゜ サーマス・アクアティクス４７０４を菌を実施例／の培
地にフマール酸アンモニウム□、λ１７ｃｕ添加した培
地中、７０℃で３ｚ時間培養したところ２００　ｕｎｉ
ｔ／ｐ−ｃｅｌｌのフマラーゼ活性を有する菌体３１／
ｌが得られた。

菌体を十分洗浄してから凍結乾燥し、この凍結乾燥菌体
をｚ　ｏ　１　／　ｚの濃度で超音波処理し粗酵素液を
調製した。

この粗酵素液を防イオン交換樹脂である吸着担体に接触
させ固定化酵素を作成した。

まずデュオライ）−Ａ７（米国ダイヤモンドジャムロッ
クケミカル社製）をレジン承知て十分に洗浄してから０
．　／　Ｍ　リン酸緩衝液（ｐ　Ｈ１，、ので緩衝化す
る。これに上記で調製した粗蔀素液を活性値として１ｏ
ｏ−コ００　ｕｎｉ号包樹脂の割で、Ｊ７〜７３℃′で
負荷し、ｌぶ時間吸着固定化させる。蛋白吸着量はり０
チ以上であった。

その後酵素の安定化剤として０．　／　％　７マール酸
ナトリウム、架橋剤として０．２チグルタールアルデヒ
ドを０．　／％リン８２緩衝液に溶かしたものを３０分
間反応させ、十分洗浄して固定化酵素とした。この固定
化酵素を！０１谷量のコーンタイプ流動珊に３０−充填
して／Ｍフマール酸ナトリウムからＬ−リンゴ酸への転
換を連続カラム運転によって行ったところ、８Ｖ＝ｏ、
≠、７０℃で約、２７７日間の間、転換率１０％でＬ−
リンゴ酸の連続生産が可能であった。反応液は完全清澄
液であシ、ぴ累の洩れもなく、また高温操作の為、雑菌
汚染もなく非常に効率よいＬ−リンゴ酸の生産が可能で
あった。

サーマス・ラフテラス・ノブ・ニスピーラ実Δ 施例３と同様の培地で７０℃でλ≠時間培養したところ
Ｊ　Ｑ　Ｏｕｎｉｔ／ＪｉＦ　、ｃｅｌｌの７マラーゼ
活性の菌体が得られた。

得られた菌体をコラーゲン・フィブリル液と十分に混合
してテフロンシート上にキャスティングして固定化微生
物とした。この固定化微生物をチップ状に細断してカラ
ムに充填して／Ｍフマール酸マグネシウムをＢ　Ｙ　＝
　０．　ｊで通液したところ？０チ以上の転換率で１０
日間以上安定したＬ−リンゴ酸の生成が確認された。

高速液体クロマトグラフィー５ｈｏｄｅｃ工０ｎｐａｋ
Ｃ−ｒ／／（昭和電工社製）で反応液を分析したところ
、Ｌ−リンゴ酸と７マール酸のみが検出さ°れ、他の不
純物は皆無であった。

実施例よ ｌ／コ濃度のブイヨン培地にて活性化スラントとしたバ
チルス・リケニホルミスＴ−４／／菌、バチルス・フミ
ルスＴ−４１３０菌、バチルス、ズフ゛デリス人ＴＣＣ
ぶ０１１およびバチルス・リケニホルミスＡＴＣＣ／／
ｊ４０をポリペブト７．０．ｒｊｉ／ｄｌＡ−スト・ｘ
キス０．／ｉｌｌ／ｌｌ。

食塩σ二ｇ７ｃｕの組成を有し、ｐＨ７，０に調整した
培地ｊＯｄを含む３００−容量フラスコに接穏し第３聚
に示す温度でコグ時間培養する。

次にこの培養物全量をグルコース３１／／ｄｌ。

ペプトン／ｉ／ｄｌ、イーストエキス０．　Ｊ　ｊ　ｉ
／ｄｌ。

リン酸−カリウムｏ、／　＃　／ｄｌ、リン酸二カリウ
ム０．　／　、９７ｄ１％硫酸−ｒｆネ’／’）ム０．
Ｉｇｌｄｔ。

硫酸鉄ｏ、ｃｏ、２ｐ７ｃｕ％硫酸マフ　、ｌ’７７０
．００００！ｇ７ａ１硫酸亜鉛０．００　／　！ｉ　／
　ｄｊ　、β−７２＝７０．０００Ｊｊｌ／ｄｌ（ＤＢ
成’ｚ有ＬｐＨ７２にｐ整した培地ＪＯＯｍを含む２１
容量バツフル付フラスコに植替えて第３弐に示す温度で
１弘時た。得られた菌体を７０．０００　Ｇにて遠心分
離を行ない２度洗浄した後、凍結乾燥した。

この乾燥菌体を１０１／ｌの濃度で１モルの７マール酸
ナトリウムと接融させｊＯ〜７０”Ｃ１３０分反応し生
成するＬ−リンゴ酸よシフマラーゼ活性を測定した。結
果を第３表に示す。

第３表 戸− 二つ ［パ ■ ［パ バ １′ 実施例２゜ バチルス・プミルスＴ−！３０菌をグルコースカリウム
０．　／　、！ｉｌ　／ｄ！、　　リン酸二カリウム０
．３ｊｉ／ａ１塩化アンモニウム０．　！Ｊ　／ｄ！　
、硫酸マグネシウム０．０　／　ｉ／ｄ１．　硝０アン
モニウムα／ｇ／ａ１塩化カルシウムＯ９θ００　／　
ｌ　／　ｄｌ、　Ｎ１ｔｓｃｈｅ’５ｔｒａｃｅ　ｅｌ
ｅｍｅｎｔ　／ｄ　／　ｌの組成を有しＰ　Ｈ７，４に
調整した３００ｒｎｔの培地を含むｕｊ容量バッフル付
フラスコＩＩＣｊ　０１１１の容量の前培養液（培地は
上記と同じ）を植菌し４ｔｒ’ｃで３１時間培養した。

フマラーゼ活性を測定したところ−よ！ｕｎｉ’、／ｐ
、ｃθ１１の菌体が得られた。

この凍結乾燥菌体をｊ　０１／ｌのａ夏で超音波処理し
た。かくして得られた粗酵素液を隘イオン交換樹脂であ
る吸着担体に接触させ固定化酵素を作成した。

まずデュオライ）−Ａ７をレジン水にて十分に洗浄して
からｏ、　／　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨＬｏ）で緩衝
化する。次に、上記で調整した粗醪素を活性値として／
　００〜２００　ｕｎｉｔ／ｄ−樹脂の割で、ｔ！〜７
Ｊ”Ｃで負荷し／を時間吸着固定化させる。蛋白吸着量
はりＯチ以上であった。

その後、酵素の安定化剤として０．／％フマール酸ナト
リウム、架橋剤としてＯ９−一グルタールアルデヒドを
０．　／チリン酸緩衝液に溶かしたものを３０分間反応
させ、十分洗浄して固定化面素とした。

この固定化酵素を１０ｒｘｌ容量のジャケット付カラム
に充填しぶ０℃流速Ｓ　Ｖ　：　０．　／で／Ｍフマー
ル酸ナトリウムを流したところ約７０％の転換率でＬ　
　＋７ンゴ酸がｌＯ日日間わたって連続生産可能であっ
た。

高温操作の為、雑菌汚染もなく、非常に安定したＬ−リ
ンゴ酸の生産がなされた。

実施例２　　　。

実施例コと同様の合成培地でバチルス・υヶニホルミス
Ｔ−、ｊ／／菌を３０℃で、４Ｌｔ時間培養したところ
、約ユ０１／ｌの菌体が得られた。この菌体のフマラー
ゼ活性は、２ｒＯｕｎｉｔ／Ｊ−ｃｅ］ｊ、であった。

次に得られた菌体を十分洗浄して凍結乾燥菌体としてか
ら、コラーゲン・フィブリル液と混合して、テフロン・
シート状にキャスティングすることによシ、コラーゲン
包括面体を作成した。

このコラーゲン包括菌体をチップ状に細断してカラムに
充填し流速ＢＴ＝０．０！、３０℃で／Ｍフマール酸マ
グネシウムを通液したところｔ！チ程度の転換率で７日
間安定したＬＩＪンゴ酸の生成が確認された。

副生成物を高速液体クロマトグラフィーにて確認したと
ころフマール酸とＬ−リンゴ酸以外の他の有機酸類は検
出されなかった。

実施例Ｌ サーマス・ルーベンス・ノブ・エスピー屑１０λ菌を実
施例／と同様に培養する。得られた菌体（ｔｏｙ／ｌ）
を超音波破砕する。

この破砕液をＤＥＡＥ・セファデックスＧ−、ｌよを充
填したカラムに通塔し、０−０．ＡＭ食塩水で濃度勾配
溶出させ、フマラーゼ活性区分を集めた。これを硫安７
０チ飽和とし、生じた沈殿をリン酸緩衝液（ｐＨ＆ｊ）
で透析する。

この透析液をＤＥＡＥ・セルロースを用いｐＨ？：Ｊ’
にてカラムクロマトグラフィーを行い、ついで溶出液を
ハイドロキシ・アパタイトでカラムクロマトを行い、凍
結乾燥を行って、フマラーゼ粉末を得る。得られたフマ
ラーゼの蛋白当）の比活性はセルフリー抽出液の約５０
倍であった。

ここで得られたフマラーゼを蛋白換算約！２１ｇ／ｊの
濃度で／Ｍ７マール酸ナトリウムとｔＯ℃、ｐＨ７２で
２０時間接鯉させたところ約１０％の転換率でＬ　　１
７ンゴ酸が得られる。

実施例２ バチルス・プミルスＴ−！３０菌を実施例／と同様にし
て１Ｉｔｊ”ｌ：、コ≠時間培養する。得られる菌体を
実施例？と同様に処理してフマラーゼ粉末を得る。得ら
れたフマラ−ゼの蛋白当シの比活性はセルフリー抽出液
の約ｔｏ倍であった。

ここで得られたフマラーゼを蛋白換７４１０　ｒ、９／
ｌの濃度で１Ｍフマール酸ナトリウムと１ＬＬ３℃、ｐ
Ｈ７，３で２０時間接触させたところ約７１％の転換率
でＩ、　　ＩＪンゴ酸が得られる。

実施例／　０゜ サーマス・アクアティクス／１６１０≠菌を実施例／の
培地にフマール酸アンモニウム２２／ｌ添加した培地中
、７０℃で３を時間培養したところ−００ｕｎｉｔ／ｙ
　ｄｒ７ｃｅｌ：Ｌの７マラーゼ活性を有する菌体が得
られた。

菌体分離後、菌体を十分洗浄して凍結乾燥品とした。本
゛品をｒ　ｏ　ｔ　／　ｌの濃度で超音波処理し粗ひ葉
液を調製した。これを陰イオン丈換樹脂でらる吸着担体
に接触させ固定化酵素を作成した。まずデュオライ）Ａ
−７（米国、ダイヤモンドジャムロックケミカル社製）
をレジン水で十分に洗浄してから０．７　Ｍリン酸緩衝
液（ｐａＡ、Ｏ）で緩衝化する。これに上記で調製した
粗醒素液をフマラーゼ活性値として１ｏｏ−λ００ｕｎ
ｉ　ｔ□樹脂の割合でぶｊ〜７Ｉ”Ｃで負荷し、／Ｇ時
間吸着固定化させる。蛋白吸着量はりＱチ以上であった
。その後７マラーゼの安定化剤として１ｙ７ｔのフマー
ル酸ナトリウム、栗橋剤として２９／ｌのゲルタールア
ルデヒドを０．　／チリン酸級衝液に溶かしたものを３
０分間反応させ十分洗浄して標品を得た。

この固定化群素を！Ｏｄ容量のコーン型流動暦にｊＯｒ
ｄ充填し、１モルフマール酸マグネシウムを違、視的に
通液したところＳＶ　＝　Ｏ，μ、７．０℃で？よチ以
上の転換率で安定してＬ−リンゴ酸マグネシウムが得ら
れた。反応液は完全清泄液であシ酵素の洩れもなぐ、ま
た高温操作の為、雑菌汚染もなく効率よいＬ−リンゴ酸
の生産が可能であった。

実施例／　／。

実施例コで得られたサーマス・ルーウス、　／７’ニビ
ーの凍結乾燥物に１モルフマール酸アンモニウムを４０
℃、！時間作用させたところ本凍結乾燥物にはアスパル
ターゼ活性がほとんどな（、Ｌ−リンゴ酸アンモニウム
がｒ＜ｔｅｌの転換率で得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第弘図は、サーマス属菌により生産される本酵
素の至適ｐｇ、安定ｐＨ範範囲作用適温の範囲および温
度安定性をそれぞれ示す。 第ｊ図〜第ｒ図は、バチルス属菌によシ生産される本酵
素の至適ｐ”ｓ安定ｐＨ範囲、作用適温の範囲および温
度安定性をそれぞれ示す。 泥　１　口 Ｐ）ｌ ５　　６　　　′７Ｂ’（ 第３１コ 菓１−　図 ’；ＯＧｏ　　　　７０　　　　ＢＯ シ３ｔノ困　（°こ　） 扇　シロ Ｈ 罵　６図 ｔ′１″′ｌ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 新菌種　サーマス・ルーベンス。