JPH0137114B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規好熱性フマラーゼ、その製造法お
よび該酵素を生産する能力を有する微生物ならび
に該酵素を利用するＬ−リンゴ酸の製造法に関す
る。 Ｌ−リンゴ酸は輸液の成分として利用され、ま
た清涼飲料水の酸味料としての用途も広がりつつ
ある重要な物質である。現在Ｌ−リンゴ酸の製造
法としてはマレイン酸より化学的に得られるDL
−リンゴ酸の光学分割法、微生物由来のフマラー
ゼを利用する方法、微生物の直接発酵による方法
などがあるが、微生物由来のフマラーゼを利用す
る方法が実用的である。微生物由来のフマラーゼ
を利用した例としては、北原等による乳酸菌ラク
トバチルス・ブレビスをフマール酸カルウムに作
用させＬ−リンゴ酸カルシウムとして析出させる
方法（特公昭37−4511）、酵母を用いフマール酸
から酵素的にＬ−リンゴ酸を製造する方法（特開
昭52−130587）およびブレビバクテリウム・アン
モニアゲネスを用いフマール酸から酵素的にＬ−
リンゴ酸を製造する方法（ヨーロピアン・ジマー
ナル・オブ・アブライト・ミクロバオロジー、第
３巻、169頁、1976年）などが知られている。特
公昭37−4511記載の方法は、石膏の副生および増
殖不良などの欠点があり、後二者は酵素反応を常
温で行うので実用上難点がある。 発酵操作、酵素反応などを高温条件で行なえる
ことは、雑菌汚染防止、酵素反応の迅速性、冷却
エネルギーの節約などの点から極めて有利であ
る。 本発明者らは、熱安定なフマラーゼを得る目的
で種々の好熱性細菌についてフマラーゼ活性を調
べた結果、サーマス属およびバチルス属に属する
高度好熱性細菌が好熱性のフマラーゼ活性を有す
ることを見出し本発明を完成するに到つた。 従つて本発明は、新規好熱性フマラーゼ、その
製造法および該酵素を生産する能力を有する微生
物ならびに該酵素を利用するＬ−リンゴ酸の製造
法に関し、以下にその詳細を説明する。 本発明に係る高度好熱性フマラーゼは、該酵素
を生産する能力を有する微生物を栄養倍地に培養
し、培養物中に該酵素を蓄積せしめ、該培養物か
ら該酵素を採取することによつて製造することが
できる。 本発明で使用する微生物は高度好熱性フマラー
ゼを生産する能力を有するものならいかなる菌株
を用いてもよいが、具体的にはサーマス属または
バチルス属に属する菌株、例えばサーマス・アク
アテイクス（Thermus aquaticus）No.104（微工
研菌寄第5150号、ATCC31558）、サーマス・ラク
テウス・ノブ・エスピー（Thermus lacteus
nov.sp.）No.108（微工研菌寄第5149号、
ATCC31557）、サーマス・ルーベンス・ノブ・エ
スピー（Thermus rubens nov.sp.）No.102（微工
研菌寄第5148号、ATCC31556）、サーマス・アク
アテイクスATCC25104、サーマス・アクアテイ
クスATCC25105、サーマス・サーモフイルス
（Thermus thermophilus）ATCC27634、バチル
ス・リケニホスミス（Bacillus licheniformis）
Ｔ−511（微工研菌寄第5151号、NRRL Ｂ−
12024）、バチルス・プミルス（Bacillus
pumilus）Ｔ−530（微工研菌寄第5152号、
NRRLB−12025）、バチルス・ズブチリス
（Bacillus subtilis）ATCC6051、バチルス・リ
ケニホルミスATCC11560、バチルス・ステアロ
サーモフライス（Bacillus stearothermophilus）
ATCC12016、バチルス・コアギユランス
（Bacillus coagulans）ATCC7050などがあげら
れる。 上記微生物の菌学的性質については下記文献に
それぞれ記載がある。 サーマス・アクアテイクス Bergey′s
Manual of Determinative Bacteriology第８
版285頁 サーマス・サーモフイルス 特開昭51−115988号
公報 バチルス・リケニホルミス Bergey′s Manual
of Determinative Bacteriology第８版、534
頁 バチルス・プミルス 同上、533〜534頁 バチルス・ズブチリス 同上、531〜533頁 バチルス・ステアロサーモフライス 同上、539
〜540頁 バチルス・コギユランス 同上、540〜541頁 尚、本発明者らが分離したサーマス・アクアテ
イクスNo.104、サーマス・ラクテウス・ノブ・エ
スピーNo.108およびサーマス・ルーベンス・ノ
ブ・エスピーNo.102の菌学的性質および同定の根
拠について以下に示す。

【表】

【表】

【表】 上述の菌学的性質をもとにして、バージーのマ
ニユアル・オブ・デターミナテイブ・バクテリオ
ロジー第８版およびジヤーナル・オブ・バクテリ
オロジー98巻289−297頁（1969）、インターナシ
ヨナル・ジヤーナル・オブ・システマテイツク・
バクテリオロジー24巻102−112頁（1974）、同25
巻357−364頁（1975）、アグリカルチユラル・バ
イオロジカルケミストリー36巻2357−2366頁を参
考にして、公知の菌株とその異同を検討した。 上記の３菌株は、グラム陰性、無胞子、非運動
性、好気性の桿菌ないし糸状桿菌で、生育至適温
度60℃以上の偏性好熱菌であるところから、サー
マス属に属するものと考えられる。No.104菌は、
同定実験に際し対照菌として使用したサーマス・
アクアテイクスの標準株についての実験結果ある
いは、前記報文中の記載とほぼ完全に一致するの
で、サーマス・アクアテイクスと同定した。No.
108菌株は、(1)コロニーがクリーム色であること、
(2)ガラクトース、ラクトース、グリセロールから
の酸生成が異なること (3)グルタミン酸の要求性
がない点からサーマス・アクアテイクスと区別で
き、新種と見なし、サーマス・ラクテウス・ノ
ブ・エスピーと命名した。No.102菌は、(1)コロニ
ーが赤橙色であること (2)生育至適温度が低いこ
と (3)至適PHが低いこと (4)グリセロール、マニ
トールからの酸性成が異なる点からサーマス・ア
クアテイクスと区別でき、新種と見なし、サーマ
ス・ルーベンス・ノブ・エスピーと命名した。 これらの菌株の培養について述べる。これらの
菌株の培養においては通常の好熱性細菌の培養法
が一般に用いられる。 炭素源としてはシユークロース、マンノース、
澱粉、糖蜜、グリセリン、マニトール等の糖質お
よび糖アルコールが単独または組合せて用いられ
る。またた菌の資化性によつては炭化水素、アル
コール類、有機酸等も用いうる。窒素源としては
硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アン
モニウム、硝酸ソーダ、尿素等の無機窒素源、あ
るいはボリペプトン、ペプトン、イーストエキ
ス、コーン・スチーブ・リカー、アミノ酸等の有
機窒素源を単独または組合せて用いることができ
る。 またフマール酸等有機酸やMn、Co、Mg
、Moを含む各種塩の添加により菌の生育や
酵素の生産が促進される。培養法としては液体培
養法が適している。培養温度は50〜80℃でPHは中
性付近で培養を行なうことが望ましい。 培養終了後、培養液より好熱性フマラーゼを彩
取するには一般の酵素採取法を用いることがで
き、本酵素は菌体内酵素であるため、例えば次の
ような方法で単離することができる。 まず得られた菌体を50ｇ／程度の濃度でダイ
ノミール（シンマルエンタープライス）にかけ無
細胞抽出液を得る。これを40〜70％の硫酸アンモ
ニウムで24時間塩析する。緩衝液は0.1Mトリ
ス・塩酸液を使用する。 次に、DEAE・セフアデツクスＧ−25（生化学
工業社製）カラムに吸着させ０〜0.6M食塩水で
濃度勾配に溶出させ活性区分を集める。次にこの
画分を硫酸アンモニウム70％飽和にし、生じた沈
澱を集めてPH約6.5のリン酸緩衝液で透析する。
さらにDEAE・セルロース（生化学工業社製）、
DEAE・セフアデツクスＧ−50（生化学工業社
製）、最後にハイドロキシ・アパタト（生化学工
業社製）に吸着・溶出させて本酵素を得る。 本酵素の活性の測定は次のように行う。 0.1Mフマール酸ナトリウムと本酵素、菌体ま
たは菌体処理物とを（DCW換算10ｇ／）接触
させ、PH7.0、温度40〜70℃で30分間反応を行う。
反応液をＬ−リンゴ酸として５〜80γ程度になる
ように稀釈する。 稀釈液１mlを採取し、これに濃硫酸６mlを加え
て十分に撹拌後、２，７−ナフタレンジオール
（１ｇ／10ml・濃硫酸）0.1mlを加えて沸とう水中
に20分間浸漬する。 これを冷却後390nｍでの吸収値よりＬ−リン
ゴ酸量を算出し、この値から酵素活性を算出す
る。その他高速液体クロマトグラフイー法、マリ
ツクエンザイム法、過マンガン酸カリウムによる
フマール酸の定量法等が使用可能である。いずれ
の場合も酵素活性は国際単位（unit／ｇ・min）
で表示する。 次に得られた酵素の性質について述べる。サー
マス属、バチルス属により生産される酵素は若干
性質に差があるので、別々に記載する。 サーマス属菌（サーマス・アクアテイクスNo.
104より得た酵素を代表として示す） (1) 作用および基質特異性 フマール酸およびＬ−リンゴ酸にのみ作用
し、Ｌ−リンゴ酸からフマール酸および水を生
成する反応およびその逆反応を触媒する。 (2) 至適PH 0.2Mリン酸緩衝液（PH６〜８）、0.2Mトリ
ス・塩酸緩衝液（PH８〜９）中での活性を60℃
10分間処理にて測定した。結果は第１図に示す
通りであつて、PH7.2付近に至適PHがある。一
般に動物起源、および常温菌産生のフマラーゼ
はアルカリ側に至適PHがあるが、好熱性フマラ
ーゼは一般的に中性かあるいは若干酸性側に至
適PHを有している。 (3) 安定PH範囲 0.2Mリン酸緩衝液（PH5.5〜8.0）、0.2Mトリ
ス・塩酸緩衝液（PH8.0〜9.0）中、60℃、16時
間処理し、1Mフマール酸ナトリウム（PH7.2）
を添加し60℃、30分反応して活性を測定した。
結果は第２図に示す通りである。PH8.0でバツ
フアーにより活性に約２倍の差が生じたが図の
ようにPH5.5〜7.5までは相対的に安定と思われ
る。 (4) 作用適温の範囲 50〜85℃の範囲でPH7.2で10分間反応した。
結果は第３図の通りであり、70℃付近に至適温
度がある。 (5) 温度安定性 本酵素を0.1Mリン酸緩衝液（PH7.2）中50〜
80℃に30〜120分間処理した後1Mフマール酸ナ
トリウムを加えて60℃、10分間反応して活性を
測定した。結果は第４図に示す通りである。60
℃までは100％安定である。 (6) 阻害、活性化および安定化 本酵素はある種の２価の金属イオンにて若干
の活性化を示す。その順序はCo＞Zn＞Mg
であり、Cuは若干の阻害作用を示す。ｏ
−フエナンスロリン、α，α′−ジピリジルなど
の金属キレート試薬により阻害を受ける。 (7) 分子量 内部標準蛋白としてチトクローム−Ｃ、オバ
ルプミン、γ−グロブリンを使用してセフアデ
ツクスＧ−200によるゲル過を行つた結果、
分子量は約18万であつた。 バチルス属菌（バチルス・リケニホルミスＴ−
511より得た酵素を代表として示す） (1) 作用および基質特異性 フマール酸およびＬ−リンゴ酸にのみ作用
し、Ｌ−リンゴ酸からフマール酸および水を生
成する反応およびその逆反応を触媒する。 (2) 至適PH 本酵素を0.2M酢酸緩衝液（PH５〜6.5）、
0.2Mリン酸緩衝液（PH6.5〜8.5）、0.2Mトリ
ス・塩酸緩衝液（PH8.5〜10.0）中での活性を
50℃30分間処理にて測定した。結果は第５図に
示す通りであつて、PH7.0付近に至適PHを有す
る。 (3) 安定PH範囲 上記の緩衝液中50℃でPH範囲5.0〜10.0にて
16時間処理後、60℃、PH7.0で活性を測定した。
結果は第６図に示す通りで、安定PH範囲はPH
7.0〜7.8で安定である。 (4) 作用適温の範囲 40〜80℃の範囲でPH7.0で10分間反応した。
結果は第７図に示す通りであり、50〜60℃に至
適温度がある。 (5) 温度安定性 酵素液を40〜80℃にPH7.0で30〜120分間処理
した後1Mフマール酸ナトリウムを添加して50
℃、10分間反応して活性を測定した。第８図に
示すように60℃までは100％安定である。 (6) 阻害、活性化および安定化 本酵素はCo、Zn、Mg、Mo等の２
価の金属イオンにて若干の活性化を示す。基質
であるフマール酸塩の存在で安定化作用が認め
られている。CuおよびＯ−フエナンスロリ
ン、α，α′−ジピリジルなどの金属キレート試
薬は若干の阻害作用を示す。 (7) 分子量 内部標準蛋白としてチトクロームＣ、オバル
ブミン、γ−グロブリンを使用してセフアデツ
クスＧ−200によるゲル過を行つた結果、分
子量は約18万であつた。 本酵素、本酵素を含有する菌体または該菌体の
処理物をフマール酸に作用させることによつてＬ
−リンゴ酸を製造することができる。反応は通常
40〜80℃、PH6.0〜8.0で行う。反応に際してのフ
マール酸濃度は0.2〜1.7モル程度が適当である。
また酵素濃度は５〜50units／ml程度が適当であ
る。 反応に際してフマール酸は通常塩として用い
る。用いられる塩としてはナトリウム塩、カリウ
ム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩
などがあげられる。従来のフマラーゼを用いる場
合は、溶解度の関係から１価の金属塩の使用に限
られていたが、本発明の耐熱性フマラーゼの使用
により２価の金属塩の使用も可能になり、Ｌ−リ
ンゴ酸への転換率が著しく向上した。 反応に際しては酵素、菌体、菌体処理物を固定
化して用いることにより実用的にＬ−リンゴ酸を
製造することができる。これらの固定化は酵素、
菌体等の固定化に用いられる一般的方法により行
うことができる。たとえば、酵素液はフマラーゼ
を吸着しうる一般的な陰イオン交換樹脂と接触さ
せればよく、菌体の固定化には、エチルセルロー
ス、酢酸、酪酸セルロース等によるマイクロカプ
セル化、アクリルアミド系単量体によるゲル包
括、ポリビニールアルコールによる包括、コラー
ゲンによる膜状包括等が用いられる。また単に菌
体を充填混合剤と混合し、架橋剤等で処理する方
法、たとえばゼラチン・グルタールアルデヒド
法、キトサン・グルタールアルデヒド法、カラゲ
ーニン・グルタールアルデヒド法、アルブミン・
ジアルデヒドデンプン法などが利用できる。 反応液からのＬ−リンゴ酸の採取は反応液を常
法によりイオン交換樹脂、活性炭処理を行つた
後、濃縮、晶析することにより得ることができ
る。 実施例 １ ポリペプトン0.8ｇ／dl、イーストエキス0.4
ｇ／dl、塩化ナトリウム0.2ｇ／dlの組成を有し
PH7.0に調整した培地30mlを含む300ml容量フラス
コにサーマス・アクアテイクスNo.104菌、サーマ
ス・ラクテウス・ノブ・エスピーNo.108菌、サー
マス・ルーベンス・ノブ・エスピーNo.102菌、サ
ーマス・アクアテイクスATCC25104、
ATCC25105、サーマス・サーモフイルス
ATCC27634を接種し、50〜80℃にて16時間振と
う培養する。次にこの培養物全量を同組成の培地
に300mlを含む２容量バツフル付フラスコに植
菌し同温度で26時間振とう培養する。この培養液
をさらに同組成の培地３を含む５容量ジヤー
フアーメンターに植菌して50〜80℃、通気量
0.8v.v.m.、撹拌300r.p.m.にて24時間培養した結
果第２表に示す量の菌体が得られた。得られた菌
体を10000Gにて遠心分離を行ない、２度洗浄を
繰り返した後、凍結乾燥した。この乾操菌体を１
モルのフマール酸ナトリウムと接触させ50〜80
℃、30分反応し生成するＬ−リンゴ酸よりフマラ
ーゼ活性を測定したところ第２表に示す如き結果
であつた。

【表】

【表】 実施例 ２ 実施例１と同様の培地にフマール酸を0.2ｇ／
dl添加してサーマス・ルーベンス・ノブ・エスピ
ーNo.102菌を60℃で24時間培養した。フマラーゼ
活性を測定したところ900unit／ｇ・cellの菌体が
得られた。この菌体を凍結乾燥し、この凍結乾燥
菌体を用いて固定化微生物を作成した。分散媒と
しての水600mlに分散剤としてエマルゲン−985
（花王アトラス社製）を7.2ｇ、セロゲン−PR（第
一工業製薬社製）を３ｇ溶解し、強撹拌下５〜10
℃に冷却しておく。一方凍結乾燥菌体15ｇを0.9
％生理食塩水50mlと菌体凝集剤である１％キトサ
ン水15mlに均一に懸濁しておく。酢酸・酪酸セル
ロース381−20（イーストマン・ケミカルインター
ナシヨナルLtd製）15ｇと分散剤としてアルラセ
ル−83（花王アトラス社製）３ｇを135ｇの酢酸イ
ソブチルに溶かしたものを十分に撹拌し、均一な
Ｗ／Ｏエマルジヨンとする。この菌体懸濁液と酢
酸・酪酸セルロースによるＷ／Ｏエマルジヨンを
先の冷却撹拌中の分散媒にロートを用いて適下
し、適下後ｎ−ヘキサン1200mlを徐々に定量ポン
プで添加する。その結果、酢酸・酪酸セルロース
内に菌体が包括された、強固で均一な粒径の固定
化微生物が液中に析出する。これを布等で取
し、十分に洗浄して反応に使用する。 得られた固定化微生物を用いて1M−フマール
酸ナトリウムからＬ−リンゴ酸への転換を60℃、
流速SV＝0.5にて連続カラム運転によつて行つた
ところ、75％以上の転換率でＬ−リンゴ酸の生産
が１ヶ月以上可能であつた。 さらに常温では使用しがたいフマール酸マグネ
シウムも一モルの濃度で60℃では可溶であり、こ
れを用いたところ85％以上の転換率で安定したＬ
−リンゴ酸マグネシウムが得られた。これにより
常温で使用し難いマグネシウム塩を用いたことに
より反応率が10％以上上昇し未反応フマール酸の
回収工程も縮少され精製工程も簡略された。 実施例 ３ サーマス・アクアテイクスNo.104菌を実施例１
の培地にフマール酸アンモニウム0.2ｇ／dl添加
した培地中、70℃で36時間培養したところ
200unit／ｇ・cellのフマラーゼ活性を有する菌体
３ｇ／が得られた。 菌体を十分洗浄してから凍結乾燥し、この凍結
乾燥菌体を50ｇ／の濃度で超音波処理し粗酵素
液を調製した。 この粗酵素液を陰イオン交換樹脂である吸着担
体に接触させ固定化酵素を作成した。 まずデユオライト−A7（米国ダイヤモンドシヤ
ムロツクケミカル社製）をレジン水にて十分に洗
浄してから0.1Mリン酸緩衝液（PH6.0）で緩衝化
する。これに上記で調製した粗酵素液を活性値と
して100〜200unit／ml樹脂の割で、65〜75℃で負
荷し、16時間吸着固定化させる。蛋白吸着量は90
％以上であつた。その後酵素の安定化剤として
0.1％フマール酸ナトリウム、架橋剤として0.2グ
ルタールアルデヒドを0.1％リン酸緩衝液に溶か
したものを30分間反応させ、十分洗浄して固定化
酵素とした。この固定化酵素を50ml容量のコーン
タイプ流動層に30ml充填して1Mフマール酸ナト
リウムからＬ−リンゴ酸への転換を連続カラム運
転によつて行つたところ、SV＝0.4、70℃で約20
日間の間、転換率80％でＬ−リンゴ酸の連続生産
が可能であつた。反応液は完全清澄液であり、酵
素の洩れもなく、また高温操作の為、雑菌汚染も
なく非常に効率よいＬ−リンゴ酸の生産が可能で
あつた。 実施例 ４ サーマス・ラクテウス・ノブ・エスピーNo.108
菌を実施例３と同様の培地で70℃で24時間培養し
たところ300unit／ｇ・cellのフマラーゼ活性の菌
体が得られた。 得られた菌体をコラーゲン・フイブリル液と十
分に混合してテフロンシート上にキヤステイング
して固定化微生物とした。この固定化微生物をチ
ツプ状に細断してカラムに充填して1Mフマール
酸マグネシウムをSV＝0.5で通液したところ90％
以上の転換率で10日間以上安定したＬ−リンゴ酸
の生成が確認された。 高速液体クロマトグラフイーShodex Ionpak
Ｃ−811（昭和電工社製）で反応液を分析したとこ
ろ、Ｌ−リンゴ酸とフマール酸のみが検出され、
他の不純物は皆無であつた。 実施例 ５ 1/2濃度のブイヨン培地にて活性化スラントと
したバチルス・リケニホルミスＴ−511菌、バチ
ルス・プミルスＴ−530菌、バチルス・ズブチリ
スATCC6051およびバチルス・リケニホルミス
ATCC11560をポリペプトン0.8ｇ／dl、イース
ト・エキス0.4ｇ／dl、食塩0.2ｇ／dlの組成を有
し、PH7.0に調整した培地30mlを含む300ml容量フ
ラスコに接種し第３表に示す温度で24時間培養す
る。 次にこの培養物全量をグルコース３ｇ／dl、ペ
プトン１ｇ／dl、イーストエキス0.25ｇ／dl、リ
ン酸−カリウム0.1ｇ／dl、リン酸二カリウム0.1
ｇ／dl、硫酸マグネシウム0.1ｇ／dl、硫酸鉄
0.002ｇ／dl、硫酸マンガン0.00005ｇ／dl、硫酸
亜鉛0.001ｇ／dl、β−アラニン0.0005ｇ／dlの
組成を有しPH7.2に調整した培地300mlを含む２
容量バツフル付フラスコに植替えて第３表に示す
温度で24時間培養した結果第３表に示す量の菌体
が得られた。得られた菌体を10000Gにて遠心分
離を行ない２度洗浄した後、凍結乾燥した。 この乾燥菌体を10ｇ／dlの濃度で１モルのフマ
ール酸ナトリウムと接触させ50〜70℃、30分反応
し生成するＬ−リンゴ酸によりフマラーゼ活性を
測定した。結果を第３表に示す。

【表】 実施例 ６ バチルス・プミルスＴ−530菌をグルコース３
ｇ／dl、硫酸ナトリウム0.2ｇ／dl、リン酸−カ
リウム0.1ｇ／dl、リン酸二カリウム0.3ｇ／dl、
塩化アンモニウム0.5ｇ／dl、硫酸マグネシウム
0.01ｇ／dl、硝酸アンモニウム0.1ｇ／dl、塩化
カルシウム0.0001ｇ／dl、Nitsche′strace
element1ml／の組成を有しPH7.2に調整した300
mlの培地を含む２の容量バツフル付フラスコに
30mlの容量の前培養液（培地は上記と同じ）を植
菌し45℃で32時間培養した。 フマラーゼ活性を測定したところ255unit／
ｇ・cellの菌体が得られた。 この凍結乾燥菌体を50ｇ／の濃度で超音波処
理した。かくして得られた粗酵素液を陰イオン交
換樹脂である吸着担体に接触させ固定化酵素を作
成した。 まずデユオライト−A7をレジン水にて十分に
洗浄してから0.1Mリン酸緩衝液（PH6.0）で緩衝
化する。次に、上記で調整した粗酵素を活性値と
して100〜200unit／ml・樹脂の割で、65〜75℃で
負荷し16時間吸着固定化させる。蛋白吸着量は90
％以上であつた。その後、酵素の安定化剤として
0.1％フマール酸ナトリウム、架橋剤として0.2％
グルタールアルデヒドを0.1％リン酸緩衝液に溶
かしたものを30分間反応させ、十分洗浄して固定
化酵素とした。 この固定化酵素を10ml容量のジヤケツト付カラ
ムに充填し60℃流速SV＝0.1で1Mフマール酸ナ
トリウムを流したところ約70％の転換率でＬ−リ
ンゴ酸が10日間にわたつて連続生産可能であつ
た。 高温操作の為、雑菌汚染もなく、非常に安定し
たＬ−リンゴ酸の生産がなされた。 実施例 ７ 実施例２と同様の合成培地でバチルス・リケニ
ホルミスＴ−511菌を50℃で、48時間培養したと
ころ、約20ｇ／の菌体が得られた。この菌体の
フマラーゼ活性は280unit／ｇ・cellであつた。 次に得られた菌体を十分洗浄して凍結乾燥菌体
としてから、コラーゲン・フイブリル液と混合し
て、テフロン・シート状にキヤステイングするこ
とにより、コラーゲン包括菌体を作成した。 このコラーゲン包括菌体をチツプ状に細断して
カラムに充填し流速SV＝0.05、50℃で1Mフマー
ル酸マグネシウムを通過したところ85％程度の転
換率で７日間安定したＬ−リンゴ酸の生成が確認
された。 副生成物を高速液体クロマトグラフイーにて確
認したところフマール酸とＬ−リンゴ酸以外の他
の有機酸類は検出されなかつた。 実施例 ８ サーマス・ルーベンス・ノブ・エスピーNo.102
菌を実施例１と同様に培養する。得られた菌体
（50ｇ／）を超音波破砕する。 この破砕液をDEAE・セフアデツクスＧ−25を
充填したカラムに通塔し、０〜0.6M食塩水で濃
度勾配溶出させ、フマラーゼ活性区分を集めた。
これを硫安70％飽和とし、生じた沈殿をリン酸緩
衝液（PH6.5）で透析する。 この透析液をDEAE・セルロースを用いPH7.5
にてカラムクロマトグラフイーを行い、ついで溶
出液をハイドロキシ・アパタイトでカラムクロマ
トを行い、凍結乾燥を行つて、フマラーゼ粉末を
得る。得られたフマラーゼの蛋白当りの比活性は
セルフリー抽出液の約50培であつた。 ここで得られたフマラーゼを蛋白換算約５mg／
の濃度で1Mフマール酸ナトリウムと60℃、PH
7.2で20時間接触させたところ約80％の転換率で
Ｌ−リンゴ酸が得られる。 実施例 ９ バチルス・プミルスＴ−530菌を実施例１と同
様にして45℃、24時間培養する。得られる菌体を
実施例８と同様に処理してフマラーゼ粉末を得
る。得られたフマラーゼの蛋白当りの比活性はセ
ルフリー抽出液の約60培であつた。 ここで得られたフマラーゼを蛋白換算10mg／
の濃度で1Mフマール酸ナトリウムと45℃、PH7.5
で20時間接触させたところ約78％の転換率でＬ−
リンゴ酸が得られる。 実施例 10 サーマス・アクアテイクスNo.104菌を実施例１
の培地にフマール酸アンモニウム２ｇ／添加し
た培地中、70℃で36時間培養したところ
200unit／ｇ・drycellのフマラーゼ活性を有する
菌体が得られた。菌体分離後、菌体を十分洗浄し
て凍結乾燥品とした。本品を50ｇ／の濃度で超
音波処理し粗酵素液を調整した。これを陰イオン
交換樹脂である吸着担体に接触させ固定化酵素を
作成した。まずデユオライトＡ−７（米国、ダイ
ヤモンドシヤムロツクケミカル社製）をレジン水
で十分に洗浄してから0.1Mリン酸緩衝液（PH
6.0）で緩衝化する。これに上記で調整した粗酵
素液をフマラーゼ活性値として100〜200unit／ml
樹脂の割合で65〜75℃で負荷し、16時間吸着固定
化させる。蛋白吸着量は90％以上であつた。その
後フマラーゼの安定化剤として１ｇ／のフマー
ル酸ナトリウム、架橋剤として２ｇ／のグルタ
ールアルデヒドを0.1％リン酸緩衝液に溶かした
ものを30分間反応させ十分洗浄して標品を得た。 この固定化酵素を50ml容量のコーン型流動層に
30ml充填し、１モルフマール酸マグネシウムを連
続的に通液したところSV＝0.4、70℃で85％以上
の転換率で安定してＬ−リンゴ酸マグネシウムが
得られた。反応液は完全清澄液であり酵素の洩れ
もなく、また高温操作の為、雑菌汚染もなく効率
よいＬ−リンゴ酸の生産が可能であつた。 実施例 11 実施例２で得られたサーマス・ルーベンス・ノ
ブ・エスピーの凍結乾燥物に１モルフマール酸ア
ンモニウムを60℃、５時間作用させたところ本凍
結乾燥物にはアスパルターゼ活性がほとんどな
く、Ｌ−リンゴ酸アンモニウムが84％の転換率で
得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第４図は、サーマス属菌により生産さ
れる本酵素の至適PH、安定PH範囲、作用適温の範
囲および温度安定性をそれぞれ示す。第５図〜第
８図は、バチルス属菌により生産される本酵素の
至適PH、安定PH範囲、作用適温の範囲および温度
安定性をそれぞれ示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ コロニーの色が赤橙色で、生育至適温度およ
   び生育至適PHが低く、かつグリセロール、マニト
   ールから酸を生成することを特徴とする新菌種サ
   ーマス・ルーベンス。