JPS63129998A - アルカリフオスフアタ−ゼの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生化学検査におけるアルカリフォスファター
ゼ（ＡＬＰ）の測定法に係り、特に低活性領域から希釈
することなく高活性領域にねってＡＬＰを精度よく測定
する方法に関する。

〔従来の技術〕

生化学検査におけるＡ　Ｌ　Ｐの測定法は、特開昭和５
６−４４３２５号、特開昭和５７−１５９４９９号、あ
るいは「実践臨床化学Ｊ　　（ｍ著、北村、仁科）に示
され、その測定法は、反応生成物から次の様に分類され
る。即ち、基質としてβ−グリセロリン酸を用いて遊離
したリン酸を測定する方法（Ｂ　ｏｄａｎｓｋｙ法、Ｓ
　ｈｉｎｏｗａｒａ　−Ｊ　ｏｎｅｓ　−Ｒｅｉｎｈａ
ｒｔ法ｅｔｃ）　、及びフェノール類などを基質として
遊離するｐ−ニトロフェノールなどを測定する方法（Ｋ
ｉｎｄ　−Ｋｉｎｇ法、Ｂ　ｅｓｓｙ　−Ｌ　ｏｗｒｙ
法）に大別される。今日では、後老のフェノール類を基
質とした測定法が普及している。以下に代表的なＫｉｎ
ｄ　−Ｋｉｎｇ法及びＢ　ｅｓｓｙ　−Ｌ　ｏｗｒｙ法
によるＡＬＰの測定原理を示す。

）、 ）　（Ｋｉｎｄ　−Ｋｉｎｇ法〕 ＬＰ フェニルリン酸十Ｈ２Ｏ−−−→フェノール＋リン酸　
　（１）水温定法はフェニルリン酸塩を基質として用い
られる。すなわち反応式（１）により血清中ＡＬＰの作
用によって基質フェニルリン酸塩は、フェノールとリン
酸に加水分解される。次に反応式（２）によりこの遊離
したフェノールをメタ過ヨウ素ナトリウムの存在下で４
−アミノアンチピリンと酸化的に縮合させ、生成した赤
色のキノン（最大吸収５０５ｎｍ）を比色定量する方法
でＡ　Ｌ　Ｐの活性を求め測定法である。

ｒ　Ｂ　ｅｓＳｙ　−Ｌ　ｏｗｒｙ法」Ｐ−ニトロフェ
ニルリン酸＋Ｈｘ　０ 本測定法は、ｐ−ニトロフェニルリン酸塩を基質として
用いている。反応式（３）により血清中゛、）ＡＬＰの
作用によって、基質Ｐ−ニトロフェニル゛；リン酸塩は
Ｐ−ニトロフェノールとリン酸にＪＭされる。この遊離
したｐ−ニトロフェノールの増加速度を吸光度の上昇（
最大吸収波長４０５ｎｍ）として検出してＡＬＰの活性
値を求める測定法である。現在の自動分析装置ではＢ　
ｅｓｓｙ　Ｌ　ｏｗｒｙ法が主流となっている。ＡＬＰ
は、他の血清的酵素（ＬＤＨ，ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＬＡＩ
３等）と同じように生化学検査において、臨床上非常に
重要であることは良く知られている。

ＡＬＰの臨床的意義は、（１）骨疾患、（２）肝、胆臓
疾患、（３）腫瘍疾患などの各種疾患において、活性の
上昇を伴うことから、上記疾患の診断に有用であること
が多くの文献等で報告されている。血清内ＡＬＰ活性の
特徴は、末期重症疾患時に著しい高活性を示すことにあ
る。ＡＬＰの場合、正常状態（健常人）での血清的酵素
は、測定温度３７℃で１００〜２８０ＩＵ／αと言われ
ている。しかしながら末期重症疾患者の例えば閉塞性黄
痕では、健常人の数十倍（７ｏｏＯ工ｕ／Ｑ）以上に上
昇することが良く知られた事実である。

この様な現状からＡＬＰの測定における難しさは、低値
の正常域において高い精度（精密度）が要求される反面
、上記のごとく重症疾患時における著しい高値領域まで
測定しなければならないと言う相反する課題を背負って
いるところにある。

Ａ１、Ｐの測定法として現在一般的に多く用いられてい
るＢｅ５ｓｙ−Ｌｏｖｒｙ法を用いた従来の自動測定に
おける各試薬メーカ（Ａ−Ｄ社）の測定条件を表１に示
す。

表１　従来の測定条件 上記測定条件での低値正常域における精密度（検出下限
）はＳ／Ｎ＝２とした場合は２０ＩＵ／Ｑである。また
高活性域の上限値は、４５００１Ｕ／Ｑ程度である。し
たがって従来は、ＡＬＰの血清内酵素が４５００１Ｕ／
Ｑ以上になるような重症疾患の検体については、１回目
の測定結果を見てから、それら検体を数倍〜数十倍程度
に希釈して再検しなければならなかった。このような希
釈再検は臨床検査数の通常１０％前後であるが、この再
検査に要する時間を人手のために、検査室でのルーチン
検査に要する時間が２倍以上になることは良く知られた
事実である。勿論、表１で示したサンプルの希釈率（サ
ンプル景＋試薬総液量／サンプル量）を大きくすれば、
ＡＬＰの測定できる活性の上限は上昇するため、再検件
数は減少する。しかしながらその反面、低値正常域にお
ける精密度は、希釈率に比例して悪化することも良く知
られた事実である。

最近、従来の低値正常域での精密度を維持しながら、１
回目の測定結果が定量上限を越えた検体、すなわち再検
を必要とするサンプルのみについて、サンプルの希釈率
を自動的に可変（試薬量は１回目の測定条件と同じにし
てサンプル量を少なくして上記の希釈率を大きくする。

）シ、かつ自動再検する自動分析装置が出現している。

この方法は以下に示す方法によって、従来の低値正常域
の精密度を維持し、再検査を自動的に行うものである。

すなわち、 １）前記の表１で示した測定条件（装置によって若干サ
ンプルの希釈率は異なる。）によって通常の検体測定を
行う。

２）１回目の測定結果からＡＬＰの測定できる定量上限
を越えて測定が不可能と判定した検体（検体番号）をコ
ンピュータに記憶させる。

３）１回目の検体（全検体）が終了した後、さらに全検
体を上記測定で流した検体の移送方向とは逆方向に順次
送り返す。

４）検体が順次逆方向に送られる過程において、上記（
２）で記憶した目的の検体（再検用）を所定の血清サン
プリング位置で停止させた時、サンプリング量を通常で
の測定条件よりも少なくして、サンプルの希釈率の上昇
を図った新たな測定条件によって再検を実施する。再検
査（再測定）におけるサンプルの希釈率は、１回目の測
定結果で得られたタイムコース（反応時間と吸光度変化
の関係）から決定される。

この従来技術による欠点は以下の２つである。

第１は、重症疾患者に対しては、緊急検査が必要である
にもかかわらず、１回目の測定結果の情報を基にしなけ
れば再検（再測定）時のサンプリング量が決定できない
ため、上記疾患の検体は２倍以上の測定時間を要するこ
とにある。そのため結果的には検査データの報告が遅れ
るという重要なｈ問題をかかえている。第２は、血清サ
ンプリング１　、 の分取量（最少量）に制限があることである。現在の自
動分析装置の血清サンプリング量は３〜２０μＱが一般
的に用いられている。すなわち分取できるサンプルの最
少量は３μ２となる。

ＡＬＰの測定で用いられているサンプル量は、前掲の表
１で示したように４〜５μＱである。この理由は、低値
正常域の精密度の維持と、できる限り酵素活性の上限が
得られるように双方を考慮して定められたものである。

上記サンプル量から７０００ＩＵ／Ｑ以上の高活性を示
す重症疾患者の再検（再測定）において、例えばサンプ
ル量を最少量の３μＱに変更した場合、この時のサンプ
ルの希釈率は４〜５μ２時の希釈率（９５〜７７倍希釈
）に比べて１．３〜１．７倍の上昇となる。

すなわち３μ０を用いた場合の測定できるＡＬＰの上限
は５９００〜７６００ＩＵ／Ｑ（４〜５　μ（１時は約
４５００ＩＵ／Ｑ）となる。しかし上記のごと＜７００
０ＩＵ／１２以上の高活性を示す検体については、上記
の上限値でも不充分であることが明白である。

〔発明が解決しようとする問題点〕

すなわち、従来の装置と測定法では、低活性の正常域で
２０ＩＵ／Ｑ　（Ｓ／Ｎ＝２の場合）の検出感度（精密
度）を保った場合、測定できるＡＬＰの上限は４５００
ＩＵ／Ｑ以下でありこれ以上の高活性を示す重症疾患者
の検体は希釈、あるいはサンプルの希釈率を上昇させて
再検査する必要があった。そのため前述したように臨床
検体の１０％程度の再検査のために２倍以上の検査時間
を要した。さらには高活性を示す重症疾患者であるがゆ
えに緊急検査が必要であるにもかかわらず、再検のため
に検査データの結果報告が遅れるという臨床検査上の致
命的欠陥を有する。

すなわち、従来の自動分析装置及びＡＬＰの測定法で問
題となっていた重症疾患者の高活性検体の再検を無くし
て、精度良く測定し、臨床化学検査に要する時間を短縮
することが本発明の目的である。加えて現在の低活性正
常域の精度（精密度）でも充分でないため、少なくとも
従来以上の精密度を有することを目的とするものである
。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明のアルカリフォスファターゼ（Ａ　Ｌ　Ｐ）の測
定法は、ＡＬＰを基質としてｐ−ニトロフェニルリン酸
を用いて測定する方法において、ｐ−ニトロフェニルリ
ン酸を高濃度に溶解した測定試薬を用い、反応生成物の
ｐ−ニトロフェノールをその吸収スペクトルのピークを
含む複数の波長による多波長測光系で測光し、ＡＬＰの
酵素活性に応じて測定波長を選択し、前記Ｐ−ニトロフ
ェノールの吸光度を検出し、ＡＬＰの酵素活性を測定す
る方法である。

また、前記多波長測光系が、主波長としてｐ−ニトロフ
ェノールの最大吸収帯の４０５ｎｍ、１／２吸収帯の４
５９ｎｍ、１１５吸収帯の４４９ｎ、　ｍ、１／１０吸
収帯の４５９ｎｍ、及び１／２０吸収帯の４６６ｎｍの
各々と副波長として無吸収帯の５００ｎｍ以下との２波
長、又は前記各主波長のみの１波長で測光することが好
しい。

更に、前記測定試薬がｐ−ニトロフェニルリン酸１０ｍ
Ｍ以上の濃度であること、生化学検査の自動分析装置で
測定することが好しい。

以下に、高活性を皇する検体のＡＬＰを自動測定する技
術を述べる６ １　　ＡＬＰの測定に関与する一連の反応系における生
成物の一種を測定するいわゆる上昇法で行う。

２　その反応系における反応物質（例えばｐ−二トロフ
ェニルリン酸、塩化マグネシウムなど）を従来以上にで
きるだけ濃度を高くした試薬を用いる。

３　多波長光度計の検出器に最近のフォトダイオードア
レイを用いて数ｎｍ程度の間隔で波長を任意選択できる
光度計を用いる。

４　測定目的の該生成物（例えばｐ−ニトロフェノール
）をその吸収スペクトルの例えば最大吸収帯、１／２吸
収帯、１１５吸収帯、１／１０吸収’ｌｉＦ、　１　／
　２０吸収帯及び無吸収帯を複数の波長で連続又は断続
的に測定できる多波長測光方式の装置を用いる。

５ＡＬＰ測定時のサンプルの希釈率は少なくとも従来よ
り２〜３倍低く設定して低活性領域での精密度を良くす
る。

６　各サンプルのＡＬＰ活性の増加に応じて、主波長を
最大吸収帯、１／２吸収帯、１１５吸収帯、１／１０吸
収帯、１／２０吸収帯のように順次吸収の低い波長に変
更してＡＬＰの酵素活性を求める。この場合、副波長は
吸収の無い無吸収帯を共通に利用する。

７　　ＡＬＰの測定条件として、例えば主波長は最大吸
収帯、１／２吸収帯、１１５吸収帯、１／１０吸収帯、
１／２０吸収帯のように複数の波長を入力し、また副波
長として任意の１波長（無吸収帯）を入力するようにす
る。

８　更には、ＡＬＰの測定条件として上記（７）で入力
した各主波長に対応する複数の濃度演算係数（ファクタ
）を入力し得るようにする。

〔作用〕

第１図に本発明の原理を示した。本発明の上昇法（Ｂ　
ｅｓｓｙ　−Ｌ　ｏｖｒｙ法）で用いる試薬は、化学量
パ麺的に２０００ＩＵ／Ｑ程度まで直線的に反応する程
度に反応物質（Ｐ−ニトロフェニルリン酸。

塩化マグネシウムなど）の濃度を十分に高くすることが
特徴である。酵素類の測定法には減少法（目的の酵素の
関与する一連の反応の反応物質の一種の減少量を吸光度
変化の減少として検出して酵素活性を求める。）と本発
明の測定で用いる上昇法がある。減少法と上昇法の最も
大きな相違点は、減少法の場合は、目的の反応物質（例
えばＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ）の濃度が測光系の上限値
（測定できる吸光度の上限）で規定されてしまう。上昇
法の場合は全ての反応物質の濃度を測光系の上限に無関
係に高めることができる。すなわち上昇法の場合は、測
定できる酵素の上限は測光系の上限値のみによって規制
されるのみである。

また測定に当っては、第２図に示した反応生成物のｐ−
ニトロフェノールの吸収スペクトルに対して、例えば主
波長に最大吸収大の４０５ｎｍ、１／２吸収帯の４３４
ｎｍ、１１５吸収帯の４４９ｎｍ、１／１０吸収帯の４
５９ｎｍ、１／２０吸収帯の４６６ｎｍを用い、副波長
に無吸収帯の５００ｎｍ＞の波長を共通に用いて５組の
２波長測光法を行う。

また、ＡＬＰの測定時のサンプルの希釈率は、従来の１
７２〜１／３に低める。これによって第１図で示される
低値正常域における最大吸収帯Ａ（４０５ｎｍ）の測定
感度は従来の２〜３倍となり、精密度（同時再現性にお
けるバラツキ）は従来の１／２〜１／３に改良される。

しかし１００ＯＩＵ／Ｑで測光系が測定できる吸光度の
上限（ＡＢ８２．０）に達する。（従来条件では２００
０〜３０００　Ｉ　Ｕ／２まで測定可能）。しかし、上
述のように５組の２波長測光を実施しているため、１０
０ＯＩＵ／Ｑ以上２０００ＩＵ／１２以下は１／２吸収
帯Ｂ（４’３４ｎｍ）、２００ＯＩＵ／Ｑ以上５０００
ＩＵ／Ｑ以下は１１５吸収帯Ｃ（４４９ｎｍ）５０００
ＩＵ／　２以上１００００ＩＵ／Ω以下は１／１０吸収
帯Ｄ　（４５９ｎｍ）　１００００１０／　Ｑ以上は１
／２ｏ吸収帯Ｅ（４６６ｎｍ）で測定することができる
。これを達成するために使用する自動分析装置は数ｎｍ
ｍ間隔測測定波長自由に選択できる機能が必要となる。

これは従来より使用されている回折格子を採用した後分
光方式の多波長光度計にフォトダイオードを検知器とし
て組込むことによって達成される。

さらにこの装置は、測定条件として従来の単なる主波長
、副波長ではなく、上述のような複数の主波長とこれら
各主波長に対する濃度換算係数（Ｋ−ファクタ）を入力
する。また測定において、副波長を設定せず、全ての測
定を各主波長のみで行う複数の１波長測光を行うことも
可能である。さらに上記の主波長の各吸収帯は、必ずし
も１／２゜１１５．１／１０．１／２０吸収帯及び最大
吸収帯のように限定されるものでなく、ＡＬＰの疾病者
の上昇限度を考慮して任意に選択できることは言うまで
もない。

〔実施例〕

以下に本発明の一実施例を第３図から第６図及び表２か
ら表４に示す。本発明による自動分析装置の原理図を第
３図に示す０本装置は、各測定対物である試料が複数個
装置できるサンプルディスク２が設けられる。この複数
個の試料は、測定対象毎に連続してサンプルディスク２
上に並べることができるように構成される。また反応デ
ィスク８は、その円周上に複数個の測定セルを兼ねた反
応容器１８を有し、サイクル毎に５回転＋１ピッチ（１
反応容器）に回転するように制御されている。ゆえにサ
イクル毎の停止時には、反応ディスク８上の反応容器１
８は１容器分ずつ反時計方向に進行した位置で停止する
。また試料の移送は、サンプリングプローブ４によって
行われる。また、試薬の分注は分注器９，１０によって
行われる。

また分光器１２は複数検知機（フォトダイオードアレイ
）を有する多波長同時測光型であり、光源ランプ１３と
相対し、反応ディスク８が回転状態にあるときに、反応
容器１８の列が光源ランプ１３からの光束２８を通過す
るように構成される。

光束２８の位置と吐出位置２９の間には、排液装置及び
洗浄装［１７が配置される。制御装置全体の構成は、マ
ルチプレクサ（ＭＰＸ）３０．対数、変換増幅器３１．
Ａ／Ｄ変換器２４．リード・オｊ。

ンリ・メモリ（ＲＯＭ）、プリンタ２５．操作パネル３
２２機構部駆動制御器１６，２０．３９からなる。また
Ａ／Ｄ変換器２４はさらにインターフェイス２１を経て
中央処理装置３３に接続される。この中央処理装置３３
は、機構系を含めた装置全体の制御と濃度演算などのデ
ータ処理全般を行うものでマイクロコンピュータが使用
される。

次に動作原理を説明する。操作パネル３２上のスタート
スイッチを挿すことにより洗浄装置１７およびサンプル
ディスク２が動作する。次いで反応ディスク８が回転し
水ブランクを測定する。この値はその反応容器で以後測
定される吸光度の基準となる。水ブランクを測定した反
応容器１８が所定の位置に進行したとき、血清サンプリ
ング機構部駆動制御器１６の指令により血清サンプリン
グ機構６が駆動する。この駆動によりサンプルプローブ
４でサンプルディスク２上の試料を所定量分取し１反応
容器１８中に吐出する。その後でサンプルプローブ４の
内外が精製水で洗浄される。

Ｊ試料の入った反応容器１８が時間と共に第１試薬添加
位置３４、さらには第２試薬添加位置３５にくると第１
試薬分注機構９、第２試薬分注機構１０が駆動し保冷庫
２７内の試薬を所定量分取し。

反応容器１８中に分注する。その後試薬用プローブ５，
１１の内外が精製水出洗浄され、次の試薬ピペッティン
グに備える。反応容器が攪拌位置３６に進行したとき、
攪拌機構１９により反応液を攪拌する。反応液の入った
反応容器１８は、測光終了後、洗浄装置１７で吸引洗浄
されて新たな試料の反応容器となる。

測光は、各サイクル毎の反応ディスク８の回転時に光束
２８を通過した時に行われ、かつ各サイクル毎にあらか
じめＣＲＴ２６から入力した複数の主波長と副波長によ
る２波長測光が同時に行われる。上記２波長組合せから
得られたそれぞれの測定値から、さらに最適な測定条件
となる２波長測光から得た信号量を選択し、濃度単位に
換算してプリンタ２５へその結果（活性値）が印字して
表示される。上述のこれら一連の動作（サイクル）は、
２０秒で完了され順次くり返される。１つの反応容器に
注目した場合のフローを図４のタイムチャートで示す。

すなわち０サイクル目の反応ディスク８の停止時（４秒
）にサンプルの所定量が反応容器１８に分取され、１サ
イクル目の停止時に第１試薬が適当量添加される。添加
後、反応ディスク８上の反応容器は２０秒間反時計方向
に回転して停止する。最後の５周目時には１回転＋１ピ
ツチ（１反応容器）が進行した状態で停止する。

すなわち２０秒間の回転中に１個の反応容器は光束２８
を５回通過（５回転／サイクル）することになる。反応
容器が１週日７５回転時に光束２８を通過した際の透過
光３７は分光器１２によって分光され、かつマルチプレ
クサ３０で、例えばあらかじめＣＴＲ２６から入力した
測定条件、すなわち主波長として反応液（ｐ−ニトロフ
ェノール）が有する例えば最大吸収帯（４０５ｎｍ）　
、１／２吸収帯（４３４ｎｍ）、１１５吸収帯（４４９
ｎｍ）、１／１０吸収帯（４５９ｎｎ＋）　、　１／　
２０吸収帯（４６６ｎｍ）に設定した中から、最初には
最大吸収帯に設定した主波長：４Ｑ５ｎｍと無吸収帯に
設定した副波長：５０５ｎｍの信号がマルチプレクサ３
０で選択されＡ／Ｄ変換器２４を介して中央処理装置３
３に取込まれＲＡＭに記憶される。２週日１５回転時に
は１／２吸収帯に設定した別の主波長：４３４ｎｍと副
波長＝５０５ｎｍの信号量がマルチプレクサ３０でさら
に選択される。以下順次３週日１５回転時では１１５吸
収帯の主波長：４．４９ｎｍ、４週日１５回転時では１
／１０吸収帯の主波長：４５９ｎｍ、５透口１５回転時
では１／２０吸収帯の主波長：　４６６ｎｍと副波長：
　５０５ｎｍの信号量が１週毎１５回転に選択される。

上記反応ディスク８の駆動と反応容器１８の測光が順次
くり返され１６サイクル目（第１試薬添加後５分）の反
応ディスク停止時には、必要に応じて第２試薬が適当量
添加される。

次の１７サイクル目の停止時には攪拌機構１９にて反応
液が攪拌される。第１試薬添加後３０サイクル（１０分
間）の間に計１５５回の吸光度変化（１組の２波長測光
としては３１回）が得られたＲＡＭに記憶される。

この測光値（吸光度の上昇変化）からマイクロコンピュ
ータによって最大吸収帯に設定した主波長：４０５ｎｍ
から１／２０吸収帯に設定した主波長：４６６ｎｍでの
吸光度が測光系における測定できる吸光度の上限値（Ａ
ＢＳ２．Ｏ）をオーバしていないかを順次判定する。最
大吸収帯に設定した主波長：４０５ｎｍが上記の上限値
を越えていない場合には、主波長：４０５ｎｍ／副波長
：５０５ｎｍの２波長測光から得た測光値を用いて。

一般的によく知られている演算法でＡＬＰの血清的酵素
の活性を求める。また最大吸収帯に設定した主波長での
吸光度が上限値を越えた場合は、次の１／２吸収帯の主
波長：４３４ｎｍでの吸光度と上記上限値を比較し、有
効であれば上記１／２吸収帯の主波長：４３４ｎｍ／副
波長：５０５ｎｍの２波長測光からＡＬＰの活性を求め
る。以下ＡＬＰの血清的酵素の活性（吸光度上昇）の度
合に応じて、さらには４４９ｎｍ（１１５吸収帯）。

’４５９　ｎｍ　（１／１０吸収’ＪＦ）　、　４６６
ｎｍ　（１′／２０吸収帯）の各吸収帯における主波長
と５０５ｎｍの副波長による２波長測光から、それぞれ
の測定値（ＡＬＰの活性値）が順次ＡＬＰの活性測定に
適用される。測光終了後の３１〜３３サイクル巨の停止
時には１反応液の入った反応容器の洗浄が行われる。洗
浄後の反応容器は０サイクル目に戻り次の新たな試料の
反応容器に備える。

次に上記の副光系を有した装置によるＡ　Ｌ　Ｐを測定
し、その条件を表２に示す。

表３に本法で用いたＡＬＰ測定試薬の組成を示す。

上記の試薬は、以下に示す基質Ｐ−ニトロフェニルリン
酸のＫｍ値及びその基質濃度と反応速度比の関係（図５
）から化学量論的に２００００　Ｉｌｌ／　Ｑ程度まで
直線的に反応の行えるような高濃度の試薬となっている
。すなわち、表２で示した測定条件におけるサンプルの
希釈率が３８．５倍（従来の１／２倍）、本装置の測光
に必要な反応時間（最少時間）が１．７分（第２試薬添
加後６ポイント）であるため、　２００００　Ｉ　Ｕ／
αに相当する基質の消費量は０．８９ｍＭとなる。

ｐ−二トロフェニルリン酸のＫｍ値４：ｆ：１．ＯｍＭ
であり、１０ｍＭの基質濃度を用いた場合の反応速度比
（υ／ＶＭ＆Ｘ）は図５から０．９１，１００ｍＭの基
質濃度を用いた場合の反応速度比は　０．９９となる。

酵素活性はＶＭａｘで測定するのが理想的であるが、基
質濃度の溶解度の問題もあり本法ではＶ　ｓ　ａ　ｘの
９０％にあたる１０ｍＭの基質濃度を用いた。この場合
、２００００　Ｉυ／Ｑの測定における反応速度比の低
下分は１０ｍＭ（基ｆｆ１度）の反応速度比０．９１の
時、　２００００　ＩＵ／　Ｑに相当する基質の消費量
が上記のとと＜　　０．８９ｍＭであるため図５から１
％程度の低下分となる。すなわち２００００　ＩＵ／　
Ｑにおける１％の反応速度比の低下分は、２００Ｉｕ／
Ｑの誤差となるが、しかし異常高値域（２００００Ｉ　
Ｕ　／　Ｑ　）の測定では問題にならない。

表２の測定条件および表３の試薬組成を用いた本発明の
効果を従来装置との比較において説明する。本発明の測
定法ではサンプルの希釈率が従来法（希釈率７７倍）よ
り１／２低いため測定感度が２倍向上する。表４の精度
（精密度）から低値正常域ではＣＶ（変動係数）で従来
の約１／２に改良される。

表４　精度（精密度） 測定結果から、高活性域における定量上限は図６に示す
ように従来の３倍程度に向上できることが明らかである
。

〔発明の効果〕

本発明方法による多波長光度計を有する自動分析装置と
高活性領域の酵素ＡＬＰに対応できる高濃度測定試薬を
採用することにより１重症疾患者の高活性領域の検体（
１０％程度）の再検に要した検査時間を１／２以下に大
巾に短縮し、低活性の正常域の精度（精密度）を変動係
数ｃｖ（％）表現で従来の１／１．６に改良できるよう
に高精度になる効果がある。

【図面の簡単な説明】

第１図から第６図は本法を説明するための図で、第１図
は本測定法の基本原理を示す図、第２図はｐ−ニトロフ
ェノールの吸収スペクトル、第３図は本法で用いた生化
学自動分析装置の概略図、第４図は第３図で用いた装置
による測定タイムチャート、第５図は基質濃度と反応速
度比の関係を示す図、第６図はＡＬＰ活性の直線性を示
す図を示す。 １・・・サンプル容器、２・・・サンプルディスク、３
・・・恒温槽水槽、４・・・サンプリングプローブ、５
・・・第１試薬用プローブ、６・・・血清サンプリング
機構、８・・・反応ディスク、９・・・第１試薬分注機
構、１０・・・第２試薬分注機構、１１・・・第２試薬
用プローブ、１２・・・分光器、１３・・・光源ランプ
、１４・・・回折格子、１５・・・フォトダイオード検
知器、１７・・・洗浄装置、１８・・・反応容器、１９
・・・攪拌機Ｗ、１６゜２４．３９・・・機構部駆動制
御器、２１・・・インターフェイス、２４・・・Ａ／Ｄ
変換器、２５・・・プリンタ、２６・・・ＣＲＴ、３０
・・・マルチプレクサ（Ｍ　Ｐ　Ｘ）、３１・・・対数
変換器、３２・・・操作パネル、３３・・・中央処理装
置。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アルカリフォスファターゼを基質としてｐ−ニトロ
   フェニルリン酸を用いて測定する方法において、ｐ−ニ
   トロフェニルリン酸を高濃度に溶解した測定試薬を用い
   、反応生成物のｐ−ニトロフェノールをその吸収スペク
   トルのピークを含む複数の波長による多波長測光系で測
   光し、アルカリフォスファターゼの酵素活性に応じて測
   定波長を選択し、前記ｐ−ニトロフェノールの吸光度を
   検出することを特徴とするアルカリフォスファターゼの
   測定法。 ２、前記多波長測光系が、主波長としてｐ−ニトロフェ
   ノールの最大吸収帯の４０５ｎｍ、１／２吸収帯の４５
   ９ｎｍ、１／５吸収帯の４４９ｎｍ、１／１０吸収帯の
   ４５９ｎｍ及び１／２０吸収帯の４６６ｎｍの各々と副
   波長として無吸収帯の５００ｎｍ以下との２波長、又は
   前記各主波長のみの１波長で測光することを特徴とする
   特許請求の範囲第１項に記載のアルカリフォスファター
   ゼの測定法。 ３、前記測定試薬がｐ−ニトロフェニルリン酸１０ｍＭ
   以上の濃度であることを特徴とする特許請求の範囲第１
   項又は第２項に記載のアルカリフォスファターゼの測定
   法。 ４、前記アルカリフォスファターゼの測定を生化学検査
   の自動分析装置によつて測定することを特徴とする特許
   請求の範囲第１項ないし第３項の何れかの１項に記載の
   アルカリフォスファターゼの測定法。