JPH06303992A - 自動化学分析装置における酵素活性測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】重傷疾患時の高活性検体の再検を無くし臨床化
学検査に要する時間を短縮する。 【構成】複数のサンプルカップを架設するサンプルディ
スク２と検体を採取するサンプルプローブ５と反応時間
２分割前半で使用する反応容器４ａ及び高活性域の検体
を連続測定するための反応時間２分割後半で使用する反
応容器４ｂと酵素活性に応じて反応生成物に基づく吸光
度の減少（または増加）を測定するための分光器９と反
応飽和状態にある反応液を分析の過程でピペッティング
する反応液ピペッティング機構６及び反応液吸引プロー
ブ７、機構系を含めた装置全体の制御と試薬の液量補正
係数の算出や濃度（酵素活性）演算などのデータ処理全
般を行う中央処理装置２１などから成る生化学自動分析
装置。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生化学検査における酵
素活性の測定法に関し、特に、検査試薬の検量上限値を
超す高活性域の被検体を所定の反応時間内で、従来の再
検操作をすることなくそのまま測定できる自動化学分析
装置と酵素測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】生化学検査における酵素測定法は、特開
昭57−33956号公報，特開昭58−4918号公報などで示さ
れるように、目的の酵素に関与する一連の反応における
反応物質の一種の減少量を吸光度の減少として捕らえて
酵素の活性を求める吸光度減少法と、反応物質の一種の
増量を吸光度の増加として捕らえて酵素の活性を求める
吸光度増加法に大別される。減少法における測定系をＧ
ＯＴを例としてまた、増加法における測定系をＡＬＰを
例にしてその測定法の原理を以下に説明する。

【０００３】１．ＧＯＴの測定原理

【０００４】

【化１】

【０００５】すなわち、ＧＯＴの活性を求めるための吸
光度減少法の測定原理は、反応物質の一種であるＮＡＤ
Ｈの減少量を３４０ｎｍでの吸光度の減少量として測定
し、その減少速度から目的酵素（ＧＯＴ）の活性値を求
めている。一方、増加法における測定系すなわち、ＡＬ
Ｐを例としたその測定法の原理を次に説明する。

【０００６】２．ＡＬＰの測定原理

【０００７】

【化２】

【０００８】本測定法は、反応物質の一種である遊離し
たＰ−ニトロフェノールの増加速度を４０５ｎｍでの吸
光度の増加量として測定し、その増加速度からＡＬＰの
活性値を求めている。ＧＯＴやＡＬＰの検査項目は生化
学検査において、臨床上非常に重要視されていることは
良くしられた公知である。さらに、吸光度減少法によっ
て酵素活性を求める上記のＧＯＴの他に、ＬＤＨ，ＧＰ
Ｔなども吸光度減少法による測定の代表的な酵素であ
り、ＣＰＫ，ＡＭＹなどは吸光度増加法の代表的な酵素
である。ＬＤＨなどの検査項目の臨床的意義は、肝疾
患，悪性腫瘍をはじめとする種々の疾患の診断に有用と
されている。一方、ＡＬＰは骨にく腫などでの上昇、Ｃ
ＰＫは進行性筋ジストロフィー症，急性心筋梗塞などで
上昇することが文献等で報告されている。また同様にＡ
ＭＹは膵疾患において上昇するといわれている。これら
血清内各種酵素の特徴は、末期重傷疾患時に著しい高活
性を示すことにある。例えば、ＧＯＴ，ＧＰＴなどは健
常者では４０ＩＵ／Ｌ以下であるにもかかわらず末期疾
患では１００００ＩＵ／Ｌになることもまれではない。
ＬＤＨ，ＨＢＤＨ，ＡＬＰなどの場合では、ＧＯＴ，Ｇ
ＰＴ以上の高い数万ＩＵ／Ｌにまで達することも知られ
ている。また、重傷膵疾患におけるＡＭＹなども１００
００ＩＵ／Ｌ以上に達すると言われている。すなわちこ
れら酵素活性の測定の難しさは、低値の正常域において
高い精密度が要求される反面、重傷疾患時における著し
い高値まで測定しなければならないという相反する課題
を背負っていることにある。従来のこれらの酵素の自動
測定においては、酵素の種類，測定用試薬の組成，分析
装置によって差はあるが、測定できる高活性値の上限値
は２０００〜３０００ＩＵ／Ｌである。そのため、酵素
活性が検量の上限値以上になるような重傷疾患の検体に
ついては１回目の測定結果からの情報によって再検する
ことになる。再検率は約１０％程度と言われている。従
来の分析装置では、自動再検機能を有する装置が普及し
ている。その方法は、再検時に使用するサンプリング量
（減量条件）をあらかじめパラメータとして入力してお
くことにある。減量条件での再検はサンプル量と試薬量
との希釈率（サンプル量＋試薬量／サンプル量）を大き
くすることで測定できる各種酵素活性の上限を上昇させ
る。これにより、再検件数は減少する。また、検体を分
析装置が自動希釈して再検する装置も出現している。し
かし、いずれの方法においても２倍の検査時間を要する
ことに成り、迅速検査が要求されている今日では高活性
域の測定における対応は十分とは言い難い。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】すなわち、従来の装置
および試薬における酵素活性の測定法では、測定できる
上限の酵素活性は２０００〜３０００ＩＵ／Ｌ以下であ
り、これ以上の高活性を示す重傷疾患の検体は２倍の分
析時間を要した。そのため高活性を示す重傷疾患である
がゆえに緊急検査が必要であるにもかかわらず再検のた
めに検査結果が遅れるという臨床化学検査上致命的欠陥
を有していた。

【００１０】本発明の目的は、従来の自動化学分析装置
および測定法による酵素で問題と成っていた重傷疾患時
の高活性検体の再検を無くし臨床化学検査に要する時間
を短縮することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明の目的を達成する
ための酵素活性の自動測定において、以下の技術を用い
る。

【００１２】１．全ての酵素活性の測定において、その
酵素に関与する一連の反応系における生成物の一種を測
定するための試薬は全て１液法を用いる。

【００１３】２．試薬の反応限界チェック機構は従来法
と同様のチェック機構とする。

【００１４】３．酵素活性に応じて所定の反応時間を２
分割する選択機能を設ける。（例えば、反応時間１０分
の分析装置の場合では前半５分反応，後半５分反応とす
る。比色法は所定の反応時間を用いる。） ４．反応限界チェック機構で高活性域の検体と判定され
た検体の反応液を分析の過程でピペッティングする機構
を設けかつ、そのピペッティング量を設定するためのパ
ラメータを設ける。（この測定は上記２項の後半５分の
反応時間を用いた連続測定となる。） ５．その反応液に初回の測定で用いた反応物質を再添加
できる試薬ピペッティング機構としかつ、そのピペッテ
ィング量を設定するためのパラメータを設ける。

【００１５】６．吸光度の減少，増量を測光するための
従来のパラメータ（測光ポイント）以外に反応時間２分
割後半５分での測光ポイントが入力できるようにする。

【００１６】７．反応物質再添加後の液量補正をし測定
値を補正する演算機能をコンピータに持たせる。

【００１７】８．反応容器は２個／１テストとして用い
前容器が反応時間２分割測定での前半用、後容器が反応
時間２分割測定での後半用とする。

【００１８】

【作用】本発明による酵素測定法の基本原理をＧＯＴを
例に図１に示す。本発明に用いる測定試薬は１液法であ
る。これにより、被検体に反応物質を添加すると以下に
示す反応が即、開始する。

【００１９】

【化３】

【００２０】ここで、ＮＡＤＨ→ＮＡＤに変化する速
度を３４０ｎｍでの吸光度の減少として捕らえることが
できる。吸光度の減少は図１に示すような反応過程を示
す。酵素活性が正常値域では、反応速度が緩やかなため
図１の１ａで示すように吸光度の減少も緩やかになる。
この吸光度変化をあらかじめパラメータとして設定した
測光ポイント（ｌ〜ｍ）における吸光度の変化を単位時
間（１分間）の吸光度変化量に換算し係数を乗じて活性
値を求める。このような正常値域の酵素活性に対し重傷
疾患では、反応速度が急速になるため測光ポイントｌ〜
ｍでは図１の１ｂで示すように反応が飽和状態に達して
しまい吸光度の変化を捕らえることができなくなる。本
発明ではこの様なケースにおいて、従来と同様な方法で
の反応限界チェック機構（パラメータとして反応限界値
を入力しておき反応液の吸光度が限界値に達しているか
をチェック）の情報によって高活性域の検体であること
を認識した後、反応時間２分割後半の５分でさらに連続
測定を行わせるための作用が働く。すなわち、飽和状態
に達している反応液を分取する反応液ピペッティング機
構が動作を開始し反応ディスクに配置された１テスト２
個分の反応容器の後容器にパラメータで指定したピペッ
ティング量（数μｌ〜数十μｌ）を分取し吐出する。こ
の時の飽和状態に達している反応液は換言すれば高活性
域の検体を前もって自動希釈した状態と同じことにあ
る。反応容器へ吐出した反応液に初回の測定時に用いた
同一反応物質を試薬ピペッティング機構により再添加す
ることで反応が再度進行する。すなわち図１の１ｃに示
すような吸光度の減少が生じる。この吸光度の減少は、
３４０ｎｍでかつ、本法の反応時間二分割選択機能によ
り後半の反応時間で測定するための測光ポイントＰ〜Ｑ
によって測定され１分間当たりの吸光度変化量が求めら
れる。この吸光度変化量に液量補正係数（α₁ ）とＮＡ
ＤＨのモル吸光係数等から求めた係数(α₂）を乗じてＧ
ＯＴの酵素活性を求める。ＧＯＴ以外の各種酵素活性の
測定においても上述と同様な測定方法によって、重傷疾
患に見られる検量上限値を越えた高値活性域の検体を再
検することなく測定できることになる。すなわち、本法
は所定の反応時間内において前半の分析で高値活性域の
検体であるかを認識しかつ、試薬で自動希釈された検体
の再サンプリングと試薬の再添加を後半の分析において
も連続的に行ういわゆる同一検体２重測定法によって、
高値活性域の検体を再検することなく酵素活性の測定を
行う。本法における検量の上限値は試薬での自動希釈操
作が入るため、後半の反応時間における検量の上限値は
前半の分析で用いたサンプル量と試薬量の希釈率(サン
プル量＋試薬量／サンプル量)で定められる。すなわ
ち、後半の反応時間における検量の上限値(Ｕ．Ｌ)＝検
量の上限値(Ａ)×希釈率(ｎ)となる。ＧＯＴを例にする
とサンプル量＝１５μｌ,試薬量＝３９０μｌ,Ａ＝１５
００ＩＵ／Ｌのため、希釈率ｎ＝１５＋３９０／１５＝
２７従って、Ｕ．Ｌ＝１５００×２７＝４０５００（Ｉ
Ｕ／Ｌ）すなわち、本法によってＧＯＴの酵素活性は40
500IU／Ｌまで測定できることになる。

【００２１】

【実施例】以下、本発明の一実施例を図２および表１に
示す。図２に示した本発明の自動化学分析装置には、各
測定対象物である試料を複数個架設できるサンプルディ
スク２が設けられている。この複数個の試料は、測定対
象ごとに連続してサンプルディスク２上に並べることが
出来るように構成されている。また、反応ディスク３は
その円周上に複数この測定セルをかねた反応容器４を有
し、サイクル毎に半回点＋２ピッチ（２反応容器分）進
行して停止するように制御されている。また、反応容器
４は１テスト当たり２個をペアーとして使用するように
制御される。ゆえに、サイクル毎の停止時には反応ディ
スク４上の反応容器４は２容器分ずつ半時計方向に進行
した位置で停止する。また、試料の移送はサンプリング
プローブ５によって行われ、反応液の移送は反応液ピペ
ッティング機構６の反応液吸引用プローブ７によって行
われる。第一試薬分注は分注器８によって行われる。分
注器８は反応限界チェック機構で高活性域の検体と認識
された場合の試薬再添加機構としても制御されている。
分光器９は多波長同時測光形であり、光源ランプ１０と
相対し反応ディスク４が回転状態にあるとき、反応容器
４の列が光源ランプ１０からの光束１１を通過するよう
に構成されている。光束１１の位置と吐出位置１２の間
には反応容器洗浄機構１３が配置されている。制御装置
全体の構成はマルチプレクサ１４，対数変換増幅器１
５，Ａ／Ｄ変換器１６，プリンター１７，操作パネル１
８，機構部駆動回路１９からなるがＡ／Ｄ変換器１６は
さらに、インターフェイス２０を経て中央処理装置２１
に接続されている。この中央処理装置２１は、本発明に
おける反応時間２分割自動選択や同一検体２重測定のた
めの機構系を含めた装置全体の制御と試薬の液量補正係
数の算出や濃度（酵素活性）演算などのデータ処理全般
を行うものでマイクロコンピュターが使用されている。
この様な機構における動作原理を次に説明する。

【００２２】操作パネル１８のスタートスィッチを押す
と反応容器洗浄機構１３およびサンプルディスク２が動
作する。次いで反応ディスク３が回転し水ブランクを測
定する。この値はその反応容器４で以後測定される吸光
度の基準となる。水ブランクを測定した反応容器４が所
定の位置に進行したとき、血清サンプリング機構部駆動
回路２３の指令により血清サンプリング機構２４が駆動
する。この駆動によりサンプルプローブ５でサンプルデ
ィスク２上の試料を所定量分取して反応容器４の前容器
（１テスト２個分）４ａ中に吐出する。サンプルプロー
ブ５はプローブ洗浄位置に移動しサンプルプローブ５の
内外が精製水で洗浄される。試料の入った前容器４ａが
時間とともに第一試薬添加位置２５にくると第一試薬分
注機構２６が駆動し試薬プローブ２７で保令庫２８内の
酵素活性測定用試薬を所定量分取し前容器４ａ中に吐出
する。その後、試薬プローブ２７の内外が精製水で洗浄
され次の試薬ピペッティングに備える。前容器４ａが撹
拌位置２９に進行したとき撹拌機構３０により反応液を
撹拌する。反応液の入った反応容器４ａの測光は各サイ
クル毎の反応ディスク３の回転時に光束１１を通過した
ときに行われかつ、各サイクル毎にあらかじめＣＲＴ３
１から入力した主波長と副波長による２波長測光が同時
に行われる。ここで、酵素活性に応じた反応生成物に基
づく吸光度の減少または増加が酵素活性正常値域では、
反応速度が緩やかなため前述の図１の１ａで示すように
吸光度の減少も緩やかになる。この吸光度変化をあらか
じめパラメータとして設定した測光ポイント（ｌ〜ｍ）
における吸光度の変化を単位時間（１分間）の吸光度変
化量に換算し係数を乗じて目的酵素の活性値を求める。
このような正常値域の酵素活性に対し重傷疾患では、反
応速度が急速になるため測光ポイントｌ〜ｍでは図１の
１ｂで示すように反応が飽和状態に達してしまい吸光度
の変化を捕らえることができなくなる。そこで、従来と
同様な方法での反応限界チェック機構（パラメータとし
て反応限界値を入力しておき反応液の吸光度が限界値に
達しているかをチェック）の情報によって高活性域の検
体であることを認識した後、反応時間２分割後半の反応
時間でさらに連続測定を行わせるため、ただちに飽和状
態に達している反応液を分取する反応液ピペッティング
機構３２が動作を開始し反応ディスクに配置された１テ
スト２個分の反応容器４の後容器４ｂにパラメータで指
定したピペッティング量（数μｌ〜数十μｌ）を反応液
吸引プローブ７で分取し吐出する。この反応容器４ｂに
初回の測定時に用いた同一反応物質が試薬用プローブ２
７により再添加され反応が再度進行する。すなわち図１
の１ｃに示すような吸光度の減少が生じる。この吸光度
の減少は、前半の測定と同一の２波長で測定される。こ
の場合の測光ポイントは、後半用の測光ポイントＰ〜Ｑ
が使用される。測光ポイントＰ〜Ｑ間で測定された吸光
度の減少はマイクロコンピュターによって１分間当たり
の吸光度変化量に換算される。さらに、この吸光度変化
量に前半の測定における希釈倍率（ｎ）とＮＡＤＨのモ
ル吸光係数等から求めた係数（α）を乗じ目的酵素の活
性を求める。測光終了後の反応ディスク３の停止時に
は、反応液の入った反応容器４ａ，４ｂは反応容器洗浄
機構１３で洗浄が行われる。洗浄後の反応容器４は次の
新たな試料の反応容器に備える。比色測定に用いる第２
試薬の分注は分注器３１及びプローブ３２によって行わ
れる。次に本発明による反応時間２分割測定でＡＬＰの
高活性検体を測定した分析値とマニュアルで９４倍希釈
後測定した分析値の比較結果を表１に示す。本法により
測定試薬の検量上限値を超えた４０００単位以上の高活
性検体が測定できる。

【００２３】

【表１】

【００２４】

【発明の効果】本発明による反応時間２分割自動選択お
よび反応試薬再添加機能を有する自動生化学分析装置で
酵素活性を２重測定することにより、重傷疾患時の高値
活性域の検体の再検に要した２倍以上の検査時間の大幅
な短縮と再検不要の改良が図れる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明における酵素測定法の基本原理をＧＯＴ
を例に示した図である。

【図２】本発明における自動化学分析装置の一実施例を
示す図である。

【符号の説明】

１ａ…酵素活性正常値域の吸光度変化、１ｂ…酵素活性
高値域の吸光度変化、１ｃ…反応試薬再添加後の酵素活
性吸光度変化、２…サンプルディスク、３…反応ディス
ク、４ａ…前反応容器、４ｂ…後反応容器、５…サンプ
ルプローブ、６…反応液ピペッティング機構、７…反応
液吸引プローブ、９…分光器、２１…中央処理装置、２
６…第一試薬分注機構。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】生化学検査における酵素の測定方法に関連
   して、反応過程（反応終末）にある反応液を分取する反
   応液ピペッティング機構とその反応液に同一の反応物質
   を再添加する試薬ピペッティング機構と所定の反応時間
   を２分割する選択機構を設けて、酵素活性に応じた反応
   生成物に基づく吸光度の減少または増加を連続的に２段
   階測定することを特徴とした自動化学分析装置における
   酵素活性測定法。