JPS6345055B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、複数項目分析方法および装置に係
り、特に血液試料等を酵素試薬を用いて複数項目
分析するに好適な分析方法および装置に関する。

近年、多成分を含む試料、特に血清等の如き体
液中の代謝物質の定量においては、当該物質に特
異性をもつて作用する酵素を用いた分析法が適用
されつつある。酵素の反応は非常におだやかな条
件で、しかも短時間で進行し、又酵素は多数の混
在物質が存在しても、特定物質にのみ作用する性
質があるので、病院等の生化学検査において、
糖、コレステロール、中性脂肪、リン脂質、アン
モニア、尿素窒素等の定量に酵素分析法が使用さ
れている。

酵素分析法を適用した従来の自動生化学分析装
置は、１つの反応容器に採取した試料について１
項目すなわち１成分だけを測定している。本発明
では１つの反応容器に採取した試料について複数
項目を測定し得る分析装置が実現され得る。

一方、臨床検査においては、患者等から提供さ
れる体液等のサンプル量は、できるだけ少ない方
が望ましい。

本発明の目的は、試料採取が１回であつてもそ
の試料の複数項目の分析が可能となり、全体とし
て試料採取量を微量化できる複数項目分析方法お
よび装置を提供することにある。

本発明は、１つの反応容器内に複数の分析項目
を分析すべき被検試料と第１の酵素試薬液とを添
加して第１の分析項目物質から第１の酵素反応に
より分析に適した形態の物質を生じさせること、
上記第１の酵素反応が生じた第１の反応液の呈色
変化を光度計で測光すること、測光後の上記第１
の反応液を収容している同一反応容器内に、所定
量の第２の酵素試薬液を添加して第２の分析項目
物質から第２の酵素反応により測定に適した形態
の物質を生じさせること、上記第２の酵素反応が
生じた第２の反応液の呈色変化を上記光度計で測
光すること、上記第１の反応液の測光情報に基づ
いて上記第１の分析項目の分析値を演算するこ
と、上記第２の酵素試薬液の添加量に対応した液
量補正値を用い上記第２の反応液の測光情報に基
づいて上記第２の分析項目の分析値を演算するこ
と、を含むことを特徴とする。

本発明は、酵素反応が特異的反応であること、
すなわち、特定の酵素は特定の対象物にだけ作用
してその対象物の形態を変化させる触媒的性質を
有し他の酵素反応を妨害しないという点に着目し
てなされた。

本発明に基づく望ましい実施例では、第２の酵
素試薬を混合する前の試料液の光学特性を特定波
長の光で測定する第２の測光段階と、第２の測光
位置に位置づけられた試料液の光学特性を上記特
定波長の光で測定する第３の測光段階と、上記第
２の測光段階のあとの試料液の増減量に基づいて
上記第２および第３の測光段階のうちの少なくと
も一方の測光情報を補正し、補正結果を用いて上
記他の項目の含有量を求める段階とを含んでい
る。このような望ましい実施例によれば、各分析
項目の測定精度を低減することなく複数項目の分
析操作を簡略化できる。

本発明に基づく実施例の説明に先立ち、血清試
料において酵素分析法が適用されるいくつかの例
について説明する。

まず血清グルコースは次の如く反応する。

グルコース＋O₂グルコースオキシターゼ ―――――――――――――→ グルコン酸＋H₂O₂ ……(1) コレステロールには、エステル型と遊離型とが
あり、それぞれ次の如く反応する。総コレステロ
ールは両者の和である。

エステル型コレステロール＋H₂Oコレステロールエ
ースデラーゼ ―――――――――――――――→ 遊離型コレステロール＋脂肪酸
……(2) 遊離型コレステロール＋O₂コレステロールオキシタ
ーゼ ―――――――――――――――→ Δ⁴−コレステノン＋H₂O₂ ……(3) 中性脂肪は次の如く反応する。

中性脂肪＋3H₂Oソポプロテインリパーゼ ―――――――――――――→ グリセロール＋脂肪酸 ……(4) グリセロール＋O₂グリセロールオキシターゼ ――――――――――――――→ グリセルアルデヒド＋H₂O₂ ……(5) リン脂質は次の如く反応する。

リン脂質フオスフオリパーゼＤ ――――――――――――→ コリン ………(6) コリン＋O₂コリンオキシターゼ ―――――――――――→ ベタイン＋H₂O₂ ……(7) 上述の(1)、(3)、(5)、(7)式の反応で生じた過酸化
水素（H₂O₂）はペルオキシダーゼの作用により、
(8)式の如く反応し、赤色色素を生成し、光度計で
計測することにより反応を追跡できる。

H₂O₂＋４−アミノアンチピリン＋フエノールペルオ
キシターゼ ―――――――――→ 赤色キノン ……(8) 従来の分析方法では、グルコースは(1)、(8)式の
組合せ、総コレステロールは(2)、(3)、(8)式の組合
せ、中性脂肪は(4)、(5)、(8)式の組合せ、リン脂質
は(6)、(7)、(8)式の組合せによる反応を利用し、１
反応容器につき１成分ずつ分析していた。

第１図は、本発明の一実施例を説明するための
分析装置の概略構成図である。この分析装置によ
つて、グルコースと総コレステロールとの２項目
を分析する場合には、一定量採取された試料に、
前述の(1)、(8)式の反応に必要なグルコースオキシ
ダーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピ
リン、フエノール等を含む試薬を第１試薬として
加え、(1)、(8)式の反応終了後、反応液の吸光度を
求め、その値からグルコースの濃度を算出する。
続いて同じ反応液に(2)、(3)式に必要なコレステロ
ールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ
等を第２試薬として、前記反応液に加えると、
(2)、(3)、(8)式の反応が起る。(8)式の反応に必要な
ペルオキシダーゼ等は第１試薬のうちの残り分で
まかなう。(2)、(3)、(8)式の反応の終了後、反応液
の吸光度を測り、前回の吸光度データとの差は総
コレステロールの濃度に比例する。同様な方法に
より、前述のグルコース、総コレステロール、遊
離コレステロール、中性脂肪、リン脂質のうち任
意の２成分を選び、同一反応容器内で一度のサン
プリングで分析することができる。

第１図の構成を説明する。多数の透明な反応容
器５２が屈曲自在なチエーン５１に装填される。
チエーン５１は着脱可能な個々の円筒状ホルダを
相互に回転可能に多数接続して構成する。各ホル
ダ内に液体試料例えば血清試料を収容した反応容
器５２を装填し、駆動スプロケツト５３，５４に
よつて水平方向に移送する。チエーン５１の両端
部は接続してもよく切り離してもよい。チエーン
５１は、所定温度の液が収容された恒温槽５０上
を移動するが、反応容器は、その下部が恒温槽５
０内に浸された状態で移送される。恒温槽５０上
には試薬添加位置５５および５６があり、測光位
置６１および６２がある。

光源６０からの光束は２分割され、恒温槽５０
の側壁に設けられた窓を通して、恒温液内に浸さ
れている測光位置６１，６２の反応容器に照射さ
れ、反対側の恒温槽側壁を通つて１つの光路を経
て凹面回折格子６５を備えた多波長光度計６３に
導かれる。図示していないが測光位置６１を経た
光束と測光位置６２を経た光束とはセクタ等によ
つて時分割され、交互に光度計６３に入射され
る。多波長光度計６３のローランド円６６上に
は、各測定波長に対応した位置に複数の半導体光
検出器６７が配列されており、いずれか２つの光
検出器からの電気信号が波長選択器７０によつて
選択され、それらの差信号が差増幅器７１によつ
て求められる。差信号はＡ−Ｄ変換器７２によつ
てデイジタル信号に変換され、インターフエース
７３を介して中央処理装置７５に導かれ必要な処
理がなされる。

第１のデイスペンサ８０および第２のデイスペ
ンサ８２は、制御機構インターフエース７４およ
びインターフエース７３を介して中央処理装置７
５に接続されている。分析項目は操作パネル７８
より入力され、測定された分析結果は表示部７９
に表示される。中央処理装置７５には読取専用メ
モリ（ROM）７６およびランダムアクセスメモ
リ（RAM）７７が付属されている。

第１デイスペンサ８０は、試薬添加位置５５上
に延在される吐出管８４と、第１酵素試薬液８１
内に挿入される吸入管８６を備えている。第２デ
イスペンサ８２は、試薬添加位置５６上に延在さ
れる吐出管８５と、第２酵素試薬液８３内に挿入
される吸入管８７を備えている。グルコースおよ
び総コレステロールの２つの分析項目を第１図の
装置で分析する場合には、下記の如き組成から成
る第１酵素試薬および第２酵素試薬が用いられ
る。

第１酵素試薬液の組成例 リン酸塩緩衝剤（PH7.0） 100ｍmole／ グルコースオキシダーゼ 18U／ml ペルオキシダーゼ 1.2U／ml ４−アミノアンチピリン 0.8ｍMole／ フエノール 11ｍmole／ 第２酵素試薬液の組成例 リン酸塩緩衝剤（PH7.7） 5mole／ コレステロールエステラーゼ 2U／ コレステロールオキシダーゼ 3U／ メタノール 10mole／ ヒドロキシポリエトキシドデカン ４％ グルコースおよび総コレステロールを分析する
場合には、反応容器５２内に採取される血清量は
5μであり、第１酵素試薬液添加量は500μで
あり、第２酵素試薬液添加量は50μである。波
長選択器７０によつて選択される波長は505nｍ
および600nｍである。恒温槽５０の温度は37℃
に維持されている。

透明材料から成る反応容器に血清試料を入れ、
チエーン５１に装填する。一連の試料列の先頭に
は試薬ブランク用容器と、グルコースおよび総コ
レテロールの標準試料を収容した容器が配列され
る。だから、分析試料の測定に先立つて試薬ブラ
ンクと標準試料の測定値から両分析項目のための
検量線が求められる。

チエーン５１が移動して血清試料を収容した反
応容器５２が第１の試薬添加位置５５に達する
と、第１デイスペンサ８０が動作され、吐出管８
４から反応容器内に第１酵素試薬液が吐出され
る。これにより試薬液が混合された試料は、ただ
ちに(1)式と(8)式の反応をはじめる。反応容器５２
が間欠的に移送されて測光位置６１に達すると、
この反応容器に光源６０からの光が照射され、透
過光が多波長光度計６３の凹面回折格子６５によ
つて分光され、特定波長光の光強度が測定され
る。この光強度の信号はあらかじめ求められてい
るグルコースの検量線に基づいて対応するグルコ
ース濃度が演算され、表示部７９に表示される。
同じ反応容器がさらに１ステツプ進んで第２の試
薬添加位置５６に達すると、第２デイスペンサ８
２が動作され、吐出管８５から反応容器内に第２
酵素試薬液が吐出される。これにより試料液は
(2)、(3)、(8)式の反応を開始する。反応容器が間欠
移送されて測光位置６２に達すると、光源６０か
らの光が照射され、透過光が多波長光度計で分光
されと同じ特定波長光の光強度に基づく信号が求
められる。同じ試料について第２酵素試薬液の添
加前である測光位置６１において求められていた
光強度に基づく信号の大きさはRAMに記憶され
ているので、その値と今回求めた値との差が、第
２酵素試薬の添加にともなつて生じた反応に基づ
くものであり、総コレステロール濃度に比例す
る。そこで両者の値とあらかじめ求められている
総コレステロールの検量線とから、分析試料中の
総コレステロール濃度が演算され、表示される。

コレステロール濃度の演算の際には中央処理装
置を含む信号処理部において、測光位置６１から
の信号と測光位置６２からの信号を同じ条件下で
比較させるための補正がなされる。すなわち、第
２酵素試薬の添加前と添加後とでは試料液量が異
なるから、少なくともいずれか一方の信号を補正
して同じ液量のときを仮想した値となしてコレス
テロール濃度が算出される。

この実施例では、第１の測光位置６１からの光
信号と第２の測光位置６２からの光信号は同じ波
長光についてのみ測定しているが、別個の波長を
用いることもできる。別個の波長を用いるときに
は、第１分析項目用として特定波長を測定し、第
２分析項目用として他の波長を測定するが、第１
の測光位置６１からの光においては特定波長と他
の波長をとり出し、第２の測光位置６２からの光
においては他の波長をとり出す。

本発明を反応速度法に適用する場合には、経時
変化も補正する必要がある。上述の実施例によれ
ば、２項目の分析が１回のサンプリングに対応
し、１つの反応ライン上で２項目を分析できるの
で、従来の複数項目を分析するものより小形化さ
れた分析計を構成できる。

次に本発明に基づく他の実施例を説明する。

第２図は他の実施例の概略構成を示す図であ
る。反応テーブル１はその円周上に複数個（例え
ば40個）の測定セルを兼ねた透光性を有する反応
容器２を有し、回転軸３を中心に一気に１回転と
１ピツチ分回転できる。試料テーブル４はその円
周上に複数個の試料容器５を有し、回転軸６を中
心に１ステツプずつ間欠的に回転できる。試料の
ピペツテイングはサンプリングプローブ８を備え
たピペツタ７によつて行なわれ、第１および第２
酵素試薬の分注は分注器９および１０によつて行
なわれる。分光器１１は複数検知器による多波長
同時測光形であり、光源ランプ１２と反応容器列
を介して相対し、反応テーブル１が回転状態にあ
る時に反応容器２の列が光源ランプ１２からの光
束１３を通過するように設置してある。

光度計の光束１３は、反応テーブル１が停止状
態にあるときに、反応容器への試料吐出位置２５
から、時計方向に数えて、例えば31番目の反応容
器２の中心を透過するように配置されている。光
束１３の位置と吐出位置２５の間には複数の排液
管２６および複数の洗浄液吐出管２７がそれぞれ
容器内への挿脱可能に配置され、それぞれ、排液
装置２８および洗浄装置２９に接続されている。

第３図は、第２図の実施例における電気信号処
理系統を示すブロツク図である。

電気信号処理系全体の構成はマルチプレクサ１
４、対数変換増幅器１５、Ａ／Ｄ変換器１６、中
央処理装置１７、読出専用記憶装置１８、読出書
込記憶装置１９、プリンタ２０、操作パネル２
１、および機構部駆動回路２２から成り立ち、バ
スライン２３で接続されている。

次にこの実施例の動作を説明する。分析試料例
えば血清を収容した試料容器５がサンプリング位
置３０に位置づけられるとピペツタ７のプローブ
（吸排管）８の先端が上記試料容器５内に浸漬さ
れ、血清の一定量を吸入し、プローブ８内に保持
する。その後、プローブ８は反応テーブル１の吐
出位置２５まで移動し、吐出位置２５に移送され
ている反応容器２内にプローブ８内で保持してい
た血清を吐出する。このサンプリング動作が終る
と反応テーブル１は時計方向に連続的もしくは間
欠的な回転移動を開始し、反応テーブル１上の反
応容器２の全数より１つ多い数の反応容器、すな
わち41個の反応容器２が吐出位置２５を通過する
に必要な角度だけ、即ち369度だけ一気に回転し
て停止する。

反応テーブル１のこの回転によつて上記サンプ
リング動作でサンプリングされた試料の入つた反
応容器２は、吐出位置２５より１ピツチ分即ち角
度９度だけ時計方向に進んだ試薬添加位置３１に
来て停止していることになる。上記反応テーブル
１の回転中に反応テーブル１上の全ての反応容器
２は光束１３を横切つて過通する。そしてそれぞ
れの反応容器２が光束１３を通過するときには分
光器１１により各試料液に基づく光吸収測定がな
され、分光器１１の出力はマルチプレクサ１４に
より現在必要な測定波長の信号が選択され、Ａ／
Ｄ変換器１６により中央処理装置１７に取り込ま
れて読出書込記憶装置１９に記憶される。

反応テーブル１の回転および停止している間の
時間を例えば30秒とすると、30秒を１サイクルと
して回転と停止の動作を繰返す。上記サイクルが
進むにつれてサンプリングされた特定の被測定試
料は、反応テーブル１が停止している状態での位
置が、１ピツチ分ずつ時計方向に進んでいること
になる。

分注器９は、第１酵素試薬３５を反応容器に添
加するものであり、分注器１０は、第２酵素試薬
３６を反応容器に添加するものである。第１およ
び第２酵素試薬は、前記した組成と同様のものを
用いることができる。各分注器の吐出管３３，３
４は上下動可能に構成されており、試薬液吐出時
にわずかに下降するようになつている。分注器９
と分注器１０の吐出管３３，３４は例えば反応テ
ーブル１の停止状態において、それぞれ吐出位置
２５より数えて時計方向に１番目に位置する試薬
添加位置３１と16番目に位置する試薬添加位置３
２の反応容器２の上に設置されている。特定の被
測定試料について見ると試薬添加位置３１で添加
された第１酵素試薬により第１グループの反応が
開始し、それより15サイクル目に試薬添加位置３
２に到達したときに分注器１０により第２の試薬
が添加され第２の反応が開始される。さらにサイ
クルが進み、反応テーブル１が停止している状態
における反応容器２の位置が光束１３を越えて光
束１３と吐出位置２５の間に達したとき、この反
応容器内の試料は測定終了したことになり、試料
液は排液管２６を通じて排液装置２８により吸引
排液される。また洗浄液吐出管２７を通じて洗浄
装置２９より洗浄液（通常は蒸留水）が吐出され
る。次の反応テーブル１の停止時にこの反応容器
２の洗浄液は上記と同様にして最終の排液が行な
われ、さらにサイクルが進んで吐出位置２５より
再度反応容器２として使用される。以上の動作は
読出専用記憶装置１８内のプログラムに従つて中
央処理装置１７より機構部駆動回路２２を通じて
各機構部が制御される。操作パネル２１は測定条
件の入力、測定開始、および測定停止等の操作に
使用される。

以上の動作で１サイクルにおける反応テーブル
１の停止時間を9.5秒、回転時間を20.5秒とする
と、特定試料に着目した場合、その特定試料の反
応過程は29.5秒毎に31回測定され、合計15分15秒
間の測定データが読出書込記憶装置１９内に記憶
されている。中央処理装置１７は、読出専用記憶
装置１８のプログラムに従つて作動し、読出書込
記憶装置１９内の31個の測定データから予定のプ
ログラムに従つて必要なデータを抽出し、濃度演
算等の処理を行つてプリンタ２０に出力する。

第２図の実施例装置をグルコースと総コレステ
ロールの２項目分析に適用した例について少し詳
細に説明する。

読出書込記憶装置１９内に記憶されている各試
料あたり31個の吸光度データに基づいて、所定の
プログラムにより、次の様に濃度演算がなされ
る。すなわち16番目の吸光度データをE₁₆、31番
目のデータをE₃₁とすると、グルコースの濃度Y₁
は Y₁＝C_S／E^S／₁₆−E^O／₁₆（E₁₆−E^O ₁₆ 総コレステロール濃度Y₂は Y₂＝C_S′／E^S／₃₁−kE^S／₁₆（E₃₁−kE₁₆） で表わされる。

ここで、C_S、C_S′は、それぞれ検量線作成用に
使用した標準液のグルコース濃度とコレステロー
ル濃度で、操作パネル２１より前もつて入力して
おく。E^O ₁₆は、試薬ブランクの16番目のデータで
ある。E^S ₁₆およびE^S ₃₁は、標準液の16番目（グルコ
ース用）と31番目（総コレステロール用）のデー
タである。ｋは、液量補正係数であり、この場合
は試料量が5μ、第１酵素試薬液量が500μ、
第２酵素試薬液量が50μであるので、ｋ＝
505／555である。

第４図は第２図の実施例の動作を示すフローチ
ヤート例である。

本発明は、２成分の分析に限らず３成分以上の
分析にも適用できる。例えば第２図の実施例装置
を応用して３成分を分析するには、第２の試薬添
加位置３２と光束１３との間に、第３の酵素試薬
添加位置を設ける。例えばグルコース、総コレス
テロール、中性脂肪の３成分分析法では、前述の
グルコースおよび総コレステロールの２成分の分
析後、第３試薬として、リポプロテインリパー
ゼ、グリセロールオキシダーゼを反応液に加え、
(4)、(5)、(8)式の反応を完結させ、第３試薬の添加
前と反応終了後の吸光度の差から中性脂肪の濃度
を算出する。

この場合の反応液の吸光度を経時的に追跡すれ
ば第５図に示すごとくなる。そして図のａ，ｂ，
ｃの大きさは、それぞれグルコース、総コレステ
ロール、中性脂肪の濃度に比例する。第５図の
イ，ロ，ハは順次、第１、第２および第３酵素試
薬の添加時期を示す。

第１図および第２図の実施例では、２つの成分
分析のために同じ測定波長を用いているが、第１
成分の分析のための測定波長と第２成分の測定波
長を異なる様に選ぶこともできる。この場合、16
番目の吸光度データとして２つの異なる波長のデ
ータを得るか或いは15番目の吸光度データE₁₅を
第１成分の吸光度データとして、E₁₆とE₃₁の測定
波長と異なる波長を選ぶことができる。

この場合第１成分の濃度Y₁は次の様に計算で
きる。

Y₁＝C_S／E^S／₁₅−E^O／₁₅（E₁₅−E^O ₁₅） 又第２成分の濃度Y₂は Y₂＝C_S′／E^S／₃₁−kE^S／₁₆（E₃₁−kE₁₆） と表わされる。

以上説明したように、本発明によれば１回の試
料採取であつても同じ試料から複数の分析項目を
分析することが可能になるので、複数項目分析の
ための試料量を微量にできるという効果がもたら
される。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例の概略構成説明図、
第２図は本発明の他の実施例の概略構成説明図、
第３図は第２図の実施例の信号処理系を示す図、
第４図は第２図の実施例の動作の流れ図、第５図
は３成分分析を説明するための図である。 １……反応テーブル、２，５２……反応容器、
４……試料テーブル、７……ピペツタ、９，１０
……分注器、１３……光束、１７，７５……中央
処理装置、３１，３２，５５，５６……試薬添加
位置、３５，３６，８１，８３……酵素試薬液、
６１，６２……測光位置、６３……多波長光度
計、８０，８２……デイスペンサ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ １つの反応容器内に複数の分析項目を分析す
   べき被検試料と第１の酵素試薬液とを添加して第
   １の分析項目物質から第１の酵素反応により分析
   に適した形態の物質を生じさせること、上記第１
   の酵素反応が生じた第１の反応液の呈色変化を光
   度計で測光すること、測光後の上記第１の反応液
   を収容している同一反応容器内に、所定量の第２
   の酵素試薬液を添加して第２の分析項目物質から
   第２の酵素反応により測定に適した形態の物質を
   生じさせること、上記第２の酵素反応が生じた第
   ２の反応液の呈色変化を上記光度計で測光するこ
   と、上記第１の反応液の測光情報に基づいて上記
   第１の分析項目の分析値を演算すること、上記第
   ２の酵素試薬液の添加量に対応した液量補正値を
   用い上記第２の反応液の測光情報に基づいて上記
   第２の分析項目の分析値を演算すること、を含む
   複数項目分析方法。 ２ 特許請求の範囲第１項記載の分析方法におい
   て、上記第２の反応液の呈色変化の測光は、上記
   第２の酵素試薬液添加前の上記第１の反応液に対
   する測光と上記第２の酵素試薬液添加後の上記第
   ２の反応液に対する測光とを含むことを特徴とす
   る複数項目分析方法。