JPS6310139B2

JPS6310139B2 -

Info

Publication number: JPS6310139B2
Application number: JP58170391A
Authority: JP
Inventors: Yasuo Fujimoto; Takashi Tatsuno; Hiroshi Tsunoda
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1983-09-14
Filing date: 1983-09-14
Publication date: 1988-03-04
Also published as: JPS6062989A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、一般式：（ただし、R₁＝Ｈの時、R₂＝OH、R₁＝OHの
時、R₂はＨを示す。）で表わされる新規なナフタレノン化合物PD及び
その製造法並びに該化合物を有効成分とする制癌
剤に関するものである。

従来、癌化学療法剤として、アルキル化剤（ナ
イトロゼンマスタード類、エチレンイミン類、ス
ルフオン酸エステル類）、代謝拮抗物質（葉酸拮
抗剤、プリン拮抗剤、ピリミジン拮抗剤）、植物
性核分裂毒（コルセミド、ビンブラスチン等）、
抗生物質（ザルコマイシン、カルチノフイリン、
マイトマイシン等）、ホルモン類（副腎ステロイ
ド、男性ホルモン、女性ホルモン）及びポルフイ
リン錯塩（マーフイリン、copp）等が用いられ
ている。しかしながら、その殆んどは細胞毒型の
物質であり、重大な副作用を呈するため、低毒性
ですぐれた制癌活性を有する物質の開発が強く望
まれている現状にある。

本発明者は、低毒性で制癌活性を有する物質を
探索したところ、枯損松より分離したペニシリウ
ム・デイバーズム・バリエタス・オーレウムの培
養物より新規なナフタレノン化合物PDを単離す
ることに成功し、更に該化合物の生理活性につ
き、鋭意研究の結果、前式で表わされる化合物が
著しく低毒性で、すぐれた制癌活性を有する事を
見出し、この物質が癌治療に顕著な効果を発揮し
得ることの新たな知見を得てここに本発明を完成
した。

本発明のナフタレノン化合物PDは、人、家畜、
犬、猫等々の温血動物に対するすぐれた癌化学療
法剤となり得るものである。

本発明に用いる制癌活性を有する化合物につい
て以下に説明する。

本発明の化合物は、以下の構造式を有する。

以下、化合物(1)を“PD−２”、化合物(2)を
“PD−４”と称する。

本発明の化合物を産生する微生物は、ペニシリ
ウム（Penicillium）属に属する該化合物生産菌
であり、その一例としてペニシリウム・デイバー
ズム・バリエタス・オーレウム（Penicillium
diversum var.aureum）Ｐ−１（以下“Ｐ−１
株”と称する）が有利に用いられる。なお、Ｐ−
１株の菌学的性質は、公知のペニシリウム・デイ
バーズム・バリエタス・オーレウムと同じである
（Mycologia、40、541、fig.11（1948）参照）。Ｐ
−１株は、昭和58年２月26日付にて、工業技術
院・微生物工業技術研究所に寄託され、その受託
番号は、微工研菌寄6936号（FERM−P6936）で
ある。

以下、本発明化合物の分離精製法について述べ
る。すなわち、上記Ｐ−１株を、例えば、20〜25
℃で３週間平面静置培養させて得られる培養物の
培養液を活性炭吸着、次いで洗浄後、有機溶媒
で脱着させる。溶出液を合わせて濃縮し、有機溶
剤で抽出し、常法により洗浄、乾燥後、減圧蒸留
する。得られた抽出物を、シリカゲルカラムクロ
マトグラフイー（溶出溶媒ベンゼン：アセトン＝
４：１）に付し、PD−２とPD−４の溶出画分を
集め濃縮し、高速液体クロマトグラフイーにて分
離し、減圧留去後、結晶化して、PD−２、PD−
４をそれぞれ得る。

培地の栄養源としては微生物の培地に通常用い
られる炭素源、窒素源その他を含有させることが
できるが、炭素源としては殿粉、デキストリン、
グリセリン、グルコース、シユークロース、ガラ
クトース、イノシトール、マンニトールなどが、
また窒素源としてはイースト・エキストラクト、
ペプトン、大豆粉、肉エキス、米ぬか、〓、尿
素、コーンスチープリカー、アンモニウム塩、硝
酸塩、その他の有機又は無機の窒素化合物が用い
られる。窒素源として、特にイースト・エキスト
ラクト又はペプトンは前記使用微生物の生育を極
めて良好ならしめるために好適な成分である。そ
の他無機塩類、例えば食塩、燐酸塩類、カリウ
ム、カルシウム、亜鉛、マンガン、鉄等の金属塩
類を適宜に添加してもよい。培養温度、培養時間
等の培養条件は使用菌の発育に適し、しかも目的
物質の産生が最高となるような条件が選ばれる。
例えば、培地のPHは6.8〜7.2、特に7.0の中性附近
がよく、培養の温度、時間は20〜25℃程度、10日
〜25日程度がよい。

このようにして得られる培養物から目的物質を
得るには、まず液に活性炭を加えて吸着させ、
アセトンで脱着した後、有機溶剤で処理して結晶
性混合物を集め、更に該混合物より有機溶剤との
分配の差を利用する手段を用いればよい。具体的
には、まず液に活性炭を加えて吸着させ、アセ
トンで脱着して得られる含水アセトン溶液よりア
セトンを留去、酢酸エチルで抽出、これを留去し
た残留物を、夾雑する不純物を除く目的でシリカ
ゲルを用いたカラムクロマトグラフイーに付す。
溶剤系としてはベンゼン−アセトン系が最適であ
り、混合比は適宜それを変化させ、極性を次第に
大きくしながら溶出する。これは段階的にもグラ
ジエントに変化させてもよく、シリカゲルカラム
としては、市販のカラムクロマト用充填剤を用い
て調整してもよいし、既製のカラムを用いること
もできる。PD−２、PD−４の溶出画分をそれぞ
れ集め、高速液体クロマトグラフイーにて分離す
る。溶媒は、ヘキサン−酢酸エチル系が最適であ
る。分離後、溶媒留去し、残渣を再結晶化する
と、それぞれPD−２、PD−４を得る。

かくして得られた化合物PD−２、PD−４の理
化学的性質は、次の通りである。

〔PD−２の理化学的性質〕 (1) 融点：141〜143℃ (2) 比旋光度：〔α〕²⁶ _D−18.6（メタノール、Ｃ＝
0.086） (3) マス・スペクトル：ｍ／z194（M⁺） (4) IR・スペクトル：ν^KBr _naxcm^-13400〜3000、
1630、1580 (5) ¹H−NMRスペクトル：（CDCl₃、90MHz、
δ） 2.07（ddd、Ｊ＝11.4、11.9、13.2Hz、Ｈ−3α） 2.84（ddd、Ｊ＝4.8、5.3、11.9Hz、Ｈ−3β） 4.36（dd、Ｊ＝5.3、13.2Hz、Ｈ−２） 4.98（dd、Ｊ＝4.8、11.4Hz、Ｈ−４） 6.93（dd、Ｊ＝2.0、8.3Hz、Ｈ−７） 7.04（dd、Ｊ＝2.0、8.3Hz、Ｈ−５） 7.57（ｔ、Ｊ＝8.3Hz、Ｈ−６） (6) 毒性：マウスに対し、50mg／Kgを連続投与し
ても何ら毒性を認めない。

〔PD−４の理化学的性質〕 (1) 融点：139〜141℃ (2) 比旋光度：〔α〕²⁶ _D−36.3℃（メタノール、Ｃ
＝0.062） (3) マス・スペクトル：ｍ／z194（M⁺） (4) ¹H−NMRスペクトル：（ｄ−６−アセト
ン、90Hz、δ） 2.07（ddd、Ｊ＝10.8、11.9、13.6Hz、Ｈ−3α） 2.79（ddd、Ｊ＝4.6、5.1、11.9Hz、Ｈ−3β） 4.38（dd、Ｊ＝5.1、13.6Hz、Ｈ−２） 5.41（dd、Ｊ＝4.6、10.8Hz、Ｈ−４） 7.09（dd、Ｊ＝2.0、7.7Hz、Ｈ−６） 7.33（ｔ、Ｊ＝7.7Hz、Ｈ−７） 7.49（dd、Ｊ＝2.0、7.7Hz、Ｈ−８） (5) 毒性：マウスに対し、50mg／Kgを連続投与し
ても何ら毒性を認めない。

次に本発明のナフタレノン化合物PDを有効成
分とする制癌剤について述べる。

本発明の制癌剤は、経口及び非経口投与のいず
れも使用可能であり、経口投与する場合は、軟・
硬カプセル剤又は錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤と
して投与され、非経口投与する場合は、注射剤、
点滴剤及び固体状又は懸濁粘稠液状として持続的
な粘膜吸収が維持できるように坐薬のような剤型
で投与され得る。

また、本発明の有効成分を製剤化するに当つて
は、前式で表わされる化合物は常法に従い、皮下
或いは静脈注射用製剤とすることができる他、カ
プセル剤、錠剤、細粒剤等の剤型に製剤化して経
口用に供することができる。

本発明の有効成分の製剤化は、界面活性剤、賦
形剤、滑沢剤、佐剤、及び有効成分の性質を考慮
して腸溶性製剤とするために医薬的に許容し得る
皮膜形成物質、コーテイング助剤等を用いて適宜
行うことができ、その具体例を挙げれば、次のと
おりである。

本発明の組成物の崩壊、溶出を良好ならしめる
ために、界面活性剤、例えばアルコール、エステ
ル類、ポリエチレングリコール誘導体、ソルビタ
ンの脂肪酸エステル類、硫酸化脂肪アルコール類
等の１種又は２種以上を添加することができる。

また、賦形剤としては、例えば蔗糖、乳糖、デ
ンプン、結晶セルロース、マンニツト、軽質無水
珪酸、アルミン酸マグネシウム、メタ珪酸アルミ
ン酸マグネシウム、合成珪酸アルミニウム、炭酸
カルシウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素カ
ルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウ
ム等の１種又は２種以上を組合せて添加すること
ができる。

滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシ
ウム、タルク、硬化油等を１種又は２種以上添加
することができ、また矯味剤及び矯臭剤として、
食塩、サツカリン、糖、マンニツト、オレンジ
油、カンゾウエキス、クエン酸、ブドウ糖、メン
トール、ユーカリ油、リンゴ酸等の甘味剤、香
料、着色料、保存料等を含有させてもよい。

懸濁剤、湿潤剤の如き佐剤としては、例えばコ
コナツト油、オリーブ油、ゴマ油、落下生油、乳
酸カルシウム、ベニバナ油、大豆リン脂質等を含
有させることができる。

また、皮膜形成物質としては、セルロース、糖
類等の炭水化物誘導体として酢酸フタル酸セルロ
ース（CAP）、またアクリル酸系共重合体、二塩
基酸モノエステル類等のポリビニル誘導体として
アクリル酸メチル・メタアクリル酸共重合体、メ
タアクリル酸メチル・メタアクリル酸共重合体が
挙げられる。

また、上記皮膜形成物質をコーテイングするに
際し、通常使用されるコーテイング助剤、例えば
可塑剤の他、コーテイング操作時の薬剤相互の付
着防止のための各種添加剤を添加することによつ
て皮膜形成剤の性質を改良したり、コーテイング
操作をより容易ならしめることができる。なお、
有効成分を皮膜形成物質を用いてマイクロカプセ
ル化してから賦形剤等と混合した剤型としても良
い。

特に代表的な剤型における配合比は下記の通り
である。

特に好ましい範囲有効成分 0.1〜90重量％ 0.3〜15重量％賦形剤 10 〜99.8〃 85 〜99.4〃滑沢剤 0 〜50 〃 0 〜20 〃界面活性剤 0 〜50 〃 0 〜20 〃皮膜形成物質 0.1〜50 〃 0.3〜20 〃特に好ましい賦形剤は、乳糖、結晶セルロー
ス、カルボキシメチルセルロースカルシウムで
あ。

また、投与量は、対象腫瘍を有効に治療するに
十分な量であり、腫瘍の症状、投与経路、剤型な
どによつて左右されるが、一般に、経口投与の場
合、大人では１日当り、約0.01〜100mg／Kg体重
（小人では、0.01〜60mg／Kg体重）の範囲で、そ
の上限は好ましくは約50mg／Kg体重、更に好まし
くは約10mg／Kg体重程度であり、非経口投与の場
合、その上限は約10mg／Kg体重程度であり、好ま
しくは５mg／Kg体重、更に好ましくは２mg／Kg体
重が適当である。

次に、上記化合物の制癌活性を確認した制癌性
試験法について述べる。

ラツトの腹水から吉田肉腫細胞（Yoshida
sarcom cells）を取り出し、20％の牛胎児血清を
含むDM−160培地（蛋白質、脂質を含まず、ア
ミノ酸組成として必須アミノ酸の他に可欠アミノ
酸を含む組織培養用純合成培地）で１ml中に10〜
15×10⁴個の細胞数になるように希釈する。この
細胞浮遊液20mlをTD₄₀フラスコに移して37℃で
３〜４日間培養すると、細胞は増殖して１ml中
110〜130×10⁴個になる。この増殖した細胞浮遊
液を再び前記DM−160培地で希釈して１ml中15
〜20×10⁴個の細胞数になるようにする。この希
釈細胞浮遊液の20mlをTD₄₀フラスコに移し、37
℃で３〜４日間培養して細胞を増殖させる。この
ようにTD₄₀フラスコ内で前記DM−160培地を用
いて増殖、希釈、増殖順序を繰り返すことによつ
て吉田肉腫細胞の組織培養を継代維持する。

組織培養に移されて、TD₄₀フラスコ内で増殖
した吉田肉腫細胞を前記DM−160培地中に懸濁
して１ml中に20〜22×10⁴個の細胞数になるよう
に調整する。この細胞浮遊液の２mlを各々のバイ
アルに分注し、被験化合物を最終濃度が所定の値
になるように10μのメタノールに溶解して各々
のバイアルに加えて37℃で４日間培養する。培養
後、バイアル中の細胞浮遊液の一部を取り、血球
計算盤を用いて顕微鏡下に細胞数を数える。

以下に、本発明を製造例、製剤例及び試験例に
よつて具体的に説明する。

製造例培養には、下記の組成のツアペツク−イース
ト・エキストラクト（Czapek−Yeast extract）
培地を使用した。

シヨ糖 50ｇ KCl 0.5ｇ MgSO₄ 0.5ｇ K₂HPO₄ １ｇ NaNO₃ ２ｇイースト・エキストラクト５ｇ滅菌水（PH7.2） 10 上記培地を扁平培養フラスコ30個に分注し（フ
ラスコ１個当り330ml）、アルミ箔をして、オート
クレーブで120℃、15分間滅菌する。滅菌後、前
記Ｐ−１菌〔微工研菌寄第6936号（FERM−
P6936）〕を接種して20〜25℃で３週間静置培養
を行つた。フラスコから吸引過して集めた培養
液10に活性炭100ｇを加え、次いで脱気し、
生産物を活性炭に吸着させた。この活性炭を吸引
過して取出し、約１の蒸留水で洗浄した。

次に、この活性炭を約２のアセトンに浸漬
し、吸着物を脱着させた。さらに、この操作を再
度行つて残りの吸着物を完全に脱着させた。アセ
トン溶出液を合わせて減圧濃縮して得られた水溶
液を、約１の酢酸エチルで２回抽出した。得ら
れた抽出液を同量の飽和食塩水で洗浄し、無水硫
酸ナトリウムを加えて乾燥した。乾燥後減圧蒸留
し、酢酸エチル抽出物1.5ｇを得た。該抽出物を
少量のアセトンに溶かし、それを少量のシリカゲ
ルに吸着させた後、アセトンを蒸発させて乾燥
し、これをシリカゲルカラム（シリカゲル200ｇ）
上にのせた。

カラムの溶出溶媒には、ベンゼン：アセトン
（４：１）を用いた。このカラムクロマトグラフ
イーによりPD−３を含む部分を分離し、TLC上
Rf1.4〜2.5（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）の
分画を集めて濃縮し、高速液体クロマトグラフイ
ー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１、
Nucleosil50−５、8φ×300mm）に付し、保持時
間14.2分（PD−４）と24.2分（PD−２）のピー
クを集めて濃縮、前記溶媒で再結晶して、それぞ
れ無色針状晶を得た。収量は、それぞれ培地当り
15〜20mgであつた。

製剤例１（注射・点滴剤）化合物PD−２（10mg）を含有するように粉末ぶ
どう糖５ｇを加えてバイアルに無菌的に分配し、
密封した上、窒素、ヘリウム等の不活性ガスを封
入して冷暗所に保存する。使用前に、0.85％生理
的食塩水100mlを添加して静脈内注射剤とし、１
日、10〜100mlを症状に応じて静脈内注射又は点
滴で投与する。

製剤例２（注射・点滴剤）化合物PD−４（２mg）を用いて、製剤例１と同
様の方法により軽症用静脈内注射剤とし、１日、
10〜100mlを症状に応じて静脈注射又は点滴で投
与する。

製剤例３（腸溶性カプセル剤）化合物PD−２（５ｇ）、乳糖2.46ｇ及びヒドロ
キシプロピルセルコース0.04ｇを各々とり、よく
混合した後、常法に従つて粒状に成形し、これを
よく乾燥して篩別してビン、ヒートシール包装な
どに適した顆粒剤を製造する。次に、酢酸フタル
酸セルロース0.5ｇ及びヒドロキシプロピルメチ
ルセルロースフタレート0.5ｇを溶解して被覆基
材となし、前記顆粒を浮遊流動させつゝこの基材
を被覆して腸溶性の顆粒剤とする。この組成物を
カプセルに充填して腸溶性カプセル製剤100個を
製造する。

試験例上記化合物PD−２およびPD−４を用い、前記
試験法により吉田肉腫細胞（Yoshida sarcoma
cells）に対する生育阻害活性を調べた。いずれ
の化合物も20〜50μｇ／mlで生育阻害活性を示し
た。この結果から、上記被験化合物は、癌細胞の
増殖抑制にすぐれた効果を発揮することが明らか
である。

Claims

【特許請求の範囲】１一般式（ただし、R₁＝Ｈの時、R₂＝OH、R₁＝OHの
時、R₂はＨを示す。）で示されるナフタレノン化合物PD。２ R₁＝Ｈ、R₂＝OHである特許請求の範囲第１
項記載の化合物。３ R₁＝OH、R₂＝Ｈである特許請求の範囲第１
項記載の化合物。４ペニシリウム（Penicillium）属に属するナ
フタレノン化合物PD生産菌を培養して、培養物
より前記ナフタレン化合物PDを分離・採取する
ことを特徴とするナフタレノン化合物PDの製造
法。５ペニシリウム属に属するナフタレノン化合物
PD生産菌が、ペニシリウム・デイバーズム・バ
リエタス・オーレウム（Penicillium diversum
var.aurem）Ｐ−１（微工研菌寄第6936号）であ
る特許請求の範囲第４項記載の製造法。