JPS6240997B2 - - Google Patents

Description

請求の範囲 １ アクリルアミドとメチレン―ビス―アクリル
アミドとの共重合体を含む生物学用ポリアクリル
アミドゲルであつて、更に生理的溶液をも含み、
かつ成分含量（質量％）が ポリアクリルアミド 3.0〜28.0 生理的溶液 72.0〜97.0 であることを特徴とする生物学用ポリアクリルア
ミドゲル。

２ 生理的溶液が0.5％塩化ナトリウム水溶液ま
たは0.9％塩化ナトリウム水溶液またはリンゲ
ル・ロカート氏液またはアール氏液またはハンク
ス氏液または培地199またはイーグル培地または
５％葡萄糖水溶液である請求の範囲第１項記載の
生物学用ポリアクリルアミドゲル。

３ 0.5％塩化ナトリウム水溶液を生理的溶液と
して含み、成分含量（質量％）が ポリアクリルアミド 6.0〜15.0 0.5％塩化ナトリウム水溶液 85.0〜94.0 である請求の範囲第２項記載の生物学用ポリアク
リルアミドゲル。

４ 0.9％塩化ナトリウム水溶液を生理的溶液と
して含み、成分含量（質量％）が ポリアクリルアミド 5.0〜18.0 0.9％塩化ナトリウム水溶液 82.0〜95.0 である請求の範囲第２項記載の生物学用ポリアク
リルアミドゲル。

５ ５％葡萄糖水溶液を生理的溶液として含み、 成分含量（質量％）が ポリアクリルアミド 4.0〜20.0 ５％葡萄糖水溶液 80.0〜96.0 である請求の範囲第２項記載の生物学用ポリアク
リルアミドゲル。

６ アクリルアミドとメチレン―ビス―アクリル
アミドとを共重合させ、次いで最終生成物を洗浄
することを含む、アクリルアミドとメチレン―ビ
ス―アクリルアミドとの共重合体を含む生物学用
ポリアクリルアミドゲルであつて、更に生理的溶
液をも含み、かつ成分含量（質量％）が ポリアクリルアミド 3.0〜28.0 生理的溶液 72.0〜97.0 である生物学用ポリアクリルアミドゲルの製法に
おいて、アクリルアミドとメチレン―ビス―アク
リルアミドとの共重合および最終生成物の洗浄を
生理的溶液の媒質中で行うことを特徴とする生物
学用ポリアクリルアミドゲルの製法。

７ 生理的溶液が0.5％塩化ナトリウム水溶液ま
たは0.9％塩化ナトリウム水溶液またはリンゲ
ル・ロカート氏液またはアール氏液またはハンク
ス氏液または培地199またはイーグル培地または
５％葡萄糖水溶液である請求の範囲第６項記載の
生物学用ポリアクリルアミドゲルの製法。

技術分野 本発明は生物学用ポリアクリルアミドゲルなら
びにその製法に関する。本発明は生物学に於て使
用するためのものである。

背景技術 現在、微生物学に於ては、天然の寒天ゲルが広
く用いられている。しかし、天然物を合成物で代
用しようとする要望がある。ポリアクリルアミド
ゲルのような重合体ゲルは比較的古くから知られ
ており、その利点のために種々の目的に用いられ
ている。それにも拘らず、その生物学的目的のた
めの使用は該ゲル内に有毒な出発単量体が存在す
ることによつて制限されている。当業界では、微
生物用の合成増殖培地であつて、水溶性単量体混
合物１部につき３―20重量部の水を含み、該単量
体混合物がまたアクリルアミド１部につき0.01〜
0.25部の１つのまたはもう１つのアルキリジン―
ビス―アクリルアミドを含む合成増殖培地が知ら
れている（米国特許第3046201号、U.S.Cl195―
100、1962年６月24日公告）。

上記ポリアクリルアミドゲルは基礎培地
（base）であり、これに微生物の栄養としての
種々の無機物質が添加される。これらの添加物質
はある型の微生物の栄養所要量を与えるように高
濃度で基礎培地中へ導入される。

しかしながら、上記の合成培地もいくらかの量
の有害な出発単量体を含んでいる。その上、合成
基礎培地は酸性反応を示す（PH3.5〜４）ため
に、ある種の栄養基質を培地中へ導入することが
できない。こう考えて来ると該合成基礎培地の使
用の可能性は限定される。

微生物の培養のための栄養基質の製造方法（ソ
連邦発明者証第659619号、IPC²C12K1／06、
1979年４月30日公告）は栄養基質のための濃密な
基礎培地（dense base）であるポリアクリルア
ミドゲルを製造し、次いでそれを滅菌の前後に栄
養基質で含浸することからなる。上記方法はアク
リルアミドとメチレン―ビス―アクリルアミドと
を重合させ、次いでそれを水で洗浄して有毒な出
発単量体を除去した後、栄養基質で含浸すること
からなる。上記方法によつて製造された基礎培地
は有毒な未反応出発単量体を含まず、かくして微
生学に於けるこの方法の適用範囲を広げた。

しかし、有毒物質除去のために行う水による最
終生成物の洗浄は、得られたポリアクリルアミド
ゲルの動物およびヒトの細胞、組織および器官と
の無害な接触を保証しない。生体と接触するポリ
アクリルアミドゲルのサイズは安定でない。

発明の開示 本発明の目的は、処理特徴のためにポリアクリ
ルアミドの等張性を保証することができかつその
適用分野を広げることができるポリポリアクリル
アミドゲルおよびその製造方法を提供することで
ある。

上記目的は、アクリルアミドとメチレン―ビス
―アクリルアミドとの重合体を含む先行技術のポ
リポリアクリルアミドゲルが、本発明に従つて生
理的溶液をも含み、かつ成分含量（質量％）が ポリアクリルアミド 3.0〜28.0 生理的溶液 72.0〜97.0 であることによつて達成される。

上記ポリアクリルアミドゲルは無毒性でありか
つ高度の多孔性、親水性、弾性、透明性および熱
安定性を特徴とする。加えて、上記ポリアクリル
アミドゲルは微生物、細胞、組織および器官に対
して等張性を有し、かくしてそのサイズを安定化
することおよび種々の物質による飽和を増加する
ことを可能にする。上記の考えがポリアクリルア
ミドと生体との間の無害の接触を可能にし、かく
して生物学に於けるその適用の可能性を著しく広
げる。

生物学に於けるポリアクリルアミドゲルの適用
の可能性を広げるためには、0.5％塩化ナトリウ
ム水溶液または0.9％塩化ナトリウム水溶液また
はリンゲル・ロカート氏液（Ringer―Lockart
solution）またはアール氏液（Earle solution）
またはハンクス氏液（Hanks solution）または
イーグル（Eagle）培地または５％葡萄糖溶液を
生理的溶液として用いることが有利である。

ポリアクリルアミドゲルが0.5％塩化ナトリウ
ム水溶液を生理的溶液として含みかつ成分含量
（質量％）が ポリアクリルアミド 6.0〜15.0 0.5％塩化ナトリウム水溶液 85.0〜94.0 であることが推せんされる。

ポリアクリルアミドゲルの上記変形は微生物に
対して最適な等張性を得ることを可能にし、かく
して微生物培養のための基礎栄養基質としてのそ
の適用を与える。

ポリアクリルアミドゲルは0.9％塩化ナトリウ
ム水溶液を生理的溶液として含みかつ成分含量
（質量％）が ポリアクリルアミド 5.0〜18.0 0.9％塩化ナトリウム水溶液 82.0〜95.0 であることが可能である。

ポリアクリルアミドゲルの上記変形は動物およ
びヒトの細胞に対する最適の等張性を得ることを
可能にし、かくして細胞培養時の栄養基質担体と
してのその適用を与える。

ポリアクリルアミドゲルは0.5％葡萄糖水溶液
を生理的溶液として含みかつ成分含量（質量％）
が ポリアクリルアミド 4.0〜20.0 ５％葡萄糖水溶液 80.0〜96.0 であることが提案される。

ポリアクリルアミドゲルの上記変形は生体に対
する最適な等張性を与えかつ塩化ナトリウムの存
在が望ましくない場合に用いられる。

上記目的はまた、アクリルアミドとメチレン―
ビス―アクリルアミドとを重合させ、次いで最終
生成物を洗浄することからなる先行技術の生物学
用ポリアクリルアミドゲルの製造方法に於て、本
発明により、アクリルアミドとメチレン―ビス―
アクリルアミドとの重合および最終生成物の洗浄
を生理的溶液中で行うことによつても達成され
る。

本発明の方法はほとんどあらゆる型の微生物の
増殖に於ける濃密な基礎培地として使用すること
ができるポリアクリルアミドゲルの製造を可能に
する。

生理的溶液として、0.5％塩化ナトリウム水溶
液、または0.9％塩化ナトリウム水溶液、または
リンゲル・ロカート氏液、またはアール氏液、ま
たはハンクス氏液、または199培地、またはイー
グル培地、または５％葡萄糖水溶液を使用するこ
とが推せんされる。

本発明の方法の上記変形は生物学に於けるポリ
アクリルアミドゲルの利用の可能性を広げること
を可能にする。

本発明の最良の実施方式 ポリアクリルアミドゲルはアクリルアミドとメ
チレン―ビス―アクリルアミドまたは他の水溶性
アルキリジン―ビス―アクリルアミドとの重合に
よつて製造される。反応混合物は一般に80―99.5
質量％のアクリルアミドと0.5―20質量％のメチ
レン―ビス―アクリルアミドまたは他の水溶性ア
ルキリジン―ビス―アクリルアミドとを含む。出
発単量体を生理的溶液中に溶解する。生理的溶液
としては、0.5％塩化ナトリウム水溶液または0.9
％塩化ナトリウム水溶液または５％葡萄糖水溶液
またはリンゲル・ロカート氏液またはハンクス氏
液またはアール氏液または199培地またはイーグ
ル培地が用いられる。反応混合物中の出発単量体
の量を変えることにより、異なる密度および弾性
のポリアクリルアミドゲルを得ることができる。

出発単量体の重合工程は反応混合物を加熱し、
あるいは加熱せずに、かつ公知の開始剤および触
媒を添加して進行させることができる。重合速度
は温度、触媒量および放射線強度に比例する。触
媒は通常出発単量体重量に対して0.05〜0.1％の
量で添加される。

反応混合物は、乾燥粉末状単量体を混合した
後、生理的溶液に溶解することによつても調製す
ることができる。溶解工程を迅速化するために、
生理的溶液を加熱する。反応混合物の重合は、一
定容積の所定の形内、すなわちガラス、金属、セ
ラミツク容器内で行うことができ、合成物質製容
器内でも行うことができる。重合工程の結果とし
て得られるゲルは用いた容器の形およびサイズを
とる。

重合条件は上記条件と同様である。重合工程の
終了後、得られたポリアクリルアミドゲルを生理
的溶液で洗浄する。

重合反応に加わらなかつた出発単量体を除去す
るためのゲルの洗浄工程は通常の条件下で温度を
上げて行うことができる。そうする場合、反応に
加わらなかつた出発単量体は生理的溶液中に溶解
し、ゲルから生理的溶液中に移行する。生理的溶
液を新しいものと取り換えることにより、ゲルか
ら有毒物質を完全に除去することが可能である。
通常この目的のためには、溶液を３回取り換えれ
ば十分である。加熱はゲルの洗浄工程を迅速化す
る。かくして得られたゲルは衝撃押出しや切断を
受けやすい。洗浄および所要の形に成形した後、
ポリアクリルアミドゲルは滅菌される。

ゲルの滅菌は熱、放射線および化学的方法で行
うことができる。滅菌方法の選択およびそのパラ
メーターは特別な仕事の条件によつて決まる。滅
菌後、ゲルは微生物培養用の栄養基質を調製する
ための濃密基礎培地として使用するのに適するよ
うになり、利用されるまで貯蔵しておくことがで
きる。

微生物および細胞培養の栄養としての基質によ
るゲルの飽和は滅菌前および後に達成され得る。
飽和方法の選択は栄養基質の組成によつて決ま
る。栄養基質中に熱不安定性成分が存在する場合
には、飽和は滅菌後に達成される。栄養基質の組
成は微生物および細胞の特別な群または種類の栄
養要求によつて決定される。本発明のポリアクリ
ルアミドゲルを飽和させるためには、天然、半合
成および合成の基質組成物あるいはそれらの混合
物を含む、あらゆる種類の微生物および細胞の栄
養要求に合致する栄養基質を利用することができ
る。

栄養培地の性能を決定するためおよび微生物、
動物およびヒトの細胞の生物学的性質を試験する
たわには、通常の研究方法が用いられる。

本発明を特別な実施例によつてさらに説明す
る。

実施例 １ ポリアクリルアミド11質量％と0.5％塩化ナト
リウム水溶液89質量％とを含む本発明のポリアク
リルアミドゲルを次のようにして製造した。３種
の溶液（Ａ、Ｂ、Ｃ）を下記の方法を用いて予め
調製した（出発成分の量は基礎溶液1000mlに対し
て与えられる）：溶液Ａは0.5％塩化ナトリウム
水溶液995ml中にテトラメチルエチレンジアミン
５mlを溶解して調製し、利用の瞬間まで温度４℃
に於て暗色ガラス容器中に貯蔵しておいた（通常
の貯蔵時間は６―８か月である）；溶液Ｂは温度
60℃に加熱した0.5％塩化ナトリウム水溶液350ml
中に7.35gのメチレン―ビス―アクリルアミドを
溶解した後280gのアクリルアミドを添加し、完
全に溶解するまで混合することによつて調製し
た。かくして得た溶液を綿ガーゼフイルターで
過した後、0.5％塩化ナトリウム水溶液を加えて
1000mlとし、得られた溶液を利用の瞬間まで温度
４℃の冷蔵庫内に入れた暗色ガラス容器中に貯蔵
した（通常の貯蔵時間は６―８か月である）；溶
液Ｃは0.5％塩化ナトリウム水溶液1000ml中に
1.4gの過硫酸アンモニウムを溶解することによつ
て調製し、これを利用の瞬間まで暗色ガラス容器
中に貯蔵した（通常の貯蔵時間は４〜６週間であ
る）。

上記溶液Ａ、Ｂ、Ｃ、から反応混合物を調製し
た。このため、２容量部の溶液Ｂと４容量部の溶
液Ｃとを１容量部の溶液Ａに加えた。

この反応混合物をおのおのが厚さ３mmの２枚の
平行平面ガラス板でできたスロツト中に注入し、
重合工程を15分間進行させた。次にガラス板を剥
がし、かくして生成したポリアクリルアミドゲル
の板を取り外した。このゲル板から直径70mmの円
板を押し出した。得られた円板を容器に入れ、
0.5％塩化ナトリウム水溶液（円板１個につき溶
液20ml）を注いだ。次に、この円板を0.5％塩化
ナトリウム水溶液中に12時間、４時間後毎に溶液
を取り換えて、浸漬した。12時間後に溶液を注ぎ
出した。

得られたポリアクリルアミドゲルは無毒性であ
り、高度の多孔性、親水性、弾性、透明性ならび
に熱安定性を有する。

このゲルに塗布された種々の種類の微生物の細
胞は長時間（３か月以上）その形、サイズおよび
生存能力を保存した。かくして、与えられたゲル
の微生物細胞に対する等張性を示した。

このゲルはビーフエキスブロスのような微生物
の栄養のための基質で容易に飽和された。それ
故、このゲルは種々の微生物群〔エシユリヒア
（Escherichia）、サルモネラ（Salmonella）、シゲ
ラ（Shigella）、プロテウス（Proteus）、スタフ
イロコツクス（Staphylococcus）、等〕の培養の
ための栄養基質製造用の濃密な基質培地として利
用された。

飽和の目的のためには、洗浄済み円板上にホツ
テインガー（Hottinger）ブロスと300mg％の量の
アミン窒素とを注ぎ（円板１個につきブロス10
ml）、温度120℃で30分間滅菌処理した。この時間
中にブロスによる飽和および滅菌が行われた。滅
菌ペトリ皿内に入れられ、ブロスで飽和され、滅
菌条件下で保たれた滅菌円板を乾燥し、それに大
腸菌を接種した。この菌を温度37℃で24時間培養
した。この間に大腸菌の培養菌はコロニーの形で
円板表面上で増殖した。

ゲル上での増殖中、菌は増殖および分裂の性
質、細胞およびコロニーの形、形態学的、染色
的、培養的、生化学的、血清学的諸性質、抗原構
造、食菌作用能力のような生物学的性質を保存し
た。接種量が同じ場合、増殖菌の生物量はビーフ
エキス寒天上で増殖させた同様な菌の生物量を越
えていた。

本発明のポリアクリルアミドゲル上および先行
技術のゲル上での研究した型の微生物の生存をも
測定した。結果は第１表に示してある。

【表】 実施例 ２ 実施例１記載の方法により、ポリアクリルアミ
ド8.0質量％および生理的溶液92質量％を含む本
発明のポリアクリルアミドゲルを製造した。0.9
％塩化ナトリウム水溶液を生理的溶液として用い
た。

得られたポリアクリルアミドゲルは無毒性であ
り、高度の多孔性、親水性、弾性透明性および熱
安定性を有していた。このゲルは微生物、動物お
よび人間の細胞の栄養のための基質で容易に飽和
された。

ゲル表面に塗布した羊の赤血球の２％懸濁液
0.2mlは溶血されなかつた。またゲル表面に塗布
した線維母細胞、ヘラ（HeLa）細胞およびKB細
胞は温度４℃で２日までそれらの形、サイズおよ
び生存能力を保存した。その得られたゲルの１cm
×１cm×0.3cmの大きさの板を白ネズミに腹膜内
移植しても５日間ではその板の初期の大きさの変
化何ら認められなかつた。２〜３個のゲル板を同
一の動物に同時移植した場合でも、ゲル板は透明
のまゝであり、周囲の器官および組織になんらの
反応性変化を起こさずかつ動物によつて十分耐え
られた。

実施例 ３ 実施例１記載の方法により、ポリアクリルアミ
ド3.0質量％と生理的溶液97.0質量％とを含む本
発明のポリアクリルアミドゲルを製造した。リン
ゲル・ロカート氏液を生理的溶液として用いた。

得られたポリアクリルアミドゲルの性質は実施
例２記載のゲルと同様であつた。

線維母細胞、ヘラ（HeLa）細胞およびKB細胞
の形、サイズおよび生存能力は温度４℃で４日ま
で保存された。

実施例 ４ 実施例１記載の方法により、ポリアクリルアミ
ド11.0質量％と生理的溶液89.0質量％とを含む本
発明のポリアクリルアミドゲルを製造した。ハン
クス氏液を生理的溶液として用いた。

得られたポリアクリルアミドゲルの性質は実施
例２記載のゲルと同様であつた。

該ゲルの板はばら色であり、線維母細胞、ヘラ
（HeLa）細胞およびKB細胞の形、サイズ、生存
能力は該ゲル上で、温度４℃で６日までそのまゝ
であつた。

かくして得られたゲル板を199培地60％とラク
タルブミン加水分解物20％と牛血精20％とを含む
細胞培養用増殖培地で飽和し、ヘラ（HeLa）細
胞の増殖に用いた。ゲル表面上で、ヘラ
（HeLa）細胞は通常の期間中典型的な単一層の形
で増殖した。

実施例 ５ 実施例１記載の方法により、ポリアクリルアミ
ド20.0質量％と生理的溶液80.0質量％とを含む本
発明のポリアクリルアミドゲルを製造した。アー
ル氏液を生理的溶液として用いた。

得られたポリアクリルアミドゲルの性質は実施
例２および４記載のゲルと同様であつた。

実施例 ６ 実施例１記載の方法により、ポリアクリルアミ
ド5.0質量％と生理的溶液95.0質量％とを含む本
発明のポリアクリルアミドゲルを製造した。

199培地を生理的溶液として用いた。

得られたポリアクリルアミドゲルの性質は実施
例２および４記載のゲルと同様であつた。

上記ゲル上で、線維母細胞、ヘラ（HeLa）細
胞およびKB細胞の形、サイズ、生存能力は、温
度４℃で８〜10日まで保存された。

ゲル板上で増殖させた細胞はゲル板に十分固定
された。かくして該ゲル板から切り取つたゲルブ
ロツクを移動させることおよびその顕微鏡検査を
行うことならびに細胞を有する該ゲルをミクロチ
ヤンバーへ入れることも可能であつた。

実施例 ７ 実施例１記載の方法により、ポリアクリルアミ
ド15.0質量％と生理的溶液85.0質量％とを含む本
発明のポリアクリルアミドゲルを製造した。

199培地を生理的溶液として用いた。

得られたポリアクリルアミドゲルの性質は実施
例２および４記載のゲルと同様であつた。このゲ
ル板上で増殖させた細胞の単一層は容易に洗浄除
去され、かくして細胞生物量の蓄積を可能にし
た。

実施例 ８ 実施例１記載の方法により、ポリアクリルアミ
ド7.0質量％と生理的溶液93質量％とを含む本発
明のポリアクリルアミドゲルを製造した。

イーグル培地を生理的溶液として用いた。

得られたポリアクリルアミドゲルの性質は実施
例２および７記載のゲルと同様であつた。

このゲル板を増殖培地で飽和し、細胞株の増殖
に用いた。そうした場合、二倍体細胞の良好な増
殖が見られた。

実施例 ９ 実施例１記載の方法により、ポリアクリルアミ
ド10.0質量％と生理的溶液90.0質量％とを含む本
発明のポリアクリルアミドゲルを製造した。５％
葡萄糖水溶液を生理的溶液として用いた。

得られたポリアミドゲルの性質は実施例２記載
のゲルと同様であつた。

また、線維母細胞、ヘラ（HeLa）細胞および
KB細胞の形、サイズ、生存能力は温度４℃で３
日まで保存された。

同時に、糖分解性酵素を含む微生物の増殖の促
進および生物量の増加が認められた。ゲル組成物
が塩化ナトリウムを含まないため微生物細胞中の
塩化ナトリウムの量の測定が非常に簡単であつ
た。

比較例 １ 実施例１記載の方法により、ポリアクリルアミ
ド2.0質量％と生理的溶液98.0質量％とを含むポ
リアクリルアミドゲルを製造した。0.5％塩化ナ
トリウム水溶液を生理的溶液として用いた。かく
して得られたポリアクリルアミドゲルは半固体の
稠度を有し、実際に、ゲル板の製造、洗浄ならび
に微生物、動物およびヒトの細胞の栄養のための
基質による飽和ならびに微生物および細胞の接種
を行うことができなかつた。

液体栄養基質を添加すると、ゲルが基質中に溶
解し、ゲル構造が喪失した。

比較例 ２ 実施例１記載の方法により、ポリアクリルアミ
ド29.0質量％と生理的溶液71質量％とを含むポリ
アクリルアミドゲルを製造した。

0.9％塩化ナトリウム水溶液を生理的溶液とし
て用いた。かくして得られたポリアクリルアミド
ゲルは極めて濃密な稠度であり、曲げたとき脆か
つた。出発成分を除去するためのゲル板の洗浄は
有効でなく、長時間（15日間以上）を要した。こ
のゲルは微生物および細胞培養の栄養のための基
質による飽和が不十分であり、37℃の温度で急速
に乾燥して亀裂が生じ、かつペトリ皿中に固定す
るのが困難であつた。

工業的適用性 本発明のポリアクリルアミドゲルは微生物の増
殖、分裂および発育のためめに必要な栄養基質を
与えるための濃密な基礎培地として使用すること
ができる。

本発明のポリアクリルアミドゲルを栄養培地の
濃密な基礎培地として利用すると、栄養培地の微
生物学的慣性を保証し、それによつて微生物生物
量の生産を1.5〜２倍に増加させる。

合成的製造法と同様に、ポリアクリルアミドゲ
ルは栄養培地の濃密な基礎培地の再現性および微
生物学的試験の標準化を保証し、異なる研究所の
結果の比較を可能にする。

本発明のポリアクリルアミドゲルの板はペトリ
皿の直径に従つた円形に成形することができ、ま
たカバーガラスまたはスライドの寸法に従つた長
方形または正方形に成形することができ、また
種々の寸法および形のブロツクに成形することも
でき、栄養基質で飽和した後、種々の群、種およ
び菌株の微生物、および動物ならびにヒトの細胞
のマクロおよびミクロ培養のために利用すること
ができる。

本発明のポリアクリルアミドゲルの製造は自動
化することができる。

ゲル板は特殊な滅菌方法を必要としない。その
滅菌は、通常の条件下で、通常の方法で行うこと
ができる。

本発明のポリアクリルアミドゲルのすぐに使用
できる板は長期間貯蔵可能である。