CN109105362B - 一种离体乳牙保存液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种离体乳牙保存液及其制备方法。该保存液包括以下重量份的组分：葡萄糖0.5～1.2份、还原型谷胱甘肽0.01～0.05份、氨基酸0.1～0.5份、人血白蛋白1～5份、Ve 0～1份、海藻糖0.1～0.3份、温敏水凝胶10～20份、抗菌药物0.3～1.5份，以及磷酸盐缓冲液70～90份；其制备方法为：在无菌条件下，按配方将各组分混合，制备得到离体乳牙保存液。本发明方法制备得到的保存液，不仅能为离体乳牙的牙髓组织提供营养物质，还能有效降低牙髓运输过程中的机械损伤，有效的延长保存时间。

Description

一种离体乳牙保存液及其制备方法

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，具体涉及一种离体乳牙保存液及其制备方法。

背景技术

干细胞(stem cell)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，随着对干细胞研究的不断深入，越来越多不同来源的干细胞成为各研究机构的研究热点，如骨髓源间充质干细胞、胎盘源间充质干细胞、牙髓源间充质干细胞、脂肪源间充质干细胞等。

2003年，Miura等在7～8岁儿童的脱落乳牙牙髓中分离出具有高度的单克隆能力、增殖能力、体内成骨等能力的多能干细胞，并命名为SHED。

乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated decid-uous teeth，SHED) 是早期外胚叶间充质组织头部的神经嵴细胞迁移衍生出的牙髓间充质干细胞。

多项研究进一步表明SHED具有成骨分化、成脂分化、神经细胞方向分化等多向分化潜能。且乳牙牙髓被视为生物废弃物，数量可观，符合伦理要求，因而渐渐成为干细胞领域的研究热点，而为了保证离体乳牙中牙髓的活性，其在运输过程中应尽可能的保证在低温条件下进行，但现有的离体乳牙保存液，在运输过程中为液态，容易导致离体乳牙的牙髓在运输过程中容易损伤，也容易引起微生物污染，而且，现有的保存液还存在营养成分不足的问题。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种离体乳牙保存液，可有效解决乳牙在离体保存时，容易出现损伤以及微生物污染的问题。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种离体乳牙保存液，包括以下重量份的组分：

葡萄糖0.5～1.2份、还原型谷胱甘肽0.01～0.05份、氨基酸0.1～0.5份、人血白蛋白1～5份、Ve 0～1份、海藻糖0.1～0.3份、温敏水凝胶10～20份、抗菌药物 0.3～1.5份，以及磷酸盐缓冲液70～90份。

进一步地，包括以下重量份的组分：

葡萄糖1份、还原型谷胱甘肽0.05份、人血白蛋白3份、氨基酸0.5份、 Ve 1份、海藻糖0.2份、温敏水凝胶12份、抗菌药物0.82份，以及磷酸盐缓冲液84份。

进一步地，温敏水凝胶的制备方法如下：

将聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸、丙烯酸以及交联剂混合，再加入引发剂，搅拌均匀，静置反应10～15h后，取出反应产物洗涤3～5次；其中，聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸、丙烯酸、交联剂以及引发剂的重量比为 5～10:0.5～1:0.5～1:0.15～0.3:0.5～1。

进一步地，聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸、丙烯酸、交联剂以及引发剂的重量比为8:1:0.6:0.15:1。

进一步地，交联剂为壳聚糖。

进一步地，引发剂为过硫酸铵、过硫酸钾、过氧化月桂酰或过硫酸钠。

进一步地，抗菌药物包括青霉素、链霉素和两性霉素；其中，青霉素、链霉素和两性霉素B的重量比为：0.2～0.6:0.1～0.5:0.01～0.05。

进一步地，青霉素、链霉素和两性霉素B的重量比为：0.5:0.3:0.02。

进一步地，磷酸盐缓冲液pH值为7.2～7.6。

上述离体乳牙保存液的制备方法，包括以下步骤：

在无菌条件下，按配方将权利要求1中各组分混合，制备得到离体乳牙保存液。

本发明的有益效果为：

1、温敏水凝胶是由聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸和丙烯酸交联聚合后形成的具有三维网络结构的水凝胶，能够根据环境温度变化从而发生体积相变现象；当温度高于最低临界溶解温度(LCST)时，大分子链上的印迹位点相互靠近，呈溶胀失忆状态，即在常温下呈液态；当温度低于最低临界溶解温度(LCST)时，大分子链上的印迹位点相互远离，处于收缩记忆状态，即在低温下呈固态；由此，通过在保存液中添加该温敏水凝胶，然后在常温下将需要保存的乳牙加入至该保存液中，震荡混匀，然后在0～8℃下保存，使乳牙固定于保存液环境中，从而减少运输过程中的颠簸、震荡等造成的牙髓损伤，利于乳牙及细胞的长期储存；另外，固态凝胶将乳牙包裹其中，还能避免微生物污染。

2、葡萄糖是从脂肪供者自身血液中提取分离得到的，其中包括大量的细胞生长因子、转化生长因子、血管内皮细胞生长因子等，可以为乳牙、脂肪细胞提供更好的营养供给环境；抗坏血酸-维生素C的加入可以帮助脂肪细胞维持各种过氧化物酶的活性，防止氧自由基对细胞膜和细胞器造成损伤，对保存乳牙起到关键作用。

3、人血白蛋白可作为稳定剂和保护剂，并且是细胞培养基的重要成分，具有较强的保护作用，能够促进细胞的增长，延长细胞存活的时间；增加血容量和维持渗透压，主要调节组织与血管之间水分的动态平衡，并可作为氮源为组织提供营养。

4、海藻糖(trehalose)是一种自然界中广泛存在的非还原性双糖，无毒副作用，化学性质十分稳定，除了具有低聚糖的一般特性，还有独特的生物学特性，在严酷环境下可保护生物体的组织和大分子的功能和活性；1)稳定生物膜和蛋白质的结构；2)保护生物体免受热和干燥的损伤；3)保护生物体免受氧化应激的损伤；氧自由基可使细胞蛋白质中的氨基酸受损而导致对细胞的损伤，而细胞中高浓度的海藻糖可防止这种损伤，这表明海藻糖具有氧自由基清除剂的作用；4)海藻糖可保护哺乳动物细胞免受缺氧的损伤。

5、本发明方法制备得到的保存液，不仅能为离体乳牙的牙髓组织提供营养物质，还能有效降低牙髓运输过程中的机械损伤，有效的延长保存时间。

附图说明

图1为CD105/CD45表达量的流式检测图；其中，图1a为a组CD105/CD45 的流式检测图；图1b为b组CD105/CD45的流式检测图；图1c为c组CD105/CD45 的流式检测图；

图2为CD90表达量的流式检测图；其中，图2a为a组CD90的流式检测图；图2b为b组CD90的流式检测图；图2c为c组CD90的流式检测图；

图3为CD19表达量的流式检测图；其中，图3a为a组CD19的流式检测图；图3b为b组CD19的流式检测图；图3c为c组CD19的流式检测图；

图4为CD11b表达量的流式检测图；其中，图4a为a组CD11b的流式检测图；图4b为b组CD11b的流式检测图；图4c为c组CD11b的流式检测图；

图5为CD34表达量的流式检测图；其中，图5a为a组CD34的流式检测图；图5b为b组CD34的流式检测图；图5c为c组CD34的流式检测图；

图6为CD73/HLA-DR表达量的流式检测图；其中，图6a为a组 CD73/HLA-DR的流式检测图；图6b为b组CD73/HLA-DR的流式检测图；图6c为c组CD73/HLA-DR的流式检测图；

图7为温敏凝胶胶凝温度检测图谱。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1

一种离体乳牙保存液，该保存液每100mL中含有葡萄糖1g、还原型谷胱甘肽0.05g、人血白蛋白3mL、氨基酸0.5g、Ve 1g、海藻糖0.2g、温敏水凝胶12mL、青霉素0.5g、链霉素0.3g、两性霉素B 0.02g，其余溶质介质为pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。

其中，温敏水凝胶的制备方法为：将聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸、丙烯酸以及壳聚糖混合，然后加入过硫酸铵，搅拌均匀，静置反应15h后，洗涤3次反应产物，得温敏水凝胶；其中，聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸、丙烯酸、壳聚糖以及过硫酸铵的重量比为8:1:0.6:0.15:1。

该保存液的制备方法为：

在无菌条件下，将上述各成分混合均匀，制备得到离体乳牙保存液。

采用该保存液保存乳牙的方法如下：

将乳牙与保存液按照0.5:1的料液比在常温状态下混合，震荡混匀，然后置于0～8℃下保存，同时，在该保存液未凝固前不时震荡，直至该保存液完全凝固为止。

实施例2

一种离体乳牙保存液，该保存液每100mL中含有葡萄糖0.5g、人血白蛋白 1mL、还原型谷胱甘肽0.05g、氨基酸0.5g、Ve 0.5g、海藻糖0.3g、温敏水凝胶20mL、青霉素0.6g、链霉素0.5g、两性霉素B 0.05g，其余溶质介质为pH值为 7.6的磷酸盐缓冲液。

其中，温敏水凝胶的制备方法为：将聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸、丙烯酸以及壳聚糖混合，然后加入过硫酸钠，搅拌均匀，静置反应15h后，洗涤3次反应产物，得温敏水凝胶；其中，聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸、丙烯酸、壳聚糖以及过硫酸钠的重量比为10:0.5:0.8:0.2:0.6。

该保存液的制备方法为：

在无菌条件下，将上述各成分混合均匀，制备得到离体乳牙保存液。

采用该保存液保存乳牙的方法如下：

将乳牙与保存液按照0.5:1的料液比在常温状态下混合，震荡混匀，然后置于0～8℃下保存，同时，在该保存液未凝固前不时震荡，直至该保存液完全凝固为止。

实施例3

一种离体乳牙保存液，该保存液每100mL中含有葡萄糖1.2g、还原型谷胱甘肽0.04g、人血白蛋白5mL、氨基酸0.3g、海藻糖0.1g、温敏水凝胶10mL、青霉素0.2g、链霉素0.1g、两性霉素B 0.01g，其余溶质介质为pH值为7.2的磷酸盐缓冲液。

其中，温敏水凝胶的制备方法为：将聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸、丙烯酸以及壳聚糖混合，然后加入过氧化月桂酰，搅拌均匀，静置反应15h后，洗涤3 次反应产物，得温敏水凝胶；其中，聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸、丙烯酸、壳聚糖以及过氧化月桂酰的重量比为6:0.8:1:0.3:1。

该保存液的制备方法为：

在无菌条件下，将上述各成分混合均匀，制备得到离体乳牙保存液。

采用该保存液保存乳牙的方法如下：

将乳牙与保存液按照0.5:1的料液比在常温状态下混合，震荡混匀，然后置于0～8℃下保存，同时，在该保存液未凝固前不时震荡，直至该保存液完全凝固为止。

实验例

1、温敏凝胶胶凝温度检测

于室温条件下，将实施例1中制备得到的温敏凝胶置于磁力搅拌器上，其中，搅拌子大小为0.6mm×1.5mm，搅拌速率为200r/min，然后分别升温降温，直至搅拌子停止转动为止，并检测此时温敏凝胶胶体温度，其胶凝温度检测图谱如图7所示。

由图7可知，在大于等于25℃时，搅拌子在温敏凝胶中的搅拌速率无任何变化，而随着温度的降低，搅拌子的搅拌速率逐渐降低，直至在3～5℃时，完全停止，由此，表明该温敏凝胶在温度大于室温时，其呈液态，在温度降低至3～5℃时，其呈固态。

2、乳牙的采集

供者要求病原微生物检测结果阴性，具体如下：HBV、HCV、HIV、HTLV、 EBV、TP，供者为乳牙适龄人群，在专业的乳牙采集机构进行乳牙的采集，共采集10颗，经过消毒后放入本发明实施例1制备得到的保存液中，于2-8℃环境中保存1周后通过酶消化法进行提取培养，均提取成功。

2、随机选取3份乳牙材料(分别为标记为a、b、c组)，按照0.8～1.2x10⁴个/cm²的接种比例进行传代扩增培养。

3、对随机培养扩增P3代乳牙源干细胞的免疫表型进行鉴定，其结果分别见表1和图1～图6；其中，图1为CD105/CD45表达量的流式检测图；其中，图1a为a组CD105/CD45的流式检测图；图1b为b组CD105/CD45的流式检测图；图1c为c组CD105/CD45的流式检测图；

图2为CD90表达量的流式检测图；其中，图2a为a组CD90的流式检测图；图2b为b组CD90的流式检测图；图2c为c组CD90的流式检测图；

图3为CD19表达量的流式检测图；其中，图3a为a组CD19的流式检测图；图3b为b组CD19的流式检测图；图3c为c组CD19的流式检测图；

图4为CD11b表达量的流式检测图；其中，图4a为a组CD11b的流式检测图；图4b为b组CD11b的流式检测图；图4c为c组CD11b的流式检测图；

图5为CD34表达量的流式检测图；其中，图5a为a组CD34的流式检测图；图5b为b组CD34的流式检测图；图5c为c组CD34的流式检测图；

图6为CD73/HLA-DR表达量的流式检测图；其中，图6a为a组 CD73/HLA-DR的流式检测图；图6b为b组CD73/HLA-DR的流式检测图；图6c为c组CD73/HLA-DR的流式检测图；

表1乳牙干细胞中免疫标志物的表达量

根据图1～图6，以及表1的检测数据可知，经过本保存液保存的离体乳牙所提取所得干细胞具有典型间充质干细胞表面标志物特征，高表达CD73、CD90、 CD105，且阳性表达率均大于95％，低表达CD11b、CD19、CD34、CD45、 HLA-DR，阴性表达率均小于2％。

Claims (8)

1.一种离体乳牙保存液，其特征在于，包括以下重量份的组分：

葡萄糖0.5~1.2份、还原型谷胱甘肽0.01~0.05份、氨基酸0.1~0.5份、人血白蛋白1~5份、Ve 0~1份、海藻糖0.1~0.3份、温敏水凝胶10~20份、抗菌药物0.3~1.5份，以及磷酸盐缓冲液70~90份；

其中，所述温敏水凝胶的制备方法如下：

将聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸、丙烯酸以及交联剂混合，再加入引发剂，搅拌均匀，静置反应10~15h后，取出反应产物洗涤3~5次；其中，聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸、丙烯酸、交联剂以及引发剂的重量比为5~10:0.5~1:0.5~1:0.15~0.3:0.5~1；

所述抗菌药物包括青霉素、链霉素和两性霉素B；其中，青霉素、链霉素和两性霉素B的重量比为：0.2~0.6:0.1~0.5:0.01~0.05。

2.根据权利要求1所述的离体乳牙保存液，其特征在于，包括以下重量份的组分：

葡萄糖1份、还原型谷胱甘肽0.05份、人血白蛋白3份、氨基酸0.5份、Ve 1份、海藻糖0.2份、温敏水凝胶12份、抗菌药物0.82份，以及磷酸盐缓冲液84份。

3.根据权利要求1所述的离体乳牙保存液，其特征在于，所述聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸、丙烯酸、交联剂以及引发剂的重量比为8:1:0.6:0.15:1。

4.根据权利要求1或3所述的离体乳牙保存液，其特征在于，所述交联剂为壳聚糖。

5.根据权利要求1或3所述的离体乳牙保存液，其特征在于，所述引发剂为过硫酸铵、过硫酸钾、过氧化月桂酰或过硫酸钠。

6.根据权利要求1所述的离体乳牙保存液，其特征在于，所述青霉素、链霉素和两性霉素B的重量比为：0.5:0.3:0.02。

7.根据权利要求1或2所述的离体乳牙保存液，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液pH值为7.2~7.6。

8.权利要求1~7任一项所述的离体乳牙保存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

在无菌条件下，按配方将权利要求1中各组分混合，制备得到离体乳牙保存液。

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