SU659619A1 - Способ приготовлени питательной среды дл культивировани микроорганизмов - Google Patents

Description

I

Насто щее изобретение относитс  к мик15обиологичёским исследовани , в которых используют плотные питательные- среды, и может быть приме нено в диагностических и научных цел х.

В микробиологической практика дл  получени  плотных нитательных сред обычно используют следующие вещества: агар, силикагель, желатин, крахмал , кровь, сьшоротку крови, пектат натри , мети.падел голозу, белок и желток куриного  йца l-4j , :

Вольвшнстйб этих веществ в силу различных причйй (отсутствие универсальности непрозрачность, вы .сока  стоимость и др.) не нашли ишр кого применени .

Наиболее близким к описываемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату  вл етс  способ приготовлени  питательной среды дл  культивировани  микроорганизмов , заключающийс  в одновременом получении полиакриламидного гел  и прюпитке его питательным субстратом (получение полиакриламидного гел  ведут в присутствии питательного субстрата) с последующей стерилизацией s .

Описанный способ имеет следующие недостатки: получаемые питательные среды содержат токсические вещества/ стерилизаци  этих сред затруднена, при их приготовлении могут быть использованы не любые питательные субстраты; питательные среды етлеют кислую реакцию (рН 3,5-4), что ограничивает возможность их использовани .

С целью получени  5 нийёрсальных питательных сред, предложен способ приготовлени  питательной среды,

5 предусматривающий получение полиакриламидного гел ,  вл ющегос  основойК- среды, и последующую пропитку его питательным субстратом до или после стерилизации.

Питательные среды на полиакрил- амидной основе микробиологически инертны, пригодны дл  культивировани  различных классов микроорганиз5 мов при рН 1-14, высокопрозрачны, прочны, эластичны, имеют гладкую поверхность, стерилизуютс  без изменени  своих свойств, могут хранитьс  в течение длительного време0 ни. Предлагаемый способ приготовлени  питательной среды осуществл ют следующим образом. Дл  достижени  поставленной цели в качестве основы дл  плотных питательных сред используют пластины полиакриламидного гчэл . Дл  получени  гел  используют: тетраметилэтилдиамин, метилен бис-акриламид , акриламид, персульфат аммони , дистиллированную воду. Готов т 3 раствора : А, В, С. Приготовление раствора А:5 мл тетраметилэтилдиамина добавл ют к 995 мл дистиллированной воды. Приготовление раствора В: к 350 дистиллированной воды, подогретой до 60°С,.добавл ют 7,35 г метилен-бис-акриламида . После фильтрации через ватно-марлевый фильтр к данному , раствору добавл ют 280 г акрил , который -тщательно размешивают . Полученный раствор повторно фильтруют через ватно-марлевый фильтр и добавл ют к нему дистиллированную воду до 1000 мл. Приготовление раствора С; в 1000 мл дистиллированной воды раствор ют 1,4 г персульфсчта аммони . Растворы А и В могут хранитьс  в посуде из темного стекла при в течение мес цев. Раствор. С в таких же услови х сохран ет свою активность в течение 25-30 суток. Получение пластин полиакриламидного гел  осуществл ют .следующим образом. Из основных растворов готов т рабочую смесь путем последовательного смешивани  одного объема раств ра А, двух объемов раствора В и четырех объемов раствора С, Приготовленную таким образом рабочую смесь заливают в щель заданно толщины, например, 2,5-3 мм, обра™ зованную двум  ч стьми стеклами на подставках, площадью от 1 1 м и более и оставл ют при естественн или искусственном осзегдении на 1520 мин. За это врем  происходи . полимеризаци  рабочей смеси. После полимеризащ-1и верхнее стекло снимаю а оставшуюс  на нижнем ст.екле плас ну полиакриламидного гел  дел т на более мелкие пластины заданной форм и размеров, например, на круглые пластины диаметром 7, см„ Послед ние снимают со стекла и помещают в дистиллированную воду на 1,5-2 ч дл  отмывани  (с трехкратной смено воды) С целью использовани  пластин п лиакриламидного гел  в качестве ос дл  плотных питательных сред, отмы в дистиллированной воде пластины п питывают питательной средой. Дл  этого пластины помешают в жидкую п тательную среду, например, м сопептонный бульон, и выдерживают в 4 ней 1-1,5 час при комнатной температуре или 30 мин в термостате при 37°С, За эго врем  происходит полное насыщение пластин питательной средой (состав жидких питательнЕзК сред опреел етс  видом исследуемых микроорганизмов ) . После насыщени  пластин питательной средой заданного состава их поещают в чашки Петри, стерилизуют паром под давлением или текучим паром {режим стерилизации определ етс  составом питательной среды), засевают исследуем лми микроорганизмами. ыращивание микроорганизмов осущестл ют по Общеприн тым методикам. Пластины полиакриламидного гел  л  микрокультивировани  микроорганизмов готов т толщиной 1,5-2 мм, разрезают на блоки заданной формы и размеров, например, квадратные, площадью примерно 1 см , отмывают в дистиллированной воде, стерилизуют паром под давлением, пропитывают стерильной жидкой питательной средой и используют дл  микрокультивировани . Эффективность питательных сред, где в качестве плотной основы были использованы пластины полиакрилс1мид ного гел ,, испытывалась на музейных культурах следующих видов микроорганизмов : StaphyEococcus. aureus 209Р, Ml7, E.coBi Ki2, Sh. sonneif Sh.fEexneri, B.proteus f 1, B.proteus mirabigis , B.pyocuaneum I65j. B.cereus 8035, B. mesentericus 1027, B, subtiSis 83, B. roegatherium 654, Mycop2asma oraEi, Mycop&asma pneumoniae, Mycopfcasraa fermentans. Изучались характер роста, форма и размеры колоний, количество бТ5Омассы , выживаемость, морфологические, тинкториальные,биохимические и серологические свойства исследуемь&с микроорганизмов. С целью приготовлени  питательных сред дл  выращивани ; Staphy&ococCU .S aureus 209,Eco6i M-17,E. соб К-12, Sh.sonnei,6h.iEexneri,S.T)oteuBff i.:&. proteus mirabiEis 56f iO,Bpyocyaneum i65,B.cepeu6 8035,15. mesenteHcu5;l027, B.Siibli8Js.83,B.megatherium 654 использовалс  м со-пептонный бульон, Дл  приготовлени , питатеа ьных сред дл  выращивани  MycopSasrna ога й, MycopEasma рпецтопше, Mycop6asma ievmen tansиспользовались следующие компоненты триптический перевар сердечных мышц крупного рогатого скота с амигишм азотом 160-170 мл - 7 вес,ч., свежа  нормальна  Л9шадина  сыворотка без консерванта 2 вес,ч., све жни 25%-ный дрожжевой экстракт 1 вес,ч., пенициллин. - 500 ед на 1 мл сре.цы.

Вых ИБаемость исследуе -и х видов микроорганнзмо э изучалась путем посева 0,5 мл взвеси, содержащей 100 клеток исследуемого вида микроорганизма , вз того в фазе экспоненциального роста, на изучаемые среды с последующей инкубацией.

659619g

Каждый опыт став т в трех повторнос т  х с последующим выведением средних величин по общеприн тым методикам.

Результаты выживаемости исследуемых видов микроорганизмов представлены в табл.