CN109880124B - 耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶及其制备方法，耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶的组分按质量浓度包括：温敏性聚合物单体9w/v％‑18w/v％；生物相容性单体0.5w/v％‑1.5w/v％；掺杂剂.01w/v％‑0.05w/v％；交联剂1.5w/v％；光引发剂0.2w/v％。本发明的耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶，具有较好的稳定性、生物相容性和机械强度，能通过高压蒸汽法进行灭菌，支持细胞的贴附和扩增。本发明的耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶，采用紫外光交联制取水凝胶，制备方法简单。
Description
技术领域
本发明涉及功能高分子材料技术领域，具体涉及一种耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶及其制备方法。
背景技术
水凝胶是一种具有较高的吸水率和保水性的三维网状交联材料，其高水合性和生物相容性与细胞外基质(ECM)类似，这使得它们在组织工程、药物输送和再生医学等生物医学领域有广泛的应用，如可注射水凝胶、环境敏感水凝胶以及弹性体水凝胶。水凝胶通常可分为天然水凝胶和合成水凝胶。天然水凝胶主要由胶原蛋白、海藻酸盐(ALG)、透明质酸(HA)和壳聚糖(CS)组成，这类凝胶具有良好的生物降解性，可支持细胞的生长；合成水凝胶，如比较常见的聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)和聚丙烯酰胺(PAM)等，它们的特点在于具有优良的机械性能。在过去的几十年中，水凝胶逐渐成为常规的组织工程生物材料，它们可以由不同的原料(天然或合成材料)制备出不同的结构，如颗粒，薄膜或多孔支架，具有可变的结构和生物学特性，以满足细胞培养和组织工程中各类需求。然而水凝胶的灭菌是一件令人头疼的事情，传统用于细胞培养的水凝胶是不能通过高压蒸汽法(121.3℃,103.4KPa)进行灭菌，因为水凝胶的主要组成是水，通常比例高达70％，当水沸腾时，水凝胶网络将被破坏，因此，无法承受高温灭菌。目前用于细胞培养或动物体内实验的水凝胶传统灭菌方法一般用75％酒精浸泡或紫外线照射，但这些方法灭菌不完全，容易造成水凝胶使用的时候染菌，难以保证细胞培养过程中细胞处于无菌状态。目前已有的少数耐高温水凝胶材料，如基于N-异丙基丙烯酰胺的水凝胶在升温时收缩表现出硬塑料的特性，可耐受高温。但是，由于该材料生物相容性和力学性能欠佳，不能很好地支持贴壁细胞在材料上的贴壁、生长和扩增分化。因此，离实际应用尚有不小的差距。
发明内容
为解决上述技术问题：本发明提供一种耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶及其制备方法，以使水凝胶具有良好生物相容性、机械性能以及高温耐受性，可用于贴壁类细胞的培养。
解决上述问题的技术方案是：本发明提供一种耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶，其组分按质量浓度包括：温敏性聚合物单体9w/v％-18w/v％；生物相容性单体0.5w/v％-1.5w/v％；掺杂剂0.01w/v％-0.05w/v％；交联剂1.5w/v％；光引发剂0.2w/v％。
在本发明一实施例中，所述温敏性聚合物单体为N-异丙基丙烯酰胺。
在本发明一实施例中，所述生物相容性单体为甲基丙烯酸酯化壳聚糖。
在本发明一实施例中，所述掺杂剂为双壁氧化碳纳米管。
在本发明一实施例中，所述交联剂为N,N’-亚甲基双丙烯酰胺。
在本发明一实施例中，所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂。
本发明还提供了一种耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶的制备方法，包括以下步骤：在1mL的蒸馏水中，依次加入90-180mg的温敏性聚合物单体、5-15mg的生物相容性单体、0.1-0.5mg的掺杂剂、15mg的交联剂以及2mg的光引发剂，得到混合溶液；将所述混合溶液在温度为20℃的条件下，搅拌10分钟，形成完全透明的预聚液；将所述预聚液注入聚四氟乙烯模具中，并用表面洁净的盖玻片进行液封，然后对所述预聚液进行冰浴，使所述聚四氟乙烯模具中的所述预聚液的温度始终保持在0-4℃，之后通过紫外灯下照射所述预聚液，10-15分钟，使其形成凝胶；将所述凝胶从所述聚四氟乙烯模具中取出，转移到蒸馏水中，溶胀2-3天，期间多次更换蒸馏水，去除未反应的温敏性聚合物单体、生物相容性单体和交联剂，获得耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶。
本发明的有益效果是：本发明的耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶，将双壁氧化碳纳米管(DWCNT)以掺杂剂的形式引入了具有N-异丙基丙烯酰胺的水凝胶中，而双壁氧化碳纳米管(DWCNT)是一种由石墨片层卷曲形成的力学性能优异的二维材料，在很大程度上提高了水凝胶材料的力学性能和表面粗糙度。N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)是温敏性聚合物聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)的单体，赋予材料高温耐受性。甲基丙烯酸酯化壳聚糖(CSMA)是天然高分子壳聚糖(CS)的衍生物，其具有良好的生物相容性和水溶性，其表面带有正电荷，对细胞贴附有促进作用。双壁氧化碳纳米管(DWCNT)是由多个不同直径的单壁氧化碳纳米管同轴套构而成的一类材料(单臂氧化碳纳米管：由单层氧化石墨烯卷成的柱状无缝管)，其表面被氧化含有大量羧基，在水相中具有比较好的分散性。少量双壁碳纳米管的掺入可以提高水凝胶机械性能、表面粗糙度以及疏水性。制备后的水凝胶具有较好的稳定性、生物相容性和机械强度，能通过高压蒸汽法进行灭菌，支持细胞的贴附和扩增。本发明的耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶，采用紫外光交联制取水凝胶，制备方法简单。
附图说明
下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步说明。
图1为实施例1中水凝胶上的L929细胞贴附形态的荧光染色图(37℃)。
图2为实施例1中水凝胶上的L929细胞贴附率和扩增倍数。
图3为实施例2中水凝胶上的L929细胞贴附形态的荧光染色图(37℃)。
图4为实施例2中水凝胶上的L929细胞贴附率和扩增倍数。
图5为实施例3中水凝胶上的L929细胞贴附形态的荧光染色图(37℃)。
图6为实施例3中水凝胶上的L929细胞贴附率和扩增倍数。
图7为实施例4中水凝胶上的L929细胞贴附形态的荧光染色图(37℃)。
图8为实施例4中水凝胶上的L929细胞贴附率和扩增倍数。
图9为实施例5中水凝胶上的L929细胞贴附形态的荧光染色图(37℃)。
图10为实施例5中水凝胶上的L929细胞贴附率和扩增倍数。
图11为实施例6中水凝胶上的L929细胞贴附形态的荧光染色图(37℃)。
图12为实施例6中水凝胶上的L929细胞贴附率和扩增倍数。
图13为实施例7中水凝胶上的L929细胞分别在医用酒精灭菌、一次高温灭菌和连续三次高温灭菌后的贴附率示意图。
图14为实施例7中水凝胶上的L929细胞分别在医用酒精灭菌、一次高温灭菌和连续三次高温灭菌后的扩增倍数示意图。
图15为商业细胞培养板、商业微载体以及实施例7中的水凝胶上的L929细胞的贴壁率示意图。
图16为商业细胞培养板、商业微载体以及实施例7中的水凝胶上的L929细胞的扩增倍数示意图。
具体实施方式
以下实施例用以例示本发明可用以实施的特定实施例，用以说明及理解本发明，而非用以限制本发明。
本发明的耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶，其组分按质量浓度包括：温敏性聚合物单体9w/v％-18w/v％；生物相容性单体0.5w/v％-1.5w/v％；掺杂剂0.01w/v％-0.05w/v％；交联剂1.5w/v％；光引发剂0.2w/v％。其中，所述温敏性聚合物单体为N-异丙基丙烯酰胺。所述生物相容性单体为甲基丙烯酸酯化壳聚糖。所述掺杂剂为双壁氧化碳纳米管。所述交联剂为N,N’-亚甲基双丙烯酰胺。所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂。
本发明还提供了一种耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶的制备方法，包括以下步骤：在1mL的蒸馏水中，依次加入90-180mg的温敏性聚合物单体、5-15mg的生物相容性单体、0.1-0.5mg的掺杂剂、15mg的交联剂以及2mg的光引发剂，得到混合溶液；将所述混合溶液在温度为20℃的条件下，搅拌10分钟，形成完全透明的预聚液；将所述预聚液注入聚四氟乙烯模具中，并用表面洁净的盖玻片进行液封，然后对所述预聚液进行冰浴，使所述聚四氟乙烯模具中的所述预聚液的温度始终保持在0-4℃，之后通过紫外灯下照射所述预聚液10-15分钟，紫外灯的功率为8mW/cm2，使其形成凝胶；将所述凝胶从所述聚四氟乙烯模具中取出，转移到蒸馏水中，溶胀2-3天，期间至少一次更换蒸馏水，去除未反应的温敏性聚合物单体、生物相容性单体和交联剂，获得耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶。
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释。
实施例1
本实施例的耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶，其组分按质量浓度包括：温N-异丙基丙烯酰胺9w/v％；甲基丙烯酸酯化壳聚糖1w/v％；双壁氧化碳纳米管0.03w/v％；N,N’-亚甲基双丙烯酰胺1.5w/v％；苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂0.2w/v％。
本实施例的耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶的制备方法，包括以下步骤：在1mL的蒸馏水中，依次加入90mg的N-异丙基丙烯酰胺、10mg的甲基丙烯酸酯化壳聚糖、0.3mg的双壁氧化碳纳米管、15mg的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺以及2mg的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂，得到混合溶液；将所述混合溶液在温度为20℃的条件下，搅拌10分钟，形成完全透明的预聚液；将所述预聚液注入聚四氟乙烯模具中，并用表面洁净的盖玻片进行液封，然后对所述预聚液进行冰浴，使所述聚四氟乙烯模具中的所述预聚液的温度始终保持在0-4℃，之后通过紫外灯下照射所述预聚液10-15分钟，紫外灯的功率为8mW/cm2，使其形成凝胶；将所述凝胶从所述聚四氟乙烯模具中取出，转移到蒸馏水中，溶胀2-3天，期间至少一次更换蒸馏水，去除未反应的N-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯化壳聚糖和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，获得耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶。
将实施例1制取的水凝胶用于培养L929细胞
将制备的水凝胶用75％的医用酒精浸泡6h充分灭菌，再用无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)润洗3次；然后将其转移到37℃的基础培养基(DMEM)中溶胀12h，将溶胀后的水凝胶置于48孔细胞培养板中的培养孔底部。
将L929细胞以2.5×104细胞/厘米2的密度接种到铺有所述水凝胶材料的48孔细胞培养板中，再加入500μL含血清的基础培养基〔DMEM+10％胎牛血清(v/v)〕,置于含质量浓度为5％的二氧化碳且温度为37℃的培养箱中培养三天，在培养的第二天更换基础培养基〔DMEM+10％胎牛血清(v/v)〕。L929细胞接种12h后的贴壁率和培养第三天时的细胞扩增倍数如图1所示。培养到第三天时，在所述水凝胶材料上贴附的、荧光染色的细胞形态参见图2所示(标尺＝100μm)。
实施例2
本实施例的耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶，其组分按质量浓度包括：温N-异丙基丙烯酰胺9w/v％；甲基丙烯酸酯化壳聚糖1.5w/v％；双壁氧化碳纳米管0.05w/v％；N,N’-亚甲基双丙烯酰胺1.5w/v％；苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂0.2w/v％。
本实施例的耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶的制备方法，包括以下步骤：在1mL的蒸馏水中，依次加入90mg的N-异丙基丙烯酰胺、15mg的甲基丙烯酸酯化壳聚糖、0.5mg的双壁氧化碳纳米管、15mg的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺以及2mg的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂，得到混合溶液；将所述混合溶液在温度为20℃的条件下，搅拌10分钟，形成完全透明的预聚液；将所述预聚液注入聚四氟乙烯模具中，并用表面洁净的盖玻片进行液封，然后对所述预聚液进行冰浴，使所述聚四氟乙烯模具中的所述预聚液的温度始终保持在0-4℃，之后通过紫外灯下照射所述预聚液10-15分钟，紫外灯的功率为8mW/cm2，使其形成凝胶；将所述凝胶从所述聚四氟乙烯模具中取出，转移到蒸馏水中，溶胀2-3天，期间至少一次更换蒸馏水，去除未反应的N-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯化壳聚糖和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，获得耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶。
将实施例2制取的水凝胶用于培养L929细胞
将制备的水凝胶用75％的医用酒精浸泡6h充分灭菌，再用无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)润洗3次；然后将其转移到37℃的基础培养基(DMEM)中溶胀12h，将溶胀后的水凝胶置于48孔细胞培养板中的培养孔底部。
将L929细胞以2.5×104细胞/厘米2的密度接种到铺有所述水凝胶材料的48孔细胞培养板中，再加入500μL含血清的基础培养基〔DMEM+10％胎牛血清(v/v)〕,置于含质量浓度为5％的二氧化碳且温度为37℃的培养箱中培养三天，在培养的第二天更换基础培养基〔DMEM+10％胎牛血清(v/v)〕。L929细胞接种12h后的贴壁率和培养第三天时的细胞扩增倍数如图3所示。培养到第三天时，在所述水凝胶材料上贴附的、荧光染色的细胞形态参见图4所示(标尺＝100μm)。
实施例3
本实施例的耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶，其组分按质量浓度包括：温N-异丙基丙烯酰胺13.5w/v％；甲基丙烯酸酯化壳聚糖0.5w/v％；双壁氧化碳纳米管0.03w/v％；N,N’-亚甲基双丙烯酰胺1.5w/v％；苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂0.2w/v％。
本实施例的耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶的制备方法，包括以下步骤：在1mL的蒸馏水中，依次加入135mg的N-异丙基丙烯酰胺、5mg的甲基丙烯酸酯化壳聚糖、0.3mg的双壁氧化碳纳米管、15mg的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺以及2mg的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂，得到混合溶液；将所述混合溶液在温度为20℃的条件下，搅拌10分钟，形成完全透明的预聚液；将所述预聚液注入聚四氟乙烯模具中，并用表面洁净的盖玻片进行液封，然后对所述预聚液进行冰浴，使所述聚四氟乙烯模具中的所述预聚液的温度始终保持在0-4℃，之后通过紫外灯下照射所述预聚液10-15分钟，紫外灯的功率为8mW/cm2，使其形成凝胶；将所述凝胶从所述聚四氟乙烯模具中取出，转移到蒸馏水中，溶胀2-3天，期间至少一次更换蒸馏水，去除未反应的N-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯化壳聚糖和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，获得耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶。
将实施例3制取的水凝胶用于培养L929细胞
将制备的水凝胶用75％的医用酒精浸泡6h充分灭菌，再用无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)润洗3次；然后将其转移到37℃的基础培养基(DMEM)中溶胀12h，将溶胀后的水凝胶置于48孔细胞培养板中的培养孔底部。
将L929细胞以2.5×104细胞/厘米2的密度接种到铺有所述水凝胶材料的48孔细胞培养板中，再加入500μL含血清的基础培养基〔DMEM+10％胎牛血清(v/v)〕,置于含质量浓度为5％的二氧化碳且温度为37℃的培养箱中培养三天，在培养的第二天更换基础培养基〔DMEM+10％胎牛血清(v/v)〕。L929细胞接种12h后的贴壁率和培养第三天时的细胞扩增倍数如图5所示。培养到第三天时，在所述水凝胶材料上贴附的、荧光染色的细胞形态参见图6所示(标尺＝100μm)。
实施例4
本实施例的耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶，其组分按质量浓度包括：温N-异丙基丙烯酰胺13.5w/v％；甲基丙烯酸酯化壳聚糖1.5w/v％；双壁氧化碳纳米管0.01w/v％；N,N’-亚甲基双丙烯酰胺1.5w/v％；苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂0.2w/v％。
本实施例的耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶的制备方法，包括以下步骤：在1mL的蒸馏水中，依次加入135mg的N-异丙基丙烯酰胺、15mg的甲基丙烯酸酯化壳聚糖、0.1mg的双壁氧化碳纳米管、15mg的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺以及2mg的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂，得到混合溶液；将所述混合溶液在温度为20℃的条件下，搅拌10分钟，形成完全透明的预聚液；将所述预聚液注入聚四氟乙烯模具中，并用表面洁净的盖玻片进行液封，然后对所述预聚液进行冰浴，使所述聚四氟乙烯模具中的所述预聚液的温度始终保持在0-4℃，之后通过紫外灯下照射所述预聚液10-15分钟，紫外灯的功率为8mW/cm2，使其形成凝胶；将所述凝胶从所述聚四氟乙烯模具中取出，转移到蒸馏水中，溶胀2-3天，期间至少一次更换蒸馏水，去除未反应的N-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯化壳聚糖和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，获得耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶。
将实施例4制取的水凝胶用于培养L929细胞
将制备的水凝胶用75％的医用酒精浸泡6h充分灭菌，再用无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)润洗3次；然后将其转移到37℃的基础培养基(DMEM)中溶胀12h，将溶胀后的水凝胶置于48孔细胞培养板中的培养孔底部。
将L929细胞以2.5×104细胞/厘米2的密度接种到铺有所述水凝胶材料的48孔细胞培养板中，再加入500μL含血清的基础培养基〔DMEM+10％胎牛血清(v/v)〕,置于含质量浓度为5％的二氧化碳且温度为37℃的培养箱中培养三天，在培养的第二天更换基础培养基〔DMEM+10％胎牛血清(v/v)〕。L929细胞接种12h后的贴壁率和培养第三天时的细胞扩增倍数如图7所示。培养到第三天时，在所述水凝胶材料上贴附的、荧光染色的细胞形态参见图8所示(标尺＝100μm)。
实施例5
本实施例的耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶，其组分按质量浓度包括：温N-异丙基丙烯酰胺18w/v％；甲基丙烯酸酯化壳聚糖0.5w/v％；双壁氧化碳纳米管0.05w/v％；N,N’-亚甲基双丙烯酰胺1.5w/v％；苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂0.2w/v％。
本实施例的耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶的制备方法，包括以下步骤：在1mL的蒸馏水中，依次加入180mg的N-异丙基丙烯酰胺、5mg的甲基丙烯酸酯化壳聚糖、0.5mg的双壁氧化碳纳米管、15mg的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺以及2mg的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂，得到混合溶液；将所述混合溶液在温度为20℃的条件下，搅拌10分钟，形成完全透明的预聚液；将所述预聚液注入聚四氟乙烯模具中，并用表面洁净的盖玻片进行液封，然后对所述预聚液进行冰浴，使所述聚四氟乙烯模具中的所述预聚液的温度始终保持在0-4℃，之后通过紫外灯下照射所述预聚液10-15分钟，紫外灯的功率为8mW/cm2，使其形成凝胶；将所述凝胶从所述聚四氟乙烯模具中取出，转移到蒸馏水中，溶胀2-3天，期间至少一次更换蒸馏水，去除未反应的N-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯化壳聚糖和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，获得耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶。
将实施例5制取的水凝胶用于培养L929细胞
将制备的水凝胶用75％的医用酒精浸泡6h充分灭菌，再用无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)润洗3次；然后将其转移到37℃的基础培养基(DMEM)中溶胀12h，将溶胀后的水凝胶置于48孔细胞培养板中的培养孔底部。
将L929细胞以2.5×104细胞/厘米2的密度接种到铺有所述水凝胶材料的48孔细胞培养板中，再加入500μL含血清的基础培养基〔DMEM+10％胎牛血清(v/v)〕,置于含质量浓度为5％的二氧化碳且温度为37℃的培养箱中培养三天，在培养的第二天更换基础培养基〔DMEM+10％胎牛血清(v/v)〕。L929细胞接种12h后的贴壁率和培养第三天时的细胞扩增倍数如图9所示。培养到第三天时，在所述水凝胶材料上贴附的、荧光染色的细胞形态参见图10所示(标尺＝100μm)。
实施例6
本实施例的耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶，其组分按质量浓度包括：温N-异丙基丙烯酰胺18w/v％；甲基丙烯酸酯化壳聚糖1w/v％；双壁氧化碳纳米管0.01w/v％；N,N’-亚甲基双丙烯酰胺1.5w/v％；苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂0.2w/v％。
本实施例的耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶的制备方法，包括以下步骤：在1mL的蒸馏水中，依次加入180mg的N-异丙基丙烯酰胺、10mg的甲基丙烯酸酯化壳聚糖、0.1mg的双壁氧化碳纳米管、15mg的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺以及2mg的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂，得到混合溶液；将所述混合溶液在温度为20℃的条件下，搅拌10分钟，形成完全透明的预聚液；将所述预聚液注入聚四氟乙烯模具中，并用表面洁净的盖玻片进行液封，然后对所述预聚液进行冰浴，使所述聚四氟乙烯模具中的所述预聚液的温度始终保持在0-4℃，之后通过紫外灯下照射所述预聚液10-15分钟，紫外灯的功率为8mW/cm2，使其形成凝胶；将所述凝胶从所述聚四氟乙烯模具中取出，转移到蒸馏水中，溶胀2-3天，期间至少一次更换蒸馏水，去除未反应的N-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯化壳聚糖和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，获得耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶。
将实施例6制取的水凝胶用于培养L929细胞
将制备的水凝胶用75％的医用酒精浸泡6h充分灭菌，再用无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)润洗3次；然后将其转移到37℃的基础培养基(DMEM)中溶胀12h，将溶胀后的水凝胶置于48孔细胞培养板中的培养孔底部。
将L929细胞以2.5×104细胞/厘米2的密度接种到铺有所述水凝胶材料的48孔细胞培养板中，再加入500μL含血清的基础培养基〔DMEM+10％胎牛血清(v/v)〕,置于含质量浓度为5％的二氧化碳且温度为37℃的培养箱中培养三天，在培养的第二天更换基础培养基〔DMEM+10％胎牛血清(v/v)〕。L929细胞接种12h后的贴壁率和培养第三天时的细胞扩增倍数如图11所示。培养到第三天时，在所述水凝胶材料上贴附的、荧光染色的细胞形态参见图12所示(标尺＝100μm)。
实施例7
本实施例的耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶，其组分按质量浓度包括：温N-异丙基丙烯酰胺13.5w/v％；甲基丙烯酸酯化壳聚糖1w/v％；双壁氧化碳纳米管0.05w/v％；N,N’-亚甲基双丙烯酰胺1.5w/v％；苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂0.2w/v％。
本实施例的耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶的制备方法，包括以下步骤：在1mL的蒸馏水中，依次加入135mg的N-异丙基丙烯酰胺、10mg的甲基丙烯酸酯化壳聚糖、0.5mg的双壁氧化碳纳米管、15mg的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺以及2mg的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂，得到混合溶液；将所述混合溶液在温度为20℃的条件下，搅拌10分钟，形成完全透明的预聚液；将所述预聚液注入聚四氟乙烯模具中，并用表面洁净的盖玻片进行液封，然后对所述预聚液进行冰浴，使所述聚四氟乙烯模具中的所述预聚液的温度始终保持在0-4℃，之后通过紫外灯下照射所述预聚液10-15分钟，紫外灯的功率为8mW/cm2，使其形成凝胶；将所述凝胶从所述聚四氟乙烯模具中取出，转移到蒸馏水中，溶胀2-3天，期间至少一次更换蒸馏水，去除未反应的N-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯化壳聚糖和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，获得耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶。
将实施例7制取的水凝胶用于培养L929细胞
将制备的水凝胶分别用75％医用酒精灭菌(浸泡6h),再进行一次高温灭菌(121℃，持续30min)和连续三次高温灭菌后，用无菌的磷酸盐缓冲液(PBS)润洗3次；然后将所述水凝胶转移到37℃的基础培养基(DMEM)中溶胀12h，将溶胀后的水凝胶转移到48孔细胞培养板中的培养孔底部。
将L929细胞以2.5×104细胞/厘米2的密度接种到经过酒精灭菌和高温灭菌后的所述水凝胶上，加入500μL含血清的基础培养基〔DMEM+10％胎牛血清(v/v)〕，置于含质量浓度为5％的二氧化碳且温度为37℃的培养箱中培养三天，在培养的第二天更换基础培养基〔DMEM+10％胎牛血清(v/v)〕。L929细胞接种12h后的贴壁率和培养三天后的细胞扩增倍数如图13、图14所示。将L929细胞以2.5×104细胞/厘米2的密度分别接种到商业细胞培养板(TCPS)、商业微载体以及该可高温灭菌水凝胶材料上，加入500μL含血清的基础培养基〔DMEM+10％胎牛血清(v/v)〕，置于含5％二氧化碳的37℃培养箱中培养三天，在培养的第二天更换培养基。L929细胞接种12h后的贴壁率和培养三天后的细胞扩增倍数如图15、图16所示。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶，其特征在于，其组分按质量浓度包括：
所述温敏性聚合物单体为N-异丙基丙烯酰胺；
所述生物相容性单体为甲基丙烯酸酯化壳聚糖；
所述掺杂剂为双壁氧化碳纳米管；
所述交联剂为N,N’-亚甲基双丙烯酰胺；
所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂。
2.一种耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
在1mL的蒸馏水中，依次加入90-180mg的温敏性聚合物单体、5-15mg的生物相容性单体、0.1-0.5mg的掺杂剂、15mg的交联剂以及2mg的光引发剂，得到混合溶液；
将所述混合溶液在温度为20℃的条件下，搅拌10分钟，形成完全透明的预聚液；
将所述预聚液注入聚四氟乙烯模具中，并用表面洁净的盖玻片进行液封，然后对所述预聚液进行冰浴，使所述聚四氟乙烯模具中的所述预聚液的温度始终保持在0-4℃，之后通过紫外灯下照射所述预聚液10-15分钟，使其形成凝胶；
将所述凝胶从所述聚四氟乙烯模具中取出，转移到蒸馏水中，溶胀2-3天，期间多次更换蒸馏水，去除未反应的温敏性聚合物单体、生物相容性单体和交联剂，获得耐高温灭菌的细胞培养用水凝胶；
所述温敏性聚合物单体为N-异丙基丙烯酰胺；
所述生物相容性单体为甲基丙烯酸酯化壳聚糖；
所述掺杂剂为双壁氧化碳纳米管；
所述交联剂为N,N’-亚甲基双丙烯酰胺；
所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂。
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