JPH01503274A - 微生物を培養するための濃栄養培地の調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 微生物を培養するための濃栄養培地の調整方法技術分野 本発明は、医学の分野及びより詳しくは異なったタイプの微生物を培養するため の合成ゲルに基づ←濃栄養培地の調製方法に関する。

従来技術 ポリアクリルアミドゲルの形成まで、それぞれ０．５〜４０．０：２．５〜１２ ．０の質量比での生理学的塩溶液中におけるアクリルアミド及びＮ　、　Ｎ　’ 　−メチレン−ビス−アクリルアミドのラジカル共重合を通して医学的及び生物 学的目的のための濃栄養培地を調製するための方法は、当業界において既知であ る。

最大量の水を含むこのようにして得られたゲルが生理学的塩溶液により洗浄され 、そして栄養基質により含浸される（ＵＳ。

Ａ、　９７７４６６）。

この調製された濃栄養培地は、微生物の生物学的性質を研究するために使用され る。しかしながら、そのような濃栄養培地は、殺菌、微生物の接種及び細菌用ル ープによるコロニーの除去の間、表面層の損傷に対する高い敏感性により特徴づ けられる。くり返えされる接種の間の微生物の除去は、生理学的塩溶液による洗 浄により行なわれ、そしてこの方法は、大多数の微生物学的操作に採用されない 。

アクリルアミド及びＮ、Ｎｌ　−メチレン−ビス−アクリルアミドのラジカル共 重合が、ポリアクリルアミドゲルの形成のためにそれぞれ１５〜２０：　０．０ １９〜０．１３２の質量比で生理学的塩溶液中において行なわれる、微生物を培 養するための濃栄養培地を調製するための方法もまた当業界において既知である 。このようにして得られたゲルは生理的塩溶液により洗浄され、そして５０〜６ ０℃で１６〜２０時間、生理的塩溶液中で膨潤される。次に、そのポリアクリル アミドゲルは、栄養基質により含浸される（ＤＨ，Ａ、　３４３０３１６．２） 。

その得られた濃栄養培地は、微生物を培養するために使用される。その培地は、 弾性で透明なものであり、そして高い粘着性質を有する。微生物の培養物は、そ の培地中には増殖しないで培地の表面上に位置し、そして細菌用ループにより完 全に除去される。しかしながら、液体の滲出が、ペトリ皿にそれを保持し、そし てインキュベートする間、この濃栄養培地の表面上に観察され、その滲出は、イ ンキュベーター中における長い乾燥においてさえ観察される。この他に、いくつ かのタイプ、特に不安定形の微生物は、特定の形態学的、生化学的、及び抗原性 質を示しながら、上記培地上で典型的なコロニーの増殖を付与しない。これは、 たとえば感染性疾病の診断のために、上記栄養培地の適用性を制限する。

発明の開示 本発明の重要目的は、典型的な生物学的特性を有する広範囲の微生物の増殖を確 保することができる、ポリアクリルアミドゲルの追加の構成のために試薬を導入 することによりそのような濃栄養培地を調製するだめの方法を提供することであ る。

前記目的は、微生物を培養するための濃栄養培地を調製する方法により達成され 、そして該方法は、ゲルの形成のために生理学的塩溶液中において（１５〜２０ ）　：（０，０１９〜０．１３２）の質量比でのアクリルアミド及びＮ　、　Ｎ 　＃　−メチレン−ビス−アクリルアミドのラジカル共重合、生理学的塩溶液中 での前記ゲルの洗浄及び膨潤、栄養基質による含浸を包含し、そして本発明によ れば、ラジカル共重合は、ポリビニルアルコールの存在下で１５〜２０：１．Ｏ 〜３．０の質量比でのアクリルアミド及びポリビニルアルコールにより行なわれ る。ポリビニルアルコールは、水溶液として使用され得る。

効果的に発明を実施するための最良の手段０．８〜０．９質量％の塩化ナトリウ ムを含む生理学的塩溶液中におけるＮ　、　Ｎ　’−メチレンービスーアクリル アミド、開始剤及びポリビニルアルコールの溶液力１周製される。開始剤として 、Ｎ　、　Ｎｌ−テトラメチレンジアミン及び過硫酸アンモニウムが使用される 。

（１５〜２０）：嬌（０，０１９〜０．１３２）　：　（１，０〜３０）の質量 比でアクリルアミド、Ｎ　、　Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミド及びポリ ビニルアルコールを含む反応混合物が溶液から調製される。その反応混合物は、 反応器に通用され、そしてラジカル共重合がディスク形でのポリアクリルアミド ゲルの形成のために行なわれる。高い湿分を有するゲルシステムは、ひじょうに 不安定であることが知られている。ゲル調製の間に達成されたポリマー液相の平 衡は、種々の因子、たとえば温度及び湿度の効果下で妨害される。従って、その 調製の間、ゲルの追加の構成をもたらすことによって得られるポリアクリルアミ ドゲルを安定化することが必要である。このためには、ポリビニルアルコールが 、好ましくは反応混合物の塊状物内の良好な分布のために水溶液の形で、反応混 合物中に導入される。水又は生理学的塩溶液中、ポリビニルアルコールの溶液は 、構成された液体である。

共重合及びゲル形成の間、侵入性ポリマー網状構造が形成され、これはゲルシス テムを安定化し、そしてその親水性特性を保持し、そして特に重要である。

ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）の量は、時間と共に基質の安定性及びそのよう な基質上に調製される培地上で増殖される不安定形の微生物の典型的なコロニー 形成の保持により指図される。少量のＰＶＡの導入は、十分に基質を安定化しな い。多量のＰＶＡの導入は、所望されない基質の透明度の損失をもたらす。たと えば、反応混合物中における１ｇ以下のＰＶＡ０量は、基質を安定化せず、そし て３７°Ｃでのインキュベーションの後、基質の表面上での液体の滲出が観察さ れ、そして不安定形の微生物が典型的なコロニーの増殖を付与せず、そしてすべ ての他の性質が保持される。

反応混合物における３ｇ以上のＰＶＡ０量は、基質を安定化するが、しかし所望 しないひじょうに濃い基質を付与する。

そのような基質上に調製される濃い栄養培地の表面はひじょうに乾燥し、そして 接種のための生物学的ループにより損傷を受ける。そのような培地上で増殖され る微生物は、非典型的な増殖により特徴化され、そして培地の表面から容易に除 去されない。

調製されたゲルは、濃栄養培地を調製するための基質として使用される。このた めには、そのゲルディスクは生理学的塩溶液により洗浄され、そして質量で３． ５〜５倍に膨潤される。そのような手段で処理されたポリアクリルアミドゲルは 栄養基質により含浸される。基質としてＨｏｔｔｉｎｇｅｒのトリプシン消化物 、肉−ペプトンブイヨン及び同様のものを使用することができる。次に、栄養培 地は消毒され、乾燥せしめられ、そして試験微生物により接種される。

その調製された濃栄養培地は、安定した構造及び高い付着特性、弾性及び好適な 透明度を有し；それは種々のタイプ、特に不安定形の培養性質の微生物の安定効 果を確保する。

本発明をより理解するために１．特定の例が例示的手段により下記に与えられる 。

例　１ ゲルを調製するために、０．８５質量％の塩化ナトリウムを含む生理的塩溶液中 、４種の溶液Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを、次の方法により調製する（成分の量は、溶液 １０００ｄに対して計算される）。

１、溶液Ａの調製。

Ｎ　、　Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤ）　５ｄを、生理的塩 溶液９９５ｄ中に溶解する。

２．　ン容液Ｂの８周製。

Ｎ　、　Ｎ　ｒ−メチレン−ビス−アクリルアミド（門ＢＡ）　０．７４２ｇを 、生理的塩溶液５００滅中に溶解し、６０°Ｃに加熱し、そしてアクリルアミド （ＡＡ）４７０ｇを、完全に溶解するまで撹拌しながら添加する。その得られた 溶液を濾過し、そして生理的塩溶液により１０００ｄにする。

３、　溶液Ｃの調製。

過硫酸アンモニウム１．７８ｇを、生理的塩溶液１０００ｄ中に溶解する。

４、溶液りの調製。

ポリビニルアルコール１００ｇを、生理的塩溶液９００ｄ中に溶解する。

反応混合物を、上記溶液から調製する。これに、最終溶液Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを、 次の体積比で混合する：Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄ＝１６：３２：５２：１０゜ 反応混合物におけるアクリルアミド：ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）の比は、 １５：１である。反応混合物を、ラジカル共重合が起こる反応器に供給し、ディ スク型のゲルを得る。６０分でゲルを取り出し、生理的塩溶液により１時間洗浄 し、そして次に、質量で３．５倍に膨潤せしめる。

調製されたゲルを、濃栄養培地を得るために基質として使用する。そのディスク を液体栄養基質（肉−ペプトンブイヨン）中に置き、そして５６°Ｃで２〜３時 間保持する。その得られた栄養培地を１２０°Ｃで３０分間、蒸気により消毒し 、そして３７°Ｃでインキュベーター中において乾燥せしめた後、試験微生物を 接種する。

濃栄養培地は、憂い付着性質、弾性、密度、透明度を有し、そして微生物の接種 のための細菌用ループにより損傷を受けない。

肉−ペプトンブイヨンは、液体栄養基質として使用され、そしてゴールデンスタ フィロコーカス（ｇｏｌｄｅｎ　５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）は試験微生物 として作用する。培養物が３７°Ｃで１日間インキュベートされた後、均等の縁 を有する金色の典型的な丸型コロニーが増殖する。顕微鏡調査により、培養物が 典型的であることを確信する。

その濃栄養培地上には、液体の滲出は観察されない。培養物は、細菌用ループを 用いることによって完全に除去される。

例２ 反応混合物を得るために、例１に記載されるようにして調製された溶液Ａ、Ｂ、 Ｃ及びＤを用いる。それらの溶液を、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄの体積比１６　：　３２　 ：　５２　：　２０で混合し、そして重合のために反応器中に注ぐ。その反応混 合物は、１５：２．０の質量比でアクリルアミド及びＰＶＡを含む。１時間で、 ゲルのプレートを、質量で５倍に増加するまで、例１に記載される方法に従って 処理する。

その調製されたゲルを、例１に記載される方法に類似して栄養基質により含浸す る。Ｈｏｔｔｉｎｇｅｒのトリプシン消化物が、アミン窒素２００ｇを含む栄養 基質として使用され、そしてバシラスピオシアネウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｈ ｏｃｙａｎｅｕｓ）が試験微生物として作用する。３７゛Ｃでのインキュベーシ ョンの後、丸型平面の粘性のコロニーが、典型的な青緑色の溶解性色素の形成を 伴って増殖せしめられる。濃栄養培地の表面上には、液体の滲出は観察されない 。その培養物は培地中には増殖せず、そして細菌用ループにより完全に除去され る。

例３ 例１に記載される方法に従って調製された溶液Ａ、Ｃ及びＤを用いる。溶液Ｂを 調製するために、Ｎ　、　Ｎ　’−メチレンービスーアクリルアミド０．５９４ 　ｇを、０．８５質量％塩化ナトリウムを含む生理的塩溶液５００ｍ１に溶解し 、アクリルアミド４７０ｇを添加し、そしてその体積を、上記濃度の生理学的塩 溶液により１０００戚にする。

Ａ：Ｂ：ＣＯＤの体積比が１６　：　３２　：　５２　：　３０の反応混合物を 調製するために溶液Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを用い、そして共重合を反応器中に行なう 。その反応混合物は、アクリルアミド及びポリビニルアルコールを１５：３．０ の質量比で含む。その調製されたゲルを、質量で５倍に増加するまで例１に記載 される方法に従って処理する。

その調製されたゲルを、例１に記載されるようにして栄養基質により含浸する。

アミン窒素２００■を含むＨｏｔｔｉｎｇｅｒの消化物を、基質として使用する 。線毛形細菌Ｅ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）０５５が、試験微生物として作用する。

３７°Ｃで１日間のインキュベーションの後、その培養物は、均質の縁を有する 滑らかな弱い凸状の明るいコロニーの形で増殖せしめられる。形態学的及び凝集 特性の研究は、その培養物が典型的であることを確証する。培地の表面上には、 液体の滲出は観察されない。

比較のために、Ｅ、コリ０５５の培養物を、ＤＨ，Ａ、　３４３０３１６に記載 されるようにして調製された濃栄養培地上に接種する。

３７゛Ｃで１日間の培養の後、その培養物は、不均等な平らなコロニーの形で増 殖せしめられる。濃栄養培地の個々の部位上には、液体の滲出は観察されない。

例４ ポリビニルアルコール２．４ｇを、水２５０ｄ中に溶解する。

その得られた溶液を、０．９質量％の塩化ナトリウムを含む生理的塩溶液４７０ 　ｍｌ中にＭＢＡ　０．２５ｇ、ＴＭＥＤ　０．２５ｍｊｉ及びアクリルアミド １５９ｇを含む溶液に添加する。その溶液の混合物を、上記濃度の生理学的塩溶 液１６０威中に過硫酸アンモニウム０．３５ｇを含む溶液に添加し、そして重合 のために反応器中に置く。

その反応混合物は、２０：３の質量比でＡＡ及びＰＶＡを含む。１時間で、ゲル プレートを除き、生理的塩溶液により洗浄し、そして生理学的塩溶液中で４倍の 質量の増加まで膨潤せしめる。

このようにして調製されたゲルを、例１に記載される方法に従って、栄養基質に より含浸する。アミン窒素２００■を含むＨｏｔｔｉｎｇｅｒの消化物を、基質 として使用する。サルモネラチピムリアム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ ｍｕｒｉｕｍ）が試験微生物として作用する。３７°Ｃでのインキュベーション の後、均等の縁を有する滑らかな弱い凸状のコロニーが増殖する。形態学的、糖 分解性及び凝集特性は、その培養物が典型的であることを確証する。

例５ ポリビニルアルコール０．８ｇを、水２５Ｏｄ中に溶解する。

その溶液を、０．８質量％の塩化ナトリウムを含む生理的塩溶液４１０ｒｎｌ中 にＭＢＡ　Ｏ，２５ｇ、Ｔ？ｌＥＤ　０．２５ｇ及びアクリルアミド１５９ｇを 含む溶液に添加する。その得られた混合物を、生理学的塩溶液１６０＋＋４！中 に過硫酸アンモニウム０．３５　ｇを含む溶液に添加し、そして重合のために反 応器中に往く。

その反応混合物は、２０：１．Ｏの質量比でアクリルアミド及びポリビニルアル コールを含む。１時間で、そのゲルプレートを生理学的塩溶液により洗浄し、そ して生理学的塩溶液中において５．５倍の増加まで膨潤せしめる。

その得られたゲルを、例１に記載される方法に従って、栄養基質により飽和せし める。アミン窒素２００ｍｇ及びグルコース２％を含む）Ｉｏｔｔｉｎｇｅｒの 消化物を、基質として使用する。

ストレブトコーカスピオゲン（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ ）が、典型的なコロニーとして増殖する試験培養物として作用する。

例６ 例１に記載されるようにして調製された溶液Ａ、Ｃ及びＤを用いる。溶液Ｂを調 製するために、Ｎ、Ｎｌ　−メチレン−ビス−アクリルアミド４．１２５ｇを、 ０．９質量％の塩化ナトリウムを含む生理学的塩溶！　５００戚中に溶解する。

次に、アクリルアミド４７０ｇを添加し、そしてその体積を、上記濃度の生理学 的塩溶液により１０００ｍ［！にする。これらのすべての溶液から、混合物を調 製しくＡ　：　Ｂ　：　Ｃ：　Ｄ＝１６：３２：５２：１５）、そして共重合を 反応器中で行なう。その反応混合物においては、アクリルアミド：　Ｎ　、　Ｎ ′　−メチレン−ビス−アクリルアミドの質量比が１５　：　０．１３２であり 、そしてアクリルアミド：ポリビニルアルコールの質量比が１５：１．５である 。

その得られたゲルを、例１に記載される方法に従って処理し、そしてそのゲルの 質量を３．５倍に高める。そのゲルを、例１に記載されるようにして栄養基質に より飽和せしめる。

肉−ペプトンブイヨンを基質として用いる。シゲラフレクスネリ（Ｓｈｇｅｌｌ ａ　ｆｌｅｘｎｅｒｉ）培養物が試験微生物として作用する。

３７°Ｃで１日のインキュベーションの後、その培養物は、均質の緑を有する明 るい弱い凸状のコロニーとして増殖せしめられる。形態学的、糖分解性及び凝集 特性の研究は、その培養物が典型的であることを確証する。培地の表面上での、 液体の滲出は観察されない。

例７ 例１に記載される方法に従って、調製された溶液Ａ、Ｃ及びＤを用いる。？容液 Ｂを調製するために、Ｎ　、　Ｎ　ｒ−メチレン−ビス−アクリルアミド０．５ ９４　ｇを、０．８５質量％の塩化ナトリウムを含む生理学的塩溶液５００滅中 に溶解する。次に、アクリルアミド２５ｇを溶解し、そしてその体積を、生理学 的塩溶液により１０００成にする。体積比Ａ　：　Ｂ　：　Ｃ：　Ｄ＝１６：３ ２：５２　：　３０での上記溶液を、混合物を調製するために使用し、そして共 重合を反応器中で行なう。反応混合物においては、アクリルアミド及びＮ、　Ｎ 　’−メチレンービスーアクリルアミドの質量比は２０７０．０１９であり、そ してアクリルアミド及びポリビニルアルコールの質量比は２０：３．０である。

その得られたゲルを、例１に記載されるようにして処理し、質量で４．６倍に高 める。そのゲルを例１に記載される方法に従って、栄養基質により含浸する。ア ミン窒素３００■を含むトリプシンＩ（ｏｔｔｉｎｇｅｒ消化物を栄養基質とし て使用する。プロテウスバルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）を、 試験微生物として使用する。２４時間のインキュベーションの後、その培養物は 、不均質形の典型的な適度に弱い凸形のコロニーとして増殖せしめられる。形態 学的特性の研究は、培養物が典型的であることを確証する。栄養培地の表面上で の液体の滲出は観察されない。

例８ 例１に記載される方法に従って調製された溶液Ａ、Ｃ及びＤを用いる。溶液Ｂを 調製するために、Ｎ　、　Ｎ′−メチレン−ビス−アクリルアミド４．１３５　 ｇを、０．８質量％の塩化ナトリウムを含む生理学的塩溶液５００ｄ中に溶解す る。次に、アクリルアミド２５ｇを添加し、そしてその体積を、前記濃度の生理 学的塩溶液により１０００ｄにする。上記溶液のすべてを、混合物（Ａ　：　Ｂ 　：　Ｃ：　Ｄ＝１６：３２：５２：１０）を調製するために使用し、そして共 重合を反応器中において行なう。反応混合物中のアクリルアミド及びポリビニル アルコールの質量比は、２０：１．０である。

その得られたゲルを、例１に記載される方法に従って処理し、質量で４．０倍に 高める。そのゲルを、例１に記載される方法に従って、栄養基質により含浸する 。肉−ペプトンブイヨンを基質として使用する。線状細菌Ｅ、コリ０１１１が、 試験培養物として作用する。３７°Ｃでのインキュベーションの後、培養物は、 均等の縁及び滑らかな表面を有する明るい丸型の弱い凸形のコロニーとして増殖 せしめられる。生態学的、糖分解性及び凝集特性の研究は、培養物が典型的であ ることを確証する。栄養培地の表面上には、液体の滲出は観察されない。

例９ 例１に記載される方法に従って調製された溶液Ａ、Ｃ及びＤを用いる。溶液Ｂを 調製するために、Ｎ　、　Ｎ　／−メチレン−ビス−アクリルアミド１．７８ｇ を、０．８５質量％の塩化ナトリウムを含む生理学的塩溶液５００成中に溶解し 、次にアク、リルアミド６２５ｇを添加し、そしてその体積を、前記濃度の生理 学的塩溶液により１０００ｄにする。Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄの比が１６：３２　：　５ ３　：　２５の上記溶液を、混合物の調製のために使用し、そして共重合を反応 器中で行なう。反応混合物中のアクリルアミド及びＮ　、　Ｎ　ｒ−メチレン− ビス−アクリルアミドの質量比は２０　：　０．０５７であり、そしてアクリル アミド及びポリビニルアルコールの質量比は２０：２．５である。

その得られたゲルを、例１に記載される方法に従って処理し、質量で４．３倍に 高める。そのゲルを例１に記載される方法に従って栄養基質により含浸する。Ｄ ｉｒｃｏブイヨンを基質として用い、そしてバシラスセレウス（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ　ｃｅｒｅｕｓ）が試験微生物として作用する。２４時間のインキュベーショ ンの後、培養物は粗い表面を有する典型的な丸型の平らなコロニーとして増殖せ しめられる。その形態学的研究は、培養物が典型的であることを確証する。栄養 培地の表面上での液体の滲出は観察されない。

産業上の適用性 本発明の方法により調製される濃栄養培地は、種々の微生物学的目的のために使 用され得る。

匡際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．微生物を培養するための濃栄養培地を調製するための方法であって、ゲルの 形成まで、生理学的塩溶液中においてアクリルアミド及びＮ，Ｎ′−メチレン− ビス−アクリルアミドをその質量比（１５〜２０）：（０．０１９〜０．１３２ ）でラジカル共重合せしめ、前記生理学的塩溶液中で洗浄し、そして前記ゲルを 膨潤し、そして前記ゲルを栄養基質により含浸することを含んで成り、前記共重 合は、アクリルアミド：ポリビニルアルコールの質量比が１５〜２０：１．０〜 ３．０で、ポリビニルアルコールの存在下で行なわれることを特徴とする方法。 ２．ポリビニルアルコールの水溶液を使用することを特徴とする請求の範囲第１ 項記載の方法。