JPS6156073A - 微生物培養およびマクロ生物細胞培養用の濃厚栄養培地の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、医学および生物学に、よ〕詳細には微生物培
養およびマクロ生物の細胞接養の栄養培地を製造するた
めの方法に関する。

（従来の技術および発明が解決しようとする問題点） 現在、微生物学の実務上、天然産のゲル（寒天）Ｋ基づ
く濃厚栄養培地が広く用いられている。

しかしながら、この天然材料はかなシ高価でちゃかつ人
手困難である。このために、微生物学の実務上、寒天に
代わυ５る合成のゲルに基づく栄養培地を開発するとい
う緊急の問題がこの技術分野においである。

微生物培養用の栄養培地を製造するための次の方法がこ
の分野において知られている。すなわち、この方法は、
水性媒体中でのアクリルアミドとＮ。

Ｎ′−メチレン−ビス−アクリルアミドとの共重合、続
いて有毒な元の単量体を取シ除くための水による生成ポ
リアクリルアミドゲルの洗浄、そのゲルへの栄養基質の
含浸、引き続く殺菌からなる（ソ連発明者証第１５’、
Ａ／り号明細書）。

栄養培地の基材としてポリアクリルアミドゲルを使用す
ることから生じる主な利点は、それが安定した組成を有
し、水洗後に異物および微生物成長を阻害する物を含ま
ず、高い透明性の物質であって、使用前に清浄化の必要
がないということである。しかしながら、従来法におい
て栄養培地用の濃厚基材として用いられたポリアクリル
アミドゲルは、栄養基質の高分子部分の拡散を抑制する
ポリアクリルアミドの高架橋度のために、脆くなりでい
ろ。そのような栄養培地上で成育した微生物の除去は、
生理学的溶液による洗浄によってのみ行われる。生物学
および医学上の目的でポリアクリルアミドゲル、ならび
Ｋその製造方法もこの分野で知られている（ソ連発明者
証第２７７．４ｔ４Ａ号明細？）。この文献によるポリ
アクリルアミドゲルも濃厚栄養培地用の基材として用い
てもよ＼・。

このゲルは、アクリルアミドとＮ、Ｎ’−メチレン−ビ
ス−アクリルアミドとの共重合によシ、ラジカル型の開
始剤の存在下、０．ｊ％塩化ナトリウム溶液中、各々ｏ
、ｒ−≠０，０　：　２．！　−１２，０の重量比で調
製される。

得られたポリアクリルアミドは、共重合工程後に、最大
可能量の水を含有しており、／２時間Ｏ，Ｓチ塩化ナト
リウム水溶液で洗浄し、その際、未反応単量体を取シ除
くべく係持間ごとＫその溶液を取υ換える。このポリア
クリルアミドゲルは、重量幅で次の成分を含有している
。

ポリアクリルアミド　　　　　　３，０−２８’、０Ｑ
５ｊチ塩化ナトリウム溶液　　７．２．０〜り乙Ｏ次い
で、洗浄ゲルを微生物栄養用の基質で、例えば、肉−ペ
プトンブイヨンで飽和させる。

引用されたソ連発明者証明細書記載の方法で製造された
濃厚栄養培地には、有毒な単量体が含まれず、微生物、
人間および動物の細胞の生物学的性質の研究用にその培
地を使用することができる。

上記の濃厚栄養培地は、ポリアクリルアミドゲル皮相部
に高い感受性を有するので、口々の取り扱い操作中に、
例えば、殺菌中に、微生物学で用いられる耳（１ｏｏｐ
　）　Ｋよる微生物の接種およびコロニーの引き剥し中
に、その脆さのために損傷を受ける。再接種時の微生物
の除去は生理学的溶液によろ洗浄のみ可能であシ、この
溶液は大部分の微生物学的操作において許容されない。

この作業は、特に、微生物の長時間培養に際して煩雑に
なる。

本発明の目的は、微生物学への広い利用機会を可能にし
、良好な生理機構上の特性を濃厚栄養培地が有するよう
に、工程操作を改善することによつて微生物成育および
細胞培養用の濃厚栄養培地を製造する良好な方法を提供
することである。

（問題点を解決するための手段および発明の効果）本発
明の目的は、ラジカル型開始剤の存在下、生理的溶液中
でアクリルアミドとメチレン−ビス−アクリルアミドと
を共重合させてポリアクリルアミドゲルを生成させ、次
いでそれを生理的溶液で洗浄することからなる、微生物
の培養およびマクロ生物の細胞培養用の濃厚栄養培地を
製造する方法において、本発明によって、アクリルアミ
ドとＮ、Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミドとの共
重合を各々１３．０〜２０，０　：　０，０１り〜０，
１３２のその重量比で行い、洗浄後得られたポリアクリ
ルアミドケルの質量が２６ｒ−≠、！倍分だけ増加する
までそのポリアクリルアミドゲルを生理的溶液中で保持
し、次いで液状栄養培地で処理する、もしくは洗浄して
得られたポリアクリルアミドゲルの質量がコ、ｊ〜Ｊ、
ｊ倍分だけ増加するまでそのポリアクリルアミドゲルを
液状栄養培地中で膨張させる方法によつて達成される。

本発明による方法でつくられた濃厚栄養培地は、種々の
要素に対する抵抗性を有しかつ種々の操作におけるその
Ｎ、υ扱いに際して損傷を受けない。

その密度は寒天のそれに近い。その培地は可撓性であシ
かつ良好な接着性を有し、したがうてペトリ皿に良く接
着する。公知の濃厚な栄養培地とは対照して、本発明に
よりつくられた濃厚な栄養培地は、その表面を損傷する
こともなく微生物の接種および除去時の微生物用の耳の
良好な滑シを確保する。

微生物の培養は、濃厚な栄養培地中で成育することなく
その培地表面で起シ、シたがつて微生物の生命活性に対
する最適条件を保証し、その結果バイオマス収率な増大
させる。濃厚栄養培地の品質を改良するために、アクリ
ルアミドとＮ、Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミド
との混合物対生理的溶液の重量比が各々ｌ：ｌ／−〜７
である共重合を行うことが望ましい。重合混合物中の成
分のこの割合によシ、得られたポリアクリルアミドゲル
の良好な空間構造形成のための最適条件が提供され、そ
れよ）調製された栄養培地の良好な生理機構上の性質が
保証される。

本発明による濃厚栄養培地の適用範囲を微生物学上の目
的で広げるために、生理的溶液として０．８チ塩化ナト
リウム水溶液、リンゲルーロクク液、アール液、ｊｌグ
ルコース水溶液のへ／クス液を使用することが望ましく
、他方、液状栄養培地としてホラチンジャーのトリプシ
ン過煮汁（Ｈｏｔｔｉｎｇｏｒ　　ｔｒｙｐｔｉｃ　　
ｏｖａｒｃｏｏｋ　）、ｆｆルチン汁（Ｍａｒｔａｎ　
ｂｒｏｔｈ　）　、肉ペプトン汁、ペプトン水、カゼイ
／氷解物、麦芽汁、培地ｌタタ（ｍｅｄｌｕｍ　／タタ
）を用いることが望ましい。

淋菌の培養用に、生理的溶液中で膨張されたポリアクリ
ルアミドゲルを、ｌ：ｌの重量比で取られた不活性無菌
のヒトの血清と血漿との混合物から成る液状栄養培地で
処理することが有利である。

この濃厚栄養培地は、形態上染色の、培養のおよび他の
生物学上の性質を保持したまま、淋菌培養の高品質を保
証する。この培地の使用によυ、りん病、特に慢性およ
び潜伏性のシん病を発見する微生物学的診断法を拡大す
る。この濃厚栄養培地の調製に要する時間は、淋菌培養
に用いられる腹水内ペブト／寒天、ペイリー寒天、血清
寒天の調製のために要求される時間と比較して数倍も短
縮されろ。また、この調製のために高価な成分を用〜・
る必要がない。

本発明による濃厚栄養培地の適用範囲を拡げるために、
ポリアクリルアミドゲルを二枚の平板（ただし、それら
の一枚は共軸および／またはジグザク様に設けられた凹
部を有するものとする）に成形し、その後それらの板を
Ｉｊ、０−２０，０　：　０．０１り〜０．／３λの重
量比のアクリルアミドとＮ、Ｎ’−メチレン−ビス−ア
クリルアミドとの溶液で含浸させ、微生物培養もしくは
マクロ生物の細胞培養用の密封空洞、を形成するよ５に
それらを合せ、単一体が形成されるまで保持し、次いで
各々少なくとも１個の前記密封空洞を有する部分に分割
し、生理的溶液中で膨張させて液状栄養培地中で処理す
ることが有利である。

密封空洞を有する得られた部分は、ポリアクリルアミド
ゲルの性質のために良好な強度、弾性および熱安定性と
を有する拡散室であると言うことができる。それらは、
容易に再生可能であシ、長時間貯蔵されまた殺菌を施す
ことができる。拡散室として形作られたこの濃厚栄養培
地は試験管内および生体内の両方の方法に広く用いられ
うる。

これらの拡散室は生物体内（例えば、動物の耳周囲洞）
への移植に際して無傷である。これらは生物体に対して
不活性であ）、これは室の空洞内に置かれた対象物に関
する周囲培地の種々の要因の効果の研究に大変重要であ
る。ポリアクリルアミドゲルの性質のために、それから
作られた拡散室は良好な拡散性を有し、マクロ生物細胞
の研究培養へのもしくは意の空洞に置かれた微生物への
栄養および他の物質の容易な浸透ならびにそれらのよυ
大きい影響を保証する。さらに、これらは透明であシ、
そのために、試験微生物もしくは細１叱培養を容易に顕
微鏡で観察してそれらの生体像を見ることができる。

本発明において、微生物培養用の濃厚栄養培地は次のよ
うな方法でつくられる。第一に、生理的溶液中で出発単
量体溶液を含む反応混合物をａ’？Ｊｓする。この反応
混合物中のアクリルアミドとメチノン−ビス−アクリル
アミドとの重量比は、各々（／ｊ、０〜２０．０　）　
：　（０，０１Ｙ〜０．１３コ）に等しい。

単量体混合物に対する好ましくはＩＡ〜７：ｌの比率で
取られる生理的溶液としては、ｏ、ｒｒチ塩化ナトリウ
ム水溶液、ｏ、ｙｅｓ塩化ナトリウム水溶液、ｊ％ブド
ウ糖水溶液、υノゲルーロック液、ノ゛ンクス液、また
はアール液を用いる。出発単量体と生理的溶液との重量
比を変えることにより、従来のものと比較して弾力性が
増大したポリアクリルアミドゲルを製造することができ
、ゲルの別の処理を容易化しさらに他の操作のために栄
養培地の良好な品質を確保できる。

出発単量体の共重合は、既知の開始剤の添加を伴う反応
混合物の加熱もしくはその加熱なしで起る。反応混合物
の共重合を、ガラス、金属、セラミック容器、合成材料
からつくられた容器などの所定形状の反応器内で行うこ
とができる。この共重合でつくられたポリアクリルアミ
ドゲルは反応器の形状および寸法を複製する。共重合後
に得られたポリアクリルアミドゲルを対応する生理的溶
液で洗浄する。次いで、洗浄したポリアクリルアミドゲ
ルを生理的溶液中で膨張させてその質量をコｊ−４’、
ｊ倍分だけ増大させる。そして、得られたゲルを、ホッ
チｙジャーによるトリプシン過煮汁、マルテン汁、肉ペ
プトン汁、ペプトン水、〃ゼイン氷解物、麦芽汁、また
は培地ｌタタから成る液状栄養培地で処理する。

本発明における栄養培地製造の第二の態様において、洗
ったポリアクリルアミドゲルを上記の液状栄養培地中で
直接Ｋ１１ｍ張させてその質量の２．ｊ−Ｊ、１倍分ま
で増加させることができろ。次いで、膨張させたポリア
クリルアミドを殺菌し、濃厚栄養培地は使用の用意がで
きる。この最後の培地がバイオマスの高収率に寄与する
。

液状の栄養培地の組成は、微生物の特定の徨もしくは群
、またはマクロ生物の細胞培養の栄養所要量によ）決ま
る。本発明におけるポリアクリルアミドゲルの飽和およ
び膨張のためには、天然、半合成もしくは合成の基質組
成物およびこれらの混合物から成υ、かつ微生物および
細胞の実質的すべての既知の栄養所要量を満足する液状
栄養培地を使用しうる。本発明による方法で製造された
。

微生物培養およびマクロ生物の細胞培養のための濃厚栄
養培地は良好な接着性（ペトリ皿によく付く）、具なる
外的要因に対する抵抗性を有し、種々の操作取り扱いに
際して損傷しない。また、それは接種に際し耳（ｂａｅ
ｔ＠ｒＬａｌ　　１ｏｏｐ　）の良好な滑り、および表
面損傷のない微生物除去を保証する。

微生物培養は本発明による濃厚栄養培地の表面上で起シ
その中に成長せず、したがうて微生物の生命活性に対す
る最適の条件を与え、バイオマスの高収率を可能にする
。

本発明による濃厚栄養培地の上記の性質が膨張したポリ
アクリルアミドゲルの性質によって決まるので、発明者
によシ見い出されたように、淋菌培養用濃厚栄養培地の
ｌｌｉ製のために首尾よく用いろことができる。質量が
好ましくは係、５倍以上になるまで生理的溶液中で膨張
されたポリアクリルアミドゲルを、重量比ｌ：ｌの不活
性無菌のヒトの血清と血漿との混合物から成る栄養培地
で処理する。

血漿はヒトの血液から調製された製剤である。

これは、無色もしくはわずかに黄味の透明またはわずか
に乳白色の液であフ、特有の臭いを持つ。

淋病の異なる診断の目的で、次の研究方法が本発明に従
りて実施される。

例えば、≠、！倍分だけ質量が増加するまで生理的溶液
中で膨張されかつ従来法で殺菌されたベトリ皿に置かれ
た千円形ポリアクリルアミドゲルの上１ｉ、０．．２ｊ
〜０．ｊ−のヒトの血清を０．２！〜０．！４の血漿と
ともにピペットによつて注ぎ、その後、不活性化を従来
法で行う。濃厚栄養培地、例えば比較培地として採られ
た血清寒天（参照、アイ、エム、オブチンニコプ著「性
病の実験室的診断」モスクワ、医学出版社、ｌりｔ２、
ｐ　６７〜６り）上で得られた急性淋病に罹患している
Ｊ人の患者からの淋菌の回復期培養物の再接種を上記の
方法で調製された培地上で行われた。接種された皿を、
サーモスタット付デシケータ内１ｃ、７７℃のｉ度で２
弘時間置く。ポリアクリルアミドゲルの血清培地上で成
長した淋菌のコロニーが霧状水滴のよ５に滑らかな表面
にでき、それらは無色透明であった。

これらのコロニーから調製されかつダラムおよび「淋病
と尿道炎の鑑別診断法」（参照、ソ連発明証第１コロ２
０１号明細書）によシ染色された塗抹標本の細菌顕微鏡
による観察からダラム陰性ビーム状双球菌が発見された
。

第二の一連の研究において、急性および慢性の淋病の３
０人の患者の尿道からの排泄物を、細菌顕微鏡による診
断法（ダラムおよびソ連発明者証第ｒコ６コｏｒ号によ
る染色）および微生物学的判定（血清寒天を比較する培
地への接８１）後に、本発明による培地上に接種した。

すべての場合１本発明による培地上に淋菌の良好成育が
観察された。

試験の結果として、本発明による濃厚栄養培地上の日蝕
培養において、従来の栄養培地上の成育と比較してよシ
強い淋菌成育が観察された。本発明による培地上の培養
に際して、淋ＩＩは形態上、染色上および培養上の性質
を保存した。淋菌培養用のこの培地使用によシ、淋病、
特に慢性および不活性の淋病の判定診断法のための機会
をかなシ広げることができる。

生体内および試験管内のマクロ生物の細胞培養および微
生物の相互作用を研究し成育する目的で。

本発明による培地を次のようｋして調製することができ
る。

アクリルアミドと、Ｎ、Ｎ’−メチレノ−ビス−アクリ
ルアミドと、ラジカル型開始剤１例えば生理的溶液中で
調製されたＮ、　Ｎ、　Ｎ’、　Ｎ’−テ′トラメｆ−
ル壬チＶンジアミンとアンモニウムベルスル７アートと
の混合物と、の混合物を反応器内に注ぎ、ポリアクリル
アミドゲルを共重合中に２枚の平板に成形する。それら
の１枚は共軸にまたはジクザク様に設けられた凹部を有
する。これらの板は重量比ｉｔ、ｏ〜２ｏ、ｏ　：　ｏ
、ｏｔｙ〜０，１３コのアクリル７ミドとＮ、Ｎ′−メ
チレン−ビス−アクリルアミドを含む溶液で含浸、され
、微生物培養もしくはマクロ生物の細胞培養用の密封空
洞がつくられるように合せられろ。この板が単一体に形
成されるまで保持され、次いで各々少なくとも１個の上
記密封空洞を有するように各々の部分に分割される。

密封空洞を有するこれらの部分は拡散室と呼ばれ、それ
をつくっているポリアクリルアミドゲルを膨張させそし
て質量を２．ｊ−弘、１倍分だけ増大させるように生理
的溶液中で保持される。次いでこれらは、研究される微
生物もしくはマクロ生物の細胞培養に応じて液状栄養培
地で処理されろ。板の形成に用いられた反応混合物と板
の含浸用の混合物との成分の量的比率が等しいことが、
得られた拡散室の壁構造の砕−性を確実にし、したがつ
て物質の均一な拡散を起させ、また製造方法を簡単化す
る。

板の凹部の配置に応じて、単一空洞および多空洞の拡散
室をつくることができる。凹部の距離と板厚を拡散室の
目的に応じて変えることができる。

したがつて、多空洞の拡散室の製造において、板の凹部
なジグザク様に、好ましくは、拡散室の密封空洞間の最
適の拡散過程を確実にするように互いにｏ、ｒ〜２頭離
れて設けられる。これらの拡散室は、多成分系をそれら
の相互作用によりて、並びに生きた有機体もしくは周囲
培地の要因の影響を同様に研究することを可能にする。

単一空洞の拡散室をつくるために、共軸に設けられた凹
部な有する板が形成される。

これらの拡散室が生体内および試験管内のマ？ロ生物の
細胞および微生物を成育するために本発明者によシ採用
された。この目的のために、案の空洞内にり／パ様器管
および他の器官（例えば、肺臓、リンパ節、胸腺および
骨髄）の細胞が注射器の針によつて室壁を刺して注入さ
れろ。次いで、拡散室が受容者の器官内に移植されろ。

ある時間の後、それらが取り出され、細胞有機体および
コロニーの特性を研究するために、顕微鏡観察された。

細胞な室壁に穿刺することＫよ多空洞から取シ出して形
態構造上のおよび機能上の特性を分析する。例えば、生
体内の骨髄細胞の培養に際してを髄系の細胞の成長およ
び発育が、他の材料からつくられた拡散室でのこれらの
細胞の通常の生存期間をかなり超えろｌカ月以上の間維
持された。

（実施例） 本発明の詳細な説明する具体的な例を以下に示す・ 例１ ポリアクリルアミドゲルの製造のために、３穏の溶液（
Ａ、ＢおよびＣ）が次の手順に従うて調製された（出発
成分の量は、溶液ｔ、０００　ｍｌを基準として定めら
れる）。

（イ）　溶液人の調製 Ｎ、　Ｎ、　Ｎ’、　Ｎ’−テトラメチルエチレンジア
ミン！−をｏ、ｒｊチＮｍＣ１水溶液２ｎｄに溶かす。

この溶液を黒つぼいガラス器具内に≠℃の温度で保存す
る。

（ロ）溶液Ｂの調製 Ｎ、Ｎ′−メチレン−ビス−アクリルアミド０６より参
Ｉを０．１１　％　ＮａＣｌ水溶液ｚｏｏ　ｒｒｔｌ　
テ溶かし、ｔ、ａ”ｃＶｃ加熱する。次いでアクリルア
ミドφ７０／／を添加して完全に溶解するまで攪拌する
。このようにして調製された溶液を口過し、ｏ、ｔｏ　
ｓ歯Ｃ１水溶液で１ｏｏｏ−の体積に増す。この溶液は
μ°Ｃの温度で黒っぽいガラス容器に保存されろ。

（ハ）溶液Ｃの調製 過硫酸塩４７１２をＯＪｊ　％　ＮａＣ１水溶液１００
−で溶かし黒つぼいガラス容器に貯蔵する。

反応混合物を上記の溶液（Ａ、ＢおよびＣ）から調製す
る。このために、溶液Ａ、ＢおよびＣ’に次の容量比で
連続的に混合する。

Ａ：Ｂ：Ｃ＝／乙：３１：ｊコ この反応混合物は、アクリルアミドとＮ、Ｎ′−メチレ
ンービスーアクリルアミドと重量比の単量体を含む。こ
の混合物対生理的溶液の重量比はｌ：６である。

反応混合物を２００−反応器に注ぎ、ポリアクリルアミ
ドゲルから所定直径の円平板に形作る。共重合工程は約
り分間で起る。得られた円平板を生理的溶液で洗浄し、
質量が代！倍分だけ増加するまでｏ、ｒｓ４歯Ｃ１溶液
中で膨張させる。膨張後、ポリアクリルアミドゲルは、
質量チで次のとおり生理的溶液　　　　　　　　　　　
　２６．７このゲルは濃厚ホクチンジャー栄養培地の製
造の基材として用いられる。この円平板をガラス容器内
に置き、それに円平板１枚あたり汁ｘｏｍｌの割合でア
ミン窒素λｏｏｘｑ−ｔ４を含有するホッチ／ジャート
リプシン過煮汁を注ぎ、飽和させるために２〜３時間放
置する。含浸された円平板を／２０’（：。

の温度の加圧水蒸気により３０分間殺菌する。使用可能
な栄養培地を乾燥し、試験用微生物、スタフィロコッカ
ス・アウレウス（Ｓｔ、　ａｕｒ＠ｕａ　）　２０り、
エシェリキア・コ！ｊ　（Ｅ、　ｃｏｔｔ　）、　Ｋ　
−／ｓ、エシェリキア・コリＭ−／７、シゲラーフレク
スネリ（Ｓｈ、　ｆｌａｘｎｅｒｌ　）、バクラス＋１
セＶウス（１３ａｅ、　ｃａｒｅｕａ　）ｊ０４Ｌ、バ
シラス・サチリス（Ｂａａ９ｇｕｂｔｌｌ　ｉｓ　）　
、カンジダ健アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｌ
ａｓｎｓ　）　　で接種する。

対照として、ソ連発明者証第２７７弘ＡＡ号よシつくら
れたポリアクリルアミドゲルによる培地上で微生物の同
様の培養が行われる。接壇物を１日間３７℃の温度のサ
ーマスタクトを有する細菌培養器に置く。

この栄養培地は調製およびその使用中損傷を受けない。

微生物の培養は典型的な成育を示し、栄養培地中に成育
せず、微生物用の耳によって容易に取シ除かれろ。下記
ｇ／表には、本発明による栄養培地上およびソ連発明者
証第２７７≠ｔ６号明細書に記載された培地上での種々
の微生物の成育強度をあられす結果が示されて〜・る。

ここで開示された方法で本発明による濃厚栄養培地上で
成育した平均コロニー数は、ソ連発明者証第２７７μ６
６号明細書に記載された栄養培地上で成育した平均コロ
ニー数より多いことが第１表かられかる。

例λ。

溶液人およびＣを例／で前記したと同様のやり方−ｃ’
ｖ４ｇする。溶液Ｂノ！１４ｉＪ＆ノタメニ、ｏ、ｔｉ
ｉｔｉ−：ｉのＮ、Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルア
ミドをｏ、　ｒ　Ｊ−％ＮａＣ１水溶液ＪｒＯＯＩＩＬ
Ｉ中に溶かし、６ｏ”ｃノ温度に加熱し、≠７０１１の
アクリルアミドを添加する。

溶液を口遇し、０．♂ｔチＮａＣ１溶液で１０θθｄに
増す。

反応混合物を例／のようにｙＡ製する。

反応温合物は／よ、０：０．λ７の重量比でアクリルア
ミドとＮ、Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミドを含
有し、この反応混合物対生理的溶液の重量比はｌ；７に
等しい。共重合のやり方は例１で記載したと同様である
。ポリアクリルアミドゲルの得られた円平板をハンクス
生理的溶液中で膨張させてその質量の３．２倍分だけ増
加させる。膨張後ポリアクリルアミドゲルは、重ｉ％で
次の成分を含有する６゜ アクリルアミドとＮ、Ｎ’−メチレン−ビス−アクリル
アミドとの共重合体　　　　　　　　≠、Ｏ生理的溶液
　　　　　　　　　　　　　タｔ、。

この例においてゲルの含浸のために肉ペプトン汁が用い
られる。°含浸および殺菌は例／で記載されたように実
施される。

試験用の微生物はスタフィロコッカス・アウレウス２０
７株の培養物である。対照として、ソ連発明者証第２７
７弘６６号明細書に記載した濃厚栄養培地上および肉ペ
プトン寒天上で成育した同じ培養物を用いる。３７℃の
温度の恒温器内での接種物の評時間培養の後、対照の接
種のそれよりも強いスタフィロコッカス培養物の成長が
本発明による栄養培地上で観察される。

スタフィロコッカスのコロニーは、典型的す、丸く、滑
らかで、光沢があシ、強い色彩を有する油性のコロニー
である。培養物の特徴は顕微鏡分析によって証明される
。コロニーは、濃厚栄養培地の表面を損傷することなく
微生物用の耳によυ完全に取り除かれる。

例３゜ 溶液人およびＣを例１に記載されたよ５に調製する。溶
液Ｂを次のように調製する、。

１、　０００Ｒ１フラスコ内に、Ｑ、り３７！ＩのＮ、
Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミドを入れ、　ｏ、
ｒｒｓＮａＣ１溶液μｏｏｙｄを添加する。その単量体
の完全な溶解後、溶液を６０℃の温度に加熱し、次いで
６コｊ７７のアクリルアミドを添加する。溶液を口過し
、０．１ｒ　ｊ　％　ＮａＣｌ溶液でｔ　ｏ　ｏ　Ｏｔ
ｄ　Ｋ増す。

反応混合物はアクリルアミドとＮ、Ｎ’−メチレン−ビ
ス−アクリルアミドとを各々λ０．０　：　０．ＯＪの
重量比で含み、他方この混合物と生理的溶液との重量比
は／；、弘である。共重合の工程は例／で記載されたと
同様に実施される。

ポリアクリルアミドの得られたゲルは、生理的溶液（ア
ール液）中で膨張されて、３．７倍分だけその質量が増
える。ポリアクリルアミドの膨張後、質量憾で次の成分
を含む。

アクリルアミドとＮ、Ｎ’−メチレン−ビス−アクリル
アミドとの共重合体　　　！、３生理的溶液　　　　　
　　　　　　　　タ弘、７含浸用の液状栄養培地として
麦芽汁を用いる。

含浸と殺菌とは前記例／に記載したように実力和する。

殺菌後の濃厚栄養培地の性質は変わらない。

試験用の微生物は菌７サリウム・アペナセウム（Ｆｕａ
ａｒｉｕｍ　　ａｖｅｎａｃｅｕｍ　）の培養物である
。３℃の温度の培養器のμ日間培養後、典型的な画状コ
ロニーが特徴的なピンク色の綿毛状菌糸体を伴って現わ
れる。顕微鏡の観察からこの菌糸体は特徴的な組織を持
つことがわかり、胞子生成が見られた。このコロニーは
栄養培地表面を損傷することなく微生物用の耳で容易に
取シ出される。

例≠。

溶ＴＬＡおよびＣを前記例ノに記載されたように調製す
る。溶液Ｂを次のように調製する。

≠、／λｊ１のＮ、　Ｎ’−メチレン−ビス−アクリル
アミドを０．ｒｊｆｒＮａＣ１水溶液ｒｏｏＩＩＬｌに
溶かし、６０℃の温度に加熱し、次いで弘７０１のアク
リルアミドを添加し、完全溶解まで攪拌する。得られた
溶液を口過し、ｏ、ｒｒチＮｈ　Ｃ１水溶液で１、　０
００ゴに増す。

調製された溶液から反応混合物を得、前記例１で記載し
たと同様の条件で共重合を行う。

反応混合物はアクリルアミドとＮ、Ｎ’−メチレン−ビ
ス−アクリルアミドとを／ｊ、０　：　０．／Ｊコのｉ
ｔ比で含む。他方、これらの混合物と生理的溶液との　
重量比はｉ：ｚ＜等しい。

このポリアクリルアミドゲルがスタフィロコッカス・ア
ウレウス、２０りＰのバイオマス生産用の濃厚栄養培地
のための基材として用いられる。つくられた円平板をｏ
、　ｒ　ｒチＮａ　Ｃ１溶液で洗浄し、２００ツーチの
アミン窒素を含むホッチンジャートリズシン過煮汁中に
浸してゲル質量をλ、ｊ倍分たけ増大させる。

最終的濃厚栄養培地を７２０℃の温度の加圧水蒸気によ
ｆ＞Ｊｏ分間殺菌する。対照としてホラチンジャー培地
寒天を用い、これはｘｏｏＲ９−ｓのアミン位素および
ソ連発明者証第２７７≠６を号明細書記載の培地を含有
する。スタフィロコッカスがｔｍｌ中の微生物体／θ　
個の割合で直径６０〜６ＪＩＩｌＩＩの円平板に接種さ
れる。第１表は、異なった濃厚栄養培地でのスタフイロ
コがカス・アウレウスのバイオマス収量を表しているデ
ータを示す。

第１表 濃厚栄養培地上で得られたスタフィロコッカスのポリア
クリルアミドゲルは、質量チで次の成分を含む。

アクリルアミドとＮ、Ｎ’−メチレン−ビス−アクリル
アミドとの共重合体　　　６．０ホツチンジヤートリブ
シン過煮汁　　　タク、θ例！。

ポリアクリルアミドゲルを前記例／で記載したように製
造する。

このポリアクリルアミドゲルを菌ベルチシルリウム・ダ
リア（Ｖ＊ｒｔｌａｌｌｌｌｕｍ　　ｄａｈＮａａ）の
培養用の濃厚栄養培地のための基材として用いる。

０．１１％ＮａＣ１溶液で洗浄した円平板を、液状栄養
培地（麦芽汁）の中に置き、その質量がＪ、１倍分だけ
増大する筐で膨張させる。

殺ｌＩ後の最終濃厚栄養培地に菌の培養物を接種する。

対照として、麦芽汁で含浸された寒天栄養培地上および
例／でｔＡ製された培地上で成育した菌ベルチシルリウ
ム・ダリアの培養物を用いる。

接種物は３℃の温度で培養される。

例！によシＭ）４ｇされた培地上で、菌の強い成育が観
察され、この菌は第３日で特徴的な形態上および培養上
の性質を持つている。他方、対照培地上では同様の強さ
の成育がやっと第５８目でＩ！！！される。

例ｔ。

例／の記載のようにＩ！ｉｌ製した反応混合物を反応器
内に流し込み、ポリアクリルアミドゲルを２枚の平板に
成形する。それらのうちの７枚は／ｊ’０Ｘ１０Ｏ×０
０ｒｕｏ大きさを持ち、１ｒｏｘｉｏｏｘ、２．ｓ１層
の大きさの第一の板は、互いに／〜／Ｊｌｌ離れてジグ
ザク様に設けられた３ｘｉ、ｏｔａｍの大きさの凹部を
有している。殺菌法を侵分実施する。次いで、このよう
にして製造された板を、例／で記載した反応混合物と類
似の組成を有する混合物で含浸させる。次いで、板を合
せて微生物およびマクロ生物の細胞の培養用の密封空洞
を形成する。単一体が形成されるまで板をＱ分間保持す
る。次いで各々３つの密封空洞を有する部分に分割する
。

密封空洞、すなわち拡散室はｏ、ｒｊチＮａ　Ｃ１溶液
中に入れ、質量が≠、！倍分だけ増大するまでその中に
保持する。その後、拡散室をｌ〜１、１時間殺菌し、培
地ｌタタで飽和させる。

Ｊ空洞拡散室の空洞の一つに、ＪＸｌｏ　　個の骨髄の
細胞を培地１５’りに置く。別の空洞に、λ×７０５拡
散宣を移植する。

最初の３日間、骨髄系細胞の成長帯域で大食細胞および
顆粒細胞のコロニーが繁殖する。大食細胞は異なうた形
態および大きさを持っている。

第７８目で大食細胞のコロニーの数が急激に増大する。

大食細胞とリンパ細胞との間に細胞原形゛　　質量の架
橋が見え始める。結合組織匿の細胞、組織球および細胞
が骨量細胞と結合する。網状細胞および好中球のコロニ
ーが形成される。

第二の空洞では、スタフィロコッカスの典製的な丸い、
滑らかなコロニーが坂路され、ｍ原則間を延ばすとその
数が増加する。これらは溶は込み空洞内に固状成長帯域
を形成する。

例７゜ 溶液人およびＣを例／で記載されたよ５に調製する。溶
液Ｂを例−で記載されたように調製する。

反応混合物はアクリルアミドとＮ、Ｎ’−メチレン−ビ
ス−アクリルアミドとをｉｒ、ｏ　’、　ｏ、コアの重
量比で含有する。他方、それらの混合物対生理的溶液の
ｉｒ比は／；７に等しい。反応混合物を反応器内に注ぎ
、ポリアクリルアミドゲルを２枚の平板に成形する。

一枚は／λ０Ｘ７ＪＸＩ朋の大きさを持ち、二枚目は／
２（：）Ｘ７ｊＸ、２．Ｊ　ＩＩｍの大きさ、および互
いに７．７ｃｍ１［ｉれた共軸的に設けられた弘Ｘ１、
２１１１１の凹部を有している。

共重合工程は侵〜３０分かけて行われる。得られた板を
、反応混合物と同様の組成を持つ混合物で含浸する。次
いで、密封空洞が形成されるように板を合せる。単一体
が形成されるまでそれらの板を６０分間保持する９５次
いで、各々７個の密封空洞を有する部分に分割される。

すなわち、拡散室がつくられ、次いで生理的溶液で洗浄
し、質量が２．１倍分たけ増加するまでＮａＣ１生理的
溶液中に保持する。

その後、７〜７．５時間この拡散室が殺菌され、培地ｌ
タタで飽和される。

骨髄は完全有性生殖動物の大腿骨から取υ出さ室内に置
かれる。

生体内の細胞培養後、拡散室を腹腔から取り出し、顕微
鏡で試験して単層の細胞（成長帯域、細胞組成物）、な
らびに成長細胞培髪物からつくられた塗抹跡を分析する
。

正常動物の腹腔内に移植された拡散室内の骨髄細胞の培
養の第３日月に、異種細胞（Ｒ成が見ら江それは完全な
骨髄の特徴であった。その後（第７日月）、細胞のある
部分が退化し、他の部分は変形し始めた。顆粒細胞の種
々の変異段階が観察された。変態骨髄細胞が未変異組織
の発展繊維附近に群をなして位置し、その表面に突起を
有する。

成熟顆粒細胞は好中球の特徴的細胞核を有する。

中間形態は明らかに核分裂であると言える。成長帯域で
大きな上皮細胞（侵μｍ）は小さな球を伴って表面上に
形成される。それらは単層状におよび個々に集って位置
している。核は平たい外観をし、食菌作用を受けた含有
物は細胞原形質になか９た。

単核大白血球は非常に活発になった。大きな食菌空洞が
たびたび内容物で満されていた。単核大丸形になった。

単核大白血球は上皮細胞の附近にたびたび偏るが、凝集
しようとする傾向は全くなかりた。λ日間の培養におい
て、成長細胞は拡散室の空洞内に位置し、したがって、
特異な構造の有機体を創成する。表面層は、上皮細胞、
続いて単核大白血球、脂肪細胞および若い形態の好中球
からなっていた。成熟形態のものは外表に旧って位置し
ていた。リンパ細胞および有核赤血球細胞は癒着層の内
側に位置した。成長帯域で小さな譲厚細胞核を持つ脂肪
細胞が観察された。場合によっては、２個の核を持つ形
態が見られた。それらは、電子顕微鏡による細胞原形質
膜の細かい脂肪滴から十分に確認され５る。脂質混在物
はたびたび網状に位置し、時々直径りμｍ以下の滴に溶
は込んでいた。脂肪の蓄積の結果として、時々それらの
細胞は最高７２０μｍの大きさになる。空胞膜の構造単
位は、脂質の細胞内合成をになっている。

丸形もしくは卵形の核は、凝縮した染色体から成る。成
熟した細胞の原形質は多数のミトコンドリアを有してい
た。脂肪の初期蓄積の段階で、原形質は未分化された。

脂肪細胞は、凝集しようとする傾向があり、機能的関係
を維持する長い期間、顆粒細胞のコロニー間の大きな焦
点を形成する。

多形核巨大細胞系の細胞がまた観察された。これらは細
胞原形質膜の表面に時として突起を持つ大形の多形核巨
大細胞でありた。血小板形成が不活性であることがわか
った。

例ｒ。

溶液人およびＣを前記例１で記載したように調製し、他
方、溶液Ｂを例弘のように調製する。

反応混合物はアクリルアミドとＮ、Ｎ’−メチレン−ビ
ス−アクリルアミドとを／！、０　：　０．０〜２０．
０：０．０１９〜０．１３２の重量比で含有する。他方
、それらの混合物と生理的溶液との重°汲比は／：ｊで
ある。反応混合物を反応器内に注ぎ、ポリアクリルアミ
ドゲルを一枚の平板に成形する。７枚の板は／；０ＸＩ
ＯＸｔ、２ｍｔａの大きさを持ち、他方、／よｏｘｒｏ
ｘλ、！鰭の大きさの別の板は１、１（Ｂ離れて共軸的
に設けられたｊＸ１、Ｊｍｍの大きさの凹部を持つ。共
重合工程はｙ。

分をかけて行われる。反応混合物と文同じ組成を持つ混
合物で得られた板を含浸し、密封空洞が形成されるよう
にそれらを合せる。密封空洞と包含する単一体が形成さ
れるまで、それらを３０分間保持する４次いで、各々７
個の密封空洞を有する部分にその単一体を分割する。そ
の空洞、すなわち、拡散室は生理的溶液中に入れてその
質量を３．２倍分だけ増大させる。その後、拡散室を殺
菌し、・・ンクス液で含浸する。

健康なヒトの白血球の培養の目的で、）・ンクス液中に
すべての形態の白血球細胞を含有する白血球集合体を、
拡散室の空洞内に導入する。次いで、拡散室を異種発生
動物の有機体内に移植し、所要の観察期間内に取り出し
た。リンパ細胞がｍ日間保存されたことがこの実験から
れかった。しかしながら、それらの数は７２〜〃チ減少
した。単核大白血球および好中球は最初の、２〜３日間
のみ活発であった。大食細胞の量はλ日目で１ｓｃｉｙ
１．２ｏ日目でＳＯ％増加することがわが９だ、、有核
赤血球、線維母細胞、移行性細胞が第ｇ日月で現れ始め
た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ラジカル型開始剤の存在下、生理的溶液中でアクリ
   ルアミドとＮ，Ｎ′−メチレン−ビス−アクリルアミド
   とを共重合させてポリアクリルアミドゲルを形成し、次
   いでそれを生理的溶液で洗浄することからなる、微生物
   培養およびマクロ生物細胞培養用の濃厚栄養培地を製造
   する方法において、アクリルアミドとＮ，Ｎ′−メチレ
   ン−ビス−アクリルアミドとの共重合を各々１５．０〜
   ２０．０：０．０１９〜０．１３２の重量比で行い、洗
   浄して得られたポリアクリルアミドゲルを生理的溶液中
   で保持してその質量を２．８〜４．５倍分だけ増加させ
   、次いで液状栄養培地で処理する、または洗浄して得ら
   れたポリアクリルアミドゲルを液状栄養培地中で膨張さ
   せてその質量を２．５〜３．５倍分だけ増加させること
   を特徴とする濃厚栄養培地の製造方法。 ２、アクリルアミドとＮ，Ｎ′−メチレン−ビス−アク
   リルアミドとの混合物対生理的溶液の重量比それぞれ１
   ：４〜７で、共重合を実施する、特許請求の範囲第１項
   記載の製造方法。 ３、生理的溶液として、０．８５％塩化ナトリウム水溶
   液、リンゲル−ロック液、アール液、ハンクス液、また
   は０．５％ブドウ糖溶液を用いる、特許請求の範囲第１
   項または第２項記載の製造方法。 ４、液状栄養培地として、ホッチンジャーのトリプシン
   過煮汁、マルテン汁、肉ペプトン汁、ペプトン水、カゼ
   イン水解物、麦芽汁または培地１９を用いる、特許請求
   の範囲第１項記載の製造方法。 ５、淋菌の培養用に、生理的溶液中で膨張されたポリア
   クリルアミドゲルを、１：１の重量比で取られた不活性
   無菌のヒトの血清と血漿との混合物から成る液状栄養培
   地で処理する、特許請求の範囲第１項、第２項または第
   ３項記載の製造方法。 ６、共重合において、得られるゲルを二枚の平板（ただ
   し、それらの一枚は共軸および／またはジグザグ様に設
   けられた凹部を有するものとする）に成形し、その後そ
   れらの板をアクリルアミドとＮ，Ｎ′−メチレン−ビス
   −アクリルアミドとの各々１５．０〜２０．０：０．０
   １９〜０．１３２の重量比の溶液で含浸させ、微生物培
   養もしくはマクロ生物の細胞培養用の密封空洞を形成す
   るように互いに合せ、単一体が形成されるまで保持し、
   次いで各々少なくとも１個の前記密封空洞を有する部分
   に分割する、特許請求の範囲第１項、第２項、または第
   ３項記載の製造方法。