JPS6232199B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新抗生物質及びその製造法に関する。 更に詳しく述べれば放線菌を培養して得られる
新抗生物質SF―2140物質及びその製造方法に関
するものである。 本発明者らは種々のグラム陽性菌及び陰性菌に
抗菌活性を有する新規かつ有用な抗生物質を探索
した結果、アクチノマジユラ属に属する放線菌を
栄養培地中にて培養することによつて新抗生物質
SF―2140物質が生産されることを見い出し、SF
―2140物質を単離し、その理化学的性状、生物学
的性状を確定することにより、本発明を完成させ
た。 本発明に使用される、アクチノマジユラ属に属
するSF―2140物質生産菌の一例としては昭和54
年９月に兵庫県の土壌より新たに分離されたSF
―2140株があり、本菌株の菌学的性状は次の通り
である。 形 態 基中菌糸はよく分枝して伸長し、通常の条件下
では分断しない。気菌糸の着生は一般に豊富で、
胞子（分節胞子）形成も良好である。気菌糸の分
枝は単純分枝で車軸分枝はみられない。胞子のう
や菌核は観察されない。気菌糸の先端の胞子の連
鎖は直鎖状である。鞭毛胞子は有しない。 電子顕微鏡による観察では、胞子は卵型〜円筒
型で、0.4〜0.6×0.6〜1.3ミクロンの大きさを有
し、胞子の連鎖は長く数十あるいはそれ以上認め
られる。胞子表面は平滑状である。 各種培地上の生育状態

【表】 上表にまとめた観察結果は、28℃、14〜21日培
養後の結果である。表中の〔〕内に示した色の標
準はColor Harmony Manual（Container
Corporation of America社製）による色の分類
に従つたものである。 生理的性質 (1) 生育温度範囲：スターチ寒天において20〜45
℃の温度範囲で生育し25〜42℃において良好に
生育する。 (2) ゼラチンの液化：陽性 (3) スターチの加水分解：陽性 (4) 脱脂乳のペプトン化：陰性 脱脂乳の凝固：陽性 (5) メラニン様色素の生成：陰性 (6) 硝酸塩の還元：陰性 (7) 耐塩性：５％以下では生育し、７％以上では
生育しない。 炭素源の同化性 基礎培地（イーストエキス0.5％、炭酸カルシ
ウム0.1％、寒天1.5％）に各炭素源１％を加えて
観察した。 (1) 同化する：Ｄ―グルコース、Ｄ―フラクトー
ス、Ｄ―キシロース、Ｌ―アラビノース、Ｄ―
マンニトール、Ｌ―ラムノース、シユクロース (2) 同化しない：Ｉ―イノシトール、ラフイノー
ス 細胞壁組成 ベツカー（Becker）等の方法（Appl.
Microbiol.12：421〜423，1964），ルシバリエ
（M.P.Lechevalier）等の方法（International
Journal of Systematic Bacteriology 20：435〜
443，1970）によつて分析した。 (1) 全細胞中の２，６―ジアミノピメリン酸：メ
ソ型 (2) 全細胞中の糖：アラビノース、キシロースを
含まず少量のマデユロースを含む。 以上の性状より、SF―2140株は形態的にはス
トレプトミセス属（Streptomyces）に類似する
が、全細胞中にメソ―２，６―ジアミノピメリン
酸を含む事から、ストレプトミセス属とは明瞭に
区別され、又全細胞中の糖にアラビノースが含ま
れない事から典型的なノカルデイア属
（Nocardia）とも区別される。ルシバリエ等によ
つて提案されたシステム（M.P.Lechevalier等：
International Jounal of Systematic
Bacteriology 20：435〜443，1970）に基づく
と、SF―2140株はアクチノマデユラ属
（Actinomadura）に属すると考えるのが最も妥当
である。従つて本発明者らは、SF―2140株をア
クチノマデユラ・エスピー・SF―2140
（Actinomadura sp・SF―2140）と命名した。 本菌株は微工研に微生物受託番号微工研菌寄第
5704号として寄託されている。 SF―2140株は他の放線菌の場合にみられるよ
うに、その性状が変化しやすく、例えば、紫外
線、エツクス線、高周波、放射線、薬品等を用い
る人工的変異手段で変異しうるものであり、いず
れの変異株であつてもSF―2140物質の生産能を
有するものはすべて本発明の方法に使用すること
ができる。更に、アクチノマデユラ属に属する
SF―2140物質生産菌はすべて本発明の方法に使
用することができる。 即ち、抗生物質SF―2140物質を製造する本発
明の方法は、アクチノマデユラ属に属するSF―
2140物質生産菌を培養し、培養物からSF―2140
物質を採取することを特徴とするものである。 本発明の方法では前記の菌を通常の微生物が利
用しうる栄養物を含有する培地で培養する。栄養
源としては、従来放線菌の培養に利用されている
公知のものが使用できる。例えば、炭素源として
グルコース、シユクロース、澱粉、グリセリン、
水あめ、糖みつ、大豆油等を使用しうる。また窒
素源として大豆粉、小麦胚芽、肉エキス、ペプト
ン、酵母エキス、コーンステイープリカー、硫酸
アンモニウム、硝酸ナトリウム等を使用しうる。
その他、必要に応じて炭酸カルシウム、食塩、塩
化カリウム、燐酸塩等の無機塩類を添加するほ
か、菌の発育を助け、SF―2140物質の生産を促
進するごとき有機及び／又は無機の物質を適当に
添加することができる。 培養法としては、一般抗生物質生産の方法と同
じく液体培養法、特に深部培養法が最も適してい
る。培養は好気的条件下で行われ、培養に適当な
温度は25〜37℃であるが、多くの場合28℃付近で
培養する。SF―2140物質の生産は振盪培養、タ
ンク培養ともに２〜６日で蓄積が最高に達する。 SF―2140物質の検定にあたつては、次の方法
が用いられる。検定用培地としてマイシンアツセ
イ寒天を用い、検定菌としてはビブリオ・パーコ
ランス（Vibrio percolance）を用いる。SF―
2140物質は上記を用いた検定において、
1000mcg／ml〜125mcg／mlにおいて濃度の対数
と阻止円径との関係は直線関係を示し、それぞれ
22.0〜14.6mmの阻止円径を与える（ペーパーデイ
スク平板法）。 本発明より得られるSF―2140物質を培養物よ
り採取するに当つてその抽出精製にはアンバーラ
イトXAD―２（米国、ローム・アンド・ハース
社製）、ダイヤイオンHP―20（三菱化成(株)製）等
の合成吸着剤、セフアデツクスLH―20（スエー
デン国、フアルマシアフアインケミカルズ社製）
等のゲル過剤、ヘキサンによる沈澱法、酢酸エ
チル等による溶媒抽出法、シリカゲルによるカラ
ムクロマトグラフイー等が使用できるが、以下に
よる採取方法が効率的である。即ち、培養液より
菌体その他の固型物をけいそう土等の過助剤を
用いて別し、次いで液中の有効成分をダイヤ
イオンHP―20に吸着させる。樹脂部を水洗後、
50％アセトン水で溶出する。溶出液中の活性部分
を減圧濃縮し、アセトンを溜去する。この濃縮液
を酢酸エチルで抽出する。抽出液を減圧濃縮し、
酢酸エチルを溜去し乾固する。これをさらにシリ
カゲル（展開溶媒：クロロホルム―メタノール
30：１）、セフアデツクスLH―20等のカラムクロ
マトグラフイーを適宜組み合わせることにより高
純度のSF―2140物質を得ることができる。 以下にSF―2140物質の理化学的性状を示す。 １ 外観 白色の無定形結晶 ２ 融点 174〜176℃（分解） ３ 元素分析値 炭素 57.01％ 水素 5.62％ 窒素 7.09％ ４ 紫外部吸収スペクトル 第１図に示すようにメタノール中での極大吸
収は222nm（Ｅ^１％_１cm＝960）、258nm（sh）、
265nm（Ｅ^１％_１cm＝228）、284nm（Ｅ^１％_１cm＝174）
、
294nm（Ｅ^１％_１cm＝192）である。また、酸、アル
カリによるシフトは認められない。 ５ 赤外部吸収スペクトル 臭化カリウム錠中で測定したSF―2140物質
のスペクトルは第２図に示されている。 ６ 分子量 質量分析より分子量は360である。 ７ 分子式 分析値とマススペクトルよりC₁₈H₂₀N₂O₆・
H₂Oと推定される。 ８ 核磁気共鳴吸収スペクトル 重クロロホルム中で測定した100MHz、Ｈ―
NMRのスペクトルは第３図に示されている。 ９ 比旋光度 〔α〕^２０ _Ｄ＝＋59゜（C₁メタノール） 10 溶解性 アセトン、ジメチルスルホキシドに溶解し、
メタノール、酢酸エチル及びクロロホルムにわ
ずかに可溶で、ヘキサン及び水に実質的に不溶
である。 11 シリカゲル薄層クロマトグラフイ―のRf値 クロロホルム―メタノール （５：１） 0.53 酢酸エチル―ベンゼン （２：１） 0.31 アセトン―ベンゼン （２：１） 0.82 12 呈色反応 レミユー硫酸の呈色反応：陽性 ニンヒドリン反応：陰極 13 安定性 酸性から中性において安定であるがアルカリ
性では不安定である。 14 中性物質である。 次にSF―2140物質の各種微生物に対する抗
菌活性を第１表に示す。

【表】

【表】 寒天稀釈法
以上の生物学的性状、理化学的性状を有する
SF―2140物質は文献上これに該当するものがな
く新規物質と判定するに至つた。 即ち、紫外部吸収で既知物質と比較したとこ
ろ、極大吸収が一致する既知物質はないが、吸収
パターンで比較的似ているものとしてはトリエニ
ン（ジヤーナル・オブ・アンテイバイオテイツク
ス、21巻、611〜615、1968年）、マイコトリエニ
ン（ジヤーナル・オブ・アンテイバイオテイツク
ス20巻329〜333、1967年）があげられるが、元素
分析値、分子量がSF―2140物質と大きく異なる
上に、黄色物質であることからも本物質とは明瞭
に区別される。又、SF―2140物質の分子式
C₁₈H₂₀N₂O₆に一致する既知物質はないが、比較
的近い抗生物質としてはキナマイシンＡ，Ｂ，
Ｃ，Ｄ（ジヤーナル・オブ・アンテイバイオテイ
ツクス24巻、353〜359、1971年）が各々
C₂₄H₂₀N₂O₁₀、C₂₀H₁₆N₂O₈、C₂₄H₂₀N₂O₁₀、
C₂₂H₁₈N₂O₉の分子式で示されているが、いずれ
も他の性状例えば外観、紫外部吸収スペクトル、
核磁気共鳴スペクトル、〔α〕_D、赤外線吸収スペ
クトル等の点において明瞭に区別される。従つて
SF―2140物質はいずれの抗生物質とも明瞭に区
別され新規物質と判定した。 以下に本発明の実施例を示すがこれらは単なる
一例示であつて本発明を限定するものではない。 ここに例示しなかつた多くの変法あるいは修飾
手段を用いうることはもちろんである。 実施例 １ SF―2140株の培養 種菌としてアクチノマデユラ・エスピーSF
―2140株（微工研、微生物受託番号微工研菌寄
第5704号）を用い、種培地として可溶性澱粉
1.0％、グルコース１％、ペプトン0.5％、肉エ
キス0.2％、酵母エキス0.3％、微粉末大豆粉0.2
％、炭酸カルシウム0.2％の培地を用いた。種
菌２〜３白金耳を100ml容３角フラスコ20mlの
上記種培地に接種し、28℃48時間培養した。得
られた種培養をさらに500ml容３角フラスコ80
mlの上記種培地に４mlずつ３本に接種し、28℃
24時間培養した。得られた種培養を500ml容３
角フラスコ50本の各生産培地80mlに４mlずつ接
種した。生産培地組成はグリセリン1.5％、グ
ルコース1.0％、微粉末大豆粉1.5％、酵母エキ
ス0.1％、リン酸一水素カリ0.1％、硫酸マグネ
シウム0.1％、炭酸カルシウム0.2％、塩化コバ
ルト0.0001％（殺菌前PH7.0）である。培養は
28℃96時間振盪方式で行なつた。培養終了後、
ケイソウ土を助剤に用いて過し、培養液
3.2を得た。 ２ SF―2140物質の精製 実施例１で得た培養液3.2をダイヤイオ
ンHP―20（三菱化成(株)製）300mlの塔に通し、
有効成分を吸着させた。１の水で洗浄後、50
％アセトン水で溶離させた。200ml分画で２〜
４番目の画分に有効物質が溶離されてくる。こ
の活性フラクシヨンを合し、減圧下で濃縮しア
セトンを除去した。 この濃縮液（300ml）を１規定苛性ソーダで
PH8.0に調整後、300mlの酢酸エチルを加えて有
効物質を抽出した。この抽出液を減圧下で濃縮
し乾固するとオイル状物質が443mg（純度約８
％）得られた。このものを３mlのメタノールに
溶解させた後、50mlのヘキサンを加えて氷冷下
に１時間放置すると有効成分は沈澱した。上澄
みを除去した後、沈澱物をクロロホルム―メタ
ノール（３：１）の混液３mlに溶解させ、シリ
カゲルＣ―200（和光純薬工業社製）100mlのカ
ラムに負荷し、クロロホルム―メタノール
（30：１）混液で展開すると15ml分画で14〜19
番目の画分に有効物質が溶出された。この活性
フラクシヨンを合し減圧下で濃縮乾固すると、
SF―2140物質の粗粉末が152mg（純度約35％）
得られた。 この粗粉末152mgを0.5mlのメタノールに溶解
させ、シリカゲルの薄層クロマトグラフイ（メ
ルク社製、F254、20cm×20cm）２枚に付し、
展開溶媒酢酸エチル―ベンゼン（２：１）で３
時間展開した後、SF―2140物質の部分をかき
とり酢酸エチル50mlで２回抽出した。この抽出
液を減圧下で濃縮乾固すると高純度のSF―
2140物質が38mg（純度約90％）得られた。 このSF―2140物質30mgを２mlのメタノール
に溶解させ、予めメタノールで充填したセフア
デツクスLH―20（フアルマシアフアインケミ
カルズ社製）150mlのカラムに負荷しメタノー
ルで展開すると、５ml分画で18〜21番目の画分
に活性フラクシヨンが得られた。この活性フラ
クシヨンを合し減圧下で濃縮乾固するとSF―
2140物質が白色粉末として12mg得られた。この
ようにして得られた。SF―2140物質を熱メタ
ノールに溶解し、一晩放置するとSF―2140物
質の白色の結晶が８mg得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図はSF―2140物質のメタノール中での紫
外部吸収スペクトルである。第２図はSF―2140
物質の臭化カリウム錠中での赤外部吸収スペクト
ルである。第３図はSF―2140物質の重クロロホ
ルムで測定した100MHz核磁気共鳴スペクトルで
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の特性を有するSF―2140物質： 組成が重量比で炭素57.01％、水素5.62％、窒
   素7.09％であり、分子量は、質量分析から360で
   ある。メタノール中での紫外部吸収スペクトルは
   第１図に示すように222nm、258nm、265nm、
   284nm、294nmに極大吸収を有し、第２図に示す
   赤外部吸収スペクトルを示す。外観は白色の結晶
   であり、アセトン、ジメチルスルホキシドに溶解
   し、メタノールにわずかに溶解し、ヘキサン、水
   に実質的に不溶である。シリカゲル薄層クロマト
   グラムのRf値は展開溶媒クロロホルム―メタノ
   ール（５：１）で0.53であり、アセトン―ベンゼ
   ン（２：１）で0.82であり、酢酸エチル―ベンゼ
   ン（２：１）で0.31であり、レミユー硫酸の呈色
   反応は陽性、ニンヒドリン反応は陰性である。メ
   タノール中での比旋光度が［α］^２０ _Ｄ＝＋59゜であ
   り、安定性は酸性から中性において安定である
   が、アルカリ性で不安定な抗菌物質である。 ２ アクチノマデユラ属に属するSF―2140物質
   生産菌を培養し、培養物からSF―2140物質を採
   取することを特徴とするSF―2140物質の製造
   法。