JPS6231917B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は微生物を培養してＬ−プロリンを製造
する方法に関する。 Ｌ−プロリンの発酵法による製造法としては、
ブレビバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、
クルチア属、バチルス属またはサツカロマイセス
属に属し、栄養要求性を有するＬ−プロリン生産
菌株を培養してＬ−プロリンを生産する方法（特
公昭43−11751、同48−38876、同44−26911、同
44−1198、同44−1193、同44−6631号公報参照）
が知られている。栄養要求性の性質を有しないＬ
−プロリン生産菌株を用いる方法としては、ミク
ロコツカス属細菌をアンモニウムイオン、塩素イ
オンを一定濃度以上含有する培地で培養する方法
（特公昭46−38557号公報参照）、またミクロコツ
カス属、パラコロバクトラム属細菌をMgイオン
もしくはMnイオンを一定濃度以上含有する培地
で培養する方法（特公昭43−13679号公報参照）
が知られている。またブレビバクテリウム属、コ
リネバクテリウム属のサルフア剤耐性のＬ−プロ
リン生産菌株を培養する方法（特公昭51−40158
号公報参照）等が知られている。 これらの方法については、栄養要求性株を用い
る方法は、培地に栄養物質を添加せねばならず、
また金属塩もしくはアンモニウムイオン、塩素イ
オンを添加する方法においてはこれらの塩をある
一定濃度以上添加することにより微生物の生育が
抑えられ、発酵時間が長くなり、またＬ−プロリ
ンの分離精製工程が複雑であるなどの工業的に不
利な点がある。 本発明者らはＬ−プロリン生産能を有しない細
菌に３・４−デヒドロプロリン耐性を付与するこ
とにより、栄養要求性、サルフア剤耐性を有せず
とも、また金属塩、アンモニウム塩、塩素イオン
を一定濃度以上添加した特殊な培地を用いなくと
も、Ｌ−プロリン生産能の高い菌株が得られるこ
とを見出し、この知見に基き本発明を完成した。 次に本発明を詳細に説明する。 即ち、本発明によれば、アースロバクター属に
属し、プロリンアナログに耐性を有し、Ｌ−プロ
リン生産能を有する微生物を炭素源、窒素源およ
び他の栄養物質を含有する培地に培養し、生成し
たＬ−プロリンを採取することによりＬ−プロリ
ンを製造することができる。 本発明を実施するに当つて用いられる微生物と
しては、アースロバクター属に属する細菌でプロ
リンアナログに耐性を有する菌株より選ばれるＬ
−プロリン生産能を有する菌株があげられるが、
さらに栄養要求性、薬剤耐性等を併せ有する菌株
も使用できる。プロリンアナログ耐性株を得るた
めの変異誘導法としては、紫外線照射、Ｘ線照射
あるいは薬剤処理（例えばニトロソグアニジン、
エチルメタンスルフオネート等）により行なう他
に自然変異によつても得られる。 本発明実施例で用いる菌株の変異操作をさらに
詳細に述べる。親株をブイヨン培地で一夜振とう
培養後集菌し、トリス−マレート緩衝液（硫酸ア
ンモニウム１ｇ／、硫酸マグネシウム・７水塩
0.1ｇ／、塩化カルシウム・２水塩５mg／、
硫酸第一鉄・７水塩0.25mg／を含むPH6.0、
0.05M、トリス・マレイン酸緩衝液）で洗浄した
後、ニトロソグアニジン１mg／mlを溶かした同緩
衝液に懸濁し、30分間28℃で静置後直ちに同緩衝
液で２度洗浄し、次いでブイヨン培地にその懸濁
液を植菌し60分間28℃で振とう培養を行ない、集
菌後トリス・マレート緩衝液で一度洗浄後、３・
４−デヒドロプロリンを含む表−１に記載の組成
の寒天平板培地上に適当量散布し、生じてくるコ
ロニーを３・４−デヒドロプロリン耐性株として
取得した。このとき、寒天平板培地の炭素源とし
ては、グルコースを用いるが、３・４−デヒドロ
プロリンの使用量を節約する目的でグルコースの
代りに乳酸、コハク酸、グリセロール等を用いる
ことも可能である。 かくして得られる３・４−デヒドロプロリン耐
性を有し、かつＬ−プロリン生産能を有する菌株
としては、コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13032より変異誘導されたH2650（微工研
菌寄第4961号）、コリネバクテリウム・アセトア
シドフイルムATCC13870より変異誘導された
H2595（微工研寄託受理番号第4962号）、ブレビ
バクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC13869より変異誘導されたH2647（微工研
寄託受理番号第4964号）、アースロバクター・シ
トレウスATCC11627より変異誘導されたH2649
（微工研寄託受理番号第4963号）が例示され、こ
の例示の菌株の３・４−デヒドロプロリン耐性の
程度についての実験結果を表−１に示す。

【表】 実験方法 培地：炭素源10ｇ／、リン酸−カリウム１ｇ／
、リン酸二カリウム３ｇ／、塩化アンモニ
ウム４ｇ／、尿素２ｇ／、硫酸マグネシウ
ム・７水塩0.4ｇ／、硫酸第一鉄・７水塩
0.99mg／、硫酸亜鉛・７水塩0.88mg／、硫
酸銅・５水塩0.3mg／、塩化マンガン・４水
塩、0.072mg／、ホウ酸ナトリウム・10水塩
0.88mg／、寒天20ｇ／、PH7.2 培養：寒天培地に上記菌株を塗布し28℃で30時間
培養 判定：〓 十分生育 ± 僅かに生育 ＋ 生育 − 生育せず なお、本３・４−デヒドロプロリン耐性菌株は
いずれもサルフア剤に対する感受性については親
株と同様であり、耐性を有していない。 本発明におけるプロリンアナログとしてはプロ
リンの構造アナログであつて、３・４−デヒドロ
プロリン、ハイドロキシプロリン、アゼチジン−
２−カルボキシリツクアシツド、プロリンハイド
ロキサメート、Ｄ−プロリン等のアナログが使用
可能である。 本発明における微生物を培養してＬ−プロリン
を生産せしめる培地としては実施例に示す如く、
炭素源、窒素源、無機物、その他使用菌株の必要
とする微量の栄養素を程良く含有するものであれ
ば合成培地および天然培地のいずれも使用可能で
ある。培地に使用する炭素源、窒素源は使用菌株
の利用可能なものならばいずれの種類を用いても
よい。即ち、炭素源としては、グルコース、フラ
クトース、シユクロース、マルトース、マンノー
ス、ソルビトール等の炭水化物、糖アルコール、
グリセロール、殿粉、殿粉加水分解物、糖蜜など
が使用でき、また酢酸、ピルビン酸、乳酸、フマ
ール酸、グルコン酸などの有機酸、およびグルタ
ミン酸、アスパラギン酸などのアミノ酸類、ある
いはエタノールなどの低級アルコールも使用可能
である。 窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン
酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種無
機および有機アンモニウム塩類、あるいはグルタ
ミン酸、アスパラギン酸などのアミノ酸類、ある
いは尿素および他の窒素含有物質ならびにペプト
ン、肉エキス、コーン・スチーブ・リカー、カゼ
イン加水分解物、大豆粕の加水分解物などの窒素
含有有機物等種々のものが使用可能である。 無機物としてはリン酸−カリウム、リン酸二カ
リウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫
酸第１鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウム等
を利用する。 さらに、ビチオン、ニコチンアミド、パントテ
ン酸、サイアミン等の微生物の生育に必要なビタ
ミン類も使用するが、前記のような他の培地組成
に伴なつて培地に供されれば特に加えなくとも良
い。 培養は振とう培養あるいは通気撹拌培養などの
好気的条件下で行なう。培養温度は一般に20〜40
℃が好適である。培地中のPHは中性付近（PH５〜
９）に維持することが高収率を上げるためには望
ましいが、これらの温度、PH条件は本発明に実施
に必須の条件ではない。培養期間は通常１〜５日
間で培地中に著量のＬ−プロリンが蓄積する。 培養終了後、菌体を除去して実施例に示した如
くイオン交換樹脂および活性炭処理等の公知の方
法で培養液からＬ−プロリンが回収される。 次に実施例を示す。 実施例 １ ブイヨンスラントで28℃一夜生育したアースロ
バクター、シトレウスH2649の一白金耳をグルコ
ース５ｇ／dl、ペプトン１ｇ／dl、酵母エキス１
ｇ／dl、塩化ナトウム0.25ｇ／dl、尿素0.3ｇ／
dl、コーン・スチーブ・リカー0.5ｇ／dl（殺菌
前PH7.2）の組成の培地30mlを含む250mlエルレン
マイヤーフラスコに植菌し、28℃、24時間培養す
る。その２mlを、グルコース10ｇ／dl、リン酸一
カリウム0.05ｇ／dl、リン酸二カリウム0.05ｇ／
dl、硫酸マグネシウム・７水塩0.025ｇ／dl、硫
酸アンモニウム２ｇ／dl、ピオチン30μｇ／、
サイアミン塩酸塩５mg／、硫酸第一鉄・７水塩
0.99mg／、炭酸カルシウム２ｇ／dl（殺菌前PH
7.2）の組成の培地20mlを含む250mlエルレンマイ
ヤーフラスコに植菌し、28℃で72時間振とう培養
したところ発酵終了時には培地中4.0ｇ／のＬ
−プロリンが蓄積した。 なお、親株であるATCC11627株を同様にして
培養したがＬ−プロリンの蓄積は認められなかつ
た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アースロバクター層に属し、プロリンアナロ
   グに耐性を有し、かつ、Ｌ−プロリン生産能を有
   する微生物を、炭素源、窒素源およびその他の栄
   養物質を含有する培地に培養し、生成したＬ−プ
   ロリンを採取することを特徴とするＬ−プロリン
   の製造法。