JPS62298571A - Ｌ−システイン塩酸塩１水和物を分離する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 〔産業上の利用分野〕 本発明はＬ−セリンを原料にして得られたＬ−システィ
ンを含む反応液から、Ｌ−システィンを分離する方法に
関する。さらに詳しくは、反応液からＬ−システィン塩
酸塩１水和物として分離する方法に関する。

Ｌ−システィンは酸化に対して不安定な化合物であるた
め、通常塩酸塩として市販されている。

Ｌ−システィン、及びその塩酸塩は、医薬あるいは医薬
原料２食品添加物、化粧品添加物などとして利用されて
おり、特に近年はコールドパーマ液の原料として需要が
伸びているＳ元素含有のアミノ酸である。

〔従来の技術及び発明が解決しようとしている問題点〕
従来Ｌ−システィンの製法としては、（１）天然物から
抽出する方法、（２）有機合成法、（３）発酵法、（４
）酵素法などが知られているが、天然物から抽出する方
法については、原料の供給が不安定であり、且つ、不要
な他のアミノ酸が混入する。また有機合成法においては
り、Ｌ一体の分割を要する。更に発酵法は酵素法より蓄
積量が低いなどの欠点があり、工業的には酵素法が有利
な製法といわれている。

酵素を用いてＬ−システィンを合成する酵素方法として
は、（１）システィン・シンターゼを用いてＬ−セリン
と硫化水素から合成する方法、（２）セリン・スルフヒ
ドラーゼを用いてＬ−セリンと硫化水素またはβ−クロ
ロアラニンと硫化水素から合成する方法などが知られて
いる。また本出願人は、先にＬ−セリンと金属水硫化物
などのスルフィドリル・シンターゼの存在下反応させて
得る方法を出願した（特願昭６０−８４５４５号）。

これらの酵素法を問わず、発酵法２合成法のいずれにお
いてもＬ−システィン含有反応液よりＬ−システィンの
分離においては、反応液の組成が複雑であることと、Ｌ
−システィンの水に対する溶解度が非常に大きいため、
Ｌ−システィン含有反応液より直接Ｌ−システィンとし
て単離、精製することは極めて難しい。

特に酵素法２発酵法においては、反応時のＰＨ調整、反
応後の水溶液からの菌体由来の不純物除去処理により多
量の塩化ナトリウムなどの無機塩が生成する。また反応
時に副生ずるシスチンの混入も避けられない。また高価
な未反応Ｌ−セリンも除去回収する必要がある。

このように１、−システィン含有反応液中には、水溶液
として比較的多量の無機塩、未反応Ｌ−セリン及び副生
シスチンが混入しているため、精製する必要があるが、
Ｌ−システィンの水に対する溶解度が極めて大きいため
、Ｌ−システィンの単離、精製には分離ロスが大きく困
難であった。

そのために、通常Ｌ−システィンを一旦強制的に酸化し
て、比較的水に対する溶解度の小さいＬ−シスチンにし
てしまい、シスチンとして精製。

単離を行ない、その後電解還元などにより精Ｌ　−シス
ティンとして回収する方法も知られている。

しかしながら、一旦生成したシスティンを酸化してシス
チンとし、精製し、さらに電解還元などによりシスティ
ンとする方法は、収率、操作、コストなどの面で極めて
工業的に非効率的であることは一目瞭然である。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、上記のような問題点を考慮し、鋭意検討
の結果、以下の知見を得た。

図−１は、塩酸濃度に対する各温度におけるＬ−システ
ィンの溶解度曲線であり、図−２は、塩酸濃度に対する
各温度におけるＬ−シスチンの溶解度曲線である。また
図−３は、塩酸濃度に対する各温度における塩化ナトリ
ウムの溶解度曲線であり、図−４は塩酸濃度に対する各
温度におけるＬ−セリンの溶解度曲線である。

図−１よりわかるように、Ｌ−システィンは２０℃以上
の温度では、塩酸濃度が１５％付近に達すれば、塩酸水
溶液中では溶解度が急上昇し、２０％濃度付近で最高に
達し、それ以上の濃度になれば急激に溶解度は低下する
。また２０％以上になると温度依存性も大きくなる。逆
に図−２及び図−３よりＬ−シスチン及び塩化ナトリウ
ムともに塩酸濃度が２０％以上となると溶解度がほと大
きな溶解度を有していることもわかった。

本発明は、これらの知見に基づき発明に到達したもので
あり、反応液中に共存するＬ−セリン。

塩化ナトリウム、副生シスチンと、目的生成物のＬ−シ
スティンとの分離においては、これらの塩酸に対する溶
解度が塩酸濃度及び温度により大きく異るのでこれを利
用してＬ−システィンを効率よく単離する方法を見出し
たものである。

即ち、本発明方法はＬ−セリンを原料にして得られた、
Ｌ−シスチン、Ｌ−セリン及び無機塩を含むＬ−システ
ィン反応液に、塩酸を添加して塩酸濃度を１５重量％以
上に調整し、温度を２，０℃以上に保持しながら、Ｌ−
シスチンと無機塩を固液分離した後、分離液を１０℃以
下に冷却して、Ｌ−セリンを溶液側に残し、Ｌ−システ
ィンをり。

−システィン塩酸塩１水和物として単離するＬ−システ
ィンの分離方法である。

本発明のＬ−セリンを原料として得られるＬ？−システ
ィンの製造法においては、酵素反応法が収率も大きく好
ましい方法である。酵素の存在下、Ｌ−セリンにスルフ
ィドリル基化合物を導入して酵素反応によりＬ−システ
ィンを得る場合、上述のように、反応において溶存する
酸素、酵素源由来の金属などの作用により生成したＬ−
システィンの一部が非酵素的にＬ−シスチンとなる。し
たがって本発明では反応時におけるＬ−シスチンの副生
を少なくし、またＬ−システィンの単離時には夾雑する
不純物はより少ない方が望ましいので、そのためには例
えば酵素にトリプトファンシンターゼを用い、スルフィ
ドリル基の導入剤として金属硫化物、金属水硫化物など
を用いずに硫化水素ガスを用いて、還元的ふん囲気を保
ちながら反応を実施するのが好ましいことがわかった。

反応にトリプトファン・シンターゼを使用する場合は、
その至適ＰＩ（は７．５〜９．０の範囲であり、硫化水
素を用いて反応させた場合、硫化水素は酸性ガスである
ためＰＨが低下する。そのため適時アルカリ水溶液を添
加してコントロールする必要がある。その際、添加する
アルカリの種類によっては酵素反応の阻害の程度が異な
り、Ｌ−セリンからＬ−システィンへの転換率が目標に
達しないものもある。例えば、通常用いられているアン
モニアは著しく阻害し、水酸化カリウム、ピロリン酸カ
リウムあるいは水酸化カルシウムなどを用いた場合も若
干その傾向があり、水酸化ナトリウムを用いた場合の転
換率に及ばない。よってＰＨ調整用アルカリとしては水
酸化ナトリウムを用いるのが好ましい。

％の範囲で使用するのがよい。

また反応液中における酵素の使用量は、酵素の使用形態
により異なり、特に制限はなく基質濃度、酵素活性など
の諸条件により変更される。また補酵素であるピリドキ
サールリン酸を微量、例えば液中濃度として１〜５０　
ｐｐｍの範囲で添加することが望ましい。硫化水素を使
用する場合はその使用量は、仕込みＬ−セリンのＬＯ〜
１．３倍モル程度が好ましく、多すぎると系内よりのリ
ークによるロス及びＰＨ調整用の水酸化ナトリウムをむ
やみに使用する結果となり塩化ナトリウムの蓄積が大き
くなるので、好ましくなくまた少なすぎると反応の量論
に不足する。

吹き込み速度は２〜１２時間程度が好ましい。

このようにして得た酵素反応終了液中には、Ｌ−システ
ィン、Ｌ−シスチン、水酸化ナトリウム、未反応Ｌ−セ
リン及び酵素（菌体〕よりなる。

通常酵素反応においては、酵素源として菌体をそのまま
用いられるので酵素反応終了液より菌体除去が行なわれ
る。

本発明方法においてもＬ−システィンを分離する前に除
菌体処理を行うのが好ましく、常法に従い塩酸にてＰＨ
をα５以下にして、Ｌ−システィン、Ｌ−シスチンなど
の菌体以外の成分を溶解せしめ、活性炭などの吸着剤を
Ｌ−システィンに対して２〜１０％添加し、３０分以上
の熱処理を付すことにより菌体を凝集させフロック化し
て固液分離により除去すればよい。

菌体除去後の反応液には、通常Ｌ−システィン約５〜２
０％、Ｌ−シスチン約０．５〜５％、Ｌ−セリン約０．
５〜５％、塩化ナトリウム約３〜１５％、塩酸３％組成
のＰ　Ｈ０，５以下の反応液となる。

得られた反応液は、Ｌ−システィン濃度が約２５％とな
るように濃縮し、本発明方法では濃縮した反応液に好ま
しくは塩酸ガスを塩酸濃度が１５％以上、好ましくは２
０〜３０重量％となるよう吹込み調整する。塩酸濃度が
１５％以下では、含有シスチン及び塩化ナトリウムの完
全な除去はできない。

塩酸ガス吹込み温度は２０℃以上で実施するのがよく、
塩酸濃度が上るにしたがい塩化ナトリウム及びＬ−シス
チンが析出し始める。また塩酸吹込みの反応熱により、
その際温度は７０℃前後まで上昇するが、放置しても別
に差し支えない。

しかしながら塩酸ガス吹込み後析出した塩化ナトリウム
及びＬ−シスチンを引続き分離するためには、分離時の
温度は２０℃以上の温度が必要であり、通常の場合好ま
しくは３０〜４０℃で分離するのが望ましいので、吹込
み時にこの範囲に温度を制御しながら塩酸濃度を上げる
のがよい。分離時の温度が２０℃以下では生成したＬ−
システィン塩酸塩１水和物も同時に析出するので分離ロ
スが大きくなり、また必要以上の温度で分離は、含有不
純物が残存する傾向となり、分離温度は塩酸濃度及び不
純物含量に合わせて適宜決められる。

本発明においては、このようにして塩酸吹込み終了後、
さらに０．５時間以上の同温度で保温し、生じた塩化ナ
トリウム及びＬ−シスチンを固液分離してケーキとして
除いた後、そのろ液を１０℃以下、好ましくは１０〜−
１５℃まで冷却することによりＬ−システィン塩酸塩１
水和物を析出させ、固液分離によりＬ−セリンはろ液と
して回収し、目的物の精し−システィン塩酸塩１水和物
が白色結晶として得られる。

一方、塩酸濃度調整後に固液分離して得られた塩化ナト
リウム及びＬ−シスチンよりなるろ塊は、水を加えて塩
化ナトリウムを溶解し、Ｌ−シスチンを結晶として単離
回収できる。

なおＬ−システィンは比較的容易に酸化されてＬ−シス
チンを生成するので本発明の反応液の処理中にＮ２ガス
シールあるいは還元剤の添加などで酸化防止操作を行な
うことは何ら差し支えなく、むしろ好ましい方法である
。

以下、実施例によって本発明の詳細な説明するが、実施
例中のシスチンの分析方法は公知のガイトンデ（Ｇａ　
ｉ　ｔｏｎｄｅ　）の方法によりシスティン換算で算出
した。

すなわち、１０００〜２０００倍に希釈した被検＆０〜
８．５とし、室温にて１時間放置して含有するシスチン
をすべてシスティンに還元し、酸性ニンヒドリン試薬を
用いて発色させ、吸光度計にて５６０ｎｍの吸光度を測
定する。一方、既知の濃度の標準サンプルを作成し、５
６０ｎｍの吸光度の検量線を作成しておき、本検量線を
もとに被検液中のシスティン＋シスチン濃度を算出した
。また、１，４−ジチオスレイトールによる還元操作を
省略してシスティン濃度の算出を行い、上記システィン
＋シスチン濃度よりシスティン濃度を差し引くことによ
りシスチン濃度は算出した。

実施例 かくはん機及び吹き込み管、排気管つき２００ｍ１容セ
パラブルフラスコにＬ−セリン１０ｇ、ピリドキサール
リン酸２．５ｍ９を加え、イオン交換水にて全容を１０
０ｇとする。３２％ＮａＯＨ液にて反応液のＰＨを８．
０として反応液を４５℃一定に保ち、トリプトファン！
′シンターゼ含有菌体〔エシェリヒア・コリ　ＭＴ−１
０２４２ＣＦＥＲＭＢＰ−２０））を乾燥菌体換算で２
．０ｇ装入する。

硫化水素ガスをボンベより約１０＋ｎ／／分の速度で吹
き込み始め、約４時間で吹き込みを終了する。

（硫化水素の使用量は、対し一セリン約１゜１倍モルで
あった。）吹き込み終了後さらに２時間かくはんを行な
い反応を完結させた。反応中は、３２％ＮａＯＨ液を反
応系内のＰＨが８．０となるようにコントロールしなが
ら添加し、最終的に初期のＰＨ調整を含めて約１５ｇの
３２％ＮａＯＨ液を消費した。

反応終了後の反応液１１３ｇをなるべく均一にサンプリ
ングし、２Ｎ塩酸に溶解後、遠心分離により除菌し、Ｌ
−システィン及びＬ−シスチンの分析を行うと、それぞ
れＬ−システィン＆５６　％（Ｌ−セリンからの転換率
８４．０％）、Ｌ−シスチン０．５０％（Ｌ−セリンか
らの転換率　５．０　　％）であった。

この反応終了後の反応液をかくはん下に３５％塩酸１８
．２．！ｉ＋を加えてＰ　Ｒ，０，，５とし、さらに活
性炭１．０ｇを添加して９０℃で１時間加熱かくはん処
理をした。熱時にヌッチェにて真空ろ過を行ない、除菌
を行なった。

除菌後の反応液を濃縮して反応液量を４５９とし、４０
°Ｇに保温しながらボンペイより乾燥塩酸ガスを吹き込
み、８ｇ（約２７重量％）の塩酸を吹き込み液量を５３
ｐとした後、さらに１時間４０℃に保温、かくはんした
。引続き析出した塩化ナトリウム及びＬ−シスチンの混
合塊をヌッチェにて真空ろ過を行ない分離した。分離し
た混合塊は湿体で７．６９であった。

混合塊を除いたろ液を一１０℃まで冷却、２時間品出し
て真空ろ過によりＬ−システィン塩酸塩１水和物の白色
結晶９．３ｇを得た。回収率は、Ｌ−セリンに対して６
２．０モル％であった。

本旨は純度９９．６％、アッシュ０．０２％、（α）Ｈ
。

＝＋６．５であり、他のアミノ酸は認められず、ＪＩＳ
規格に合格するものであった。

また分離した混合塊を水２０ｍ１に溶解し、水酸化ナト
リウムでＰＨを３程度まであげるとＬ−シスチンの白色
結晶が析出し、本結晶をろ取、洗浄、乾燥し、Ｌ−シス
チン０．９ｇを得た。

【図面の簡単な説明】

図−１は、０℃２２０℃２３０°ｃ、４０℃における塩
酸濃度とＬ−システィンの溶解度との関係図であり、 図−２は、０℃５２０℃１３０°（：、、４０℃におけ
る塩酸濃度とＬ−シスチンの溶解度との関係図であり、 図−３は、θ°Ｇ、　２００Ｇ、　３０℃２４０℃にお
ける塩酸濃度と塩化ナトリウムの溶解度との関係図であ
り、 図−４は、０℃ｌ２Ｏ℃１３０℃２４０℃における塩酸
濃度とＬ−セリンの溶解度との関係図である。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｌ−セリンを原料にして得られた、Ｌ−シスチン
   、Ｌ−セリン、及び無機塩を含むＬ−システィン反応液
   に、塩酸を添加して塩酸濃度を１５重量％以上に調整し
   、温度を２０℃以上に保持しながら、Ｌ−シスチンと無
   機塩を固液分離した後、分離液を１０℃以下に冷却、晶
   出させてＬ−セリンを溶液側に残し、生成したＬ−シス
   ティン塩酸塩１水和物を、分離する方法。
2. （２）塩酸濃度が、２０〜３０重量％である特許請求の
   範囲第１項記載の方法。
3. （３）Ｌ−シスチンと無機塩を分離する温度が、３０〜
   ４０℃である特許請求の範囲第１項記載の方法。
4. （４）Ｌ−セリンを原料にして得られたＬ−システィン
   反応液が、スルフィドリル基導入剤として硫化水素ガス
   を用いて酵素法で得られた反応液である特許請求の範囲
   第１項記載の方法。
5. （５）無機塩が塩化ナトリウムである特許請求の範囲第
   １項記載の方法。