JPS62210998A - 抗生物質ミニマイシンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗菌及び制癌作用を有するヌクレオシド抗生物
質ミニマイシンの製造法に関する。

〔従来の技術〕

ヌクレオシド抗生物質ミニマイシン（Ｍｉｎｉｍｙ−ｃ
ｉｎ）はジャーナル・オプ・アンティビオティクス（Ｊ
ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）　２５
巻４４ページ、１９７２年に記載された公知の抗生物質
であり、放線菌ストレプトミセス８ｐ、　８０４３２　
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ。

８０４３２）により生産される。又本物質はジャーナル
・オプ・アンティビオティクス（Ｊ、Ａｎｔｉ−ｂｉｏ
ｔｉｃｓ）　２４巻７９７ページ、１９７１年に記載さ
れたオキサジノマイシン（Ｑｘａｚｉｎｏ＋ｎｙｃｉｎ
　）と同一物　□質であり、ストレプトミセス・タネサ
シエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔａｎｅｓａ
ｓｈｉｅｎｓｊｓ　ｎｏｖ、　ｓｐ、　）の発酵生産物
である。

〔発明が解決しようとする問題点〕

ヌクレオシド抗生物質ミニマイシンは、抗菌及び制癌作
用が見い出されており、医薬品として期待されているこ
とから、よりすぐれた製法開発のため本物質の新規製造
法の開発が望まれている。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、ストレプトミセス属に属し、核酸系抗生物質
ミニマイシン産生能を有する微生物ストレプトミセス・
Ｓｐ、　ＮＫ８３−０１５３を培地中で培養し、ミニマ
イシンを生成蓄積せしめ、得られた培養液からミニマイ
シンを採取することを特徴とするミニマイシンの製造法
に関する。

この発明で使用するミニマイシン生産菌のうち、発明者
が東京都奥多摩山中の土壌から新たに分離した菌株（Ｎ
Ｋ８３−０１５３株と番号を付す）は次のような菌学的
性質を有する。

■、形態学的性質 （１）胞子形成菌糸ら分枝　：単純分枝＋２）””　　
の形態　：ループないしらせん状 （３）輪生枝の有無　　　　：認められない（４）胞子
の表面構造及び　：平滑、 大きさ　　　　　　　　０．６〜０．７　Ｘ　Ｏ，９〜
１．１μ（５）　　胞子の数　　　　　　：数１０個（
６）胞子の５の有無　　　：偽似胞子の５を認める （７）鞭毛胞子の有無　　　：認められない（８）胞子
柄の着生位置　　：気菌糸上（９）菌核形成性の有無　
　：認められない２、各種培地上の性状および生理学的
性質下記の各培地上の性状は特記しない限り２７°Ｃで
１０〜１４日間培養後の観察である。

尚、色の記載については日本色彩研究所１９５１年出版
０「色の標準」を用いた。

＊）２０℃、〜３週間 ＊＊）　３７°Ｃ，３週間 ＊＊＊）培養３日目頃”よ、り気菌糸の先端がループな
いしらせん状を呈し、７日目頃から胞子数１０個からな
るポール状を呈し、偽似胞子の５を形成。

３、生理学的性質 （１）生育温度範囲 ＝１０〜３７°Ｃ１最適温度２７°Ｃ０（２）　　ゼラ
チンの液化〔グルコース・ペプトン・ゼラチン培地（２
７°Ｃ）、及び１５％単純ゼラチン培地（２０°Ｃ）） ：共に液化は認められない。

（３）　　デンプンの加水分解性〔スターチ寒天培地（
Ｗａｋｓｍａｎ　−２Ｌ　２７°Ｃ）及びスターチ・ア
ンモニウム寒天培地（２７°Ｃ）） ：共にデンプンの加水分解は認められる。

（４）　　脱脂粉乳の凝固・ペプトン化（３７°Ｃ）：
凝固は認められない。ペプトン化は１０日目頃からはじ
まり、比較的弱い。

（５）　　メラニン様色素の生成〔チロシン寒天培地（
２７°Ｃ）及びペプトン・イースト・鉄寒天培地（２７
°Ｃ）） ：メラニン様色素はごく薄い黒色を呈する。

（６）　　硝酸塩の還元性（２７°Ｃ）：還元性は認め
られない。

４、各炭素源の資化性（プリドハム・ゴツトリーブ寒天
培地上、２７°Ｃ） （１）　　グルコース　　　　　　＋ （２）Ｌ−アラビノース　　　− （３）Ｄ−キシロース　　　　− （４）　　シュクロース　　　　　− （５）イノシトール　　　　　− （６）Ｄ−マンニトール　　　＋ （７）　　ラフィノース　　　　　− （８）　　ラムノース　　　　　　− （９）Ｄ−フラクトース　　　（田 ＋：よ（利用する。　−：利用しない。

注：　（−１−１はおそらく＋ ５、細胞壁組成 ＬＬ−ＤＡＰ　（ジアミノピメリン酸）、グリシンの存
在が認められる。

以上の性状を要約するとＮＫ８３−０１５３株はストレ
プトミセス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓン属に属し、
気菌糸は輪生枝が認められず、ループないしらせん形成
が認められる。菌糸の先端は胞子１０個以上から成るボ
ール状を呈し、偽似胞子の５の形成が認められる。胞子
の表面は平滑である。

種々の培地上で発育は無色からうす黄茶、気菌糸は白〜
明るい茶入な呈し、溶解性色素は認められないかあるい
は巣色味をおびる程度である。

メラニン様色素の生成は陰性であり、蛋白分解力は認め
られず、またスターチの氷解性は弱い方である。硝酸塩
の還元性は認められない。これらの性状よりワックスマ
ン著ザ・アクチノミセテスの第２巻（１９６１年）、シ
ャーリングおよびゴツトリーブのインターナショナル・
ストレプトミセス・プロジェクトの報告（１９６８年、
１９６９年および１９７２年）とバージェズのマニアル
・オプ・デターミネイティブ・バクテリオロジー第８版
より検索するとＮＫ８３−０１５３株に特に近縁するも
のとしてストレプトミセス・ヒグロスコピクス（３ｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ　）
、ストレプトミセス・バーソビエンシス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏ−ｍｙｃｅｓ　ｖｏｒｓｏｖｉｅｎｓｉｓ　）、スト
レプトミセス・ムリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　
ｍｕｒｉｎｕｓ　）　、ストレプトミセス・クレストマ
イセチカス（３ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｈｒｅｓｔ
ｏｍｙｃｅ−ｔｉｃｕｓ　）およびストレプトミセス・
タネサシエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔａｎ
ｅｓａｓｈｉｅｎｓｉｓ）が挙げられるが、ＮＩ（８３
−０１５３株はこれらの菌株と以下の諸点において異な
る。

（１１ストレプトミセス・ヒグロスコピクス各種培地上
の気菌糸の色は黄色。グルコース・アスパラギン寒天培
地で可溶性色素を産生しない偽似胞子の５を認めない。

糖の資化性はＬ−アラビノース、Ｄ−キシロース、シュ
クロースおよびイノシトールを利用する。

硝酸塩の還元性は陽性。

（２ストレフトミセス・バーソビエンシス各種培地上の
気菌糸の色は白ないし黄茶色を呈し、可溶性色素を産生
じない。また偽似胞子のうを認めない。抗生物質はオキ
シテトラサイクリｙ　（０ｘｙｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎ
ｅ　）を産生。

（３）　　ストレプトミセス・ムリナス各種培地上の気
菌糸の色は灰色ないし赤色を呈する。可溶性色素は黄色
を呈し、偽似胞子のうを認めない。糖の資化性はＤ−キ
シロースを利用する。抗生物質はアクチノマイシ７　Ｘ
　（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ　Ｘ　）を産生。

（４）　　ストレプトミセス・クレストマイセチカス各
種培地上の気菌糸の色は黄ないし白色を呈する。またオ
ートミール寒天培地上で緑色ないし白色を呈する。偽似
胞子の５を認めない糖の資化性ばＬ−アラビノースを利
用する。

硝酸塩の還元性は陽性。抗生物質はクレストマイシ７　
（Ｃｈｒｅｓｔｏｍｙｃｉｎ　）を産生。

（５）　　ストレフトミセス・タネサシエンシス気菌糸
の分枝は直状ないし曲状であるが偽似胞子のうは認めら
れない。糖の資化性はＤ−マンニトールを利用しない。

ゼラチンの液化は陽性、メラニン様色素の生成は陽性。

尚、本菌株ＮＫ８３−０１５３は上記記載した如くスト
レプトミセス属に属し、シュクロース硝酸塩寒天培地上
で偽似胞子のうを形成することを特徴とする。文献ジャ
ーナル・オプ・アンティビオティクス（Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　Ａｎｔｉｏｔｉｃｕｓ　）　１９７２年、２５
巻、４４頁に報告されている抗生物質ミニマイＶ　ン（
Ｍｉｎｉｍｙｃｉｎ　）の生産菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ　ｓｐ＋８０４３２は日本特許公告、昭４９−４４
３４８によるとストレプトミセス・ヒグロスコピクス（
ジエンセン）ワクスマン・アンド・ヘンリッチト同定さ
れている。

本菌株はシュクロース・硝酸塩寒天培地上で気菌糸を着
生しないが、ＮＫ８３−０１５３株は白へ明るい茶入の
気菌糸を着生し、走査型電子顕鏡の所見では気菌糸の先
端が胞子１０個以上からなる球状ないしポール状を呈し
、偽像胞子のうを形成する点、また糖の利用性において
ストレプトミセス　Ｓｐ、８０４３２株はＬ−アラビノ
ース、Ｄ−４シロース、シュクロースおヨヒイノシトー
ルを利用するが、ＮＫ８３−０１５３株は利用しない点
が大きな相異点である。またジャーナル・オプ・アンテ
ィビオティクス１９７１年、２４巻、７９７ページに記
載されている抗生物質オキサジノマイシン（Ｑｘａｚｉ
ｎｏｍｙｃｉｎ　）の生産菌ストレプトミセス・タネサ
シエンシ、ｉ、　（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔａｎ
ｅｓａ−ｓｈｉｅｎｓｉｓ　）は日本特許公報、昭４８
−１６１９８によると各種培地上の気菌糸は直状あるい
は曲状を有し、束状態（クラスター）を形成すると記載
されているが、ＮＫ８３−０１５３株は気菌糸の先端が
ループ状ないし、らせん状を形成、する。特にシュクロ
ース・硝酸塩寒天培地上における気菌糸の走査型電子顕
微鏡の所見では培養がすすむにつれて気菌糸の先端が胞
子１０個以上からなるボール状を呈し、偽像胞子のうの
形成が観察され、この点がストレプトミセス・タネサシ
エンシスと大きく相異する。また糖の利用性においてマ
ンニトール、フラクトースを利用しないが、ＮＫ８３−
０１５３株は両者を利用する。さらにメラニン様色素の
生成およびゼラチンの液化についても両菌株は相異する
。

以上の相異点からＮＫ８３−０１５３株はストレプトミ
セス属に属する一菌株、ストレプトミセスｓｐ、ＮＫ８
３−０１５３と命名し、工業技術院微生物工業技術研究
所に申請書受託番号、微工研菌与第７３１７号（ＦＥＲ
Ｍ　Ｐ−７３１７）と寄託されている。

この発明で使用するストレプトミセス　５ｐＮＫ８３−
０１５３株は例えば紫外線、　ＣＯ等の照射処理、ナイ
トロジェンマスタード、アザセリン、亜硝酸、Ｎ−メチ
ル−Ｎ′−二トローＮ−二トロングアニジン（ＮＴＧ）
、２−アミノプリン等の変異誘起剤による変異処理、形
質導入、形質転換、細胞融合等の通常用いられる変異処
理手段によってミニマイシンの生産能力を高めることが
できる。

この発明によるミニマイシンの生産は菌株ＮＫ８３−０
１５３を培地にて培養することにより行われる。培養方
法は原則的には放線菌の培養方法に準するが、通常は液
体培養による深部培養法が有利である。培養に用いられ
る培地としては、菌株ＮＫ８３−０１５３が利用する栄
養源を含有する培地であればよい。

本発明により、ミニマイシンを製造するには、先ず前記
菌株を放線菌が利用し得る栄養物を含有する培地で好気
的に培養する。栄養源として゛　は、従来から放線菌の
培養に利用されている公知のものが使用でき、例えば、
炭素源としてはグルコース、ガラクトース、マンニトー
ル、テキストリン、澱粉、水飴（澱粉麦芽糖化物）、大
豆油など単独または組み合わせて用いることができる。

無機および有機窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、６Ｉ［ソーダ
ー、ペフトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コー
ン・スチープ・リカー、大豆油カス、オートミール、カ
ザミノ酸、バクトソイトン、ソリプル・ベジタブル・プ
ロティンなど単独または組み合せて用いることができる
。その他必要に応じて食塩、硫酸マグネシウム、硫酸銅
、硫酸亜鉛、塩化マンガン、炭酸カルシウム、燐酸塩な
どの無機塩を、加えることができるほか、本菌の生育や
ミニマイシンの生産を促進する。有機物、例えば、核酸
類、アミノ酸類、ビタミン類や無機物を適当に添加する
ことができる。培養中発泡が著しい時゛には、例えば大
豆油、亜麻仁油等の植物油や東邦隘１（東邦化学社製）
、シリコンＩ（Ｍ−７０（信越化学工業社製）等の石油
系消泡剤を適宜添加すればよい。培養温度は２５°〜３
０°Ｃ１ｐＨは中性ないし微酸性で培養を行うことが望
ましい。液体培養では通常３〜６日間培養を行うと抗生
物質ミニマイシンが培養液中に生成蓄積される。培養液
中の生成量が最大に達したとき培養を停止し、菌体な沢
別し、得られた培養沢、液より目的物を精製、単離する
。

培養Ｐ液より本物質の精製、単離には一般に微生物代謝
生産物をその培養液から単離するために用いられる分離
精製の方法が利用される。

ミニマイシンは水、メタノール、ジメチルスルホキサイ
ドに溶けるがアセトンをはじめとする一般有機溶媒に不
溶ないし溶けにくい物質で、その精製にはいわゆる核酸
系抗生物質の精製に用いられる方法により行われる。す
なわち活性炭末あるいはダイアイオン■ＨＰ−２０など
の多孔性吸着樹脂による吸脱着法、アビセル■、セファ
デックス■Ｇ−１０、セファデックス■ＬＨ−２０、イ
オン交換セファデックス■等を適当に組み合わせて用い
ることができる。

例えば、培養ｒ液（ｐＩ４６．０）を活性炭末に吸着さ
せ、水洗後５０チアセトン水で溶出し、活性区分を濃縮
後凍結乾燥する。得られた茶褐色の粗粉末をメタノール
で不溶部を除去し、可溶部を乾燥後水に溶かし、活性炭
末カラムに吸着後シ水および５０チアセトン水によるア
セトンの直線濃度勾配溶出法により溶出し、活性区分を
濃縮後凍結乾燥する。得られた薄茶色のミニマイシンを
含有する粗粉末を少量の水に溶かし、アビセルのカラム
に充填した後含水プロパツールにて展開し、水含有量を
段階的にたかめることにより溶出し、活性区分を濃縮後
凍結乾燥する。

次にこの精製粉末をＳＰセファデックス■Ｃ−２５（Ｎ
ａ＋）のカラムに充填し、食塩による直線濃度勾配法に
より溶出し、活性区分を集め、脱塩した後、濃縮、凍結
乾燥する。この無色の精製粉末を少量の水にて処理する
ことによりミニマイシンの針状結晶が得られる。

実施例１゜ ロータリー型振盪用５００容三角フラスコに溶性澱粉２
％、グルコース０．５％、プロリッチ（味）素社製）０
．５％、ペプトン（極東製薬工業社製）０．５％、酵母
エキス（犬五栄養化学社製）０．５％、燐酸第２力ＩＪ
０．０！ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５％の培
地（ｐＨ７，２）に炭°酸カルシウム０．２％を別途添
加したもの１００ｍ１を分注し、１２０°Ｃ，２０分間
オートクレーブ滅菌した。上記シード培地にＮＫ８３−
０１５３（微工研、　菌寄第７３１７号）の１白金耳を
接種し、２７°Ｃ１１８０回／分、２日間培養した。

これとは別にロータリー型振盪機用５００ｍ１容三角フ
ラスコに、麦芽水飴（場内食品工業社製）５゜０チ、ポ
リペプトン（大玉栄養化学社製）０．５俤、酵母エキス
（大玉栄養化学社製）０．３チ、肉エキス（ミクニ化学
社裂）０．５％、食塩０．３％、硫酸マグネシウム１１
７水塩０．０５％の培地（ｐＨ７，０）　１００　ｍｌ
を分注し、１２０’Ｃｌ２Ｏ分間オートクレーブ滅菌し
たフラスコＫ　前記培養液２ｍｌを無菌的に移植し、２
７°Ｃ，１８０回／分の条件下で５日間振盪培養した。

培養液はｐＨ６，０で菌体をＰ別し、Ｆ液９．７ｔを得
た〔培養力価はバチルス・ズプチルス（１３ａｃｉｌｌ
ｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）　ＰＣＩ　２１９を被検菌とす
るペプトン寒天平板によるカップ法にて行い、培養Ｐ液
をＩＵ／ｍｌとした〕。活性炭末６００ｍ１　を充填し
たカラムに上記Ｐ液を通しミニマイシンを吸着させ、水
洗後水および５０％アセトン水、各１５００ｍｌよりな
るアセトンの直線濃度勾配溶出法にて溶出した。活性区
分を集め、減圧下で濃縮し、凍結乾燥することにより茶
褐色の粗粉末２２．０１ｇ（０，２４０／ｍｇ）を得た
。次にこの粉末を５００ｍ１のメタノールで処理し、不
溶部を除去した後、可溶部を減圧下で乾燥し、茶色の粗
粉末２．８７、　ｇ　（１，Ｉ　Ｕ　７ｍｇ）を得た。

これを４０ｍ１の水に溶かし、活性炭末２００ｍ１Ｏカ
ラムに吸着させ、水洗後、水および５０％アセトン水各
６Ｏ０ｍ１よりなるアセトンの直線濃度勾配溶出法にて
溶出し、活性区分を集め、減圧下で濃縮し、凍結乾燥す
ることにより薄茶色を帯びた粉末１．２２ｇ　（４，Ｉ
　Ｕ／ｍｇ）を得た。次にこの粉末を５ｍｌの水に溶か
し、予めプロパツール：水（９７，５：２．５）で平衡
化したアビセル■８００ｍ１のカラムに充填し、前記溶
媒系１５００ｍｌ、ついでプロパツール：水（９５：５
）１６００ｍｌ、さらにグロパノール：水（９０：１０
）２０００ｍｌで溶出し、活性区分を集め、減圧下で濃
縮し、活性炭末にて脱色後、凍結乾燥することにより７
７．１ｍｇ　（２４，４Ｕ／ｍｇ）の粉末を得た。次に
この粉末４６．０　ｍｇをＱ、　５　ｍｌの水に溶かし
、予め０．０５Ｍの食塩水にて平衡化したＳＰセファデ
ックス■Ｃ−２５（Ｎａ＋）　１７０ｍ１　　のカラム
に充填した後０．０５Ｍの食塩水にて溶出し、活性区分
を集め、脱塩後濃縮、凍結乾燥し、２２．８　ｍｇ（４
１，ＯＵ／ｍｇ　）の無色の粉末を得た。この粉末にご
く少量の水を加え室温たて放置することによりミニマイ
シンの針状結晶を得た。

この結晶の臭化カリウム錠にて測定した赤外吸収スペク
トルの吸収極大値（波数ｃｍ−’　）は３４７５、　３
３７０．、　３０４０．　２９１０．　１８００゜１７
６０、　１７０５．　１６５５．　１５５０．　１４７
０゜１４２０、　１３７５．　１３４０．　１２６５．
　１２１０゜１１９０、　１１３５．　１１００．　１
０６０．　１０４５゜９８５、　９７０．　９５０．　
９３５．　９０５．　８７５゜８４５．８１５，７７５
，７５５．７００を示し、ジャーナル・オプ・アンティ
ビオティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｉ
ｏｔｉｃｓ　）　１９７２年１、第２５巻、４６頁記載
の文献値と一致することが確認された。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ストレプトミセスｓｐ．ＮＫ８３−０１５３を培地に培
   養し、ミニマイシンを生成蓄積せしめ、得られる培養物
   からミニマイシンを分離、採取することを特徴とするミ
   ニマイシンの製造法。