JPS60184390A - 新規抗生物質ｆ−２７０２及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、グルコノバクタ−属の菌株を培養することに
よって得られる新抗生物質Ｆ−２７０２及びその製造法
に関するものである。

本発明者は、名古屋市平針から採取した土壌試料より分
離したグルコ／バクター属に属する微生物を好気的条件
下で培養し、培養液中に強い抗かび作用を有する有効物
質Ｆ−２７０２物質が生産され、蓄積されることを認め
、ついでこの有効物質を純粋に単離し、その性状を検索
した結果、文献未載の新規抗生物質であることを確認し
たので本発明を完成するに至った。

以下、本発明の新抗生物質Ｆ−２７０２及びその製造法
について詳述する。

本発明方法において用いる微生物は、新抗生物質Ｆ　−
２７０２物質を産生する能力を十分有するグルコノバク
タ−に属するもので、例えば本発明者によってグルコノ
バクタ−・オキシダンス・サブエスピーＩＩＦ　２７０
２（ＧＩｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ◆ｏｘｄａｎｓ０ｓ−
ＬＩＩＩＳＩ）−Ｆ−２７０２）と命名された菌株（以
下Ｆ−２７０２株）が用いられる。

Ｆ−２７０２株は工業技術院微生物技術研究所に微工研
菌寄第７４４９号（ＦＥＲＭ　Ｐ−７４４９）として寄
託されている。

また、Ｆ−２７０２株の自然的及び人工的変異株は勿論
、グルコノバクタ−属に属する菌株で新抗生物質Ｆ−２
７０２物質を産生する菌株はすべて本発明方法において
使用することができる。

Ｆ−２７０２株は次の菌学的性質を有する。

（ａ）形態的特徴 （１）ベネット寒天培地及びその液体培地に３４℃、７
日の培養： 電子顕微鏡での観察によると楕円形に近い桿菌で、その
大きさは１．０〜１，５Ｘ０．５〜０．７μである。

３− 尚、培養期間等の条件によっては、種棒状、長糸状、袋
状等の膨大した変形細胞（多形性）が観察される。

また運動性を有し、極性鞭毛をもつ。胞子はなし）。

グラム陰性である。抗酸性は認められない。

（ｂ）以下の培地における生育状態： Ｆ−２７０２株は、通常培地組成に食塩が含まれておら
ず、かつグルツース及び酵母エキス等が含まれている場
合は、２７°Ｃ〜３７℃、３日〜７日で生育良好である
。肉汁培地、肉汁寒天培地、肉汁ゼラチン培地及びリド
マスミルク等には生育できない。

以下、各培地の生育状態を記す。

（１）ベネット寒天平板培養；３４℃、７日培養で生育
良好。集落は゛その表面につやがあり、粘稠性を有した
り（ムコイド型；Ｍ型）、つやのないしわ状（ラフ型；
Ｒ型）を呈したりする。新しい集落はクリーム色〜灰黄
色であるが、培養日数を経ると黄〜茶色になり、同時に
集落の中央が茶褐色になる。また、Ｒ型のものでスウォ
ーミングが観察さ４− れることがある。黄〜茶色の可溶性色素を産生する。

（２）ベネット液体培養；３４℃、３日以上培養すると
表面（液面）に比較的もろい菌の皮膜を形成し、その時
の培養液の濁度はほとんどなく、透明に近い。また、そ
の皮膜は分離し易く、動揺によって容易に雲霧状又は小
塊状に沈降する。

（３）その他の寒天平板培養；以下の培地での３４℃、
１０日培養した時の主な特徴を記す。

［月グルコース・炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）培地： 生育良好で培地中のＣａＣＯ３が溶解される。

黄〜茶色の可溶性色素を産生する。

［２］マンニトール培地：　１ 生育良好だが、可溶性色素は産生じない。

［３１グルタメート培地： 生育はやや劣る。可溶性色素は産生しない。

（ｃ）生理学的性質 （１）硝酸塩の還元　：３４°Ｃ，７日、陰性。

（２）ＭＲテスト　＝３４℃、７日、陰性。

（３）ＶＰテスト　：３４°Ｃ１７日、陰性。

（４）インドールの生成　：３４℃、７日、陰性。

（５）硫化水素　：３４℃、７日、擬陽性。

（６）デンプンの加水分解：３４℃、７日、陰性。

（７）クエン酸の利用：コープ−（Ｋｏｓｅｒ）ノ培地
及びクリステンセン（Ｃ１＋ｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）の培
地：３４°Ｃ１２１日、陰性。

（８）無機窒素源（硝酸塩及びアンモニウム塩）の利用
：３４℃、２１日、陰性。

（９）色素の生成　：３４℃、７日、黄色可溶性（水溶
性）色素生成。

（１０）ウレアーゼ　：３４℃、７日、陰性。

（１１）オキシダーゼ　：３４℃、３日及び７日、陰性
。

（１２）カタラーゼ　：３４℃、７日、陽性（１３）生
育の範囲：５０’Ｃで生育は認められない。

１０℃で生育微弱。至適温度は３４℃〜３７℃。

ｐＨ４，０〜９．０の広範囲にわたって生育する。

ｐＨ２，５では生育が認められないが、ｐＨ３，０で生
育する。至適ｐＨは４．０〜５．０付近である。

（１４）酸素に対する態度：偏性好気性（１５）Ｏ−Ｆ
テスト（ヒューレイフラン法による。）：糖としてグル
コースを用いると好気的に酸を生成する。嫌気条件下で
は無変化（発酵性ではない。） （１６）糖類の酸及びガス生成の有無：糖　類　糟生虞
　ガス生成 １）Ｌ−アラビノース　十　− ２）Ｄ−キシロース　十　− ３）Ｄ−グルコース　十　− ４）Ｄ−マンノース　＋　− ５）Ｄ−７ラクトース　十　− ６）Ｄ−ガラクトース　士　− ７）麦芽糖　＋　− ８）ショ糖　十　− ９）乳　糖　−− １０）トレハロース　−　− １１）Ｄ−ソルビット　−− 】２）Ｄ−マンニット　−− １３）イノジット　−　− ７− １４）グリセリン　−　− １５）澱粉　−− （ｄ）他の諸性質 （１）塩化ナトリウムの耐性 塩化ナトリウム０．５％から１％を含む培地では生育が
悪く、１％以上含む培地では生育しな（１゜ （２）塩化第２鉄反応陽性物質の産生 グルコース及びフラクトースから塩化第２鉄反応陽性物
質を産生する。

（３）アルコールからの酢酸生成の有無２％エタノール
を含む培地を用い、３４℃、１４日で生成しない。

（４）アルコール（エタノール）、酢ｌｌ、乳酸の酸化
の有無 ａ）エタノール；３４℃、２１日で無変化。酸化しない
。

ｂ）酢　酸；３４°Ｃ１２１日でアルカリに変化。

（ＣＯ２に分解）。酸化する。

Ｃ）乳　酸；３４°Ｃ１２１日で無変化。酸化し８− ない。

（５）ジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）の生成の有無 グリセロールを含む培地を用い、３４℃、７日、１４日
、２１日の判定で生成しない。

（６）キ７ンシステム；高速液体クロマトグラフィーに
よる同定。

ユビキノン：コエンザイムＱ−１０をメジャーコンポー
ネント（ｍａ、ｉｏｒ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）としても
つ。

（７）グアニン＋シトシンＧＣ含量：融解温度法価ｅｌ
ｔｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、　Ｔｍ）。

約５７モル％ 以上の諸性質から、Ｆ−２７０２株は、いわゆる酢酸菌
（Ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ）と通称
される菌であることは明らかであるが、この菌類は、バ
ージイズマこユフルオブディターミネイティブバクテリ
オロジイ第８版（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏ
ｆ　Ｄｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌｏｇｙ　８ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　１９７４年）では
、グルコノバクタ−（Ｇ　１ｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）
属及びアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に
分１されている。しかしこれらの属については、近年、
分類学上の諸説があり、帰属に関する困難な問題をかか
えているのが現状である。そして、そのいずれにも該当
しない中間菌株（ｉｎＬｅｒｍｅｄｉａｌ、ｅ　ｓｔ、
ｒ−ａｉｎ）の存在が指摘されて外な。例えば、ジャー
ナルオブシ゛エネラルアンドアプライド　ミクロバイオ
ロジイ：（Ｊ−Ｇｅｎ　Ａｐｐｌ　ＭｉｃｒｏｂｉｏＬ
１０巻。

９５頁〜１２５頁、１９６４年。同、２２巻、２３７頁
〜２４５頁、１９７６年。）インターナショナルジャー
ナルオブシステマティックバクテリオロジイ：（Ｉｎｔ
、、５゜５ｙｓｔ、　Ｂａｃｔ−ｅｒｉｏｌ、　、３０
巻、５４７頁〜５５６頁、１９８０年等。）。

しかし、Ｆ−２７０２株の鞭毛の着生位置及びキノンシ
ステムを特に考慮に入れると、グルコノバクタ−属に帰
属させるのが最も相応しく、また」二記菌学的諸性質を
併せて考慮すると、グルコノバクタ−・オキシダンスに
入れるのが妥当である。そして、上記バージイズマニュ
アル等を参照すると、Ｆ−２７０２株は、酢酸酸化能陽
性、エタノール酸化能陰性、ジヒドロキシアセトン（Ｄ
Ｉ−ｉＡ）生成能陰性、種々の寒天培地での生育状態等
と、抗生物質Ｆ−２７０２物質を産生する能力を併ぜる
と、グルフッバクター・オキシダンスに属する既知菌株
とは明確に区別できる。従って、」１記マニュアルでは
、グルフッバクター・オキシダンスはさらに種々の亜種
が分類されているので、Ｆ−２７０２株をグルコノバク
タ−・オキシダンス・サブエスピーＦ−２７０２と命名
し、既知菌株から区別するのが妥当である。

く抗生物質の製造法〉 本発明の方法を実施する場合、グルコノバクタ−属に属
する抗生物質Ｆ−２７０２生産菌を、抗生物質を生産す
るような以下の方法で培養することができる。例えば、
栄養源としては、炭素源はグルコースが好ましく、窒素
源はペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス等を
用い、さらにアミノ酸（例えば、０．０５％のメチオニ
ン、アスパラギン酸、フェニルアラニン等）を添加して
もよい。

また、菌の発育を助け、抗生物質Ｆ−２７０２物質の生
産を促進するような適当な物質（例えばビタ１１− ミソ類等）を添加してもよい。

培養法としては、一般の抗生物質生産方法と同様である
が、比較的少量の実験室規模では、液体静置培養で、空
気と培養液との接触面をで外るだけ広くした方がよく、
深部培養は適さない。

培養に適するｐＨ１，ｔｐＨ６，０〜８．０、温度は２
７℃〜３７°Ｃであるが、通常＋）Ｈ６，８、温度３４
℃で培養する。

培養日数は４〜１０日であるが、通常、抗生物質Ｆ−２
７０２の生産・蓄積量が安定しているのは、７日前後で
ある（抗生物質Ｆ−２７０２物質は、培養液中に生産・
蓄積される。）。

また、Ｆ−２７０２産生菌が産生する培地中の抗生物質
の検定には、試験菌として、アスペルギルス◆ニが−（
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）を用いた円筒−
平板拡散法を用いる。また、検定液が有機溶媒の場合に
はペーパーディスク法を用いる。試験菌検定用培地はツ
アペック寒天培地を用いるのがよい。

そして、至適のブロス力価が得られた後、濾過又は遠心
分離等により菌体等を培養液から除く。

この場合、抗生物質活性は濾液中に含まれている１２− ので、これを以下に述べるような適当な方法で抽出・精
製する。すなわち、通常用いられる抽出・精製手段が適
応され、例えば、酢酸エチル、クロロホルム、ジエチル
エーテル等の有ｐＨｍ　剤を用いた抽出法（活性物質は
ｒ＋）Ｔ３．Ｏ〜４．０の溶液から有機溶剤に移る。）
と、重曹水又はリン酸緩衝液等の溶液による転溶（活性
物質は有機溶剤からｐＨ７，０〜７．５の溶液に移る。

）をくりかえし、さらにカラムクロマトグラフィ（例え
ば、セファデックスＬＨ−２０．ファルマシア社製、又
はトヨパールＨＷ　−４０Ｆ、東洋ソーダ製を用いたゲ
ル濾過法）を組合せて用いれば抗生物質Ｆ−２７０２物
質を単離することがで外る。

ただ、これらの採取工程で注意すべぎは、この物質が、
アルカリ溶液中で不安定であり、又、酸化され易い等の
性質があるので、この点を留意して採取操作を実施すべ
きである。

以下、本発明方法を実施例によって詳述するが、本発明
方法はこれに何ら限定されるものではない。

実施例 グルツース１％、麦芽エキス０．５％、酵母エキス０．
５％、肉エキス０．５％、ペプトン１％を含有する培地
（５００＋ｎｌ坂ロフラスコ中培地２００ｍ　ｌを含む
。）に、前記Ｆ−２７０２株を接種して、４日間、３４
℃で、好気的条件で静置培養する。同様の組成からなる
培地５００ｍ　ｌを含む１リツトルルーピン（合計１７
本）に前記の前培養した菌液１０ｍ１を各々分注した後
、ルーピンをやや斜口にねかした状態で、３４℃、７日
間、静置培養する。その時の最終ｐＨは、ｐＨ３，０〜
４．０である。その培養液を遠心分離により、面体と培
養濾液とに分離する。得られた濾液８．５リツトルを分
液ロートを用い、１．５リツトルの酢酸エチルで抽出す
る。この抽出溶剤から、活性物質を０．１Ｍ（モル）リ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，５）１リツトルに転溶させ、ＩＮ
（規定）塩酸で、ｐＨ３，５に調整し直す。この水溶液
をさらに５００ｍ１のクロロホルムで再抽出し、前記と
同様に、０．１Ｍ（モル）リン酸緩衝液ＤＨ７，５，５
００ｍ１に転溶し、ｐ、Ｉ（３，５に調整する。この水
溶液を、今度はジエチルエーテル５００ｍ　ｌで抽出す
る。

以上の抽出−転溶操作は分液ロートを用いる。

この活性物質Ｆ−２７０２物質を含むエーテル溶液を減
圧乾固すると約１．００ｍｇの抗生物質Ｆ−２７０２の
橙色相物質が得られる。

これを、２ｍｌのメタノールで溶解して、溶出液にメタ
ノールを用いたセファデックスＬＨ−２０のカラムクロ
マトグラフィー（カラム直径２．５ｃｍ、　長さ６０ｃ
＋ｎ、溶出流速１珀１／分）を実施し、３ｍｌ／試験管
の割合で、溶出液を分画する。各分画液の活性物質の所
在は、シリカゲル薄層（メルク社、シリカゲル６０Ｆ２
５４）クロマトグラフィー；展開溶媒：クロロホルム：
メタノール：ベンゼン：酢酸エチル＝５：４：５：８容
量比；で展開した後、ＵＶランプ（紫外線ランプ）［３
，５６０Ａ］で青白色を呈し、かっ濃硫酸を噴霧すると
、橙色を呈するので確認できる。さらには、前述した検
定法で確認できる。

それによって、各分画が、はぼ活性物質のスポットのみ
の試験管を集めてプールし、減圧濃縮（２ｍｌ）する。

さらに精製するために、今度は溶出液にメタノ１５− 一ルを用いたトヨパール−ＨＷ４０Ｆのカラムクロマト
グラフィー（カラム直径２．５ｃｎ＋、長さ３０ｃｍ、
流速１ｍｌ／分）を実施し、同様に、３ｍ１／試験管の
割合で溶出液を分画する。各分画液の活性物質の所在は
、前記と同様な操作で確認する。ここにおいて、完全に
単一なスポットのみを有する分画をプールし、減圧乾固
すると橙色針状晶の抗生物質Ｆ−２７０２物質が約４０
ｍｇ得られる。

以下、本発明方法によって得られるＦ　−２７０２物質
の理化学的ならびに生物学的性質を述べる。

新抗生物質Ｆ−２７０２物質の理化学的性質及び生物学
的性質： （１）物質の外観：黄橙色の針状晶 （２）塩基性、゛酸性、中性の区別： 酸性物質である。

（３）溶剤に対する溶解性： メタノール、エタノールに易溶。その他、一般の有機溶
剤には難溶又は不溶。水に可溶。

（４）融点：１１９℃以上。（１１９℃より分解）（５
）比旋光度：［α１２．。＝＋１．４０３５°（Ｃ＝０
．７１３、＝１６− メタノール） （６）元素分析 炭素：６４．８８％、水素：５，５２％、窒素、硫黄、
リン、ハロゲンを含まない。

（７）紫外部吸収スペクトル： ”　”　；　３１５ｎｍ、２３５ｎｍ、　２１０ｎｍλ 第１図に示す通りである。

（８）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠を用いた
方法。第２図に示す通りである。

（９）Ｒｆ値ニジリカゲル薄層クロマトグラフィーによ
る方法。

（メルク社製シリカゲル６０Ｆ２Ｓ４　厚さ０．５ｍｍ
使用）スポットは、濃硫酸噴霧後、橙色に呈色すること
で確認する。

溶媒組合せ　容量比　Ｒｆ値 クロロホルム：メタノール：　５：４：５：８　約０．
５ベンゼン：酢酸エチル 酢酸エチル：エタノール　６：４　約０．７ｎ−ブタノ
ール：酢酸：水　３：１：１　約０．９（１０）呈色反
応ニジリカゲル薄層上での呈色ａ、濃硫酸、濃塩酸、又
は７０％過塩素酸を噴霧すると黄乃至橙色を呈す。

ｂ、塩化第２鉄１％水溶液を噴霧すると茶褐色を呈す。

ｅ、２．４−ジニトロフェニルヒドラジン０．５％水溶
液を噴霧すると橙色乃至茶色を呈す。

ｄ、その他エールリッヒのジアゾ反応では、黄橙色を呈
し、エールリッヒ反応では橙紫色を呈す。

（１１）安定性：溶液中では４”Ｃで比較的安定である
が、熱、アルカリ溶液では失活し易い。固形状態では、
−１０℃以下で保存すれば、抗菌活性はほとんど維持さ
れる。酸化され易い。また、シリカゲル薄層クロマトグ
ラフィーで、活性物質を展開し、そのスポットをかきと
り、メタノールで抽出した場合、その活性は全く失う。

しかし、かきとったシリカゲルをそのまま平板にのせて
効力検定した場合は、抗菌活性は残っている。

（１２）分子量；質量分析法で３００付近。

（１３）抗菌スペクトル；適当な寒天培地を用い倍数希
釈法によって、２７℃、５日培養した時の上背阻止最小
濃度をめた結果を次に示す。抗生物質Ｆ−２７０２は、
かび類に特異な生育・阻害活性を示し、ある種の酵母類
には活性を示す。

（以下余白） １４− 供　試　薗　最小阻止濃度ｉ＋ｃｇ／ＩＩｌ　使用培地
Ｆリコフイートン・メンタグロフィテス　１３．７３　
サブロー培地（Ｔｒｉａｈｏｐｈｙｔｏｎ　ｍｅｎＬａ
ｇｒｏｐｌ＋ｙｔｅｓ）　（マルトース４％含有）ペニ
シリウム・クリソゲニウム　２フ＋４６・ノアベ・ツク
培地（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕ＋ｍ　ｅｈｒｙｓｏｇｅｎ
ｕｍ）アスベルギウス・二ｆｆ−１３＋７３−７アベツ
ク培地＜　ＡｓｐｅｒｇＮｌｕｅ　ｎｉｇｅｒ）カンジ
ダ・アルビカンス　２１９．７０　サブロー培地（Ｃａ
ｎｄｉｄｍ　ａｌｂｉａａｎｓ）　（グルコース４％含
有）（以下余白） ２０− 以上、述べた理化学的、生物学的性状を有する本発明の
Ｆ−２７０２物質は、文献上該当するものがなく、従っ
て本物質の新規性は明らかであり、医薬として、特を二
白癖菌に有効に作用し、又、一般抗かび剤、例えば農園
芸用抗かび剤、防腐剤としての有用性が期待で軽る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｆ−２７０２物質の紫外部吸収スペクトルを
示す図、 第２図は、Ｆ−２７０２物質の赤外部吸収スペクＦルを
示す図、 第３図は、Ｆ−２７０２物質の電子顕微鏡写真。（倍率
ｔｏ、ｏｏｏ倍。シリカタングステン酸によるネガティ
ブ染色。楕円形の菌体が中央でくσれ、分裂しかけてい
る。菌体の片方から極性鞭毛が一本認めねれる、Ｆ−２
７０２物質の電子顕微鏡写真。生物の形態を示す。） 出願人　扶桑薬品工業株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の理化学的性質及び生物学的性質を有すること
   を特徴とする新規抗生物質Ｆ−２７０２゜（１）元素分
   析 炭素：８４．８８％、水素：５．５２％、窒素、硫黄、
   リン、ハロゲンを含まない。 （２）分子量：（質量分析法） 約３００ （３）融点：１１９℃以上。（１１９°Ｃより分解）（
   ４）比旋光度：［α］２ｏ”　＝　＋１．４０３５°（
   Ｃ＝０．７１３、メタノール） （５）紫外部吸収スペクトル： （６）赤外部吸収スペクトル：（主な極大値）３４００
   ．３１００−２８００．２７００−２６００．１７００
   ．１６２０゜１５９０、１５２０．１４６０．１３９０
   ．１３３０、＋２８０．１１．４０．１０９０．１０５
   ０．９９０．９６０．９４０．８７０．８２０．７００
   ｃｍ−’（７）溶解性： メタノール、エタノールに易溶。一般の有機溶剤には難
   溶又は不溶。水に可溶。 （８）呈色反応： 濃硫酸、濃塩酸、又は７０％過塩素酸により黄乃至橙色
   を呈す、 塩化第２鉄反応・・・陽性 ２．４−ジニトロフェニルヒドラジンによる反応・・・
   陽性 エールリッヒのジアゾ反応・・・陽性 エールリッヒ反応・・・擬陽性 （９）塩基性、酸性、中性の区別： 酸性物質である。 （］Ｏ）物質の色：黄橙色 （１１）抗菌スペクトル： かび類、酵母類に対して、生育阻害活性を示す。 ２、グルコノバクタ−（Ｇ　１ｕｃｏｎｏｂａｃｔ、ｅ
   ｒ）属に属する抗生物質Ｆ−２７０２生産菌を培養し、
   その培養物から新規抗生物質Ｆ−２７０２を採取するこ
   とを特徴とする抗生物質Ｆ−２７０２の製造法。 ３．グルコノバクタ−（Ｇ　１ｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ
   ）属に属する抗生物質Ｆ−２７０２生産菌が、グルコノ
   バクタ−・オキシダンス・サブエスピー・Ｆ　−２７０
   ２（Ｇ　１ｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　９ｏｘｄａｎｓ　
   φ５ｕｂｓｐ　ＩＩＦ　−２７０２）である特許請求の
   範囲第２項記載の製造法。