JPS59183691A - 固定化リパ−ゼの製造法 - Google Patents

固定化リパ−ゼの製造法

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JPS59183691A
JPS59183691A JP5838583A JP5838583A JPS59183691A JP S59183691 A JPS59183691 A JP S59183691A JP 5838583 A JP5838583 A JP 5838583A JP 5838583 A JP5838583 A JP 5838583A JP S59183691 A JPS59183691 A JP S59183691A
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JP
Japan
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lipase
immobilized lipase
carrier
anion exchange
crosslinking agent
Prior art date
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Pending
Application number
JP5838583A
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English (en)
Inventor
Emiko Kono
恵美子 河野
Hideo Hirohara
広原 日出男
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sumitomo Chemical Co Ltd
Original Assignee
Sumitomo Chemical Co Ltd
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Publication date
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  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、固定化リパーゼの製造法に関する。更に詳し
くはマクロ多孔性フェノールホルムアルデヒド系陰イオ
ン交換樹脂を担体としでキャユ・ディグ・シリンドラッ
セ起源のリパーゼを吸着させた後、さらにこれに多官能
性架橋剤を反応させることによって得られる0℃より高
く60℃以下で長期間安定で、活性が高い固定化リパー
ゼの製造法に関する。
リパーゼは高級脂肪酸と3価のアルコール脂肪酸とアル
コールのエステル結合にも作用の様な観点からリパーゼ
に胸しても工業的操作で使用できる、活性が高く長期間
安定な固定化リパーゼの開発が望まれる。
そこで、本発明者らは、固定化リパーゼの製造法、とり
わけ長期間安定でしかも活性か高い方法について、鋭N
rTiR究の結果、本発明の結合は強固で、反応の際に
担体から容易に性も低いことが多い。
そこで、本発明者らは、0°Cより高<60℃以下で、
長期間安定で、活性が高い固定化リパーゼを得るべく鋭
意研究した結果、本発明を完成するに至ったのである。
すなわち、比表面積が5 m’ / y以上、孔径10
0人ないし、2. OOOXのマクロボアーの細孔容量
の合計が0.2 * / y以上、アミン基あるいは置
換アミノ基に基づく、陰イオン交換容量が1meq /
 y以上あるマクロ多孔性フェノールホルムアルデヒド
系陰イオン交換樹脂を担体としてキャンディダ・シリン
ドラッセ起源のリパーゼを吸着させた後、さらにこれに
多官能性架橋剤を反応させて得られる固定化リパーゼは
、0℃より高<60℃以下で、長期間安定で、活性も高
いことを見いだしたのである。
本発明におけるマクロ多孔性フェノールホルムアルデヒ
ド系陰イオン系交換樹脂は上記の特性を有していれば、
いかなる方法で製造されたものでも良い。公知の方法で
製造できるし、また上記の特性を有するイオン交換樹脂
のいくつかが市販されている。形状はクラニュー状また
はビーズ状であって、その大きさはおよそ1410μ(
12メツシユ)から177μ(80メツシユ)程度のも
のが好ましい。特に好ましいのは590μ(28メツシ
ユ)から177μ(80メツシユ)程度のものである。
あまり大きいと空隙体積が大きくなり、体積あたりの活
性は小さくなる。
−万あまり細かい破片では圧損が大きくなり離が困難に
なったりして好ましくない1、またようなポリエチレン
ポリアミンあるいは四級アンモニウム基等があげられる
本発明におけるリパーゼはキャンディダ・シリンドラツ
セ(Candida cylindracea )起源
のリパーゼであればよく、粗製、精製にかが1OIII
Fないし200〜、好ましくは80 trzないしは1
50■の範囲が経済的である。
本発明における担体へのリパーゼの吸着に際してはp 
H8,5ないし、p H8,0の範囲の緩衝液に溶解し
たリパーゼ溶液に担体を浸漬し、このpH範囲でリパー
ゼを担体に吸着させる。特に好ましいのはp H4,5
〜p H7,5の範囲である。あまりに低いp、Hおよ
び高いpHではリパーゼの失活がおこる。吸着温度は熱
失活がおこらない範囲の温度であればよ)いが実際的に
は5℃ないし45℃の範囲がよい。吸着時間は1時間な
いし15時間でよく、吸着温度が高い場合には短時間で
よい。振盪あるいは攪拌によって行なうのが効率的であ
る。また吸着時に用いる緩衝液に溶解したリパーゼ溶液
量は乾燥担体重量の3倍ないし15倍であれはよく、よ
り好ましくは4倍ないし10倍量である。溶液量があま
り少ないと吸着時の振盪あるいは攪拌によって担体のま
た本発明における多官能性架橋剤としては、例えば、グ
リオキザール、マロンアルデヒド、スクシニルアルデヒ
ド、グルタルアルデヒド、ジアルデヒド澱粉などのポリ
アルデヒド類が好ましく、ジエチルマロンイミド、ジエ
チルアジピンイミドなどのポリイミテ−ト類も使用可能
である。リパーゼ吸着担体への多官能性架橋剤の反応は
p H2,0ないし、p H8,0程度のpH範囲内で
可能であるが、あまりに低いpHあるいは高いpH領域
ではリパーゼの失活がおこる。結局、実際的にはp H
8,5ないしp H7,0の範囲、より好ましくは、p
 H4,0ないしp H7,0のpH範囲内で使用さす
ると、先に吸着したリパーゼが架橋剤との反応中に溶出
することがない。使用する多官能性架橋剤の濃度は、O
,l (w/v )シないし5(w/v)%程度が適当
であり、特に0.2 (w/v )%ないし2(w/v
)%程度が好ましい。多官能性架橋剤の反応温度は、4
5素の脱離がおこりにくいが、多官能性架橋剤の反応性
が劣ることになり、結果的には15℃ないしは35℃が
最も好ましい。多官能性架橋剤を反応させる時間は温度
および濃度によって異なってくるが、0.5時間ないし
、20時間程度である。15°Cないし35℃程度で多
官能性架橋剤を反応させる場合には、1時間ないし6時
間程度で十分である。なお多官能性架橋剤を反応せしめ
た後、高濃度の緩衝液および/あるいは水によって固定
化リパーゼを十分に洗浄し、不充分な結合のために脱離
しやすいリパーゼはすべて除去した方がよい。
以上の様にして視られた、固定化リパーゼはl Oun
it/9−固定化リパーゼ以上の高活性を有し、またこ
れを用いて繰り返し反応をバッチ式で行なったか10回
後の活性低下は数%以下であった。
本発明においては、本発明に用いられた固定化担体、リ
パーゼの起源および固定化法の組み合わせ条件が必要で
ある。1つの条件、を得られるとは限らない、1 次に実施例をあげて、本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明の趣旨を越えない限り、以下の実施例によっ
て限定されるものではない。なお、実施例中に記載され
ているリパーゼの活性測定は、次の方法で行なったもの
である。
オリーブ油PVA乳化液(オリーブ油25%)5+++
t’、O,l M、リン酸M衝液(’pH7,0)させ
、このとき生成した脂肪酸量を滴定によを加え、そこに
固定化リパーゼを適量浸漬し、30℃、30分の反応中
は往復振m(ioOrpm以上、8.5cm以上)させ
、同様にして生成I。
た脂肪酸量を定量する。固定化リパーゼの乾燥重量は次
のように測定する。すなわち反応終了後、固定化リパー
ゼを炉別し、50℃で8時間以上減圧乾燥した後、1.
5時間以上室温(18〜25℃)のデシケータ−中に放
置後型量測定を行ない恒温に達し、ていζことを確認し
た後、この値を固定化リパーゼの乾燥重量とする。固定
化リパーゼの活性はクラム乾燥重量あたりの単位(un
 i t79−固定化リパーゼ)で表示する。
実施例1 キャンディダ・シリンドラッセ起源の乾燥粉末リパーゼ
(6糖り業製p H7,0,30°Cにおける活性が2
00 unit/’〜)4.2yをp H6,0で0−
 Q 5 M濃度のリン酸緩拘液、180絋に溶解した
。この溶液に粒子径が177μないし590μで比表面
積が32rrz79.孔径か1ooXな)L2.000
Xまでのマクロポア−の細孔容量の合計が0..53 
CC/ 、qでアミ7基および置換アミノ基1ご基づく
陰イオン交換容態が7.5 meq/y である多孔性
フェノールホルムアルデヒド、系イオン交換樹脂(市販
のデュオライl−’ A −7樹脂(ダイヤモンド・ジ
ャムロック社製))を302浸濱し温度を30℃に保ち
ながら6時間約120rpmで攪拌しながら吸着を行な
った。
吸着固定化担体を0.05%濃度のグルタルアルデヒド
溶液(p H6,0に調製)15mlに浸漬し、約20
°Cに保ちながら3.5時間120 rpin程度に攪
拌しつつグルタルアルテヒドを反応さぜた。その後イオ
ン交換水で十分に洗浄し出された。得られた固定化リパ
ーゼの活性は30 unit/P  −固定化リパーゼ
であった。
また、この固定化リパーゼを活性測定の同等の条件で、
20回繰り返し、反応を行なったところ、20回目の活
性は1回目の97%であった。
実施例2 実施例1Lご用いたのと同じ乾燥粉末リパーゼ250■
を0.05 M濃度のリン酸緩衝液(pH6,0) l
 5y+/に溶解した。
この浴液に粒子径か177μないし590μで比表面積
が68 = / y 、孔径10oXないし2.000
 >までのマクロポア−の細孔’S量の合計が0.56
CC/g、陰イオン交換容量が4.4meq/7である
マクロ多孔性フェノールホルムアルデヒド系陰イオン交
換樹脂(市販(7)Duolite[相]A−4m脂(
タイヤモンドシャムロツタ社製))3yを浸油し、液温
を30±2°Cに保ちなから、7時間約12 Orpm
で攪拌しながらリパーゼを担体に吸着させた。
−ゼ吸着担体を0.05 (w/v)%濃度のグルタル
アルデヒド溶液16mc(pH6,0)に浸漬し、約2
0℃に保ちながら、3時間12Orpmで攪拌してグル
タルアルテヒドを反応させた。ついで0.2 M濃度の
リン酸緩衝液、およびイオン交換水で十分に洗浄した。
得られた固定化リパーゼ20−をオリーブ油−PVAエ
マルジョン液(1: 8 ) 50−中に浸漬し、25
Orpmで攪拌しながら40℃20時間反応さぜたとこ
る加水分解率8870であった。この固定化リパーゼを
反応後P別し、同条件で再使用を10回くり返したとこ
ろ10回目の加水分解率は86%であ−、た。
手続補正書(自発) 特許庁長官若杉和夫殿 1 事件の表示 2、発明の名称 固定化リパーゼの製造法 3 補正をする者 事件との関係 9寺計ト4.上人 住 所  大阪市東区北浜5丁目15番地明細書の「特
許請求の範囲」および「発明の詳細な説程1」の欄 2、明細書を下記のとおり補正する。
以上 特許請求の範囲 比表面積が5d/f以上、孔径100Aないし2,0O
OAのマクロポア−の細孔容量の合計が0.2 art
 / 1以上、アミノ基あるいは置換アミン基に基づく
陰イオン交換容量が1meq/g以上あるマクロ多孔性
フェノールホルムアルデヒド系陰イオ゛ン交換樹脂を担
体としてキャンディダ・シリンドラッセ(Candid
a  cylindracea)起源のリパーゼを吸着
させtこ後、さらにこれに多官能性架橋剤を反応させる
ことを特徴とする固定化リパーゼの製造法。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 比表面積が5−79以上、孔径100人ないし2. O
    ’00 Xのマクロポア−の細孔容是の合計が0.21
    Ie/9以上、アミン基あるいは置換アミン基に基づく
    陰イオン交換容量がl meq/2以上あるマクロ多孔
    性フェノールホルムアルデヒド系陰イオン交換樹脂を担
    体としてキャシディタ・シリンドラッセ(Candid
    a  ・cylinclracea)起源のリパーゼを
    吸着させた後、さらにこれに多官能性架橋剤を反応させ
    ることを特徴とする固定化リパーゼの製造法、。
JP5838583A 1983-04-01 1983-04-01 固定化リパ−ゼの製造法 Pending JPS59183691A (ja)

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