JPS61257184A - 固定化酵素用担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、新規な固定化酵素用担体に関する。

詳しくは、酵素を担持させた状態で電気透析が可能な固
定化酵素用担体である。

［従来の技術及び発明が解決しようとする問題点］従来
、酵素反応は一級に酵素を水に溶解した状態で基質は作
用させることによって行われていたが、この方法には多
くの欠点があった。特に反応終了液中より酵素のみを変
性させずに回収し、これを再利用することは技術的にも
難かしく、酵素がなお活性を有している場合でさえも、
これを変性失活させて除去し、反応生成物を分離する方
法が採用されているので経済的でない。

そのため、近年、酵素を担体に固定して水に対して不溶
化することにより、反応生成物と酵素の分離を容易にす
ると共に酵素反応を連続的に行う方法が提案されている
。

しかしながら、かかる酵素反応においては、反応生成物
が系内に４ＩＩｔ積し、経時的に酵素の反応活性が低下
するという現象を生じる。そのため、基′質の反応率が
充分上がらず、上記反応を工業的に実施する上での大き
な問題となっていた。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者等は、上記問題を解決すべく研究を重ねた結果
、イオン交換膜に酵素を固定化し、これをイオン交換膜
として電気透析装置の脱塩室に組み込み、該室内で酵素
反応を実施するとともに電気透析を行うことにより、酵
素反応によって生成する電解質を電気透析によって除去
することができ、これによって反応速度の低下を防止し
得ることの知見を得た。かかる知見に基づき、更に研究
を重ねた結果、イオン交換膜の表層部に一級アミノ基を
有する固定化酵素用担体が、これに酵素を固定化して上
記電気透析に使用した場合、該酵素の固定化力の低下が
なく、長期間安定した反応を行うことができることを見
い出し、本発明を完成するに至った。

本発明は、イオン交換膜の表層部に一級アミノ基を共有
結合してなる固定化酵素用担体である。

本発明において、−級アミノ基は共有結合法、イオン結
合法により酵素を固定化するためのものであり、イオン
交換膜の少なくとも表層部に存在させる。イオン交換膜
の表層部における一級アミノ基の濃度は高い程酵素の固
定化が多く、反応において有利であるが、該−級アミノ
基の濃度があまり高すぎると陽イオン交換膜の場合に電
気透析において、抵抗の増大を招き、経済的な運転が実
施できないばかりでなく、中性撹乱現象が起こり易くな
り、これによって生成する水素イオン或いは水酸イオン
によって固定化した酵素が失活するおそれがある。従っ
て、イオン交換膜の表層部における一級アミノ基の濃度
は、０．１〜３．Ｏｍｅｑ／ｇ−乾燥樹脂、好ましくは
０．５〜２．　Ｏｍｅｑ　／ｇ−乾燥樹脂とすることが
望ましい。

また、上記−級アミノ基は、イオン交換膜を構成するイ
オン交換樹脂に直接共有結合させて存在させることが、
イオン交換膜の性能の低下がなく、しかも酵素の固定化
力も強いため好ましい。なお、前記−級アミノ基はイオ
ン交換膜の片面に存在させてもよいし、両面に存在させ
てもよく、また、イオン交換膜の表面に均一に存在させ
てもよいし、部分的に存在させてもよい。即ち、−級ア
ミノ基は酵素を固定化した場合、該固定化酵素と基質と
が反応し得るような位置に設けることが必要である。本
発明において、イオン交換膜は、陽（又は陰）イオン交
換基を有する高分子膜状物であれば特に限定されず、炭
化水素系、含フッ素系、縮合系、重合系、均一系、不均
一系の如何を問わず公知のものが特に制限なく使用され
る。また、上記イオン交換膜はその使用態様によって陽
イオン交換膜又は陰イオン交換膜の形態をとる。即ち、
電気透析において、脱塩室を構成する陽イオン交換膜及
び／又は陰イオン交換膜のいずれかに、本発明の固定化
酵素用担体を使用するかによって適宜決定すればよい。

例えば、イオン交換膜が陽イオン交換膜の場合には、陽
イオン交換基としてスルホン酸基、硫酸エステル基等の
強酸性イオン交換基、また陰イオン交換基の場合には、
陰イオン交換基として第４級アンモニウム塩基、第４級
ホスホニウム塩基、スチボニウム塩基、アルソニウム塩
基、第四級ピリジニウム塩基等の強塩基性イオン交換基
が好適である。

本発明において、前記したイオン交換膜のイオン交換容
量は、電気透析に支障のない範囲で適宜決定すればよく
、例えば、０．５〜３，０ＩＩＩｅｑ／ｇ−乾燥樹脂が
適当である。

また、本発明の固定化酵素用担体は、電気透析装置に組
み込んだ場合に１１１潤、収縮による破損、脱塩室内の
厚みむらの発生等を防止するために、多孔性シートより
なる支持体を一体化することが望ましい。上記支持体を
一体化する態様は、前記イオン交換膜の層の内部に存在
させてもよいし、Ａｉｌちしてもよい。また、支持体と
なるシートは、補強効果を有するものであれば特に制限
されず、例えば織布、不ｍ布、編物等が好適に使用され
る。

かかる多孔性シートの材質は、例えばポリプロピレン、
ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、
ポリビニルアルコール、ポリエステル、ポリフッ化ビニ
ル、ポリアミド、ポリイミド等の樹脂、ガラス、カーボ
ン等の無機物が好適に使用される。また、多孔性シート
の厚み、空隙葎細孔径は特に制限されないが、一級に、
厚みｌＯ〜２００μ、空隙率２０〜７０％、平均孔径０
゜０５〜５．０１ｔのものが好ましい。

本発明の固定化酵素用担体において、−級アミノ基の存
在するイオン交換膜の面は凹凸を有す眉ことが、イオン
交換膜としての電気抵抗を上げイことなく、酵素の固定
化量を増大でき好ましい。

かかる凹凸は、表面積が１平方センチメートルレ画当た
り１．５平方センチメートル以上、好ましくは２〜４平
方センチメートルとなるように形量させることが好まし
い、上記凹凸面を形成させ（方法は特に制限されるもの
ではない、ＰＩ３えば、イオン交換膜表面をサンドブラ
スト法による処理によって荒らすことによって形成させ
る態様又イ］ン交換膜を製造する際、可塑剤、アルコー
ル等σ液体、炭酸カルシウム粉体等の粉体などの非反綻
性物質を混入させた原料モノマーを重合後除去オる方法
、或いは前記した支持体をイオン交換膜σ表面付近に存
在させることにより、支持体の目ζ、　　よって凹凸を
形成させる態様がある。上記態様のうち、サンドブラス
ト法によって表面を荒らす態様が一級アミノ基に対する
酵素の固定化力が強くより好ましい。

本発明の固定化酵素用担体の製造方法は、特に制限され
ない０代表的な方法を例示すれば、−級アミノ基及びイ
オン交換基を導入可能なスチレン系ビニルモノマー及び
架橋剤よりなる混合モノマーを、前記支持体に含浸させ
るか或いは含浸させずに膜状に形成して重合させ、膜状
重合体を得た後、該膜状重合体の少なくとも一方の表層
部に一級アミノ基を導入し、イオン交換基を導入する方
法がある。上記方法において、混合モノマーに対して、
悪影響を及ぼさない範囲で他の共重合可能なモノマー、
非重合性化合物、熱可塑性高分子物）　　質を併用して
もよい。

前記した一級アミノ基及びイオン交換基を導入可能なモ
ノマーとしては、スチレン、ビニルトル；　　エン、ニ
トロスチレン、クロルメチルスチレン、ハロゲン化スチ
レン、ビニルナフタレン等が好適に使用される。架橋剤
としては、ジビニルベンゼンが最も一級的である。また
、前記モノマーと共重合するモノマーとして、アクリロ
ニトリル、アクリル酸誘導体、メタクリル酸誘導体等が
ある。

前記重合において、重合触媒としては油溶性のものが好
ましいが、若干その例を挙げると過峻化ベンゾイル、α
αゝアゾビスイソブチロニトリル等が使用できる。

その他、非重合性化合物として、例えばジオクチルフタ
レート、ジブチルフタレート、アセトン、ベンセン、ガ
ソリン等といった通常使用される可塑剤および溶剤が適
宜選択使用される。また、熱可塑性高分子物質としては
、クロロブレン重合体、アクリロニトリル−ブタジェン
共重合体、ポリスチレン、ポリアクリル酸エステル、ポ
リブテン、ポリブタジェン、ポリ塩化ビニル、塩化ビニ
ル−アクリロニトリル共重合体、塩素化ポリエチレン等
が使用される。

膜状重合体の少なくとも片方の表面に一級アミノ基を導
入する方法及びイオン交換基を導入する方法は、公知の
方法が特に制限なく使用される。

−級アミノ基を導入する方法について、若干の例を示す
と、スチレン系のビニルモノマーが、スチレン、ビニル
トルエンの場合は、クロロメチルエーテルにてベンゼン
環にクロロメチル基を導入した後、例えばアンモニア、
エチレンジアミン、プロとレンジアミン、ｍ又はｐ−キ
シリレンジアミン、ポリエチレンイミン等と反応させれ
ばよい。

又、クロロメチル基の代わりに濃硝酸−濃ＷＬｉ１１１
混合溶液にて、ニトロ基を導入して、該ニトロ基を還元
アミノ化することによりて、芳香族−級アミノ基を導入
するこ−とができる。又、同じくとニルモノマーがスチ
レンの場合、クロルスルホン酸にてスルホニルクロライ
ド基をベンゼン環に導入後、例えばエチレンジアミン、
ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テト
ラエチレンペンタミン、ポリエチレンイミン等と反応さ
せスルホン酸アミド結合させて目的を達成することがで
きる。ビニルモノマーがクロルメチルスチレンの場合に
は、そのままエチレンジアミン、ｍ又はｐ−キシレンジ
アミンと反応させればよい、　　　〜その他、上記のス
チレンなどを共重合した膜状重合体の場合には、膜表面
のスチレン部分のベンゼン環にニトロ基を導入した後、
内部を濃硫酸でスルホン化して予め陽イオン交換基を導
入し、次いで表面のニトロ基を導入してもよい。なお、
−級アミノ基の導入は、膜状重合体の両面でもよいし片
面でもよい。

上記の膜状重合体にイオン交換基を導入する方法は公知
の方法が用いられる。例えば陰イオン交換基の導入は、
例えば前記クロロメチル基の導入された膜状高分子体の
表面を前記したエチレンジアミンで表面処理をした後、
内部をトリメチルアミン水溶液で処理することによって
容易に内部に陰イオン交換基を導入できる。

また、陽イオン交換基の導入は、例えばスチレンなど共
重合した膜状高分子体にクロルスルホン酸−硫酸混合液
にて内部まで、スルホン酸基とスルホニルクロライド基
を導入し、次いでポリエチレンイミンなどを反応させる
ことによって表面に一級アミノ基を導入し、さらに薄い
苛性ソーダ水溶液に浸漬することによって内部のスルホ
ニルクロライド基をスルホン酸ソーダに交換して陽イオ
ン交換基を導入できる。

なお、上記態様にもあるように、−級アミノ基とイオン
交換基との導入はいずれを先におこなってもよく、導入
方法によって適宜決定すればよい。

本発明の固定化酵素用担体は、以下の方法により一級ア
ミノ基に酵素を結合させることができる。

固定化酵素用担体と酵素を結合させる方法を例示する。

例えば−級アミンが芳香族の場合は一級アミンをジアゾ
化後、酵素とカップリング反応させることができる。又
、脂肪族−級アミンの場合はホスゲンと反応させて、−
級アミンをイソシアネート基に変換した後、酵素と反応
させることができる。或いは、グルクルアルデヒドのよ
うに一分子中に二個以上のアルデヒド基を有する試薬と
一級アミンを反応させた後、残りのアルデヒド基と酵素
のアミノ基を結合させることができる。

本発明の担体に固定化できる酵素は、担体のアミノ基を
利用する結合法にて固定化される酵素であれば特に制限
されない。このような酵素の具体例として、グリコール
オキシターゼ、カタラーゼ等の酸化還元酵素、アスパラ
ギン酸塩、アミノトランスファラーゼ、ビスタミントラ
ンスファラーゼ等の転移酵素、α−アミラーゼ、β−ア
ミラーゼペプシン、ウレアーゼ、リパーゼ等の加水分解
酵素、グルコースイソメラーゼ、アラニンラセマーゼ等
の異性化酵素等を挙げることができる。

［効果及び作用］ 以上の説明により理解される如く、本発明の固定化酵素
用担体は、それ自体イオン交換膜としての機能を有して
いるため、該担体に酵素を結合させて電気透析装置の分
離膜として使用することができる。従って、脱塩室を本
発明の固定化酵素用担体を分離膜として使用することに
より、該脱塩室に基質を含有する被処理液を供給して酵
素反応行いながら、電気透析によって生成する電解質を
系外に除去することが可能となり、酵素反応の反応率を
飛躍的に向上させることができる。

また、本発明の固定化酵素用担体は、−級アミノ基とイ
オン交換基との何らかの作用により、酵素の固定力が著
しく優れ、上記電気透析における苛酷な条件下において
も、酵素の脱離或いは失活が全くなく、長期間安定した
性能を発揮する。

［実施例］ 本発明をさらに具体的に説明するため、以下に実施例を
示すが、本発明は、以下の実施例によって拘束されるも
のではない。

実施例１ クロルメチルスチレン１００部、ジビニルベンゼン１０
部、過酸化ベンゾイル２部、エポキシスチレン２部ジオ
クチルフタレート３０部よりなるモノマー混合液にアク
リロニトリル−ブタジェンゴム５部を溶解し、得られた
混合溶液をポリ塩化ビニル布に塗布し、両面をビニロン
フィルムで密着せしめ押圧下に８０℃で８時間加熱重合
せしめ、クロロメチル基を有する膜状高分子を得た。

次いで、上記膜状高分子をエチレンジアミン中に３０℃
で２日間浸漬し、クロロメチル基とエチレンジアミンと
を反応せしめ、更に１０％トリメチルアミン水溶液へ３
０℃５日間浸漬して内部に四級アンモニウム基を導入し
て陰イオン交換膜とし、表面に一級アミノ基を有する陰
イオン交換膜を得た。この陰イオン交換膜の表層におけ
る一級アミン基の量は１ｍｅｑ／ｇであり、内部の四級
アンモニウム基は２ｔａｅｑ／ｇであった。

上記方法によって得られた陰イオン交換膜を固定化酵素
用担体として０．１ｔＪｌ／？χのリン酸１１衝液でＰ
Ｈ６，０に調整した６％グルタルアルデヒド水溶液に室
温にて１時間反応させた後、ＰＨ７の０．１ｔ＆／’は
リン酸塩緩衝液で十分洗浄した。

次いで、上記担体をグルコースイソメラーゼ１１（活性
５０００Ｕ／ミリ葭）　をＰＨ７の２０ミリ）Ｂ／￥１
リン酸塩緩衝液２０ミ１７？λに溶解した水溶液に室温
で１５時間浸漬し、グルコースイソメラーゼを担体に固
定化した。このようにして酵素を固定化した担体を、０
．１℃１％／’はマレイン酸、０．１七１７′ハトリス
ヒドロキシメチルアミノメタン（以下トリスという’）
、０．１ｔ３／？ＸＭｇ５Ｏ，−７Ｈ，０及び２　ミ’
ｊ＊ｎ／　￥Ｋ　Ｃａ　Ｃｌ、の混合液を苛性ソーダで
ＰＨが７．５となるように調整したトリスマレイン酸塩
緩衝液で十分洗浄し、結合していない酵素を除去した。

得られた固定化酵素の活性は３　、６０　Ｕ　１ｃｍ”
−担体であった。なお、実施例１において、酵素活性の
測定は、上記トリスマレイン酸緩衝液にグルコースを２
ｕ／７にの濃度となるように溶解させた基質溶液６１を
温度６０℃で３０分間酵素と反応させたとき、１分間当
たりにフラクトースを１Ｍモル生成させる活性を１単位
（Ｕ）とした。フラクトースの濃度はシスティンカルバ
ゾール硫酸法により測定しｙ−９ 得られた固定化酵素の耐久性をみるため、前記酵素活性
の測定操作を５回繰り返して行い、活性の低下をみた。

結果を第１表に示す。

第　　　１　　　表 実施例２ スチレン９０部、純度５５％のジビルベンゼン１０部に
ベンゾイルパーオキサイド２部を溶解させた混合溶液中
に空隙率６０％の多孔性ポリエチレンフィルムを５０℃
で１０時間浸漬し、次いでセロハンフィルムでポリエチ
レンフィルムの両側をおおい、押圧下に９０℃にて１０
時間加熱重合して膜状物を得た。

この膜状物を濃硫酸と濃硝酸の容量比】＝１の混合液に
５℃にて１０分間浸漬して、ポリスチレンリベンゼン環
中にニトロ基を導入した。水洗後乾燥させ、濃硫酸中で
６０℃１６時間反応させ内部にスルホン酸基を導入して
陽イオン交換膜とした。

水洗後、上記膜を１０％塩化第一スズの５Ｎ−塩酸水溶
液中へ、２５℃３日間浸漬処理を行い、ニトロ基をアミ
ノ基に還元し、両側の表層に一級アミノ基を有する陽イ
オン交換膜を得た。

この陽イオン交換膜の表層の一級アミノ基は０゜８ａ＋
ｅｑ／ｇであり、内部のスルホン酸基は２　ｓ＋ｅｑ／
ｇであった。

上記方法で得られた固定化酵素用担体を１％亜硝酸ナト
リウムを含有する２％塩酸溶液中に５℃で２０分浸漬し
て、−級アミノ基をジアゾニウム基に変換した。次いで
冷水にて水洗し、０．１Ｍ−トリス−塩酸緩衝液にて洗
浄した。次いで、これをウレアーゼ溶液に浸漬して、１
時間反応させて両面に酵素を固定化した後、０．１Ｍ−
）リス−塩酸緩衝液にて洗浄し、供給していない酵素を
除去した。

得られた固定化酵素の活性は３２Ｕ／ｃＩＩｌｌ−担体
であった。なお、実施例２において酵素活性の測定は０
．１モア１／？五の尿素水溶液よりなる基質溶液１００
１を２０℃で３０分間酵素と反応させたとき、１分間当
たりにｌμｔルのアンモニアを発生させる活性を１単位
（Ｕ）として行った。得られた酵素の耐久性をみるため
、前記酵素活性の測定操作７回繰り返して行い、夫々の
回の酵素活性を測定した。結果を第２表に示す。

比較例 実施例２において、膜状物にスルホン酸基を導入しない
以外は同様にして、表層部に一級アミノ基を有する固定
化酵素用担体を得た。

得られた担体に、実施例２と同様な方法でウレアーゼを
固定した。この固定化酵素の活性は２８Ｕ　／　ｃｙａ
ｌ−担体であった。

得られた固定化酵素の耐久性をみるため、実施例２の酵
素活性の測定操作を７回繰り返して行い、夫々の同の酵
素活性を測定した。結果を第２表に併せて示す。

第　　　２　　　表 用途例 実施例２で得られたウレアーゼを固定化した固定化酵素
用担体を陽イオン交換膜として用い、陰イオン交換膜と
してネオセブタＡｃＨ（商品名：徳山曹達−社製）を用
いて電気透析装置を構成した。電気透析装置は、陽極及
び陰極間に上記イオン交換膜を１枚ずつ配列し、中央の
室が脱塩室となるように組立てた。従って、各電極の存
在する電極室は濃縮室を兼ねるようになる。

上記透析装置の脱塩室に０．１モＲ／’ＩＸの尿素水溶
液供給し、両電極室には緩衝液を供給してＰＨを一定に
保った。また、電圧はｌＯＶの定圧とした。上記運転を
バッチで１日行った結果、尿素水溶液中の尿素の残存率
は４０％になっていた。なお、この時の尿素水溶液のＰ
Ｈは８．０であった。

上記方法に対して、電圧を全くかけない以外は同様にし
て尿素水溶液の反応を行わせた結果、１日後の尿素の残
存率は９０％、尿素水溶液のＰＨは１２になっていた。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）イオン交換膜の表層部に一級アミノ基を共有結合
   してなる固定化酵素用担体。
2. （２）イオン交換膜が多孔性シートよりなる支持体を一
   体化した特許請求の範囲第１項記載の固定化酵素用担体
   。
3. （３）イオン交換膜が陽イオン交換膜である特許請求の
   範囲第１項記載の固定化酵素用担体。
4. （４）陽イオン交換基が強酸性イオン交換基である特許
   請求の範囲第３項記載の固定化酵素用担体。
5. （５）イオン交換膜が陰イオン交換膜である特許請求の
   範囲第１項記載の固定化酵素用担体。
6. （６）陰イオン交換基が強塩基性イオン交換基である特
   許請求の範囲第５項記載の固定化酵素用担体。