SU1723124A1 - Способ иммобилизации галактозооксидазы - Google Patents

Abstract

Использование: биознеорганическа  хими , способы иммобилизации ферментов на неорганическом.носителе дл  пищевой промышленности . Сущность изобретени : 1 г дисперсного пирогенного кремнезема смешивают с 0,1-2,5 Е галактозооксидазы в буферном растворе с рН 4,5-9,1, смесь инкубируют, раствор декантируют. Препарат отмывают буфером от несв завшегос  фермента. Активность препарата 28,6 Е/г. 1 табл.

Description

Изобретение относитс  к бионеорганической химии, в частности к способам иммобилизации ферментов на неорганическом носителе, и может быть использовано дл  определени  галактозосодержащих углеводов в пищевой промышленности (молочной, сахарной, спиртовой)и медицине.

Известны различные способы иммобилизации ферментов на кремнеземах с привитыми аминоорганогруппами на поверхности , путем предварительной активации носител  сол ми диазони , изоцианата- ми, галоидалкилами, хлорангидридами и т.п., фотохимическим присоединением ферментов к поверхности неорганического носител .

К недостаткам способа, включающего предварительную активацию, следует отнести его длительность и многостадийность, а также недостаточно высокую активность полученного препарата.

Известен также способ иммобилизации галактозооксидазы путем предварительной активации дисперсного кремнезема с привитыми аминопропиловыми группами при

перемешивании его с органическим раствором хлористого цианура, с последующим удалением маточного раствора, промывкой активированного носител  растворителем дл  удалени  избытка цианура и сушкой его на вод ной бане под вакуумом. Активированный носитель смешивают с буферным раствором галактозооксидазы, инкубируют, а затем удал ют буферный раствор и отмывают от несв завшегос  фермента буферным раствором.

Недостатками способа  вл ютс  его сложность и многостадийность, низка  активность полученного препарата.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту  вл етс  способ иммобилизации галактозооксидазы, включающий взаимодействие дисперсного носител  - кремнезема , содержащего на поверхности частиц привитые аминопропиловые группы с галак- тозооксидазой в буферном растворе при пе- ремешивании, введение галактозы и промывку препарата дл  удалени  несв занного фермента при следующем соотно (Л

С

4

Ю

СА) Ю

4

шении компонентов: на 1 г носител -кремнезема с привитыми аминопропиловыми группами 12-115 международных единиц активности фермента и 0,36-2,88 г галактозы .

Данный способ характеризуетс  невозможностью повышени  активности фермента в получаемом препарате при иммобилизации .

Целью изобретени   вл етс  повышение активности фермента.в

Поставленна  цель достигаетс  тем, что согласно способу иммобилизации галакто- зооксидазы, включающему перемешивание дисперсного кремнеземсодержащего носител  с галактозооксидазой в буферном растворе и промывку препарата дл  удалени  несв занного фермента, в качестве кремнеземсодержащего дисперсного носител  используют пирогенный диоксид кремни , причем берут 1 г носител  на 0,1-2,5 международных единиц активности фермента, при рН буферного раствора в пределах 4,5- 9,1.

Дл  реализации способа использовали следующие вещества: в качестве кремнеземсодержащего носител  - пирогенный диоксид кремни  С-80 с удельной поверхностью 80 м /г, с объемом пор 1,2 см /г, размером частиц 0,25-0,5 мм, изготовленный на Ставропольском заводе химреактивов и люминофоров; галактозооксидаза из Fusarium graminearum ИМВ-Р-1060. Фермент галактозооксидаза получен по известному методу. Активность лиофильно высушенного порошка фермента составила 0,1 ед/мг, так как стабильность растворимых препаратов значительно зависит от степени очистки фермента, активность иммобилизованного препарата регистрировали по про вл емой иммобилизованным ферментом активности. В качестве буфера использовали 0,05 М Na - ацетатный буфер - рН 4,0-5,5; 0,05 М Na - фосфатный буфер - рН 5,5-8,0; 0,05 М трис-HCI - рН 8,2-9,1.

Активность иммобилизованной галак- тозооксидазы определ ли следующим образом .

В термостатированную при 25°С  чейку с кислородным электродом Кларка, содержащую 5,5 мл 100 мм раствора галактозы со 100 мкм феррицианида кали  и 1 М Na - ЭДТА в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,0, вносили 0,01 г иммобилизованного фермента и регистрировали на тенте самописца кинетику потреблени  кислорода (1 ед. активности соответствует количеству фермента , катализирующего окисление 1 мкМ субстрата за 1 мин). Использовали коэффициент повышени  активности фермента (К),

который равен отношению активности полученного препарата фермента к активности исходного буферного раствора фермента. Способ осуществл ли следующим образом .

Предварительно готовили буферный раствор фермента с требуемым значением рН, затем смешивали раствор с носителем. На 1 г носител  брали 10 мл раствора с

0 ферментативной активностью. Смесь инкубировали при 25°С 2 ч и затем отмывали от несв завшегос  фермента буфером. При этом на 1 г носител  использовали 10 мл буферного раствора фермента.

5 Пример1.1г исходного пирогенного кремнезема инкубировали с 10 мл буферного раствора галактозооксидазы, содержащего 1,3 единиц активности, 2 ч. Декантацией раствор удал ли, а после этого

0 носитель отмывали от несв завшегос  фермента небольшим количеством 0,05 М фосфатного буфера (рН 7,0). Активность иммобилизованной галактозооксидазы определ ли , как описано выше. Активность

5 полученного иммобилизованного препарата составл ла 28,6 ед/г носител .

Примеры 2-5. Поступали так, как описано в примере 1, за исключением того, что измен ли соотношение количества фер0 мента в растворе на 1 г носител . Полученные результаты приведены в примерах 2-5 таблицы.

Примеры 6-13. Одинаковую во всех примерах навеску фермента 0,015 г рас5 твор ли в 15 мл буферного раствора с соответствующим значением рН. К 10 мл приготовленного раствора фермента добавл ли 1 г дисперсного пирогенного кремнезема . Из оставшегос  раствора фермента

0 отбирали по 0,5 мл дл  определени  исходной активности фермента. Выделение иммобилизованного фермента осуществл ли так, как описано в примере 1. Полученные результаты приведены в примерах 6-13 таб5 лицы.

П р и м е р 14 (прототип). В примере приведены соответствующие данные по прототипу. В примерах 1-5 показано вли ние на достижение цели соотношени  ак0 тивности фермента в растворе к массе носител -кремнезема. Если значение соотношени  в предлагаемых пределах (примеры 1-3), то поставленна  цель достигаетс . За пределами предлагаемого значени  кон5 центраций (примеры 4 и 5) цель не достигаетс , значение К не лучше, чем у прототипа. В примерах 6-13 показано вли ние рН буферного раствора на достижение цели. Если значение рН в предлагаемых пределах (при- меры 6-11), то поставленна  цель достигаетс . За пределами предлагаемого интервала рН (примеры 12 и 13) цель не достигаетс , происходит инактиваци  фермента.

П р и м е р 14. В таблице приведены данные по способу-прототипу - зависимость активности сорбированного на модифицированном носителе фермента от концентрации растворимой галактозоокси- дазы при рН 7,0.

Таким образом, предлагаемый способ иммобилизации галактозооксидазы позвол ет получить высокоактивный препарат иммобилизованного фермента, более того, полученный иммобилизованный препарат обладает активностью, значительно превышающей активность исходного раствора фермента. Используемый дл  иммобилизации носитель не требует предварительной

активации, что упрощает технологический процесс.

Claims (1)

1. Формула изобретени  Способ иммобилизации галактозооксидазы , предусматривающий смешивание дисперсного кремнеземсодержащего носител  с раствором галактозооксидазы в буфере , инкубирование смеси, декантацию раствора и отмывание препарата буфером

   дл  удалени  несв завшегос  фермента, о т- личающийс  тем, что, с целью повышени  активности целевого продукта и упрощени  способа, в качестве дисперсного кремнеземсодержащего носител  используют дисперсный пирогенный кремнезем в количестве 1 г на 0,1-2,5 Е фермента, а дл  приготовлени  смеси примен ют буферный растворе рН 4,5-9,1.

   Концентраци  галактозы 2,88 г/г носител .